JPS5930398B2 - アルギン酸アルミニウム固定化菌体包括体の再生方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化菌体包括体の再生方法、更に詳細には活
性低下または失活したアルギン酸アルミニウムまたはア
ルミニウムカルシウム固定化菌体包括体の再生方法に関
する。

各種菌体が広い範囲にわたって産業上利用されている。

例えば食品工業、医薬品工業において、更には産業廃水
の処理等にも利用されている。

しかしながら従来のかかる菌体を使用するいわゆる醗酵
においては、それぞれの分野に適した菌体をそのまま水
相で使用しており、このため連続法で醗酵を実施すると
、菌体は醗酵を生起させる反応器内に留まることができ
ず、製品と共に流出してしまい、流出した醗酵沿を更に
処理して菌体を分離除去する必要があり、また菌体は使
い捨てにするのが通常であった。

従って菌体を水その他の液体に不溶性または非流動性の
形に固定して反応器内に滞留できるようにし、連続法で
長期間にわたり使用できるようにすることが提案されて
いる。

かかる固定化方法に種種な方法が提案されているが、そ
の一つの方法としてポリアクリルアミドかうなるゲル材
料の微細格子中に菌体を包括させて固定化する方法があ
る。

また別の固定化方法として例えばキャンデイダ、トロピ
カルス （Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｓ ）酵母をアル
ギン酸アルミニウムで固定化する方法が報告されている
（アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ、シンポジウム
・シリーズＡ１０６、第１０１貢、１９７９年、クライ
ン等による［インモービライズド・マイクロビアル・セ
ル」参照）。

この方法によればアルギン酸ナトリウムと酵母からなる
懸濁液を硫酸アルミニウムの架橋液（水溶液）に直接入
れ、アルギン酸をゲル化させることにより、その中に酵
母を包括１固定化させている。

そしてかかる固定化された酵母を工業廃水中のフェノー
ルの除去に使用し、有効であることが報告されている。

しかしながらアルミニウム塩としてアルミニウムを使用
した場合固定化された酵母はフェノールを除去する活性
がないと報告されている。

またアルコール醗酵に使用されるサツカロミセス、セル
ビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉ
ｓｉａｅ ）を上記方法で固定化して包括体とすると、
菌体濃度とは無関係に、架橋液中の硫酸アルミニウムに
より、菌体含有アルギン酸ナトリウム液のｐＨが低下し
、そのため例えば硫酸アルミニウムを１０ ｆ／４の濃
度で使用した場合、上記酵母のアルコール生産活性がな
（なってしまう、またｐＨの低下を小さくするため硫酸
アルミニウムの濃度を１１／ｌに下げると、アルコール
生産活性は有するが包括体の強度が不充分となり、アル
コール連続醗酵装置内で割れ易くなり、微細化されて装
置からの流れに随伴されて流出してしまう欠点を有する
。

別の方法として、サツカロミセス、セルビジアエとアル
ギン酸ナトリウム水溶液からなる懸濁液を架橋液である
塩化カルシウム水溶液中に通して糸状のアルギン酸カル
シウム包括固定化酵母を作成し、これによりグルコース
を原料としてエタノールを製造しうろことが報告されて
いる（キーゼルスタンおよびデューク：バイオテクノロ
ジー。

アンド、バイオエンジニアリング第１９巻第３８７頁、
１９７７年参照）。

この場合、架橋液のｐＨハ４．５位に維持することがで
きるので酵母の活性がなくなることはない。

しかしながらアルギン酸カルシウムで包括した包括体の
硬度が不充分で、連続式アルコール醗酵に最適とはいい
難い。

一般にアルギン酸アルミニウム包括体の方がアルギン酸
カルシウム包括体およびポリアクリルアミド包括体に比
し、ゲル硬度が犬である等、包括体の物理的性質がすぐ
れている特長を有し、このためアルコール醗酵等の連続
法においてはアルギン酸アルミニウムで固定化した包括
体の方が物理的には適している。

しかしながら上述した如く、従来法によるアルギン酸ア
ルミニウムで固定化した包括体では酵母の活性を失う欠
点がある。

このため物理的に破壊し難（、かつ酵母の失活を招来す
ることなく固定化しうる方法について研究開発を行なっ
た結果法のことが明らかとなった。

アルギン酸ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩
水溶液中にアルミニウムイオンおよびカルシウムイオン
を共存させたときナトリウム、カリウムまたはアンモニ
ウムイオンをイオン交換してアルギン酸カルシウムゲル
を形成する反応速度はアルギン酸アルミニウムゲルな形
成する反応速度より速い。

従ってアルミニウム塩およびカルシウム塩を含む水溶液
中に、菌体を懸濁させた例えばアルギン酸ナトリウム水
溶液を加えると、あるいはこの逆に加えると、先ずアル
ギン酸カルシウムが形成されて、菌体を固定化したゲル
包括体が形成される。

ここで注目すべきことは、次いでアルギン酸カルシウム
固定化包括体中のカルシウムイオンがアルミニウムイオ
ンによって交換されてアルギン酸アルミニウムが形成さ
れ、その結果形成されたゲル包括体の硬度が上昇し、そ
れと共に包括体の体積の縮小が生ずる。

アルミニウム塩を加えると、一般に水溶液のｐＨは下り
、例えばｐＨ２，８と低くなり、前述した如（酵母は失
活する恐れがあったのであるが、上述した如くカルシウ
ム塩を同時に使用すると、アルミニウム塩によりｐＨが
下っても、菌体は急速にアルギン酸カルシウムに包括さ
れるので、遊離の菌体が低ｐＨ環境に置かれる期間が短
く、このため菌体失活を防止することができる。

別法として、カルシウム塩単独の水溶液に、菌体を懸濁
したアルギン酸ナトリウムの水溶液を加え、またはこの
逆にし、予めアルギン酸カルシウムで菌体を固定した包
括体を形成する。

この場合水溶液のｐＨは４．５付近になるので、菌体の
失活は生じない。

次にｐＨの低いアルミニウム塩水溶液に、上記固定化菌
体包括体を入れると、カルシウムイオンの一部または全
部がアルミニウムイオンによって交換され、硬度の高い
ゲル包括体を生ずる。

この二段法の場合には遊離の状態で菌体が低いｐＨに曝
露されることがないため、菌体の失活が生ぜず、製造時
に特別の注意を払う必要がなく有利である。

アルミニウムイオンとカルシウムイオンが共存する状態
では、カルシウムイオンのアルミニウムイオンによる交
換反応は平衡状態に達するまで進行する。

このため一般に包括体中にはアルギン酸カルシウムとア
ルギン酸アルミニウムを金色する。

なお上記二段法での第二工程で、アルミニウム塩水溶液
を多量に使用してその中にアルギン酸カルシウム包括体
を通すと、理論的にはアルミニウムイオンによってカル
シウムイオンの全部を交換することも可能であるが、実
際問題としてカルシウムイオンの全部をアルミニウムイ
オン交換することは、包括体の物理的性質および菌体の
活性の点から見て不要であり、無駄である。

一般にアルミニウム塩、例えば硫酸アルミニウムを多量
に添加すると、カルシウムイオンは硫酸カルシウムとな
り、その溶解度以上となって沈澱して（る、このためア
ルギン酸アルミニウムカルシウム包括体内でのアルミニ
ウム対カルシウムの比は３０対１にまですることができ
る。

またアルミニウム対カルシウムの比が５対１でも包割体
の硬度は醗酵工業に充分長期間使用できる根太である。

上述した方法で製造した包括体中に包括され、固定化さ
れる菌体の量は、包括体１を当り、約４００１にもする
ことができる。

菌体としてパン酵母（サツカロミセス、セルビジアエ）
を使用し、コーンシュガーからエタノールを醗酵生産す
る場合を例にとると、従来のポリアクリルアミド包括体
中の菌体量１３０ ｆ！′／、！以上では脆くなり、使
用できない。

これに対し、４００ ？／ｌの酵母を含むアルギン酸ア
ルミニウムカルシウム（Ａｌ ／Ｃａ ＝５ ／ １
）包括体ではｐＨを２．８に下げても活性を有し、例え
ばポリアクリルアミドで固定化した包括体のｐＨ４，５
の場合の活性の３倍も大である。

またｐｍ ２．８の醗酵溶液中に置いた場合、ポリアク
リルアミドで包括固定した酵母およびアルギン酸カルシ
ウムで包括固定化した酵母の活性は、ｐＨ４，５の場合
のそれぞれ１０チおよび６０係にまで低下する。

これらの事実から、アルギン酸アルミニウムカルシウム
で包括固定化した酵母菌体は、修飾されて、上記従来の
固定化菌体または生酵母菌体などと異なり、ｐＨ２，８
の環境においても良好な醗酵活動を維持でき、かつ硬度
等の物理的条件もすぐれている特長を有し、連続醗酵法
に使用できることが判る。

しかしながら上記方法で製造したアルギン酸アルミニウ
ムまたはアルミニウムカルシウム固定化菌体包括体も、
ｐＨ２，７で３０℃で１力月以上、例えばアルコール醗
酵に使用すると、菌体の活性低下は避けられない。

従って本発明は上記の如きアルギン酸アルミニウムまた
はアルギン酸アルミニウムカルシウムで固定化された活
性低下または失活した菌体包括体の再生方法を提供する
ことにある。

かかる活性低下または失活した包括体を再生するに当り
、包括体を単にアルミニウム塩水溶液中にｐＨ２，７付
近で入れ、更にペプトンや酵母エキスを含む基質を加え
て再生せんとしても沈澱を生じ、固定化菌体な活性のあ
る菌体とするには非常に長時間を要する。

しかるに上記基質中にカルシウム塩を加えてカルシウム
含有量を多くしてやると、アルミニウムイオンは逆にカ
ルシウムイオンで交換されてくる。

かくすることによって包括体内のアルミニウムとカルシ
ウムの比を１：１００とするとｐＨを３．５以上にでき
るので、ペプトンや酵母エキスを加えても沈澱を生ずる
ことなく、従って包括体内の活性低下または失活した菌
体（古い菌体どを活性のある新しい菌体に再生すること
ができることが判った。

かくして菌体活性の再生された包括体を前記二段法に準
じて、アルミニウム塩含有水溶液中にて処理すると、再
びｐＨ２，７付近でも活性のあるアルギン酸アルミニウ
ムカルシウムで固定化した前記方法で製造した包括体と
同等のものにすることができることが判った。

従って本発明方法は失活または活性低下した固定化した
菌体包括体を再生することができることにおいて工業的
用途に非常に有用であることが判るであろう。

本発明は失活または活性低下した菌体包括体を再生する
ことにあるのであるから、包括体内に固定化されている
菌体には特別の制限はなくあらゆる用途にそれぞれ適し
た任意の菌体であることができる。

力・かる菌体の例の一部を以下に示すが、これらに限定
されないことは明らかであろう。

サツカロミセス属の全て、例えばサツカロミセス・カー
ルスペルジエンシス （ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒ
ｇｅｎｓｉｓ）、サツカロミセス、ホルモセンス （ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｏｒｍｏｓｅｎ
ｉｓ ）シゾサツカロミセス属の全て、例えばシゾサツ
カロミセス・ボンベ（ Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓｐｏｍｂｅ ） クルイベロミセス属の全て、例えばクルイベロミセス・
ラクティス（ ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉ
ｓ ） カンデイダ属の全て、例えばカンデイダ・シュードトロ
ピカルス（ Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉ
ｃａｌｓ）ザイモモナス属の全て、例えばザイモモナス
。

モビリス（ Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ）
シュードモナス属の全て、例えばシュードモナスーオバ
リス（ Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｖａｌｉｓ ）
グルコノバクタ−属の全て、例えばグルコノバクタ−・
サブオキシダンス（ Ｇ ｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓ
ｕｂｏｘ ｙｄａｎｓ ） 本発明で使用する無機酸および有機酸のカルシウム塩お
よびアルミニウム塩としては、例えば塩化アルミニウム
、硫酸アルミニウム、硝酸アルミニウム、塩化カルシウ
ム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩素酸カルシウ
ム、ギ酸カルシウム等任意のものを使用しうるが、特に
硫酸アルミニウムおよび塩化カルシウムが好ましい。

以下に参考例および実施例を挙げて本発明を説明する。

なお菌体としてはサツカロミセス、セルビジアエを用い
て、エタノール生産の例をとって、包括体の活性例を示
す。

参考例 １ 糖蜜を基質とし、振盪培養し、更に゛タンク培養した湿
潤酵母菌体（サツカロミセス・セルビジアエ：水分７５
％含有）１０１を１．５重量％のアルギン酸ナトリウム
水溶液８ｖ中に懸濁させた。

この懸濁液をノズルを通して第一の架橋液である１６．
７重量％の塩化カルシウム水溶液中に滴下した。

この時ノズル先端には無菌空気または滅菌酸素を吹きつ
けた。

また上記塩化カルシウム水溶液は約４℃に保持し、攪拌
した。

かくして直径１〜２ｔｒｒＩｒＬのアルギン酸カルシウ
ムで固定化した菌体を含む包括体粒子を形成させた。

次にこのアルギン酸カルシウム固定化粒子を取り出し、
生理食塩水で洗浄後、下記に示す第二の架橋液０．５７
に入れ、４℃で２日間保存した。

Ａ１２（Ｓｏ、）３．１６〜１８Ｈ２０１０？／ｌ。

ＫＨ２Ｐ０． １． Ｏｆ？／
ｌ。

ＭｇＳＯ４，７Ｈ２０２，０？／ｌ グルコース １３．０グ／を上記
架橋液にアルギン酸カルシウム固定化粒子を入れる前、
上記第二架橋液のｐＨは２．７〜２．８であるが、導入
後カルシウムがアルミニウムによりイオン交換されるに
従ってｐＨは次第に上昇しテ最終的には３．４を示した
。

形成されたアルギン酸アルミニウムカルシウムで固定化
された包括体粒子は球状であり、アルミニウム対カルシ
ウムの比は約５対１であった。

上記二段法で製造した粒子を生体触媒として糖よりエタ
ノールの生産に使用した。

上下円錐型ユニットを垂直に三段積重ねた全容積１ｔの
バイオリアクター（特開昭５４−０２６９７２号および
特願昭５５−２７７２４号参照）の下部に取り付けた焼
結ガス分散板より炭酸ガスを０．３ ＮＡ ７分、およ
び下記組成供給液０．４７ｍ１１分を上昇流として送入
した。

グルコース ２１６グ／ｌＡ １
２ （ＳＯ４） ３−１６〜１８Ｈ２０２，０１１７１
Ｍｇ５０４．７Ｈ２０２，０グ／１ ＫＨ２Ｐ０． ０．２グ／１Ｃ
ａＣ１２，２Ｈ２Ｏ２，８５Ｙ／ １ これに上記の固定化粒子０．３０．ｆｆを懸濁させて醗
酵させた結果バイオリアクター内反応温度３０’Ｃ，ｐ
Ｈ２，６〜２．８で送出液は７９ Ｌ？／ｌのエタノー
ルを含有し、９日間連続運転できた。

実施例 １ 参考例１で作ったアルギン酸アルミニウムカルシウムで
固定化した酵母菌体包括体粒子を使用して、アルコール
醗酵を行ない、活性の低下したものを出発物質として、
これの再生を行なった。

上記包括体粒子１０２を下記組成の水溶液中に入れた。

ＣａＣｌ２．２ Ｈ２Ｏ２８？／ １ サツカロース １０グ／１ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２０２？／Ｌ 酵母エキス ５グ／１ ＫＥ（２ＰＯ４０，１グ／ｌ この間液を３０℃に保ち、１ ｖ ／ ｖ ７分の滅菌
空気を通じながら２４時間処理した。

次に粒子を液中より取り出し、生理食塩水で良く洗浄し
、参考例１の第二架橋液０．５２中に４℃で２日間保存
すると、そのエタノール生産活性は参考例１と同様にま
でもとに戻ったことが判った。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルギン酸アルミニウムまたはアルギン酸アルミニ
   ウムカルシウムで固定化された活性低下または失活した
   菌体包括体を再生するに当り、上記活性低下または失活
   した菌体包括体を窒素源、および無機酸または有機酸の
   カルシウム塩を含む架橋液中で処理して菌体を再生せし
   め、次いで無機酸または有機酸のアルミニウム塩を含む
   架橋液で処理することを特徴とするアルギン酸アルミニ
   ウムまたはアルギン酸アルミニウムカルシウムで固定化
   された活性低下または失活した菌体包括体の再生方法。