JPS59224687A - 免疫グロブリン産生雑種細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトα−インターフェロンに対して免疫処置さ
れたマウスの肺臓細胞と骨髄腫細胞の、それ自体公知の
細胞融合によシ得られる新規な免疫グログリン産生雑種
細胞系、これらの細胞の生育時に生成される抗体、およ
びそのヒトインターフェロンの精製、診断、検出への利
用に関する。

モノクロナール抗体の利用によシヒトインターフェロン
の精製が簡易化され、インターフェロンの迅速かつ正確
な非生物学的定量方法の開発が可能なことは知られてい
る〔たとえばり、　５ｅｃｈｅｒ　＆Ｄ、　Ｏ，Ｂｕｒ
ｋｅ　：　Ｎａｔｕｒｅ、　２８５　：　４４６〜４５
０（１９８０）　；　Ｄ、　Ｓ、　５ｅｃｈｅｒ　：　
Ｎａｔｕｒｅ、　２９０　：５０１〜５０３　（１９８
１）　；　Ｌ、　Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ。

Ａ、Ｇ、Ｌａｕｒｅｎｔ　＆　Ｊ、Ｇｒｕｅｓｔ　　：
　　Ｏ，Ｒ，Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｐａｒｉｓ、２９１　　：５ｅｒｉｅＤ、８９３〜８９
６（１９８０）　；　　Ｔ、　５ｔａｅｈｅ１．ｉｎ、
　　Ｂ、　Ｄｕｒｒｅｒ、　：ｒ。

Ｓｃｈｍｉｄｔ、　　Ｂ、　　Ｔａｋａｃｓ、　　Ｊ、
　　５ｔｏｃｋｅｒ、　　Ｖ、　　Ｍｉｇｇｉａｎｏ。

０、　５ｔａｈｌｉ、　　Ｍ、　　Ｒｕｂｌｎｓｔｅｉ
ｎ、　　Ｗ、　　Ｐ、　　Ｌ６１ｕ７＋　　Ｒ。

Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ　＆’　Ｓ、　　Ｐｅ５ｔｋａ　　
：　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａａ。

Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　７８　：　　１８４８〜１８５
２　（１９８１）；Ｔ、５ｔａｅｈｅｌｉｎ、Ｄ、　　
Ｓ、Ｈｏｂｂｅ、Ｈ，Ｋｕｎｇ＋　　Ｏ，Ｙ、Ｌａｉ＆
　　Ｓ、　　ｐｅｓｔｋａ　　：　　：ｒ、　　Ｂ１１
１．　　ａｈｅｍ、、　　２　５　６　　：　　９７５
０〜９７５４　　（１９８１）　　；　　：ｒ、　　Ｒ
，Ｗａｌｋｅｒ、　　、Ｔ。

Ｎａｇｉｎｇｔｏｎ、（）、Ｍ、５ｃｏｔｔ　　＆　Ｄ
、Ｓ、　　５ｅｃｈｅｒ　　：　　Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　　６２　　：　　１８１〜１
８５　　（１９８２）参照〕。

本発明は新規な免疫グロブリン産生　雑種細胞系の使用
によシ、驚くべきことに、α−インターフェロンに対し
て優れた抗原特異性を有する新規モノクロナール抗体が
得られることを発見し完成されたものである。しかも、
本発明によって製造される新規抗体の細胞培養上澄液中
の濃度Ｆｉ１００〜２００μｌ／／ｍｌで、文献に記載
されている１〜２０μ＆／ｍｌという値〔たとえばＧ、
　Ｇａ１ｆｒｅ′ｔ　Ｏ。

Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　＆　’Ｂ、Ｗｒｉｇｈｔ　　：　　
Ｎａｔｕｒｅ、２　７　７　　：　　１３１〜１３３（
１９７９）参照〕に比べて驚異的に高値である。

すなわち、本発明は、新規な免疫グロゾリン産生　雑種
細胞系、その製造方法、ならびにα−インターフェロン
マタハヒトα−インターフェロン亜型に対して選択的抗
原特異性を有する、マウスからのモノクロナール免疫グ
ログリンＧ（工ｇＧ）型抗体の製造方法を提供する。

新規なこのモノクロナール抗体は、したがって、ヒトα
−インターフェロンの高度精製および検出にとくに適し
ている。

本発明によれば、新規な免疫グログリン産生雑種細胞系
は細胞融合によって得られる。

この目的のためには、免疫処置マウスたとえばＢＡＬＢ
／ｃ　マウスから肺臓細胞を取シ出し、直ちに骨髄種細
胞たとえは細胞系Ｐ　３−　Ｘ　−６３Ａｇ３−６−５
−３の骨髄腫細胞と、Ｇ、　Ｇａ１ｆｒｅら［：　Ｎａ
ｔｕｒｅ、２６６　：　５５０〜５５２　（１９７７）
］の方法に従って細胞融合させる。

すなわち、菟疫処置マウスの膵臓細胞から細胞構造を機
械的に除去し、得られた細胞懸濁液を等張索塩溶液で１
回洗浄し、遠心分離する。骨髄腫細胞は血清を含まない
細胞培養メジウムで１回洗浄し、１・ｏ　ｏ　ｏ　ｘ、
ｙで遠心分離する。生成した２種の細胞ペレット（骨髄
腫細胞および肺臓ａ胞）を、血清を含まない培養メジウ
ムに再懸濁し、−澄両分を除去し、細胞融合を５０％ポ
リエチレングリコール中、たとえば５％ジメチルスルホ
キシド含有５０％ポリエチレングリコール４０００（Ｅ
、　ＭｅｒＱｋｒ　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ製）中（容量１
．５７ｍ　）で実施する。２分間反応させたのち、反応
混合物を血清を含まなりメジウムで容量４５　ｍｌに希
釈シ、次ＶＣ１０ｑ６ウシ胎仔血清含有培養メゾウム６
Ｍを加え、混合物を１，０００Ｘ、ｌｉ’で遠心分離す
る。

融合後、細胞を２４個の陥凹部がある培養プレートに移
し、６７℃において文献公知の方法〔たとえばＪ、　Ｗ
、　Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ　：　５ｃｉｅｎｃｅ、　
１４５　ニア０９（１９６４）の方法〕に従って、好ま
しくは２係ウシ胎仔血清および適当な抗生物質またはそ
の混合物たとえばペニシリンとストレプトマイシンを加
えた、たとえばＩ（ＡＴメジウム中でインキュベートす
る。

雑種細胞の生育が認められる培養液中のインターフェロ
ン特異的抗体の含量を以下の方法により試験する。

雑神細胞が陥凹部表面の少なくとも１０〜２０チを覆う
まで生育した培養液の上澄画分から、サンプル６００μ
ｌを採取し、５工Ｅ組換えヒトインターフェロンα２亜
型（Ａｒｇ）　（１９８２年１２月２４日出願ドイツ特
許Ｐ３２　４７　９２２．０号の記載参照）とともに６
７℃で１〜２時間時間インキュトート。ヒトインターフ
ェロンと抗体の複合体を沈殿させるため、マウス免疫グ
ログリンに対するヤギ抗血清（Ｃａｌす１ｏｃｈｅｍ−
Ｂｅｈｒｉｎｇ）　３μｌを加え、混合物をさらに６時
間、６７℃でインキュベートする。サンプルをＥｐｐｅ
ｎａｏｒｆマイクロ遠心分離装置で５分間遠心分離し、
その上澄画分のインターフェロン活性残遺量を、Ｇ、Ｊ
。

０ｈｒｉｓｔｏｆｉｎｉｓによって確立された方法［Ｊ
、　Ｍｅｄ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、３：２５ｉ〜２５８（１９７０
）］によってｖ６ザル腎臓細胞培養液に対して試験した
。すなわち、２４個の陥凹部を有する組織培養プレート
上、各陥凹部に５００μｌのメジウムを加えて培養した
Ｖ３細胞を上述の試験上清両分と３７℃で２０時間イン
キュベートし、ついでＧ陥凹部に約５　Ｑ　ｐｆｕ　（
プラーク形成単位）の水痘性口内炎ウイールスを感染さ
せ、半固体メジウム中で４０時間インキュベートする。

この時点でプラーク形成阻止を測定する。

雑種細胞上澄画分における特異的抗体産生のスクリーニ
ングは、したがって、インターフェロンの抗つイールス
活性に基づく生物学的試験によって実施される。モノク
ロナール抗体はＮｏ−３７または白血球インターフェロ
ンにおける亜型の一部にのみ結合し、したがって任意の
インターフェロン混合物中の総インターフェロン活性を
ある限界だけ低下させるにすぎないという理由から、単
一のα−インターフェロン亜型（ＩＦＮα２Ａｒｇ）が
使用される。

新しい雑種細胞系の産生には、以上の細胞および動物材
料が用いられる。

細胞融合には、ｊ、ｎ　ｖｉｔｒｏで永久に生育を続け
る８−アずグアニン抵抗性骨髄腫細胞系、Ｐ６−Ｘ　−
０３ＡｇＦ３　ＣＧ、　Ｋｏｅｈｌｅｒ　＆；　０．　
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　：Ｎａ’ｅｕｒｌＬ　２５６　：　
４９５　（１９７５）　］から誘導される細胞豆果ｐ　
３−　ｘ　−６３Ａｇ　８−６−５−３［：　Ｊ、Ｆ、
　Ｋｅａｒｎｅ７　ｒ　Ａ、Ｒａｄｂｒｕｃｈ＋　Ｂ−
Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ＆　Ｋ、　Ｒａｊｅｗｓｋｉ　：　
Ｊ、■ｍｍｕｎｏ１．．１２３　：　１５４８（１９７
９））を用いる。この豆果は免疫グロブリンの検出可能
量を産生ずることはない。１０％ウシ胎仔血清、ペニシ
リンおよびストレプトマイシン含有ＲＰＭ工１６４０メ
ジウム中で培養される。

抗ヒトα−インターフェロン特異性を有する免疫グログ
リンを産生ずる雑種細胞系を生成させるためには、マウ
スたとえばＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを以下の方法
で免疫処置する。

ヒトインターフェロンはＧ、　Ｒ，Ａａｏｆ、　Ｇ、　
Ｂｏｄ。

＆　　：ｐ、　　Ｓｗｅｔｌｙ　　［’Ａｎｔｉｖｉｒ
ａｌ　　Ｒｅｓ、＋　　１　　＋　　２　５　７（１９
８１））の方法を用いてｙａ、−３７細胞中に産生させ
、純度は少なくとも１０フインタ一フエロン国際単位（
工、ｔｒ、■ｐＮ／Ｉｎ９蛋白質に相当する程度で完全
）ｐインドアジュバントとのエマルジョンの形としてＥ
　ｈ　Ｌ　Ｂ　／　Ｏマウスの免疫処置に使用する。

免疫処置　要領Ａ： １群５匹の各マウスに、濃度５　Ｘ　１０７エＵ　／　
ｍｌで５　ｘ　１０６　工Ｕ　ＩＦＮによる一次免疫処
置を実施する。用量の半分は腹腔内への経路で投与し、
残シは動物の背部２〜６個所に皮下投与する。最初の免
疫処置から７週後に、不完全フロインドアジュバントを
使うほかは最初の免疫処置と同じ方法で、高純度インタ
ーフェロン５　Ｘ　１０６エυによシ２２回目免疫処置
を実施する。２回目の免疫処置から２週後に、免疫処置
動物の血清についてＮｃ−５７細胞からのインターフェ
ロンに対する中和抗体の含量を試験する。この時点で、
すべての血清は約１．０００程度の力価を有する（定量
法についてはインターフェロン中和試験の項参照）。２
回目の免疫処置から３週後、マウスの１匹に高純度イン
ターフェロン５　Ｘ　１０６エＵをアジュバントととも
に静脈内注射する。４日後に膵臓細胞を骨髄腫細胞との
細胞融合に使用する。

免疫処置要領Ｂ： １群５匹のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを同一総量の
Ｎｏ−６フインターフエロンで免疫部ｌする。すなわち
ｓ　ｘ　ｉ　ｏａ工Ｕのインターフェロンを３回に分け
、２〜６週間週間性射する。この期間後の血清力価は１
０〜２００となる。さらに高純度ＮＯ−３フインターフ
ェロン５　Ｘ　１０６エＵを６回注射すると、血清力価
は１匹のマウスでは１．０００に達する程度であるが、
他のマウスでは３，０００もしくはそれ以上の力価を示
す。これらのマウスの６匹からの膵臓細胞を最初の免疫
処置から１９．２２および２５週後に骨髄腫細胞との細
胞融合に使用する。

膵臓摘出の６〜４日前に、各マウスにインターフェロン
５×１０６エＵ゛を腹腔内または静脈内いずれかの経路
で投与する。

インターフェロン中和試験： 抗インターフェロン抗体の力価は、血清サンプルまたは
雑種細胞もしくは腹水細胞培養上澄液について、次のよ
うに測定する。

Ｎｏ　−３７細胞からのインターフェロン１０工Ｕ（１
００ｐＨ）を血清サンプルの系列希釈液１０μｌとイン
キュベートする。

各種インターフェロンサンプルの中和を比較するために
、試験すべきインターフェロンサンプルのインターフェ
ロン１０　ＩＵ　（１００μｌ）液をモノクロナール抗
体１００μ！またはＨｕ　ＩＦＮ−αおよび／またはＨ
ｕＩＦＮ−βに対するウザギ抗血清に５０希釈液１００
　ｐｌとインキュベートする（　Ｊｕｓｔｉｎ　Ｂ−Ｇ
ａｒｖｅｙ　ｌ　Ｎａｔａｌｌｅ　Ｋ、Ｏｒｅｍｅｒ＋
Ｄｉｅｔｅｒ　Ｈ，Ｓ’ｕｓｓｄｏｒｆ著：　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ工ｍｍｕｎｏ　１ｏｇｙ＋Ｂａ５ｉｏ　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、　Ｗ、　Ａ、　Ｂｅｎｊａｍｉｎ工ｎｃ
、１９７７刊参照）。６７℃で６０〜９０分間インキュ
ベートしたのち、サンプル中に残存するインターフェロ
ン活性をｖ６細胞中で滴定し、測定する（二重測定）。

本発明によれば、新規モノクロナール抗体は細胞培養上
澄液また担腫瘍マウスの腹水から公知の方法によって単
離される。たとえば分別沈殿、好ましくは硫酸アンモニ
ウムによる分別沈殿で、ついで所望によシ適当な担体上
好ましくはセルロースペースの担体たとえばジエチルア
ミンエチルセルロース上クロマトグラフィーによって単
離される。

このようにして産生された抗体はそのままインターフェ
ロンα型の非生物学的検出に、また生物学的に不活性な
担体と共有結合させてヒトインターフェロンの高純度精
製に使用できる。この抗体は、適当に活性化された担体
、好ましくはデキストランベースのたとえばＣＮＢｒ−
活性化セファローヌまたはＯＨ−活性化セファロース（
Ｐｈａｒｍａｃｉａｏｆ　Ｕｐｐｓａｌａ製）に共有結
合させる。高純度精製を行うには、わずかに塩基性たと
えばＰＨ７〜８のヒトインターフェロン溶液を抗体親和
性担体上に送り、溶出液中に蛋白質が認められなくなる
までＰ）１７．０で洗浄し、ついで結合したインターフ
ェロンを酸性範囲たとえばＰＨ２，２で溶出させる。か
くして得られた蛋白質含有画分は、とくに分析的目的の
ために、直接、強酸性陽イオン交換樹脂たとえは陽イＪ
’　ン交換樹脂Ｍｏｎｏ　−Ｓ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
製）上でクロマトグラフィーに付する。ｐＨ２，２溶出
液中のヒトインターフェロンはこの陽イオン交換カラム
に直ちに吸着され、わずかに酸性のＰＨ１たとえばｐＨ
５，５±０．１で溶出される。

次に本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する
。

例１ 雑種細胞系ｇＢエニー１の製造とその特性要領Ａに従っ
て免疫処置したマウスの膵臓細胞と骨髄肺細胞系ｐ　３
−　ｘ　−６３Ａｇ８−６−５−３の細胞との細胞融合
から、上述の方法を用いて、■ＦＮα２　（Ａｒｇ　）
の抗ウィール活性をほぼ完全に中和する細胞培養上澄液
を与える雑種細胞系が単離される。この雑種細胞系はＥ
Ｂエニーと命名され、抗体の安定した産生を保証するた
めに数回ザグクローニングを行う。細胞系ＫＢエニーは
細胞培養メジウム中ｉｎ　ｖｉｔｒｏでも、またＢＡＬ
Ｂ／ＣマウスにＥＢエニー細胞を腹腔内注射後腫瘍とし
ても培養できる。

雑種細胞系ＥＢエニーによる工ｇＧ産生雑種細胞系ＫＢ
ニー１は細胞培養液（たとえばＲＰＭ工　１６４０メジ
ウム）中に永久にマウスｘｇ、ａ　１−抗Ｈｕ工ＦＮα
抗体を合成し、これが細胞培養メジウム中に分泌される
。

これらの分泌された抗体の濃度は細胞培養メジウム中２
００μｇ／ｍｌにまで達する。

この雑種細胞系ＢＥエニーは種特異的にＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ
／ｃマウス生体内でも腹腔内腫瘍として生育できて、こ
の条件下に同じくマウスエビＧ１−抗Ｈｕ工ＦＮα抗体
を産生ずる。

これらのｉｎ　ｖｉｖｏ条件下に、担腫瘍マウスから、
１Ｍ中にＩｇＧ　ｉ　Ｑ〜２０Ｉｎ９を含有する腹水が
得られる。Ｈｕ工ＦＮα２中和抗体の濃度はこの腹水中
の方がＥＥエニー細胞培養上澄液中よシも１００倍も高
い。

第１表　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス生体内における
腹腔内　　１４　　４／　　　１０−２　　９９％１０
〜３　９９％ １０−４　　９９％ １０−５　　３０％ 担腫瘍マウスの腫瘍で産生された腹水液中の工ｇＧ抗体
を、第１表に示すように、Ｈｕ工ＦＮα２（大腸菌から
の組換えインターフェロン）の抗つイールス活性の中和
によって測定した。

雑種細胞系ＥＢエニーのマウスＩｇＧ抗ＨｕＩＦＮα抗
体の単離 ＫＢエニーから得られるｘｇ、ａは以下の精製工程によ
って単離される。

１、　硫酸アンモニアによる分別沈殿 ２、ジエチルアミノエチルセルロースを用いるクロマト
グラフィー 収量＝１００〜２００ｍ９／ｌｌ細胞培養上澄液例２ 定 精製ＥＢニー１抗体の分子量は１５０，０００ダルトン
である（ポリアクリルアミドデル電気泳動によって演υ
定ン。

ＥＢエニー１抗体の特異的活性はヤイの抗マウス免疫グ
ログリン抗血清によって沈殿させることができる。

ＥＢエニー１抗 はにである（　０ｕｃｈｔθｒｌｏｎ７の二重拡散分析
によって測定）。

ＥＢエニー１抗 （　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）
のＰｒｏｔｅｉｎ　Ａによつ＼ て結合される。

ＥＢエニー１抗 分子量：＞１５０，０００ダルトン 柿：マウス 型：工ｇＧ１ Ｈ鎖：γ１ Ｌ鎖：に 例６ ＥＢエニー１抗 に産生させた、純粋なヒトインターフェロンα２亜型（
　Ａｒｇ　）の抗つイールス活性に対し中和作用を有す
る。

ＥＢエニー１抗体は、複数種の細胞系において各種条件
下に誘導さ９れたヒトα−インターフェロンの各種亜型
の天然混合物の抗つイールヌ活性に対して部分的中和作
用を有する。

その中和活性の程度は第１図に示すように、α−インタ
ーフェロンの各亜型間で変動する。

第１図は縦軸がインターフェロン活性の阻止率（％Ｌ横
軸が腹水の希釈によるＥＢエニー抗体濃度の希釈を示し
ている。１０−１の希釈が抗体濃度１ダ／　ｍｌにほぼ
相当する。図中、・−・はＩＦＮα２　（　Ａｒｇ　）
　：大腸菌からのインターフエロンα２亜型（Ａｒｇ　
）、◇−◇は工ＦＮαＣ：大腸菌からのインターフェロ
ンα２亜型、〇−〇はヒトリンパ芽球細胞から天然に産
生されたインターフエｏ　７　（Ｗｉｅｎ　−６７）、
−はＮａｍａ１ｗａ細胞からの工ＦＮα亜型の混合物、
マーマはヒト血球からの工ＦＮα亜型の混合物（Ｃａｎ
ｔｅｌｌの方法によって得られるインターフェロン−Ｃ
！ａｎｔｅｌｌインターフェロン）の場合を示す。

要約： ＥＢＩ　−１抗体ハヒトβ−インターフェロンに対して
中和作用をもたない。

ＫＢＩ　−１抗体（ｒｉヒトγ−インターフェロンに対
して中和作用をもたない。

ｚＢエニー１　抗体Ｂマウスインターフェロンに対して
９コ和作用をもたない。

したがって、ＥＢニー１抗体はヒトインターフェロンα
亜型の分析的検出、この亜型の区別、他のヒトインター
フェロンヤ他種インターフェロンからの識別に適してい
る。

インターフェロンα２亜型やヒトリンパ芽球細胞に自然
に生成するインターフェロン（たとえばｗｉｅｎ　−６
７）に、対するＦｉＢＩ　−１抗体ノ中和作用ハトくに
顕著である。この天然インターフェロンはＳθｎｄａｉ
ウイールスやポリ（１）：（りのようなインターフェロ
ン誘発剤を添加しないで細胞培養中に産生じ、細胞によ
って培養メジウム中に連続的に放出される。

インターフェロンαＣ型の抗つイールヌ活性に対するＥ
ＢＩ−１抗体の中和作用は幾分弱い。

ＥＢエニー１腹水液を１万倍に希釈してもまだ７７％の
抗つイールス活性が中和されるが、１０万倍に和訳する
と抗つイールス活性の１５％が中和されるにすぎない。

Ｎａｍａ１ｗａ細胞（少なくとも５種のＩＦＮ−α亜型
の混合物）と血球細胞（（！ａｎｔθ１１インターフェ
ロンニア〜８棟の工ＦＮ−α亜型の混合物）からの抗つ
イールヌ活性の中和では最も弱い作用しか認められない
。腹水液の１００倍希釈で、インターフェロン混合物の
抗つイールス活性はわずかに６０〜８０％中和された。

第２表には別種の細胞から得られたその他のヒトインタ
ーフェロンプレバレージョン、おヨヒ細胞処置または誘
導過程によってその組成を改変したヒトインターフェロ
ンプレバレージョンの抗つイールス活性に対するＥＢエ
ニー１抗体の中和結果を示す。

４５ 第２表中の注 ＡＢ＝抗体 大腸菌ＨｕＩＦＮα２＝　大腸菌培養により得られた組
換エインターフェロンα２Ｗ（Ａｒｇ）Ｂｒｄ　Ｕｒｃ
ｌ　＝ブロモデオキシウリジンポリ（１）　：　（０）
　＝ボリイノシンニポリシチジン細胞系ｕＮａｍａｌＷ
ａ”および”　Ｎｏ−３７”はＢｕｒｋｉｔｔのリンパ
腫から誘導され、その他の細胞系はＥ　９５　／　８Ｅ
ｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒウイールス（Ｎ５Ｌ−２４６／
７９）または自然変換（Ｗｉｅｎ　６２　、６７１４２
．１４３，１４６）のいずれかによって確立された血中
リンパ球から得られた。

中和試験は、抗体源としてＰ２ＢＩ　−１細胞培養上澄
液または腹水液ｉ：ｉｏｏ希釈液を用いて実施した。

それぞれの結果は少なくとも２回、独立に実施された中
和試験の結果に基づくもので、第２表にはその平均値を
示す。

要約： 細胞の前処置の差によシ（たとえばＮａｍａ　ＩＷａ　
＋Ｎｏ−３７、Ｎ５Ｌ−２４６／７９　、　Ｗｉｅｎ　
−６２およびＷｉｅｎ　−６，７型〕、インターフェロ
ンα亜型混合物の組成が変動し、それはＥＢエニー１抗
体に上って中和される抗つイールス活性の割合に反映さ
れる。

インターフェロンα亜型混合物に加えてβ−インターフ
ェロンも誘導される細胞の場合、β−インターフェロン
はＦｉＢＩ〜１抗体によっては中和されない。

例４ リ　生物学的に不活性な担体材料への抗体の共有結合 使用する不活性担体材料はＣＮＢｒ−活性化セファロー
ス４Ｂまたはその他の活性化ＯＨ−セファロース４　Ｂ
　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）のいずれでもよい。担体材
料１ｇに対して精製Ｋ］３ニー　１抗体２５Ｉｎ９を使
用する。担体に対するＥＢニー１抗体のカップリングは
０．２　Ｍ　ＮａＨＣＯ２＋０．５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ　（
ｐＨ８，４）中、室温下ＶＣ２時間行う。次に担体拐料
を吸す１ろ過し、エタノールアミン１ＭとｐＨ８，０で
１時間インキュベートし残った活性基を遮断し、　ＰＨ
４，０（０：、Ｉ　Ｍ酢酸塩＋Ｉ　Ｍ　　Ｎａ（Ｊ　）
およびｐＨ８，０（０，１Ｍホウ酸塩＋１ＭＮａ（Ｊ）
による洗浄サイクルを３回くり返す。

完成した親和性担体はｐｉ−１７，０（０，０２リン酸
ナトリウム＋０．１５　Ｍ　　Ｎａ（Ｊ　）で０．１係
ナトリウムアシドを加え、冷蔵庫に保存する。

ｂ）親和性担体に対するヒトα−インターフェロンの可
逆的結合 工ＦＮ−α溶液をＰＨ７〜８、イオン強度０．１〜Ｑ、
５　Ｍ　Ｎａ（Ｊにおいて親和性カラムに通じる。イン
ターフェロンはカラムによって結合される。このカラム
を溶出液に蛋白質が認められなくなるまで０．０２　Ｍ
リン酸ナトリウム十〇−１５Ｍ　　ＮａＣＪＬで洗浄す
る。結合したインターフェロンの溶出は２５％　（ｖ／
ｖ）エチレングリコール中０．１Ｍクエン酸（Ｐｌ−１
２，２）によって実施する。溶出液を分画し、蛋白質を
含有する画分を集める。

以下に、大腸菌からの工ＦＮ−α２　（Ａｒｇ　）およ
びＮａｍａｌＷａ細胞からのＩＦＮ−α混合物について
得られた結果を°示す。

ａ）大腸菌からのＩＦＮ−α２　（Ａｒｇ　）担体：Ｊ
妃Ｂニー１セファローヌ４Ｂ 床容量＝６ｍ／ 適用量　　　　　　　１．２０ｘ１０９１００２．１ｘ
１０６非吸着量　　　　　０．１７ｘ１０９１４０．４
ｘ１０６酸性溶出液中含量　１．１０ｘ１０’　　９２
３８０ｘｌＯ６（ｘ１８０） ｂ）　　Ｎａｍａ１ｗａ細胞からの工ＦＮ−α混合物担
体：ＥＢニー１抗体−０Ｒ−セファロース４Ｂ床容量二
６ゴ 適用量　　　　　１４５Ｘ１０６１００　０．０７８Ｘ
１０６非吸着量　　　　　１０ｘ１０６　７　０．００
５ｘ１０６酸性溶出液中含量　１２７ｘ１０６８８　１
２７ｘｌＯ’（Ｘ１６３０） 例５ ４ｆｉ１３ニ一１抗体親和性カラムの酸性溶出液中に含
まれるＩＦＮ−αをさらに精製する場合、強酸性陽イオ
ン交換樹脂ＭＯＮＯ−Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）での
クロマトグラフィーを行うのが以下の理由により適当で
ある。

１、　酸性溶出液はさらに他の処理、たとえば透析等を
行わないでそのままクロマトグラフィーに付すことがで
きる。

２、　　ＥＢエニー抗体親和性クロマトグラフィーとＭ
ＯＮＯ−Ｓクロマトグラフィーを組み合わせると高純度
の工ＦＮ−αプレバレージョンが得られる。ＥＢエニー
抗体親和性カラムの溶出液をそのままＨＲ５１５型ＭＯ
ＮＯ−Ｓカラム上に直接送り、ＩＦＮをＭＯＮＯ−Ｓカ
ラムに吸着はせる。溶出けＰＨ勾配を用いて実施する。

これは２種の緩衝液を混合すればよい。

緩衝液Ａ：　２５％（ｖ／ｖ）プロパンジオール−１，
２中０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ＰＨ４，５）緩衝液
Ｂ：　２５％（ｖ／／ｖ）プロパンジオール−１，２中
０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）工ＦＮは鋭い
ピークとしてｐＨ５，５０＋　０．１０で溶出し、これ
は溶出液の２８０　ｎｍにおける吸収で確認することが
できる。溶出液を分画し、相当する両分を集める。

次に、大腸菌からのＩＦＮ−α２　（ｈｒｇ）およびＮ
ｏ　−３７細胞からの工ＦＮ−α混合物について得られ
た結果を示す。

ａ）大腸菌からの工ｐＮ−α２（Ａｒｇ）凡Ｂニー１抗
体カラム：　担体：ＣＨ−セファローヌ４Ｂ、床答量；
５０ゴ ＭＯＮＯ−Ｓカラム　二ＨＲ５１５型（容量１　ｍｌ　
）１、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦＰＬＯシステムに接続エ
ＦＮ　　　　　　　工ＦＮ巣位　　チ　　　　ェＦＮ単
位／ｉｎ９蛋白質（純度） ＫＢＩ−ｉ抗体クロ　　４．１３ｘ１［］９１００．０
　０８２ｘ１０６（ｘ３８５）マドグラフィー前 兄Ｂニー１抗体カラ　　３．９１ｘ１０９　９４．６　
３１６ｘ１［１６（ｘ３８５）ム溶出液 ＭＯＮＯ−Ｓカラム　２，４６ｘ１０９５９．６　５１
５ｘ１０６（ｘ２６８）ＰＨ５，５ピーク ｂ）グチレート処理、Ｓθｎｄａｉウイールス誘発Ｎｏ
　−３７細胞の工ＦＮ−α混合物 ＥＢニー１抗体カラム：担体；ＣＨ−セファロース４Ｂ
、床容量；５ｍ７ ＭｏＮＯ−ｆ３カラム：　　ＨＲ５１５型（容量ｉｍｐ
）、Ｐ１１ａｒｌＴ！ａ　Ｃｉａ　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｏシス
テムに接続ＥＢエニー抗体クロ　９０．６ｘ１０６１０
０　　　ＱＪ］４１ｘ１０６マトグラフイー前 ＥＢエニー抗体カラ　８３．９Ｘ釦６９３　　６０ｘ１
０６（ｘ１４６０）ム溶出液 ＭＯＮＯ−Ｓカラム　４７．４ｘ１０６５２　　１８０
ｘ１０６（ｘ４３９０）−５，５ピーク Ｎｏ−３７工ＦＮ−αの例におけるｐＨ５，５ピークは
非対称で、これらの細胞からのＩＦＮ−αが均一ではな
いことを示している。

例６ 要領Ｂに従って免疫処置したマウスの肺臓細胞と骨髄腫
細胞系Ｐ　３−　Ｘ　−６３Ａｇ３−６−５−３の細胞
との細胞融合から、上述の方法を用いて、工ＦＮα２　
（Ａｒｇ　）の抗つイールス活性をほぼ完全に中和する
細胞培養上澄液を与える雑種細胞系が単離される。この
雑種細胞系はＦＢＩ−２と命名され、抗体の安定した産
生を保証するために数回ザグクローシングを行う。細胞
系ＥＢエニーは細胞接養メジウム中ｉｎ　ｖｉｔｒｏで
も、またＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／ｃマウマウＥＢエニー細胞を
腹腔内注射後腫瘍としても培養できる。

雑種細胞系ＥＢエニー２は細胞培養液（たとえばＲＰＭ
工１６４０メジウム）中に永久にマウスエｇＧ１−抗Ｈ
ｕＩＦＮα抗体を合成し、これが細胞培養メジウム中に
分泌される。これらの分泌された抗体の濃度は細胞培養
メジウム中１００μｇ／ｍｌにまで達する。

この雑種細胞系ＥＥエニーは種特異的にＢＡＬＢ／ｃマ
ウス生体内でも腹腔内腫瘍として生育できて、この条件
下に同じくマウスエｇＧ　１−　抗ＨｕＩＦＮ−α抗体
を産生ずる。これらの条件下に、担腫瘍マウスから、１
ゴ中に１ｇＧ１０〜１５ダを含有する腹水液が得られる
。

第６表　ＢＡＬＢ／ｃマウス生体内における雑種細胞系
ＥＢエニーの生育 腹腔内　　　１５　　４／１０１　　９８％１０７細胞
　　　　　　　　　１０２　　９８％１０３　　９８チ ｉｏ’　　　ａｏチ １０５　２４％ 担腫瘍マウスの腫瘍で産生された腹水液中の工ｇＧ抗体
を、第６表に示すように、ＨｕＩＦＮα２（Ａｒｇ、大
腸菌からの組換えインターフェロン）の抗つイールス活
性の中和によって測定した。

体の単離 ＥＢＩ　−２から得られるＩｇＧは以下の精製工程によ
って単離される。

１、　硫酸アンモニウムによる分別沈殿２、ジエチルア
ミノエチルセルロースを用いるクロマトグラフィー 収量＝１００〜１５０ｍｇ工ｇＯ／ｉｔ細胞培養上澄液 例７ ！ 精製ＫＢニー２抗体の分子量は１５０，０００ダルトン
以上である（ポリアクリルアミドデル電気泳動によって
測定）。

ＥＢエニー２抗 にである（　０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙの二重拡散分析に
よって測定）。

ＥＢＩ−２抗体は黄色ブドウ球菌のＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ
によって結合される。ＥＥニー２抗体の活性はヤイの抗
マウス免疫グロブリン抗血清によって沈殿させることが
できる。

ＢＢニー２抗体の分子特性 分子量：　＞　ｉ　ｓ　ｏ，ｏ　ｏ　ｏダルトン種：マ
ウス 型：工ｇＧ１ Ｌ鎖：に 例８ ＫＢエージ雑種細胞からの抗体の生物学的特性の決定 ＥＢエニー２抗 ヒトインターフェロンα２亜型（　Ａｒｇ　）の抗つイ
ールス活性に対して中和作用を有する。ＥＢエニーＪＪ
ｉｌ’ｆ瘍をもつＢＡＬＢ／ｃマウスからの腹水液は１
，０００倍希釈でＩＦＮα２をほぼ完全に中和するが、
１万倍希釈では８０％、１０万倍希釈では２４％を中和
するにすぎない。

ＲｉＢニー２抗体は天然に産生されたインターフェロン
の抗つイールス活性に対して中和作用を示す。腹水液を
１万倍まで希釈しても、インターフェロンのα２亜型（
Ａｒｇ）の場合と同じ中和効果がある。ＦｉＢニー２の
腹水液を１０万倍に希釈すると、Ｗｉｅｎ−６７細胞か
らの天然産生インターフェロンは約５０％中和されるの
みである。

ＥＢエニー２抗 ルが完全に異なるのは、大腸菌からのインターフェロン
αＣ亜型およびＮａｍａｌＷａと血球（Ｏａｎｔｅｌｌ
）インターフェロン混合物の中和の場合である。すなわ
ち工ＦＮαＣ活性は濃厚腹水液（　ｇＢエニー２抗体の
濃度＞　１　ｍｙ／ｍ！　）でも中和されず、血球のイ
ンターフェロン混合物はわずか３　０　％　、　　Ｎａ
ｍａ１ｗａ細胞からのインターフェロン混合物は約５０
チ程度しか中和されない。

一部のインターフェロンゾレパレーションに対するＥＢ
エニー２抗 示す。

第２図は縦軸がインターフェロン活性の阻止率（％）、
横軸が腹水液の希釈によるＢＢエニー抗体濃度の希釈系
列を示している。１０−１の希釈が抗体濃度１ｍ９／　
ｒｎｌ！にほぼ相当する。

図中、・−・はＩＦＮ　ａ２　（　Ａｒｇ　）　：大腸
菌から（１）インターフェロンαＣ亜型（　Ａｒｇ）　
、◇−◇は工ＦＮαＣ：太腸菌からのインターフェロン
αＣ亜型、Ｑ−〇はヒトリンパ芽球細胞（　Ｗｉｅｎ　
−　６　７　）から自然に産生されたインターフェロン
、−はＮａｍａｌＷａ細胞からの１ＦＮα亜型の混合物
、マーマはヒト血球からの工ＦＮα亜型の混合物（Ｏａ
ｎｔｅｌｌインターフェロン）の場合を示す。

例９ 雑種細胞系ＥＢエニー３の製造および特性要領Ｂに従っ
て免疫処置したマウスの膵臓細胞と骨髄腫細胞系ｐ３−
ｘ−６３Ａｇ８−６−５−３の細胞との細胞融合から、
上述の方法を用いて工ＦＮα２　（　Ａｒｇ　）の抗つ
イールス活性をほぼ完全に中和する細胞培養上澄液を与
える雑種細胞系が単離される。この雑種細胞系はＥＢエ
ーロと命名され、抗体の安定した産生を保証するために
数回サグクローニングを行う。細胞系ＥＢエニー３は細
胞培養メジウム中ｉｎ　ｖｉｔｒｏでも、またＢＡＬＢ
／Ｃ！　マウスにＥＢＩ　−　３細胞を腹腔内注射後腫
瘍としても培養できる。

雑種細胞系［Ｊ３ニー３による工ｇＧ産生雑種細胞系Ｅ
Ｂエーロは細胞培養液（たとえばＲＰＭＩ　１　６　４
’　０メジウム）中に永久にマウスＩｇＧ６抗Ｈｕ工Ｆ
Ｎα抗体を生成し、これが細胞培養メジラム中に分泌さ
れる。これらの分泌された抗体の濃度は細胞培養上澄液
中１００μ９　／　ｒｎｌにまで達する。

この雑種細胞系ＥＢエーロは種特異的にＢＡＬＢ／ｃマ
ウス生体内でも腹腔内腫瘍として生育でき、これらの条
件下でも同様にマウスエｇＧ３抗ヒトα−インターフェ
ロン抗体を産生ずる。これらの条件下に、担腫瘍マウス
から、１ゴ中に１ｇＧ　１０〜１５Ｉｎ９を含有する腹
水液が得られる。

第４表　ＢＡＬＢ／Ｃマウス生体内における雑種細胞系
ＥＢエーロの生育 Ｈｕ工ＦＮα２ 投与経路　　投与後日数　腫瘍率　腹水希釈度　（Ａｒ
ｇ）活性腹腔内　　１４　　４／　　　１０１　＞９８
％１０７細胞　　　　　　　　　　　　　　１０２　　
＞９８％１０３　　＞９８％ ｉ０’＞９８％ １０５　　４３％ 雑種細胞系ＥＢエーロのマウスエｇＧ抗ＨｕＩＦＮα抗
体の単離 ＫＪ３Ｉ−３抗体は以下の精製工程によって単離される
。

１、　硫酸アンモニウムによる分別沈殿２、ジエチルア
ミノエチルセルロースを用いるクロマトグラフィー 収量：１００〜１５０〜ＩｇＧ／ｌ細胞培養上澄液例１
０ 精製ＦＢＩ　−３抗体の分子量は１５０．０００ダルト
ン以上である（ポリアクリルアミドデル電気泳動によっ
て測定）。

ＦＢＩ　−３抗体は工ｇＧ　３型で、Ｈ鎖はγ６、Ｌ鎖
はにである（　０ｕｃｈｔθｒｌｏｎ７の二重拡散分析
によって測定）。１！ｉＢニー　３抗体は黄色ブドウ球
晶のＰｒｏｔθｉｎ　Ａによって結合される。ＥＢエー
ロ抗体の活性はヤギの抗マウス免疫グログリン抗血清に
よって沈殿させることができる。

ＦｉＢエーロ抗体の分子特性 分子量：）１５０．０００ダルトン 種：マウス 型：工ｇＧ６ Ｈ鎖：γ３ Ｌ鎖：に 例１１ ＦＢＩ　−３抗体は大腸菌に産生させた、純粋なインタ
ーフェロンα２亜型（Ａｒｇ　）の抗つイールス活性に
対して中和作用を有する。ＥＢエーロ腫瘍をもつＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスからの腹水液は、１万倍希釈でＩＦＮα２
　（Ａｒｇ　）をほぼ完全に中和するが、１０万倍希釈
では４６チしか中和しない。

ＦＢＩ−３抗体はＷｉｅｎ−６７細胞に自然に産生　。

したインターフェロンに対しても同様の中和作用を示す
（「自然に」とは、インターフェロン誘発因子を添加し
なくても細胞によってインターフェロンが生成される場
合を指す）。ＫＢエーロ抗体は大腸菌からのインターフ
ェロンαＣ亜型を中和するが、活性はＥＢニー１抗体の
場合と異なっている。

Ｓθｎｄａｉウイールス誘発ＮａｍａｌＷａ細胞および
５ｅｎｄａｉウイ一ルス誘発血球細胞（Ｃａｎｔｅｌｌ
インターフェロン）のインターフェロン混合物はＥＥエ
ーロ腹水液の１００倍希釈液によって約６０％中和され
る。一部のインターフェロンに対するＥＢエーロの活性
スペクトルを第６図に示す。

第６図は縦軸がインターフェロン活性の阻止率（チ）、
横軸が腹水液の希釈によるＥＢエーロ抗体濃度の希釈系
列を示している。１０−１の希釈が抗体濃度１　ｍ９７
　ｍ、ｌにほぼ相当する。

図中、・−・は工ＦＮα２（Ａｒｇ）：大腸菌からのイ
ンターフェロンα２　亜ｆＪ　（Ａｒｇ）　、◇−◇は
ＩＦＮαＣ：大腸菌からのインターフェロンαＣ亜型、
○−○はヒトリンパ芽球細胞（Ｗｉｅｎ　−６７）から
自然に産生されたインターフェロン、−は誘発、Ｎａｍ
ａ１ｗａ細胞からの工ＦＮα亜型の混合物、マーマはヒ
ト誘発血球細胞からのＩＦＮα亜型の混合物（Ｃａｎｔ
θ１１インターフェロン）の場合を示す。

例１２ 決定 亜型の分離： 原理：ＰＨ範囲７．１〜４．０におけるＭＯＮＯ−Ｐカ
ラム（ＭＯＮＯ−Ｐ　　ＨＲ５／２０型、：ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ。

ＵｐｐＳａｌａ　ｊＪｌ　）上のクロマトフオーカシン
グ亜型混合物を２５％（ｖ／ｖ）　１　、２−プロパン
ジオール／水中０．０２５　Ｍ　　Ｂ１５−ｔｒｉｓ　
（’Ｓｉｇｍａ　Ｂ９７５４）−イミノージ酢酸（Ｓｉ
ｇｍａ工５６２９）、Ｐｌ−１７，１に対して透析し、
ＭＯＮＯ−Ｐカラム上に吸着はせる。カラムはＰｈａｒ
ｍａｃｉａ　ＦＰＬＯシステムに接続させて使用する。

カラムに吸着された亜型混合物をＰＨ勾配によって浴出
させる。この目的には２５　％　（ｖ／ｖ）　１　、２
−プロパンジオール中Ｐｏ１ｙｐｕｆｆｅｒ　７４　（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）をイミノーゾ酢酸でｐＨ４，０
に調整し、この混合物をＭＯＮＯ−Ｐカラムに送る。溶
出液を分画し、各両分の用値とインターフェロン含量を
測定する。

第４Ａ図は日ｅｎｃＬａｉウイールス感染Ｎａ１ｌｌａ
ｌＷａ細胞によつで産生された混合物からの工ＦＮ−α
亜型の分離を示す図である。これから、第４八図中に陰
影を付して示した両分をとり、前述した方法に従って、
モノクロナール抗体ＥｉＢニー１．ＩｕＢニー２および
ＥＢエニーの中和試験を実施した。第４Ｂ図はその各成
分が各抗体と特徴的に反応することを示している。要約
すれば次のとおりである。

１、　　ＥＢエニー、２および６抗体はＭＯＮＯ−Ｐカ
ラムによ９μｍ５．８で溶出された工ＦＮα亜型の抗つ
イールス活性を、いずれも事実上１００％阻害する。

２、　　ＥＥエニー、２および６抗体はＭＯＮＯ−Ｐカ
ラムにより　ｐｉ（５，５で溶出されたＩＦＮα亜型の
抗つイールス活性を、それぞれ４２．６７および４０％
阻害する。

３、　　ＢＢエニー、２および６抗体はＭＯＮＯ−Ｐカ
ラムによりｐｉ（５，２５で溶出された工ＦＮα亜型の
抗つイールス活性を、それぞれ９８．４４および９８チ
阻害する。

４、　　ＫＢエニー、２および６抗体はＭＯＮＯ−Ｐカ
ラムによりＰＨ５，０で溶出された工ＦＮα亜型の抗つ
イールヌ活性を、それぞれ、９８．２０および９８９ｇ
阻害する。

５、　ルＢニー１も２も、またＦｉＢエーロも、ＭＯＮ
Ｏ−Ｐカラムによ、９　ｐＨ４，８で溶出された１ＦＮ
α亜型の抗つイールヌ活性は阻害しない。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第６図は、各種インターフエロン
グレパレーションに対するそれぞれ本発明ＥＢエニー、
ＥＢエニーおよびＥＢエーロ抗体の中和活性のスペクト
ルを示す図であり、第４図は本発明ＥＢエニー、ＥＢエ
ニーおよびＥＢエーロ抗体を用いて、　　Ｎａｍａ１ｗ
ａ細胞からのヒトインターフェロンα亜型を分画した図
であシ、第４Ｂ図は第４Ａ図の陰影を何した画分につい
てそれぞれＫＢエニー１．１ｊＢＩ　−２およびＥＢＩ
　−３抗体による中和試験を行い、各画分の抗つイール
ス活性の各抗体による阻害率を調べた結果である。 図面の浄書（内容に変更なし） 狛１図 腹　水　５夜　布　釈　度 第２図 腹水液柘釈度 第３図 腹水〉夜布釈度 第４Ａ図 分画 第４Ｂ図 ＩＩ［１１！ｉ７Ｖ オーストリア国ウィーン・ヒラ ジンガー・ハウプトストラーセ ４０ビー 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和　５９年１．ンγ１願第　　３０１３５　　　号２
、発明の名称 ３、補正をする者 １１’ｌとの関係　乃１、′］出願人 ４、代理人 ８、袖ｉ［の内容　　別紙のとおり 図面の６□１′ｌ（（内容に変更なし）手続補正書（睦
） 昭和５９年３　月３０口 特許庁長官殿 １．１Ｃ件の表示 １１１（和５９　＋ｒ：ｑ、１ｒご１願第３０１３５　
　号２、発明の名称 免疫グロブリン産生雑種細胞系 ３、補＋１をする者 １Ｂ件との関係　１１ｒＪ’＋出願人 ５、補＋Ｉ命令の１−１イ４ 昭和　　年　　月　　日 ”、ｈｌｉｊＴ：により増加する発明の数８、袖１にの
内容　　別紙のとおり （１）明細書、７頁７行の［゛６６％許請求の範囲」ｋ
「６９発明の詳細な説明」に訂正する。 （２）、同書、９頁６〜７行の「α−インター　フェロ
ンまたは」を、および８行の「選択的」を削除する。 （３）　　同書、１０頁２〜３行の「膵臓細胞から・・
・・・・に除去し、」を「膵臓細胞な膵臓組織から機械
的に遊離し、」に訂正する。 （４）　　同書、１１頁３行の１２％」を「２０％」に
訂正する。 （５）同書、１３頁１０行の「細胞豆果」を「細胞系」
に、および１３行の「豆果」を「細胞系」に訂正する。 （６）　　同書、１５頁４〜５行の「アジュバントとと
もに」を「１アジユバントを使用することなく」に訂正
する。 （７）同書、１６頁６〜８行のｌ’−Ｎａ−３７細胞か
らの・・・・・・・・・インキュベートする。」を削除
する。 （８）　　同書、２１頁５行のｒ１５０．０００ｊの前
に［≧」を加入する。 （９）同書、２９頁１１行の「イオン強度」を「イオン
濃度」に訂、正するＯ ａ■　同書、６３頁の表中の最左欄末行の「（×２６８
）Ｊをｒ（Ｘ６２Ｂ）ｌに訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ヒトα−インターフェロンで免疫処置された
   マウスの肺臓細胞を骨髄腫細胞と細胞融合させて得られ
   、ヒトα−インターフェロンに対する抗体を産生ずるこ
   とを特徴とするｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ
   で培養可能な雑種細胞系。 （２）使用する肺臓細胞はＢＡＬＢ／ｃマウヌ由来、使
   用する骨髄腫細胞は細胞系Ｐ　３−　Ｘ　−６３Ａｇ３
   −６−５−３由来の特許請求の範囲第１項記載の雑種細
   胞系。 （３）永久にＦＢＩ　−１抗体を合成する特許請求の範
   囲第１項および第２項のいずれかに記載の雑種細胞系Ｅ
   Ｂエニー。 （４）永久にｈＢｘ　−２抗体を合成する特許請求の範
   囲第１項および第２項のいずれかに記載の雑種細胞系Ｅ
   Ｂエニー。 （５）永久にＥＢエーロ抗体を合成する特許請求の範囲
   第１項および第２項のいずれかに記載の雑種細胞系ＢＥ
   Ｉ　−３゜ （６）　　ヒトα−インターフェロンの活性を完全また
   は部分的に中和することを特徴とするモノクロナール抗
   体。 （７）　　ａ）　分子１１５０，０００ダルトン以上、
   ｂ）Ｈ鎖がγ１、Ｌ鎖がｃ、ｃ）　　黄色ブドウ球菌Ｐ
   ｒｏｔｅｉｎ　Ａによって結合されｔｄ）　　大腸菌産
   生ヒトα２１ンターフエロン（Ａｒｇ　）の抗つイール
   ヌ活性に対して中和作用を有し、θン　誘発因子の非存
   在下、ヒトリンパ芽球細胞に自然に生成するα−インタ
   ーフェロンの抗つイールス活性に対して中和作用を有し
   、ｆ）　　ヒトα−インターフェロンの各種亜型の天然
   混合物の抗つイールス活性に対して部分的中和作用を有
   し、ｇ）１，０００倍希釈下にαＣ−インターフェロン
   の抗つイールス活性を約９０％まで中和する作用を有し
   、ｈ）ヒトβ−インターフェロンには中和作用を示さず
   、１）ヒトγ−インターフェロンには中和作用を水源ず
   、かつｊ）マウスインターフェロンには中和作用を示さ
   ない特許請求の範囲第６項記載の工ｇＧ　１型モノクロ
   ナ一ル抗体ＥＢニー１゜ （８）　　ａ）　　分子量１５０，０００ダルトン以上
   、ｂ）Ｈ鎖はγ１．Ｈ鎖はに、Ｃ）黄色ブドウ球菌のＰ
   ｒｏｔｅｉｎ　Ａによって結合され、ｄ）大腸菌産生ヒ
   トα２−インターフェロン（Ａｒｇ　）の抗つイールス
   活性に対して中和作用を有し、ｅ）誘発因子の非存在下
   、ヒトリンパ芽球細胞に自然に生成するα−インターフ
   ェロンの抗つイールヌ活性に対して中和作用を有し、ｆ
   ）　　ヒトα−インターフェロンの各種亜型の天然混合
   物の抗つイールス活性に対して部分的中和作用を有し、
   ｇ）　　αＣ−インターフェロンに対しては中和作用を
   示さない特許請求の範囲第６項記載のＩＱＧ　Ｉ型モノ
   クロナール抗体ＥＢニー２゜ （９）　　ａ）　　分子量１５０，０００ダルトン以上
   、ｂ）Ｈ鎖はγ３、Ｌ鎖はに、Ｃ）黄色ブドウ球菌のＦ
   ｒｅｔθｉｎ　Ａによって結合され、ｄ）大腸菌産生ヒ
   トα２−インターフェロン（ｈｒｇ）の抗つイールス活
   性に対して中和作用を有し、ｅ）誘発因子の非存布下、
   ヒトリンパ芽球細胞に自然に生成するα−インターフェ
   ロンの抗つイールス活性に対して中和作用を有し、ｆン
   　　ヒトα−インターフェロンの各種亜型の天然混合物
   の抗つイールス活性に対して部分的中和作用を有し、ｇ
   ）１，０００倍希釈下にαＣ−インターフェロンの抗つ
   イールス活性を約９０係まで中和する作用を有する特許
   請求の範囲第６項記載の工ｇＧ　３型モノクロナ一ル抗
   体ＩｇＧ６゜ （＋ｃ）　　Ｉ＄抗体を産生ずる雑種細胞系を細胞融合
   によって製造し、サグクローニングを行い、細胞生育後
   に抗インターフェロン特異性を有するＩｇＧ抗体を単離
   することを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の抗ヒ
   トα−インターフェロン特異性を有する工ｇＧ抗体をマ
   ウス生体内で製造する方法。 αめ　ヒトインターフェロンに対して免疫処置したマウ
   ス由来の肺臓細胞と骨髄腫細胞を細胞融合に使用する特
   許請求の範囲第１０項記載の製造方法。 （６）骨髄腫細胞としては細胞系Ｐ６〜Ｘ　−６３Ａｇ
   ３−６−５−３を用いる特許請求の範囲第１１項記載の
   製造方法。 α１　肺臓細胞として、ヒトイ、ンター７エロンに対し
   て免疫処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスの細胞を用いる特
   許請求の範囲第１１項記載の製造方法。 ０Φ　ヒトインターフェロンとしてヒトα−インターフ
   ェロンを用いる特許請求の範囲第１１項および第１６項
   のいずれかに記載の製造方法。 α→　ヒトα型インターフェロンを工ｇＧ抗体親和性カ
   ラムクロマトグラフィーによって精製することを特徴と
   するヒトインターフェロンの精製方法。 θｆＪ　　］：ｇＧ抗体親和性カラムクロマトグラフィ
   ーによって精製したインターフェロンをついで酸性陽イ
   オン交換樹脂を用いて精製する特許請求の範囲第１５項
   記載の精製方法。 α７Ｉ　　％許請求の範囲第９項記載のように製造され
   たｘｇ、ａ抗体を担体に共有結合的に結合される抗体と
   して用いる特許請求の範囲第１５項記載の精製方法。 ０椋　活性化セファロースを担体として用いる特許請求
   の範囲第１６項記載の精製方法。 αｌ　　ＭＯＮＯ−Ｓクロマトグラフィーカラムを陽イ
   オン交換樹脂′として用いる特許請求の範囲第１６項記
   載の精製方法。 （イ）　２つの精製工程はいずれかの順序で続けて実施
   する特許請求の範囲第１５項から第１９項までのいずれ
   かに記載の精製方法。 Ｑη　特許請求の範囲第１０項の記載に従って製造され
   た工ｇＧ抗体を活性化担体に共有結合させること奮特徴
   とするＩｇＧ抗体親和性担体の製造方法。 に）　ａ）抗体のα−インターフェロン結合およびａ−
   インター７二ロ／中和活性の両者を使用するヒトα−イ
   ンターフェロンの検出、ｂ）結合および抗つイールヌ活
   性の中和における差によるヒトα−インターフェロン亜
   型の鑑別診断、ｃ）　　ヒトα−インターフェロンの各
   亜型およびα−インターフェロンの亜型混合物の精製な
   らびに他の型のインターフェロンからの分離のだめの特
   許請求の範囲第６項から第９項までのいずれかに記載の
   モノクロナール抗体の利用。 （ハ）特許請求の範囲第６項から第９項までのいずれか
   に記載のモノクロナール抗体を、各抗体それ自体で、た
   がいに任意の所望の組み合わせで、他の１側坑体とたが
   いに接合させ、他の１側坑体と接合させあるいは抗体の
   多価混合物と接合させて使用するヒトα−インターフェ
   ロンの検出、診断または精製への利用。