JPS59203494A - Ｎα−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラ−ゼおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は公知のアミノアシラーゼとは種々な性質におい
て異なる新規な醇県Ｍ−力ルポベンゾキシアミノ酸アミ
ドヒドロラーゼおよびその製法に関する。

アミノアシラーゼはツノミノ酸のα−アミノ基がアシル
化されたＷ−アシルアミノ酸の酸アミド結合に作用しア
ミノ酸とアシル基に相当する脂肪酸を生成する反応を触
媒する酵素である。またヒプレートヒドロラーゼ、ある
いはヒブリカ−１と呼称される酵素はアミノアシラーゼ
の一種であり、ヒブリン酸、即ち安息香酸とグリシンが
酸アミド結合で脱水縮合した化合物に作用し、安息香酸
とグリシンを生成する反応を触媒する酵素である。

一般的に、これら酵素をず一アシルーＤ［−アミノ酸混
合物に作用さけると選択的にＭ−アシル−Ｌ−アミノ酸
を加水分解づることができる。この原理に基づき、アシ
ラーゼは光゛７純疫の高い１−アミンの製造工程に実用
化されている。微生物により生産されるアミノアシラー
ゼは既にいくつか発明され、また実用化されているが、
これら既知のアシラーゼとは異なる新規なアミノアシラ
ーゼを提供することは、アミノ酸、ペプチド、医薬品原
料、試薬等の製造において重要な課題の−っＣ゛あり、
また酵素化学或いは分析化学等の見地からも重要視され
る課題である。

従来、Ｌ−アミノ酸のα−アミ７塁がアシル化されたＷ
−アシルアミノ酸を加水分解する酵素は＋４１ｉ乳動物
の各組織、カビ、細菌、放線菌、各種の植物種子などに
存在することが知られており、特に豚腎皮質由来のアミ
ノアシラーゼ［Ｊ、Ｂｉｏｌ。

ＣＣ１１ｅ、、１史１．４５５　＜１９５２）Ｊは箸名
である。微生物起源ではアスペルギルス（Ａ　ｓｐｃｒ
ｇｉｌｌｕｓ）またはリゾプス（Ｒｔ＋１ｚｏｐｕｓ　
）屈［３ｕｌｌ　、Ａｇｒ、ＣＣ１１ｅ　、　Ｓｏｃ、
　Ｊｐｎ、　、　１１゜２９１．２９６，３００．３０
４　（１９５７）］、二’Ｊリネバクテリウム（Ｑ　ｏ
ｒＶｎｅｂａｃ＋ｅｒｒｕｍ）属［特公昭４９−１３９
８９号］、シュートモツース（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　）属［特公昭５６−４３３　：）３号ｊ、ラクトバシ
５　ス（Ｌ　ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属［Ｊ。

Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｃｍ　、　、　２３５．３１９３　
（１９（５０）」、ス１〜レブ１〜ミレス（Ｓ　ｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　）属［特開ｆｉｌ（５３−５９０９
２Ｎ　］等が知られ′（いる。これら既知の７ミノアシ
ラーゼ類は種々なアシルアミノ酸に分解作用を有でるが
、アミノ酸のα−７ミノ基がカルボベンゾキシ基で保護
された化合物、即らＭ−カルボベンゾキシアミノ酸には
全く作用しない。

そこで本発明者は、かかる現況にｚｌみＭ−カルボベン
ゾキシアミノ酸に作用づ−る酵素の検索を目的として広
く微１．［物の培養物を検１１」シた結果、乳酸菌にＢ
するｌＩｌ菌の培養物にＭ−カルボベンゾシアミノ酸に
作用する活性を発見し／Ｊ、、この活性因子につき鋭意
研究を重ねた結果、従来に報告例を見ない新規な酵素を
見出し、Ｎ″　　カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒト
ロラーぜと命名した。本発明はこの発見に幇づいで完成
されたもの（・ある１゜即ち、本発明は一般式； ％式％ ［式中、Ｒ１はカルボベンゾキシ基またはヘンゾイル阜
、および）犬２は水素、メブル基、またはヒドロキシメ
チル基を表わり］ぐ表わされる化合物に作用し、ｉｌラ
ニン、セリンまたはグリシンとペンシルアルニ】−ルま
たは安息香酸を生成する醇崇Ｗ−カルボヘンゾギシアミ
ノ酸アミドヒドロシーＩｚ　（１３Ｊ、びくの１払【こ
関り−る。

本発明酵素はラフ１−バシラス属に属する菌株から生産
されることが解った。菌株はイーカルボベンゾ−１−ジ
アミノ酸アミドヒドロラーゼ生産能を右４る細菌であれ
ぽいかなる菌株でもＪ：＜、またこれ宿の菌株の変種も
しくは変異株でもよい。そし−（ラクトバシラス属に属
゛する上記菌株の具体例としてしよ、ラクトバシラス・
カゼイ（Ｌａｃｔｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃａｓｃｉ
　）が挙げられる。なお、本菌株はアメリカン・タイプ
・カルチュアー・コレクシ−＄　ン　（Ａ　ｍｃｒｉｃ
ａｎ　　　　Ｔ　ｙｐｅ　　　　Ｃｕｌｔｕｒｅ　　　
Ｃｏｆ　　−１ＱＣｔｉＯ１１＞に寄託されているもの
であり、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌ　ａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　　ｃａｓｅｉ　）△ｒＣＣ７４６９である
。

本発明において、Ｗ−カルボベンゾキシアミノ酸アミド
ヒドロラーゼ生産菌を使用しＭ−カルボベンゾキシアミ
ノ酸アミドヒドロラーピを製造づるにあたっ−Ｃ用いら
れる培地は、通常の乳酸菌の培養に用いられる培地が挙
げられる。即ち、Ｗ−カルポベンゾキシアミノ酸アミド
ヒドロシーゼ生産菌が寅化しうる炭素踪、窒素源および
無機塩、更に必要ならば微開栄養素を含イｊ（Ｊる・ｂ
のであればよい。

炭素源としては、例えばグルコース、ノック１−−ス、
ラクトース、シュークロース、ｆ−ｉストリン、澱粉加
水分解物、麦芽エキス、廃糖蜜等の炭水化物、クエン酸
、コハク酸、ノマール酸、耐酸等の有機酸類およびマン
ニ１〜−ル、グリレリン等のアルコール類が用いられる
。培地の窒素源としては資化しうる窒素化合物またはイ
れを含有するものであればよく、例えばポリペプトン、
肉エキス、大豆等の蛋白質の加水分解物、各種アミノ酸
類、アンモニウム塩、硝酸塩等が用いられる。その他、
無機塩としては、例えばマンガン、リン酸、カリウム、
マグネシウム等の無機塩類が適宜用いられ、または有機
微量栄養素としてアミノ酸、ビタミン、プリン塩基およ
びこれら４！：８右りるペプトン、酵母エキス等が適宜
用いることかできる。

菌の培養は静置培養で行なう。入量培養などの工業的生
産には攪拌深部培養が好適であるが、通気攪拌培養、浸
透培養等の好気的条件上に１８薔Ｊること１：）できる
。培養温度は３０〜４０℃、好ましくは３７Ｊイ」近で
あり、培地ｐ　Ｈは８　”　５　％好ましくは７．０付
近である。培養時間は培養形態によっでも異なるが、通
常１４〜１７時間モある。

本発明のＷ−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒトロラ
ーゼはＷ−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラー
ゼ生産菌の培養液中および菌体内に存在り−るか、その
大部分は菌体内中に存在４−る。

培養時間を長＜ツ゛ることにより自己消化を引起しず−
カルレボベンゾ４ジアミノ酸アミドヒドロラーゼを培養
液中に遊離させることもできる。

本発明のＭ−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒトロラ
ーＣを培養物から抽出、精製するには通常の耐糸蛋白質
抽出、精製法を適用することかできる。

例えば、遠心分離法などの適当な操作により培養物から
菌体を集めた後、その菌体をガラスピーズなどの適当な
摩耗剤とともに機械的に破砕りる方法、超音波照射によ
って破砕りるブノ法、ルンチプレスを用いて破砕Ｊ−る
方法、リゾチーム等の溶菌酵素を用いる方法、またはオ
スしラーインクショックを起用する方法等により菌体を
破砕りるか、または水あるいは生理食塩水もしくは緩衝
液中に菌体を懸濁し、トルエン等の存右−ド（・放置も
しくは浸透して抽出した後、該溶液を遠心介助法などの
適当な操作により不溶物を除去し、これをそのまま粗酵
素液として得る。また通常の蛋白１．’ｌｉ　ｉ１１縮
り法、例えば粗酵素液を凍結乾燥づる方法、あるいはエ
タノール、アセトン、イソブ［」パノール等の有機、８
媒を用いる分別沈澱による方法、もしくは硫酸アンモニ
ウム等の塩類を用いる塩析を１１なった後限外濾過膜あ
るい（よ中空糸膜もしく番よコ［１ジオン膜等を用いる
透析操作をイーＪなう方法等を適宜選択して実施り−る
ことにより粗酵素粉末を智ることができる。

上記の粗酵素液もしくは粗酵素粉末より精製酵素を分取
づるには、イオン交換、ゲル濾過、吸る、電気泳動、ア
ノイニテイクロマトグラフイー′、９を適宜組合せて行
なう。

例えば、ジＪチルアミノエチル−セフンノ−ノ゛ツクス
などのイオン交換体を用いるイオン交換り１］７１〜グ
ラノイー法、アミンへキシル−レフｊ７［」−スもしく
はヒドロ４シアパタイ１−等の吸着体を用いる吸名りロ
ンｊ〜グシフィー法、ヒフｊ７デツクスあるいは七７７
０−スもしくはせ）７１クリルなどの親水性担体を用い
るゲル濾過法、ポリアクリルツノミドゲルあるいはキレ
リアーアンフＡライトなどを用いる電気泳動法、適当な
りガント化合物を化学結合ざヒＩζ親水性１υ体を用い
るアフィニテｒクロア１−グラフィー法、分子篩膜ある
いは中空糸膜等を用いる分子猷分画法等を適宜選択し、
これらの方法を組み合わけて行なうことにより、精製さ
れた本酵素を１（ｆることができる。

本発明新規酵素の典型的な製法およびその採取方法は、
例えばラクトバシラス属のず−カルボベンゾキシアミノ
酸アミドヒトロラーげ佳産能を右”す゛る菌株、例えば
ンク１〜バシラス・カゼイを培養し、培養菌株を集めて
中性ｐ　ｔ−１の緩衝液中で破壊し、破壊抽出液を塩析
し、沈澱物を中性ｐ１−１の緩衝液に溶解後、同緩衝液
で透析づ−ることによつＣ１該酵素抽出液を得る。この
抽出液は必要により以下の方法で精製してもよい。例え
ば、」−記抽出液をアニオン交換能を有するデキストリ
ンまたはＬル１コース誘導体等で充填したカラムを用い
、液体クロマｌ−グラフィーにかけ、イの活性画分を採
取する。ざらに限外濾過し、その濃縮液を採取しＣもに
い。必要ならば、十記限外応過濃縮液を吸着カラムクロ
マトグラフィーにか４）、　’ｆ’、の粘付１曲分を適
当な方法、例えば適当な有機溶剤を用いて分別沈澱させ
、濃縮してもよい。さらに生成を波づるときは、これを
１ないしそれ以−Ｌのグル応過クロマトグラフィーで分
別し、活性画分を採取してもよい。

上記の製法は最も好ましい方法であるが、本発明方法は
これに限定されるものではなく、適当な変更、例えば工
程の一部を他の方法（パ代替づ−るか、工程の一部を省
略しＣもよい。工程の代替、イ・」加おＪ、び削除は、
菌株の培養条件、種類、副任成物、双晶される純度等に
応じて適宜選定づればよい。

上記の方法で得られる新規なＭ−カルボベンゾキシアミ
ノ酸アミドヒドロラーゼは下記に記載される特徴を有し
、微生物または１−１ｊ乳動物の組厭縛るいは植物種子
から採取される公知のアミツノ７シラーゼとは明確に区
別される。ずなわら、これら公知の酵素はアミノ酸のα
−７ミノ基がアシル化されたＷ−アシルアミノ酸に作用
し、そのアシル阜部分に相当づる脂肪酸とアミノ酸を生
成゛りる反応を触媒するが、アミノ酸のα−アミノ基が
カル１１ζベンゾキシ化されたＶ−カルボベンゾキシア
ミノ酸類には全く作用しない。これに反し、本発明のＭ
〜カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロラーゼはＭ−
カルボベンゾキシアミノ酸に極めて高い分解作用を示し
、更にアミツノフシラーゼ類一般の好適な基質であるＮ
’−アシルアミノ酸に全く分解作用を示さない。以上の
知見より本発明の酵素は公知の何れのアミノアシラーＬ
とも明確に区別することができ、新規な酵素と認められ
る。

以下に本発明の酵素Ｍ−カルボベンゾ１ジアミノ酸アミ
ドヒドロラーゼの理化学的性質を記載づる。

（１）作用 Ｗ−カルボベンゾキシグリシンに作用し、その反応産物
としてベンジルアルロールとグリシンを生成り−る。Ｉ
Ｖ”　−７Ｊルボベンゾー１−シ　ｌ−ノ’シニンに作
用し、その反応産物としてヘンシルアル］−ルとアラニ
ンを生成Ｊ−る。Ｎ’−カルボベンゾキシ−し−セリン
に作用し、その反応産物としＣベン。

ジルアルコールどレリンを生成Ｊる。

グリシンまたはアラニンのα−ノアミノ基がベンゾイル
化された化合物、即ら、Ｍ−ヘンジイルグリシンまたは
Ｗ−ベンゾイル−Ｌ、　−７ラニンにも分解作用を示し
、その分解゛反応の産物として安Ｊｉｔ香酸とグリシン
またはアラニンを生成づ−る。

（２）基質特異性 グリシン、し　−アラニンならびにＬ　−セリンのα　
アミノ基がカルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、核置換
基を有するカルボベンゾキシ基、または核置換基をイｊ
？Ｊるベンゾイル基で保護された化合物に作用する。

グリシンあるいはＬ−アラニンのα−アミノ、Ｉ：ｔが
アセチル化された化合物、即ち、Ｗ−アセチルグリシン
、Ｍ−アレチル−Ｌ−アラニンには全く作用ゼず、本酵
素にはアミノアシラーゼ様作用を小さない。

Ｍ−カルボベンゾ４−シーＤ−アラニン、まノｃはＷ−
ベンゾイル−Ｄ−アラニンを基質として用いた１、１、
該化合物のＬ体の場合と異なって、本酵素は全く作用せ
づ゛、その分解作用はし１体アミノ酸を含イｊＳｌる化
合物に特異的である。

グリシンのα−アミノ基が上記以外の基で保護された化
合物、例えばＷ−小ルミルグリシン、Ｎ″ツノ上ルアレ
デルグリシン、Ｎ”−１）−二トロノ１ニルアレプルグ
リシン、Ｎ″−２，４−ジニト］］フ」、ニルグリシン
、ｒ−ｔ−リフェニルグリシン、Ｗ−フタリルグリシン
、Ｎ’−１−リルスルホニルグリジン、あるいはｒ−ｔ
　−１トキシ力ルポニルグリシン等には全く作用′ｔ！
ず、Ｌ−アラニンの場合においても同様のＩＣ保護され
た化合物には全く作用しない。

Ｗ−カルボベンゾキシグリシンのカル小−１シル基がア
ミノ酸残塁以外で保護された化合物、例えばず−カルボ
ベンゾキシグリシル、メチルゴスノル、Ｗ−カルボベン
ゾキシグリシンフミド等にはほとんど作用を示さない。

またグリシンがアミノ未ＮＭｉ　（ｉンにイ）装置りる
ペプチドであり、そのペプチド中のグリシン残基のα−
アミノ基がカルボベンゾキシ基で保護された化合物を基
質として用いたＩＩ、１、本酵素はＭ−カル小ペンゾギ
シグリシルグリシンに作用しグリシン残基間のペプチド
結合の開裂が認められたが、その他の化合物、例えばＷ
−カルボベンゾキシグリシルーし一ロイシン、Ｍ−カル
ボベンゾキシグリシル−グリシル−し−プロリン、Ｍ−
カルボベンゾキシグリシルグリシルグリシン、Ｎ”−カ
ルボベンン゛１ジグリシルグリシル−Ｌ−フェニルアラ
ニンまたはＭ−カル小へンゾキシグリシルグリシル　１
−ヒリン弯（こ（よ仝りｖｌ：用し４ヱい。そしてグリ
シンがツノミノ末端位に位置り−るペブＪ−ドであり、
そのへゾチド中のグリシン残基のα−アミン基がベンゾ
イル基で保訝された化合物、例えばＭ−ベンゾイルグリ
シルグリシンあるいはＭ−ベンゾイルグリシル−１，−
ヒスデジル−し−ロイシン等にははどんどイ′１用しイ
ｒい。

グリシンをカルボキシル末端位に含むジペプチド、例え
ばし−アラニル−グリシン、Ｌ−チロシルグリシン、１
−一〕１ニルアラニルーグリシンあるい【、Ｌクリシル
グリシン等には全く作用しない，。

、Ｌｌごグリシンがアミン末端位に位置ｄるジペプチド
、例え（、丁グリシル−［−ロイシンあるいはグリシル
　Ｌ−）、Ｌニル）アラニンにも全く作用しない。

グリシンまたは１−〜アラニンあるいはし一ゼリン以外
の天然型アミノ酸のα−アミン基がカルボベンゾ−１シ
基、ベンゾイル基、またはアレチル基で保護された化合
物には全く作用しない。

本酵素の種々な基質に対する活性を第１表に示Ｊ．なお
、第１表中の相対活性はＷ−カルボベンゾキシグリシン
に対する分解活↑１Ｆを１００どした時の活性比で示し
たものである。

第１表 （３）１９価の測定法 ０．０２５Ｍ　　Ｃｏ　Ｃλ２０．０２鱈と酵素液０．
０５鱈に０．０５Ｍリン酸Ｍ　ＶＭ液（ｐＨ６゜０）を
加えて全容０．４５ｚｚｎとし、これに０．ＯＩＭ　　
Ｎ’−カルボベンゾキシグリシン０．０５ｙ、ｔを加え
、５０℃で１０〜３０分間反応させた後、蒸溜水０．５
ｘβを加え全容を１戴とりる。この反応混液を用い、酵
素反応の結果、生成ｌｉｔ離されるグリシンをニンヒド
リン比色法１ト、Ｗ、Ｙｃ制０＆　　　　Ｅ、　　Ｃ，
Ｃｏｃｋｉｎｑ、　　、　　Ａｎａｌｙｓｔ、　　、　
　、８−Ｑ−、２０９（１９５５）］で定量した。。

酵素活性の測定法は以下に小でごとくである１、なお、
上記反応系でグリシン１ｍ　Ｍを１時間で生成する酵素
活性を１１１１位（ｕ１１自）とした１、また比活性は
上記の方法により測定した酵素活性の酵素蛋白１ｍｑ当
りの酵素単位で表不した１、４Ｔお蛋白の定積は紫外部
の吸光度を測定することにＪ、って行なった。

（４）作用至適１）　ｌ−１および作用適温の範囲第１
図に示されるように作用至適１１１−１の範囲は５〜７
−（あり、作用１６適ｐｆ−１は６．０イｑ近である。

第２図に小されるように作用適温の範のｊは３７〜６０
　’にであり、作用最適温度は５０℃（ｑ近である８゜ （５ｉ　）安定１１　）−１および安定側ｌむ（１１１
安定ｐ　ｌ−１範囲【ま６〜７にあり、第３図に示され
るようにＩ）Ｈ６，５，３５）℃、１６時間後の活ｆＩ
残存率は７０％である。

安定ｎ１１度範囲は４５℃までであり、第４図に小され
るように１ｌＩ−ｆ６．２．４０℃、１時間接の油性残
／／率は１００％Ｃあり、５０℃、１間間で７０％であ
り、（３０℃、Ｉ　Ｂ；７間で【まほぼ完全に夫れ５（
」る、。

（６）酵素活１１に及ぽり各種金属イオンの影響各種金
属イＡ゛ンを最終濃度が第２表に承り濃度になるように
酵素溶液に添加し、５．０　’Ｃ１１ｏブ）間反応せし
めた後、Ｗ−カルボベンゾキシグリシンを基質として用
いて酵素活性を測定した結果を第２表に小り。

なｄ３第２表中の相対活性はＧＯＣＩ！、２１１１１Ｍ
存在下での分解活性を１００とした局の話（）１１１．
て小したものである。

第　２　表 （７）酵素活性に及ばず金属キレ−１〜化合物、ＳＨ試
薬、または蛋白修飾試薬の影響 各種の金属キレ−１・化合物、５１−１試薬、有機水銀
化合物、または蛋白修飾試薬を最終濃瓜が第３表に示ｖ
′ａ度になるように酵素溶液（Ｉ　Ｉｌｌ　ＭＣｏ　Ｃ
１０を含有）に添加し、５０℃、１０分間反応せしめた
後、ず−カルポベンゾニ１−ジグリシンを基質として用
いて残存酵素活性を測定した結果を第３表に示−リ。

なお第３表中の相対活性は−Ｆ記の薬剤を添加しないで
測定しｌζ時の酵素活性を１００とし、その活性比で示
したものである。

第３表 （８）分子が ０、ＩＭ　　ＮａＣ／を含イｊりる０、０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐｌ−４６，８）で平衡化したピ゛ノアＬ１−ス
　６Ｂ（ファルマシア・ファイングミカルズ着製）を用
いたゲル濾過クロア１〜グラフイーにより分子量を測定
した。標ｉ、ｌｌ、蛋白買とし−（ｔＪ　Ｊ、　Ｄグ［
ｊプリン、カタラーぜ、アルトラ−Ｕを用いた。その結
果本酵素の分子量は２３５　、０００−（”あることが
解った。

（９）等重点 ポリアクリルアミドゲル舌電点分離法により等電点を測
定した。この結果、木酵素の等重点は４゜３”−４，６
の範囲にｄうることが解つノ（、。

（１０）ディスク電気泳動 ポリアクリルアミドを担体とし７，０％ゲル濃度、ｐｉ
−１８，０のトリス・バルヒタール緩価液を用いディス
ク電気泳動を行な・）だ１．カラム１本あたり３ｍＡの
電流を通じ、４℃で１時間泳動をｉ）なった後、クマシ
ブリリアント・ブルー１＜−２５０で染色した。その結
果、マーカー（ブ「−１ムノ」−）−ルブルー）に対η
る本酊累の比泳動距離ＲＩＢＰＢ−０，５１であった。

本発明の新規な酵素Ｗ−カルポベンゾギシアミノ酸アミ
ドヒドロセーＬは以上の性質を有する酵素である。

以］・、実施例を挙げて本発明を具体的に説明りるが、
本発明はこれにより制限されるものではない。

実施例１ 水１２につきカザミノ′Ｍ（ディフコ社Ｍ）５（１、バ
クトドリブし・ン（ディフコ社製）５ｇ、し−シスノー
゛イン　０．２ｇ、ｌ−−アスパラギン酸　０゜１（１
、ＤＬ−アラニン　０．５＜１、ＤＬ−トリプトノンノ
ン　０．２（＋、グルコース　２０ｇ、＾１酸す１〜リ
ウム　１０ｇ、コハク醗ナトリウム　２０ｇ、Ｋ１−１
　２　ト）　０４．　　　　０．　　５　　ｇ　、　　
Ｋ２　　ＨＰＯａ　　　　　０゜５０　、Ｆｅ　ＳＯ４
・７Ｈ２０１Ｏｎ＋ｇ、Ｍｎ　ＳＯ４・＋」２０　１０
１１１（］、　Ｍ（ｌ　ＳＯａ　・７１−１２０　１０
１１１（１、ＮａＣＪｌ　１０１１１（１、チアミン１
１１１ｇ、パントデン酸カルシウム　１ｍｇ、菓Ｍ　　
Ｏ。

２５ｍＬＩ）−アミノ安！、６１０．５ｍｇ、ビオジン
５μＱ１アデニン硫酸塩５ｎｌ（］、グツノニン塩酸塩
５ＩＩ１ｇ１ウラシル　５ｍｇ、１−Ｗｅｅｎ　　８０
　１　ｙｄを含有する培養基をｐｌ−１６，８に調整後
、１００戯容三角フラスコ１０本にそれぞれ１００露ず
−）　′１）２Ｊし、１２０℃で１０分間殺菌した。こ
の殺菌培地にラフ１〜バシラス・カゼイ　Ａ　ｌ−ＣＣ
７’１６９株の穿刺培地より、それぞれ３白金月を接秤
し、３７℃、２４時間静装ｉ８養をイ）４ｉ−った８、
この前培養液２００鱈を前培養に用いた培地と全く同じ
組成の培地２０℃の入った３０℃容スアンレス製ジャー
ファーメンタ−に移し、３７°Ｃで毎分４５回転の攪拌
で本ｊ８養を行なった。

１６時間で本培養を終了し、培養液を速心分離し、菌体
を集めた。同様にｂ疫の」８ｊ＆をｉ゛Ｊない合計１０
０℃の培養液から湿重量で１１クリの菌体を得た。

このようにして得られた菌体を０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐ、Ｈ（３、’　８　）約２０００露に懸濁し、０．
１ｍｍｍｍツガラスピーズ約１．２１ＤＩれたダイノミ
ル（ウィリー・ニー・バコオヘン社製）を用い、０℃の
水ぐ冷却しつつ菌体を破壊した。この破壊液を遠心分前
（０℃１．１２．　ＯＯＯｒｐｍ　、３０分）し、粘性
のある淡黄色の細胞抽出液２７５Ｑ　　ｙｉｌｌ　　を
　１；ノ　ｌこ　。

実施例２ 実施例１で得られた粗酵素液２７５０鱈に固形硫安６６
２ｇを水冷下、攪拌しながら少産ずつ添加し、４０％飽
和とする。このものは氷至に３０分放置後、生じた沈澱
を遠心分離にて除去し、そのＪ、：　ｉＵ　８１に更に
固形ｆｉｆｒ　’ｉｔ　ｂ　６４　Ｑを氷冷上、攪拌し
ながら少量ずつ添加し７０％飽和とする。このものは−
夜氷室に放置した後、生じｌこ沈６を遠心分離にて回収
した。得られた硫安沈澱物は０．０１ＭリンＭ緩絢液（
多＋ｌＩ６．８）に溶解し、同緩衝液にス４　Ｌ、て１
６時間透析を行ない、８００戯の透析溶液を１１７だ１
．この酵素液のＷ−カルボベンゾキシグリシン分解活性
は９．３ｂｔＪｓ位／　ｙｘｌ、蛋白濃度は１３ｍ（１
／戴であった。

実施例３ 実施例２で得られた酵素液８０−０戚を、予め３ｎ＋Ｍ
のＮａ　Ｎ３を含む０．０１ＭリンｅｍＭ％’ｍ（ｐ　
Ｈ６，８）で平衡化したＤＥＡ’［Ｅ−セフｊ・デック
スＡ−５０（フフ７ルマシア・フンノインケミカルズ社
製）の７　、０ｃｍｘ　３５．００＋１１のカラムにン
土ぎ、同緩衝液にで十分洗浄した後、同緩衝液を用い、
０〜１Ｍ、ＮａＣｆｆ１の直線グシシ］−ン１〜溶出を
行ない、Ｗ−カルボベンゾ−１ジノ！ミノ酸アミドヒド
ロラ一ゼ活性画分８００戯を得、これをメンプラン濃縮
器（米国アミニ」シネ１製、ＰＭ’−１０）で限外濾過
を行ない、１４５〕版の酵素液を得Ａ＝　、。

この酵素液の活性は５）１単４；ｔ　／鱈（・あ−一だ
、。

実施例４ 実施例３で七）られた酵素液１／１５ｚβを、ｒめ０゜
０１ＭリンＩＩＱ緩雨液（Ｌｌｌ−１６，ε３）で平衡
化したＡ　ｌｌ　−セファロース　４　Ｂ　（）７／ル
ンシノトノｌノインク゛ミ力ルズ社製）の３　、　Ｑｃ
ｍＸ　５８．　Ｑｃ’ｍのカラムに注ぎ、同緩衝液２．
５２で洗浄した後、同緩衝液を用い、０−・１ＭＮａＣ
６の直線グノジエント溶出を行４１い、Ｎ’−カルボベ
ンゾ−１シアミドヒドロン−Ｕ活性画分１１６鱈を得、
これをポリ１）レンゲリコールを用いて濃縮し、２９　
ｙｔｚｐの酵素液を１；また１、この酵素液の活性は２
０８単イ＼ン／ηβてあった、。

実施例５ 実施例４で１已ノられた酵素液２９戯を、予め３　ｍＭ
　　ＮａＮ３．０．０１％２−メルカプｌ−〕ニエタノ
ール３よび０．１Ｍ　　ＮａＣ６を含有した０、０１　
Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ−１６，８）で平衡化した七ツノ
・デックス　Ｇ−１５０（ファルマシノノ・ノンフイン
クミカルズネ」製）の５．Ｏｃｎ＋ｘ８８．Ｏｃｍのカ
ラムに注ぎ、同緩衝液により、２２．５露／１１ｒの流
速で溶出を行ない、Ｍ−カルボベンジル７１１ジアミノ
酸アミドヒドロラーゼ活性画分２９５かを得、これをポ
リエチレングリコールを用いて濃縮し、３３／１露の酵
素液を１！Ｊだ。この酵素液の活ＩＪ１は２３：３単イ
☆／戯であった。

実施例６ 実施例５で得られＩｃ酊素液３４謔を、０．０１％メル
カフ”］・エタノールおよび３１１１　Ｍ　　Ｎａ　Ｎ
３を含むＯ，ＯＩＭリン酸緩１ｆＩＪ液（ｐｌ−１６，
８）で平衡化したＤ　［Ａト−レファデックス　Δ−５
０（〕７ルマシア・ファインケミカルズ２１製）の５゜
０ｃｍｘ７０．０ｃｍのカラムに注ぎ、カラムな同緩衝
液で十分洗浄した後、同緩衝液を用い、０〜１１ｖｌ　
　Ｎａ　Ｃｉ！、の直線グラジエンｈ　２ＦＶ出をｆ］
＜Ｋ　イ、Ｍ−カルボベンゾキシアミノ酸アミドじドロ
１ラーゼ活性画分１１７露を１！ｌ、これをポリ−１Ｊ
レンゲリコールで濃縮して、２２．５廉の酵素液を得た
。

この酵素液の活性は３７３甲位／πβＱ　ｉｌすった。

。 実施例７ 実施例６で得られた酵素′ｆ２２２．り露を予め、０．
０１％２−メルカプ１へエタノール、３ｍＭＮａ　Ｎ３
及び０．１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ６を含イｊした０゜０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐｌ−１６，８）で平衡化したセフフＩク
リル　Ｓ　−３００（フノノルンシノノ・ノンｌインケ
ミカルス゛社製）の２　、６ｃｍｘ　９　’Ｉ　、　Ｏ
ｃｍのカラムに注ぎ、同緩衝液を用い−１２，５露／ｌ
＋ｒの流速で溶出を行ない、Ｍ−カルボベンゾ−１−ジ
アミノ酸アミドヒドロラーゼ活性画分６ｏ戴を得、これ
をポリエチレングリコールで濃縮して、１／１１βの酵
素液を得た。この酵素液の活性は４３１中イイｌ／戴で
あった。

実施例８ 実施例７で得られた酵素液１４滅を、予め実施例７と全
く同条イ′−１の緩衝液で平衡化したセフン７クリル　
Ｓ−ζ３００（ファルマシア・ファインクミカルス′社
製）の２　、６ｃｍｘ　９１　、　Ｏｃｍのカラムに汀
込゛′、同緩協液を用いて９．５願／１１ｒの流速（゛
溶出を行ない、Ｗ−カルボベンゾキシアミノ酸）′ミド
ヒトロラーし活性画分７５πβを得、これをポリエチレ
ングリコールで濃縮して、２５かの酵素液を１！１ｋ。

この精製酵素液の活性は３６２単位／戴で、蛋白１１１
１（ｌ当り９９ｔｈ５単位の活性を示した。

上記精製工程におりる全活性、比活性、収率を第４表に
小り。

第４表 参考例１ Ｗ−ベンゾイルグリシンを０．０５ＭリンＭ　Ｘｉ衝液
（ｐｌ−１６，８）に溶かし、１０７１１１１０１　／
　ｙｘｇの溶液を調整し、その２０戴に上記Ｖ１製法ｃ
　＜：ｔられた酵素液１戴を加え、３７℃で１時間反応
した後、この反応波をエーテル２０戴を用い（３回抽出
を７１なった。このエーテル層を無水硫酸ノー１−リウ
ムで乾燥した後、エーテルを留去すると白色の結晶が析
出り、　タ。こ（Ｄ結晶を［Ｒ，ＭＳ、ＩＪＩＶ、１−
　ＬＣで検ＷＪ　Ｌ７だ結末、エーテル層から寄られた
白色結晶は安息香酸であった。

また、エーテル抽出した後の水層な濃縮した後、シリカ
ゲル　６０のｐ　ｒｅ−Ｃｏａｔｅｃｌ　　Ｐ　ｆ−Ｃ
ｐｌａｔｅ　　（メルク社製）に塗布し、溶媒、ＭｃＯ
Ｉｌｌ−（２０６０：４０で展開した後、グリシン族開
部分のシリカゲルをかぎとり、ビーカー中で水ぐ抽出を
行なった。シリカゲルを濾過して取除いた後、水溶液を
濃縮し析出した白色結晶をＭｅＯＩ−ｌと水の混液から
再結晶した。この結晶は［Ｒ、ｍｐ、１１−Ｃ冗累分相
の結果、グリシンであ・）だ。

Ｖ−ベンゾイル）′シニンを全く同じ方法ぐ処理した結
果、エーテル層から安息香酸、水層からアラニンを検出
した。

参考例２ Ｗ−カルボベンゾニ１ジグリシンを０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐ　Ｈ６，８）に溶かし、１０μｍｏｌ／戴の溶
液を調整し、ぞの１０７１１βに−Ｆ記！１′Ｉ製法で
得られた酵素液１ｙｚβおよびＭ／１０　　ＣｏＣに２
水溶液Ｑ、１ｉ／！を加え、３７℃ｒ１Ｌｌｊｔ間反応
した後、この反応液をエーテル２０７ＪＩβを用い４３
回抽出を行なった。この１．−　フル層を無水Ｍｉ　Ｈ
プリリウムで乾燥した後、溶媒を留去し、残った液体を
ｌ　Ｒ５ＵＶ、−Ｉ−ＬＣＪ３ｃｊ；びＭＳで検ｉｉＪ
　シタ結果、エーテルに抽出されたものはペンシルｊ′
ルコールであった。

また、エーテル抽出した後の水層な１ｊ１１２．０に調
整したアンバーライｌ〜Ｉ　Ｒ−１２０（［ｊ−ム・ア
ンド・バーｉ社製）にバッチ法で吸着さ”し次に５％Ｎ
８４０Ｈを用いて溶出した。これを濃縮して析出した結
晶をＴ−ＬＣ，ｍｐ、　　Ｉ　ｌ＜元糸分析で検器した
結果、水層から得られた結晶はグリシンであった。

Ｎ′−カルボベンゾキシアラニンを全く同じ方法で処理
した結果、エーテル層からベンジルアルコール、水層か
らアラニンを検出した。。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ず−カルボベンゾキシアミノ酸ノアミドヒド
ロラーゼの最適ｐ　ｌ−４を示す図である。 第２図は、Ｍ−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロ
ラーゼの作用温度を示す図である。 第３図は、スー＝カルボベンゾキシアミノ酸ノｌミドヒ
ドロラーゼの３５℃におけるｐＨ安定性を小゛り図であ
る。 第４図は、Ｖ−カルボベンゾキシアミノ酸アミドヒドロ
ラーゼの熱安定性を示す図ぐある。 第１図 ○：ＫＨ２〜ＮａＯ唾旬波 第３図 ５６７８ Ｈ ム：酢−イψ丁ン−； Δ：ＫＨ２ＰＯ４−ＮＣｌ０Ｈ緩髄 第２図 第４図 叡（０Ｃ） ＱＡ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式： ％式％ Ｆ式中、Ｒ１はカルボベンゾキシ基またはベンゾイルＵ
   およびＲ２は水素、メチル基またはヒドロキシメチル基
   を表わす１で示される化合物に作用し、アラニン、セリ
   ンまたはグリシンとベンジルノフルコールまたは安息香
   酸を生成する酵素Ｍ−カルボベンゾキシシノミノ酸フン
   ミドヒドロラーゼ、１２、　ラフ１ヘパシラス属から得
   られる第１項記載の■′−カルボベンゾキシアミノ酸ア
   ミドヒト［１クーゼ。 ３６　分子量約２３５０００．等電点４゜３〜４．６お
   よび、ＤＩＳＣ電気泳動がＲｍ　　　＝Ｏ。 ＰＢ ５１である第１項記載のＷ−カルボベンゾキシアミノ酸
   アミドヒドロラーゼ。 ４、　ラフ１−バシラス１萬に属し、一般へ二１【２ □ Ｒ＋　　−Ｎｔ−１−Ｃｌ−Ｉｃ０ＯＨ［式中、Ｒ１は
   カルボベンゾキシ基またはベンゾイル基、およびＲ２は
   水素、メブール基、またはヒドロキシメチル基を表ねり
   １で表わされる化合物に作用し、アラニン、レリンまた
   はクリシンとヘンシルアルコールまたは安息香酸を生成
   づる酵系Ｎ″−カルボベンゾキシアミノ酸）７ミドヒド
   ロラーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物よ
   り新規なＭ−カルボベシン゛キシアミノ酸ノＩミドヒド
   ロラーゼを採取することを特徴とするＭ−カルボベンゾ
   キシアミノ酸アミ１〜ヒト［」ラーゼの製法、。 ５、　菌株かラクトバシラス・７Ｊ　ｔイＣ゛ある第４
   項記載の製法。 ６、　採取を、培養液から菌株を集め、中１１ｐＨの緩
   衝液中でこれを破壊し、破壊抽出液を塩析し、沈澱物を
   中性ｐＨの緩衝液に溶解後、同級絢液で透析りることに
   より行なう第４項記載の製法。 ７、　採取を、第６項記載の透析液をアニＡン交換液体
   りロマｌ−グラノイーで処理し、その活性画分を限外濾
   過し、その濃縮液を採取することにより行なう第４項記
   載の製法。 ８、　採取を、第７項記載の限外濾過濃縮液を吸着カラ
   ムクロマトグラフィーにかけ、その活性画分を所望によ
   り濃縮することにより行なう第４項記載の製法。 ９、　採取を、第８項記載の活性画分またはその濃縮液
   をゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、その活性画分を
   所望により濃縮づ°ることにより行なう第４項記載の製
   法。 １０、　採取を、第９項記載の活性画分また（Ｊその濃
   縮液をざらに別のゲル濾過クロマトグラフィーにか【プ
   る第９項記載の製法。