JPS59196088A - ジヒドロキシアセトンキナーゼ及び製造法 - Google Patents
ジヒドロキシアセトンキナーゼ及び製造法Info
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- JPS59196088A JPS59196088A JP58067627A JP6762783A JPS59196088A JP S59196088 A JPS59196088 A JP S59196088A JP 58067627 A JP58067627 A JP 58067627A JP 6762783 A JP6762783 A JP 6762783A JP S59196088 A JPS59196088 A JP S59196088A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はシゾサツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａ−ｒｏｍｙｃｅｓ ）属に属する菌株によるジヒドロ
キシアセトンキナーゼ（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏ
ｎｅ ｋｉｎａｓｅ 、以下ｒＤＨＡＫＪという）の
製造法に関する。
ａ−ｒｏｍｙｃｅｓ ）属に属する菌株によるジヒドロ
キシアセトンキナーゼ（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏ
ｎｅ ｋｉｎａｓｅ 、以下ｒＤＨＡＫＪという）の
製造法に関する。
Ｄ ＨＡ Ｋはリン酸供与体のリン酸基を基質ジヒドロ
キシアセトン（以下［ＤＨＡ、Ｊという）に転移しジヒ
ドロキシアセトシリン酸を生成する反応を触媒する酵素
である。リン酸供与体としてアデノシン三リン酸（以下
「ＡＴｐ」という）を使用した場合の反応式を以下に示
す。
キシアセトン（以下［ＤＨＡ、Ｊという）に転移しジヒ
ドロキシアセトシリン酸を生成する反応を触媒する酵素
である。リン酸供与体としてアデノシン三リン酸（以下
「ＡＴｐ」という）を使用した場合の反応式を以下に示
す。
ＤＨＡ＋ＡＴＰ−−→ＤＴ（Ａリン酸十アデノシンニリ
ン酸 本発明者らはグリセロール脱水素酵素を用いたグリセロ
ールの測定法について検討を重ねてきたが、グリセロー
ル脱水素酵素の触媒する反応は次式に示すように平衡反
応であって、反応を正方向に進めるためにはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（以下ｒＮＡＤＪという）
を過剰量添加するとか、ｐＨ１０〜１１の高ｐＨ域で反
応するといった不利を強いられてきた。
ン酸 本発明者らはグリセロール脱水素酵素を用いたグリセロ
ールの測定法について検討を重ねてきたが、グリセロー
ル脱水素酵素の触媒する反応は次式に示すように平衡反
応であって、反応を正方向に進めるためにはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（以下ｒＮＡＤＪという）
を過剰量添加するとか、ｐＨ１０〜１１の高ｐＨ域で反
応するといった不利を強いられてきた。
グリセロール＋ＮＡＤ＋：
ＤＨＡ十ＮＡＤＨ十Ｈ＋
上記反応を進めるためには生成りＨＡを系外に除くこと
が望まれる。そこで本発明者らは酵素にその作用を求め
各種検索したところ、ＤＨＡＫが有効であることを見い
だした。
が望まれる。そこで本発明者らは酵素にその作用を求め
各種検索したところ、ＤＨＡＫが有効であることを見い
だした。
従来ＤＨＡＫは〜例えはキャンシダ・メチリカ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ ｍｅｔｈｙｌｉｃａ ） （ツアイトシュ
リフトアルゲマイネ ミクロビオロジエ（Ｚ、 Ａｌ１
ｇ。
ｄｉｄａ ｍｅｔｈｙｌｉｃａ ） （ツアイトシュ
リフトアルゲマイネ ミクロビオロジエ（Ｚ、 Ａｌ１
ｇ。
Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ、）第２０巻、３８９頁（１９８０
）および同第２１巻、２１９頁（１９８１） ） 、グ
ルコノバクタ−・サブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂ
ａｃｔｅｒ ５ｕｂｏｘｉｄａｎｓ） （日本農芸化
学会、中部支部・関西支部合同大会（昭和５６年１０月
９日）講演要旨集、第３頁〕、アセトノペクタ−・キシ
リナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ ）
〔ジャーナル オブ ハクテリオロジー（Ｊ。
）および同第２１巻、２１９頁（１９８１） ） 、グ
ルコノバクタ−・サブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂ
ａｃｔｅｒ ５ｕｂｏｘｉｄａｎｓ） （日本農芸化
学会、中部支部・関西支部合同大会（昭和５６年１０月
９日）講演要旨集、第３頁〕、アセトノペクタ−・キシ
リナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ ）
〔ジャーナル オブ ハクテリオロジー（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、）第１２７巻、７４７頁（１９
７６） ）および緑藻類の一種であるデユナリエラ（Ｄ
ｕｎａｌｉｅｌｌａ）〔プラント フイジオロジー（Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、）第５９巻、１５頁（１９
７７）およびパイオキミカ ノくイオフィジカ アクタ
−（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ）第
６１５巻、１頁（１９８０） ）に存在することが知ら
れているが、酵素の生産性、性質などいずれも満足でき
るものではない。
７６） ）および緑藻類の一種であるデユナリエラ（Ｄ
ｕｎａｌｉｅｌｌａ）〔プラント フイジオロジー（Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、）第５９巻、１５頁（１９
７７）およびパイオキミカ ノくイオフィジカ アクタ
−（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ）第
６１５巻、１頁（１９８０） ）に存在することが知ら
れているが、酵素の生産性、性質などいずれも満足でき
るものではない。
本発明者らはＤＨＡＫを産生ずる菌株を新たに検索した
ところ、シゾサツカロミセス属に属する保存菌株がすぐ
れた性質を有するＤＨＡＫを著量産生することを見いだ
し本発明法を完成した。
ところ、シゾサツカロミセス属に属する保存菌株がすぐ
れた性質を有するＤＨＡＫを著量産生することを見いだ
し本発明法を完成した。
なお、古くからＤＨＡＫと同様の反応を触媒する酵素と
してトリオキナーゼ（Ｔｒｉｏｋｉｎａｓｅ、 ＥＣ２
，７，１，２８） ）がモルモット肝、ラット肝、バチ
ルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ）などに存在することが知られている〔メソッド
イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ
、）第５巻、３６２頁（１９６２）ユーロピアン ジャ
ーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ、 Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第３１巻、５９頁（１９７２）およ
びシ エンザイム（Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ）第２版
、第６巻、７５頁（１９６２） ）が、トリオキナーゼ
はＤＨＡとＤＬ−グリセルアルデヒドをほぼ等速度でリ
ン酸化するのに対し、本発明法のＤＨＡＫならびに前記
各種起源のＤＨＡＫはＤＬ−グリセルアルデヒドに対す
る反応性が低い点でトリオキナーゼとは異なった酵素で
あるとみられている。
してトリオキナーゼ（Ｔｒｉｏｋｉｎａｓｅ、 ＥＣ２
，７，１，２８） ）がモルモット肝、ラット肝、バチ
ルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ）などに存在することが知られている〔メソッド
イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ
、）第５巻、３６２頁（１９６２）ユーロピアン ジャ
ーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ、 Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第３１巻、５９頁（１９７２）およ
びシ エンザイム（Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ）第２版
、第６巻、７５頁（１９６２） ）が、トリオキナーゼ
はＤＨＡとＤＬ−グリセルアルデヒドをほぼ等速度でリ
ン酸化するのに対し、本発明法のＤＨＡＫならびに前記
各種起源のＤＨＡＫはＤＬ−グリセルアルデヒドに対す
る反応性が低い点でトリオキナーゼとは異なった酵素で
あるとみられている。
本発明法で使用される微生物はシゾサツカロミセス属に
属するＤＨＡＫ産生能を有する菌株であればいずれでも
良いが、具体的にはシゾサツカロミセス０ポンへ（Ｓｈ
ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＩＦ
Ｏ０３４０、シゾサツカロミセス・ボンへＩＦＯ０３５
４、シゾサツカロミセス・マリデポランス（Ｓｏｍａｌ
ｉ−ｄｅｖｏｒａｎｓ） ＩＦＯ１６０８、シゾサツカ
ロミセス・ヤポニカス（Ｓ、 ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）
ＩＦＯ１６０９、シゾサツカロミセス・オフトスポラス
（Ｓ、 ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ ） ＩＡＭ１２２５７
などがあげられる。これらのうち特に好ましいのはシゾ
サツカロミセス・ボンへＩＦＯ０３５４である。
属するＤＨＡＫ産生能を有する菌株であればいずれでも
良いが、具体的にはシゾサツカロミセス０ポンへ（Ｓｈ
ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＩＦ
Ｏ０３４０、シゾサツカロミセス・ボンへＩＦＯ０３５
４、シゾサツカロミセス・マリデポランス（Ｓｏｍａｌ
ｉ−ｄｅｖｏｒａｎｓ） ＩＦＯ１６０８、シゾサツカ
ロミセス・ヤポニカス（Ｓ、 ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）
ＩＦＯ１６０９、シゾサツカロミセス・オフトスポラス
（Ｓ、 ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ ） ＩＡＭ１２２５７
などがあげられる。これらのうち特に好ましいのはシゾ
サツカロミセス・ボンへＩＦＯ０３５４である。
上記菌株を培養する栄養培地としては、炭素源、窒素源
、無機物等を含む培地であれば合成培地、天然培地いず
れも用いることができる。炭素源としてはグルコース、
フラクトース、マルトース、シュクロース等が使用され
、窒素源としては麦芽エキス、ペプトン、酵母エキス、
肉エキス等が使用される。無機物としてはカリウム、ナ
トリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄などの金属塩が必要
に応じて使用される。培養温度は菌が生育しＤＨＡＫが
生産される範囲内であればいずれの温度でもよいが、好
ましくは２５〜３５℃である。培地のｐＨは通常５〜７
の範囲で行われる。培養時間は酵素力価が最大に達する
時間を選べばよく、通常２４〜７２時間である。
、無機物等を含む培地であれば合成培地、天然培地いず
れも用いることができる。炭素源としてはグルコース、
フラクトース、マルトース、シュクロース等が使用され
、窒素源としては麦芽エキス、ペプトン、酵母エキス、
肉エキス等が使用される。無機物としてはカリウム、ナ
トリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄などの金属塩が必要
に応じて使用される。培養温度は菌が生育しＤＨＡＫが
生産される範囲内であればいずれの温度でもよいが、好
ましくは２５〜３５℃である。培地のｐＨは通常５〜７
の範囲で行われる。培養時間は酵素力価が最大に達する
時間を選べばよく、通常２４〜７２時間である。
以上のようにして得られた培養物からＤＨＡＫを採取す
る゛には、本酵素が菌体内に存在するためまず菌体から
酵素の抽出を行う。すなわち培養物をろ過または遠心分
離して菌体を集め、アルミナ磨砕、フレンチプレス、グ
イノミルなどの機械的方法あるいはアセトン等の有ｔａ
熔媒処理、細胞壁溶解酵素による処理などによって本酵
素を抽出する。その後ろ過もしくは遠心分離によって固
型物を除き粗酵素液を得、さらに塩析、有機溶媒沈澱、
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ケルろ過などの公知の方法を適宜組み合せることに
より精製ＤＨＡＫ標品が得られる。
る゛には、本酵素が菌体内に存在するためまず菌体から
酵素の抽出を行う。すなわち培養物をろ過または遠心分
離して菌体を集め、アルミナ磨砕、フレンチプレス、グ
イノミルなどの機械的方法あるいはアセトン等の有ｔａ
熔媒処理、細胞壁溶解酵素による処理などによって本酵
素を抽出する。その後ろ過もしくは遠心分離によって固
型物を除き粗酵素液を得、さらに塩析、有機溶媒沈澱、
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ケルろ過などの公知の方法を適宜組み合せることに
より精製ＤＨＡＫ標品が得られる。
本酵素の活性測定法は、２．５ｍＭ Ａ Ｔ Ｐ、４ｍ
Ｍ硫酸マグネシウム、０．２ｍＭ Ｎ Ａ Ｄ Ｈｌｌ
、０ｍＭ Ｄ ＨＡおよび２．５ｕ／ｍｎクリセロール
ー３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ヘーリンガー・マンハ
イム社製）を含む０．１Ｍ ）リエクノールアミン塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５） １．０ ｍｅと酵素溶液０．０
１ｍＥを混合し２５°Ｃで反応させ、反応開始後１分間
の３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定する。対照と
してＤＨＡを含まない系を用いて上記と同様に操作し、
得られた吸光度をブランク値として上記測定値から差引
くことによりＮＡＤＨの減少量を求める。酵素活性の表
示は、上記条件で１分間に１ＭモルのＮＡＤＨを減少さ
せる酵素量を１単位とした。以上の反応式を示せば次の
通りである。
Ｍ硫酸マグネシウム、０．２ｍＭ Ｎ Ａ Ｄ Ｈｌｌ
、０ｍＭ Ｄ ＨＡおよび２．５ｕ／ｍｎクリセロール
ー３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ヘーリンガー・マンハ
イム社製）を含む０．１Ｍ ）リエクノールアミン塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５） １．０ ｍｅと酵素溶液０．０
１ｍＥを混合し２５°Ｃで反応させ、反応開始後１分間
の３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定する。対照と
してＤＨＡを含まない系を用いて上記と同様に操作し、
得られた吸光度をブランク値として上記測定値から差引
くことによりＮＡＤＨの減少量を求める。酵素活性の表
示は、上記条件で１分間に１ＭモルのＮＡＤＨを減少さ
せる酵素量を１単位とした。以上の反応式を示せば次の
通りである。
Ｄ ＨＡ ＋ Ａ Ｔ Ｐ−Ｄ ＨＡリン酸＋ＡＤＰＤ
ＨＡリン酸＋ＮＡＤＨ− グリセロール３−リン酸＋ＮＡＤ＋ 次に、シゾサツカロミセス・ボンベＩＦＯ０３５４より
得られたＤＨＡＫの性質について述べるが、本酵素は後
述の実施例に示すようにＤＥＡＥ−セファロースを用い
たカラムクロマトグラフィーによって約０．１２Ｍ食塩
で溶出される両分（以下ｒ Ｄ ＨＡ Ｋ （Ｉ） Ｊ
という）と約０．１６Ｍ食塩で溶出される両分（以下ｒ
ＤＨＡＫ（ＩＤＪという）の二種類のアイソザイムから
成る。
ＨＡリン酸＋ＮＡＤＨ− グリセロール３−リン酸＋ＮＡＤ＋ 次に、シゾサツカロミセス・ボンベＩＦＯ０３５４より
得られたＤＨＡＫの性質について述べるが、本酵素は後
述の実施例に示すようにＤＥＡＥ−セファロースを用い
たカラムクロマトグラフィーによって約０．１２Ｍ食塩
で溶出される両分（以下ｒ Ｄ ＨＡ Ｋ （Ｉ） Ｊ
という）と約０．１６Ｍ食塩で溶出される両分（以下ｒ
ＤＨＡＫ（ＩＤＪという）の二種類のアイソザイムから
成る。
（１）作 用
ＡＴＰなどリン酸供与体のリン酸基を基質ＤＨＡに転移
しジヒドロキシアセトンリン酸を生成する反応を触媒す
る。
しジヒドロキシアセトンリン酸を生成する反応を触媒す
る。
（２）基質特異性
リン酸供与体として２．５ｍＭ Ａ Ｔ Ｐならびに４
ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２ｍＭＮＡ Ｄ Ｈ、１，
３ｍＭホスホエノールピルビンｆｉｌ、６ｕ／ ｍｅピ
ルビン酸キナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）、
６ｕ／ｍＱ乳酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー・マン
ハイム社製）および第１表に示す各種基質（１，０ｍＭ
）を含む０．１Ｍ Ｉ−リエタノールアミン塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５） １．０ ＋＋＋１！と酵素溶液０．０
１ｍｅを混合し２５℃で反応させ、反応開始後１分間の
３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定することにより
活性を求めた。以上の反応を式に示せば次のとおりであ
る。
ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２ｍＭＮＡ Ｄ Ｈ、１，
３ｍＭホスホエノールピルビンｆｉｌ、６ｕ／ ｍｅピ
ルビン酸キナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）、
６ｕ／ｍＱ乳酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー・マン
ハイム社製）および第１表に示す各種基質（１，０ｍＭ
）を含む０．１Ｍ Ｉ−リエタノールアミン塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５） １．０ ＋＋＋１！と酵素溶液０．０
１ｍｅを混合し２５℃で反応させ、反応開始後１分間の
３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定することにより
活性を求めた。以上の反応を式に示せば次のとおりであ
る。
基質＋ＡＴＰ−基質−リン酸化合物＋ＡＤＰＡＤＰ＋ホ
スボエノールピルビン酸← ＡＴＰ＋ピルビン酸 ピルビン酸十ＮＡＤＨ−→ＮＡＤ＋十乳酸本酵素は第１
表に示すように、ＤＨＡに作用するが、ＤＬ−グリセル
アルデヒドに対する作用は弱く、またその他の基質には
作用しない。
スボエノールピルビン酸← ＡＴＰ＋ピルビン酸 ピルビン酸十ＮＡＤＨ−→ＮＡＤ＋十乳酸本酵素は第１
表に示すように、ＤＨＡに作用するが、ＤＬ−グリセル
アルデヒドに対する作用は弱く、またその他の基質には
作用しない。
第１表
（３）リン酸供与体の特異性
本酵素は第２表に示すように、ＡＴＰを最もよいリン酸
供与体とする。
供与体とする。
第２表
（４）二価金属イオンの特異性
第３表に示す金属イオン（４ｍＭ）を反応液に加え活性
を測定したところ、本酵素は二価金属イオンが存在しな
いと酵素活性を示さず、ＤＨＡ Ｋ （１）はＣａ２＋
イオン、Ｄ ＨＡ Ｋ （Ｉ［）はＭ ｇ Ｚ＋イオン
で最大の活性を示す。
を測定したところ、本酵素は二価金属イオンが存在しな
いと酵素活性を示さず、ＤＨＡ Ｋ （１）はＣａ２＋
イオン、Ｄ ＨＡ Ｋ （Ｉ［）はＭ ｇ Ｚ＋イオン
で最大の活性を示す。
（以下余白）
第３表
（５）至適ｐＨ
ｐＨ６，０〜８．５の各ｐＨにおいて活性を測定したと
ころ、Ｄ ＨＡ Ｋ （Ｉ）、Ｄ ＨＡ Ｋ （ｎ）と
もにｐＨ７，３付近が至適であった（第１図に示される
）。
ころ、Ｄ ＨＡ Ｋ （Ｉ）、Ｄ ＨＡ Ｋ （ｎ）と
もにｐＨ７，３付近が至適であった（第１図に示される
）。
（６）安定ｐＨ範囲
ｐＨ３，０〜１１．０の各ｐＨにおいて２５°Ｃ１２時
間処理した後の残存活性を測定したところ、ＤＨＡＫ
（Ｉ）はｐｔ＋約５〜１１、ＤＨＡＫ■はＩ）Ｈ約６〜
１１の範囲で安定であった（第２図に示される）。
間処理した後の残存活性を測定したところ、ＤＨＡＫ
（Ｉ）はｐｔ＋約５〜１１、ＤＨＡＫ■はＩ）Ｈ約６〜
１１の範囲で安定であった（第２図に示される）。
（７）至適・温度
１０〜６０゛Ｃの各温度において活性を測定したところ
、Ｄ ＨＡ Ｋ （Ｉ）は６０°Ｃ付近、ＤＨＡＫ（Ｉ
Ｏは５５℃付近が至適であった（第３図に示される）。
、Ｄ ＨＡ Ｋ （Ｉ）は６０°Ｃ付近、ＤＨＡＫ（Ｉ
Ｏは５５℃付近が至適であった（第３図に示される）。
（８）温度安定性
ｐＨ７，０において、０〜６０°Ｃの各温度で１５分間
処理した後の残存活性を測定したところ、ＤＨＡ Ｋ
（Ｉ）は約５０℃以下、ＤＨＡＫＧＤは約４０°Ｃ以下
で安定であった（第４図に示される）。
処理した後の残存活性を測定したところ、ＤＨＡ Ｋ
（Ｉ）は約５０℃以下、ＤＨＡＫＧＤは約４０°Ｃ以下
で安定であった（第４図に示される）。
（９）基質親和性
ｐＨ７，５，２５°Ｃの反応条件における本酵素のＤＨ
Ａ、ＤＬ−グリセルアルデヒド、ＡＴＰに対するミバエ
リス定数（Ｋｍ値）はＤ ＨＡ Ｋ （１）の場合それ
ぞれ８．４Ｘ １０−６ Ｍ、２．ＩＸ １０−５ Ｍ
、２．２ｘ １０−４Ｍ、 Ｄ ＨＡ ＫＧ［）ノ場合
ハソレソレ２、Ｏｘｌ０−５Ｍ、 ３．２ｘｌＯ−５
Ｍ、 ９．１ｘｌＯ−４Ｍであった。またＭｇｚ＋イ
オンは反応系において４１以上の濃度であれば十分な酵
素活性が得られた。
Ａ、ＤＬ−グリセルアルデヒド、ＡＴＰに対するミバエ
リス定数（Ｋｍ値）はＤ ＨＡ Ｋ （１）の場合それ
ぞれ８．４Ｘ １０−６ Ｍ、２．ＩＸ １０−５ Ｍ
、２．２ｘ １０−４Ｍ、 Ｄ ＨＡ ＫＧ［）ノ場合
ハソレソレ２、Ｏｘｌ０−５Ｍ、 ３．２ｘｌＯ−５
Ｍ、 ９．１ｘｌＯ−４Ｍであった。またＭｇｚ＋イ
オンは反応系において４１以上の濃度であれば十分な酵
素活性が得られた。
（１０）分子量
セファデックスＧ −’２００ （ファルマシア社製）
を用いたゲルろ適法により測定したところＤ ＨＡＫ中
、Ｄ ＨＡ Ｋ （ｎ）ともに約１４５，０００と算出
された。
を用いたゲルろ適法により測定したところＤ ＨＡＫ中
、Ｄ ＨＡ Ｋ （ｎ）ともに約１４５，０００と算出
された。
上記ＤＨＡＫを、前述のようにグリセロール脱水素酵素
を用いたグリセロールの測定およびグリセロール脱水素
酵素とリパーゼを用いたグリセライドの測定に利用した
ところ、 Ｆ高感度の測定が可能となった。その他本酵
素は生体中のジヒドロキシアセトンの定量、ＡＴＰの定
量、またジヒドロキシアセトンリン酸の製造用酵素とし
て今後幅広く利用できるものと考えられる。
を用いたグリセロールの測定およびグリセロール脱水素
酵素とリパーゼを用いたグリセライドの測定に利用した
ところ、 Ｆ高感度の測定が可能となった。その他本酵
素は生体中のジヒドロキシアセトンの定量、ＡＴＰの定
量、またジヒドロキシアセトンリン酸の製造用酵素とし
て今後幅広く利用できるものと考えられる。
以下試験例、実施例をもって本発明の詳細な説明する。
試験例
麦芽エキス１％、ペプトン０．３％、酵母エキス０．１
％、リン酸二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水
塩 ０．０５％、塩化カリウム ０．０５％、硫酸第一
鉄７水塩０．００１％から成る組成の培地１００ｍｅ
（ａｌｌ ６．２）の入った５ ００ｍｅ容の坂ロフラ
スコに第４表に示すシゾサツカロミセス属の菌株を接種
し、３０℃で４８時間振盪培養した。培養液を遠心分離
して菌体を集め、２０ｍＭ）’Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，０） ３０ｍＥで洗浄したのぢ菌体をアルミナで破砕
し５−の同緩衝液で酵素を抽出した。抽出液を遠心分離
（１０，００Ｏｒｐｍ 、１０分間）し、得られた上滑
液の活性を測定したところ第４表に示す結果を得た。
％、リン酸二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水
塩 ０．０５％、塩化カリウム ０．０５％、硫酸第一
鉄７水塩０．００１％から成る組成の培地１００ｍｅ
（ａｌｌ ６．２）の入った５ ００ｍｅ容の坂ロフラ
スコに第４表に示すシゾサツカロミセス属の菌株を接種
し、３０℃で４８時間振盪培養した。培養液を遠心分離
して菌体を集め、２０ｍＭ）’Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，０） ３０ｍＥで洗浄したのぢ菌体をアルミナで破砕
し５−の同緩衝液で酵素を抽出した。抽出液を遠心分離
（１０，００Ｏｒｐｍ 、１０分間）し、得られた上滑
液の活性を測定したところ第４表に示す結果を得た。
第４表
実施例１
麦芽エキス１％、ペプトン０．３％、酵母エキス０．１
％、リン酸二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水
塩 ０．０５％、塩化カリウム ０．０５％、硫酸第一
鉄７水塩０．００１％から成る組成の培地１００ｍｅ
（ｐＨ６，２）の入った５０（７容の坂ロフラスコにシ
ゾサツカロミセス・ボンベＩＦＯ０３５４株を一白金耳
接種し、３０℃で４８時間振盪培養し種培養液とした。
％、リン酸二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水
塩 ０．０５％、塩化カリウム ０．０５％、硫酸第一
鉄７水塩０．００１％から成る組成の培地１００ｍｅ
（ｐＨ６，２）の入った５０（７容の坂ロフラスコにシ
ゾサツカロミセス・ボンベＩＦＯ０３５４株を一白金耳
接種し、３０℃で４８時間振盪培養し種培養液とした。
上記と同組成の培地１ｏβの入った２ｏβ容ジャーファ
ーメンタ−に上記種培＃液を接種し、３０”ｃで４８時
間培養した。
ーメンタ−に上記種培＃液を接種し、３０”ｃで４８時
間培養した。
培養液を遠心分離して菌体を集め、２０ｍＭ）’Ｊス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁後、ダイノミルにて約１
０分開閉体破砕を行い酵素を抽出した。抽出液を遠心分
離して固型物を除去し、得られた上清液にポリエチレン
イミン溶液を最終濃度０．０２％になるように添加し、
沈澱物を再度遠心分離により除去した。次に得られた上
清液を硫酸アンモニウム塩析し、４０〜７０％飽和画分
の酵素沈澱を取得した。
酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁後、ダイノミルにて約１
０分開閉体破砕を行い酵素を抽出した。抽出液を遠心分
離して固型物を除去し、得られた上清液にポリエチレン
イミン溶液を最終濃度０．０２％になるように添加し、
沈澱物を再度遠心分離により除去した。次に得られた上
清液を硫酸アンモニウム塩析し、４０〜７０％飽和画分
の酵素沈澱を取得した。
沈澱を上記同緩衝液に熔解したのちセファデックスＧ−
２５（ファルマシア社製）を使用したゲルろ過法により
脱塩したのち、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファ
ロース（ファルマシア社製）カラムに吸着させ、カラム
を洗浄後０〜０．３Ｍの食塩濃度勾配により酵素を溶出
した。溶出パターンを第５図に示す。酵素活性は二つの
ピークに分れ、約０．１２Ｍ食塩で溶出される画分をＤ
ＨＡ Ｋ （Ｉ）、約０．１６Ｍ食塩で溶出される両
分をＤ ＨＡ Ｋ （Ｉｔ）としてそれぞれ別に集めた
。
２５（ファルマシア社製）を使用したゲルろ過法により
脱塩したのち、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファ
ロース（ファルマシア社製）カラムに吸着させ、カラム
を洗浄後０〜０．３Ｍの食塩濃度勾配により酵素を溶出
した。溶出パターンを第５図に示す。酵素活性は二つの
ピークに分れ、約０．１２Ｍ食塩で溶出される画分をＤ
ＨＡ Ｋ （Ｉ）、約０．１６Ｍ食塩で溶出される両
分をＤ ＨＡ Ｋ （Ｉｔ）としてそれぞれ別に集めた
。
Ｄ ＨＡ Ｋ （Ｉ）、Ｄ ＨＡ Ｋ （Ｉ）画分はそ
れぞれ硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように加え
て酵素を沈澱させたのち、遠心分離により集め、上記同
緩衝液に溶解してセファデックスＧ−２５により脱塩し
た。得られた酵素溶液を４０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（
ｐｌ（７，０＞で平衡化したブルーセファロース（ファ
ルマシア社製）カラムに通し、吸着されずに溶出してき
た活性画分を限外ろ過法により濃縮したところ、１２υ
／ｍｌの活性を有するＤ ＨＡ Ｋ （１）溶液１０ｍ
！ならびに２０ｕ／ｍ（！の活性を有するＤＨＡＫＧ［
）溶液１Ｂ＋ｎｆｆを得た。
れぞれ硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように加え
て酵素を沈澱させたのち、遠心分離により集め、上記同
緩衝液に溶解してセファデックスＧ−２５により脱塩し
た。得られた酵素溶液を４０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（
ｐｌ（７，０＞で平衡化したブルーセファロース（ファ
ルマシア社製）カラムに通し、吸着されずに溶出してき
た活性画分を限外ろ過法により濃縮したところ、１２υ
／ｍｌの活性を有するＤ ＨＡ Ｋ （１）溶液１０ｍ
！ならびに２０ｕ／ｍ（！の活性を有するＤＨＡＫＧ［
）溶液１Ｂ＋ｎｆｆを得た。
実施例２
シゾサツカロミセス・オクトスボラス ＩＡＭ１２２５
７株を使用して、実施例１と同様に操作したところ、１
０ｕ／カ！の活性を有する酵素溶液５ ｍｅを得た。
７株を使用して、実施例１と同様に操作したところ、１
０ｕ／カ！の活性を有する酵素溶液５ ｍｅを得た。
第１図は、本発明法によりシゾサツカロミセス・ボンベ
ＩＰ０ ０３５４株から得られたＤＨＡＫ（Ｉ）および
ＤＨＡＫＧＤの至適ｐｌ＋を表す図であり、第２図は同
じく安定ｐｔ＋範囲、第３図は至適温度、第４図は温度
安定性、第５図はＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマ
トグラフィーにおける溶出パターンをそれぞれ表す図で
ある。 特許出願人 天野製薬株式会社 第１図 ６ ７ ８ ９ 第２図 ３ ５ ７ ９ １１
Ｈ 第 ３ 図 ２０ ４０ ６０ 温 度 （ＯＣ）
ＩＰ０ ０３５４株から得られたＤＨＡＫ（Ｉ）および
ＤＨＡＫＧＤの至適ｐｌ＋を表す図であり、第２図は同
じく安定ｐｔ＋範囲、第３図は至適温度、第４図は温度
安定性、第５図はＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマ
トグラフィーにおける溶出パターンをそれぞれ表す図で
ある。 特許出願人 天野製薬株式会社 第１図 ６ ７ ８ ９ 第２図 ３ ５ ７ ９ １１
Ｈ 第 ３ 図 ２０ ４０ ６０ 温 度 （ＯＣ）
Claims (1)
- シゾサツカロミセス属に属するジヒドロキシアセトンキ
ナーゼ産生菌を栄養培地に培養しジヒドロキシアセトン
キナーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とするジヒドロキシアセトンキナーゼの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58067627A JPS59196088A (ja) | 1983-04-16 | 1983-04-16 | ジヒドロキシアセトンキナーゼ及び製造法 |
| US06/598,746 US4579822A (en) | 1983-04-16 | 1984-04-10 | Process for producing dihydroxyacetone kinase |
| CA000451739A CA1209505A (en) | 1983-04-16 | 1984-04-11 | Process for producing dihydroxyacetone kinase |
| EP84109933A EP0135166A1 (en) | 1983-04-16 | 1984-04-13 | Process for producing dihydroxyacetone kinase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58067627A JPS59196088A (ja) | 1983-04-16 | 1983-04-16 | ジヒドロキシアセトンキナーゼ及び製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59196088A true JPS59196088A (ja) | 1984-11-07 |
| JPH0429349B2 JPH0429349B2 (ja) | 1992-05-18 |
Family
ID=13350403
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58067627A Granted JPS59196088A (ja) | 1983-04-16 | 1983-04-16 | ジヒドロキシアセトンキナーゼ及び製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4579822A (ja) |
| EP (1) | EP0135166A1 (ja) |
| JP (1) | JPS59196088A (ja) |
| CA (1) | CA1209505A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4942910A (en) * | 1986-11-07 | 1990-07-24 | Fantasy Flavors Inc. | Process and apparatus for making shaped confections |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999032638A1 (fr) * | 1997-12-22 | 1999-07-01 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Procede de production de dihydroxyacetone 3-phosphate |
-
1983
- 1983-04-16 JP JP58067627A patent/JPS59196088A/ja active Granted
-
1984
- 1984-04-10 US US06/598,746 patent/US4579822A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-04-11 CA CA000451739A patent/CA1209505A/en not_active Expired
- 1984-04-13 EP EP84109933A patent/EP0135166A1/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY=1982 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4942910A (en) * | 1986-11-07 | 1990-07-24 | Fantasy Flavors Inc. | Process and apparatus for making shaped confections |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1209505A (en) | 1986-08-12 |
| EP0135166A1 (en) | 1985-03-27 |
| US4579822A (en) | 1986-04-01 |
| JPH0429349B2 (ja) | 1992-05-18 |
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