JPS59193353A - 分析試薬、分析方法および多層化学分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な過酸化水素分析用の試薬、こ扛を用いる
過酸化水素の分析方法、こｆＬ’ｉ用いるベルオキシダ
ーゼの分析方法、■？工びこｆＬ’ｆｆ含む多層化学分
所、要素に関するもので、さらに詳しくは過酸化水素の
存在下、ペルオキシダーゼなど酸化作用全４１１−る物
質が触媒として働き、呈色する新規な発色体、こｎ’ｌ
用込ろ過酸化水素の比色亢奮方法、こｆＬを用いるペル
オキシダーゼ活性の比色定斌方法、およびこｆＬ全含む
過酸化水素または過酸化水素を生成しうるアナライト（
被検体）の定量分析またはペルオキシダーゼ活性の定量
分析に適し次多層化学分析要素に関するものである。

近年、臨床検査における酵素学的分析方法は、その特異
性が高く評価さｎ１急速に普及しつつある。そｎらのう
ち、尿および液体中のグルコース、尿酸、コレステロー
ル、トリグリセリド、乳酸、クレアチニン、遊離脂肪酸
、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、グルタ
ミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、コリンエステ
ラーセ、クレ゛アアンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酸素
などを測定する方法としてそ１１．ぞ几の系に３ける最
終的に定置すべ＠ｖＤ員の酸化酵素を作用させて生成し
た過酸化水素を定量することにより、目的物を定量する
方法がしばしは用いら几てｂる。

過酸化水素の定量方法としては、例えは特開昭６０−／
／、！ｒざ２２．特開昭ｊｆ！−／１０ざり７、特開昭
タグ−。２夕とりλ、特Ｉ用昭１１−２０≠７７１特開
昭ｊよ−７２６７６、特開昭５！−ｌコ１／≠２、特開
昭３３−／３／≠ｏｏ、待開詔Ｊ゛Ａ−，３７３！７．
特開昭ｊ乙−３９０７２、特開昭！乙−≠２！タタ、特
開昭ｊ７−／弘コ３１，２、特開昭３７−／！０３り７
等の各四澗沓に開示の方法が知ら几ている。こｎらの方
法はペルオキシダーゼの存在下に′“：　ｏ　　）　”
Ｊジン、λ、７−ジアミツフルオレン、Ｎ、Ｎ−ジメチ
ル−ｐ−フェニレンジアミン、０−ジアニシジン、０−
アミノンエノール等の色原体を酸化型の発色体に変化さ
せて比色定量する方法、≠−アミノアンチピリンとフェ
ノール又はＮ、Ｎ−ジアルキルアニリンあるいはＮ、Ｎ
−ジアルキルトルイジンとの組合せ、３−メチル−２−
ベンゾチアゾリノンヒドラゾンと０−）リジン又ｆｌＮ
、Ｎ−ジメチルアニυンＡるいｆｌＮ　、　Ｎ−ジエチ
ルアニリンとの組合せ、あるいは二量体全形成するグー
メトキシ−／−す７トール及びその誘導体等の色原体孕
酸化縮合させて発色体として比色定ｔする方法等である
。

こｎらの化合物では、７モルの発色体（色素）を形成す
るために２モルの過酸化水素を必要とするため、微量成
分の定量にとって、不利な方法である。そｎ故１モルの
色素音形成するために、ｌモルだけの過酸化水素で十分
な過酸化水素定量用試薬が望ま庇ていた。

本発明の目的は、ペルオキシダーゼの触媒作用または関
与の下に７モルの過酸化水素で１モルの色票を形成しう
る、高感度の過酸化水素定量用試薬、その試薬音用いる
過酸化水素の定量方法、およびその試薬を含む試薬層を
有する過酸化水素定量用多層分析要素を提供することで
ある。

本発明者は、下記一般式（１）で表わき几る化合物を用
いることにより前記の、目的が達成さｎること全見出し
た。

一般式〔／〕において、Ｒはオルト位またはパラ位がヒ
ドロキシル基で置換さｎ、たアリール基を表わ丁。Ｒお
よびＲはそ１１　（Ｊｎアリール基、置換アリール基ま
たはフリル基を表わし、ＲとＲ３の少なくとも一方はフ
リル基である。

一般式〔ｌ〕のＲＴ：Ｒわされるヒドロキシアリール基
はヒドロキシル基のほかにハロゲン原子（塩紫原子、臭
紫原子など）、シアン基、アルコキシ基、モノアルキル
アミノ基、シアルアルキルアミノ基などの置換基全７個
、ま７こは同種ま７ζは異種のこｆＬらの１ｆａ、侯基
葡２個以上宿してもよい。

Ｒ２ｐｊびＲで表ゎさＩＬる置換アリール基はハロゲン
原子（ｊＭ索原子、゛臭素原子など）、ヒドロキシル基
、シアン基、アルコキシ基、モノアルキルアミノ基、ジ
アルキルアミン基などの置換基を１個、または同種′！
ｌ：瓦は異種のこ１．らの置換基？λ個以上有するアリ
ール基である。

Ｒ１で表わさｎる＠換アリール基の好ましい具体例は２
−ヒドロキシフェニル基、クーヒドロキシフェニル４．
　３　ｒ　３−ジブロモ−≠−ヒドロ・キシフェニル基
、３−ブロモ−弘−ヒドロキシ−よ一メトキシフェニル
基％　３−メトキシ−≠−ヒドロキシンエニルＭ、３ｓ
ｓ−ジメトキシ−弘−ヒドロキシフェニル基である。

Ｒ及びＲで表わさｎる置換基の好ましい具体例は、Ｒに
関する上記の例のほか、弘−（ジメチルアミノ）フェニ
ル基％クー（ジエチルアミン）フェニル基、≠−メトキ
シフェニル基、４’−エトキシフェニル基”、フェニル
基、フリル基である。

次に一般式〔ｌ〕で表わさｎる化合物のうち好ましいも
のの具体例を示すが、本発明の範囲はこｎらの化合物の
みに限足さ几るものではない。なお、以下でＭｅはメチ
ル基、Ｅｔはエチル基、Ｐ’ｒは２−フリル基を表わす
。

ｅｚＮ Ｊシｔ２Ｎ ＯＭｅ 一般式〔ｌ〕で表わさｎる新規化合物は日本化学雑誌第
λｇ巻第７号／２３頁（１９６／年）、米国特許第３２
り７７１０号に記載さ几ている方法に従って合成するこ
とができる。次に一般式〔／〕で示さｆＬる化合物の合
成例を示すが以下に具体的に示さｌｔ″１５ていない化
合物も以下の合成例に準じて容易に合成することができ
る。

合成例１　化合物（３）、２−（≠−ヒドロキシー３゜
！−ジメトキシフェニル）−ｔａ−［：≠−（ジメチル
アミノ）フェニル〕−！ −（２−フリル）イミダゾールの合成 フロ（ｐ−ジメチルアミノ）ベンジル（スナわち２−フ
リルｐ−（ジメチルアミノ）ンエニルジケトン）４ｔ、
ざ２、シリンガアルデヒド（すなわチク−ヒドロキシ−
３，ｊ−ジメトキシベンズアルデヒド）３．６？、酢酸
アンモニウム１ｔｙ２氷酢酸／、５′０ｒＩＬｌ中で２
時間加熱還流して反応させた。冷却後水３００ｍ１．ｆ
加え水冷］アンモニア水をカロえ中オロしたところ洛ｉ
晶が析出し１こ。生じた結晶−＜ｐ取し、水洗、乾屁後
、ベンゼンで熱時処理して白色の結晶として化合物（３
）がｔｆｉ′得らｆ′Ｌだ。

融点　２．２０°Ｃ以上（分角′ｔ） 合成例２　化合物（５）、Ｊ−（４ｔ−ヒドロキシ−３
゜ｊ−ジメトキシフェニル）−グ、Ｊ−−ジ（，２−フ
リル）イミダゾールの合成フリルｊ７、シリンガアルデ
ヒドｊｖ、酢酸アンモニウムλ０７ン氷酢Ｈｐ　ｌ、　
Ｏｍｌ；中で２時間加熱還流して反応させた。その後合
成例１と同様に処理し化合物（５）が３７得らｆＬｌこ
。融点　２≠００Ｃ以上（分解） 本発明の過酸化水素分析用試薬は、各成分をそｊ、ぞｆ
別個め固体（粉末または顆粒など）として、あるいは水
溶液または緩衝水溶液として調製し、使用時、すなわち
被検試料を定量分析する操作の際にこｎ、らの形の成分
上紐み合わせ混合して使用することができ、また各成分
の固体（粉末ま罠は顆粒など）の混合物、あるいは全成
分金倉む水溶液または緩衝水溶液としてあらかじめ調製
しておいて使用することもできる。全成分を含む溶液と
して用いる場合ｃ／ｃは各成分を同時にあるいは適宜な
順序で溶解して全成分を含む水溶液または緩衝水溶液を
調製することができる。

本発明の過酸化水素分析用試薬の好ましい用途態様例と
して、特開昭ｌター５３ｇｇｇ、特開昭３０−／３７／
タス、特開昭ｊ／−≠Ｏ／り１１特開昭ｊｊ−タｏｇｚ
り、特開昭！！；−／Ａ弘３１、＜％特開昭３７−１．
Ａ３ｊり、実開昭５７−≠フタ３フ等の各明＃Ｉ書に開
示さ几ているような水不透過性光透過性支持体の上に試
薬層および多孔性展開層（ま１ζは定面績多孔性層）が
この順に設けられてなる一体型多層化学分析要素（フィ
ルム−１友はシート）の試薬層の中に（または必要によ
り設けらｎる他の）曽の中と試薬層の中に）本発明の試
薬の各成分を配合して含有させる態様がある。

本発明の過酸化水素分析用試薬と過酸化水素との反応（
呈色反応）は例えば〔１〕式により表ゎさｎ、る。

０　　　　　　０ へ　　　　　≧ 反応〔２〕により色素（色素Ａ）が化学量論的に生成す
る′ので、生成した色素の吸光度測定または反射分光光
度測定を実施することによりあらかじめ作成した検量線
にもとづいて過酸化水素の定量を行うことができる。

本発明の過酸化水素分析用試薬は１モルの過酸化水素力
・ら１モルの色素が生成するので、被検試料力・ら過酸
化水素を高感度で定量することができるのが特徴点であ
る。

本発明の分析方法は、例えば次のように実施することが
できる。

被検試料に一般式（１）で表わさｎるイミダゾール紡専
体、および反応触媒としてのペルオキシダーゼを前記の
形で同時に、または適宜のノ順序で添加し、混合物２ｚ
”Ｃから≠ｏ　ＣＣ，好ましくは２０°Ｃ７１・ら弘Ｏ
０Ｃの軸回の温度およびｐＨ３，０から７．０、好まし
くはｐ）１≠、夕からｒ、　　　　−０の範囲において
７分から６０分の時間範囲におりて反応を進行させ、生
成した色素を含有する反応混合！吻の吸光度を測定する
。あるいは前Ｒｔの諸特許明ａ書に記載された多層化学
分析要素（フィルムまたはシート）中に一般式（１）で
表わさｎるイミダゾール誘導体およびペルオキシダーゼ
を含有させ、その多孔性展開層に約６μｔから約ｌ！μ
ｔの被検試料液、またはその定面積多孔性層に約ｉｏμ
Ｌから約３０μＬの範囲内の一定量の被検試料液全点着
し、コＯ′Ｃから≠００Ｃ・好ましくは２ｓ”Ｃから≠
０６Ｃの範囲の温度で１分から２θ分、好ましくは２分
から１０分め時間範囲でインクベーションし多層化学分
析要素の光学濃度を反射分光測光する。吸光度ま１こは
反射光学濃度の測定方法はｅｎｄ　　ｐｏｉｎｔ法およ
びｒｅａｃｔｉｏｎ　　ｒａｔｅ　法を適宜に選択して
実施することができる。

本発明の分析試薬、分析方法および多層化学分析要素は
アナライトとして微量の過酸化水素（または過酸化水素
を生成しうるアナライト）を含む試料の過酸化水素の定
量に特に有利である。

本発明に秒い１、定量試楽として一般式（１）で示さｎ
るイミダゾール誘導体２よびペルオキシダーゼのｌミか
に、さらに酸化酵素を組合わせることによって、よシ広
い＠囲への応用が可能となる。

すなわち、最終的に定量すべ＠物質が酸化酵素の作用に
より過酸化水素を生成する場合に、酸化酵素會本発明の
試楽系に組み合わせることによって、生成する過酸化水
素を定量して目的とする種々の物質ヶ定量することが可
能になる。具体的には、尿および液体（例、血液）の中
のグルコース、尿酸、コレステロール、トリグリセリド
、乳酸、クレアチニン、遊ＰｊＲＪＪ１ｆ肪酸、グルタ
ミン酸ピルビン醒トランスアミナーゼ、グルタミン酸オ
キザロ酸ｅ）ランスアミナーゼ、コリンエステラーゼ、
クレアチンホスホキナーゼ、乳酸脱水累＃累なトに測定
することができる。

こノ１．らのｌ＋ｌｌＩ定に用いる酸化酵素としては、
グルコースオキシダーゼ、ウリカ〜セ、コレ、ステロー
ルオキシダーゼ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシグーゼ
、ビルヒンはオキシダーゼなどが挙けらτｌる。こｎら
の酸化酵素はいかなる起非のものでもよい。

酸化酵素を併用する場合には、酸化酵素の作用によりＨ
２Ｏ２にあらかじめ生成させてもよいが、Ｈ２Ｏ２生成
反応と発色反応全同時に進行させることが好ましい。酸
化酵素の使用量はその種類、目的とする基質、または混
在物などに応じて適宜定めら几る。

本発明に用いらｎ、るはルオキシダーゼは過酸化水素に
よる水素供与体の酸化反応の触媒である。

ペルオキシダーゼとして特公昭ｊ４−≠５５タタ、特公
ｌ１８３７−！；５．２０等に開示の・ト）＾物起源お
よび動物起源のペルオキシダーゼ（ＥＣ／、／／。

７）、および特開貼ｊ７−タタ／りλ等に一４示の微生
物起源のベルオキシタ゛−ゼ（ＥＣ／、／／。

７）のうちから適宜に／柚ま疋はλ稙以上？組合せて用
することができる。

植物起源のペルオキシダーゼの例として、西洋わさび、
じゃがいも、いちじく樹液、かふ、だいこんから抽出さ
１．たペルオキシダーゼを、動物起源のペルオキシダー
ゼの例として、牛乳から抽出さ２″Ｌ７（ラクトペルオ
キシダーゼ、白血球から抽出、！′ｉ″Ｌ、７コベルド
ベルオキシダーゼを、微生物起源のペルオキシダーゼと
して７〜１ｔｅｒｎａｒｉａ　　屈、Ｃｏｅｈｌｉｏｂ
ｏｌｕｓ　、’ｉ’ｑ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　　ｋＬ
Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ８Ｖｒ、ｌＡし非特異的ペル
オキシダーゼ生産能葡有する微生′吻起ふのペルオキシ
ダーゼ７、そノーＩ、そ）ｔあげることができる。

その他に９守公昭ｊ＆−ψタタデ９、特公昭タフ−ｓｓ
、ｚｏ＊ｐｖｃし１ｊ示のチオシアン酸鉄、タンニン酸
鉄、フェロシアン化鉄（いう”■も鉄（＋コ）化合物）
、クロム硫酸カリウム、沃化ナトリウム、沃１じカリウ
ム、モリブデン散アンモニウム、モリフテン酸カリウム
等のペルオキシダーゼ活性を有する無依化合物を用いる
こともできる。

こｎらのうちで植物起源１πは微生物起源の非特異的ペ
ルオキシダーゼが好ましい。

ＵｊＪ述の式（−２，１の例Ｖ？−φらスしるように、
ペルオキシダーゼの触媒作用のもとて一般式〔／〕で表
わさｎるイミダゾール化合物と過酸化水素とが化学量論
に従って反応して色素全生成するので、試薬として一般
式〔／〕で表イノさノ１．るイミダゾール化合物とＨ２
０２を組みあわせた試薬または両者を含む多層化学分析
要素に活性値が未知のペルオキシダーゼ？含む試料全添
加ま７Ｃは点着し生成する色素を測定することにより試
料中のペルオキシダーゼ活性ン分析または定量すること
ができる。

この方法ははルオキシダーゼ？標識物質として用いた酵
索児投測定法にオリ用できる。

本発明は人ば〃りでなく神々の動物・例えば家畜、愛玩
動物、実験動物などの尿、体液（例、血液）などの過酸
化水素ま１ζは過酸化水素水溶液しうるアナライトの分
析にももちろん利用できる。

以下、実施例により本５ｔ′明忙芒らに具体的に詳細に
説明する。

実施例１ （１）発色液のｓｌｌ　ｋド化合＋吻（３）　／　ｊ　
１ｖ′に／　０１’＋７のアセトンに溶解しペルオキシ
ダーゼ；０層０単位紫ｐｉ１７．ｊの硼酸塩緩函水舒赦
に浴解し全容をλｊ　ｔｎｌ　ＶＣして発色液全調製し
た。

（２）　　過酸化水素の定量二発色ｈ３ｍｉ＊試料セル
にとり・温度既知の過は化水累２０μｔを加えて、ブラ
ンク（過酸化水素水溶液のかわりに蒸留水を加え罠もの
）荀対照として３７°ＣでＩＯ秒後波長夕２０Ｂで吸光
度才測定し、次の請果全得７ζ。

実施例− ゼラチン下塗９層を有する厚さｌδ゛！μｍの無色透明
ホリエナレンテレンタレート（ＰＥＴ）フィルムの上に
次の成分からなる試も増血布液全塗イロし乾燥妊せた。

Ｃ以下、数値は乾燥後の各層における各成分の）（含有
割合分示す。

試薬層塗布液の成分（溶媒二適宜量の水ウリカーゼ　　
　　　　　　　　１ｒｏＵ７’ｍ２化合物（３）　　　
　　　　　　　　０．２グ／ｍ２ペルオキシダーゼ　　
　　　、２！ＯＯＵ／ｍ２ゼラチン　　　　　　　　　
　　　７０１７ｍ２ｐＨ１，！硼酸塩緩衝剤 調製さＴ′Ｌ、π試薬層を水で湿潤させ、その上に多孔
性展開層としてセルロースアセテートメンブランフィル
タ−（平均孔径３．０μｍ、厚さ７ｇθμｍ、富士写真
フィルム社製ミクロフィルターＦＭ−３００■）をラミ
ネートして一体化させて尿酸定量用多層化学分析要素を
調製した。

えられた多層化学分析要素を評価するために尿ｅ水ｍ液
＜濃ｌｉｄ　ｉ　／　０　；　／　２ｍ９７ｄ　ｔおよ
び尿酸不含のブランク溶′ｅ、）の各１０μｔ２多孔件
展開層に点着し、３７６Ｃで２分インクベーションした
後直ちにマゼンタフィルターを備え１こマクベス反射分
光光度計音用いてＰＥＴフィルム側から発色光学線度を
測足波長ｊ２０１ｊｎｎ近傍で反射測光し、次の値をえ
九〇 尿酸溶液（濃度Ｉｌ夕／ｄｔ　）　　　反射光学限度Ｏ
（ブランク）　　　　　　　　Ｏ０≠２１、　　　　　
　　　　　　　　　　０．７２１θ　　　　　　　　　
　　　　　０．１７／２　　　　　　　　　　　　　０
．　タｊこの結果から、この多す化学分析要素を用い、
反射側光により比色法によって尿酸濃度の定量を実施で
きることが明らかになった。

実施例３ ゼラチン下塗層を有する厚さ１ｇ！μｍの無色透明１′
ＥＴフイルムの上りこ次の成分からなる試薬層塗布ｇを
塗布し乾燥させた。

試楽崩塗イＦ液の成分ＣＭ媒：コ１δ宜量の水）！：）
＋）カーゼ　　　　　　　　　　２００Ｕ／ｍ２化合物
ｊ（３）　　　　　　　　　　　０．２？／ｍ２ゼラチ
ン　　　　　　　　　　　１ｏ１７Ｈ１ペルオキシダー
ゼ　　　　　３０００Ｕ／Ｈ１２オクチルンエノキシボ
リ　　０　、　／　Ｊｆ　ｔ、７ｍ　２エトキシエタノ
ール （トリトンＸ−１００■） ｐＨざ、ｊ硼酸塩緩衝剤 試薬層の上に次の゛成分からなる光反射層塗布分散液全
塗布し乾燥させた。

光反射層塗布分散液の成分（分散媒：適宜量の水） 二液化チタン微粉末　　　　　　　３　ｔ　／　ｍ　２
ゼラチン　　　　　　　　　　　　／　Ｓ’　／　ｒｎ
　２オクチルフエノキシポリ　　　０．１７７ｍ２エト
キシエタノール 光反射層の上にさらに次の成分からなる妨害物質排除層
塗布液？塗布乾燥させた。

妨害物排除層塗布赦の成分（溶媒：適宜量の水）アスコ
ルビン酸オキシダ　　≠０ＯＯＵ／ｍ２−ゼ ゼラチン　　　　　　　　　　　　４’　ｆ　／　ｒＨ
２ｐＨＪ’、ｊ硼酸塩緩衝剤 このようにてきあがつ１こ妨害物排除層を水で湿潤させ
ておき、１００番手の益糸から織らｒｔたブロード布（
水洗し脱Ｉｊａさｎた後乾燥さｎた布）をラミネートし
一体化させて尿酸定量用多層化学分析要素を調製した。

ついで実施物２と同様にして既知の尿酸濃度に対する多
層化学の分析要素の発色反射光学濃度値ヶえた。

ｗ酸浴液（’ｔｔ度Ｉｎｇ／　ｄｉ　）　　　反射光学
ｆａＷＯ（ブランク）　　　　　　　　０．２７ｔ　　
　　　　　　　　　　　　　Ｏ，≠ざｌＯθ、ｔコ １２　　　　　　　　　　　　　θ、＆／ｒ実施例４ ゼラチン下塗り）ＦＩｋ有する厚さ／♂夕μｍの無色透
明ＰＥＴフィルムの上に次の成分からなる試薬層塗布液
を塗布し乾燥させて第二試薬層を形成し罠。

第二試薬層塗亜散の成分（浴媒：適宜量の水）ペルオキ
シダーゼ　　　　　ｊＯＯＯＵ／ｍ２化合物（，３）　
　　　　　　　　　　　　、　／　？　／　ｍ　２ゼラ
チン　　　　　　　　　　　／　０１ｉ’　／　ｍ　２
オクチルフエノキシポリ　　０．ｌｊｆ／ｍ２エトキシ
エタノール （トリトンＸ−１ｏｏ■） ｐＨ６，６燐酸塩緩衝剤 この層の上に次の成分からなる光反射油塗布分散液を塗
布し乾燥させて光反射層全形成した。

光反射油塗布分散液の成分（分散媒：適宜量の水） 二酸化チタン微粉末　　　　　　　３　？　／　ｍ　２
ゼラチン　　　　　　　　　　　１７／ｍ２オクチルフ
ェノキシポリ　　　０．／ｆ！／ｍ２エトキシエタノー
ル さらにこの層の上に次の成分からなる試薬層塗布液を塗
布し乾燥させて第−試薬揄孕形成した。

第一試薬層塗布液の成分（溶媒：適宜量の水）コレスプ
ロールオキシダ　　２０００ＴＪ／Ｈ１２−ゼ ゼラチン　　　　　　　　　　　ＩＯ’ｆ／ｍ２オクチ
ルンエノキシボリ　　　０．１１７ｍ２エトキシエタノ
ール ｐ　ｌ−１６，！燐酸塩緩衝剤 ついで第一試薬ｆＭｋ水で湿飼し、その上にセルロース
アセテートメンブランフィルタ−（平均孔径３．０μｍ
５厚さ／ｇθμｍ、ハ士与Ａフィルム社製ミクロフィル
ターＩ”Ｍ−３θθ■）ヲ軽く圧肴ラミネート１〜一体
化させて多孔性展開層を設け、コレステロール定量用多
層化学分析侠素紫調製した。

えらＴＬｌこコレステロール足量用多層化学分析袋２に
評価する７ζめにコレステロール含イｆコントロール血
γ１′ｆ（コレスプロール言イｉじ０：１００：）００
　；　３００　：６００〜／ｄｔｖよびコレステロール
不言のブランク）の各ｌＯμｔを展開層に点着し、３７
″Ｃで１０分インクベーションし、直チにマゼンタフィ
ルターを備えたマクベス反射分光元度計紫用いてＰＥＴ
フィルム側から発色光学跋度ケ測定彼長！λθｍ１ｌｉ
で反射細光し、仄の値才え１こ〇 ０（ブランク）　　　　　　　　ｏ、、ｚ７よ０Ｏ８ｌ
Ａｌｌ。

ｉｏｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｏ−ｔ。

、２００　　　　　　　　　　　　　　　０．Ｉ／３０
０　　　　　　　　　　　０・り７！００　　　　　　
　　　　　　　　　　　　／、　　／７この結果からこ
のコレステロール定量用多層化学分析要素を用い、反射
測光に工り比色法によってコレステロール含有量の定量
ケ実施できることが明らかになった。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　一般式〔ｌ〕で表わさｎるイミダゾール誘導
   体か２なることを特徴とする過酸化水素分析試薬。 式（１）において、Ｒ１はオルト位またはパラ位がヒド
   ロキシル基で置換されたアリール基を表わす。Ｒ２およ
   びＲ３はそｎぞれアリール基、置換アリール基またはフ
   リル基金表わし、ＲとＲ３の少なくとも一方はフリル基
   である。
2. （２）さらにペルオキシダーゼが組合せらＴしてなる特
   許請求の範囲ｌに記載の試薬。
3. （３）過酸化水素と一般式（１）で表わｉｆＬるイミダ
   ゾール誘導体とを反応させて生成する色素を検出するこ
   とを特徴とする過酸化水素の分析方法。 ■ 式〔ｌ〕において、Ｒ１はオルト位またはパラ位がヒド
   ロキシル基で置換さｎ、たアリール基を表わす。Ｒ２お
   よびＲ３はそ−ｎ−ｆニルアリール基・置換アリール基
   またはフリル基金表わし、ＲとＲの少なくとも一方はフ
   リル基である。
4. （４）前記反応をペルオキシダーゼの存在下で行わせる
   特ｉｆｆ請求の範囲３に記載の方法。
5. （５）前記色素の検出を比色により実施し、分析方法が
   定知１分析方法である特ＦＦ４Ｎ求の範囲３または≠に
   記載の方法。
6. （６）　　一般式〔／〕で表わさｎるイミダゾール誘導
   体と過酸化水素との反応にペルオキシダーゼを存在させ
   て行わせること？特徴とするペルオキシダーゼの分析方
   法。 式（１）において、Ｒ１はオルト位または／々う位がヒ
   ドロキシル基で置換さＲ７（アリール基金表わす。Ｒ２
   およびＲ３はそ几ぞｎアリール基、置換アリール基ま７
   Ｃはフリル基を表わし、ＲとＲＱ全少々とも一方はフリ
   ル基である。
7. （７）水不透過性光透過性支持体、試薬層および多孔性
   層をこの順に設けらｎてなる多層化学分析要素において
   、前記試薬層に一般式〔／〕で表わさ几るイミダゾール
   誘導体が含貰れることを％徴とする多層化学分析要素。 式〔／〕において、Ｒはオルト位ま１ζは／ξう位がヒ
   ドロキシル基で置換さｎ、たアリール基を表わす。１（
   およびＲはそｎ、ぞｎアリル・ル基、置換アリール基ま
   たはフリル基を表わし、ＲとＲの少なくとも一方はフリ
   ル基である。
8. （８）前記要素の中にさらにペルオキシダーゼが含ま才
   りる待￥Ｆ　’ａｆ２求の範囲乙に記載の要素。
9. （９）前記多孔性層が多孔性展開層である特許請求の範
   囲ｔまたは７に記載の要素。 （１（＋ｉ　　前記多孔性ルｉが定面ね（多孔性層であ
   る時Ｏｆｆ請求の範囲ｔまたは７に記載の要素。