JPS59173079A - セルラ−ゼ類の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はセルラーゼ類の回収方法に関し、さらに詳しく
は、セルラーゼやヘミセルラーゼなどのセルラーゼ類に
よるセルロース性物質の分解糖化終了液から、残存する
前記のセルラーゼ類を極めて簡便な操作によって高得率
で回収する方法に関するものである。

近年、エネルギー問題、環境汚染、未利用資源の有効利
用などの観点から、セルロース性物質の糖化の研究が盛
んに行われており、なかでも装置や操作が簡単であって
、しかも温和な条件で行うことができ、その上生成した
糖がそれ以上分解することのない酵素糖化法が有効な方
法として注目されている。

この酵素糖化法においては、一般に、酵素として用いる
セルラーゼやヘミセルラーゼなどのセルラーゼ類を生産
する費用が全経費の約半分を占めろといわれており、そ
のためこの高価な酵素を回収再利用することが極めて重
要な間頓となっている。

しかしながら、従来、セルロース性物質の分解糖化終了
液に遠心分離などを施して分離された溶液中に残存する
セルラーゼ類を回収する方法は種々提案されているもの
の、分離された固形物中に残存するセルラーゼ類を回収
する方法については、まったく提案されていない。した
がって、従来のセルロース性物質の酵素糖化法において
は、セルラーゼ類の回収率はたかだか３５〜４５係程度
にすぎない。

本発明者らは、セルロース性物質の分解糖化終了液から
分離された固形物中に残存するセルラーゼ類の量を、円
二色性測定装置を用いて測定することに成功し、その結
果この固形物中に残存するセルラーゼ類の量は、前記の
分解糖化終了液から分離された溶液中に残存するセルラ
ーゼ類の量よりも多いこと、したがって従来の酵素糖化
法においては、高価なセルラーゼ類の半分以上が未回収
のまま固形物とともに捨てられていることを知った。

また、不発明者らの研究により、該固形物中に残存する
セルラーゼ類の活性は、前記の浴液中に残存ずろセルラ
ーゼ類の活性と同様に、はぼ１００係近く保存されてい
ることも分った。

不発明者らは、このような事情に鑑み、セルラーゼやヘ
ミセルラーゼなどのセルラーゼ類によるセルロース性物
質の分解糖化終了液から、残存する該セルラーゼ類を簡
便な操作によって従来の方法では得られないような高得
率で回収する方法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、
該分解糖化終了液から分離された溶液中に残存するセル
ラーゼ類を通常の方法で回収するとともに、分離さ′れ
た固形物中に残存するセルラーゼ類を水溶性多糖類、オ
リゴ糖類又はアルコール類の水浴液若しくはｐＨ緩衝溶
液を用いて処理することにより、その目的を達成しうろ
ことを見出し、この知見に基づいて不発明を完成するに
至った。

すなわち、本発明は、セルラーゼ類によるセルロース性
物質の分解糖化終了液から該セルラーゼ類を回収するに
当り、まず分解糖化終了液を溶液と固形物とに分離した
のち、該溶液中から常法に　３− 従ってセルラーゼ類を回収するとともに、該固形物中に
残存するセルラーゼ類を水浴性多糖類、オリゴ糖類又は
アルコール類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液により処理
して回収することを特徴とするセルラーゼ類の回収方法
を提供するものである。

不発明方法において用いるセルロース性物質としては、
例えば針葉樹や広葉樹、南洋材や北洋材などから得られ
ろ木屑、のこぎり屑、樹皮、廃木材などすべての木質が
挙げられ、さらに農業廃棄物として廃棄するために経費
を必要とする稲ワラやサトウキビ、トウモロコシなどの
廃棄物、あるいは新聞紙、段ボールのような紙類などが
挙げられる。

また、不発明方法において用いる酵素のセルラーゼ類と
しては、例えばアスペルギルス属の菌体やトリコデルマ
属の菌体などから生産されるセルラーゼ若しくはセルラ
ーゼとへミセルラーゼを含む酵素などが挙げられろ。ま
た、不発明においては、これらの酵素はそれぞれ起源の
異なるものを単独で用いてもよいし、あるいは２梗以上
同時に４− 用イテモヨ（、さらに酵素源としてこれらの酵素を含む
菌体抽出液や菌培養液を用いろこともできる。

不発明方法においては、分解糖化終了液から、残存する
セルラーゼ類を回収するために、まず該分解糖化終了液
を遠心分離などの手段によって溶液と固形物とに分離し
たのち、該溶液中に含まれろセルラーゼ類を通常用いら
れている方法、例えば限外ろ過などによって回収する。

この際の回収率は溶液中の残存量に対し９０〜１００係
である。一方分離された固形物中に残存するセルラーゼ
類は、水溶性多糖類、オリゴ糖類又はアルコール類の水
浴液若しくばｐＨ緩衝溶液により処理して回収する。

このセルラーゼ類の回収に用いる水浴性多糖類としては
例えばグルコマンナンなどが、オリゴ糖類としては例え
ばセロビオースなどが、アルコール類としては例えばエ
タノールのよりな１価アルコールやエチレングリコール
のような多価アルコールなどが挙げられろ。また水溶性
多糖類やオリゴ糖類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液の濃
度は０．５〜５重量係の範囲が好適である。その濃度が
０．５重量係未満ではセルラーゼ類の回収効果が十分で
なく、一方上限の５重量係の濃度は水溶性多糖類やオリ
ゴ糖類のほぼ溶解限度である。これらの糖類の水溶液若
しくはｐＨ緩衝溶液を用いて得られたセルラーゼ類を含
有する回収液は、そのまま多糖類やオリゴ糖類の分解酵
素源として使用することができ、さらにセルロース性物
質の分解糖化酵素源として再使用できろ。一方アルコー
ル類の水溶液若しくばｐＨ緩衝溶液の濃度は１〜３０重
量係の範囲が好適である。この濃度が１重量係未満では
セルラーゼ類の回収効果は十分でなく、また３０重量係
を超えてもそれ以上の効果は認められない。

ｐｕ緩衝溶液は、回収後のセルラーゼ類の安定性を増す
ために用いられ、好ましいｐＨば３．０〜８０の範囲で
ある。このｐＨ緩衝浴液としては、通常酢酸緩衝溶液が
好ましく用いられろ。

不発明方法においては、分解糖化終了液から分離された
固形物を、前記の水浴性多糖類、オリゴ糖類又はアルコ
ール類の水溶液若しくはｐＨ緩衝浴液中に加え、室温〜
５５℃の温度で゛ゆるやかにかきまぜろか、あるいは振
と５などを行って該固形物と溶液を接触させるといった
極めて簡便な操作により、該固形物中に残存するセルラ
ーゼ類を、その残存量に対して６０〜７０係の得率で回
収することができろ。

不発明方法においては、セルロース性物質の分解糖化終
了液を溶液と固形物とに分離したのち、溶液と固形物の
それぞれから残存するセルラーゼ類を回収することによ
って、従来の溶液のみから残存するセルラーゼ類を回収
する方法に比べて、セルラーゼ類の回収率は約３０〜４
０係高く、７５〜８５係の高得率でセルラーゼ類を回収
することができる。また、回収されたセルラーゼ類の活
性は、本来の活性に比べて何ら低下が認められず、この
回収セルラーゼ類はセルロース性物質の分解糖化に再使
用することができる。したがって、セルロース性物質の
酵素糖化に不発明方法を適用することにより、その経費
を大幅に節減することができろ。

次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ ｐＨ４、５酢酸緩衝浴液１００ｍｇに粉砕したアカマツ
木粉４ｇを加え、さらに市販のアスペルギルス・ニゲル
起源のセルラーゼ（セルロジンＡＣり２０（ｌｌｉ’を
加えて４０℃で２４時間振とうしたのち、木粉の４０係
が分解した反応終了液を遠心分離により溶液と固形物２
．４ｇとに分離した。溶液には９０ｍｇのセルラーゼが
残存し、このセルラーゼを限外ろ過去により１００係回
収した。

一万固形物２．４Ｉを０．８重量％グルコマンナン水浴
液５５ゴ中に懸濁し、４０”Ｃで２時間振と５したのち
、遠心分離を行い、得られたグルコマンナン水溶液には
６７ｍ７のセルラーゼが含まれていた。回収されたセル
ラーゼは合計１５７ｍｆであり、回収率は７８．５係で
あった。

この回収されたセロビオース溶液に、あらたにアカマツ
木粉３．４ｇを加えて全容量８ｏ７！とじて酵素分解を
４０℃で行った結果、グルコース生成量は、セルラーゼ
１　ｍｇ・１時間当り１６５μモルであり、これは当初
の１６０μモルに比して、回収セルロジンＡＣの活性低
下は認められなかった。

実施例２ ５００ＣＣ容のフラスコに炭素源として適量のセルロー
ス粉末を加えた水溶性栄養培地１０ｏｆｎｅを入れて滅
菌したのち、これにトリコデルマ・ビＩＪ　テＱＭ４１
４を接種し、３０℃の温度で好気条件下に６日間培養し
た。培養液のｐＨは常に５．４に調節した。

別〕３００ＣＣ容フラスコに粒度２ｏ〜５０μのブナの
微粉砕木粉５ｇを入れ、これに前記の培養液５０−（酵
素含有量１２０ｍＬｉ）を加え、４０”Ｃにて４８時間
分解を行って木粉の５６係を分解したのち、反応終了液
を遠心分離により溶液と固形物とに分離した。溶液には
５０ｍｇの酵素が残存しており、限外ろ過により酵素４
２ｙｑを回収した。

一方固形物に４．５重量係セロビオーズ含有ｐＨ４，５
酢酸緩衝液７０−を加えて４０℃で２時間振とうしたの
ち、遠心分離を行って得られたセロビオース溶液には５
０ｍｌ１の酵素が含まれていた。酵素の全回収率は７７
ヴであった。

この回収された酵素溶液に、あらたにブナ木粉を加えて
酵素糖化な行った結果、セルビオーズの分解分をブラン
クとして差し引いても木粉に対して当初の酵素の活性と
同等の活性を示した。

実施例３ ｐＨ４、５酢酸緩衝溶液１００＋＋＋１！、に粉砕した
アカマツ木粉４ｇを加え、さらに市販のトリコデルマ・
ビビリデ起源のセルラーゼ（セルラーゼーオノヅカＲＩ
Ｏ）　２００ｍｙを加えて４０°Ｃで２４時間分解を行
ったのち、木粉の４５係が分解した反応終了液を遠心分
離により溶液と固形物２．２ｇとに分離した。

溶液にば１０（ＩＩｇのセルラーゼが残存し、限外ろ過
により８５７ｎｇのセルラーゼを回収した。

一方固形物２．２Ｉに４重量係エタノール含有ｐＨ４，
５酢酸緩衝溶液５０ｍｅを加えて３５℃で１時間振とう
し、７０■のセルラーゼを回収した。全セルラーゼ回収
率は７７．５％であり、回収セルラーゼの活性低下は認
められなかった。

実施例４ 新聞紙を乾燥し、−辺３ｍの正方形片として２ｇを５０
−の水に懸濁し、これにセルラーゼーオノヅカＲＩ０１
０（Ｉｌｇを加えて４０℃で２４時間分解を行ったのち
、反応終了液を遠心分離により溶液と固形物１．４ｇと
に分離した。溶液には３５ｍ’ｉのセルラーゼが残存し
ていた。

前記で得られた固形物１．４ｇに１５重量係エチレング
リコール水溶液４０−を加えて４０℃で２時間眼とうし
た結果、セルラーゼ４７ｍｇを含有したエチレングリコ
ール水溶液として回収した。回収セルラーゼの活性低下
は認められなかった。

実施例５ とうもろこし茎を乾燥してすりつぶした粉末４ｇを１０
０ｍ１のｐＨ５、Ｑの酢酸緩衝液中に懸濁し、これにト
リコデルマ・ビリデ起源のセルラーゼ（セルラーゼーオ
ノヅカＲＩＯ）　１００　ｍｇとアスペルギルス・ニゲ
ル起源のセルラーゼ（セルロジンＡＣ）１００ｐ１ｇを
加えて３５°Ｃで２時間分解したのち、反応終了液を遠
心分離により溶液と固形物３．２ｇとに分離した。溶液
から１００■のセルラーゼを回収することができた。

一方、固形物３．２ｇに１２重量係エタノール含有声５
．０酢酸緩衝溶液５０−を７１０えて３５℃で２時間振
とうしたのち、遠心分離によりセルラーゼ６３■含有の
エタノール溶液が得られた。全セルラーゼ回収率は８１
．５％であった。

また、回収されたセルラーゼ溶液に粉砕したアカマツ木
粉を加えて分解を行ったところ、単位時間当りの分解率
は、最初の混合酵素によるアカマツ木粉の分解率と変り
がなかった。

特許出願人　工業技術院長　石　坂誠　−指定代理人　
　工業技術院大阪工業技術試験所長内藤−男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　セルラーゼ類によるセルロース性物質の分解糖化終
   了液から該セルラーゼ類を回収するに当り、まず分解糖
   化終了液を溶液と固形物とに分離したのち、該溶液中か
   ら常法に従ってセルラーゼ類を回収するとともに、該固
   形物中に残存するセルラーゼ類を水浴性多糖類、オリゴ
   糖類又はアルコール類の水浴液若しくばｐＨ緩衝溶液に
   より処理して回収することを特徴とするセルラーゼ類の
   回収方法。 ２　水溶性多糖類又はオリゴ糖類の水溶液若しくはｐＨ
   緩衝溶液の濃度が０．５〜５重量係である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ６　アルコール類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液の濃度
   が１〜３０重量係である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ４　　ｐＨ緩衝溶液のｐＨが３．０〜８．０である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。