JPS6024713B2 - セルラ−ゼ類の回収方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はセルラーゼ類の回収方法に関し、さらに詳しく
は、セルラーゼやへミセルラーゼなどのセルラーゼ類に
よるセルロース性物質の分解糖化終了液から、残存する
前記のセルラーゼ類を極めて簡便な操作によって高得率
で回収する方法に関するものである。

近年、エネルギー問題、環境汚染、未利用資源の有効利
用などの観点から、セルロース性物質の糖化の研究が盛
んに行われており、なかでも装置や操作が簡単であって
、しかも温和な条件で行うことができ、その上生成した
糖がそれ以上分解することのない酵素糖化法が有効な方
法として注目されている。

この酵素糖化法においては、一般に、酵素として用いる
セルラーゼやへミセルラーゼなどのセルラーゼ類を生産
する費用が全経費の約半分を占めるといわれており、そ
のためこの高価な酵素を回収再利用することが極めて重
要な問題となっている。

しかしながら、従来、セルロース性物質の分解糖化終了
液に遠心分離などを施して分離された溶液中に残存する
セルラーゼ類を回収する方法は種々提案されているもの
の、分離された固形物中に残存するセルラーゼ類を回収
する方法については、まったく提案されていない。

したがって、従来のセルロース性物質の酵素糖化法にお
いては、セルラ−ゼ類の回収率はたかだか３５〜４５％
程度にすぎない。本発明者らは、セルロース性物質の分
解糖化終了液から分離された固形物中に残存するセルラ
ーゼ類の鼻を、円二色性測定装置を用いて測定すること
に成功し、その結果この固定物中に残存するセルラーゼ
類の量は、前記の分解糖化終了液から分離された溶液中
に残存するセルラーゼ類の量よりも多いこと、したがっ
て従来の酵素糖化法においては、高価なセルラーゼ類の
半分以上が未回収のまま固形物とともに捨てられている
ことを知つた。

また、本発明者らの研究により、該固形物中に残存する
セルラーゼ類の活性は、前記の溶液中に残存するセルラ
ーゼ類の活性と同様に、ほぼ１００％近く保存されてい
ることも分った。

本発明者らは、このような事情に鑑み、セルラーゼやへ
ミセルラーゼなどのセルラーゼ類によるセルロース性物
質の分解糖化終了液から、残存する該セルラーゼ類を簡
便な操作によって従来の方法では得られないような高得
率で回収する方法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、
該分解糖化終了液から分離された溶液中に残存するセル
ラーゼ類を通常の方法で回収するとともに、分離された
固形物中に残存するセルラーゼ類を水溶性多糖類、オリ
ゴ糖類又はアルコール類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液
を用いて処理することにより、その目的を達成しうろこ
とを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至
った。

すなわち、本発明は、セルラーゼ類によるセルロース性
物質の分解糖化終了液からセルラーゼ類を回収するに当
り、まず分解糖化終了液を溶液と固形物とに分離したの
ち、該溶液中から常法に従ってセルラーゼ類を回収する
とともに、該固形物中に残存するセルラーゼ類を水溶性
多糖類、オリゴ糖類又はアルコール類の水溶液若しくは
ｐＨ緩衝溶液により処理して回収することを特徴とする
セルラーゼ類の回収方法を提供するものである。

本発明方法において用いるセルロース性物質としては、
例えば針葉樹や広葉樹、南洋材や北洋材などから得られ
る木屑、のこぎり屑、樹皮、廃木材などすべての木質が
挙げられ、さらに農業廃棄物として廃棄するために経費
を必要とする稲ワラやサトウキビ、トウモロコシなどの
廃棄物、あるいは新聞紙、段ボールのような紙類などが
挙げられる。また、本発明方法において用いる酵素のセ
ルラーゼ類としては、例えばアスベルギルス属の菌体や
トリコデルマ属の菌体などから生産されるセルラーゼ若
しくはセルラーゼとへミセルラーゼを含む酵素などが挙
げられる。

また、本発明においては、これらの酵素はそれぞれ起源
の異なるものを単独で用いてもよいし、あるいは２種以
上同時に用いてもよく、らに酵素源としてこれらの酵素
を含む菌体抽出液や菌培養液を用いることもできる。本
発明方法においては、分解糖化終了液から、残存するセ
ルラーゼ類を回収するために、まず該分解糖化終了液を
遠心分離などの手段によって溶液と固形物とに分離した
のち、該溶液中に含まれるセルラーゼ類を通常用いられ
る方法、例えば限外ろ過などによって回収する。

この際の回収率は溶液中の残存量に対し９０〜１００％
である。一方分離された固形物中に残存するセルラーゼ
類は、水溶性多糖類、オリゴ糖類又はアルコール類の水
溶液若しくはｐＨ緩衝溶液により処理して回収する。こ
のセルラーゼ類の回収に用いる水溶性多糖類としては例
えばグルコマンナンなどが、オリゴ糖類としては例えば
セロビオースなどが、アルコール類としては例えばエタ
ノールのような１価アルコールやエチレングリコールの
ような多価アルコールなどが挙げられる。また水綾性多
糖類やオリゴ糖類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液の濃度
は０．５〜５重量％の範囲が好適である。その濃度が０
．５重量％未満ではセルラーゼ類の回収効果が十分でな
く、一方上限の５重量％の濃度は水潟性多糖類やオリゴ
糖類のほぼ溶解限度である。これらの糠類の水溶液若し
くはｐＨ緩衝溶液を用いて得られたセルラーゼ類を含有
する回収液は、そのまま多糖類やオリゴ糖類の分解酵素
源として使用することができ、さらにセルロース性物質
の分解糖化酵素源として再使用できる。一方アルコール
類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液の濃度は１〜３の雲量
％の範囲が好適である。この濃度が１重量％未満ではセ
ルラーゼ類の回収効果は十分でなく、また３の重量％を
越えてもそれ以上の効果は認められない。解緩衝溶液は
、回収後のセルラーゼ類の安定性を増すために用いられ
、好ましいｐＨは３．０〜８．０の範囲である。このｐ
Ｈ緩衝溶液としては、通常酢酸緩衝溶液が好ましく用い
られる。本発明方法においては、分解糖化終了液から分
離された固形物を、前記の水溶性多糖類、オリゴ糖類又
はアルコール類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液中に加え
、室温〜５５ｑｏの温度でゆるやかにかきまぜるか、あ
るし、は振とうなどを行って該固形物と溶液を接触させ
るといった極めて簡便な操作により、該固形物中に残存
するセルラーゼ類を、その残存量に対して６０〜７０％
の得率で回収することができる。

本発明方法においては、セルロース怪物質の分解糖化終
了液を溶液と固形物とに分離したのち、溶液と固形物の
それぞれから残存するセルラーゼ類を回収することによ
って、従来の溶液のみから残存するセルラーゼ類を回収
する方法に比べて、セルラーゼ類の回収率は約３０〜４
０％高く、７５〜８５％の高得率でセルラーゼ類を回収
することができる。

また、回収されたセルラーゼ類の活性は、本来の活性に
比べて何ら低下が認められず、この回収セルラーゼ類は
セルロース性物質の分解糖化に再使用することができる
。したがって、セルロース性物質の酵素糖化に本発明方
法を適用することにより、その経費を大幅に節減するこ
とができる。次に実施例によって本発明をさらに詳細に
説明する。

実施例 １ ｐＨ４．母酢酸緩衝溶液１００のとに粉砕したアカマツ
木粉４夕を加え、さらに市販のアスベルギルス・ニゲル
起源のセルラーゼ（セルロシンＡＣ）２００のｏを加え
て４０ｑｏで２岬時間振とうしたのち、木粉の４０％が
分解した反応終了液を遠０分離により溶液と固形物２．
４夕とに分離した。

溶液には９肋夕のセルラーゼが残存し、このセルラーゼ
を眼外ろ過法により１００％回収した。一方固形物２．
４夕を０．母重量％グルコマンナン水溶液５５叫中に懸
濁し、４０ｑｏで２時間振とうしたのち、遠心分離を行
い、得られたグルコマソナン水溶液には６７の９のセル
ラーゼが含まれていた。

回収されたセルラーゼは合計１５７の３であり、回収率
は７８．５％であった。この回収されたセルロシンＡＣ
溶液に、あらたにアカマツ木粉３．４夕を加えて全容量
８０の‘として酵素分解を４０００で行った結果、グル
コース生成量は、セルラーゼ１雌・１時間当り１６．５
〆モルであり、これは当初の１６．０仏モルに比して、
回収セルロシンＡＣの活性低下は認められなかった。

実施例 ２５００ｃｃ客のフラスコに炭素源として適量
のセルロース粉末を加えた水溶性栄養塔地１００の‘を
入れて滅菌したのち、これにトリコデルマ・ビリデＱＭ
４１４を接種し、３０℃の温度で好気条件下に６日間培
養した。

培養液のｐＨは常に５．４に調節した。別の３００ｃｃ
客フラスコに粒度２０〜５０山のブナの微粉砕木粉５夕
を入れ、これに前記の培養液５０叫（酵素含有量１２０
のｏ）を加え、４０００にて４劉時間分解を行て木粉の
５６％を分解したのち、反応終了液を遠心分離により溶
液と固形物とに分離した。

溶液には５０の９の酵素が残存しており、限外ろ過によ
り酵素４２の夕を回収した。一方固形物に４．５重量％
セロビオーズ含有ＰＨ４．５酢酸緩衝液７０泌を加えて
４０℃で２時間振とうしたのち、遠心分離を行って得ら
れたセルビオース溶液には５０のｏの酵素が含まれてい
た。

酵素の全回収率は７７％であった。この回収された酵素
溶液に、あらたにブナ木粉を加えて酵素糖化を行った結
果、セルビオーズの分解分をブランクとして差し引いて
も木粉に対して当初の酵素の活性と同等の活性を示した
。

実施例 ３ｐＨ４．裏酢酸緩衝溶液ｌｏｏｍ‘に粉砕し
たアカマツ木粉４夕を加え、さらに市販のトリコデルマ
・ビビリデ起源のセルラーゼ（セルラーゼーオノヅカＲ
，ｏ）２００腿を加えて４０午０で２独特間分解を行っ
たのち、木粉の４５％が分解した反応終了液を遠Ｄ分離
により溶液と固形物２．２夕とに分離した。

溶液には１００の‘のセルラーゼが残存し、限外ろ過に
より８５雌のセルラーゼ類を回収した。一方固形物２．
２ターこ４重量％エタノール含有ｐＨ４．韓酢酸緩衝溶
液５０磯を加えて３５ｑ０で１時間振とうし、７０の９
のセルラーゼ類を回収した。

全セルラーゼ回収率は７７．５％であり、回収セルラー
ゼの活性低下は認められなかった。実施例 ４ 新聞紙を乾燥し、一辺３側の正方形片として２夕を５０
の‘の水に懸濁し、これにセルラーゼーオノヅカＲ，ｏ
ｌｏｏの夕を加えて４０ｑ０で２独特間分解を行ったの
ち、反応終了液を遠心分離により溶液と固形物１．４夕
とに分離した。

溶液には３５の９のセルラーゼが残存していた。前記で
得られた固形物１．４のこ１５重量％エチレングリコー
ル水溶液４０の‘を加えて４０００で２時間振とうした
結果、セルラーゼ４７の９を含有したエチレングリコー
ル水溶液として回収した。

回収セルラーゼの活性低下は認められなかった。実施例
５ とうもろこし茎を乾燥してすりつぶした粉末４夕を１０
０の‘のｐＨ５．０の酢酸緩衝液中に懸濁し、これにト
リコデルマ・ビリデ起源のセルラーゼ（セルラーゼーオ
ノヅカＲ．ｏ）１００岬とアスベルギルス・ニゲル起源
のセルラーゼ（セルロシンＡＣ）１００Ｍを加えて３５
ｑｏで２時間分解したのち、反応終了液を遠０分離によ
り溶液と固形物３．２夕とに分離した。

溶液から１００岬のセルラーゼを回収することができた
。一方、固形物３．２のこｌａ重量％エタノール含有風
５．堪能酸緩衝溶液５０のＺを加えて３５℃で２時間振
とうしたのち、遠心分離によりセルラーゼ６３の９含有
のエタノール溶液が得られた。

全セルラーゼ回収率は８１．５％であった。また、回収
されたセルラーゼ溶液に粉砕したアカマツ木粉を加えて
分解を行ったところ、単位時間当りの分解率は、最初の
混合酵素によるアカマツ木粉の分解率と変りがなかった
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ セルラーゼ類によるセルロース性物質の分解糖化終
   了液から該セルラーゼ類を回収するに当り、まず分解糖
   化終了液を溶液と固形物とに分離したのち、該溶液中か
   ら常法に従つてセルラーゼ類を回収するとともに、該固
   形物中に残存するセルラーゼ類を水溶性多糖類、オリゴ
   糖類又はアルコール類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液に
   より処理して回収することを特徴とするセルラーゼ類の
   回収方法。 ２ 水溶性多糖類又はオリゴ糖類の水溶液若しくはｐＨ
   緩衝溶液の濃度が０．５〜５重量％である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３ アルコール類の水溶液若しくはｐＨ緩衝溶液の濃度
   が１〜３０重量％である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ４ ｐＨ緩衝溶液のｐＨが３．０〜８．０である特許請
   求の範囲第１項記載の方法。