JPS59161397A - ヌクレオチド化合物標品およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、凍結乾燥された保護ヌクレオチドおよびその
製造法に関する。本発明による保護ヌクレオチドは、ホ
スホトリエステル法（本発明者らによるＮｕｃｌｅｌｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃＪ　８．５５０７（１９
８０）外）によるオリゴヌクレオチ１合成の場合の縮合
させるべき単位フラクションないし「単量体」として使
用するのに特に適したものである。

比較的少数の、たとえば約４〜約加個程度の、ヌクレオ
チド単位が互に結合してヌクレオチド鎖を形成してなる
オリゴヌクレオチドは、核酸、たとえばデオキシリ１核
酸（以下、ＤＮＡという）およびリチ核酸（以下、ＲＮ
Ａといつ）、の分子鎖の構成成分である。

核酸が生物の遺伝情報を担っているところより、核酸分
子鎖をなすオリゴヌクレオチドは遺伝子を構成するもの
であり、遺伝子組換え技術の発展に伴なって、それに利
用すべきオリゴヌクレオチドの合成法についても既にい
くつかのものが提案されている。

定められたヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを生
産するための一つの確笑な方法は、本発明者らが開発し
たホスホ）　ＩＪエステル法固相合成である。この方法
は、下記の文献に記載されている。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１９７９
．３６３５（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　８．５４７３（１９８０）Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　８．５４
９１（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ、　８．５５０７（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ８ｅａｒｃｈ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ　５ｅｒｉｅｓ、　７゜２８１（１９８０） Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　１０３．７０６（１
９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、　１０．１９７（１９８１’）この方法では、ポリ
スチレンの様な固状ポリマーを、官能基を有する側鎖を
持つ様に改良し、このポリマーな第一番目の適当に保護
されたヌクレオチド単位と反応させて該単位を固状ポリ
マーの担体に結合させる。次いで、この結合した単位を
適当に脱保護しく通常は、末端５′−水酸基を脱保護す
る）、この生成物を保護ヌクレオチド化合物（通常は、
末端３′−リン酸の水酸基の１個は脱保護されていて、
しかもこの脱保護リン酸水酸基はトリエチルアミンと塩
を形成させである）と反応させると、この化合物はポリ
マー支持単位の適当に脱保護された場所に結合してヌク
レオチド鎖に加わることとなる。この一連の操作を繰り
返すことによって、実質的に所望の長さの、そして予め
決定された単位配列の、ヌクレオチド鎖を組み立てるこ
とができる。最終工程または最終工程に近い工程でオリ
ゴヌクレオチド鎖をポリマーから切断して単離する。一
般的ＤＮＡ合成の場合と同様にこの同相合成法において
も、高収率で目的物を得るために最も留意すべきことは
、縮合反応を完全に無水の条件で行なわなければならな
いということである。なぜならば、ヌクレオチド間の結
合はリン酸残査と水酸基との脱水縮合反応によるからで
ある。

上記の方法の顕著な特徴は、半自動操作が可能であると
いう点にある。

従来、縮合反応の際の無水化は、保護ヌクレオチド化合
物と固状ポリマーとを混合した−も、のについてピリジ
ン共沸等により行われていた。固状ポリマーの乾燥に関
しては、報告（Ｈ，Ｉｔｏ、　Ｙ、　Ｉｋｅ。

Ｓ、Ｉｋｕｔａ、　Ｋ、Ｉｔａｋｕｒａ　１Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１０゜１７５
５（１９８２））および本発明者らの検討の結果、揮発
性有機溶媒（例えば無水テトラヒドロフランなど）によ
る洗浄およびそれに続く乾燥窒素ガ２等の送風によって
乾燥すること力匈丁能であった。

しかしながら、縮合させていくべき保護ヌクレオチドの
方は、その末端３′−リン酸が保護された化合物（後記
化合物〔■］）を必要時に部分脱保護して末端３′−リ
ン酸ジエステルとしてしかもこれをトリエチルアミン塩
（後記化合物［１］）とし、これをピリジン共沸によっ
て無水に調製しなければならず、従って乾燥！その場で
製造しなげればならない。また、トリエチルアミン塩化
合物をあらかじめ調製していた場合（通常ペンタン等に
滴下して粉末状にして保存する）でも、そのまま使用す
ると収率が悪く、高収率を得るには必要時にピリジン共
沸により無水にする必要がある。

必要時Ｖこ保護ヌクレオチド化合物を無水にしなげれば
ならないことがＤＮＡの合成において最も繁雑で、機械
的に行なうことが困難な操作の一つとなっていた。また
、このことがオリゴヌクレオチド製造において安定した
高収率を得られない原因の一つにもなっていた。

発明の概要 要旨 本発明者らは、鉛量検討した結果、適当な溶媒を用いる
ことにより、保護ヌクレオチドを凍結乾燥することがで
きた。また、該化合物は長期間保存することができ、直
ちに縮合反応に用いても安定した高収率を与えることも
みいだした。

本発明は、このような発見に基くものである。

すなわち、本発明は、下式［１１で示される保護された
ヌクレオチド化合物の凍結乾燥標品に関する。

Ｂ′ 〔式中、Ｒは水素または保諦された水酸基であり、Ｒ１
はリン酸基の化学的保護基τ・あり、Ｒ２は水酸基の化
学的保護基を表わし、Ｂ′は保護されたグアニン、アデ
ニン、シトシン、ウラシルおよびチミンから選ばれる塩
基を表わし、Ａは低級アルキルアミンであり、ｎは任意
の自然数である。］また、本発明による保護されたヌク
レオチド化合物の凍結乾燥標品の製造法は、下式［１１
で示される保護されたヌクレオチド化合物の固体標品を
ピリジンと共にジオキサンに溶解させ、この溶液を凍結
乾燥に付すこと、を特徴とするものである。

Ｂ′ し式中、Ｒは水素または保護された水酸基であり、Ｒ１
はリン酸基の化学的保護基であり、Ｒ２は水酸基の化学
的保護基であり　Ｂ／は保護されたグアニン、アデニン
、シトシン、ウラシルおよびチミンから選ばれる塩基で
あり、Ａは低級アルキルアミンであり、ｎは任意の自然
数である。〕本発明によるもう一つの保護されたヌクレ
オチド化合物の凍結乾燥標品の製造法は、下式［１１で
示される保護されたヌクレオチド化合物の液体標品をジ
オキサンに溶解させ、この溶液を凍結乾燥に付すこと、
を特徴とするものである。

Ｂ′ 〔式中、Ｒは水素または保護された水酸基であり、Ｒ□
はリン酸基の化学的保護基であり、Ｒ）ま水酸基の化学
的保護基であり、Ｂ′は保護されたグアニン、アデニン
、シトシン、ウラシルおよびチミンから選ばれる塩基で
あり、Ａは低級アルキルアミンであり、ｎは任意の自然
数である。〕 上記式（１）において、ｎが２以上のときは、複数個の
Ｂ′、ＲおよびＲ□は同一でも異なっていても八・。

効果 本発明による凍結乾燥標品は、一般に、重い粒状粉末や
塊ではなくて、凍結乾燥品に典型的にみられる形態、す
なわち軽いふんわりした分離性良好な粒子、で存在する
。この標品は、この状態で、湿気を除いたり汚染されな
いようにするなどの通常の注意を払うだけで、いつまで
も貯蔵したり、輸送したりすることができる。また、こ
の標品はトリエステル法で慣用される溶媒、たとえばピ
リジン、に容易に溶解する。

従来のホスホトリエステル法では、ヌクレオチド試薬（
一般式〔Ｉ〕）は使用直前にピリジン共沸により無水と
して縮合反応に供していた。この操作は実際には意外と
繁雑で、数多くのオリゴヌクレオチドの合成を同時に行
なうことは事実上困難であったことは前記した通りであ
る。本発明による凍結乾燥させた試薬を用いると、縮合
反応と別に並行して行なっていた共沸操作が必要でない
ため、その間に数多くの縮合反応を同時に行なうことが
可能となった。また、共沸操作のミス等による収率の低
下がな（なり、安定した収率を与えることがわかった。

１回の収率も共沸操作を行なう場合と同程度またはそれ
以上の高収率を与えることがわかった。この安定した高
収率を与えることおよび操作が簡素化されたことから、
反応スケールを大幅に小さくすることも可能となった。

また、従来より最も機械的操作が困難と考えられていた
縮合反応のステップも、機械で行なうことが可能となる
。

なお、本発明に類似するものとして、特開昭５７−１５
０７００号公報記載のものがある。しかし、同公報記載
の凍結乾燥標品は、ホスファイト法［Ｍ、Ｄ、　Ｍａｔ
ｔｅｕｃｃｉ　、　Ｍ、ＨｌＣａｒｕｔｈｅｒｓ　：　
Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、、１０３．３１８５（１，９８１）　）に用い
られるべきヌクレオシドまたは亜リン酸化ヌクレオシド
のそれである。本発明び結乾燥標品が化合物としてこの
先行発明のそれと異なることはいうまでもないが、本発
明によりヌクレオチドと低級アルキルアミンとの１：１
の塩の形で凍結乾燥標品を製造しえたこと、ならびにこ
の塩が低級アルキルアミンとの塩であることによってそ
れが可能となったことすなわち低級アルキルアミンなら
ば常圧沸点が約８０℃以下であるので反応系の脱水に慣
用されるピリジン共沸工程でその過剰分を容易に除去し
て１：１の塩を製造しうろこと、はこの先行技術からは
思いがけなかったことというべきである。

不発明による凍結乾燥標品としてのヌクレオチド化合物
は、前記の式〔Ｉ”１で示されるものである。

から２′−１３′−および５′−水酸基ならびに塩基を
除去した残基を示すものとして慣用されているものであ
って、具体的には下記の構造を示すものである（立体異
性は無視する）。

弐ｔ＋１でＲが水素である場合は、このリボース単位は
２′−テオキシリテ）シルであって、式〔１］の化−合
物はＤＮＡ鎖を成す。Ｒが水酸基または保護された水素
基である場合は、・このリボース単位はリセシルであっ
て、式〔Ｉ〕の化合物はＲＮＡ鎖を成す。重合度ｎが２
以上のときは、複数個のＲは同一でも異なっていてもよ
いから、式［Ｉ〕の化合物はＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖との混
成物であることができる。

Ｂ′は、保護されたヌクレオシＰ塩基である。これは、
一般に、塩基として−はアデニン匹）、グアニン（Ｇ）
、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル側であ
る。弐ｒ−１１の化合物がＤＮＡ　釦を成す場合の塩基
はＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、ＲＮＡ鎖を成す場合はＡ
、Ｇ、ＣまたはＵである。保護基は通常はアシル基であ
って、保護された塩基として例示すれば、Ｒ６−ベンゾ
イルアデニン、Ｎ−インブチリルクアニン、Ｒ６−ベン
ゾイルシトシン、チミン、およびウラシルである。Ｂ′
としてチミンおよびウラシル自身を例示したところから
明らかなように、チミンおよびウラシルは通常は保護が
不要であり、従って本発明で１保護されたチミン」ある
いは「保護されたウラシル」というときは格別な保護基
を持たない場合をも包含するものとす−０なお、式［１
）において塩基は前記のように特定されて（・るが、こ
れらの塩基は上記の１保護基」の範囲に入るアシル基以
外の基によって修飾されていてもよいことはいうまでも
なく、またＤＮＡまたはＲＮＡ中でこの種塩基にみられ
る変異、たとえばｎが、２のときでＢがチミンである場
合のチミンの二量体化、あるいはＢがシトシン、アデニ
ンの場合の一部アミノ基のカルゼニル基への変換、が生
じているものについても本発明が成立つことは明らかで
ある。従って、塩基がこのように変異している場合も本
発明の範囲に属する。

基Ｒ０およびＲ２ならびに保護された水酸基を示す場合
の基Ｒは、リン酸基および水酸基の保護基として核酸合
成技術において周知のものでありうるが、その具体例は
上記の塩基の保護基と共にたとえば有機合成化学、第３
６巻、第９号、第７２３−７３１頁（１９７８年）その
他の総説および放置たとえば「ヌクレオシド・ヌクレオ
チドの合成」（丸善１９７７年）、「核酸有機化学」（
化学同人１９７９年）、「核酸」（朝倉書店１９７９年
）、Ｔｅｔｒａｈｅ−ｄｒｏｎ　Ｎ　３４．３１４３（
１９７８）、有合化、聾、７２３（１９７８）および化
学の領域、翌、５６６（１９７９）等に記載されている
□。本発明で特に好ましい保護基は、Ｒ１としてはオル
トクロロフェニル基、ノぐラクロロフェニル基があり、
Ｒ２としてはモノメトキシトリチル基、ジメトキシトリ
チル基があり、Ｒとしては水素、オルトニトロフェニル
で保護された水酸基がある。

ｎは、任意の自然数である。通常は、ｎは、１〜１０程
度、好ましくは１〜６程度、特に１〜３程度、である。

Ａは、低級アルキルアミンである。「低級アルキルＪは
、炭素数１〜４程度のものを意味する。

代表的な低級アルキルアミンはトリエチルアミン、ジイ
ソプロピルアミン、ジメチルアミン、ｔ−ブチルアミン
、５ｅｃ−ブチルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−プロ
ピルアミン、１８ｏ−プロピルアミンは、好ましくはト
リエチルアミン、である。

化合物口〕の合成も、上記文献その他に記載の核酸合成
技術に従って行なえばよい。一つの具体例を挙げれば、
下記の通りである。先ず、それ自身公知の方法に従って
、式〔ｎ〕の化合物を合成する。

〔式中、Ｒ３はリン酸基の化学的保護基であって、他の
保護基が全て安定な条件で脱保護できるもの、である。

通常は、シアンエチル基である。Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｂ’
およびｎは前記と同意義である。）式［１１〕の化合物
をその溶液中で（溶媒は、たとえば、ピリジンその他）
低級アルキルアミン）好ましくはトリエチルアミン（こ
の場合はピリジン−（３：　１　ｖ／ｖ　）溶液中がよ
り好ましい）その他と反応させて保護基Ｒ３を除去すれ
ば、化合物〔１〕が生成する。このようにして生成した
化合物ｃ　１１は、油状の析出物として得られる。この
油状物は、必要に応じて共沸操作により過剰の低級アル
キルアミンおよび水を留去してから（共沸用溶剤は、た
とえばｇ　ＩＪレジンの他）、化合物ＣＩ’ｌの液体標
品として利用するか、これを化合物［１１の非溶剤（た
とえばヘキサンその他）中に徐々に添加することによっ
て粉粒状化させて固体標品として利用することができる
。なお、化合物［Ｄの油状物は、化合物［１１以外の成
分、特にピリジン、が共存することによって油状となっ
ているものと解される。

凍結乾燥 溶液の調製 基本的な溶媒は、ジオキサンである。しかし、化合物［
１〕が固体標品の場合はジオキサンに対する溶解速度が
遅いので、ピリジンとジオキサンとの混合物に溶解させ
ることが好ましい。その場合に、ピリジン簀が多すぎる
と溶液の凍結がよく行なわれない。従って、ビリ・ジン
の量はジオキサンの２〜１０　ｖ／ｖ容量ｙ程度にする
ことが望ましい。

なお、化合物［１１の溶液をつくるに当っては、ピリジ
ンを予じめジオキサンと混合しておいて、そこへ化合物
［１１を溶解させるようにしても、化合物［１’ｌを先
ずピリジンに溶解させてから、これをさらにジオキサン
に溶解させるようにしてもよい。

後者の方が、ビリ・クン使用の効果をより享受すること
ができる。従って、本発明で［ピリジンと共にジオキサ
ンに溶解させ］というときは、上記両頭様のいずれをも
包含するものである。

化合物（１１が液体標品の場合は、ピリジンを併用しな
くても十分な溶解速度が得られる。

以上いずれの場合も基本的溶剤はりオキサンであるが、
本発明の精神を損なわない限り、少量の溶剤を併用する
ことは可能であり、また本発明特許請求の範囲もそのよ
うに理解するものとする。

従って、たとえば、化合物〔１］が液体標品の場合に、
少量のピリジンを併用することは本発明の範囲内の事項
である。

溶液中の化合物［１〕の濃度は、その粘度、凍結乾燥工
程での利便等の観点から適当に定めればよい。具体的に
は、たとえば、１０〜１００　ｍｇ／ｍ１程度がふつう
である。

凍結乾燥工程 溶質が化合物〔Ｉ〕であると共に溶剤がジオキサン（お
よび少量のピリジン）であるという点を除けば、凍結乾
燥操作自身は慣用のものと本質的には変らない。

一般に、この工程は溶液の冷却（−３０℃程度以下がふ
つうである）による凍結および凍結物に対する減圧（数
ｍｍＨｚ程度以下がふつうである）の印加による凍結溶
媒の昇華からなるであろう。

その他、凍結乾燥に必要ブよ事項については、成性、た
とえば新実験化学講座１　［１１４５９（丸首１９７５
年）等を参照することができる。

凍結乾燥標品の利用 本発明による化合物［１Ｆの凍結乾燥標品は、ピリジン
その他の溶剤に対する溶解性が良好であるばかりでなく
、化合物［１１としての反応性も従来の標品（使用直前
に共沸乾燥したもの）と同じまたはそれ以上である。

従って、この凍結乾燥標品は、通常の防湿条件下に保存
されている限り、共沸乾燥せずに従来公知のトリエステ
ル法（同相法および液相法。特に前者）の際の単位ヌク
レオチドとして有利に使用することができる。

凍結乾燥ヌクレオチド化合物を用いるオリゴヌクレオチ
ドの固相合成方法を具体的に示せば下記の通りである。

なおこれにより本発明が限定されるものではない。

すなわち、ヌクレオシＦを結合したポリスチレン樹脂約
５０〜６０ｍｇをストップコックおよびガラスフィルタ
ー付反応容器に採り、イソプロパノ−ルー塩化メチレン
（１５：　８５　（ｖ／ｖ）　）溶液でよく洗浄する。

次に、１モル臭化亜鉛溶液で５分間４回処理する。臭化
亜鉛による脱トリチル化後、インプロ・ぐノール−塩化
メチレン（１５：　８５　（ｖ／ｖ）　）溶液で洗浄し
、続いてピリジンで洗浄して、真空ポンプにて樹脂を乾
燥する。この脱トリチル化の方法はベンゼンスルホン酸
、あるいはトリクロロ酢酸などを使う方法であってもか
まわない。

また、樹脂の乾燥は揮発性有機溶媒による洗浄およびそ
れに続く乾燥ガスによる乾燥であってよＸｄｌ。

一方、縮合に用いるヌクレオチＰ試薬としては、本発明
の凍結乾燥された保護ヌクレオチド（約加ｍｇ）にメシ
チレンスルホニトリルトリアシリｒ（以下ＭＳ　ＮＴと
略す）（約３０ｍｇ）加え、無水ピリジン（約４００　
ｍｌ　）を加え、攪拌して溶解して、調製する。

このヌクレオチド試薬を乾燥した樹脂にすばやく加えて
（イ）分間反応させる。反応後、ピリジンで洗浄し、ア
セチル化により未反応５′−水酸基を保護する。−アセ
チル化剤として、無水酢酸−ピリジン（１：５）溶液０
．５　ｍｌ　とジメチルアミノピリジン（以下ＤＭＡＰ
と略す）−ピリジン（２０ｍｇ／ｍｌ　）　０．５　ｍ
ｌを合わせて加え、５分間反応させる。

ピリジン洗浄の後、次のサイクルに入る。この操作（表
−１中の５ｔｏｐ　１〜９）を繰り返して、順次鎖長を
延長していく、。

実験例 実施例１ 下式； （式中、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基であり、Ｒ１
は０−クロロフェニル基であり、Ｔはチミンであり、Ｃ
Ｅはシアンエチル基である。）で示される化合物［１１
〕約３０ｍｇをとり、ピリジン−トリエチルアミン−水
（３：　１　！　１　ｖ／ｖ　）溶液１ｍｌ　を加えて
室温で１５分間処理して、シアノエチル基を除去する。

溶媒を留去し、ピリジン共沸により過剰のトリエチルア
ミンおよび水を完全に留去する。得られた油状物をジオ
キサン６００μｌに溶かし、凍結乾燥することにより、
目的とする化合物〔ｌ］の凍結乾燥標品が得られる。

同化合物［１１〕約３０ｍｇをとり、ジエチルアミン−
ピリジン（１：　９　ｖ／ｖ　）　１　ｍｌ　　を加え
て室温で加分間処理する。以下同様にして化合物［１１
の凍結乾燥標品が得られる。

また、ジエチルアミンの代わりに、ｎ−ジチルアミンま
たはジイソプロピルアミンを用いても同様の結果が得ら
れる。

実施例２ ジメトキシトリチルージーヌクレオチＰ（下式：〔式中
、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基、Ｒ１は０−クロロ
フェニル基、Ｂ１０、Ｂ１０　は保護されたｉ基”’Ｃ
−１Ｎ−ベンゾイルアデニン（Ａ）、Ｎ−ベンゾイルシ
トシン（Ｃ）、Ｎ−イソブチリルグアニン（Ｇ）、チミ
ン（Ｔ）より選ばれる。］ 以下、このジヌクレオチドを、その塩基に着目してＡＣ
，ＴＧなどとよぶ。

■〔ＣＡ〕、■［ＧＧ’ｌ］、■ＣＣＡ）、■〔ＴＡ）
、■〔ＴＡ〕、■［ＡＡ］および■〔ＴＣ′３谷３５　
ｍｇを採ってそれぞれ無水ピリジン５０μｌ　に溶解し
、無水ジオキサン８００μｌ　を加えて一５０℃で凍結
し、３ｍｍＨｇ減圧下に溶剤を昇華させて乾燥する。凍
結乾燥ジヌクレオチＰ■〜■はデシケータ−中で保存す
る。

ジメトキシトリチルアデノシン樹脂（６０ｍｇ、６．６
μｍｏｌ　）を反応容器に採り、前記表−１の操作法に
従って操作を行なう。すなわち、インプロパノ−ルー塩
化メチレン洗浄、１モル臭化亜鉛による脱トリチル化、
インプロ／ぐノール洗浄、ピリジン洗浄および真空ポン
プによる樹脂の乾燥を行なう。この乾燥樹脂にジヌクレ
オチド■［ＣＡ’ｌおよびＭＳＮＴ　（３０ｍｇ　）の
ピリジン溶液（４００μｌ）を加えて６０分反応させる
。反応後、ビリ・シン洗浄、無水酢酸−ビリジン−ジメ
チルアミノピリジン（１：９：触媒量）によるアセチル
化およびピリジン洗浄を行なって、１回の縮合を終える
。この操作を繰り返してジヌクレオチド■［ＧＧｌ、■
〔ＣＡ〕、■［ＴＡｌ、■〔ＴＡ〕、■〔呑Ａ〕、■［
ＴＣ”ｌを順次縮合していくことにより、ペンタデカヌ
クレオチド、ｄ（ＴＣＡＡＴＡＴＡＣＡＧＧＣＡＡ）を
合成した。平均の収率は９５チ、通算収率は７０％であ
った。これは、ピリジン共沸による従来法に比べて、同
程度またはそれ以上の高収率である。

合成したオリゴヌクレオチドは常法に従って脱保護し、
精製した。すなわち、樹脂約１０ｍｇをとり、０．５Ｍ
テトラメチルグアニジン−ピリジン−２−アルドキシム
のジオキサン−水（９：　１　ｖ／ｖ）溶液１００μｌ
　で室温−夜処理し、その後濃アンモニア水２．５ｍｌ
　を加えて５０℃−夜処理する。樹脂なろ別後、濃縮し
、セファデックスＧ−５０（１，５Ｘ　１２０　ｃｍ　
；溶出−ｇ　０００５　Ｍ　ＴＥＡＢ　（重炭酸トリエ
ステルアンモニウム）緩衝液（ｐＨ７，５））にて粗＠
製した（第１図）。

ピーク部分を取り、逆相カラムによるＩ（ＰＬＯでトリ
チル体を精製した（第２図）。８０％酢酸で脱トリチル
化後、逆相カラムで再び精製し、目的のペンタデカヌク
レオチドを高純度高収率で得た（第３図）。

実施例３ ジヌクレオチド試薬■〔ＣＡ〕、■［ＴＧｌ、■［ＣＡ
］、■［ＴＡｌ、■［ＴＡｌ、■［ＡＡｌおよび■（Ｔ
Ｃ１谷３５ｍｇを採り、無水ピリジン（５０μｌ）に溶
解し、無水・ジオキサン（８００μｌ）を加えて、凍結
乾燥する（−刃’Ｃ／　３　ｍｍＨｇ　）。

ジメトキシトリチル−アデノシン樹脂（６０ｍｇ・６．
６　ｍｍｏｌ　）を反応容器に取り、実施例２と同様に
順次ジヌクレオチド試薬■→■→■→■→■→■→■と
縮合させて、ペンタデカヌクレオシドｄ（ＴＣＡＡＴＡ
ＴＡＣＡＴＧＣＡＡ）を合成した。

平均の収率は９５％、通算収率は７０チであった。

従来法に比べて、各サイクルでの収率のばらつきが少な
く高収率であった。

目的のペンタデカヌクレオチドは、実施例１と同様にし
て精製することにより、高純度高収率で得られた（第４
〜６図）。

【図面の簡単な説明】

第１図および第４図はセファデックスＧ　−５０カラム
クロマトダラムを示すものである。 第２図および第５図はトリチル体のＨＰＬＣパターンで
あり、第３図および第６図は目的物質のＨＰＬＣパター
ンを示すものである。 カラム：　μ”Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８（Ｗａｔｅｒ
ｓ　）溶出液ニアセチルニトリルの０．０２Ｍ　ＥＤＡ
Ａ緩衝液（ｐＨ７，８） 濃度勾配二図中に示す 流速：２ｍｌ／分 チャートスピード：　１０ｍｍ　／分 温度：５０℃ 出願人代理人　　　猪　股　　　　清 ｂ　１　ｍ 筋２′図 ｆｉ３［Ｋ 時間（ケ） も４　図 ケ゛画数 も５　灰 時間（８） ５６　図 日プｒ　　　闇　　（イυ＼） 手続補正書 昭和閏年１２月９日 特許庁長官　　　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和詔年特許願第３４０１７号 ２、発明の名称 ヌクレオチド化合物標品および その製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 湧永製薬株式会社 （ほか１名） 〔電話東京（２１１）　２３２１大代表〕７、補正の対
象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ８、補正の内容 明細書を、下記の通りに補正する。 （１）第７頁第６行 「同相合成法」を、「固相合成法」と補正する。 （２）第５頁下から第３行 「凍結乾燥標品」の前に「トリエチルアミン塩の」を加
入する。 （３）第５頁下から第３行と下から第２行との間に、「
実施例２」を加入する。 （４）第２６頁第１行 「以下同様にｔ７て」の前に、「溶媒を留去し、ピリジ
ン共沸により過剰のジエチルアミンを留去する。得られ
た油状物をジオキサン６００μｍに溶かし、」を加入す
る。 （５）第あ頁第１〜２行 「凍結乾燥標品」の前に、「ジエチルアミン塩の」を加
入する。 （６）第あ頁第６行 「実施例２」を、「実施例３」と補正する。 （力　第四頁第１行 「実施例３」火、「実施例４」と補正する。 ９９１−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下式［１’ｌで示される保護されたヌクレオチド化
   合物の凍結乾燥標品。 Ｂ′ 〔式中、Ｒは水素または保護された水酸基であり、Ｒ１
   はリン酸基の化学的保護基であり、Ｒ２は水酸基の化学
   的保護基であり　Ｂｌは保護されタフアニン、アデニン
   、シトシン、ウラシルおよびチミンから選ばれる塩基で
   あり、Ａは低級アルキルアミンであり、ｎは任意の自然
   数である。ｎが２以上のときは、複数個のＢ’、Ｒおよ
   びＲ１は同一でも異なっていてもよい。〕２、下式［１
   ’）で示される保護されたヌクレオチド化合物の固体標
   品をピリジンと共にジオキサンに溶解させ、この溶液を
   凍結乾燥に付すことを特徴とする、保護されたヌクレオ
   チド化合物の凍結乾燥標品の製造法。 Ｂ′ 〔式中、Ｒは水素または保護された水酸基であり、Ｒ１
   はリン酸基の化学的保護基であり、Ｒ２は水酸基の化学
   的保護基であり　Ｂ／は保護されたグアニン、アゾ斤ン
   、シトシン、ウラシルおよびチミンから選ばれる塩基で
   あり、Ａは低級アルキルアミンであり、ｎは任意の自然
   数である。ｎが２以上のときは、複数個のＢ′、Ｒおよ
   びＲ１は同一でも異なっていてもよい。〕３、下式［１
   １で示される保護されたヌクレオチド化合物の液体標品
   をジオキサンに溶解させ、この溶液を凍結乾燥に付すこ
   とを特徴とする、保護されたヌクレオチド化合物の凍結
   乾燥標品の製造法。 Ｂ′ 〔式中、Ｒは水素または保護された水酸基であり、Ｒ１
   はリン酸基の化学的保護基であり、Ｒ２は水酸基の化学
   的保護基であり　ＢＪは保護されタフアニン、アデニン
   、シトシン、ウラシルｉ６よびチミンから選ばれる堰塞
   であり、Ａは低級アルキルアミンであり、ｎは任意の自
   然数である。ｎが２以上のときは、複数個のＢ′、Ｒお
   よびＲ１は同一でも異なってもよい。〕 ４、式〔Ｉ〕で示される保護されたヌクレオチド化合物
   の液体標品が、下式シ■〕で示される保護されたヌクレ
   オチド化合物をその＃液中において低級アルキルアミン
   と反応させて末端３′−リン酸の保護基Ｒ３を除去する
   ことによって生成した油状析出物からなる、特許請求の
   範囲第３項記載の方法。 Ｂ′ 〔式中、Ｒ３はリン酸基の化学的保護基であって他の保
   護基が全て安定な条件で脱保護できるもの、である。Ｒ
   ，Ｒ１、Ｒ２、Ｂ′およびｎは前と同意義である。〕