WO1997049833A1 - Procede de formation de complexes d'hybridation dont la stabilite depend peu de la composition en base des deux molecules d'acides nucleiques hybridees - Google Patents

Procede de formation de complexes d'hybridation dont la stabilite depend peu de la composition en base des deux molecules d'acides nucleiques hybridees Download PDF

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WO1997049833A1
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Thuong Nguyen
Ulysse Asseline
H. K. Nguyen
Maurice Durand
Jean-Claude Maurizot
Daniel Dupret
Edwige Bonfils
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Appligene-Oncor S.A.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction

Definitions

  • the present invention relates to a process for the formation of hybridization complexes whose stability depends little on the base composition of the two hybrid nucleic acid molecules.
  • the invention also relates to the implementation of this method for the analysis of nucleic acid sequences.
  • the subject of the invention is also hybridization complexes formed from two complementary, or substantially complementary, nucleic acid molecules, the stability of which depends little on the base composition of said two hybridized nucleic acid molecules.
  • the A-T (or A-U) and G-C pairing law gives nucleic acids the property of forming specific hybridization complexes between complementary sequences. This property, which has been known for a long time, makes it possible to use a nucleic acid fragment, or oligonucleotide, as a probe, to demonstrate the presence of a complementary nucleic sequence.
  • the analysis of DNA fragments after separation on gel (E. Southern, J. Mol. Biol., 1975, 98, 503-517) is today widely used both in the field of fundamental research and in that of medical analysis (Caskey, Science, 1987, 236, 1223-1228; Landegrer et al., Science, 1988, 242, 229-237; Arnheim et al., Ann Rev. Biochem., 1992, 61, 131- 156).
  • nucleic acid analysis techniques based on their hybridization property with probes have been developed, in particular for the sequencing of unknown DNA or RNA, the detection of pathology-related sequences, the search for point mutations in sequences (S. Ikata et al., Nuclei. Acids Res., 1987, 15, 797-811; JA Matthews, LJ Kricka, Analytical Biochemi ⁇ tr ⁇ , 1988, 169, 1 -25).
  • These new methods consist in detecting the signals emitted by the hybrids formed from the pairing of a labeled DNA with a series of oligonucleotides of the same length and of different sequences immobilized on a membrane or a glass surface, then in reconstructing the sequence. of the DNA fragment according to an algorithmic process.
  • the analysis of the hybridization complexes obtained by the above methods is based on the greater stability of the hybrids without mismatch compared to that of the hybrids comprising one or more mismatches.
  • the discrimination between a perfect hybrid and a hybrid with mismatch can be achieved for example by raising the temperature of the medium, which causes dissociation of the complexes with mismatch before that of the complexes without mismatch.
  • oligonucleotides composed of the natural nucleosides dA, dG, dC, T or dU, therefore constitutes a major obstacle to the development of these new techniques for analyzing nucleic acid sequences.
  • the present invention therefore aims to provide a method for forming hybridization complexes whose stability depends little on the base composition of the two hybrid nucleic acid molecules.
  • This object is achieved by a method consisting in bringing a first nucleic acid molecule into contact with a second nucleic acid molecule under conditions allowing the formation of a specific hybridization complex, characterized in that one at least of the four types of base entering the sequence of the first and / or second nucleic acid molecule is a modified base having pairing properties close to those of the natural base which it replaces, so that one at less of the two types of base pair entering into the composition of the complex comprises a modified base and in that the set of base pairs entering into the composition of said complex exhibits similar stability.
  • the deoxycytidine will be represented indifferently by C or dC, marked with "*" to designate the corresponding modified base
  • deoxyguanosine will be represented either by G or dG
  • deoxyuridine will be represented respectively by T or du
  • deoxyadenosine will be represented either by A or dA, marked with an "*" to designate the corresponding modified base.
  • the invention proposes to replace at least one of the natural nucleosides chosen from deoxycytidine (dC), deoxyguanosine (dG), thymidine (T ) and deoxyadenosine (dA), by nucleosides modified but respecting the law of pairing, designated respectively dC *, dG *, du * and dA *, in order to have nucleic acid sequences capable of forming complexes of hybridization in which: the base pairs C * -G and / or G * -C have a stability equivalent to that of the pairs A-T, and / or
  • the base pairs A * -T and / or A-T * have a stability greater than that of the pairs A-T and close to that of the natural C-G pairs, or else
  • the base pairs C * -G and / or G * -C have a stability equivalent to that of the pairs A * -T and / or A-T *; in this embodiment, the stability of the C * -G and / or G * -C pairs is lowered compared to that of the natural GC pairs and the stability of the A * -T and / or A-T * pairs is increased by compared to that of ' natural A-T pairs.
  • the method according to the invention comprises several forms of implementation and in particular the following four.
  • a first embodiment of the process of the invention is characterized in that the same type of base entering into the sequence of the first and of the second nucleic acid molecule is a modified base having similar pairing properties those of the natural base which it replaces.
  • at least one, same type of base (A, G, C or T) entering into the composition of the first and of the second nucleic acid molecule is a modified base having properties d 'pairing close to that of the natural base it replaces.
  • a second embodiment of the method of the invention is characterized in that at least two of the four types of base entering into only one of the first and second nucleic acid molecules are modified bases having properties of pairing close to those of the natural bases which they replace, so that at least one of the two types of base pair entering into the composition of the complex comprises modified bases.
  • the method of the invention can be advantageously used for the analysis of nucleic acid sequences, in particular for the sequencing or the detection of mutations.
  • One such method consists in producing a hybridization complex, in accordance with the method described above, in which the first nucleic acid molecule constitutes or comprises the sequence to be analyzed and the second nucleic acid molecule is a nucleic probe useful for sequencing or detection of point mutation, then in that the hybridization complex is analyzed by any appropriate means.
  • a method of nucleic acid analysis according to the invention is characterized in that one puts in contact the nucleic acids to be analyzed, optionally previously labeled, with an adequate quantity of at least one nucleic probe, then in that any hybridization complexes which are possibly formed are analyzed by any suitable means, in particular in order to identify the presence of mismatch.
  • said nucleic acid probe is an oligonucleotide comprising from 4 to 30 nucleosides.
  • first nucleic acid molecule into contact with the second nucleic acid molecule which is a nucleic probe useful for sequencing or detecting point mutations, so as to form a hybridization complex in which one of the four basic types entering into the sequence of the first and of the second nucleic acid molecule is a modified base having pairing properties close to those of the natural base which it replaces, so that the one of two types of base pairs entering the composition of the complex comprises a modified base.
  • a particular embodiment of the method for analyzing nucleic acid sequences according to the invention is characterized in that the nucleic acid probe has been prepared by a chemical process or biological using at least one type of nucleosides modified so as to obtain a probe whose sequence includes at least one modified base having pairing properties close to those of the natural base which it replaces.
  • nucleic probes are targeted in which two of the four types of base entering into their composition are modified bases having pairing properties close to those of the natural bases which they replace.
  • nucleosides dC and dG are replaced respectively by nucleosides dC * and dG *
  • nucleosides dA and T are replaced respectively by nucleosides dA * and du *
  • the first nucleic acid molecule is prepared in accordance with the second embodiment of the method of analysis of acid sequences nucleic acid previously described,
  • nucleic acid molecule is prepared in accordance with the second embodiment of the method of analysis of nucleic acid sequences described previously,
  • the first nucleic acid molecule is prepared in accordance with the second embodiment of the method of analysis of nucleic acid sequences described previously, - the nucleosides dA and dC are replaced respectively by nucleosides dA * and dC *, in this case, the first nucleic acid molecule is prepared in accordance with the second embodiment of the method for analyzing nucleic acid sequences described above.
  • the combinations of modifications envisaged above more particularly preferred are those leading to oligodeoxynucleotides in which:
  • nucleosides dC and dG are replaced respectively by nucleosides dC * and dG *.
  • the nucleic acid probes constituted by these modified oligodeoxynucleotides are useful for forming hybridization complexes with unmodified complementary nucleic acid sequences.
  • this double modification of the oligodeoxynucleotides makes it possible to form hybridization complexes in which all the base pairs G * -C and C * -G have a stability equivalent to that of the base pairs A-T or A-U unmodified.
  • All nucleosides dA and T are replaced respectively by nucleosides dA * and dU *.
  • nucleic acid probes constituted by these modified oligodeoxynucleotides are useful for forming hybridization complexes with unmodified complementary nucleic acid sequences. Indeed, this double modification of the oligodeoxynucleotides makes it possible to form hybridization complexes in which all the base pairs A * -T and A-U * exhibit a stability close to that of the unmodified G-C base pairs.
  • the other doubly modified nucleic probes at the level of only one of the nucleosides of each base pair are useful for forming hybridization complexes with complementary nucleic acid sequences of which the same nucleoside of each base pair also has been replaced by a modified nucleoside, in order to form hybridization complexes whose stability depends little on the base composition.
  • the replacement of natural nucleosides present in the target nucleic acids, during this prior modification step can be carried out by any method known to those skilled in the art, such as an enzymatic polymerization reaction carried out with one or more nucleosides modified.
  • nucleic probes fixed on a support, such as membranes or threads of cellulose, or of synthetic polymers or even glass surfaces.
  • the oligodeoxynucleotides constituting the nucleic probes can then be synthesized directly on the support.
  • nucleic acid probes used in the methods for analyzing the above nucleic acid sequences can also be substituted for at least one of their 5 ′ and / or 3 ′ ends, in particular:
  • intercalating agents such as derivatives of acridine in order to increase the stability of the hybrids
  • nucleosides dC, dG, T and dA Chemical modifications of nucleosides dC, dG, T and dA within the scope of the present invention will be described below.
  • a first type of base which can enter into the composition of said first and / or second nucleic acid molecule is a modified deoxycytidine corresponding to the following formula: NH — R
  • R represents a hydrogen atom, a C1-C5 alkyl group, an allyl or propargyl group
  • Ri represents a hydrogen atom or a group -OH
  • X is a nitrogen atom or a group - CH-
  • Nucleic acids having dC * in place of dC are useful for forming hybridization complexes with complementary nucleic acid sequences whose natural deoxycytides dC have also been replaced by modified nucleosides dC *, in order to form complexes hybridization in which all the base pairs C * -G exhibit a stability close to that of the unmodified A-T base pairs.
  • the natural deoxycytidines can be replaced by dC * defined above, by any method known to a person skilled in the art, such as an enzymatic polymerization reaction carried out with dC * nucleosides.
  • a second type of base which can enter into the composition of said first and / or second nucleic acid molecule is a modified deoxyguanosine corresponding to the following formula:
  • R represents a hydrogen atom or a C 1 to C 5 alkyl group, an allyl or propargyl group
  • R 1 represents a hydrogen atom or a group -OH
  • R 2 represents a hydrogen atom or a bromine atom
  • X is a nitrogen atom or a group -CH-
  • modified deoxyguanosines of formula (II) mention may be made of the following compounds: N-2-methyldeoxyguanosine (d 2Me G), N-2-propyldeoxyguanosine (d 2Pro G), N-2-isopropyldoxy - guanosine (d 2IsoPro G), N-2-ethyldéoxyguanosine
  • Nucleic acids comprising dG * in place of dG are useful for forming hybridization complexes with complementary nucleic acid sequences whose natural deoxyguanosines dG have also been replaced by modified nucleosides dG *, in order to form complexes hybridization in which all the G * -C base pairs have a stability close to that of the unmodified A-T base pairs.
  • the natural deoxyguanosines present in the target nucleic acid sequence can be replaced by dG * defined above, by all methods known to those skilled in the art, such as an enzymatic polymerization reaction carried out with dG * nucleosides.
  • a third type of base which can enter into the composition of said first and / or second nucleic acid molecule is a modified deoxyuridine corresponding to the following formula:
  • Ri represents a hydrogen atom or a group -OH
  • R represents a group of formula - C ⁇ CH, or - C sc - CH3
  • said modified deoxyuridine having pairing properties close to those of natural thymidine qu 'she's replacing.
  • modified deoxyuridines of formula (III) above mention may be made of the following compounds: 5-ethynyldoxyoxyidine (d 5Eth V ⁇ y1 U), 5-propynyldoxyoxyidine (d 5Pr ° pyn y 1 U).
  • Nucleic acids having dU * in place of T are useful for forming hybridization complexes with complementary nucleic acid sequences whose natural thymidines T have also been replaced by modified nucleosides of *, in order to form complexes of hybridization in which all the base pairs U * -A have a stability close to that of the base pairs GC unmodified.
  • the natural thymidines present in the target nucleic acid sequence can be replaced by dU * defined above, by any method known to those skilled in the art, such as a reaction of enzymatic polymerization carried out with nucleosides dU *.
  • a fourth type of base which can enter into the composition of said first and / or second nucleic acid molecule is a modified deoxyadenosine corresponding to the following formula:
  • R 1 represents a hydrogen atom or a group -OH
  • R represents a hydrogen atom or a group NH 2
  • X is chosen from a nitrogen atom, the groups of formula: C - Br, C - Cl, C - C ⁇ CH, C - C ⁇ C - CH3, said modified deoxyadenosine having pairing properties close to those of the natural deoxyadenosine which it replaces.
  • modified deoxyuridines of formula (IV) above mention may be made of the following compounds: 1-amino-2-deoxyadenosine (d 2NH2 A), 7-deaza-7-bromodesoxyadenosine, 7-deaza-7-propynyl - deoxyadenosine, 1 'amino- 2-7 -de az a- 7- bromo deoxy ⁇ adenosine, 1' amino-2-7-deaza-7-propynyl-deoxyadenosine.
  • Nucleic acids comprising dA * in place of dA are useful for forming hybridization complexes with complementary nucleic acid sequences whose natural deoxyadenosine dA have also been replaced by modified nucleosides dA *, in order to form complexes hybridization in which all the base pairs A * -U or A * -T exhibit a stability close to that of the unmodified GC base pairs.
  • the natural deoxyadenosines present in the target nucleic acid sequence may be replaced by dA * defined above, by any method known to those skilled in the art, such as an enzymatic polymerization reaction carried out with dA * nucleosides.
  • the first and second nucleic acid molecules are of the deoxyribonucleic type.
  • methods of forming a hybridization complex and of analyzing the sequence of a nucleic acid according to the invention bringing the first and second nucleic acid molecules into contact in conditions allowing the formation of a specific hybridization complex is carried out in the presence of tetramethylammonium chloride or a derivative thereof functionally equivalent, such as trimethylalkylammonium halides.
  • tetramethylammonium chloride or a derivative thereof functionally equivalent such as trimethylalkylammonium halides.
  • the invention also relates to a hybridization complex formed from two complementary, or substantially complementary, nucleic acid molecules, the stability of which depends little on the base composition of the two hybridized nucleic acid molecules, characterized in that one at least types of base pair entering into the composition of said complex comprises at least one modified base having pairing properties close to those of the natural base which it replaces, so that all of the base pairs entering into the composition of said complex has a similar stability.
  • the hybridization complex of the invention is characterized in that the same type of base entering into the sequence of the first and of the second nucleic acid molecule is a modified base having properties of matching close to those of the natural base which it replaces.
  • the invention envisages more particularly the cases where: the hybridization complex is characterized in that one of the four basic types entering into the sequence of the first and of the second acid molecule nucleic acid is a modified base having pairing properties close to those of the natural base which it replaces, so that one of the two types of base pair entering into the composition of the complex comprises a modified base;
  • the hybridization complex is characterized in that two of the four types of bases entering into the sequence of the first and of the second nucleic acid molecule are modified bases having pairing properties close to those of the natural bases which 'they replace, so that the two types of base pair used in the composition of the complex include modified bases.
  • the hybridization complex of the invention is characterized in that two of the four types of bases entering into only one of the first and second nucleic acid molecules are modified bases having properties of pairing close to those of the natural bases which they replace, so that one of the two types of base pair entering into the composition of the complex comprises a modified base.
  • the first or second nucleic acid molecule forming the hybridization complex of the invention is an oligonucleotide probe.
  • nucleosides dC, dG, T and dA entering more particularly into the composition of said first and / or second nucleic acid molecule of the complexes of the invention are those described above for the modified deoxycytidine, the modified deoxyguanosine, the deoxyuridine modified, modified deoxyadenosine.
  • the 3 'phosphoramidites of the modified nucleosides are commercially available, such as: 5 '-0-dimethoxytrityl-3' -O- (2-cyanoethyl-
  • the other modified nucleoside phosphoramidites can also be prepared in the laboratory from other modified nucleosides according to the techniques described in the literature (ND Sinha et al., Nucleic Acid Res., 1984, 12, 4539-4557; J. Nielsen and al. Nucleic Acid Res., 1986, 14, 7391-7403).
  • the conversion of 2 '- deoxyuridine to N-4-alkyl-2' - deoxycytidine is carried out in a first step by activating the C 4 position of 2 '- desoxyuridine protected by treatment with phosphorus oxychloride in the presence of triazole followed by treatment with the corresponding primary amines.
  • the phosphitylation of the 3' position is carried out using 2-cyanoethyl-N, N-diisopropylamidochlorophosphite.
  • (2-cyanoethyl-N, N-diisopropylamidophosphite) -6-aza-2 '- deoxycytidine is produced, for example, from commercial 6-aza-uridine (Sigma), which is deoxygenated in position 2' then converted to 6 - aza-2 'deoxycytidine.
  • Selective protection of the 5 'and 3' hydroxyls of 6-aza-uridine is achieved by the action of tetraisopropyldisiloxane chloride.
  • the 5 'and 3' hydroxyls are then protected respectively with the dimethoxytrityl and acetyl groups.
  • the hydroxyl in position 2 is then transformed into the ester of trifluoromethane sulfonic acid.
  • the treatment of the latter with an amine (methylamine, ethylamine ...) leads to corresponding N-2-alkyl-2 '-deoxyguanosine compound.
  • Example 1 Preparation of 5 '-0- dimethoxytrityl-3' -O- (2-cyanoethyl-N, N-diisopropylamido phosphite) -N-4-ethyl-2 '-deoxycytidine.
  • the reaction mixture is then brought to temperature ambient and stirred for 4 hours.
  • Rf 0.26 syst A.
  • Rf 0.70 syst B.
  • the medium is concentrated under reduced pressure then taken up with dichloromethane and washed with a sodium bicarbonate solution and concentrated under reduced pressure.
  • the residue is purified on a column of silica gel in the system [eluent: CH 2 C1 2 / MeOH (98: 2, v / v) to (95: 2: 5, v / vj.
  • This compound was obtained in 6 steps from 6-aza-uridine.
  • 6-azadesoxyuridine After activation of the 2 'hydroxyl with phenoxythiocarbonyl chloride, deoxygenation is carried out with tin tributyl in the presence of ⁇ , ⁇ azoisobutyronitrite (MJ Robins and JS Wilson, J. Am. Chem. Soc, 1981, 103, 932-933).
  • the conversion of 6-azadesoxyuridine to 6-azadesoxycytidine is carried out in a first step by activating the C 4 position of 6-azadesoxyuridine by treatment with phosphorus oxychloride in the presence of triazole followed by treatment with gaseous ammonia (M. Perbostand and YS Sanghvi, J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, 1994, 2051-2052).
  • step (e) leads to the sought phosphoramididite of formula (VI):
  • oligonucleotides comprising modified bases can be prepared in solution or on a solid support according to the conventional methods of synthesis of oligonucleoides using the phosphotriester method (J. Stawinski et al., Nucleic Acids
  • oligonucleotides can be conveniently made on a solid support.
  • the bases are assembled on a synthesizer of oligonucleotides on a CPG (Controlled Pore Glass) support functionalized with a nucleoside according to the phosphoramidite method described by Beaucage and Caruthers.
  • the syntheses are carried out on a micromole scale using ten equivalents of commercial phosphoramidites and of modified phosphoramidite (s) prepared as indicated in examples 1 to 10, per cycle.
  • the cycle time is close to 10 minutes with a coupling time of 1.5 minutes for the phosphoramidites of natural nucleosides.
  • the coupling time of the modified nucleoside phosphoramidite was extended by one minute.
  • an additional detrytilation step is carried out to release the terminal primary alcohol function.
  • Deprotection is carried out with a concentrated ammonia solution at 50 ° C. overnight. Extraction with ethyl acetate makes it possible to remove the soluble organic compounds. After extraction, the aqueous solution is recovered and concentrated then the products are purified by HPLC.
  • the analyzes of the oligomers by ion exchange are carried out on an FPLC device Pharmacia Fine Chemicals (GP 250 / P 3500) with a DEAE Waters column (Protein-Pak TM, DEAE 8HR (10 mm X 100
  • the gradients used are gradients in salt (NaCl): 2 minutes at 0% in B; from 0 to 30% in B in 40 minutes; flow rate: 1 ml / min.
  • A: 25 mM tris, 10% CH3CN , pH 8; B: buffer A + 1.5 M NaCl.
  • reverse phase analyzes are performed on a Waters 625 LC System device equipped with a Waters 990 photoiode detector with a Merck column, LichroCart (125 mm X 4 mm) filled with Lichrospher 100 RP-18 (5 ⁇ m).
  • TEAA triethylammonium acetate
  • A contains 5% CH 3 CN and B 80% CH 3 CN. Gradients are produced in CH 3 CN: from 0% to 20% in B in 20 minutes. The flow rates of these eluents are 1 ml / minute.
  • the reaction is left in a water bath for 2 hours at 37 ° C.
  • the pH of the hydrolyzate is then adjusted to pH 9 with a Tris 1M solution.
  • alkaline phosphatase 10 ⁇ l of alkaline phosphatase are added to the mixture and incubated for 2 hours at 37 °. C.
  • the enzyme is then destroyed by heating by boiling the solution for 1 to 2 minutes, the different compounds formed are then identified and quantified by reverse phase with the following gradient: 0% at B for 5 minutes; from 0% to 9% in B in 15 minutes.
  • Flow rate 1 ml / min.
  • oliguucleotides No. 11 to 16 were verified by mass spectrometry by the MALDI technique (Matrix-Assisited Laser Desorption; Lasermat apparatus from Finnigan), using dT ⁇ 2 as reference and 1 ⁇ l of a mixture made up. 10 ⁇ l of a 0.5 M solution of 2, 4, 6-trihydroxy acetophenone in ethanol, 5 ⁇ l of a 0.1 M aqueous solution of diammonium-L-tartarate and 1 ⁇ l of an aqueous solution (10 OD / ml) of the sample to be analyzed are deposited on a target and the solvents are removed by evaporation.
  • MALDI technique Microx-Assisited Laser Desorption; Lasermat apparatus from Finnigan
  • oligonucleotides appearing in Table VI below were prepared using phosphoramidites of natural deoxynucleosides and phosphoramidites of modified nucleosides prepared in the laboratory or obtained commercially.
  • the nucleic acid fragments to be analyzed consisting of natural nucleosides and modified nucleoside (s) can be obtained by the technique of genetic amplification PCR using a mixture of triphosphates of natural nucleosides and modified nucleoside (s) ). These compounds can also be obtained by preparing, in a first step, single-stranded natural DNA fragments by the asymmetric PCR technique, then by copying in a second step the single-stranded natural DNA fragment in complementary sequence consisting of natural nucleosides and nucleoside ( s) modified using a mixture of natural desoxynucleoside triphosphate and modified nucleoside (s) and DNA polymerase.
  • the deoxynucleosides modified 5 'triphosphates can be prepared from the deoxynucleosides modified in two stages as for natural deosxynucleosides triphosphates.
  • the first step concerns the preparation of modified 5 'monosphates deoxynucleosides by reaction of nucleosides modified with phosphorus oxychloride in trialkyphosphate (M. Yoshikawa, T. Kato and T. Takenishi, Tetrahedron Lett., 1967, 5065-5068).
  • the second step concerns the activation of the 5 'phosphate by reaction with carbonyldiimidazole then coupling of the activated intermediate with the tributylammonium salt of the pyrophosphate according to DE Hoard and DG Ott (J. Amer. Chem. Soc. 1965, 87, 1785-1788).
  • the triphosphates can be obtained from deoxycytidine triphosphate by transamination in the presence of alkyl lamin and bisulfite (PS Miller and CD Cushman, 1992 Bioconjugate Chem., 3, 74 -79).
  • Hybridization studies were performed with a KONTRON UVIKON cell changer 941 absorption spectrometer at 260 nm.
  • FIGS. 1 and 2 indicate the Tm of the double strands formed between natural tridecadeoxynucleotides and natural nonadesoxynucleotides of a on the one hand and nonadesoxynucleotides comprising a dC * modified deoxycytidine on the other hand.
  • the Tm values in FIG. 1 show that for the double strands made up of natural nucleotides, the stability of the hybrids varies greatly with the base composition.
  • the replacement of the A-T pair by the GC pair ( Figure 2) in positions 4 and 7 leads to an increase in Tm of the order of 10'C.
  • N-4-ethydeoxycytidine and 1-b-D-arabinofuranosyl-cytosine is equivalent to that of my pairings
  • cytosines located on the two strands are replaced by N-4-methylcytosine (duplex 42, FIG. 7) or N-4-ethylcytosine (duplex 43).
  • duplexes 2 and 41 When the nonadeoxy-nucleotide sequences for example are immobilized on the same solid support, it is not possible to form at the same time time specific hybrids such as duplexes 2 and 41 without formation of mismatched hybrids such as duplexes 14, 21 and 28 which have higher Tm than that of duplex 41.
  • duplexes consisting of base pairs A -T and G-CN And makes it possible to obtain specific hybrids such as duplexes 41 and 43, indeed duplex 44 for example which derives from duplex 43 with however a mismatch ⁇ -C NEt is very little stable (Tm ⁇ 10 'VS) .
  • duplexes 46 and 47 constituted respectively by 9 pairs A _ ⁇ j5Propynyle and 9 pairs GC 4Met were studied and compared with those of the corresponding unmodified duplexes 41 and 45 (FIG. 8).
  • Tm of the modified duplexes 46 and 47 are located between those of the natural duplexes 41 and 47.
  • FIG. 9 gives the Tm of the double strands formed between a tridecadeoxynucleotides and nonadesoxynucleotides comprising a modified deoxyguanosine dG *.
  • the results obtained show that the replacement of a natural base pair CG by a base pair CG * has an effect on the thermal stability of the hybridization complexes.
  • the derivatives substituted on the amino group in position 2 make it possible to modulate the stability of the hybrids.
  • the stability of the duplexes containing the cG 2alkyl base pair decreases when the steric hindrance of the substituent increases (duplexes 55, 56, 57, 58).
  • the duplex 58 comprising the pair CG 2iPr has a thermal stability close to that of the duplex 52 enclosing the pair TA at the same position.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de formation d'un complexe d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en base des deux molécules d'acide nucléique hybridées, consistant à mettre en contact une première molécule d'acide nucléique avec une seconde molécule d'acide nucléique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, caractérisé en ce que l'un au moins des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et/ou de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un au moins des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée et en ce que l'ensemble des paires de bases entrant dans la composition dudit complexe présente une stabilité voisine.

Description

PROCEDE DE FORMATION DE COMPLEXES D'HYBRIDATION DONT LA STABILITÉ DÉPEND PEU DE LA COMPOSITION EN BASE DES DEUX MOLÉCULES D'ACIDES NUCLÉIQUES HYBRIDÉES.
La présente invention concerne un procédé de formation de complexes d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en base des deux molécules d'acides nucléiques hybrides. L'invention se rapporte également à la mise en oeuvre de ce procédé pour l'analyse de séquences d'acide nucléique. L'invention a aussi pour objet des complexes d'hybridation formés de deux molécules d'acide nucléique complémentaires, ou sensiblement complémentaires, dont la stabilité dépend peu de la composition en bases desdites deux molécules d'acide nucléique hybridées.
La loi d'appariement A-T (ou A-U) et G-C confère aux acides nucléiques la propriété de former des complexes d'hybridation spécifiques entre des séquences complémentaires. Cette propriété connue de longue date permet d'utiliser un fragment d'acide nucléique, ou oligonucléotide, comme sonde, pour mettre en évidence la présence d'une séquence nucléique complémentaire. L'analyse de fragments d'ADN après séparation sur gel (E. Southern, J. Mol . Biol . , 1975, 98, 503-517) est aujourd'hui largement répandue tant dans le domaine de la recherche fondamentale que dans celui de l'analyse médicale (Caskey, Sci ence , 1987, 236, 1223-1228 ; Landegrer et al., Science, 1988, 242, 229-237 ; Arnheim et al., Ann Rev. Biochem. , 1992, 61, 131-156) .
Plusieurs techniques d'analyse des acides nucléiques basées sur leur propriété d'hybridation avec des sondes ont été développées notamment pour le séquençage d'ADN ou d'ARN inconnus, la détection de séquences associées à une pathologie, la recherche de mutations ponctuelles dans des séquences (S. Ikata et al., Nuclei . Acids Res . , 1987, 15, 797-811 ; J. A. Matthews, L. J. Kricka, Analytical Biochemiεtrγ, 1988, 169, 1-25) .
Plus récemment, il a été proposé de nouveaux procédés d'analyse et de séquençage de fragments d'ADN, basés sur l'hybridation avec une série d'oligonucléotides immobilisés sur un support solide (E. Southern, Brevet Européen No. 0 373 203 ; K. R. Khrapko et al., FEBS Lett ers, 1989, 256, 118-122 ; R. Drmanac et al., Genomics, 1989, 4, 114-128 ; R. Drmanac et al., DNA and Cell Biology, 1990, 9,527-534 ; K. R. Khrapko et al., J. DNA Sequencing Mapp . , 1991, 1, 375-388 ; R. Drmanac et al., Science , 1993, 260, 1649-1652; R. J. Lipshutz, J. Biomol . Struct . Dyn . , 1993, 11, 637-653 ; U. Maskos, E. Southern, Nucleic Acids Res . , 1993, 21, 4663-4669 ; A. C. Pease et al., Proc. Natl . Acad. Sci . , USA, 1994, 91, 5022-5026 ; J. C. Williams, Nucleic Acids Res . , 1994, 22, 1365-1367 ; E. M. Southern, Nucleic Acids Res . , 1994, 22, 1368-1373) . Ces nouveaux procédés consistent à détecter les signaux émis par les hybrides formés de 1 'appariement d'un ADN marqué avec une série d'oligonucléotides de même longueur et de séquences différentes immobilisés sur une membrane ou une surface en verre, puis à reconstruire la séquence du fragment d'ADN selon un processus algorithmique. L'analyse des complexes d'hybridation obtenus par les procédés ci- dessus est fondée sur la plus grande stabilité des hybrides sans mesappariement par rapport à celle des hybrides comportant un ou plusieurs mesappariements . La discrimination entre un hybride parfait et un hybride avec mésappariement peut être réalisée par exemple en élevant la température du milieu, ce qui provoque une dissociation des complexes avec mésappariement avant celle des complexes sans mésappariement. Mais l'emploi d'oligonucléotides naturels dans les techniques précédentes, utilisant en même temps un grand nombre de ces oligonucléotides sondes, se heurte à une difficulté fondamentale liée à la différence de stabilité des hybrides en fonction de la composition en base des oligonucléotides immobilisés. Il est en effet connu que la paire de base G-C, caractérisée par trois liaisons hydrogène, est plus stable que les paires A-T ou A-U qui ne possèdent que deux liaisons hydrogène. En conséquence, les hybrides parfaits formés par des séquences riches en paires A-T sont susceptibles de présenter une stabilité voisine, voir même inférieure, à celle d'hybrides imparfaits comportant un mésappariement et formés avec des séquences de même longueur mais riches en paires G-C. Ce phénomène conduit à des signaux faux positifs ou faux négatifs selon les conditions de température d'hybridation et de lavage mises en oeuvre.
L'utilisation d'oligonucléotides composés des nucléosides naturels dA, dG, dC, T ou dU, constitue donc un obstacle majeur au développement de ces nouvelles techniques d'analyse de séquences d'acide nucléique. Le risque de défaillance dans la discrimination entre hybrides parfaits et imparfaits, implique en outre une vérification systématique pour un grand nombre d'oligonucléotides dans des conditions de température et de milieu définis.
Afin de pallier cet inconvénient, il a été proposé dans l'art antérieur, un procédé d'hybridation utilisant le chlorure de tétraméthylammonium visant à atténuer la différence de stabilité des hybrides en fonction de leur composition en base (W. B. Melchoir, P. H. von Hippel, Proc . Natl . Acad. Sci . , USA, 1973, 70, 298-302 ; U. Maskos, E. M. Southern, Nucleic Acids Res . , 1993, 21, 4663-4669), mais les résultats ainsi obtenus ont été contredits avec d'autres séquences nucleotidiques (P. V. Riccelli, A. S. Benight, Nucleic Acids Res . , 1993, 21, 3785-3788) .
Il a également été proposé de faire varier la densité des oligonucléotides immobilisés sur gel de polyacrylamide en fonction de leur composition en base (K. R. Khrapko et al., J. DNA Sequencing Mapp . , 1991, 1, 375-388) . Mais cette stratégie complique considérablement le système dès lors que celui-ci est appliqué avec un grand nombre d'oligonucléotides immobilisés.
Il a aussi été envisagé d'utiliser des bases modifiées telles que la 5-CldU et la 2-NH2dA, cependant, une grande variation de stabilité des hybrides a été observée (J. D. Heisel, H. Lehrach, FEBS Lett . , 1990, 274, 103-106) . Une autre approche utilisant des oligomères construits avec des désoxyribonucléosides et des ribonucléosides pour déstabiliser les hybrides des séquences riches en bases G et C a aussi décrite (Jorg D. Hoheisel, Nucleic Acids Research, 1996, vol. 24. No. 3), mais la quantité des hybrides formés avec ces oligonucléotides diminue très rapidement lorsque le nombre d'alternance augmente. De plus la dissociation thermique de ces hybrides s"étendent sur une zone de température très large ce qui rend très aléatoires la distinction entre les hybrides parfaits et les hybrides avec mésappariement.
La présente invention a donc pour but de fournir un procédé permettant de former des complexes d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en bases des deux molécules d'acide nucléiques hybrides. Ce but est atteint grâce à un procédé consistant à mettre en contact une première molécule d'acide nucléique avec une seconde molécule d'acide nucléique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, caractérisé en ce que l'un au moins des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et/ou de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un au moins des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée et en ce que l'ensemble des paires de bases entrant dans la composition dudit complexe présente une stabilité voisine. La nomenclature utilisée, dans ce qui suit, pour désigner par une lettre les quatre types de base entrant dans la composition des acides désoxyribonucléiques, sera la suivante : la désoxycytidine sera représentée indifféremment par C ou dC, marqué d'une "*" pour désigner la base modifiée correspondante, la désoxyguanosine sera représentée indifféramment par G ou dG, marqué d'une "*" pour désigner la base modifiée correspondante, - la thymidine et la désoxyuridine seront représenté respectivement par T ou du, marqué d'une "*" pour désigner la base modifiée correspondante, la désoxyadénosine sera représentée indifféramment par A ou dA, marqué d'une "*" pour désigner la base modifiée correspondante.
Pour réduire la différence de stabilité des hybrides, due à la différence de composition en base, l'invention propose de remplacer l'un au moins des nucleosides naturels choisis parmi la désoxycytidine (dC) , la désoxyguanosine (dG) , la thymidine (T) et la désoxyadénosine (dA) , par des nucleosides modifiés mais respectant la loi d'appariement, désignés respectivement dC*, dG*, du* et dA*, afin de disposer de séquences d'acides nucléiques capables de former des complexes d'hybridation dans lesquels : - les paires de bases C*-G et/ou G*-C ont une stabilité équivalente à celle des paires A-T, et/ou
- les paires de bases A*-T et/ou A-T* ont une stabilité supérieure à celle des paires A-T et voisine de celle des paires C-G naturelles, ou encore
- les paires de bases C*-G et/ou G*-C ont une stabilité équivalente à celle des paires A*-T et/ou A-T*; dans ce mode de réalisation, on abaisse la stabilité des paires C*-G et/ou G*-C par rapport à celle des paires G-C naturelles et on augmente la stabilité des paires A*-T et/ou A-T* par rapport à celle des 'paires A-T naturelles.
Ainsi, le procédé selon l'invention comprend plusieurs formes de mise en oeuvre et notamment les quatre qui suivent.
Une première forme de mise en oeuvre du procédé de 1 ' invention est caractérisée en ce que le même type de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace. Dans cette forme de mise en oeuvre, un au moins, même type de base (A, G, C ou T) , entrant dans la composition de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace. On peut ainsi envisager : - que l'un seulement des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un seulement des deux types de paire de bases (A-T, G-C) entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée.
- que deux des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d' appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que les deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprennent une base modifiée.
Une deuxième forme de mise en oeuvre du procédé de l'invention est caractérisée en ce que deux au moins des quatres types de base entrant dans l'une seulement des première et seconde molécules d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que l'un au moins des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne des bases modifiées.
Le procédé de 1 ' invention peut être avantageusement utilisé pour l'analyse de séquences d'acides nucléiques, notamment pour le séquençage ou la détection de mutation. Un tel procédé consiste à réaliser un complexe d'hybridation, conformément à la méthode décrite précédemment, dans lequel la première molécule d'acide nucléique constitue ou comprend la séquence à analyser et la seconde molécule d'acide nucléique est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, puis en ce que l'on analyse le complexe d'hybridation par tout moyen approprié. Un procédé d'analyse d'acides nucléiques selon l'invention est caractérisé en ce que l'on met en contact les acides nucléiques à analyser, éventuellement préalablement marqués, avec une quantité adéquate d'au moins une sonde nucléique, puis en ce que l'on analyse par tout moyen approprié les complexes d'hybridation éventuellement formés, notamment afin d'identifier la pésence de mésappariement.
Parmi les méthodes d'analyse entrant dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment les méthodes de détection par luminescence, fluorescence, par colorimétrie et par radioactivité.
Avantageusement, ladite sonde nucléique est un oligonucléotide comprenant de 4 à 30 nucleosides.
Une première forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique selon l'invention consiste :
- à préparer la première molécule d'acide nucléique par un processus chimique ou biologique de copie de tout ou partie de la séquence à analyser, ledit processus mettant en oeuvre un nucléoside modifié de façon à remplacer l'un des quatre types de bases entrant dans la composition de ladite séquence par une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace,
- à mettre en contact ladite première molécule d'acide nucléique avec la seconde molécule d'acide nucléique qui est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, de façon à former un complexe d'hybridation dans lequel l'un des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la compos i tion du complexe comprenne une base modifiée .
- à analyser le complexe d ' hybridation par tout moyen approprié .
Une deuxième forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique selon l'invention consiste :
- à préparer la première molécule d'acide nucléique par un processus chimique ou biologique de copie de tout ou partie de la séquence à analyser, ledit processus mettant en oeuvre deux nucleosides modifiés de façon à remplacer deux des quatre types de bases entrant dans la composition de ladite séquence par deux bases modifiées possédant des propriétés d' appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, à mettre en contact ladite première molécule d'acide nucléique avec la seconde molécule d'acide nucléique qui est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, de façon à former un complexe d'hybridation dans lequel deux des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que les deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprennent une base modifiée. - à analyser le complexe d'hybridation par tout moyen approprié.
Une forme de mise en oeuvre particulière du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique selon 1 ' invention est caractérisée en ce que la sonde nucléique a été préparée par un processus chimique ou biologique mettant en oeuvre au moins un type de nucleosides modifiés de façon à obtenir une sonde dont la séquence comprend au moins une base modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace.
On vise plus particulièrement, dans cette forme de mise en oeuvre, des sondes nucléiques dans lesquelles deux des quatre types de base entrant dans leur composition sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent. On peut ainsi envisager les combinaisons suivantes :
- les nucleosides dC et dG sont remplacés respectivement par des nucleosides dC* et dG*, - les nucleosides dA et T sont remplacés respectivement par des nucleosides dA* et du*,
- les nucleosides dC et T sont remplacés respectivement par des nucleosides dC* et du* définis précédemment, dans ce cas, la première molécule d'acide nucléique est préparée conformément à la deuxième forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique décrit précédemment,
- les nucleosides dG et T sont remplacés respectivement par des nucleosides dG* et du*, dans ce cas, la première molécule d'acide nucléique est préparée conformément à la deuxième forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique décrit précédemment,
- les nucleosides dA et dG sont remplacés respectivement par des nucleosides dA* et dG*, dans ce cas, la première molécule d'acide nucléique est préparée conformément à la deuxième forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique décrit précédemment, - les nucleosides dA et dC sont remplacés respectivement par des nucleosides dA* et dC*, dans ce cas, la première molécule d'acide nucléique est préparée conformément à la deuxième forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique décrit précédemment. Parmi, les combinaisons de modifications envisagées ci-dessus, on préfère plus particulièrement, celles conduisant à des oligodésoxynucléotides dans lesquels :
- Tous les nucleosides dC et dG sont remplacés respectivement par les nucleosides dC* et dG* . Les sondes nucléiques constituées par ces oligodésoxynucléotides modifiés sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires non modifiées. En effet, cette double modification des oligodésoxynucléotides permet de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de base G*-C et C*-G présentent une stabilité équivalente à celle des paires de base A-T ou A-U non modifiées . - Tous les nucleosides dA et T sont remplacés respectivement par les nucleosides dA* et dU* . Les sondes nucléiques constituées par ces oligodésoxynucléotides modifiées sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires non modifiées. En effet, cette double modification des oligodésoxynucléotides permet de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de base A*-T et A-U* présentent une stabilité voisine de celle des paires de bases G-C non modifiées.
Les autres sondes nuc léiques doublement modifiés au niveau de l ' un seulement des nucleosides de chaque paire de base sont utiles pour f ormer des complexes d ' hybridation avec des séquences d ' acide nucléique complémentaires dont le même nucléoside de chaque paire de bases a également été remplacé par un nucléoside modifié, afin de former des complexes d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en bases.
Dans ce dernier cas, comme dans celui où seulement un nucléotide d'un type de paire de bases est modifié, il convient de soumettre l'acide nucléique complémentaire à une étape préalable de modification permettant de remplacer le même nucléoside de la paire de bases considérée afin que l'un ou l'autre des deux nucleosides de ladite paire de bases dans le complexe d'hybridation soit modifié de façon à ce que la stabilité de l'hybride dépende peu de la composition en base.
Cette étape de modification préalable des acides nucléiques intervient dans le cas où 1 'oligodésoxynucléotide constituant la sonde nucléique ne comprend que :
- l'un seulement des quatre nucleosides modifiés dC*, dG*, dU* ou dA*, ou - deux de ces quatre nucleosides modifiés, dès lors que ces deux-ci n'appartiennent pas à la même paire de base comme :
- dC* et dU* ou dA*,
- dG* et dU* ou dA*, - dU* et dC* et dG*,
- dA* et dC* et dG* .
Le remplacement de nucleosides naturels présents dans les acides nucléiques cibles, au cours de cette étape préalable de modification peut être réalisé par toutes méthodes connues de l'Homme du métier, telle qu'une réaction de polymérisation enzymatique mise en oeuvre avec un ou plusieurs nucleosides modifiés.
Selon une forme de réalisation avantageuse des procédés d'analyse définis ci-dessus, ceux-ci sont mis en oeuvre avec des sondes nucléiques fixées sur un support, tels que des membranes ou des fils de cellulose, ou de polymères synthétiques ou encore des surfaces de verre. Les oligodésoxynucléotides constituant les sondes nucléiques peuvent être alors synthétisés directement à sur le support.
Les sondes nucléiques mises en oeuvre dans les procédés d'analyse de séquences d'acide nucléiques précédents peuvent être en outre substituées à l'une au moins de leurs extrémités 5 ' et/ou 3 ' notamment :
- par des agents intercalants tels que les dérivés de 1 ' acridine afin d'augmenter la stabilité des hybrides,
- par la biotine pour former des complexes avec des dérivés de la streptavidine,
- par des groupements fonctionnels pour préparer des conjugués ou pour les immobiliser sur des supports solides comme par exemple : - (CH2 ) n~COOH, - (CH2) n-NH2, -<CH2)n-SH, - (CH2 ) n"CHOH-CH2OH , -(CH2)nO-P03 27 -(CH2) n-Pθ2 -S 7 où n est compris entre 1 et 20. Ces oligodésoxynucléotides substitués peuvent être préparés conformément aux méthodes décrites dans la littérature (Nguyen, T. Thuong, U. Asseline, Oligonucléotides and analogues : A practical approach, F. Eckstein éd. , I. R. L. Press, Oxford, 1991, 283-306 ; U. Asseline et al., Tetrahedron, 1992, 48, 1233-1254) .
Des modifications chimiques des nucleosides dC, dG, T et dA entrant dans le champ de la présente invention seront décrites ci-après.
Un premier type de base pouvant entrer dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxycytidine modifiée répondant à la formule suivante : NH—R
Figure imgf000016_0001
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Ci à C5, un groupe allyle ou propargyle, Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, et X est un atome de d'azote ou un groupe -CH-, ladite désoxycytidine modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la cytidine naturelle qu'elle remplace.
Parmi les désoxycytidineS modifiées de formule (I) ci-dessus, on peut citer les composés suivants : la N-4-méthyl-2 ' -désoxycytidine (d4MeC) , la
N-4-éthyl-2 ' -désoxycytidine (d4EtC) , la N-4-propyl-2 ' - désoxycytidine (d4ProC) , la N-4-allyl-2 ' -désoxycytidine
(d4A11y1C) , la N-4-propargyl-2 ' -désoxycytidine (d4ProPargylC) ( la x-β-D-arabinofuranosy1-cytosine (dAraC) , la 6-azadésoxycytidine (d6NC) .
Les acide nucléiques comportant des dC* à la place des dC sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires dont les désoxycytides naturelles dC ont également été remplacées par des nucleosides modifiés dC*, afin de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de base C*-G présentent une stabilité voisine de celle des paires de base A-T non modifiées. Les désoxycytidines naturelles peuvent être remplacées par des dC* définies ci-dessus, par toutes méthodes connues de l'Homme du métier, telle qu'une réaction de polymérisation enzymatique mise en oeuvre avec des nucleosides dC* . Un deuxième type de base pouvant entrer dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyguanosine modifiée répondant à la formule suivante :
Figure imgf000017_0001
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C5, un groupe allyle ou propargyle, Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R2 représente un atome d'hydrogène ou un atome de brome, et X est un atome d'azote ou un groupe -CH-, ladite désoxyguanosine modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la désoxyguanosine naturelle qu'elle remplace.
Parmi les désoxyguanosines modifiées de formule (II) ci-dessus, on peut citer les composés suivants : la N-2-méthyldésoxyguanosine (d2MeG) , la N-2- propyldésoxyguanosine (d2ProG) , la N-2-isopropyldésoxy- guanosine (d2IsoProG) , la N-2-éthyldésoxyguanosine
(d2EtG) , la 7-déazadésoxyguanosine (d7cG) , la 8-bromo- désoxyguanosine (d8BrG) .
Les acide nucléiques comportant des dG* à la place des dG sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires dont les désoxyguanosines naturelles dG ont également été remplacées par des nucleosides modifiés dG*, afin de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de bases G*-C présentent une stabilité voisine de celle des paires de base A-T non modifiées. Les désoxyguanosines naturelles présentes dans la séquence d'acide nucléique cible peuvent être remplacées par des dG* définies ci-dessus, par toutes méthodes connues de l'Homme du métier, telle qu'une réaction de polymérisation enzymatique mise en oeuvre avec des nucleosides dG* .
Un troisième type de base pouvant entrer dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une desoxyuridine modifiée répondant à la formule suivante :
Figure imgf000018_0001
dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R représente un groupe de formule - C ≡ CH, ou - C s c - CH3, ladite desoxyuridine modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la thymidine naturelle qu'elle remplace. Parmi les désoxyuridines modifiées de formule (III) ci-dessus, on peut citer les composés suivants : la 5-éthynyldésoxyuridine (d5EthVτιy1U) , la 5- propynyldésoxyuridine (d5Pr°pyny1U) .
Les acide nucléiques comportant des dU* à la place des T sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires dont les thymidines naturelles T ont également été remplacées par des nucleosides modifiés du*, afin de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de bases U*-A présentent une stabilité voisine de celle des paires de base G-C non modifiées. Les thymidines naturelles présentes dans la séquence d'acide nucléique cible peuvent être remplacées par des dU* définies ci-dessus, par toutes méthodes connues de l'Homme du métier, telle qu'une réaction de polymérisation enzymatique mise en oeuvre avec des nucleosides dU* .
Un quatrième type de base pouvant entrer dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyadénosine modifiée répondant à la formule suivante :
dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R représente un atome d'hydrogène ou un groupe NH2 , X est choisi parmi un atome d'azote, les groupes de formule : C - Br, C - Cl, C - C ≡ CH, C - C ≡ C - CH3 , ladite désoxyadénosine modifiée possédant des propriétés d ' appariement voisines de celles de la désoxyadénosine naturelle qu'elle remplace .
Parmi les désoxyuridines modifiées de formule (IV) ci-dessus, on peut citer les composés suivants : 1 ' amino- 2 -désoxyadénosine (d2NH2A) , la 7- déaza-7-bromodésoxyadénosine, la 7-déaza-7-propynyl- désoxyadénosine , 1 ' amino- 2-7 -dé az a- 7- bromo désoxy¬ adénosine, 1 ' amino-2-7-déaza-7-propynyl-désoxyadénosine . Les acide nucléiques comportant des dA* à la place des dA sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires dont les désoxyadénosine naturelles dA ont également été remplacées par des nucleosides modifiés dA* , afin de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de base A*-U ou A*-T présentent une stabilité voisine de celle des paires de base G-C non modifiées . Les désoxyadénosines naturelles présentes dans la séquence d'acide nucléique cible peuvent être remplacées par des dA* définies ci-dessus, par toutes méthodes connues de l'Homme du métier, telle qu'une réaction de polymérisation enzymatique mise en oeuvre avec des nucleosides dA* .
Avantageusement, dans le procédé de l'invention les première et seconde molécules d'acide nucléique sont de type désoxyribonucléique.
Selon une forme de réalisation particulièrement intéressante, des procédés de formation d'un complexe d'hybridation et d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'invention la mise en contact des première et seconde molécules d'acide nucléique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, est effectuée en présence de chlorure de tetramethylammonium ou d'un dérivé de celui-ci fonctionnellement équivalent, tel que les halogénures de triméthylalkylammonium. En effet, ce milieu permet d'ajuster la stabilisation des paires comprenant ou non des bases modifiées.
L'invention concerne aussi un complexe d'hybridation formé de deux molécules d'acide nucléique complémentaires, ou sensiblement complémentaires, dont la stabilité dépend peu de la composition en bases des deux molécules d'acide nucléique hybridées, caractérisé en ce que l'un au moins des types de paire de base entrant dans la composition dudit complexe comprend au moins une base modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'ensemble des paires de bases entrant dans la composition dudit complexe présente une stabilité voisine. Selon une première forme de réalisation préférée, le complexe d'hybridation de l'invention est caractérisé en ce que le même type de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace. Dans cette forme de réalisation, 1 ' invention envisage plus particulèrement les cas où : - le complexe d'hybridation est caractérisé en ce que 1 'un des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée;
- le complexe d'hybridation est caractérisé en ce que deux des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que les deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprennent des bases modifiées.
Selon une seconde forme de réalisation préférée, le complexe d'hybridation de l'invention est caractérisé en ce que deux des quatres types de bases entrant dans l'une seulement des première et seconde molécules d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d' appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée. Avantageusement, la première ou la seconde molécule d'acide nucléique formant le complexe d'hybridation de l'invention, est une sonde oligonucléotidique.
Les modifications chimiques des nucleosides dC, dG, T et dA entrant plus particulièrement dans la composition desdites première et/ou seconde molécule d'acide nucléique des complexes de l'invention sont celles décrites précédemment pour la désoxycytidine modifiée, la désoxyguanosine modifiée, la desoxyuridine modifiée, la désoxyadénosine modifiée.
D'autres avantages et caractéristiques de
1 ' invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre non limitatifs, et concernant la préparation de nucleosides modifiés, leur utiliation pour préparer des acides nucléiques modifiés et la mise en oeuvre de ceux-ci pour préparer des complexes d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en bases .
I - Préparation de nucleosides modifiés.
1) Schémas généraux.
Les 3 'phosphoramidites des nucleosides modifiés sont accessibles dans le commerce, comme par exemple : . 5 ' -0-diméthoxytrityl-3 ' -O- (2-cyanoéthyl-
N,N-diisopropylamidophosphite) -1-β-D-arabinofuranosyl- cytosine (Glen Research) ,
. 5 ' -O-diméthoxytrityl-3 ' -O- (2-cyanoéthyl- N,N-diisopropylamidophosphite) -5-propynyl-2 ' - desoxyuridine (Glen Research) , . 5 ' -0-diméthoxytrityl-3 ' -0- (2-cyanoéthyl- N,N-diisopropylamidophosphite) -7-déaza-2 ' - désoxyguanosine (Glen Research) ,
. 5 ' -0-diméthoxytrityl-3 ' -O- (2-cyanoéthyl- N,N-diisopropylamidophosphite) -8-bromo-2 'désoxyguanosine
(Glen Research) .
Les autres phosphoramidites de nucleosides modifiés peuvent aussi être préparés au laboratoire à partir d'autres nucleosides modifiés selon les techniques décrites dans la littérature (N. D. Sinha et al., Nucleic Acid Res., 1984, 12, 4539-4557 ; J. Nielsen et al. Nucleic Acid Res., 1986, 14, 7391-7403) .
La synthèse de la 5 ' -O-diméthoxytrityl-3 ' -O- (2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamidophosphite) -N-4-alkyl- 2 ' -désoxycytidine est réalisée à partir de la 2 ' - desoxyuridine commerciale (Aldrich) . Elle consiste à protéger les hydroxyles 5' et 3 ' de la 2 ' desoxyuridine respectivement par action du chlorure de diméthoxytri tyle et du chlorure de fcert- butyldiméthylsilyle . La conversion de la 2 '- désoxyuridine en N-4-alkyl-2 ' -désoxycytidine est réalisée dans une première étape par activation de la position C4 de la 2 ' -desoxyuridine protégée par traitement avec de 1 ' oxychlorure de phosphore en présence de triazole suivi d'un traitement avec les aminés primaires correspondantes . Après déprotection de 1 ' hydroxyle 3 ' par action du fluorure de tétrabutylammonium, la phosphitylation de la position 3 ' est réalisée en utilisant la 2-cyanoéthyl-N, N- diisopropylamidochlorophosphite .
La synthèse de la 5 ' -O-diméthoxytrityl-3 ' -O-
(2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamidophosphite) -6-aza-2 ' - désoxycytidine est réalisée par exemple à partir de la 6-aza-uridine commerciale (Sigma) , qui est désoxygénée en position 2' puis convertie en 6 -aza-2 ' désoxycytidine . La protection sélective des hydroxyles en 5 ' et 3 ' de la 6-aza-uridine est réalisée par action du chlorure de tétraisopropyldisiloxane . Après activation de 1 ' hydroxyle en 2 ' avec le chlorure de phenoxythiocarbonyle, la desoxygenation est réalisée avec le tributyle étain en présence de l'α, α azoisobutyronitrite (M. J. Robins and J. S. Wilson, Am. Chem. Soc , 1981, 103, 932-933) . La conversion de la 6- aza-déεoxyuridine en 6-azadésoxycytidine est réalisée dans une première étape par activation de la position C4 de la 6-aza-désoxyuridine par traitement avec de 1 'oxychlorure de phosphore en présence de triazole suivi d'un traitement à l'amoniac gazeux (M. Perbostand and Y. S. Sanghvi, J. Chem. Soc . Perkin . Tranε . , 1, 1994, 2051- 2052) . Le groupement amino exocyclique est ensuite protégé par benzoylation. Après déprotection des hydroxyles 5' et 3', l 'hydroxyle 5' est protégé par tritylation et la phosphitylation de la position 3 ' est réalisée en utilisant le 2-cyanoéthy1-N, N- diisopropylamidochlorophosphite.
La synthèse du 5 ' -O-diméthoxytrityl-3 ' -O-(2- cyanoéthyl-N,N-diisopropylamidophosphite)-N-2-alkyl-2 '- désoxyguanosine a été réalisée par un procédé en 8 étapes (T. Steinbrecher, C. Wameling, F. Oesh and A. Seider, Angew. Chem. Int . Engl . 1993, 32, 404-406) . La première étape consiste en une protection du carbonyle en position 6 selon la réaction de Mitsunobu en employant le p-nitrophényle-éthanol. La désamination de la position 2 par traitement avec du nitrite de sodium conduit au composé hydroxyle. Les hydroxyles 5' et 3 ' sont ensuite protégés respectivement avec les groupes diméthoxytrityle et acétyle. L'hydroxyle en position 2 est ensuite transformé en ester de l'acide trifluorométhane sulfonique. Le traitement de ce dernier avec une aminé (méthylamine, éthylamine ... ) conduit au composé N-2-alkyl-2 ' -désoxyguanosine correspondant. Après déprotection de l' hydroxyle en 3 ' , la phosphitylation de ce dernier avec la 2-cyanoéthyl-N,N- di i sopr opy lamidochlor ophosphi t e sonduit au phosphoramidite cherché.
2) Exemples expérimentaux.
Exemple 1 : Préparation de la 5 ' -0- diméthoxytrityl-3 ' -O- (2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamido phosphite) -N-4-éthyl-2 ' -désoxycytidine .
a) Préparation de la 5 ' -O-diméthoxytrityl- 2 ' -desoxyuridine . A 5g (0,0219 mole) de 2 ' desoxyuridine préalablement séchés par coevaporation avec de la pyridine anhydre (3 fois) puis mis en solution dans 80 ml de pyridine anhydre, on ajoute 8,2 g (0,024 mole) de chlorure de deméthoxytrityle à 0°C . L'avancement de la réaction est contrôlé par CCM . Après 2 heures de réaction a température ambiante, la CCM du mélange montre que la réaction est achevée. L'excès de chlorure de diméthoxytrityle est détruit par addition de 2 ml de methanol. Le mélange est concentré sous vide, repris au dichl orométhane et lavé avec une solution de bicarbonate de sodium à 5 % (2 fois) puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium et le solvant chassé sous vide. Le résidu est purifié par précipitation à 1 ' hexane . Un précipité blanc apparaît. Ce composé est récupéré par filtration et séché au dessiccateur .
Rendement = 77 % (9 g) .CCM Merck silica gel 60F 254. Rf = 0,40 [éluant : CH2CI2 / MeOH (95 : 5, v/v)] = Syst A. Rf = 0,77 [éluant : CH2CI2 / MeOH (90 : 10, v/v)] = Syst B. b) Préparation de la 5 ' -O-diméthoxvtrityl- 3 ' -0- (tert-butvldiméthvlsilsvl) -2 ' -desoxyuridine.
9 g de 5 ' -0-diméthoxytrityl-2 ' -desoxyuridine (0,016 mole) et 3,26 g d'imidazole (0,048 mole) sont séchés par coevaporation avec de la pyridine anhydre (3 fois) et mis en solution dans 100 ml de pyridine anhydre. 3,13 g de tert-butyldiméthylchlorosilane (0,02 mole) sont ajoutés. La réaction est suivie par CCM. Après 12 heures de réaction, à température ambiante, le mélange est repris avec du dichloromethane. La phase organique est lavée avec une solution de bicarbonate de sodium à 5 % (2 fois) puis séchée sur sulfate de sodium. La milieu est concentré et précipité à froid dans de l'hexane. Le précipité obtenu est filtré sous le vide de la trompe à eau et séché au dessiccateur.
Rendement = 71 % (7,7 g) . CCM Merck silicagel 60F 254, Rf = 0,57 syst A, Rf = 0,86 syst B.
c) Préparation de la 5 ' -O-diméthoxvtritvl- 3 '-O- (tert-butvldiméthvlsilsvl) -N-4-éthvl-2 ' - désoxvcvtidine. A 3,1 g de triazole (0,047 mole) préalablement séchés 3 fois par coevaporation avec de 1 ' acétonitrile anhydre, solubilisé dans 50 ml d'acétonitrile, on ajoute à 0°C 0,98 ml de P0C13 (0,01 mole) et 7,3 ml de triéthylamine (0,052 mole) . Le mélange réactionnel est maintenu sous agitation pendant
30 minutes à 0°C. Puis 2 g de 5 ' -O-diméthoxytrityl-3 ' -O-
( ter t-butyldiméthylsilsyl ) -2 ' -desoxyuridine ( 0 , 003 1 mole ) préalablement séché par coevaporation avec de
1 ' acétonitrile anhydre et solubilisé dans 10 ml d ' acétonitrile sont aj outés dans le milieu réactionnel .
Le mélange réactionnel est ensuite amené à température ambiante et mis sous agitation magnétique pendant 4 heures .
Sur le dérivé triazole brut obtenu (Rf=0,55 syst A, Rf=0,91 syst B) , on ajoute 9,6 ml d'une solution d'éthylamine (16 M dans 1 'acétonitrile, 0,15 mole) . La réaction est contrôlée par CCM et on observe la disparition totale du composé de départ au bout de 2 heures . Le milieu est ensuite concentré sous pression réduite, repris par du dichloromethane et lavé à l'eau. Après séchage sur sulfate de sodium, le solvant est chassé et une purification sur colonne de gel de silice dans le système [éluant : CH2CI2 / MeOH / Et3N (98:1:1, v/v) à ( 97 : 2 : 1] permet d'isoler 1,7 g du produit recherché. Rendement = 81 %. CCM Merck silicagel 60F
254, Rf = 0,26 syst A. Rf = 0,70 syst B.
d) Préparation de la 5 ' -Q-diméthoxytrityl-N- 4-éthvl-2 '-désoxycytidine. 1,7 g de 5 ' -O-diméthoxytrityl-3 ' -O- (tert- butyldiméthylsilsyl) -N-4-éthyl-2 ' -désoxycytidine (0, 0025 mole) est traité par 5 ml d'une solution 1 M de fluorure de tétrabutylammonium dans le tétrahydrofurane (0,005 mole) à température ambiante. La réaction contrôlée par CCM est complète après 2 heures. Le milieu est concentré sous pression réduite puis repris avec du dichloromethane et lavé avec une solution de bicarbonate de sodium et concentrée sous pression réduite. Le résidu est purifié sur colonne de gel de silice dans le système [éluant : CH2C12 / MeOH (98:2, v/v) à (95:2:5, v/vj .
Rendement = 78 % (1,1 g) .CCM Merck silicagel 60F 254, Rf=0,55 syst B.
e) Préparation de la 5 ' -O-diméthoxvtritvl- 3 ' -O- (2-cvanoéthyl-N.N-diisopropvlamidophosphite) -N-4- éthvl-2 ' -désoxvcvtidine. La 5 ' -0-diméthoxytrityl-N-4-éthyl-2 ' -désoxy¬ cytidine est séchée par 3 coévaporations successives avec de 1 ' acétonitrile anhydre puis laissée une nuit au dessiccateur . A 200 mg (0,35 mmole) de 5 ' -0- diméthoxytrityl-N-4-éthyl-2 ' -désoxy-cytidine solubilisé dans 4 ml de dichloromethane (anhydre et passé sur alumine basique) , on ajoute sous agitation et atmosphère inerte 0,24 ml de diisopropyléthylamine distillée (1,43 mole), puis goutte à goutte 0,12 ml (0,53 mmole) de 2- cyanoéthyl-N,N-diisopropylamidochlorophosphite. Au bout d'une heure, la réaction est achevée. On ajoute alors au mélange réactionnel 20 ml d'acétate d'ethyle et on lave avec une solution de bicarbonate de sodium à 10 % puis avec une solution de Nacl saturée. Après extraction, la phase organique est séchée sur sulfate de sodium et concentrée. On purifie le résidu sur colonne de gel de silice dans le système [éluant : CH2CI2 / AcOEt / Et3N, (60:30:10, v/v)]. Puis le composé est précipité dans 1 'hexane à -70°C et récupéré par filtration rapide et séché au dessiccateur.
Rendement = 48 % (130 mg) . CCM Merck silicagel 60F 254, Rf = 0,35 et 0,33 syst A. Ref = 0,68 et 0, 61 syst C.
Exemples 2 à 5 :
En opérant comme dans l'étape (c) de l'exemple 1 et en remplaçant 1 ' éthylamine par la méthylamine, la propylamine, l'allylamine et la propargylamine, on obtient respectivement les 5 ' -0- diméthoxytrityl-3 ' -O- (tert-butyldiméthylsilsyl) -N-4- méthyl-2 ' -désoxycytidine (composé 2c) , 5 ' -O- diméthoxytrityl-3 ' -O- (tert-butyldiméthylsilsyl) -N-4- propyl -2 ' -désoxycytidine (composé 3c) , 5 ' -O- diméthoxytrityl-3 ' -O- (tert-butyldiméthylsilsyl) -N-4- allyl-2 ' -désoxycytidine (composé 4c) , 5 ' -0- diméthoxytrityl-3 ' -O- (tert-butyldiméthylsilsyl) -N-4- propargyl-2 ' -désoxycytidine (composé 5c) , dont les caractéristiques sont résumées dans le tableau I ci- dessous.
Tableau I
Figure imgf000029_0002
Puis en opérant comme dans l'étape (d) de l'exemple 1 en partant des composés ci-dessus 2c, 3c, 4c et 5c, on obtient les composés correspondants 2d, 3d, 4d et 5d dont les caractéristiques sont résumées dans le tableau II ci-dessous.
Tableau II
Figure imgf000029_0003
Enfin les phosphoramidites 2e, 3e, 4e et 5e de formules (V) suivantes :
Figure imgf000029_0001
sont obtenus à partir des composé ci-dessus 2d, 3d, 4d et 5d en opérant comme à l'étape (e) de l'exemple 1. Les caractéristiques de ces composés sont résumées dans le tableau III ci-dessous ou sont indiquées également les significations de R.
Tableau III
Figure imgf000030_0001
[éluant CH2C12 / AcOEt / Et3N, (45:45:10, v/v) ] = syst C.
Exemple 6 Préparation de la 5 -O- diméthoxytrityl-3 ' -O-(2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamido- phosphite)-6-aza-désoxycytidine.
Ce composé a été obtenu en 6 étapes à partir de la 6-aza-uridine.
La synthèse de la 5 ' -O-diméthoxytrityl-3 ' -O- (2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamido-phosphite) -6-aza- désoxycytidine est réalisée par exemple à partir de la 6-aza-uridine commerciale, qui est désoxygénée en position 2' puis convertie en 6-aza-2 ' -désoxycytidine . La protection sélective des hydroxyles 5' et 3 ' de la 6- aza-uridine est réalisée par action du tétraisopropyldisiloxanne . Après activation de l' hydroxyle 2' avec le chlorure de phenoxythiocarbonyle, la desoxygenation est réalisée avec le tributyle étain en présence de l'α,α azoisobutyronitrite (M. J. Robins and J. S. Wilson, J. Am. Chem. Soc, 1981, 103, 932- 933) . La conversion de la 6-azadésoxyuridine en 6- azadésoxycytidine est réalisée dans une première étape par activation de la position C4 de la 6- azadésoxyuridine par traitement avec de 1 ' oxychlorure de phosphore en présence de triazole suivi d'un traitement à l'ammoniac gazeux (M. Perbostand and Y. S. Sanghvi, J. Chem. Soc. Perkin. Trans . 1, 1994, 2051-2052) . Le groupement amino exocyclique est ensuite protégé par benzoylation. Après déprotection des hydroxyles 5' et 3 ' par traitement avec le fluorure de tétrabutylam-moniume dans le tétrahydro-furane, 1 'hydroxyle 5' est protégé parle groupe diméthoxytrityle et la phosphitylation de la position 3 ' est réalisée en utilisant le 2- cyanoéthyl-N, N-diisopropyla-mi-dochlorophosphi-te comme dans l'exemple 1 étape (e) .
CCM Merck silicagel 60F 254, Rf = 0,37 et 0,43 syst A.
Exemple 7 à 10 : Préparation de la 5 ' -O- diméthoxytrityl-3 ' -O- (2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamido- phosphite) -N-2-alkyl-2 ' -désoxyguanosine
La synthèse de 5 ' -O-diméthoxytrityl-3 ' -O- (2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamidophos-phite) -N-2-alkyl- 2 ' -désoxyguanosine a été réalisée par exemple en 8 étapes selon T. Steinbrecher , C. Wameling, F. Oesh et A. Seider (Angew. Chem. Int; Engl . 1993, 32 , 404-406) . Elle consiste dans une première étape en la protection du carbonyle en position 6 de la désoxyguanosine selon la réaction de Mitsunobu en employant le p-nitrophényl- éthanol . La désamination de la position 2 par traitement avec du nitrite de sodium conduit au composé hydroxyle. Les hydroxyles 5 ' et 3 ' sont ensuite protégés respectivement avec les groupes diméthoxytri-tyle et acétyle . L' hydroxyle en position 2 est ensuite transformé en ester de l'acide trif luorométhane sulfonique. Le traitement de ce dernier avec une aminé (méthylamine, éthylamine, propylamine, i s opropy lamine, ...) conduit au composé N-2-alkyl-2 ' -désoxyguanosine correspondant. Après déprotection de l' hydroxyle 3', la phosphitylation de ce dernier avec le 2-cyanoéthyl-N, N-diisopropylamidochlorophosphite comme dans l'exemple 1, étape (e) conduit au phosphoramididite cherché de formule (VI) :
Figure imgf000032_0001
r
Figure imgf000032_0002
dans laquelle R = Méthyle (composé de l'exemple 7), R = Ethyle (composé de l'exemple 8), R = Propyl (composé de l'exemple 9), R = Isopropyl (composé de l'exemple 10),
II - Préparation àfis oligonucléotides modifiés.
Les oligonucléotides comprenant des bases modifiées, et désignés oligonucléotides modifiés, peuvent être préparées en solution ou sur un support solide selon les procédés classiques de synthèse d ' oligonucléoides utilisant la méthode aux phosphotriester (J. Stawinski et al., Nucleic Acids
Res., 1977, 4, 356-371) la chimie des phosphoramidites (S. L. Beaucage, M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett . 1981, 22, 1859-1862) ou la chimies des H-phosphonates (P. J. Garegg et al., Tetrahedron Lett. 1986, 27, 4055- 4058) .Les oligonucléotides modifiés peuvent être commodément fabriqués sur support solide. L'assemblage des bases est effectué sur un synthétiseur d'oligonucléotides sur support CPG (Controlled Pore Glass) fonctionnalisé avec un nucléoside selon la méthode au phosphoramidites décrite par Beaucage et Caruthers . Les synthèses sont réalisées à l'échelle d'une micromole en utilisant dix équivalents de phosphoramidites commerciaux et de phosphoramidite(s) modifié(s) préparés comme indiqués aux exemples 1 à 10, par cycle. La durée du cycle est voisine de 10 minutes avec un temps de couplage de 1,5 minutes pour les phosphoramidites de nucleosides naturels . Le temps de couplage du phosphoramidite de nucleosides modifiés a été prolongé d'une minute. A la fin de la synthèse, une étape de détrytilation supplémentaire est réalisée pour libérer la fonction alcool primaire terminale. La déprotection est réalisée avec une solution d'ammoniaque concentrée à 50°C pendant une nuit. Une extraction à l'acétate d'ethyle permet d'éliminer les composés organiques solubles . Après extraction, la solution aqueuse est récupérée et concentrée puis les produits sont purifiés en HPLC.
Le tableau IV ci-dessous donne le temps de rétention (TR) de quelques oligonycléotides préparés.
Tableau IV
Figure imgf000033_0001
Dans le système (a), les analyses des oligomères par échange d'ions sont réalisées sur un appareil FPLC Pharmacia Fine Chemicals (GP 250 /P 3500) avec une colonne DEAE Waters (Protein-Pak™, DEAE 8HR (10 mm X 100 mm) . Les gradients utilisés sont des gradients en sel (NaCl) : 2 minutes à 0 % en B; de 0 à 30 % en B en 40 minutes; débit : 1 ml/min. A : 25 mM tris, 10 % CH3CN, pH = 8; B :tampon A + 1,5 M NaCl.
Dans le système (b) , les analyses en phase inverses sont réalisées sur un appareil Waters 625 LC System équipé d'un détecteur à photoiode Waters 990 avec une colonne Merck, LichroCart (125 mm X 4 mm) remplies avec Lichrospher 100 RP-18 (5 μm) . Les éluants sont des mélanges eau/acétonitrile à 0,1 M d'acétate de triéthylammonium (TEAA) , pH=7. A contient 5 % en CH3CN et B 80 % en CH3CN. On réalise des gradients en CH3CN : de 0 % à 20 % en B en 20 minutes. Les débits de ces éluants sont de 1ml/minutes.
La présence et les proportions des nucleosides dans les séquences ont été vérifiées par hydrolyse enzymatique par action de 1 ' endonucléase Pi, puis dans une deuxième étape par l'action de la phosphatase alcaline (PA) , selon le protocole suivant : A 1 DO d'oligonucléotide sont ajoutés 50 μl d'une solution de tampon CH3COO"Na+ (0,03 M) pH = 5,33 et de ZnS04 (0,1 M) et 10 μl d'une solution de nucléase Pi . La réaction est laissée au bain-marie pendant 2 heures à 37°C. Le pH de l'hydrolysat est ensuite ajusté à pH 9 avec une solution Tris 1M. Puis 10 μl de phosphatase alcaline sont ajoués au mélange et incubé pendant 2 heures à 37°C. On détruit ensuite l'enzyme par chauffage en faisant bouillir la solution pendant 1 à 2 minutes. Les différents composés formés sont ensuite identifiés et quantifiés par phase inverse avec le gradient suivant : 0 % en B pendant 5 minutes; de 0 % à 9 % en B en 15 minutes. A : 0,1 M TEAA, 2 % CH3CN; B : 0,1 M TEAA, 80 % CH3CN. Débit = 1 ml/min.
A titre d'exemple, l'hydrolyse enzymatique de 1 ' oligonucleotide No. 13 conduite selon le schéma suivant : d5'[CpGpAp4EtCpGpApCpGpA] 3 '
dC + pdG + pdA +pd4EtC + i pd'G + pdA pdC + pdG + pdA i PA
2 dC + 3dG + 3 dA' ( →3dl ) + d4EtC
a abouti à : 2 dC + 3dG + 3 dA + d4EtC, dont le tableau V ci-dessous donne les temps de rétention (TR) de chaque nucléoside (temps de rétention en phase inverse sur colonne Cig) .
Tableau V
Figure imgf000035_0001
La masse des oligucléotides No. 11 à 16 a été vérifiée par spectrométrie de masse par la technique MALDI (Matrix-Assisited Laser Desorption; appareil Lasermat de Finnigan) , en utilisant le dTι2 comme référence et 1 μl d'un mélange constitué. 10 μl d'une solution 0,5 M de 2 , 4, 6-trihydroxy acétophénone dans l'éthanol, 5 μl d'une solution aqueuse 0,1 M de diammonium-L-tartarate et de 1 μl d'une solution aqueuse (10 DO/ml) de l'échantillon à analyser sont déposés sur une cible et les solvants sont éliminés par évaporation.
Selon le même mode opératoire que précédemment, les oligonucléotides figurant dans le tableau VI ci-après ont été préparés en utilisant des phosphoramidites de desoxynucleosides naturels et des phosphoramidites de nucleosides modifiés préparés au laboratoire ou obtenus dans le commerce.
Tableau VI
4Me
5' C G A C G A C G A 3 '
4Et
5' C G A C G A C G A 3 '
4Pro
5' c G A C G A C G A 3 '
4Al lyl
5' c G A C G A c G A 3 '
4Prop argyl
5' c G A C G A c G A 3 ' ara
5' c G A C G A c G A 3 '
4MB 4Me
5' c G A C G A C G A 3'
4Et 4Et
5' c G A C G A C G A 3 '
Pro Pro
5' c G A C G A C G A 3 ' ara ara
5' c G A C G A C G A 3 '
4Et 4Et 4Et
5' A C A A C A A C A 3'
4Me 4Me 4Me
5' T T T C G T C G T C G T T 3 '
4Me 4Mθ 4Me
5' C G A C G A C G A 3 '
4Et 4Et 4Et
5' T T T C G T C G T C G T T 3'
4Et 4Et 4Et
5' C G A C G A C G A 3 '
4Et 4Et 4Et
5' T T T C G T C T T C G T T 3'
5Prop 5Prop 5Prop 5Prop 5Prop 5Prop ynyl e ynyl e ynyle ynyle ynyle ynyle
5' T T U U A U U A U U A T T 3 '
5Prop 5Prop 5Prop ynyl e ynyle ynyle
5' U A A U A A U A A 3 ' 4Me 4Me 4Me 4Me 4Me 4Me
5 ' T T C C h C C A C C A T r 3 •
Tableau VI ( suite)
4Me 4Me 4Me
5 ' C G G C G G C G G 3 '
7C
5 ' C G A C G A C G A 3 '
5 ' C G A C I A C G A 3 '
2Et
5 ' c G A C G A C G A 3 '
2 Pro
5 ' c G A C G A C G A 3 '
2iPro
5 ' c G A C G A C G A 3 '
2iBut yryl
5 ' c G A C G A C G A 3 '
III - Préparation de l ' ADN à analyser .
Les fragments d'acide nucléique à analyser constitués de nucleosides naturels et de nucléoside(s) modifié (s) peuvent être obtenus par la technique d'amplification génétique PCR utilisant un mélange de triphosphates de nucleosides naturels et de nucléoside(s) modifié(s) . Ces composés peuvent être également obtenus en préparant dans une première étape des fragments d'ADN naturel monocaténaire par la technique de PCR asymétrique puis en recopiant dans une seconde étape le fragment d'ADN naturel monocaténaire en séquence complémentaire constitué de nucleosides naturels et de nucléoside(s) modifié(s) en utilisant un mélange de triphosphate de desoxynucleosides naturels et de nucléoside(s) modifié(s) et d'ADN polymérase.
Les desoxynucleosides modifiés 5 ' triphosphates peuvent être préparés à partir des desoxynucleosides modifiés en deux étapes comme pour les désosxynucléosides triphosphates naturels. La première étape concerne la préparation des desoxynucleosides modifiés 5' monosphates par réaction des nucleosides modifiés avec 1 ' oxychlorure de phosphore dans du trialkyphosphate (M. Yoshikawa, T. Kato and T. Takenishi, Tetrahedron Lett. , 1967, 5065-5068) . La deuxième étape concerne l' activation du 5' -phosphate par réaction avec le carbonyldiimidazole puis couplage de l'intermédiaire activé avec le sel de tributylammonium du pyrophosphate selon D.E. Hoard et D.G. Ott (J. Amer. Chem. Soc. 1965, 87, 1785-1788) .
Dans le cas des dérivés de la N-4- alkyldésoxycytidine, les triphosphates peuvent être obtenus à partir de la désoxycytidine triphosphate par transamination en présence d ' alky lamine et de bisulfite (P. S. Miller and C. D. Cushman, 1992 Bioconjugate Chem. , 3, 74-79) .
IV - Propriété" d ' hybridation des oligonucléotides modifiés comportant une désoxycytidine modifiée (dC*1 avec des séquences d'ADN naurel .
Les études d'hybridation ont été réalisées avec un spectromètre d'absorption KONTRON UVIKON cell changer 941 à 260 nm.
Les mesures de la température de demi transition Tm de la série des nonanucléotides naturels et modifiés avec des tridécadésoxynucléotides naturels ont été effectuées avec des solutions à 2.10"^ M en oligonucléotides dans un tampon cacodylate de sodium 10-2 M à pH 7 et contenant de 1 ' EDTA 2. 10-4 M et du chlorure de sodium 1 M. La montée en température s'effectue de 0°C à 60°C à raison de 0,5°C par minute.
Ces conditions seront identiques pour les exemples des figures 1 à 12 ainsi que pour la figure 13 en partie.
Les figures 1 et 2 indiquent les Tm des à doubles brins formés entre des tridécadésoxynucléotides naturels et des nonadésoxynucléotides naturels d'une part et des nonadesoxynucleotides comportant une désoxycytidine modifiée dC* d'autre part.
Les valeurs de Tm de la figure 1 montrent que pour les doubles brins constitués de nucléotides naturels, la stabilité des hybrides varie fortement avec la composition en base. Ainsi le remplacement de la paire A-T en position 4 du double brin 1 (Tm = 46,1'C) par une paire G-C conduit à une augmentation du Tm de + 5,2 *C (double brin 2, Tm = 51, 3 'C) ; par contre le remplacement de cette même paire A-T par une paire G-C* (en particulier pour C* = N-éthyl-dC) permet d'obtenir des hybrides ayant une stabilité équivalente [C* = N-4- éthyldésoxycytidine, duplex 4 (Tm = 47,2*C)] à celle du duplex 1. Cette propriété d'hybridation de la paire
G_G4Et est maintenue lorsque celle-ci est introduite à la place de la paire A-T en positions 4 et 7 du double brin 9 (figure 2; duplex 9, Tm = 41,1"C; duplex 11, Tm = 41,7*C) . Comme attendu, le remplacement de la paire A-T par la paire G-C (figure 2) en positions 4 et 7 conduit à une augmentation du Tm de l'ordre de 10'C.
Pour montrer que la formation des duplex comportant la paire G-C* est spécifique, les études d'hybridation des nonamères modifiés 3'AGCAGC*AGC5' avec les séquences d'ADN 5 ' dTTTCG TCA_TCGTT 3 ' , 5'dTTTCGTCÇ_TCGTT3 ' , 5'dTTTCGTCT_TCGTT3 ' ont été également réalisées . Les résultats donnés par les figures 3 , 4 et 5 montrent que la déstabilisation due aux mesappariements A-C* (duplex 15 à 20 de la figure 3), C- C* (duplex 22 à 27 de la figure 4) et T-C* (duplex 29 à
34 de la figure 5) (pour dC* = N-4-méthyldésoxycytidine,
N-4-éthyldésoxycytidine et 1-b-D-arabinofuranosyl- cytosine) est équivalente à celle des mesappariements
A-C (duplex 14), C-C (duplex 21) et T-C (duplex 28) . — J o —
V - Propriété d'hybridation de doubles brins constitués des paires de bases A-T et G-C4alkvle.
Les études ont été réalisées sur deux types de séquences.
Dans le premier type de séquence les cytosines qui sont toutes situées sur le même brin sont remplacées par la N-éthyldésoxycytosine. Les résultats de la figure 6 montrent que le remplacement de 3 paires
A-T du duplex 35 (Tm = 20'C) par trois paires G-C4Et conduit au duplex 37 possédant un Tm peu différent
(duplex 37, Tm = 27,4'C) par contre la substitution des mêmes paires A-T du duplex 35 par les paires G-C produit comme attendu à une augmentation de l'ordre de 21 'C.
D'autre part la formation du double brin 37 est spécifique, car on observe une diminution de Tm de plus de 17*C lorsqu'il y a un mésappariement τ-C4Et (duplex
38) ou C-C4Et (duplex 39) ou A-C4Et (duplex 40) . Dans le deuxième type de séquence les cytosines situées sur les deux brins sont remplacées par la N-4-méthylcytosine (duplex 42, figure 7) ou la N-4- éthylcytosine (duplex 43).
Les résultats donnés par la figure 7 montrent que lorsque les 6 paires A-T du duplex 41 (Tm = 18,7"C) sont remplacées par 6 paires G-C (duplex 2, Tm = 51, 3 "C) la variation de Tm est très importante (+32, 6*C) ; dans les mêmes conditions, l'utilisation de la paire de base G-C* telle que G-C4Et permet d'obtenir par exemple le duplex 43 dont la stabilité est peu différente de celle du duplex 41.
Ces résultats permettent les remarques suivantes :
Lorsque les séquences nonadésoxy- nucléotides par exemple sont immobilisées sur le même support solide, il n'est pas possible de former en même temps des hybrides spécifiques tels que les duplex 2 et 41 sans formation des hybrides avec mésappariement tels que les duplex 14, 21 et 28 qui possèdent des Tm plus élevés que celui du duplex 41. - l'utilisation des duplexes constitués des paires de bases A-T et G-CNEt permet d'obtenir des hybrides spécifiques tels que les duplex 41 et 43, en effet le duplex 44 par exemple qui dérive du duplex 43 avec cependant un mésappariement τ-CNEt est très peu stable (Tm < 10'C) .
VI - Propriété d'hybridation de double brin comportant des paires de bases A-U5Pr°Pynyle et/ou Ç_ç4Met _
Les propriétés d'hybridation des duplex 46 et 47 constitués respectivement de 9 paires A_τj5Propynyle et 9 paires G-C4Met ont été étudiées et comparées avec celles des duplex non modifiés correspondants 41 et 45 (figure 8) .
Les résultats obtenus montrent que le duplex 46 qui comporte 9 paires de bases A-U5ProPYnYle possède un Tm équivalent (duplex 46, Tm = 31,2'C) à celui du duplex 47 (Tm = 33, 3 "C) comportant 9 paires G-CN4Met, par contre les duplex 41 et 45 de même longueur et constitués respectivement des paires de bases A-T et G-C donnent des Tm très différents (duplex 41, Tm = 18, 7 'c; duplex 45, Tm = 63,4'C) .
D'autre part, on remarque que les Tm des duplex modifiés 46 et 47 sont situés entre ceux des duplex naturels 41 et 47. On remarque aussi que
1 ' appariement de la paire A-U5ProPynvle est spécifique
(duplex 48, Tm = 26,1'C) car un mésappariement c_Tj5Propynyle (duplex 49) OU G-U5ProPynyle (duplex 50) OU τ_u5Propynyle (duplex 51) conduit à une déstabilisation importante . VII - P rop r i é t é d ' hvb r i da t i on ri e s o ligonuc léot ides dont le s dé s oxyσuanos ine s sont. part ie l lement remplacées par les désoxvσuanos ines modifiées .
La figure 9 donne les Tm des doubles brins formés entre un tridécadésoxynucléotides et des nonadesoxynucleotides comportant une désoxyguanosine modifiée dG* . Les résultats obtenus montrent que le remplacement d'une paire de base naturelle C-G par une paire de base C-G* a un effet sur la stabilité thermique des complexes d'hybridation. Parmis les désoxyguanosines modifiées utilisées, les dérivés subtitués sur le groupe amino en position 2 permettent de moduler la stabilité des hybrides. Ainsi la stabilité des duplex contenant la paire de bases c-G2alkyle diminue lorsque 1 'encombrement stérique du subtituant augmente (duplex 55, 56, 57, 58) . De plus le duplex 58 comportant la paire C-G2iPr a une stabilité thermique voisine de celle du duplex 52 renfermant la paire T-A à la même position.
D'autre part 1 'appariement des paires de bases C-G* étudiées est spécifique (sauf pour C-I) ; en effet un mésappariement A-G* (figure 10) ou T-G* (figure 11) ou G-G* (figure 12) conduit à une déstabilisation importante comme dans le cas de mésappariement A-G ou T- G ou G-G.
Les résultats obtenus dans cet exemple et dans les exemples IV et V montrent qu'il est possible d'utiliser des oligonucléotides modifiés constitués de T, de dA, de dC4Et et de dG2alkyle pour former avec des séquences d'acides nucléiques naturels complémentaires des hybrides dont la stabilité dépend peu de la composition en bases . VIII - Formation de double brin par l'utilisation des paires de bases A-U^opy^1 e et/ou G-C en présence de chlorure de tetramethylammonium.
La stabilité thermique des duplex 41, 45 et
46 comportant 9 paires de bases et constitués respectivement des paires de bases A-T, G-C et A-τj5ProPynyle a été étudiée dans un milieu renfermant 1 M NaCl ou du chlorure de tetramethylammonium TMACl de concentration variable. Les résultats données dans la figure 13 montrent que pour un milieu donné le Tm du duplex 41 constitué de 9 paires de base A-T est inférieur à celui du duplex 45 formé avec 9 paires G-C. Par contre en présence de 3,5 M TMACl la stabilité thermique du duplex 46 (Tm = 50,9"C) formé avec 9 paires de bases A-U5Pr°Pynyle est équivalente à celle du duplex 45 (Tm = 51, 8 "C) . Dans la figure 13, les Tm marqués d'une "*" correspondent à des conditions expérimentales identiques à celles des expériences précédentes rapportées dans les figures 1 à 12 , les Tm marquée de
"**" correspondent aux conditions expérimentales suivantes : 2. 10-6 M en oligonucléotides dans le tampon tris HC1 50. 10"3 M à pH 8 et contenant de 1 ' EDTA 2.10-3 M et du chlorure de tetramethylammonium de concentration variable (2 ; 3 ; 3,5 et 4,4 M) .
On observe aussi que 1 ' appariement de la paire A-U5Pr°Pynyle est spécifique dans une solution de 3,5 M TMACl (duplex 48, Tm = 42, 6 "C) car les mésappariement c-U5Pr°Pynyle (duplex 49, Tm = 18,8'C) ou G-U5Pr°Pynyle (duplex 50, Tm = 25.7 'C) ou τ-u5Pr°pynyle
(duplex 51, Tm = 25,7'C) conduit à une déstabilisation importante .
Ces résultats permettent d'utiliser des paires de base G-C et A-U5Pr°Pynyle pour former des duplex dont la stabilité est d'une part élevée et d'autre part dépend peu de la composition en bases. Ces exemples, qui ne sont pas limitatifs, montrent d'une part que les oligonucléotides comportant au moins une base modifiée selon l'invention forment des hybrides spécifiques avec les séquences nucléiques complémentaires, et d'autre part que la stabilité des hybrides formés dépend peu de la composition en base de chaque brin des hybrides. En outre, le procédé de l'invention permet de mieux discriminer les hybrides parfaits des hybrides avec mésappariement, lorsque plusieurs sondes nucléiques sont utilisées en même temps et dans des conditions de température et de milieu déterminées

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en bases des deux molécules d'acide nucléique hybridées, consistant à mettre en contact une première molécule d'acide nucléique avec une seconde molécule d'acide nucléique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, caractérisé en ce que l'un au moins des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et/ou de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un au moins des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée et en ce que l'ensemble des paires de bases entrant dans la composition dudit complexe présente une stabilité voisine.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le même type de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace.
3 ) Procédé selon la revendication 2 , caractérisé en ce que l'un des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée.
4) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que deux des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d' appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que les deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée.
5) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que deux au moins des quatres types de base entrant dans l'une seulement des première et seconde molécules d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d' appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que l'un au moins des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne des bases modifiées.
6) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique caractérisé en ce que l'on réalise un complexe d'hybridation conformément au procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 5, dans lequel la première molécule d'acide nucléique constitue ou comprend la séquence à analyser et la seconde molécule d'acide nucléique est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, puis en ce que l'on analyse le complexe d'hybridation par tout moyen approprié.
7) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique caractérisé en ce que l'on réalise un complexe d'hybridation conformément au procédé selon la revendication 3, dans lequel :
- la première molécule d'acide nucléique a été préparée par tout processus chimique ou biologique de copie de tout ou partie de la séquence à analyser, ledit processus mettant en oeuvre un nucléoside modifié de façon à remplacer l'un desdits quatre types de bases entrant dans la composition de ladite séquence par une base modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, et
- la seconde molécule d'acide nucléique est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, puis en ce que l'on analyse le complexe d'hybridation par tout moyen approprié.
8) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique caractérisé en ce que l'on réalise un complexe d'hybridation conformément au procédé selon la revendication 4, dans lequel :
- la première molécule d'acide nucléique a été préparée par tout processus chimique ou biologique de copie de tout ou partie de la séquence à analyser, ledit processus mettant en oeuvre deux nucleosides modifiés de façon à remplacer deux des quatre types de bases entrant dans la composition de ladite séquence par deux bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des base naturelles qu'elles remplacent, et
- la seconde molécule d'acide nucléique est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, puis en ce que l'on analyse le complexe d'hybridation par tout moyen approprié. 9) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que la sonde nucléique a été préparée par tout processus chimique ou biologique mettant en oeuvre au moins un type de nucleosides modifiés de façon à obtenir une sonde dont la séquence comprend au moins une base modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace.
10) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon la revendication 9, caractérisé en ce que la sonde nucléique est un oligonucleotide comprenant de 4 à 30 nucleosides.
11) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxycytidine modifiée répondant à la formule suivante :
Figure imgf000048_0001
HO R, (I) dans laquelle R représente un atome d ' hydrogène , un groupe alkyle en Ci à C5 , un groupe allyle ou propargyle , Ri représente un atome d ' hydrogène ou un groupe -OH, et X est un atome d ' azote ou un groupe -CH- , ladite désoxycyt idine modif iée possédant des propriétés d ' appariement voisines de celles de la désoxycytidine naturelle qu ' elle remplace . 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la cytidine modifiée de formule
(I) est choisie parmi : la N-4-méthyl-2 ' -désoxycytidine, la N-4-éthyl-2 ' -désoxycytidine , la N-4-propyl-2 ' - désoxycytidine, la N-4-allyl-2 ' -désoxycytidine, la N-4- propargyl-2 ' -désoxycytidine, la 1-β-D-arabinofuranosyl- cytosine, la 6-azadésoxycytidine .
13) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications
1 à 5, ou d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyguanosine modifiée répondant à la formule suivante :
Figure imgf000049_0001
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C5, un groupe allyle ou propargyle, Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R2 représente un atome d'hydrogène ou un atome de brome, et X est un atome de d'azote ou un groupe -CH-, ladite guanosine modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la désoxyguanosine naturelle qu'elle remplace.
14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la guanosine modifiée de formule
(II) est choisie parmi : la N-2-méthyldésoxyguanosine, la N-2-propyldésoxyguanosine, la N-2-isopropyldésoxy- guanosine, la N-2-éthyldésoxyguanosine , la 7- déazadésoxyguanosine, la 8-bromo-désoxyguanosine .
15) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une desoxyuridine modifiée répondant à la formule suivante :
Figure imgf000050_0001
dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R représente un groupe de formule - C ≈ CH, ou - C ≡ C - CH3, ladite desoxyuridine modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la thymidine naturelle qu'elle remplace.
16) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la desoxyuridine modifiée de formule (III) est choisie parmi : la 5- éthynyldésoxyuridine, la 5-propynyldésoxyuridine.
17) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que l'un des types de base entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyadénosine modifiée répondant à la formule suivante :
Figure imgf000051_0001
dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R représente un atome d'hydrogène ou un groupe NH2 , X est choisi parmi un atome d'azote, les groupes de formule : C - Br, C - Cl, C - C ≡ CH, C - C ≡ C - CH3 , ladite désoxyadénosine modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la désoxyadénosine naturelle qu'elle remplace.
18) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la désoxyadénosine modifiée de formule (III) est choisie parmi : l'amino-2- désoxyadénosine, la 7-déaza-7-bromodésoxyadénosine, la 7 -déaza-7 -propynyldésoxyadénosine , 1 ' amino-2 -7 -déaza-7 - bromodésoxyadénosine , 1 ' amino-2 -7 -déaza-7 -propynyl¬ désoxyadénosine .
19) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que les première et seconde molécules d'acide nucléique sont de type désoxyribonucléique.
20) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 19 pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle.
21) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 20, caractérisé en ce que la mise en contact des première et seconde molécules d'acide nucléique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, est effectuée en présence de chlorure de tetramethylammonium ou d'halogénure de triméthylammonium.
22) Complexe d'hybridation formé de deux molécules d'acide nucléique complémentaires, ou sensiblement complémentaire, dont la stabilité dépend peu de la composition en bases des deux molécules d'acide nucléique hybridees, caractérisé en ce que l'un au moins des types de paire de base entrant dans la composition dudit complexe comprend au moins une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'ensemble des paires de bases entrant dans la composition dudit complexe présente une stabilité voisine.
23) Complexe d'hybridation selon la revendication 22, caractérisé en ce que le même type de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d' appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace.
24) Complexe d'hybridation selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'un des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée.
25) Complexe d'hybridation selon la revendication 23, caractérisé en ce que deux des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que les deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprennent une base modifiée.
26) Complexe d'hybridation selon la revendication 22, caractérisé en ce que deux des quatres types de base entrant dans 1 'une seulement des première et seconde molécules d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d' appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne des bases modifiées.
27) Complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 22 à 26, caractérisé en ce que la première ou la seconde molécule d'acide nucléique est une sonde oligonucléotidique.
28) Complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxycytidine modifiée définie à l'une des revendications 11 et 12.
29) Complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyguanosine modifiée définie à l'une des revendications 13 et 14.
30) Complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une desoxyuridine modifiée définie à l'une des revendications 15 et 16.
31) Complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyadénosine modifiée définie à l'une des revendications 17 et 18.
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