JPS59112973A - テトラゾリウム塩化合物およびその化合物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法 - Google Patents
テトラゾリウム塩化合物およびその化合物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法Info
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- JPS59112973A JPS59112973A JP21224483A JP21224483A JPS59112973A JP S59112973 A JPS59112973 A JP S59112973A JP 21224483 A JP21224483 A JP 21224483A JP 21224483 A JP21224483 A JP 21224483A JP S59112973 A JPS59112973 A JP S59112973A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なテトラゾリウム塩化合物およびその化合
物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法に関し、四に詳
しくは一般式 で表わされるテトラゾリウム塩化合物およびその化合物
を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法に関する。たたし
式中の記号の意味はつぎのようである。
物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法に関し、四に詳
しくは一般式 で表わされるテトラゾリウム塩化合物およびその化合物
を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法に関する。たたし
式中の記号の意味はつぎのようである。
Ｙ：炭素数２〜４の直鎖式、または０Ｉ１１鎖を有して
も良く、さらに必要に応じ１個の水酸基を有してもよい
アルキレン基。
も良く、さらに必要に応じ１個の水酸基を有してもよい
アルキレン基。
ｌｔｌ：炭素数１〜４のアルキル基、甘たはヒドロキシ
エチル基。
エチル基。
Ｒ１：炭素数１〜４で、必要に応じ１〜２個の水酸基ま
たは１個のフェニル基を有しても良いアルキル基。
たは１個のフェニル基を有しても良いアルキル基。
Ｘ：塩素原子、−１：たけ臭素原子。
Ｗ：ニトロ基。
Ｚ：４−玉一ドフェニ）ｖ基。
１
なお、−０Ｙ−Ｎ−Ｒ’ のベンセン環における置換
位置は３位。
位置は３位。
ニジ
または４位である。
本発明に係わる上述一般式（１）ヲ有する化合物は文献
未載の新規物質であり、水素を受容してホルマザンを生
ずるため脱水素酵素の定量に用いることかできるという
大きな特色がある。すなわち従来のテトラゾリウム塩化
合物が脱水素酵素の定量のために用いられていたが、こ
れが速元されて生じるホルマザンは、非水浴性のため実
用上かなり不便であった。
未載の新規物質であり、水素を受容してホルマザンを生
ずるため脱水素酵素の定量に用いることかできるという
大きな特色がある。すなわち従来のテトラゾリウム塩化
合物が脱水素酵素の定量のために用いられていたが、こ
れが速元されて生じるホルマザンは、非水浴性のため実
用上かなり不便であった。
ところで、今日ではホルマザン生成反応を利用した呪水
素酸素定幇は広く普及し、！ｌ′ｉ′ｆに臨床検査の分
野では障めて繁用される様になり、そのため現実には自
動分析器を用いて（つ定量操作を行う機会か増してきて
いる。ところがその際に公知のテトラゾリウム塩を用い
た場合は、操作中に生ずるホルマザンが水に不溶のため
、これが分析器のチューブ内壁専に付着したり沈着した
りするため検査の自動化に大きな支障となっている。こ
のような欠点を解消するためには、水にｌＪＪ浴性のホ
ルマザンを作ることが先決である。本発明はこの問題の
解決に成功し７たものである。以下に９本発明化合物の
様に水素を受容して生じるホルマザンか水浴性である牛
が臨床（τＲ査上いかに有用であるかを今少し詳しく説
明する。
素酸素定幇は広く普及し、！ｌ′ｉ′ｆに臨床検査の分
野では障めて繁用される様になり、そのため現実には自
動分析器を用いて（つ定量操作を行う機会か増してきて
いる。ところがその際に公知のテトラゾリウム塩を用い
た場合は、操作中に生ずるホルマザンが水に不溶のため
、これが分析器のチューブ内壁専に付着したり沈着した
りするため検査の自動化に大きな支障となっている。こ
のような欠点を解消するためには、水にｌＪＪ浴性のホ
ルマザンを作ることが先決である。本発明はこの問題の
解決に成功し７たものである。以下に９本発明化合物の
様に水素を受容して生じるホルマザンか水浴性である牛
が臨床（τＲ査上いかに有用であるかを今少し詳しく説
明する。
脱水素酵素、たとえば乳酸脱水素酵素（以−１”［１，
，１ツＨ１と略記する。）、アルコ−７し脱水素酵素、
グルタミン１投脱水素醇素等は、これまでテトラゾリウ
ム塩化合物を用いて定１１λ分析が行われてきた、すな
わちテトラゾリウム塩化合物は、これら各槙脱水素酵素
の作用により遊離した水素を中間７１Ｌ子運搬体を介し
て受容することによりホルマザンを生成する。そして、
ここに生成したホルマザンの吸光度を測定することによ
り脱水素酵素が定量できるのである。ところで、これら
の脱水素酵素のうちＬＤＨはすべての体雌胞に分布し特
に・Ｕ筋。
，１ツＨ１と略記する。）、アルコ−７し脱水素酵素、
グルタミン１投脱水素醇素等は、これまでテトラゾリウ
ム塩化合物を用いて定１１λ分析が行われてきた、すな
わちテトラゾリウム塩化合物は、これら各槙脱水素酵素
の作用により遊離した水素を中間７１Ｌ子運搬体を介し
て受容することによりホルマザンを生成する。そして、
ここに生成したホルマザンの吸光度を測定することによ
り脱水素酵素が定量できるのである。ところで、これら
の脱水素酵素のうちＬＤＨはすべての体雌胞に分布し特
に・Ｕ筋。
肝臓、骨格筋、腎臓等に多く存在し、かつ・Ｕ筋梗塞、
豊性腫瘍、肝疾患、進行性Ａｌｊ委縮、 Ｉｔ’ｌｌ管
内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には血清ＬＤ
Ｈ活性が著しく上昇することが知られている。従って血
中のＬＤＨ活性を測定することにより臨床上、上記疾患
の診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる
。
豊性腫瘍、肝疾患、進行性Ａｌｊ委縮、 Ｉｔ’ｌｌ管
内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には血清ＬＤ
Ｈ活性が著しく上昇することが知られている。従って血
中のＬＤＨ活性を測定することにより臨床上、上記疾患
の診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる
。
従来は上述の様にテトラゾリウム塩化合物、たとえば３
．３′二（３，３’−シフ１−キシ−４，４′−ビフエ
ニリレン）−ビス〔２−（４−ニトロフェニ／Ｉ／）
−５−フェニ／Ｖ−２Ｈテトラゾリウム塩化合物１〕（
以下［ニトロＴＢＩと略記する。）などがこの目的のだ
めの水素受容体として一般に用いられている。しかしな
がらこのニトロＴＢが水素を受容して生じるホルマザン
は水に全く溶けず、これは実用上いろんな１もｊ萌かあ
った。
．３′二（３，３’−シフ１−キシ−４，４′−ビフエ
ニリレン）−ビス〔２−（４−ニトロフェニ／Ｉ／）
−５−フェニ／Ｖ−２Ｈテトラゾリウム塩化合物１〕（
以下［ニトロＴＢＩと略記する。）などがこの目的のだ
めの水素受容体として一般に用いられている。しかしな
がらこのニトロＴＢが水素を受容して生じるホルマザン
は水に全く溶けず、これは実用上いろんな１もｊ萌かあ
った。
特に自動分析法の普及に伴い、オートアナフィサーが繁
用されているが、その場合生成ホルマザンが分析器のチ
ューブ等へ沈着し、１Ｍ後の操作に支障を及はすことは
致命的な欠点であった。そのため現在では界面活性剤等
の分散剤を用いて該不漏性ホルマザンを分散させた上で
吸光光度定量しているが。
用されているが、その場合生成ホルマザンが分析器のチ
ューブ等へ沈着し、１Ｍ後の操作に支障を及はすことは
致命的な欠点であった。そのため現在では界面活性剤等
の分散剤を用いて該不漏性ホルマザンを分散させた上で
吸光光度定量しているが。
これは単に操作を繁雑化するのみにとどまらず、測定値
に誤差を生じさせる原因ともなり極めて好ましからぬこ
とであった。
に誤差を生じさせる原因ともなり極めて好ましからぬこ
とであった。
これらの欠点を除去するためには、生成ホルマザンか水
に溶は易い化合物を使用する必要がある。その目的のた
めには。
に溶は易い化合物を使用する必要がある。その目的のた
めには。
たとえ１ｄ３−（４−ヨードフェニ／ｌ／）−２−（４
−二トロフェ−１−／Ｖ）−５−フェニ／Ｉ／−２Ｈテ
トラゾリウム塩化合物のような、生成ホルマザンの水浴
性を若干上昇させた化合物も用いられているが、吸光光
度測定の目的のためには、該ホルマザンにおいてもなお
水溶性が小さすぎ実用上ン゛両足すべきものではない。
−二トロフェ−１−／Ｖ）−５−フェニ／Ｉ／−２Ｈテ
トラゾリウム塩化合物のような、生成ホルマザンの水浴
性を若干上昇させた化合物も用いられているが、吸光光
度測定の目的のためには、該ホルマザンにおいてもなお
水溶性が小さすぎ実用上ン゛両足すべきものではない。
本発明者らは、溶解性が良く安定した測定値を与えるホ
ルマザンを生じさせる化合物ＩＩこついて種々の研究を
ｑｆ′＋２だ結果。
ルマザンを生じさせる化合物ＩＩこついて種々の研究を
ｑｆ′＋２だ結果。
前記一般式中を有する化合物が水溶性の優れた水素受答
体であることを見いだして本発明を完成した。
体であることを見いだして本発明を完成した。
従来においても、化合物の水浴性化法についてはいろい
ろと検討されており、中でもメ／Ｌ／オン酸基の導入に
よる水浴性の向上はある桿度拭みられている、し、かし
このようなスルホン酸誘導体は精製が困難である牛や、
テトラゾリウム塩の状態ではむしろ水溶性が低下するな
どの問題点があった。これに対し、４級アンモニウム塩
を側頓に持つ本発明化合物は。
ろと検討されており、中でもメ／Ｌ／オン酸基の導入に
よる水浴性の向上はある桿度拭みられている、し、かし
このようなスルホン酸誘導体は精製が困難である牛や、
テトラゾリウム塩の状態ではむしろ水溶性が低下するな
どの問題点があった。これに対し、４級アンモニウム塩
を側頓に持つ本発明化合物は。
これから生じるホルマザンが水浴性ににむといつ極めて
有利な特徴を有するため、この化合物を用いることによ
って自動分析装置への付着や沈殿のむ配がなく、安定し
た測定値か得られる定値方法か確立されたのである。
有利な特徴を有するため、この化合物を用いることによ
って自動分析装置への付着や沈殿のむ配がなく、安定し
た測定値か得られる定値方法か確立されたのである。
本発明に係わる前記一般式（１）を有する化合物は常法
により製造することができる。例をあけると、３（また
は４）−ヒドロキシベンズアルデヒドに塩基性下でエピ
クロルヒドリン。
により製造することができる。例をあけると、３（また
は４）−ヒドロキシベンズアルデヒドに塩基性下でエピ
クロルヒドリン。
または炭素数が２ないし４のジハロゲン化アルキルせ，
対応する３（または４）−アｌレコキシベンスアルデヒ
ド類をまず合成する。なお、オキシラン環を有するアル
コキシベンズアルデヒド化合物の場合は，水冷下で塩酸
，臭素酸と反応させハロヒドリン化合物としても艮い。
対応する３（または４）−アｌレコキシベンスアルデヒ
ド類をまず合成する。なお、オキシラン環を有するアル
コキシベンズアルデヒド化合物の場合は，水冷下で塩酸
，臭素酸と反応させハロヒドリン化合物としても艮い。
さて、ここで得られたアルコキシベンヌ゛アルデヒド類
は，次いでこれにフェニルヒドラジン類を作用させ，対
応するヒドラゾン化合物とする。このうちオキシラン環
を有するヒドラゾン化合物は。
は，次いでこれにフェニルヒドラジン類を作用させ，対
応するヒドラゾン化合物とする。このうちオキシラン環
を有するヒドラゾン化合物は。
ジアルキルアミンと反応させ側鎖に３級アミンを有する
ヒドラゾン化合物とする。また側鎖にハロゲンを有する
ヒドラゾン化合物はジアルキルアミンと反応をせても良
い。
ヒドラゾン化合物とする。また側鎖にハロゲンを有する
ヒドラゾン化合物はジアルキルアミンと反応をせても良
い。
次いで．ヒドラゾン化合物に’ｘ基性下で，４−ヨート
ヘンセンシアソ゛ニウム塩のジアソ゛ニウム塩とカッツ
ブりング反応を行いホルマザンとした後．側鎖に３級ア
ミンを有するホルマザンはハロゲン化アルキルと，捷だ
側鎖にハロゲンｉ＝Ｍつホルマザンは３級アミンと反応
させ，対応する４級アンモニウ塩化合物を合成する。次
いで．このような４級アンモニウム塩を側鎖に有するホ
ルマザンを亜硝酸ｎ−ブチル、Ｎ−プロムフハク酸イミ
ド（以下「ＮＢｓＪと略記する。）等の酸化剤を用いて
酸化し，目的とするテトラゾリウム塩化合物を得る。
ヘンセンシアソ゛ニウム塩のジアソ゛ニウム塩とカッツ
ブりング反応を行いホルマザンとした後．側鎖に３級ア
ミンを有するホルマザンはハロゲン化アルキルと，捷だ
側鎖にハロゲンｉ＝Ｍつホルマザンは３級アミンと反応
させ，対応する４級アンモニウ塩化合物を合成する。次
いで．このような４級アンモニウム塩を側鎖に有するホ
ルマザンを亜硝酸ｎ−ブチル、Ｎ−プロムフハク酸イミ
ド（以下「ＮＢｓＪと略記する。）等の酸化剤を用いて
酸化し，目的とするテトラゾリウム塩化合物を得る。
これらの詳＃ｌは実施例においてさらに具体的にのべる
。
。
次に，このようにして得らノ′また一般式（１）ヲ有す
る化合物ケ用いる脱水素酵素の吸光光度定量法につき説
明する。すなわち、脱水素酵素をリン酸緩衝液などの中
で該酵素に対応する基質と接触させる。ここで生成する
水素は一旦ニコチンアミドアデニンシヌクレオチＦ（以
下ＪＮＡＤｊと略ｍｌする、）に受答され，次いでシア
フォラーセやフェナジンメトザルフェート（以下［）’
ＭＳＪと略記する。）などの中間″ｒＪｊｌ子７ｆｌ囁
９体に介して，本発明のデトラゾリウｌ−塩化合物に水
素か受容され。
る化合物ケ用いる脱水素酵素の吸光光度定量法につき説
明する。すなわち、脱水素酵素をリン酸緩衝液などの中
で該酵素に対応する基質と接触させる。ここで生成する
水素は一旦ニコチンアミドアデニンシヌクレオチＦ（以
下ＪＮＡＤｊと略ｍｌする、）に受答され，次いでシア
フォラーセやフェナジンメトザルフェート（以下［）’
ＭＳＪと略記する。）などの中間″ｒＪｊｌ子７ｆｌ囁
９体に介して，本発明のデトラゾリウｌ−塩化合物に水
素か受容され。
ここにおいて従来のホルマザンには認められ〃い，Ｈ：
、＋ｉ度の水溶性をもったホルマザンを生成する。その
ため、牛した反応溶液の吸光度ヲ閑接測定することのみ
によって，正確に目的酵素の活性値を定量することがで
きる。
、＋ｉ度の水溶性をもったホルマザンを生成する。その
ため、牛した反応溶液の吸光度ヲ閑接測定することのみ
によって，正確に目的酵素の活性値を定量することがで
きる。
なお、一般式（１）においてＹ， Ｒ’， １１’及び
Ｘが既定義のものと同一であり，Ｗが水素原子であり，
２がヨードフェニル基又はシメチ）Ｖ−２−チアゾリル
基であるよう々化合物：Ｙ。
Ｘが既定義のものと同一であり，Ｗが水素原子であり，
２がヨードフェニル基又はシメチ）Ｖ−２−チアゾリル
基であるよう々化合物：Ｙ。
Ｒ’， Ｒ２， Ｘ及びＷが既定義のものと同一であり
２がジメチル−２−チアゾＩＪ ）し基であるような化
合物は何れも本発明におけるような方法で製造すること
ができ，かつそこに得られたものは本発明化合物と同様
な作用効果を奏することが予測される。
２がジメチル−２−チアゾＩＪ ）し基であるような化
合物は何れも本発明におけるような方法で製造すること
ができ，かつそこに得られたものは本発明化合物と同様
な作用効果を奏することが予測される。
以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが
。
。
本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に制約さ
れるものではない。
れるものではない。
実施例１（一般式（１１においてＹが２−ヒドロキシプ
ロピレン、 Ｒ１かエチル基 Ｗが２−ヒドロキシエチ
ル基，Ｘが塩素原子，Ｗがニトロ基，２が４−ヨードフ
ェニル基で，置換アルコキシ基がベンゼン環の４位に置
換した化合物の合成法。）４−ヒドロキシベンズアルデ
ヒド］１４ｙとエピクロルヒドリン１７（１’ｉテトラ
ヒドロフランに溶かし，これに水酸化ナトリウに浴液を
加え熱還流させた後減圧蒸留して，４−オキシランメト
キシベンズアルデヒド１ ０ ０ １１′ｆｃ得る。次
に。
ロピレン、 Ｒ１かエチル基 Ｗが２−ヒドロキシエチ
ル基，Ｘが塩素原子，Ｗがニトロ基，２が４−ヨードフ
ェニル基で，置換アルコキシ基がベンゼン環の４位に置
換した化合物の合成法。）４−ヒドロキシベンズアルデ
ヒド］１４ｙとエピクロルヒドリン１７（１’ｉテトラ
ヒドロフランに溶かし，これに水酸化ナトリウに浴液を
加え熱還流させた後減圧蒸留して，４−オキシランメト
キシベンズアルデヒド１ ０ ０ １１′ｆｃ得る。次
に。
この４−オキシランメトキシベンズアルデヒド５０ｇと
４−二トロフェニルヒドラジン４３ｇをメタノール中で
加１ｍｌ昆合し，４−オキシランメトキシベンズアルデ
ヒド−４−二トロフェニルヒドヲゾン８５ｇを合成する
。このヒドラゾン４０ｙをメタノールに分散させ攪拌し
なからジエチルアミン３０ｇを加え加温後減圧濃鰯し、
４−（２−ヒドロキシ−３−ジエチルアミノプロポキシ
）ペン７′アルテヒド−４−ニトロフェニルヒドラゾン
４（ｌを得る。得られたヒドラゾン１８ｇをテトラヒド
ロフランに溶かし、これに水酸化カリウム浴液を加え冷
却しなから４−ヨードアニリン１０．５ ｇと塩酸、亜
硝酸ナトリウムを用いて合成した４−ヨードベンセンジ
アゾニウム塩酸塩の水溶液を徐々に滴下し、２時間（パ
〃拝する。反応溶液に水を加えて濾過し、３−（４−ヨ
ードフェニ）ｖ ） −２−（４−ニトロフェニル）−
５−（４−（２−ヒドロキシ−３−ジエチルアミノプロ
ポキシ）フェニル〕ホルマザン１５５ｇを得る。得られ
たホルマザン１２ｇ’（ｚエチレンクロルヒドリンとテ
トラヒドロフランの混合溶媒に俗かし加熱還流する。
４−二トロフェニルヒドラジン４３ｇをメタノール中で
加１ｍｌ昆合し，４−オキシランメトキシベンズアルデ
ヒド−４−二トロフェニルヒドヲゾン８５ｇを合成する
。このヒドラゾン４０ｙをメタノールに分散させ攪拌し
なからジエチルアミン３０ｇを加え加温後減圧濃鰯し、
４−（２−ヒドロキシ−３−ジエチルアミノプロポキシ
）ペン７′アルテヒド−４−ニトロフェニルヒドラゾン
４（ｌを得る。得られたヒドラゾン１８ｇをテトラヒド
ロフランに溶かし、これに水酸化カリウム浴液を加え冷
却しなから４−ヨードアニリン１０．５ ｇと塩酸、亜
硝酸ナトリウムを用いて合成した４−ヨードベンセンジ
アゾニウム塩酸塩の水溶液を徐々に滴下し、２時間（パ
〃拝する。反応溶液に水を加えて濾過し、３−（４−ヨ
ードフェニ）ｖ ） −２−（４−ニトロフェニル）−
５−（４−（２−ヒドロキシ−３−ジエチルアミノプロ
ポキシ）フェニル〕ホルマザン１５５ｇを得る。得られ
たホルマザン１２ｇ’（ｚエチレンクロルヒドリンとテ
トラヒドロフランの混合溶媒に俗かし加熱還流する。
反応溶液にメタノールを加え濾過し、Ｐ喉を議稲し、ホ
ルマザン側鎖の４級アンモニウム塩８５Ｉ２を身る。こ
の４級アンモニウム塩８ｙをメタノールに溶解し、それ
に塩酸を加え室温で攪拌しながら亜硝酸ブチル３．５ｆ
を加える。反応浴液を濾過し減圧濃縮して、目的とする
テトラゾリウム塩化合物７．５７を得る。
ルマザン側鎖の４級アンモニウム塩８５Ｉ２を身る。こ
の４級アンモニウム塩８ｙをメタノールに溶解し、それ
に塩酸を加え室温で攪拌しながら亜硝酸ブチル３．５ｆ
を加える。反応浴液を濾過し減圧濃縮して、目的とする
テトラゾリウム塩化合物７．５７を得る。
融点 １０５〜１１２”Ｃ（分解）
元素分析［ｉ（ｌ ＣｙｓＨｓｔＮｓＯ＊０６＊ １
０ ＨＮ 理論値 ４５．８６ ４．４０ １１．４６実測
値 ４６．１Ｂ ４．３５ １１．０２’Ｉ（
−ＮＭＲ（ｄ、−ＤＭ８０）δＦ（ＴＭ８）１．２５（
ｔ、Ｊ ＝＝６．７ｆ（ｚ、６Ｈ） ３．１５〜４．
６８（ｍ、１３１Ｈ）７．００〜７．６３（ｍ、４Ｂ）
８．１５〜８．６０（ｍ、８Ｈ）ＩＲ（α−１） ３３００（−ＯＢ） ２８６０（−ＯＨ） １６０
０（Ｎ０ｔ）１４５０（−ＯＨ） １２４５（−００
０−） ｓｓｏ、（−Ｃ）−）実施例２（実施例１で
得られた化合物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法。
０ ＨＮ 理論値 ４５．８６ ４．４０ １１．４６実測
値 ４６．１Ｂ ４．３５ １１．０２’Ｉ（
−ＮＭＲ（ｄ、−ＤＭ８０）δＦ（ＴＭ８）１．２５（
ｔ、Ｊ ＝＝６．７ｆ（ｚ、６Ｈ） ３．１５〜４．
６８（ｍ、１３１Ｈ）７．００〜７．６３（ｍ、４Ｂ）
８．１５〜８．６０（ｍ、８Ｈ）ＩＲ（α−１） ３３００（−ＯＢ） ２８６０（−ＯＨ） １６０
０（Ｎ０ｔ）１４５０（−ＯＨ） １２４５（−００
０−） ｓｓｏ、（−Ｃ）−）実施例２（実施例１で
得られた化合物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法。
）
３７７に予備加温したグリシン−乳酸塩溶液（グ１ノシ
ン一０．７２％、ｄｉ−乳酸＝０．４２％、 ｐＨ＝
９．６ ）４珂ｔ（７こ同加温で３０分間予備加１品
した標準血清をＯ〜８２．６ ｍ Ｕ／ＷＩ加え攪拌す
る。１分後に実施例１で得られた化合物の０．０７１０
％水＠液をｌ屑を加えて攪拌し、さらに１後戻ＮＡＤ−
ＰＭＳ溶液（ＮＡＤ＝２％、ＰＭＳ＝０．２％、牛血清
アル〕゛ミン留分５＝０．１５％、ｐｌ（＝７．４のリ
ン酸緩悔液）０１雰ｌを加えて攪拌し、３７°Ｃに正確
に８分間保つ。たたちに０１規定唱酸１ｍ／を加え＊４
９５ｎｍで吸光度を測定する。対照には血清の代わりに
精製水を用いた。その結果は図１に示す様に原点を通り
良好な直線性の検量線が得られ、これにより血清の酵素
活性を正確に求めることができる。
ン一０．７２％、ｄｉ−乳酸＝０．４２％、 ｐＨ＝
９．６ ）４珂ｔ（７こ同加温で３０分間予備加１品
した標準血清をＯ〜８２．６ ｍ Ｕ／ＷＩ加え攪拌す
る。１分後に実施例１で得られた化合物の０．０７１０
％水＠液をｌ屑を加えて攪拌し、さらに１後戻ＮＡＤ−
ＰＭＳ溶液（ＮＡＤ＝２％、ＰＭＳ＝０．２％、牛血清
アル〕゛ミン留分５＝０．１５％、ｐｌ（＝７．４のリ
ン酸緩悔液）０１雰ｌを加えて攪拌し、３７°Ｃに正確
に８分間保つ。たたちに０１規定唱酸１ｍ／を加え＊４
９５ｎｍで吸光度を測定する。対照には血清の代わりに
精製水を用いた。その結果は図１に示す様に原点を通り
良好な直線性の検量線が得られ、これにより血清の酵素
活性を正確に求めることができる。
実施例３（一般式（１１におけるＹが２−ヒドロキシメ
チルエチレン、 Ｒ１、Ｒ’が１０ピルハ、Ｘが塩素原
子、Ｗがニトロ基。
チルエチレン、 Ｒ１、Ｒ’が１０ピルハ、Ｘが塩素原
子、Ｗがニトロ基。
Ｚが４−ヨードフェニル基で、置換アルコキシ基がベン
ゼン環の３位に置換した化合物の合成法。）３−ヒドロ
キシベンズアルデヒド８６９とエピクロルヒドリン１３
０ｆｅテトラヒドロフランに溶かし、これに水酸化ナト
リウム溶液を加え加熱還流させた後減圧蒸留して３−オ
キシラン４トキシベンスアルデヒド７５ｇを得る。次に
濃塩酸１’４ｔｇｌを冷却しなから３−オキシラン４ト
キシベンスアルデヒド１（ＨＦをゆっくりと滴下し攪拌
した後、クロロホルムを加え冷希度酸水素ナトリウム水
溶液、ついで冷水で洗浄し。
ゼン環の３位に置換した化合物の合成法。）３−ヒドロ
キシベンズアルデヒド８６９とエピクロルヒドリン１３
０ｆｅテトラヒドロフランに溶かし、これに水酸化ナト
リウム溶液を加え加熱還流させた後減圧蒸留して３−オ
キシラン４トキシベンスアルデヒド７５ｇを得る。次に
濃塩酸１’４ｔｇｌを冷却しなから３−オキシラン４ト
キシベンスアルデヒド１（ＨＦをゆっくりと滴下し攪拌
した後、クロロホルムを加え冷希度酸水素ナトリウム水
溶液、ついで冷水で洗浄し。
溶媒を留去して、３−（２−クロロ−３−ヒドロキシプ
ロポキシ）ベンズアルデヒド１０５ｇを得る。この３−
（２−クロロ−３−ヒドロキシプロポキシ）ベンズアル
デヒト９９と。
ロポキシ）ベンズアルデヒド１０５ｇを得る。この３−
（２−クロロ−３−ヒドロキシプロポキシ）ベンズアル
デヒト９９と。
４−ニトロフェニルヒドラゾン６．４ｇをメタノール中
で加温混合し、３−（２−クロロ−３−ヒドロキシプロ
ポキシ）ベンズアルデヒド−４−二トロフェニルヒドラ
ゾン１１．４ｐｆ：合成する。このヒドラゾン１０．４
ｆ’ｅテトラヒドロフランとメタノールの混合溶媒に溶
かし、これに水酸化カリウム溶液を加え冷却する。これ
に４−ヨードアニリン６．５９と塩酸および亜硝酸ナト
リウムを用いて合成した４−ヨードベンゼンジアゾニウ
ム塩酸水溶液を徐々に滴下し、攪拌する。反応溶液に水
を加え一夜放置して濾過し、３−（４−ヨードフエニ／
ｌ／）−２−（４−ニトロフエニ７Ｉ／）−５−（３−
（２−クロロ−３−ヒドロキシプロポキン）フェニル）
ホルマザン８５ｇを得る。得られたホルマザン７．５ｙ
をトリプロ上ピルアミン乙 支テトラヒドロフランの混合溶媒に浴かし加熱還流する
。反応溶液にテトラヒドロフランを加え濾過しホルマザ
ン側鎖の４級アンモニウム４５．２ｇを得る。この４級
アンモニウム塩４ｇをメクノーＩしに溶解し、それに塩
酸を加え室ｆ８で９拌しながらこれに亜硝酸ブチ７Ｌ／
２．８ｆを加え反応させる。反応溶液に活性炭を加え濾
過し減圧濃縮して、目的とするテトラゾリウム塩化合物
３．８１を得る。
で加温混合し、３−（２−クロロ−３−ヒドロキシプロ
ポキシ）ベンズアルデヒド−４−二トロフェニルヒドラ
ゾン１１．４ｐｆ：合成する。このヒドラゾン１０．４
ｆ’ｅテトラヒドロフランとメタノールの混合溶媒に溶
かし、これに水酸化カリウム溶液を加え冷却する。これ
に４−ヨードアニリン６．５９と塩酸および亜硝酸ナト
リウムを用いて合成した４−ヨードベンゼンジアゾニウ
ム塩酸水溶液を徐々に滴下し、攪拌する。反応溶液に水
を加え一夜放置して濾過し、３−（４−ヨードフエニ／
ｌ／）−２−（４−ニトロフエニ７Ｉ／）−５−（３−
（２−クロロ−３−ヒドロキシプロポキン）フェニル）
ホルマザン８５ｇを得る。得られたホルマザン７．５ｙ
をトリプロ上ピルアミン乙 支テトラヒドロフランの混合溶媒に浴かし加熱還流する
。反応溶液にテトラヒドロフランを加え濾過しホルマザ
ン側鎖の４級アンモニウム４５．２ｇを得る。この４級
アンモニウム塩４ｇをメクノーＩしに溶解し、それに塩
酸を加え室ｆ８で９拌しながらこれに亜硝酸ブチ７Ｌ／
２．８ｆを加え反応させる。反応溶液に活性炭を加え濾
過し減圧濃縮して、目的とするテトラゾリウム塩化合物
３．８１を得る。
融点 １１３〜１１８°Ｃ（分解）
−ｘ＝ｘ分析値１９１；） Ｏｓ＋ＨＪ＊Ｎｅ０ｉ（
Ｊ！ＷｙＯＯＨＮ 理論値 ４８．０１ ５．３３ １０．８４実
測値 ４８．１６ ５．４５ １１．２１１Ｈ
−ＮＭＲ（ｄ、−ＤＭ８０）δ１ｐ （ＴＭ８ ）１．
１６（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、９Ｈ）２．１５〜２．２５
（ｍ、６ＩＩ）３．０６〜４．４５（ｍ、１８Ｈ）
６．９８〜７．６０（ｍ、４Ｈ）８．１０〜８．５５
（ｍ、８Ｈ） ＩＲ（ｚ−’） ３２５０（−０Ｈ） ２８８０（０ＩＩ） １
６０５（Ｎｏｔ）１２４０（−ＣＯＣ！−） ５６
ｏ（−ＣＦ）実施例４（実施例３で得られた化合物を用
いる脱水素酵素の吸光光度定量法。） 実施例２と同様の測定操作により図２にだすように原点
を通り良好な直線性の検す線が得られた。なお該化合物
は００７０％溶液として用い、ｌ￥ｌｌｌ定は４９５
ｎｍで行った。
Ｊ！ＷｙＯＯＨＮ 理論値 ４８．０１ ５．３３ １０．８４実
測値 ４８．１６ ５．４５ １１．２１１Ｈ
−ＮＭＲ（ｄ、−ＤＭ８０）δ１ｐ （ＴＭ８ ）１．
１６（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、９Ｈ）２．１５〜２．２５
（ｍ、６ＩＩ）３．０６〜４．４５（ｍ、１８Ｈ）
６．９８〜７．６０（ｍ、４Ｈ）８．１０〜８．５５
（ｍ、８Ｈ） ＩＲ（ｚ−’） ３２５０（−０Ｈ） ２８８０（０ＩＩ） １
６０５（Ｎｏｔ）１２４０（−ＣＯＣ！−） ５６
ｏ（−ＣＦ）実施例４（実施例３で得られた化合物を用
いる脱水素酵素の吸光光度定量法。） 実施例２と同様の測定操作により図２にだすように原点
を通り良好な直線性の検す線が得られた。なお該化合物
は００７０％溶液として用い、ｌ￥ｌｌｌ定は４９５
ｎｍで行った。
図１１図２は、それぞれ実施例２および実施例４による
ところの、それぞれ４９２Ｈｍおよび４９５Ｈｍにおけ
る吸光度とＬｐｎ浩性値の関係を表わす。
ところの、それぞれ４９２Ｈｍおよび４９５Ｈｍにおけ
る吸光度とＬｐｎ浩性値の関係を表わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）一般式 で表わされるテトラゾリウム塩化合物。ただし式中の記
号の意味はつぎのようである。 入 Ｙ：炭素数２〜４の直鎖式、−！たけ側鎖全面しても良
く。 さらに必要に応じ１個の水酸基を慣しても良いアルキレ
ン基。 Ｒ′＝炭素数１〜４のアルキル基、またはヒドロキシエ
チル基。 １（２：炭素数１〜４で、必要に応じ１〜２個の水１暫
糸、１だは１個のフェニル基を有しても良いアルキル法
。 Ｘ：塩素原子、捷たけ臭素原子、 Ｗ：二トロ基。 ｚ：４−ヨードフェニル基。 １？１ または４位である。 ２）一般式 で表わされるテトラツリウム塩化合物を用いる脱水素酵
素の吸光光度定量法。ただし式中の記号の意味はっぎの
ようである。 Ｙ：炭素数２〜４の直鎖式、または側鎖を有しても良く
。 さらに必要に応じ１個の水酸基を有しても艮いアルキレ
ン基。 Ｒ１：炭素数１〜４のアルキル基、またはヒドロキシエ
チル基。 ｌ（２：炭素数１〜４で、必要に応じ１〜２Ｉｌｉ８１
の水目（是１ｔ；１１個のフェニル基を有しても良いア
ルキル基。 Ｘ：塩素原子、またけ臭素原子。 Ｗ：二トロ基。 ｚ：４−ヨードフェニル基。 １ なお、 −ｏｙ−〒−Ｒ’ のベンセン環における置
換位置は３位。 丑たは４位である。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21224483A JPS59112973A (ja) | 1983-11-10 | 1983-11-10 | テトラゾリウム塩化合物およびその化合物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21224483A JPS59112973A (ja) | 1983-11-10 | 1983-11-10 | テトラゾリウム塩化合物およびその化合物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21461881A Division JPS603396B2 (ja) | 1981-12-26 | 1981-12-26 | テトラゾリウム塩化合物およびその化合物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59112973A true JPS59112973A (ja) | 1984-06-29 |
Family
ID=16619356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21224483A Pending JPS59112973A (ja) | 1983-11-10 | 1983-11-10 | テトラゾリウム塩化合物およびその化合物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59112973A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0379048A2 (en) * | 1989-01-17 | 1990-07-25 | Abbott Laboratories | Beta-lactamase assays employing chromogenic precipitating substrates |
| JPH06100548A (ja) * | 1990-09-26 | 1994-04-12 | Adir | 新規ヘテロ環置換アルキルアミン、その製造方法および医薬組成物 |
-
1983
- 1983-11-10 JP JP21224483A patent/JPS59112973A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0379048A2 (en) * | 1989-01-17 | 1990-07-25 | Abbott Laboratories | Beta-lactamase assays employing chromogenic precipitating substrates |
| JPH06100548A (ja) * | 1990-09-26 | 1994-04-12 | Adir | 新規ヘテロ環置換アルキルアミン、その製造方法および医薬組成物 |
| JPH0786097B2 (ja) * | 1990-09-26 | 1995-09-20 | アディール エ コンパニー | 新規ヘテロ環置換アルキルアミン、その製造方法および医薬組成物 |
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