JPS5910194B2 - Ｌ−セリンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−セリンの製造法に関する。

さらに詳しくは本発明はノカルディア属に属し、グリシ
ンをＬ−セリンに変換する能力を有する微生物の菌体を
グリシンと接触せしめ、グリシンをＬ−セリンに変換し
、これを採取することを特徴とするし−セリンの製造法
に関する。

その目的とするところは医薬用、その法に用いられるＬ
−セリンを工業的に安価に製造する方法を提供すること
にある。

従来、微生物を用いるＬ−セリンの製造法としては、炭
素源、窒素源などを原料として含む発酵培地にＬ−セリ
ン生産菌を培養してこれらの炭素源、窒素源から直接Ｌ
−セリンを生成蓄積せしめる方法（特公昭４６−２９１
９１、同４８−６５５８、特開昭５１−５４９８４参照
）、あるいはＬ−セリンの前駆物質であるＤＬ−グリセ
リン酸（特公昭４２−１７７２８参照）、ベタイン（特
開昭４９−１３４８９０参照）、グリシン（特公昭４５
−１１１１４、同４６−３２７９３、同４７−３８９９
４、同５１〜６２３６、同５１−９３９１、ユーロピア
ン、ジャーナル・オブ・アプライド・マイクロバイオロ
ジー第２巻、第１７５頁、１９７６年参照）などを含む
発酵培地に各種の微生物を培養して、培養液中にＬ−セ
リンを生成せしめる方法、あるいは微生物培養除菌液も
しくは微生物を処理して得た除菌物の存在下でアルデヒ
ドとグリシンを反応せしめる方法（特公昭５１−６２３
９参照）などが知られている。

しかしながら、これらの方法による場合には、微生物菌
体、原料、生成物などが培養液あるいは反応液中に存在
するために種々の欠点を有していた。

例えば、培養物中に生成したＬ−セリンは菌体、培養原
料あるいは種々の蛋白質と共存し、純度の高いＬ−セリ
ンを得るためには面倒な後処理が必要であった。

またＬ−セリンの製造の原料としてグリシンのほかに高
価な糖質やアルデヒド類および窒素源を培地中あるいは
反応液中に添加する必要があった。

本発明者らはＬ−セリンの製法について種々研究を重ね
た結果、ノカルディア属に属し、グリシンをＬ−セリン
に変換する能力を有する微生物の菌体をグリシンと接触
せしめるだけで、グリシンをＬ−セリンに変換すること
ができること、とくに該菌体を担体に固定化して用いれ
ば、Ｌ−セリンが工業的に有利に製造されることを見出
し本発明を完成するに到った。

従来、グリシンからＬ−セリンを製造する方法において
、炭素源や栄養物の存在下に菌体とグリシンを接触反応
せＬめる方法については知られている（特公昭５１−６
２３６参照）が、・本発明のごとく菌体とグリシンを他
の炭素源や栄養物の非存在下で直接反応せしめる方法、
とくに固定化された菌体を用いてグリシンをＬ−セリン
に変換せしめる方法については例がなく、本発明の方法
はＬ−セリンの工業的製法として極めて優れている。

以下、本発明な詳細に説明する。

本発明によれば、ノカルディア属に属し、グリシンをＬ
−セリンに変換する能力を有する微生物の培養物から菌
体を集菌し、これに直接グリシンを接触反応せしめるが
、これを担体に固定化しグリシンを接触反応せしめるこ
とによってグリシンをＬ−セリンに変換せしめることが
できる。

本発明に用いる微生物としては、ノカルディア属に属し
、グリシンをＬ−セリンに変換する能力を有するものな
らば、いかなる菌株も用いることができる。

たとえば、ノカルディア・ブタ二カ （Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｕｔａｎｉｃａ ）、ノカルデ
ィア・バラフイニカ（ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｐａｒａｆ
ｆｉｎｉｃａ ）など、およびそれらから誘導される各
種変異株（例えば、栄養要求性変異株、アナログ耐性変
異株、その他の薬剤耐性変異株）が用いられる。

具体的に好適な菌株の一例としては、メカルディア・ブ
タ二カＫＹ−７９９０（微工研菌寄第３７７０号）、ノ
カルディア・バラフイニカＡＴＣＣ２１１９８があげら
れる。

この両菌種の菌学的性質は特公昭４７−４８６７３号公
報やイギリス特許 １２１６０４５号明細書に記載されている。

本発明に用いる微生物菌体は次のごとき方法で培養した
培養物を遠心分離、ｒ過などによって集菌して得ること
ができる。

本発明に用いる微生物の培養には、炭素源、窒素源、無
機物その他の必要な栄養素を程良く含有するものであれ
ば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ンルビト
ール、マニトール、グリセロール、殿粉、殿粉加水分解
物、糖蜜、廃糖蜜などの各種炭水化物、エタン、プロパ
ン、ブタン、ｎ−パラフィン、ケロシンなどの炭化水素
、酢酸、フマール酸、コハク酸、乳酸、ピルビン酸など
の有機酸、さらにメタノール、エタノールなどのアルコ
ール類も使用できる。

窒素源としてはアンモニア水、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、尿素、酸
アミド類、アミノ酸や、さらには肉エキス、酵母エキス
、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、フィッ
シュミールおよびその消化物、脱脂大豆およびその消化
物、大豆蛋白質酸加水分解物、各種発酵菌体およびその
消化物などが使用できる。

無機物としてはリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、
硫酸マンガン、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウムな
どが使用できる。

もちろん、本発明に使用する微生物が生育の為に特定の
栄養素を必要とする場合にはその栄養素を適当量培地に
存在させなげればならないが、これらの物質は窒素源と
して例示した天然物に含まれて添加される場合がある。

培養は振盪培養、あるいは深部通気攪拌培養などの好気
的条件下で行う。

培養温度は通常２０〜４０℃の範囲で、培養液のｐＨは
３〜９の範囲で、好ましくは中性付近に保持することが
望ましいが、これ以外の条件下でも使用菌株が生育すれ
ば実施できる。

培地のｐＨ調整は炭酸カルシウム、酸、あるいはアルカ
リ溶液、ｐＨ緩衝剤などによって行う。

培養期間は通常１〜７日間行う。かくして培養した培養
物から遠心分離、沢過などの操作により菌体を得る。

菌体は必要ならば凍結して保存する。

本発明において菌体をグリシンと接触反応させてＬ−セ
リンを得るには次のごとくして得られた菌体を０．５〜
２０％のグリシンを含むリン酸緩衝液（ ｐＨ ７．０
）に５〜２００■／７Ｍ／（乾物換算）の割合で懸濁
し、５〜３０時間、室温で振盪反応せしめることによっ
て反応液中にＬ−セリンを生成せしめることができる。

本発明において菌体を担体に固定化し、グリシンと接触
反応させてＬ−セリンを得るには、次のごとく行う。

菌体の固定化は、ゲル包括法またはマイクロカプセル化
法など微生物の固定化に一般的によく知られた方法によ
って行われる。

包括法による固定化は、微生物菌体の懸濁液に高分子単
体、重合開始剤、重合促進剤などを加え、菌体と高分子
単体を重合させることによって行うことができる。

菌体の懸濁液は５〜２００Ｍ９／１ｒＬｌ（乾物換算）
の菌体濃度が好適である。

高分子単体としては、例えばアクリル酸アミド、Ｎ−Ｎ
−メチレンービスーアクリル酸アミド、アクリル酸、メ
タアクリル酸、メタアクリル酸アミド、アクリル酸また
はメタアクリル酸のアルカリ金属塩誘導体などが単独あ
るいは混合して用いられる。

高分子単体の濃度は０．０１〜０．３ｆ／ｄｌが好適で
ある。

重合開始剤としては、例えば過硫酸カリウム、過硫酸ア
ンモニウム、ビタ，ミンＢ２、メチレンブルーなどが用
いられる。

重合開始剤の濃度は０．０１〜０． ０ ５ ９Ａ／ｄ
ｌが好適である。

重合促進剤または重合安定剤としては、例えばジメチル
アミノープロピオニトリル、Ｎ−Ｎ−Ｎ’−Ｎ’−テト
ラメチルエチレンジアミンなどが用いられる。

重合促進剤または重合安定剤の濃度は０．０２〜０．
１ ０ ｆ／ｄｌが好適である。

重合反応はθ〜４０℃、特にθ〜１０℃で好適に行われ
、一般に６０分以内の短時間で重合は完了する。

また、重合反応に際しては反応系に無機頃類を存在せし
めておくことにより、得られる固定化菌体によるグリシ
ンからのＬ−セリンへの変換能を著しく高めることがで
きる。

無機塩類としては、例えば塩化カルシウム、リン酸カル
シウム、塩化ナトリウム，リン酸第二カリウム、リン酸
マグネシウム、硫酸マグネシウムなどが用いられる。

無機塩類の濃度は０．５〜３ｒ／ｄｌが好適である。

マイクロカプセル化による固定化は、沸点が水より低く
、水と混和しない有機溶媒中に半透膜形成物質を溶かし
、この溶液中に微生物菌体を一次分散させ、油中水形の
一次エマルジョンを作り、この一次エマルジョンをゼラ
チン、ポリビニルアルコールあるいは界面活性剤などの
保護コロイド物質を含む懸濁液中に攪拌しながら加えて
二次分散させて二次エマルジョンを作り、この二次エマ
ルジョンから有機溶媒を除去することＫよって得られる
。

菌体の濃度は５〜２０９７ｄｌｃ乾物換算）の範囲で好
適に行われる。

半透膜形成物質としてはエチルセルロース、ポリスチレ
ン、フエニルチロキサンのラダーポリマーなどのシリコ
ン系ポリマー、ま゜たはこれらの混合物などが用いられ
る。

半透膜形成物質の濃度は３〜１ ０ ？／ｄｌが好適で
ある。

半透膜形成物質の溶剤としては、ベンゼン、シクロヘキ
サン、クロロホルムなトカ用いられる。

保護コロイド物質の濃度は０．５〜６０９７ｄｌが好適
である。

一次エマルジョンと二次エマルジョンの比率は１対１〜
５くらいカ好適である。

かくして得られる固定化菌体にグリシンを作用させれば
、Ｌ−セリンを生成せしめることができる。

この操作はバッチ法のみならずカラム法、流動化法など
によって連続的に実施することができる。

例えば、バッチ法による場合には、固定化菌体をグリシ
ン溶液に懸濁して攪拌し、反応終了液を沢過または遠心
分離処理することによってＬ 一七リンを含む溶液を得
ることができる。

固定化菌体の濃度は５〜１５Ｙ／ｄｌ，グリシン濃度は
固定化菌体とグリシン溶液を合わせた容量当り５〜５０
ｆ／Ｊが好適である。

反応温度は２０〜４０℃、反応時間は１０〜２０時間で
行われるとよい。

分離された固定化菌体は反復して使用することができる
。

カラム法による場合は、固定化菌体をカラムに充填し、
このカラムにグリシン溶液を通塔することによりＬ−セ
リンを含む溶液が得られる。

グリシン溶液のグリシン濃度は５〜５ｏ？／ｌが好適で
ある。

本法は、例えばマグネシウム、マンガン、燐酸その他の
無機物の存在下でｐＨ５〜９程度で行うのが好ましく、
反応温度は２０〜４０℃が好適である。

無機物の濃度は０．５〜３ ｆ／ｄｉが適当である。

流動化法は、流動層反応器に固定化菌体を入れ、空気と
リン酸バツファーにて流動化しつつ、グリシン、マグネ
シウム、マンガン、燐酸その他の無機物などを通液して
行う。

反応器中のグリシン濃度は５〜５０グ／ｌ，無機物の濃
度は０．５〜３１／ｄ／、ｐＨは５〜９、温度は２０〜
４０℃が好適である。

グリシンからＬ−セリンへの反応進行率は、固定化菌体
の量、反応温度、反応時間、グリシン溶液の濃度や流速
により影響される。

バッチ法による場合は反応時間を調整することにより、
またカラム法、流動化法の場合にはグリシン溶液の流速
を調整することにより最高収率を得る至適条件を容易に
見出すことができる。

生成したＬ−セリンは吸脱着法、イオン交換樹脂法など
の一般的な精製法を利用して容易に単離、精製すること
ができる。

以下に実施例を示す。

実施例 １ ノカルディア・ブタニヵＫＹ−７９９０を種培地（グル
：７−ス４ ｔ／ｄｉ，ＫＨ２ ｐｏ４ｏ． １ ５
Ｙ／ｄｌ，Ｋ２ＨＰＯ４０．０ ５／ｄｌ， ＭｇＳＯ
４− ７Ｈ２０ ０．０ ５Ｓｉ’ ／ｄｌ，酵母エキ
ス０． ５ ？ ／ｄｌ、ヘプト７２９／ｄｉ１ｐＨ
７． ２ ） ３ ０ｍｌヲ含ム３ ０ ０ ｍｌ容三
角７ −ｙ ス＝ｒに接種して回転数２ １ ０ ｒｐ
ｍのロータリーシェーカー上、３０℃で２４時間振盪培
養する。

その培養液１ｍｌずつを生育培地（グルコース８１／ｄ
ｌ、（ＮＨ，）２Ｓ０４ １ｔ／ｄｌ、ペプトン１グ／
ｄｌ．Ｍｇ ３ （ ＰＯ４ ） ２ ３１／（ｉｌ
１ＫＨ２ Ｐ ０４ ０． １ ５ｔ／ｄｌ， Ｋ２Ｈ
ＰＯ４０． ０ ５ ｆｌ／ｄｉ，ＭｇＳ０４− ７
Ｈ２０ ０． ０ ５ ？／ｄｉ、ＦｅＳＯ４ −
７ Ｈ２００． ０ ０ １ ｙ／ｄｌ，ＭｎＳＯ４・
４Ｈ２０ ０． ０ ０ １ Ｖ／ｄｌ， ｐＨ ７．
２ ）３０ｍｌ宛を含むバツフル板つきの３００ｍｌ容
三角フラスコ１５本にそれぞれ植菌し、上記と同様に２
４時間振盪培養した。

これに、２９７ｄｉのグリシン溶液を２ｒｒＬｌ宛添加
してさらに１６時間培養を続行した。

得られた培養液を合わせ遠心分離して沈殿物を得た。

得られた沈殿物を菌体の乾燥重量として６ ０ ｍｙ／
ｍｌになるように２．５グ／ｄｌのグリシンを含む０．
２ Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０１Ｉｔｌ中
に懸濁して、上記と同様に３００ｍｌ容三角フラスコ中
で振盪したところ、反応２０時間目で１２１Ｉ９／ｒｒ
ＬｌのＬ−セリンが生成した。

実施例 ２ 実施例１においてノヵルディア・ブタニヵＫＹ−７９９
０に替えてノカルディア・バラフィニヵＡＴＣＣ２１１
９８を用いるほかは、実施例１と同様な操作を行ったと
ころ、４．３ｍｙ／ｒｎｌのＬ−セリンが生成した。

実施例 ３ （マイクロカプセル化） 種菌としてノカルディア・ブタニヵＫＹ−７９９０を用
い、実施例１と同様に種培養を行う。

種培養液１００ｍｌを５ｌ容量のジャーフアーメンター
中の本培養培地３ｌに加えて培養する。

本培養培地はグルコース８ｆ／ｄｌ、ペプトン１ｔ／ｄ
ｌ、リン酸−３マグネシウム３ｔ／ｄｌ，硫安１ ？／
ｄｉ、リン酸−■カリウム０． １ ５ ｆｌ／ｄｉ，
リン酸−２カリウム０． ０ ５ ｔ／ｄｌ，硫酸マグ
ネシウムｏ．ｏ５？ ７ｃｕ、硫酸第１鉄・７水塩０．
Ｏ Ｏ Ｉ Ｙ／ｄｌ、塩化カルシウム・２水塩ｏ．
ｏｉめ／ｄｌｃ ｐＨ７．０＞である。

温度３０℃、４８時間、通気量Ｉ Ｖ／Ｖ ／ ｍ、攪
拌数３０００〜３５ ００ ｒ．ｐ．ｍ．の条件で培養
する。

培養液から遠心分離により菌体を集め０．１Ｍリン酸バ
ッファ二（ｐＨ７．０）にて２度洗．浄シテリン酸ハッ
ファ一中凍結品として保存する。

次に固定化菌体はまず７２．５ｆＩの溶媒ベンゼン、２
５．５ｆ？のｎ−へキサンと２１の分散剤スパンー２０
（ソルビタン・モノラウリル酸の商品名、関東化学社製
）に５１のエチルセルロース（５０〜１ ０ ０ ｃｐ
ｓ ）を溶解する。

それに、前述の解凍した凍結菌体５ｆ？（乾物換算）と
リン酸−１−マグネシウム１００ＷＩ９，リン酸−３マ
グネシウム１００Ｗ１９を０．１Ｍリン酸バッファ−５
ｏ１ｒＬｌ（ｐＨ７．０）に懸濁して強攪拌下１次エマ
ルジョンを形成させる。

さらに、この１次エマルジョンをｐＨ８〜９の水冷（１
０〜１５℃）した１％（Ｖ／Ｗ）ポリエチレングリコー
ル（平均分子量６０００）溶液３００ｍｌ中に添加し、
均一攪拌下２次エマルジョンを形成させる。

次いで、１０〜１５ｍｌ／ｍで氷冷したｎ−へキサン（
５〜ｌＯ’ｃ）を連続添加し、ベンゼンを系外に除去す
ると同時にエチルセルロースを析出させる。

約１時間にて析出したエチルセルロースに包括された菌
体は５〜ｌＯｏμの径をもつ球状の固定化菌体となる。

生菌との活性比は約５０〜６０％であり、包括量は３０
０〜３５０ 〜・ｃｅｌｌ／ｍｌ・マイクロカプセルである。

ＩＪ容量（９０Ｘ１５０ψ）の流動層型反応器に上記マ
イクロカプセル化固定化菌体を１００ｍｌ投入し、空気
と０． １ Ｍ ＩＪン酸バッファ一（ｐＨ６．１）に
て流動化せしめる。

これに、０． １ Ｍリン酸バツファ一（ｐＨ ６．１
）１ ００ｍｌにグリシン２０ｖ１リン酸−１マグネ
シウム５ｏｏＷＩ９、リン酸−２マグネシウム５ｏｏＷ
Ｉ９を懸濁したものを滞留時間１５〜２０時間Ｋて通液
した。

その結果約１ ０ 〜１ ３ ｗｒｙ／ｒｕｌノＬ−セ
リンが４０〜５０時間にわたって連続して生産された。

実施例 ４ （アクリルアミドゲル包括法） アクリルアミド系単量体によるゲル包括菌体の調製法は
以下のとおりである。

分散媒としてシクロヘキサン５００７７１ｌ，分散剤と
して４ｆのスパン−２０を使用し１０〜１５℃に水冷下
窒素気流中で攪拌しておく。

そこに、リン酸バツファ一（０．１Ｍ，ｐＨ ６．１
）１ ００ｍｌに溶解あるいは懸濁したアクリルアミド
１９．５Ｐ、Ｎ−Ｎ’−ビスーアクリルアミド０．５Ｓ
’，および実施例１で調製したと同一方法で調製した凍
結菌体を解凍したもの１０グ（乾物換算）を添加し、重
合安定剤として２５％（Ｗ／Ｖ）Ｎ−Ｎ−ＮξＮ’一ｆ
トラメチルエチレンジアミン１０Ｔｒｌｌ１重合開始剤
として２５％（Ｗ／Ｖ）過硫酸アンモニウム１２．５ｍ
／を加えて懸濁重合する。

重合時間は０．５〜１．０時間である。

生成したゲル包括菌体は３． ０ ０〜４００μ程度の
球形ゲルで、生菌に対する比活性は約３０〜４０％、包
括菌体量は６０〜７０ 〜・Ｃｅｌｌ／ｍｌ−ｇｅｌｌ である。

反応はゲル１００ｍｌを１１容量の攪拌槽に投入し、グ
リシンを２ ５ ｍｙ／ｍｌの濃度で添加し、バッチ法
で約２０〜２５時間反応を行った結果１２．５〜／ｒｒ
ＬｌのＬ−セリンが生成した。

反応液からゲルを回収し、そのゲルを使用して同様の反
応を繰返し２度行なった結果は表のごとくであった。

反応中ＮＡＤの洩れは認められなかった。

第１回目の反応液１ｌから固定化微生物を沢別し、沢液
を塩酸でｐＨ２．０に調製し、ダイヤイオンＳＫ−ＩＢ
（スチレン系強酸性陽イオン交換樹脂の商品名）（ＮＨ
４＋型）に通液し、２Ｎ−アンモニア水にて溶出する。

溶出液を真空濃縮してＬ−セリン８，５グを得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ノカルディア属に属し、グリシンをＬ−セリンに変
   換する能力を有する微生物の菌体とグリシンとをグリシ
   ン以外の炭素源の非存在下に接触せしめてグリシンをＬ
   −セリンに変換し、これを採取することを特徴とするＬ
   −セリンの製造法。 ２ 該菌体が固定化菌体である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。