JPS588836B2 - 固定化酵素及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素及びその製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で工業的にも行
なわれているが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解させ
て、溶液中で反応を行なわせている。

しかし、このような方法によれば、反応条件を一定に維
持しつつ、新鮮な酵素を補給したり、また反応後に酵素
を回収したりすることが困難であり、一方、反応生成物
の分離精製も容易ではない。

このような問題を解決するために、既に、酵素を担体に
固定化した固定化酵素を用いて、基質と反応させること
が提案されており、担体結合法、物理的吸着法、包括法
等の酵素固定化法が知られている。

しかし、担体結合法は特殊な担体を必要とするうえに、
酵素をとの担体に固定化するために複雑な操作を要し、
一般に高活性の固定化酵素が得られない。

また、物理的吸着法は担体と酵素との結合が十分でない
ので、使用中に酵素が担体から脱離しやすく、酵素反応
を安定に行ない得ない。

これらの方法に比べて、包括法は、水溶性重合体に酵素
を添加した後、架橋剤や放射線処理によって上記重合体
をゲル化させ、酵素をゲルの格子内に固定されるもので
あり、一般に簡単且つ低廉に製造できるため、特に工業
的には有用な方法であり、既に一部実用化もされている
が、水溶性重合体を架橋、ゲル化させる際に、酵素活性
の低下を免れないという欠点がある。

架橋密度を抑えれば、ある程度は酵素活性の低下を防ぐ
ことができるが、一方酵素の固定化格子の間隔が大きく
なるので、酵素の溶出が顕著となる。

これは、酵素反応を工業的に連続して安定に行なう際に
致命的である。

本発明者らは、酵素の固定化における上記した種々の問
題を解決するために鋭意研究した結果、エチレンー酢酸
ビニル共重合体ケン化物（以下、ＥＶＡ重合体という。

）を水と混和し得る有機溶剤に溶解し、この重合体溶液
に酵素を溶解又は分散させた後、適宜形状に成形し、次
いでこの成形物の全表面を主として水からなる凝固液と
接触させて成形物中の上記有機溶剤を水と置換とするこ
とにより、微孔を有する緻密な表面層と比較的粗な多孔
質の内部層とからなる上記重合体の異方性ゲルの格子中
に酵素が固定化され、従って、かかる異方性のゲル格子
によれば、緻密な表面層により酵素の溶出が効果的に阻
止され、一方、内部の多孔質層は固定化酵素の自由度を
制限しないので、酵素活性が高いことを見出し、本発明
に至ったものである。

即ち、本発明の固定化酵素は、エチレン単位３〜４０重
量％及び酢酸ビニル単位６０〜９７重量％よりなるエチ
レンー酢酸ビニル共重合体の酢酸ビニル単位の８０モル
％以上がケン化されている重合体からなり、微孔を有す
る緻密な表面層と比較的粗な多孔質の内部層とが一体に
連続して形成された異方性のゲルの格子中に酵素が固定
化されていることを特徴とし、かかる固定化酵素は、上
記重合体を水と混和し得る有機溶剤に溶解し、この重合
体溶液に酵素を溶解又は分散させ、かくして得だ成形用
原液を所要形状に成形した後、この成形物の全表面を主
として水からなる凝固液と接触させ、成形物中の上記有
機溶剤を水と置換して上記重合体をゲル化させることに
よって得られる。

本発明において用いるＥＶＡ重合体は、上記のように、
エチレン単位３〜４０重量％、好ましくは５〜３０重量
％と、酢酸ビニル単位６０〜９７重量％、好ましくは７
０〜９５重量％よりなるエチレン酢酸ビニル共重合体の
酢酸ビニル単位の８０モル％以上がケン化されているＥ
ＶＡ重合体である。

エチレン単位が３重量％より少ないときは、得られるＥ
ＶＡ重合体の水に対する安定性が悪くなり、後に説明す
るゲル化に際して種々の不都合を生じ、また、４０重量
％を越えるときは、ＥＶＡ重合体が有機溶剤（含水有機
溶剤を含む。

）に溶解し難くなるので、酵素をＥＶＡ重合体中に一様
に分散させることが困難となる。

まだ、ケン化度が酢酸ビニル単位の８０モル％より少な
いときは、ＥＶＡ重合体の親水性が十分でなく、従って
、一般に水性雰囲気で行なわれる酵素反応に適しなくな
る。

このようなＥＶＡ重合体を溶解させるための有機溶剤と
しては、水と混和し得る極性有機溶剤、具体的にはジメ
チルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、フェノール
やクレゾールのようなフェノール類、エチレンクロルヒ
ルドリン、エチレングリコール、プロピレングリコール
、セロソルブ、グリセリン、メタノール、エタノール、
グロパノール、プタノール、ジオキサン、テトラヒドロ
フラン等が用いられ、これらの内、例えば、アルコール
、グリコール、エーテル類は水と併用し、水性有機溶剤
として、ＥＶＡ重合体の溶解度を高めるのが望ましい。

また、ジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミドは
単独でＥＶＡ重合体をよく溶解するが、水、アルコール
、グリコール、エーテル類を含有していてもよい。

本発明においては、ジメチルスルホキシドのようなＥＶ
Ａ重合体の良溶剤が好ましく用いられるが、一方、ｎ−
プロパノールと水との混合溶剤も好ましく用いられる。

ＥＶＡ重合体溶液におけるＥＶＡ重合体の濃度は３〜４
０重量％、好ましくは１０〜２５重量％に調整される。

ＥＶＡ重合体溶液は、後に説明するように、これを所要
形状の成形物、例えば膜や管に成形した後、主として水
からなる凝固液に浸漬して、成形物中の上記有機溶剤を
水と置換し、かくして、異方性のゲル構造を形成するの
であるが、ＥＶＡ重合体溶液におけるＥＶＡ重合体濃度
が３重量％より小さいときは、表面に緻密層を形成し難
くなると共に、例えば、膜状成形物であれば十分な機械
的強度を有しない等の不都合が生じる。

また、緻密層を形成し得ても、その微孔の孔径が大きす
ぎて、ゲル格子中に固定化された酵素の溶出を効果的に
阻止できない。

反対に、４０重量％より太きいときは、緻密層が厚くな
ると共に、その微孔の孔径も著しく小さくなるので、基
質が緻密層を透過し難くなり、酵素反応が円滑に進行し
ない。

ＥＶＡ重合体溶液を調製するに当って、必要ならば加熱
し、ＥＶＡ重合体の溶剤への溶解を促進してもよいが、
酵素をＥＶＡ重合体溶液へ添加する際には、ＥＶＡ重合
体溶液の温度は０〜４０℃、特に０〜３５℃の範囲にあ
るのが望ましい。

酵素を添加する際の温度が４０℃より高いときは、酵素
の失活が起こりやすく、０℃より低いときは溶液の粘度
が高いので、酵素を溶液中に一様に溶解又は分散させる
ことが困難である。

酵素はＥＶＡ重合体溶液へ単独で添加してもよいが、好
ましくは予め水、緩衝液等に溶解させ、これを重合体溶
液に加えて、酵素を溶解又は分散させる。

酵素の添加量は、ＥＶＡ重合体１００重量部当り０．１
〜２０重量部、好ましくは１〜１０重量部である。

このようにして酵素を添加されたＥＶＡ重合体溶液は（
以下、成形用原液という。

）、次いで、適宜形状に成形される。

本発明において、この「成形」は次の二つの方法を含む
。

第一に、成形用原液を多孔質基材の表面に薄層に塗布す
ることであり、この場合、基材と一体化された固定化酵
素が得られる。

多孔質基材としては、具体的には天然繊維や合成繊維か
らなる織布、不織布等が適する。

かかる基材としてはシート状や管状の基材が好ましく用
いられ、シート状基材にあっては、その表面とは表裏両
面を意味し、管状基材にあっては、外側及び内側の両表
面を意味する。

これら多孔質基材への成形用原液の塗布厚は特に制限さ
れるものではないが、通常、３０〜５００μ程度である
。

本発明において、「成形」の第二は、基材を用いること
なく、成形用原液を直接に内部が実である糸や中空糸、
又はペレット等に形成することである。

このようにして成形用原液が所要の形状に成形されると
、次いで、その成形物を主として水からなる凝固液に接
触させ、成形物に含まれる有機溶剤を水と置換させるこ
とにより、成形物表面に微孔を有する薄い緻密層を形成
させると共に、内部に比較的粗大な多孔質層を形成させ
る。

即ち、ＥＶＡ重合体からなる異方構造のゲルを形成させ
る。

凝固液は水単独でもよいが、好ましくは水にリン酸塩、
ホウ酸塩、トリス（オキシメチル）アミノメタン等の緩
衝剤や、ボウ硝、硫酸アンモニウム等の無機塩類を溶解
させておく。

酵素の活性低下を防ぐためである。

成形物の凝固温度は通常、０〜３５℃の範囲であるが、
好ましくは０〜２０℃である。

３５℃よりも高温にすると、この重合体のゲル化の過程
で酵素が失活する傾向が大きく、まだ、形成される緻密
層の微孔が大きくなって、酵素の溶出が起こりやすくな
るからである。

本発明においては、緻密層の微孔孔径は、上記のように
、成形物の凝固温度によっても制御することができるが
、また、成形用原液中のＥＶＡ重合体の濃度によって制
御することができ、更に、成形用原液を所要形状に成形
した後、凝固液と接触させる前に、数秒乃至数時間にわ
たって成形物から有機溶剤を蒸発させることによって制
御できる。

従って、酵素や基質の種類に応じて、酵素反応が円滑に
進むように、上記の方法を適当に組合せて緻密層の微孔
が設計されるが、通常は、その平均孔径０．００１〜０
．０１μの範囲であり、また、緻密層の厚さは通常０．
０５〜０．５μである。

一方、多孔質層は一般に平均孔径０．０５〜１０μの細
孔を有し、場合によっては重合体が欠落した空洞を有す
ることもある。

成形物を凝固液と接触させて、異方性のゲル構造を形成
するに当っては、成形物の全表面を凝固液と接触させ、
かくして酵素反応の際に基質水溶液が接することとなる
すべての成形物表面に緻密層を形成する。

従って、この場合の「表面」とは、前記したと同じであ
る。

従って、例えば成形用原液をシート状や管状の基材に塗
布したときは、これら基材を凝固液に浸漬すれば、成形
物の全表面を凝固液と接触させることができる。

しかし、成形用原液を中空糸に成形する場合には、二重
管状ノズルを用い、外側の環状部から成形用原液を押出
して中空糸に形成すると共に、特に、中空糸の内側表面
に凝固液を接触させるために、中央の孔から中空糸の内
側に凝固液を供給することが必要である。

本発明において用いる酵素は、微生物菌体内酵素のよう
に細胞内に存在する酵素でもよいし、細胞から分離抽出
した酵素でもよい。

酵素は必らずしも高度に精製されている必要はなく、抽
出液や部分精製品も用いられる。

更に、本発明に従って単一の酵素を固定化してもよいが
、複数の酵素を固定化してもよい。

酵素の具体例としては、アミノ酸オキシダーゼ、カタラ
ーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコース・オキシダ
ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ
、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ベルオキシダ
ーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アスパラギ
ン酸アセチルトランスフエラーゼ、アスパラギン酸アミ
ノトランスフエラーゼ、グリシンアミノトランスフエラ
ーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸アミントランスフエ
ラーゼ、グルタミン酸−ピルビン酸アミントランスフエ
ラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチル
トランスフエラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フジクトキ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチルトランス
フエラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼのような転移
酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ
、アミノアシラーゼ、アミラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−
アルギニンデイミナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ
、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラ
ス．トシダーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリ
プシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダー
ゼ、パパイン、ヒヤウロニターゼ、プラスミン、ペクチ
ナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペブシン、ペニシリナーゼ
、ペニシリンアミダーゼ、ホスホリバーゼ、ホスファタ
ーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポヌクレアーゼ、レン
ニンのような加水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキ
シラーゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニアリア
ーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアーセ、フマラー
ゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リンゴ酸シンテターゼの
ようなリアーゼ、アラニンラセマーゼ、グルコースイソ
メラーゼ、グリコースホスフエートイソメラーゼ、グル
タミン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセ
マーゼのような異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、
グルタチオンシンターゼ、ピルヒン酸シンターゼのよう
なリガーゼ等を挙げることができる。

以上のように、本発明の固定化酵素は、表面に微孔を有
する薄い緻密層と内部の比較的粗な多孔質層とを有する
異方性のゲルに酵素が固定化されているので、この多孔
質層のゲル格子内で酵素は大きい酵素活性を有するよう
に自由度が確保されると共に、表面の緻密層によって、
従来、包括法による酵素固定において重要な欠点であっ
た酵素の溶出を阻止し、従って、長期にわたる使用にお
いても、固定化酵素の活性が高く維持されるのである。

更に、本発明によれば、ＥＶＡ重合体のゲル化において
、架橋剤や放射線を用いることなく、ＥＶＡ重合体を水
と接触させるものであるから、ゲル化の段階で酵素活性
が低下するようなことがない。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れらによって何ら制限されるものではない。

実施例 Ｉ ＥＶＡ重合体（エチレン単位含量１３重量％、日本合成
化学工業■製ンアレツクスＦＨ）の９８モルチケン化物
２５ｇを水３５ｇとｎ−プロパノール４５ｇからなる混
合溶剤に加熱しつつ溶解した。

別に、α−キモトリプシン２ｇを水ＩＦＷに溶解した後
、ｎ−プロバノール５ｇを加えて上記酵素を混合液中に
分散させた。

この酵素分散液を、２５℃の温度にまで冷却した上記重
合体溶液に加えて混合し、酵素を分散させ、脱泡して成
形用原液を調製した。

次に、厚さ０．１ｍｍのポリエステル不織布をこの成形
用原液に浸漬した後、ロール間を通して全体の厚さを０
．３ｍｍに調整し、３０秒間空気中に放置して、成形物
から水及びｎ−プロバノールの一部を蒸発させた。

次に、これを３重量チのボウ硝水溶液に０℃の温度で約
１時間浸漬し、基材と一体の成形物中のｎ−プロパノー
ルを水と置換してＥＶＡ重合体をゲル化させた。

このゲルを基材と共にリン酸塩緩衝液（０．０５Ｍ、ｐ
Ｈ７．０）にて十分に水洗し、本発明の固定化酵素を得
た。

このようにして得た固定化酵素をＮ−アセチル−Ｌ−チ
ロシンエチルエステルの０．２５ｍｇ／ｍｌ水溶液（５
０ｍＭ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液）を基準とし、２５
℃における反応によって、基質水溶液の２３７ｎｍにお
ける吸光度を１分間に０．００１減少させる活性を１ユ
ニット（Ｕ）とするとき、固定化酵素は５．１Ｕ／ｃｍ
２の活性を示した。

また、同様にしてこの酵素反応を繰返したとき、第１０
回目の活性は４．８Ｕ／ｃｍ２であって、繰返し使用に
おいても、活性が非常に高く維持された。

比較例１ ポリエステル不織布の片面にのみ全体の厚さが０．２５
ｍｍになるように成形用原液を塗布した以外は、実施例
１と同様にして固定化酵素を得た。

この固定化酵素は第１回目の反応では５．３Ｕ／ｃｍ２
の活性を示したが、１０回目には、活性は０．４９Ｕ／
ｃｍ２で低下し、繰返し使用における活性の低下が顕著
であった。

実施例２ ＥＶＡ重合体（エチレン含量２５重量％、ケン化度９９
．８モル％、■クラレ製エバールＥＰ−Ｆ）５０ｇをジ
メチルスルホキシド１８０ｇに加熱溶解し、３０℃に冷
却した。

ウレアーゼ２．５ｇをイオン交換水１０ｇに加え、これ
に更にアセトン１０ｇを徐々に加えて、酵素を微粒子状
に分散させた。

この酵素液を上記重合体溶液に添加、攪拌して、酵素を
一様に分散させ、脱泡処理した。

次に、こうして得た成形原液をポリエステル不織布の両
面にそれぞれ厚さ８０μに塗布した後、直ちに０℃の水
中に２時間浸漬し、ゲル化させた。

これをトリスー塩酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ６．７）に
て十分に水洗して、本発明の固定化酵素を得た。

この固定化酵素を３重量多尿素水溶液（０．１Ｍ，ｐＨ
６．７のトリスー塩酸緩衝液）を基準とし、２０℃にお
ける反応によって、１分間に１ｎモルのアンモニアが発
生するとき、この固定化酵素の活性を１Ｕとして、１２
．２Ｕ／ｃｍ２の活性を示した。

また、同様にして、この酵素反応を繰返したとき、第１
０回目の活性は１０．９Ｕ／ｃｍ２であった。

比較例２ 実施例２の成形原液をガラス板上に厚さ１５０μに塗布
し、実施例２と同様にして、ガラス板と共に水中に浸漬
してゲル化させた後、ガラス板から剥離して膜状固定化
酵素とした。

実施例２と同じ酵素反応について、活性は第１回目が４
．８Ｕ／ｃｍ２、第１０回目は１．９０Ｕ／ｃｍ２であ
った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １エチレン単位３〜４０重量％及び酢酸ビニル単位６０
   〜９７重量％よりなるエチレンー酢酸ビニル共重合体の
   酢酸ビニル単位の８０モル％以上がケン化されている重
   合体からなり、微孔を有する緻密な表面層と比較的粗な
   多孔質の内部層とが一体に連続して形成された異方性の
   ゲルの格子中に酵素が固定化されていることを特徴とす
   る固定化酵素。 ２エチレン単位３〜４０重量％及び酢酸ビニル単位６０
   〜９７重量％よりなるエチレンー酢酸ビニル共重合体の
   酢酸ビニル単位の８０モル％以上がケン化されている重
   合体を水と混和し得る有機溶剤に溶解し、この重合体溶
   液に酵素を溶解又は分散させ、かくして得た成形用原液
   を所要形状に成形した後、この成形物の全表面を主とし
   て水からなる凝固液と接触させ、成形物中の上記有機溶
   剤を水と置換して上記重合体をゲル化させることを特徴
   とする固定化酵素の製造方法。 ３成形用原液をシート状多孔質基材の両面に塗布して成
   形した後、基材と共に凝固液に浸漬することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の製造方法。 ４成形用原液を管状多孔質基材の内外両表面に塗布して
   成形した後、基材と共に凝固液に浸漬することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の製造方法
   。 ５成形用原液を二重管状のノズルの環状部から押出して
   中空糸に成形し、上記ノズルの中央孔から凝固液を中空
   糸内に供給すると共に、中空糸を凝固液に浸漬すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の
   製造方法。