JPS5888319A - ステリン結合抗原性蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗体産生促進物質に関し、更に詳しくはステリ
ン結合蛋白質およびその製法およびその免疫学的応用に
関する。

本発明に係る物質は、抗原性蛋白質と３位に水酸基を有
し１１位に脂肪族炭化水素を有するステリンとを結合さ
せた化合物である。抗原性蛋白質としては、経消化管的
および経呼吸器管的に感染をおこす病原菌またはウィル
スのワクチンに使用される細菌またはウィルスに関連す
る蛋白質、例えばジフテリア曹毒素、コレ）曹毒素、イ
ンフルエンザウィルスの血球凝集素。

並びに各種アレルギー疾患の原因となる蛋白質、即ち、
食餌アレルギーの原因となる食餌由来の蛋白質、祁粉ア
レルギーの原因となる植物由来の蛋白質、直毛アレルギ
ー疾患因となる動物由来の蛋白質、ダニや蜂などＯ虫ア
レルギーの原因となる寄生虫、昆虫由来の蛋白質などが
あげられる。上記蛋白質に結合′ｌＩぜるステリンとし
ては、ステリン骨格のムｓｓ位に水酸基を有しＤｉｉｌ
Ｆ位に好ましくは比較的長鎖の脂肪族炭化水素基を有す
るステリンである。例えばコレステロール、シトステロ
ール、スティグマステロールなどがあげられる。蛋白質
と該ステリンとを結合させるには、常法によってステリ
ンの３位の水酸基と蛋白質の構成アミノ酸側鎖上の水酸
基またはアミノ基、例えばセリン、スレを二ンの側鎖の
水酸基、リジンの側鎖のアミノ基等とを二塩基性酸、炭
酸等によって架橋的に結合させればよい。例えばステリ
ンをジカルボン酸の反応性誘導体例えばコハク酸、グル
タル酸の無水物、モノハロゲン化物、アジピン酸のモノ
ハロゲン化物等と反応させて、該ジカルボン酸のモノス
テリンエステルに変換適せ、次に残余のカルボキシル基
を反応性誘導体、例えばハロゲノ炭酸エステルを使用す
る混合酸無水物などで活性化し良後蛋白質と反応させる
か、または前記ジカルボン酸のモノステリンエステルを
縮合剤例えばジシクロへキシルカルボジイミドのような
脱水剤の存在下で蛋白質と反応させることによって、目
的とするステリン會結合した抗原性蛋白質を得ることが
できる・ 本発明に係るステリン結合抗原性蛋白質は１生体内で種
々の作用を有する。その主なものとして、次の２つの作
用があげられる◎ 本発明に係るステリン結合抗原性蛋白質を経口的に投与
することによｐ、生体の抗体産生を刺戟促進し、血中に
感染肪禦効釆を有するＩｇＭ局所免疫維持の九めに重要
な役割を演じているの原因病原体として、例えばチフス
菌、コレラ菌、ジフテリア菌、舒兎病菌、百日咳菌、結
核菌などの病原細菌、インフルエンザウィルスなどの病
原ウィルスなどが知られている。これら病原体による疾
患に対する予防法又は治療法として鉱ワクチンがよく使
用されている。ポリオの生ワクチンは現在知られている
最も有効な経口ワクチンで娶るが、多くの他のワクチン
は対象の病原体の感染経路が経消化管的１＋は経呼吸器
管的であるにも拘らず、その投与方法は皮下注射によっ
ている。このような接種方法においては産生される抗体
は主として血中に見い出され、その抗体は免疫グロブリ
ンのうちの工ｇＭおよびＩｇＧ抗体である。経消化管的
又は経呼吸器管的感染を起す病原体の感染防禦において
は侵襲する病原体を感染経路の第１の部位、即ち口腔、
腸管又は気道で捕捉し、その感染能力を失わしめるのが
最も望ましいにも拘らず、現在のワクチン投与法では局
所感染防禦に重要な役割を果す分泌ｆｆ１１ｇム抗体の
産生を誘導させる能力ｔもたないためにこれができない
。また現行のワクチンの多くは、水酸化アルミニウムを
抗原の吸着剤およびアジュバント物質として用いている
が、この物質は工―抗体の産生管弦く誘導するため〔イ
ムノロジー　１１巻４６頁（１１１８１年）〕、ときに
副作用として重篤な即時城アレルギーを発現させること
がある。本発明に係る物質は、経口的に投与することに
よシ、このような不利点を解消したものであル、副作用
の極めて少い、且つ局所免疫に働きｔ−もつＸｇム抗体
の産生を誘導し、経腸管的又鉱経気道的感染を感染経路
の第１の局所で防禦することができるものである。

よく知られているように、細胞膜の構造は脂質二重層か
らなっている。極性脂質分子のうち親水性部位は直接外
界および細胞内部に接し、疎水性部位絋疎水結鉱によっ
て互に平行に並んだ二重構造をとる。本発明者郷はステ
リンのＤ積の１１位に存在する疎水性基と対称的位置に
あるムｌｌｓ位に抗原性蛋白質を結合させてこれｔ−経
口投与することによシ、疎水性部位は細胞膜の極性脂質
分子内Ｋｌｌ没し、抗原性蛋白質部分は細胞膜表面に保
持され、このようにして細胞表面に強く結合された抗原
性蛋白質は、消化器系および呼吸器系粘膜固有層に豊富
に存在するリンパ組織の免疫担尚細胞、例えばマクロフ
ァージ、！細胞、Ｂ細胞膜いは形質細胞と接触して、こ
れらの細胞に抗原刺戟を与えて、その抗原に対する抗体
、即ちＩｇＭ、Ｉｇ（）のみならず工ｇム抗体を産生ず
る機会は、通常のワクチンより遥かに増大すると考え所
期の結果を得て本発明を完成し九ものである。生体にお
ける工ｇム抗体産生のｗＡ構の詳細に関しては未だ解明
されていないが、その大部分が粘膜固有層のリンパ組織
で産生され、一部鉱血中に放出され、他の一部はＪ−・
ｈａｔｎを介して二量体とな）、更に上皮細胞で産生さ
れた５ｓＣｒ＠ｔｏｒｙ　ｏｏｍｐｏｎ＠ｎｔと結合し
て局所感染防禦作用を有する分泌聾工ｇムが腸管に放出
されるといわれている〔最新医学３１巻４号ｒｏｔ頁（
１９１７年）〕。

本発明におけるステリン結合抗原性蛋白質は経口投与す
ることにより生体に対して有効に抗原刺戟管与えること
ができ、血中には感染防禦効果をもつｒｇＭ　、　工ｇ
ムおよび工ｇＧ抗体を産生せしめ、腸管には局所感染防
禦効果を有する分泌ｍＸｇム抗体を産生させることので
きる、医療用として極めて価値を有する抗原刺戟剤であ
る。

経口投与用の製剤としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤
、シロラグ剤等の通常の剤形が使用され、使用ｔは抗原
の種類、年令、体重、体質および病状等によって異なる
が、成人１日ＩＬＩＩ７〜２２＠［であって１日１度又
は教皇に分けて投与される。

１７１２に本発明に係るステリン結合抗原性蛋白質を非
経口的投与例えば静脈内注射１７’ｔは皮下注射によ〕
工ｇｌ特異的免疫反応を抑制することができる。前記の
ように、即時型アレルギー反応はＸｇＮ抗体が関与して
発現することが知られておシ、この抑制にはＸｇＭ抗体
産生の抑制が菫ましい。現在多くの研究者がこの命題に
取組んでおシ、数多くの報告がなされているが、その研
究の方向はいくつかある。第１の方向は目的とする抗原
を自己生体成分に結合し良ものを投与する方法〔ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー　４巻！ｅ１
頁（１＠１４年）；フエデレーション・グロシーデイン
グス　３６巻１１８４頁（１８７７年）〕、または免疫
原性の弱い高分子に結合したものを投与する方法〔ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイシン　１３
６巻１４０４頁（１１７２年）：”クリニカル・アンド
・エクスペリメンタルーイムノロジ−３１巻４＠＠”Ｒ
Ｃ１９Ｔｔ１年）；同誌　３３巻２１頁（１１Ｆ＠年）
；ジャーナル・オブ・イムノロジー　１２２巻　１１１
８＠ｊ（（１１７１１年）；バイｔケミストリー　１８
巻・−０頁（１１１年）〕であシ、この方法により部分
的な或いは完全なＩｇｌｌｌ免疫反応の抑制は達成され
るが、目的とする抗原の適用範囲が低分子のハプテンに
限定されることが多く、蛋白質のような高分子抗原への
応用が困難な場合が多い。第１の方向は、目的とする抗
原を変性させて投与する方法〔ジャーナル・オブ・イム
ノロジー　１１６巻１２＠Ｔ頁（１９１１年）〕であシ
、この方法は花粉アレルギーの原因抗原であるラグウイ
ード（ｒａｇｗ＠ｅｌ）抗原のようなものにも適用され
ているが抑制が完全ではない。第３の方向は、抗原性蛋
白質を合成ポリアルコール高分子化合物と結合させて投
与する方法〔インターナショナル・アーカイブス・アレ
ルギー・アンド・アプライド・イムノロジー　８６巻１
５８頁（１ｓｔｓ年）；ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー　１２ｓ巻４０？頁（１９１年）〕である。この方法
によると、抗原特異的およびＩｇｆｔ特異的な免疫抑制
が強力に達成されると云われているが、合成ポリアルコ
ール高分子自体が生体にとって異物であシ、長期投与に
よる毒性等に不安が残る。第４の方向は、結核菌に目的
とする抗原を結合させる方法〔ジヤーナル・オブ・イム
ノロジー　１１７巻３Ｉ＠買（１１７１年）〕である。

この方法では、結合させる担体である結核死菌Ｏ毒性ｍ
に問題が残る。

このように、従来工ｇｌ免疫反応を人為的に抑制し、生
体にとって不利な即時的アレルギー反応を制圧すべく多
くの研究がなされているにも拘らず、種々な面で不完全
なものであり良。本発明に係るステリン結合抗原性蛋白
質はこのような不利点を解消したものである。非経口投
与方法として社主として静ｉｉｔ＊射によるが、皮下注
射４行ないつる。投与量としては、抗原の種類、年令、
体重、体質、病状によっても異なるが、成人１日１・雫
〜２１ｍ度であって１日１度又は数置に分けて投与され
る。

試験例１゜ 後記実施例１で得られるコレステロール結合卵白アルブ
ミン〔以下、コレステロールヘミサクシネート卵白アル
ブミンをＯｈｏｌ−ｍｕ・−０ム、コレステロールへミ
グルタレート結合卵白アルブｉンをＯｈＯｌ−ｇｌｕ−
０ムと略記する。ｔた卵白アルブミンに対するコレステ
ロールの結合モル数（エピトープ濃度）を示すときは例
えばｏｈｏｘ−−１・翫◎−〇ムの如く記して卵白アル
ブ尤ン１モルに対シコレステロールヘミサクシネート　
Ｓモルが結合していることを示すものとする。また卵白
アルブミンをＯムと略記する。〕を実験に使用しえ。

ＢムＬ）／　Ｏマクス（雌、生後８〜１０週令）１鮮場
匹につき、試験マクスには０ｈｏｌ−ｓｕＣ，。

−〇ムを１μｇ　＃　１００４ｇ　＃　１　ｑ／　ａｎ
ｉｍａｌ／　ｔｉｍｅを、対照マクスにはＯムのＩ　Ａ
ｇｅ　Ｉ　Ｍ９／ａｎｉｍｌＬｌ／　ｔｉｎ・　を夫々
経口投与した。投与は１日間隔で５回投与し、その後２
週間放置してから連日Ｓ回投与し、更に２週間放置して
から連日５回投与し良。蛾初の投与からＳ遍目以降、血
中のＩｇＭまたはＩｇＧ抗Ｏム抗体価を間接赤血球凝集
反応〔ジャーナル・すブ・エクスベリメンタル参メデイ
シン　・３巻１０７頁（１１７１年）〕によって測定し
、Ｉｇム抗Ｏム抗体価は酵素抗体側定法〔酵素抗体法（
医学書院刊、１１７１年）〕試験例１ 試験例１では、０ｈｏｌ−ｓｕｅｌ、、−０ムの投与ス
ケジュールとして、週１回投与したが、この投与方法で
は投与初期においては有効な抗体産生が認められず、連
日投与を蝶じめてから抗体産生が発現したので、本例で
はＩＩＩＦＩ匹のマウスに投与初期から連続的に投与し
た。“投与方法は１回当、９２００μｇ　の投与を行い
、最も有効な抗原刺＠を与える０ｈＯ１−１１ｕｏ−０
ムのエビドーグ濃度をも併せて検討し良。

実施例１において調製されたエビドーグ濃度の異なる３
種類のａｈｏｌ−ｓｕｅ　−ｏム標品を用いた。

第２図に示されるようにＣｈｏｐ　−ｓｕ　ｏ　ｔｓ−
０ム、０ｈｏｌ　−５ｕａ４．、−０ム・マえは０ｈｏ
ｌ−ｓｕｅ、　ｔ、ｏ　−０ム１ｓ品を投与した結果、
ａｈｏ：ｔ−５ｕｅ、、−ｏムよ）もａｈｏｘ−ｓｕｅ
、、−ｏムまたは０ｈｏｌ−ｓｕｅ　、　ｔ、ａ−ｏム
の方がより有効な抗原刺戟を与えることが明らかである
。

上記Ｓ６品は、ウサギを０ムで免疫して作られ九抗Ｏム
抗血清との関に１試験管内で沈降反応を起しつる抗原性
を保持しているが、エピトープ濃度を更に大きくし九〇
ｈｏｌ−ｓｕｅ、、−０ムでは試験管内抗原性を失なっ
ていることも明らかにされた。０ｈｏｌ−ｓｕａ、、−
０ムは経口的に投与しても抗０ム抗体の産生は認められ
なかった。以上り結果からｃｈｏｌ−ｓｕａ−ｏムのエ
ピトープ濃度は、小さすぎてもまた大きすぎても良い抗
原刺戟を与えることができないことが判る。

試験例１ 試験例１および２では、コレステロールを結合させた蛋
白抗原として０ムを用いたが、本試験例ではヒトガンマ
グロブリン（以下、ＨＧＧと略す）ｔ−使用し、コレス
テロール結合ヒトガンマグロブリンを用いて試験例１お
よび２と同業の方法で１群５匹のマウスに経口投与した
。

この標品の経口免疫能を以下のようにして検討した。

ＧｈＯｌ−Ｂｕ（ｌ　ｓ、ｏ−ＩＩＧＧの１ｐｇ、　　
１０　ｐｇｔたは１００１０Ｏｓ対照としてインｆｉク
トのＨ（）（）のｔ　ｊｉｌｇ。

１０　Ａｇおよび１００　＃ｇ／ａｎ１ｍａｍノ投与量
で連続的に経口投与した。いずれの投与量によっても、
０ｈｏｌ−ｓｕｅ、、−ＨＧＧ投与群がＭＧＧ投与群よ
〕も高い血中ＸｇＭおよびＩｇＧ抗体童庄を起すことが
認められた。

試験例４ コレステロール結合抗原性蛋白質の急性毒性試験として
、Ｃｈｏｐ−ｓｕｅｌ、ｏ−ＯＡま九は０ｂｏ１−ｓｕ
ｏｓ、ｏ−ＥＧＧを夫々２０５９１群５匹のマウスに投
与したが何等の異常も認められなかった・試験例１ 工ｇｍ４１異的免疫抑制作用を０ｈｏｌ−ｓｕｅ、、−
０ムおよびＯｈＯＮ−ｇＮｕ　ａ。−０ムを使用して検
討した。

ＢＡＬＢ１０マクス（雌、ｌ〜１０週令）１群５匹にイ
ンタクトの０ム１０岬を水酸化アルミニウムゲル（以下
、ａｌｍｍと略す）３Ｍｇに吸着させたものを腹腔免疫
した。対照評祉そのｔ′＞経日的に尾静脈から採血し、
血清中のＩｇｌ抗０ム抗体価をラットを用いた４時間７
０ム反応〔イムノロジカル・メソツ１′″ニブラックウ
ェル出鷹（ＩＩ＠４年〕〕で測定した。試験群はｏｈｏ
ｘ−ｓｕｅ　　−０ＡｔたはＯｈｏｌ−ｇｌｕ、、−０
ムを２０８　ｐｇ／Ｌ！Ｉ ａｎｉｍｏｘ／ｌｉｎ・で連日６回またはｌ　＃　／　
ａｎｉｍｍ１１回を０ムとａｘｕｍの腹腔免疫と同時に
静脈投与し、以後対照群と同様・に採血し、血中１ｇｌ
抗０ム抗体価を測定した。第３図に見られるように、対
照群は免疫後次第に工ｇｘ抗体価の上昇を認め、第３週
以後プラトーに達し、長期間高い抗体価を艙持した。一
方Ｃｈｏｌ−ｓｕｏ８．５−　ＯＡ　ｔたはｏｈｏ１ｇ
１ｕ６．、−０ム腹腔投与群のうち２００μｇｌ１回連
日投与群は、２週目以後、ＸｇｌｌＪ抗体価の激減が認
められた０１９１回投与群においても不完全ではあるが
抗体価の減少は認められた。第４図は同じ動物の血清中
の工ｇＭ　ｔたはＸｇＧ抗０ム抗体の推移を示している
。本図から明らかなように、ＺｇＭ　ｔ　次は工ｇＧ％
異的抗０ム抗体価には全く影響を与えないか、極めて僅
かな影響しか与えなかった。

以上の結果紘、Ｃｈｏｐ−ｓｕａ８．、−０ムまたはｃ
ｈｏｘｇＩｕｅ、ｏ−ＯＡいずれのコレステロール化抗
原でも、好ましくはその中等用量の持続的投与によ夛、
”ｇ”特異的な一次免疫反応の抑制を＃ｔソ完全に達成
できることを示す。

一般にＸｇｍ免疫反応は極めて持続的な免疫反応である
。例えば花粉アレルギーにおいては、毎年、原因抗原で
ある花粉が空気中に散布される季節になると患者はアレ
ルギー反応に悩まされる。このような患者はｏｎｇｏｉ
ｎＨの免疫反応を発現しておシ、その抑制は前記種々の
抑制方法では困難であった。このようなＯｆｌｇＯｌｎ
ｇ　ＯＩｇｌ免疫反応を抑制することは実際の臨床に望
噛れることである。この点についての本発明者等の成果
を次に具体的に示す。

試験例１ 試験例Ｓと同様にＢＡＬＢ１０マクス１群５匹にインタ
クトのＯＡの１０・肉とａｌｕｍ　Ｓ　１１１１とから
なる懸濁液を腹腔に免疫した。ｏｎｇｏ　ｉｎｇのＩｇ
ｌ免疫反応が達成された第２１白目よ？）、０ｈｏｌ　
−ａｕａ　　−０ムｉたはａｈｏ　ｘ　　ｇ　１ｕ　６
．ｏ−０ムｔ２００　ｓｇ＆５ 連日Ｓ＠または１Ｍ９１回静脈注射し、その後のＩｇｌ
抗０ム抗体価とＩｇＭおよびＸｇ（ｋ　ｖｃＯム抗体価
を経口的に測定した。第Ｓ図に示すように、コレステロ
ール結合ＯＡを投与したいずれの群も、初めからＩｌｌ
＠　、　Ｔ週目にかけて著しい工ｇｌｌ抗０ム抗体価の
減少が認められた。第６図はＩｇＭまたは工ｇＧ抗Ｏム
抗体価の推移を示しである０いずれの群の抗体価も対照
群のそれに比較して差＃−ｊ認められなかった。

以上の実験成績は、コレステロール結合０ムがＯｎｇＯ
ｌｎｇのＩｇｌｌ＋免疫反応も特異的に抑制することを
示しており、その臨床的価値は高いものと推定される。

次に本発明者等はコレステロール結合ＯＡによるＸｇ］
Ａ特異的な抑制について、その抗原特異性を検討した。

試験例Ｔ。

０ム　１０　ｐｇと豚回虫（Ａｓａａｒｉｓ　ａｕｕ）
よシ抽出した虫体蛋白質（以下、ムｇｏと略す）１０μ
ｇとをａｌｕｍの３４に吸着せしめ良悪濁液ｔ−１群５
匹のマウスの腹腔内へ免疫した。直ちに、０ｈｏｌ−ｓ
ｕｅ、５−０ムｔｌ　Ｑ　Ｑ　Ａｇ／ａｎｉｍａｌの用
量で連日Ｓ囲靜脈注射し、その後経日的に採血し、血中
ＸｇＭ　、　ＩｇＧ　ｔたＢｘｇｓ抗０ム抗体価、及び
Ｉｇｌ抗ム−０抗体価を測定した。第２群のマウスには
０ムとム−Ｃの免疫を同様に行い、その後の０ｈｏｌ−
ｓｕｅ、、−０ム靜脈注射を除いえ、第３群マウスには
０ム単独で１１ｔｕ＋ａと共に免疫した。本脚はコレス
テロール結合ＯＡの代シに、インタクトの０ム會２００
　声ｇづつ同様に１回静脈注射した。

第１図は第１．第２．第３群マウス０１ｇｌ抗Ｏム抗体
価と、第１．第１群マウスＯＸｇＭ抗ム−・抗体価の推
移を示している。本図から明らかなように、第１群マウ
スではＸｇ’ｌＡ抗０ム抗体価とＸ−抗ムｎｏ抗体価は
第２週以降持続的に高値を保った。一方、第１群マウス
のＩｇｌ抗ム−・抗体価が第２群のそれと同等の推移を
示したが、ＸｇＭ抗０ム抗体価絋第鉱週で一時的な上昇
を示したのみで、第宜週以降完全に抑制され、その抑制
線長期間維持され良。第３群マクスのＸ−抗Ｏム抗体価
は第２群のそれよｐむしろ高値を示した・第８図は第１
、第１、第３群のＩｇＭまたはＩ−抗０ム抗体価の推移
を示している。本図から明らかなように、いずれの群の
抗体価もほり同等であった・以上の実験成績は、０ｈｏ
ｌ−ｓｕｅ、、−０ム島置が抗原ＯＡの工ｇｌ免疫反応
のみを特異的に抑制する作用を有し、０ムに無関係な抗
原には何等の影蕃ももたないことを示している・またＯ
Ａに対するＸｇＭ免疫反応の抑制はコレステロール結合
０ムを処置することによってのみ達成され、０ムのみの
処置では達成できないことを示している。

次に実施例をあげて、ステリンを蛋白質に結合させる方
法を具体的に説明するが、本実明嬬これによって限定さ
れるものではない・実施例１゜ 両　動物性ステリンとしてコレステロチルを用い、その
へ識サクシネートおよびヘミグルタレート誘導体を作成
した。

ピリジン　１００　ｗＬｌにコレステロール　１０Ｆを
溶解する。更に無水コハク酸２　！１．　ＩＩ　Ｆを加
え１１０〜１２０℃で２時間加熱還流する０反応液を氷
水１００　ｉｕ　Ｋ注加し、酢酸１２・ｄを加えて中和
し、析出せる結晶をＦ職する。水で嵐く洗い温結晶を得
る。これをエーテル　４１１１１ｊＫ１１解し、水１・
０１１ｊで３回洗った後、溶諜を留去すると固形物が得
られる。これを酢酸エチル　１００　ｗＬｌで再結晶す
ると融点１７１１〜１ＦＩ　Ｃのコレステロールヘミサ
クシネート　１１１１ｆが得られる。

上記実験において無水コハク酸を使用する代〕に、無水
グルタル酸１＆＠ｔを使用して同様に反応を行ない、後
処理し、シリカゲルを使用し九カラムクロマトグツフィ
ー（移動相（へ呼サン；酢酸エチル−４：１））によシ
精製し、更に酢酸エチル　３０ＷＩＩによシ再結晶する
と融点１２２〜１２４℃を有するコレステロールへ１ゲ
ルタレ−）ｌｅａＦが得られみ。

に）　コレステロールへ主サクシネート４１５Ｉｆ（（
ＬＯ＠！Ｉｍｏｘｅ　）をジオキサ＞ＬＢＭＩに溶解し
た。水冷下撹拌しながらトリーｎ−ブチルアミンａ、１
１７ｍ１（０，１７ｍｍｏｌｅ　）　ｆ；加え、更にイ
ソブチルクロロホルメート　１１．＄＠１９（亀・・１
ｍ　ｍｏｌ・）を加えて３０分攪拌し、活性化コレステ
ロール液とする。卵白アルブミン（０ム）４５０ａ１１
　（＆０１　ｍ　ｍｏｌｍ　）を（ＬＩＭホウ酸緩衝液
（ＰＨ１４）５１Ｌｌに溶解し、この溶液に先に得られ
た活性化コレステロール液を滴下する。全量を約ＳＯ分
間かけて滴下した後４時間攪拌を続ける。

反応液を１００００１”、］＞、”で３０分間遠心分離
し、上滑液を水に対して２４時間透析した。透析内液を
セファデックスＧ−２５カラム（８Ｘ４！１α）でクロ
マトグラフィーを行ない、溶出し九蛋自分画を集めて、
０ｂｏ１−ｓｕｅ−０ムとした。結合したエピトープ濃
度をコレステロール　すキシダーゼを用いた酵素法にて
測定した結果ｏｈｏ１−ｓｕａ−ｏムでは＆Ｓモルであ
った。

上記実験において、コレステロールヘミサクシネートの
代シにコレステロールへミグルタレ”　）　　４ＬＳ　
ＩＮ　（０，０１ｓｍｍｏｌ・）を使用して同様に実験
するとエピトープ濃度１０モルを示すＯｂｏｅ−ｇｌｕ
−Ｏｈ　；６Ｅ　得６　ｔＬ　ｈ　。

エピトープ濃度の異なったコレステロール結合蛋白標品
を得るため、次０Ｅ１１の結合操作を行つ九。

コレステロールヘミサクシネー）　　！！ｌ０１ｖ（Ｂ
　＠　ｔｍｒｎｏｌ・）をジすキサン　！−に溶解し、
これに駅す−ｎ−ブチルアミン　仏＠１２１Ｌｌ（１ｍ
ｍｏ１・）ｔ−加える。混合液を水冷下撹拌し、インブ
チルクロロホルメート　・８１ｖ（ａ５５ムｏｌ・）を
加え、３０分間攪拌して活性化コレステロール液とする
。Ｏム　４ｓ・Ｗ９ｔ−１−のホウ酸緩衝液に濤解し、
こＯｏム溶液を５ＩＩｊづつ（α＠０１１　ｍｗｈｏｌ
・）３りＯビーカーに移す。それぞれを水冷下撹拌し、
先の活性化コレステロール液ｔｚ倍モル、ｙ、ｓ倍モル
を良ａｔＳ倍モル加えた。以後は先に述べ良と同様Ｋｌ
Ｋ験を行ない実験後の処理をすると夫々０ｈｏ）−ｓｔ
ｉａ、、−０ム、０ｈＯ１−ｓｕｅ　　−ｏム、０ｈＯ
１−ｓｕｅ、　ｔ、ｏ−０ムの標品が０ 得られ丸。

結合蛋白質として、０ムの代〕にヒトガンマグロブリン
（ＩＩＧ（））を用い０ｈｏ１−ｓｕｅ　−１１０Ｇ　
。

Ｏｈｏｌ−ｇｌｕ−１１（）Ｇを調整した。１倍モルの
活性化コレステロールを加えた場合のエピトープ濃度は
１．６モル、１０倍モルを加えた場合は−モルであった
。

エビドーグ濃度は添加する活性化コレステロール量によ
って比較的容易に調節できるＯ実施例２ 植物性ステリンとしてスティグマステロールおよびシト
ステロールを、使用した。

に）　ピリジン　１００−にスティグマステロール１０
Ｆを加えて溶解する。更に無水コ／１り酸２４．２ｆを
加え１１０〜１２０　℃で２時間加熱還流する。

反応液を氷水５ｓｏＷＬｌ中に注加し酢酸１１１０−を
加えてｐＨ４に調整し、析出せる結晶ｔ−ｐ取する。

水で良く洗い温結晶を得る。これをエーテル４００１に
溶解し、水１０Ｇ−で３＠洗った後エーテルを留去する
と粗結晶が得られる。この粗結晶を酢酸エチル　５０ｍ
に加熱溶解し、活性炭を加えて脱色して冷却する。再結
晶によって得られ九スティグマステロールヘミサクシネ
ート標品はτＬＯで単一のスポットを示し、融点１■〜
１＠６℃であった。収量は１ｓである。

上記実験においてスティグマステロールの代シにシトス
テロール　１０１を使用して同様に反応生骨ない、反応
後の丸環をすると融点１１１．１〜Ｉ＠ＩＩＣを示すシ
トステロールヘミサクシネ−）　　１１ｔが得られる。

ＣＢ）　　スティグマステロールへ貫サクシネート４１
　ＩＩＰ（ｒＬＨｍｍｏｌｅ　）をジｔｄｔ４ｔ＞　　
２ｗＪＫ溶解し、更にトリーｎ−ブチルアミン　６ＨＩ
Ｉｊ（０，１１１ｗａｍｏｌ・）を加えた。混合液を水
冷下攪拌し、インブチルクロロホルメート　１１１ｖ（
Ｑ、（ｉｌｌ　ｍｍｏｌ・）を加え３６分間攪拌し活性
ステロール液とする。９％のＯムホウ酸緩衝液溶液Ｓ１
に上記の活性ステロール液を加え、水冷下４時間攪拌し
反応液を水に対して透析する。透析内液をセファデック
スＧ−４８０カラムクロマトグラフイーを行い蛋白質の
主分画を採取するとスティグマステロール結合ＯＡ−（
５１ｔ１ｇｍａ−ｓｕａ、６−０ム）が得られた。

上記実験においてスティグマステロールへ電サクシネー
トの代シにシトステロールヘミサクシネー）　　４１．
２〜（α０１１　ｍｍｏｌｅ　）を使用して同様に反応
を行ない反応後の処理をすると、シトステロール結合０
ム（８ｉｔｏ−８ｕＯ４，ｏ−ｏム）が得られる。

また、上記の実験において−チ０ム溶液を使用する代り
Ｋ、　　ＩＩＪ−のＥＧＧホウ酸緩衝溶液１８　ｍ　（
０，０１ｍｍｏｌｅ　）を使用して同様に反応を行ない
、後処理するとスティグマステロール結合ＨＧ　（）　
（８ｔｉｇｍａ−ｓｕＣｔ、ｏ　−ＨＧＧ　）およびシ
トステロール結合ＨＧ　Ｃｋ　（８１ｔｏ−１ｕＱ、、
−Ｉ！ＧＧ　）が得られる。

による抗０ム免疫反応」の結果を示す口０は０ｈＯ１−
ｓｕｏ、、−ＯＡ　１　＃ｇ％Δは同１００　Ｊｇｓ口
は同１〜、・はＯＡｌμｇ、　ｘは同１１１９投与の結
果である。

第２図は「コレステロール結合ＯＡのエビドーグ濃度の
影響」を示す。ｏ　ｌｄ　０ｈｏｌ−ｓｕｅｌ、、　−
一〇ム、Δは０ｈｏｌ−ｓｕａ４−０ム、口はＯｈ　ｏ
　１−ｓｕｏ　１１−〇ム投与の結果である。

第３図は「コレステロール結合０ムによる一次１ｇｌ抗
０ム免疫反応の抑制」を示す・Ｏは０ｈｏｌ−ｓｕｅ、
、−０ム２００　ＪｌｇＸ　！！　％Δは同ＩＷ９Ｘ１
、＊　Ｕ　ａｈｏＮ　ｇｌｕ　６．０−０ム２０＠　ｓ
ｇｘ　５　％口は同１ダ×１投与の結果であシ、×は対
照である。

第４図は「コレステロール結合０ムによる一次ｘｇＭお
よびＩｇＧ免疫反応への影響」を示す。

図中の符号は第３図と同意義。

第５図は「コレステロール結合０ムによる継続的１ｇ１
ｌｌ抗０ム免疫の抑制」を示す。図中の符号は第３図と
同定義。

＠６図は「コレステロール結合０ムによる継続的１ｇＭ
およびＩｇＧ抗Ｏム免役反応への影響」を示す。図中の
符号線菌３図と同定義。

第Ｔ開拡「コレステロール結合０ムによる抗原特異的１
ｇ１Ｃ抗０ム免疫反応の抑制」を示す。

０は第１９の抗ＯＡ抗体価、・は同抗ムー〇抗体価、△
は第２群の抗０ム抗体価、ム拡同抗ムｌ抗体価ミロは第
３群の結果を示す。

第・図は「コレステロール結合０ムによる抗原特異的Ｘ
ｇＭおよびＸｇ（）抗０ム免疫反応への影響」を示す。

Ｏは第１群、Δは第１群、口は第３群の結果である。

全図中の矢印は薬物投与の時期を示す。

特許出願人　三共株式会社 代理人　弁理士樫出庄治 （ＯＬ　”０１）ＹＨｄ Ｃｇ６０１）ｖ：）ｄ 第５図 介　　　　　　　　　　　　　　　↑す↑↑↑ｅｅｋ 第６図 介　　　　　　　　　　　　　　↑↑↑Ｔｉｅｅｋ 第７図 制用１ 第８図 介↑↑↑ｔ↑ ｅｅ　ｋ 手続補正書（自発） 昭和５７年１１月１ｑ日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、　４１件の表示 昭和５６年特許願第１８５６４７号 ２　発明の名称 ステリン結合抗原性蛋白質 ３　補正乞する者 事件との関係　特許出願人 住所　〒１０３東京都中央区日本橋本町３丁目１番地の
６名称　　　（１８５）三共株式会社 代表者　増締役社長　河村喜典 ４代理人 居所　〒１４０東京部品川区広町１丁目２番５８号三共
株式会社内 ６　補正の対象 ［明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明
の欄Ｊ ７　補正の内容　　別紙の通り １　明ＩＩｔＩＩ書の特許請求の軒囲ケ次のようにＡ］
−止する。

ｆｉｌ＋　　３位ＶＣ水酸基を有し１１位にｖａ肋族欠
化水索基馨南するステリンヶその３位水酸基にあ・いて
抗原性蛋白質と梨橋的に結合場せにステリン結合抗原性
蛋白質。

（２）　３位に水叡基馨有し１７１■に廂肋娃炭化水紫
基ケ南するステリンをジカルボン酸の反応性誌導体と反
応させて該ジカルボン酸のモノステリンエステルン製造
し、次いでこれン反応性鋳導体に変換した後抗原性蛋白
質と反応させるか又は該ジカルボン酸のモノステリンエ
ステルを縮合剤の存在下で抗原性蛋白質と反応させるこ
とを特徴とする３位に水酸基を有し１１位に）Ｊα肪族
炭化水索基馨Ｍするステリンをその３位水酸基において
抗原性蛋白質と架橋的に結合させたステリン結合蛋白質
の製法。

（３）３位に水酸基を有し１１位に脂肪族炭化水素基な
有するステリンをその３位水酸基において＃ＪＬ原性缶
臼賀と架橋的に結合させたステリン結合抗原性缶白ｗｙ
ｒ王剤とする経口および打気迫免疫刺戟剤。

（４）３位に水酸基を南し１７位に屈肪族炭化水素基ン
会するステリンをその３位水酸基において抗原性蛋白質
と架橋的に結合させたステリン結合抗原性蛋白−ケ王剤
とする非杆口Ｉ（７Ｅ抗体Ｎ２生抑制創。　　　　　　
　　　　　　」２　明鯛噸１重第７貴第６行の 「保持きれ、」欠 １保持されるものと推定した。」と訂正する。

３　四組１６頁第１６？Ｔ−第１７行の［この標品の・
・・・・・・・・　した。］ン削除する。

４１０ｊ第ｔＳＩＥ！第１９行の ［ＨＧＧの１μｇＪケ ｒＥＧＧを１μｇＪと６１正する。

５　同第１７頁第６行の 「抗原性」ケ削除する。

６　声」第１Ｔ員第１４行の 「０Ａ１０１ｎ９」な ［０ＡＩＯμｇ１と訂正する。

Ｉ　同第１８自第２打の ［’　ａｎｌｍｏｌＪ　ｙｌ ［ａｎｉｍａ／　Ｊ　と訂［ヒする。

Ｙ・人　　Ｌ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）１位に水酸基を有し１１位に脂肪族炭化水素基を
   有するステリンをその３位水酸基において抗原性蛋白質
   と架橋的に結合させたステリン結合抗原性蛋白質。
2. （２）３位に水酸基を有しｔｙ位に脂肪族炭化水素基を
   有するステリンをジカルボン酸の反応性誘導体と反応さ
   せて誼ジカルボン酸のモノステリンエステルを製造し、
   次いでこれを反応性誘導体に変換し九後抗Ｊ［性蛋白質
   と反応させるか又は該ジカルボン酸のモノステリンエス
   テルｔａ合剤の存在下で抗原性蛋白質と反応させること
   を特徴とする３位に水酸基を有し１Ｔ位に脂肪族炭化水
   素基を有するステリンをその３位水酸基において抗原性
   蛋白質と架橋的に結合させたステリン結合蛋白質の製法
   。
3. （３）３位に水酸基を有し１１位に脂肪族炭化水素基を
   有するステリンをその３位水酸基において抗原性蛋白質
   と架橋的に結合させたステリレ結合抗原性蛋白質を主剤
   とする経口免疫刺戟剤。
4. （４）　３位に水酸基を有し１１位に脂肪族炭化水嵩−
   基を有するステリンをその３位水酸基に訃いて抗原性蛋
   白質と架橋的に結合させたステリン結合抗原性蛋白質を
   主剤とする非経口Ｉｇｌｌ抗体童抗体創生抑