JPS5830035B2 - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素の製造方法に関するものである。

より詳しくいえば、酵素反応を連続的に行なわせる際に
好適な、繰り返し使用することができる粒子状の酵素担
持体を、所望の酵素を含有させた光重合性化合物で粒子
状体を被覆し、該化合物を光重合させて製造する方法に
関する。

従来、工業用あるいは臨床検査用として酵素を利用する
際、それを固定化し、繰り返し使用することができるよ
うになされていた。

そして、これまでにその固定化技術として、適当な担体
に酵素を化学的又は物理的に結合させる担体結合法、酵
素同士を共有結合させる架橋法及び高分子母体中又はマ
イクロカプセル中に酵素を包蔵させる包括法などが開発
されて来たが、いずれの方法においても、その固定化処
理の際に酵素を変質させ、その活性度を低下させるとい
う欠点があった。

他方、固定化酵素の用途によっては、粒子状の形態のも
のが要求される分野もある。

そして、このような粒子状の固定化酵素を製造する方法
としては、担体に単量体と酵素との混合物を付着させ、
重合させる方法が知られている。

しかし、この方法は重合条件下で単量体と酵素とが反応
して、酵素の不活性化を生じたり、あるいは未反応の単
量体が残存し、所定の酵素反応に対し悪影響を及ぼすな
どの欠点がある。

本発明者らは、このような従来方法のもつ欠点を克服し
、高い活性度を維持したまま酵素を固定化し、しかも有
効表面積の大きい粒子状の形態とする方法を開発するた
めに、鋭意研究を重ねた結果、特定の高分子化合物と水
に不溶な粒子状体とを用いることの目的が達成できるこ
とを見い出した。

この方法は、光活性基を側鎖に持つ高分子化合物が遂次
的に光橋かけ反応を起こすことにより網目構造を形成す
ることを利用するものであり、連鎖的に橋かけ反応が起
こる光重合系感光性樹脂米米の場合に比べて、光の透過
を妨げる担体粒子の存在が酵素の光固定化に不利と考え
られたが、この方式で粒子状体の重合ができることは、
意外のことであった。

本発明は、このような知見に基づいて完成したものであ
る。

すなわち、本発明は、酵素を含有する光架橋性高分子化
合物で非水溶性粒子状担体を被覆し、これに光を照射し
て光架橋性高分子化合物を重合させることにより製造す
る方法を提供するものである。

本発明において用いられる光架橋性高分子化合物は、そ
の側鎖に、一般式（１） 〔式中のｍはＯ又は１〜６の整数１ 、Ａは式 （ただし、式中のＲ１はアルキル基、アリール基又はア
ルアルキル基、Ｘ−は強酸の陰イオン残基である）で示
される基である〕 で表わされる構造単位を１以上有するポリビニルアルコ
ール又はそのヒドロキシル基の水素原子がアセチル基で
部分的に置換されたものである。

※※ この部分的にアセチル基で置換されたポリビニ
ルアルコールは、水溶性である点において好ましくその
アセチル基含有率は３０モル％未満であることが望まし
い。

また、これらのポリビニルアルコール系重合体は、その
重合度が２００〜３０００であることが好ましい。

重合度が低すびるとこれらを架橋させて不溶化する際に
要する光照射時間が著しく増加し、反対に高すぎると重
合体の粘度が大きくなってその取扱いが困難になる。

本発明において用いられる光架橋性高分子化合物は、ポ
リビニルアルコール又は部分ケン化ポリビニルアルコー
ルと一般式（Ｕ） （式中のｍ、ｎ及びＡは前記一般式（１）におけるもの
と同じである） で表わされるホルミル基を有するオレフィン化合物若し
くはそのアセタール誘導体とを酸触媒の存在下、水中で
高分子アセタール化反応させることにより得ることがで
きる。

この一般式（ＩＩ）で表わされる化合物を例示すると、
その人がピリジニウム基のものとして、 Ｎ−メチル−α−（ｐ−ホルミルスチリル）ピリジニウ
ム、 Ｎ−メチル−γ〜（ｐ−ホルミルスチリル）ピリジニウ
ム、 Ｎ−メチル−α〜（ｍ−ホルミルスチリル）ピリジニウ
ム、 Ｎ−アリル−α−（ｐ−ホルミルスチリル）ピリジニウ
ム、 Ｎ−アリル−γ−（ｐ−ホルミルスチリル）ピリジニウ
ム などの塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、過塩素
酸塩、メト硫酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−）ルエン
スルホン酸塩が、 アセタール基のものとして、 １−メチル−２−（ｐ−（ホルミルメトキシ）スチリル
〕ピリジニウム、 １−メチル−４−（ｐ−（ホルミルメトキシ）スチリル
〕ピリジニウム、 １〜メチル−４−（ｍ −（ホルミルメトキシ）スチリ
ル〕ピリジニウム、 １−メチル−４−（ｏ −（ホルミルメトキシ）ステリ
ル〕ピリジニウム １−メチル−２−（ｐ−（３−ホルミルプロポキシ）ス
チリル〕ピリジニウム、 などの塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、メト硫
酸塩、メタンスルホン酸塩が、 キノリニウム基のものとして、 ２−（ｐ−ホルミルスチリル）キノリニウム、４−（ｐ
−ホルミルスチリル）キノリニウム、１−メチル−２−
（ｐ−ホルミルスチリル）キノリニウム、 １−メチル−４−（ｐ−ホルミルスチリル）キノリニウ
ム、 １−エチル−４−（ｐ−ホルミルスチリル）キノリニウ
ム、 １−（２−ヒドロキシエチル）−４−（ｐ−ホルミルス
チリル）キノリニウム、 １−ベンジル−４−（ｐ−ｔ、ルミルスｆ ＩＪ ／Ｉ
／ ）キノリニウム、 １−メチル−２−（ｐ−（ホルミルメトキシ）スチリル
フキノリニウム、 １−メチル−４−（ｐ −（ホルミルメトキシ）スチリ
ルフキノリニウム、 １−メチル−４−（ｍ −（ホルミルメトキシ）スチリ
ルフキノリニウム、 １−メチル−４−（ｏ −（ホルミルメトキシ）スチリ
ルフキノリニウム、 ｌ−メチル−２−（ｐ−（３−ホルミルプロポキシ）ス
チリルフキノリニウム、 １−メチル−２−（ｐ−（２−ホルミルエトキシ）スチ
リルフキノリニウム などの塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、メト硫
酸塩、メタンスルホン酸塩がある。

一般式（１）で表わされる光架橋性高分子化合物の製造
において、これらの一般式（ＩＩ）で表わされる化合物
は、ポリビニルアルコール系重合体のビニルアルコール
単位当り０．２〜１５モル％の割合で用いることが望ま
しく、ポリビニルアルコール系重合体の水溶液濃度は２
〜２０Ｗ／Ｗ％の範囲が好適であり、触媒として用いら
れる酸は、有機酸又は無機酸のいずれであってもよく、
好ましくは塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸及びメタン
スルホ／酸、ｐ−）ルエンスルホン酸などの有機酸であ
り、酸を多く使用する程反応時間を短縮することができ
、通常、溶液の州が４以下になるように使用される。

また、その反応温度は室温〜１００℃の範囲が適当であ
り、反応時間は通常１〜２４時間程度である。

水溶液中での高分子アセタール化反応の進行状態は、ア
ルコール中に反応液の一部を注入し、生じた沈殿を水に
溶かしてスチリル系共役残基に基づく吸収極大を測定す
ることにより知ることができ、また、反応液の感光性の
感度を経時的に測定することによっても知ることができ
る。

後者の方法は前者に較べより簡便である。

反応の完結した溶液は、そのまま感光液として用いるこ
とができる程に高感度のものである。

この反応完結溶液を、例えばアセトン又はエタノールな
どの多量の貧溶媒中に注入し、生じた沈殿を分離し、ア
ルコールで洗うことにより、反応生成物を精製すること
ができる。

この際、少量のアンモニアを含むアルコールで洗うか、
再沈殿処理を繰り返すかすることにより、酸を十分に取
り除くことができる。

このようにして得られた光架橋性高分子化合物は、水に
易溶性で光感度が非常に高く、分子中に一般式（Ｉ）で
表わされる基を０．１〜１０モル％含有し、波長４３０
〜５６０ ｎｍの波長の光に感光して重合し、不溶化す
る。

本発明において用いられる非水溶性粒子状担体としては
、特に制限はなく、例えばアルミナ、シリカゲル、二酸
化チタン、カオリン、活性炭、ベントナイトなどの無機
物、セルロース、アガロースなどの多糖類、ポリアクリ
ルアミド、ナイロン、フェノール樹脂などの有機物があ
り、その粒度が数メツシュー数百メツシュの粉末状ない
し粒状のものが好ましい。

本発明方法に従えば固定化酵素は次のようにして製造す
ることができる。

すなわち、光架橋性高分子化合物を水に溶解して濃度１
〜４０Ｗ／Ｗ％程度の水溶液とする。

この際、加熱すれば溶解が促進される。

次いでこの水溶液に所望の酵素をそのまま若しくは水溶
液として加える。

この溶液における酵素濃度は用途や酵素の種類などに応
じて異なるが、通常約０．１〜２０Ｗ／Ｗ％とする。

このようにして得た水溶液をかきまぜながら、これに水
に不溶な粒子状担体を少量ずつ添加する。

このとき、粒子状担体は通常、光架橋性高分子化合物に
対し１〜１０００重量倍が使用されるが、この範囲に限
定されず、担体の大きさ、酵素の種類などによって適宜
変えることができる。

また、粒子状担体として吸湿性のものを用いれば、溶液
中の水分を吸収し、光架橋性高分子化合物の付着性がよ
くなる上に、その表米米面はべたつくことなくサラサラ
としており、そのまま次の露光処理をしてもよいし、あ
るいは、この粒子状担体と酵素含有感光性高分子水溶液
との混合を明室内で行うだけで固定化が達成されるので
好都合である。

次に、この酵素を含有した光架橋性高分子化合物で被覆
された粒子状担体をそのまま又は脱水乾燥しこれを粒子
状にほぐしたのち、光照射する。

この際の光源としては、特に制限はなく、例えばキセノ
ン灯、けい光灯、高圧水銀灯、太陽光などを使用するこ
とができる。

照射時間は、光架橋性高分子化合物の種類、被照射体の
含水率などにより相違するが通常１〜６０分である。

この光照射の際、担体を被覆する光架橋性高分子化合物
の重合を完全に行なわせるため、粒子状担体をかきまぜ
ながら光照射することが好ましい。

この光照射により光架橋性高分子化合物は、次式で示す
ように三量化反応を起す。

この光二量化反応により、光架橋性高分子化合物は不溶
化する。

この不溶化反応は酵素の存在下であっても円滑に進行す
る。

したがって、大気中で酵素の固定化処理を行なっても支
障がない。

本発明方法により固定化することができる酵素としては
特に制限はなく、例えばインベルターゼ、グルコアミラ
ーゼ、ウレアーゼ、トリプシンなどの加水分解酵素、グ
ルコースオキシターゼ、キサンチンオキシターゼなどの
酸化還元酵素、その他カタラーゼ又はこれらの混合物な
どであり、これらの酵素は、光架橋性高分子化合物が酵
素の静電状態に与える影響が極めて小さいため、その活
性度を殆んど低下することなく、高い活性状態で安定に
固定化される。

本発明の固定化酵素はそのままで十分実用に供しうるが
、さらに酵素の安定性及び耐久性を高めるため、グルタ
ルアルデヒド処理、グルタルアルデヒド・ジアミン処理
などを施してもよい。

本発明方法によれば、容易な操作で効率よく酵素を固定
化することができ、得られた固定化酵素はその表面積効
果により能率よく酵素反応に関与し、特にカラム状に充
てんするなどして、連続的な酵素反応を繰り返し行なわ
せる場合に有利である。

次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するととも
に参考例として本発明における光架橋性高分子化合物の
製造例及びその感光特性を掲げる。

参考例 ｌ Ｎ−メチル−α−ピコリニウム−ｐ−）ルエンスルホン
酸塩５ｇとテレフタルジアルデヒド１０ｇとをエタノー
ル２０ｒＩＬｌに加熱溶解し、これにピペリジ７５滴を
加えて３時間還流したのち、冷却し、次いでエタノール
約１０ｒｒＬｌを減圧留去したものに酢酸エチルを加え
、生成した黄色沈殿をデカントにより分離し、これを酢
酸エチルで２回洗ったのち熱エタノールに再び溶解し酢
酸エチルを除徐に加えて鮮黄色の結晶を得、ｐ側稜酢酸
エチルで洗って乾燥した。

収量は５．５７９であった。重合度１７００の８７％ケ
ン化ポリビニルアルコール１５．９を熱水２００ｒＩＬ
ｌに溶解したものに、先に得たＮ−メチル−α−（ｐ−
ホルミルスチリル）ピリジニウム−ｐ−）ルエンスルホ
ン酸塩３．５ｇ及び８５％リン酸８ｇを加え、６５℃で
１４時間かきまぜながら反応させたのち、この反応液を
アセトン２１に細い流れとして注加しかきまぜ、沈殿物
をデカントして分離し、メタノールで３回洗った。

次いでこのものを、再び温水２００７１Ａ’に溶解し、
この溶液をアセトン２１に注加し、生成した沈殿物を分
離後メタノールで１度洗ったのち、乾燥し、光架橋性高
分子化合物１４．８ｇを得た。

このものは増感ポリケイ皮酸ビニルに対し、９倍の感度
を示した。

参考例 ２ ｒ−ピコリン２７．７ｆＩとテレフタルアルデヒド５９
、（ｌとをキシレン１５０ｒｒＬｌに加熱溶解したもの
に無水酢酸４２．２ｍｌを加え、６時間還流したのち、
還流管を常圧蒸留装置に換え、生成した酢酸を留去し、
留分約１００ｒｆＬｌを分離した。

この留出処理の後半では留分の沸点は約１３０℃であっ
た。

冷却後、暗褐色の残油をアセトン１５０１ｎＩ！と混合
し、７時間以上放置して黄色の結晶を析出させ、これを
戸別し、アセトンの少量で洗い、この洗液と溶液との混
液にエタノール１００ｒＩＬｌを加え、さらにジメチル
硫酸４８ｇをかきまぜながら加え、かさ高い黄色結晶を
得た。

これを−夜装置したのち戸別し、直ちにエタノールで洗
浄し、Ｎ−メチル−γ−（ｐ−ホルミルスチリル）ピリ
ジニウムメトサルフエー）７４．１６ｇを得た。

次に、ポリビニルアルコール（ケン化度約８７％、重合
度１７００）５０ｇを蒸留水６５０１１Ｌｌに溶解した
ものに、Ｎ−メチル−γ−（ｐ−ホルミルスチリル）ピ
リジニウムサルフェート７、５．９を加え、均一溶液と
し、この溶液に８０％リン酸３０、！９を加え、５０〜
６０℃で５時間かきまぜた。

反応終了後、反応液を大量のアセトンにかきまぜながら
注加し、生成した沈殿物を戸別し、浸漬型抽出器でメタ
ノールによる連続洗浄をし、真空乾燥した。

このようにして得られたものは、その紫外線吸収スペク
トル特性からスチルバゾリウム基約１．１モル％を含有
していることがわかった。

またその感度は、重クロム酸アンモニウム６重量％を含
有するポリビニルアルコール（ケン化度約８７％、重合
度１７００）が示す値の約１２倍であった。

参考例 ３ ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド５０ｇと水酸化カリウ
ム２３ｇとをメタノール５０ｒＬｌに溶解したのち減圧
下に溶媒を留去し、乾燥してカリウム塩とし、Ｎ−メチ
ルピロリドン６０１７１Ａ’に溶解したものに、クロル
アセトアルデヒドジメチルアセクール７１を加え、１５
０℃で１５時間加熱還流した。

得られた反応液を冷却後、これにジクロルメタン２００
ｍ１！を加え、水で３回洗い、次いで２０重量％力性ソ
ーダ水溶液５０ｍにより洗い、未反応のヒドロキシベン
ズアルデヒドを抽出回収し、有機層を１回水洗し、無水
炭酸カリウムで乾燥したのち、ジクロルメタンを減圧留
去した。

残油を真空蒸留し、ｂｐ３が１３５℃のＮ−メチルピロ
リドンと１４５℃のｐ−ホルミルフェノキシアセトアル
デヒドメチルアセクールを得た。

再蒸留後の収量は３４．２９であった。

ｍ−ヒドロキシベンズアルデヒド４．８８９と力性ソー
ダＬ６５ｇとを２−エトキシエチルアルコール１０ｍに
溶解したものにプロムアセトアルデヒトジメチルアセク
ール７．４ｇを加え、２０時間還流したのち、反応液を
冷却し、これにベンゼンを加えて１回水洗し、次いでヒ
ドロキシベンズアルデヒドがなくなるまで希アルカリで
洗った。

このベンゼン溶液を無水炭酸カリウムで乾燥して蒸留し
、ｂｐ３１３８℃のｍ−ホルミルフェノキシアセトアル
デヒドジメチルアセクール３．６ｇを得た。

同様な操作により、Ｏ−ヒドロキシベンズアルデヒドか
らＯ−ホルミルフェノキシアセトアルデヒドジメチルア
セクール（ｂｐ５１４７℃）及ヒγ〜（ｐ−ホルミルフ
ェノキシ）ブチルアルデヒドジメチルアセクール（ｂｐ
３１６８℃）を得た。

メタノール７ａにＮ−メチル−α−ピコリニウムヨウ化
物１．６１．Ｆとｐ−ホルミルフェノキシアセトアルデ
ヒドジメチルアセクール１．７ｇとを溶解した溶液にピ
ペリジン０．３ ｍＪを加えて４時間還、流させた反応
液を冷却して結晶を析出させ、これを分離し、少量の冷
メタノールで洗ったのちアセトンで十分に洗い、１−メ
チル−２−［ｐ−（２゜２−ジメトキシエトキシ）スチ
リル〕ピリジニウムヨウ化物２．１１．９を得た。

このもののｍｐは１９２〜１９７℃であった。

同様の操作により、ｍｐ１８１〜１８６℃の１−メチル
−２−（ｍ−（２，２−ジメトキシエトキシ）スチリル
〕ピリジニウムヨウ化物、ｍｐ１６９〜１７３℃の１−
メチル−２−（ｏ −（２゜２−ジメトキシエトキシ）
スチリル〕ピリジニウムヨウ化物及びｍｐ２１９〜２２
６℃の１−メチル−４−（ｐ−（２，２−ジメトキシエ
トキシ）スチリル〕ピリジニウムーｐ−トルエンスルホ
ネートを得た。

次に、ポリ酢酸ビニル（ケン化率８７％、重合度１７０
０）５００ｍｆＩを水７ｒｆＬｌに溶解した溶液に１−
メチル−４−〔ｐ−（２，２−ジメトキシエトキシ）ス
チリル〕ピリジニウムメトサルフェート１８７■を溶か
したのち８５％リン酸０．５ ｒｆＬｌを加え、これを
６０℃で１５時間かきまぜた。

得られた黄色の反応液は高い感光度を示した。

この反応液を大量のアセトンに江別し、反応生成物を沈
殿させ分離し、メタノールで２回十分に洗い真空乾燥し
た。

収量は４２０ｒｒＩ９であった。この精製物は、水溶液
中で波長３７０ ｎｍに吸収極大値を示し、全部がリン
酸塩として存在すると仮定したとき、スチルバゾリウム
基の導入率は紫外吸収スペクトルから２．２モル％と算
出された。

また、この精製物を水溶液とし、これをアルミ板上に塗
布し、乾燥して４５０Ｗの水銀灯を用いてネガ像を透し
て露光し、水で現像すると鮮明な画像が得られた。

この精製物の感度の、重合度１７００のポリけい皮酸ビ
ニルを５−ニトロアセナフテンで増感したものが示す光
感度（１）に対する比（以下相対感度という）は３０で
あった。

また、ピリジニウム塩の添加量を９７．１■及び４９．
５■にし、上記と同様の操作で得たものは、スチルバゾ
リウム基がそれぞれ１．１モル％及び０．７１モル％導
入されており、その相対感度は１２及び９であった。

同様の操作により得た種々のアセタール基を有するスチ
リルピリジニウム塩化ポリビニルアルコールも、優れた
感度を示した。

参考例 ４ ２−メチルキノリン２Ｂ、６９、テレフタルジアルデヒ
ド６７ｇ、酢酸２４ｇ及び無水酢酸４５ｇの混合物を８
時間加熱還流したのち冷却し、析出した結晶をジクロル
メタンに溶かして水洗し、次いで水酸化ナトリウム溶液
で洗って酢酸を除去したジクロルメタン溶液に濃塩酸を
加え、直ちにかさ高い黄橙色の結晶を得た。

この結晶を戸別し、水から再結晶させたのち、約３００
ｍのエタノール中にけん濁し、トリエチルアミンで中和
して加温し、脱塩酸した。

次いで不溶のジオレフィン型化合物３．９９を戸別し、
Ｐ液に水を加えて放置し、２−（ｐ−ホルミルスチリル
）キノリンの黄色の結晶３５ｇを得た。

このものはｍｐ １１２〜１１３℃、λｍａＸ（クロロ
ホルム） ２９７ ｎｍ及び３６０ ｎｍであった。

この２−（ｐ−ホルミルスチリル）キノリン８．１４ｐ
を酢酸エチル３０−に溶解した溶液にジメチル硫酸９ｇ
を加え、６時間加熱還流し、冷却後、析出した結晶をｐ
果し、水から再結晶させて１−メチル−２−（ｐ−ホル
ミルスチリル）キノリニウムメトサルフェートの結晶１
１．１を得た。

このもののｍｐ ２０４〜２１０℃、λｍａＸ（水）２
４５ ｎｍ 、 ２９９ ｎｍ及び３６６ ｎｍであっ
た。

８５％ケン化ポリ酢酸ビニル（重合度１７００）の７．
１ Ｗ／Ｗ％水溶液２１に１−メチル−２−（ｐ−ホル
ミルスチリル）キノリニウムメトサルフェート９０■を
加熱溶解した溶液に８０％リン酸１５０１ｒＩ９を加え
、６０℃で７時間振り混ぜた。

この反応液を大量のアセトン中に注入し、生じた沈殿を
済集し、メタノールで洗い、さらに少量のアンモニアを
含んだメタノールで洗ったのち、再び熱水に溶かし、こ
の溶液をアセト／中に注入し、生じた沈殿をρ集し、真
空乾燥して得たものは、スチリルキノリニウム残基を０
．６５モル％含有シていることが紫外線吸収スペクトル
から判明した。

このもののλｍａＸ（水）は２５２ｎｍ、２９７ｎｍ及
び３７４ ｎｍであった。

また、このものの水溶液をアルミニウム板に塗布し、ネ
ガフィルムを透して４５０Ｗ超高圧水銀灯で露光し、温
水で現像すると明りような像が得られ、その相対感度は
約１，６であった。

同様の操作により１−メチル−２−（ｐ−ホルミルスチ
リル）キノリニウムメトサルフェートを６０■使用して
得たものの相対感度は約０．５であった。

参考例 ５ １．４−ジメチルキノリニウムメトサルフエー）１４．
９５．！９とテレフタルジアルデヒド２２．３５ｇとを
メタノール４０ｍ１に加熱溶解したものにピペリジン０
．５ ｍｌを加え、１０時間加熱還流して冷却し、次い
でアセトン約２００ｒ／Ｌｌを加えて結晶性の沈殿を析
出させた。

この沈殿を済集し、アセトンで洗って１−メチル−４−
（ｐ−ホルミルスチリル）キノリニウムメトサルフェー
トの粗製品＋５．７３ｇを得た。

このもののλ （水）はａＸ ２４５ｎｍ、３３２ｎｍ及び３７６ ｎｍであった。

。次に、このもの３２■を８５％ケン化ポリ酢酸ビニル
（重合度１７００）の８Ｗ／Ｗ％水溶液６ｇに溶解した
溶液に８５％リン酸１５０■を加え、６０℃で３時間か
きまぜ、得られた黄色の反応液をアルミニウム板に塗布
し、ネガフィルムを透して超高圧水銀灯で露光し、水で
現像すると緑色のけい光を発する鮮明な像が得られた。

反応生成物の相対感度は約１０であり、このものの水溶
液は波長３８３ ｎｍの光に吸収極太を示した。

参考例 ６ 参考例３で得たｐ−ホルミルフェノキシアセトアルデヒ
ドジメチルアセクール８．６ｇと１，４ジメチルキノリ
ウム・メト硫酸塩１０．５ｇとをメタノール１０ｒｆＬ
ｌに溶解した溶液にピペリジン１０滴を加え、１日還流
して得た反応液に酢酸エチルを加えて油状物を分離し、
これを放置して結晶を析出させたのち濾過し、結晶をア
セトンで洗った。

この洗液に酢酸エチルを加えると、さらに板状結晶が析
出した。

このようにして得た結晶を少量の熱エタノールに溶解し
たものに、はぼ同浴のアセトンを加え、さらに酢酸エチ
ルを徐々に添加して、山吹き色の１−メチル−４−（ｐ
−（２，２−ジメトキシエトキシ）スチリルキノリニム
・メト硫酸塩の結晶を得た。

次に、約８７％ケン化ポリビニルアルコール（重合度１
７００）２ｇを含む水溶液３０７７１７１！に、この結
晶１７０１ｎ９を溶かしたのち、８０％リン酸５００■
を加え、６０℃で３日間反応させ、得られた橙色の反応
液をアセトンに江別し、反応生成物を分離し、メタノー
ルで十分に洗って真空乾燥した。

このものは、波長４１０ ｎｍの光に吸収極大を示し、
その相対感度は約８であった。

実施例 １ 参考例２で得た光架橋性高分子化合物の１７重量％水溶
液２５９にインベルターゼ（生化学工業社製、２１５
ｎ／■） ４ ｏ１ｎ９を加えて均一な黄色の水溶液と
したものに、シリカゲル（和光純薬株式会社製、ワコー
ゲルＣＣ−２００）３４を乳鉢の中でよくかきまぜなが
ら少量ずつ加えた。

このとき、水溶液中の水分はほとんどシリカゲルに吸収
された。

水分を吸収したシリカゲルは、サラサラとした手触りの
粉末状のものとなった。

このシリカゲルを３５℃で減圧乾燥したのち、直射日光
下で約２０分間かきまぜ、無色の粉末を得た。

この粉末１５０■をｐＨ５の緩衝溶液１０−で洗ったの
ち、ｐＨ５の５％しよ糖水溶液５ａ中にけん濁させ、３
７℃で振とうしながら酵素反応をさせた。

所定の時間が経過するごとに少量の反応液を採取し、グ
ルコスタンド試薬（藤沢メディカル社製）で生成したブ
ドウ糖を比色定量した。

その結果、インベルターゼの全量が均等に粉末表面に固
定化されたものとして酵素活性度を算出するとその値は
７９％であった。

なお、光照射したシリカゲルを洗ったＰＨ５の緩衝溶液
からは、もとのインベルターゼの１１％の活性が検出さ
れた。

実施例 ２ 参考例２で得た光架橋性高分子化合物の３重量％水溶液
２．５．！７にインベルターゼ（実施例１におけるもの
と同じ）９．４■を溶解したものにアクリルアミドゲル
（バイオラド社製、バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ ） Ｐ
−６、２００−４００メツシユ）５．０ｇを加えてよく
混練したのち、−夜風乾し、乳鉢で細粉化し、紙面上に
広げて室内光で２時間曝した。

このようにして得た粉末５．１８９のうち、２００１ｎ
９をｐＨ５の緩衝溶液で洗い、実施例１と同様の測定を
行なった。

その結果、算出された酵素活性は３３％であった。

なお、該洗液の酵素活性は８％であった。

実施例 ３ 実施例２と同様の光架橋性高分子化合物の３重量％水溶
液５．５ｇにインベルターゼ１７．９ｒｖヲ溶解したも
のに中性アルミナ（カラムクロマトグラフィ用活性１
） １６．ｐを加えて混練したのち一夜放置し、風乾後
実施例２と同様にして酵素活性を求めると、その値は１
５〜２６％であった。

なお、洗液の酵素活性は１％であった。

実施例 ４ 実施例６で得た光架橋性高分子化合物の３重量％水溶液
２．５ｇにインベルターゼ（実施例１と同じもの）７■
を溶解したものにシリカゲル（実施例１と同じもの）６
ｇを加えて混練し、この粉末を紙面上に広げて一夜風乾
したのち、さらに室内光下で２時間曝した。

このとき、ときどきかきまぜた。

次いでこれを乳鉢中でよく粉砕し、黄色の粉末とした。

この粉末２００■について実施例２と同様の測定をする
と、その酵素活性は４６％であった。

実施例 ５ 実施例１で得たインベルターゼ固定シリカゲル粉末１．
０４．９に、シリカゲル（実施例１と同じもの）１５．
７，１を混合し、内径２０ｍｍの保温ジャケット付きカ
ラムに充てんした。

次に、このカラムに、ｐＨ５の３％しよ糖緩衡溶液（０
，０１Ｍクエン酸系）を１１／日の流速で滴下した。

このときの温度は２５℃であった。

このカラムから留分を所定臼が経過する毎に採り、これ
を１／１０に希釈し、グルコスタット試薬（実施例工と
同じもの）により、グルコースの生成量を比色定量した
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素を含有する光架橋性高分子化合物で非水溶性粒
   子状担体を被覆し、これに光を照射して光架橋性高分子
   化合物を重合させることを特徴とする固定化酵素の製造
   方法。 ２ 光架橋性高分子化合物が、一般式 〔式中のｍはＯ又は１〜６の整数１ 、Ａは式 （ただし、式中のＲ１はアルキル基、アリール基又はア
   ルアルキル基、Ｘ−は強酸の陰イオン残基である）で示
   される基である〕 で表わされる構造単位を１以上有するポリビニルアルコ
   ール又は部分的にケン化されたポリビニルアルコールで
   ある特許請求の範囲第１項記載の製造方法。