JPS58187185A - 組織培地での細胞の界面成長 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｆ文に示した例に実証される様に、組＃ａ培地を含む乳
ｆ＃ｊ液の分散相液体の小滴表向での細胞伸長と生育は
、４り威されていた。この研究の多くは、フルオロカル
ボン液体で行なわれていた。なぜなら、それから形成さ
れる小滴は、難なく安定化され、乳濁液の破壊で十分析
出し、減菌後に再利用゛　　できるからである。これら
のフルオロカルボンは、毒性が無いこと、不活性、高い
密度（約１．９）、水に不混和性、大部分の他の物質に
対する溶解性が低い、熱や化学物質に安定１，４低い粘
性、１明（顕微鏡観察に関して）及び疎水性の特性を有
する。

使用されたフル、オロカルボン油は、ｙ、ｏ−７０（主
としてペルフルオロアミン鎮）とｙｏ−第２（主として
ペルフルオロヘキサン類）で、ミネソタ州セントボール
、３Ｍ社から市販されている。更に、シリコンオイル（
ダウコーニング７０４）とパラフィン油を用いて研究が
行なわれた。

３Ｔ３−Ｌｌ（正常なマウス胎仔繊維芽細胞）と３Ｖ−
Ｔ２（ウィルス転換のマウス繊維芽細胞）の細胞系を使
用する他に１正常なヒト包皮繊維芽細胞が使用された。

これらの細胞は全部、固定依存物として−いた。

実験ハ、最適蛋白としてゲラチンを用いて報告されたに
すぎないが、コラーゲンやフィブロネクチンも又使用さ
れることができる。

抜瘤された安定乳濁液の＃１４製は、フルオロカルホン
液の１．　Ｏｍｇを、大−（約２．０　ｍｅ　）’のポ
リリジンの水４液（０，０１ＮＫＯＨ中に２　ｎ＠ｔ／
ＩＬｅのポリリジン）中に分散し１、水溶液中に分散さ
れた゛フルホロカルボン液が約１００−４００μｍの径
の大き己の軸間の安定した小滴となるまで、渦動ミキ丈
−（゛慾竺に攪拌して製する。このことを完成するため
に用いた渦動、ミキサーに関する時間／速度の関係は、
機械的操作で決足できる。ボＩＪ　ＩＪリジン分子−ハ
、朧大でなく、十分に安定した乳濁液が３０００から２
４０，０００までの範囲の分子菫のポリリジンを使用し
て＃振されていた。スペルマシン、ポリヒスチジン及び
ポリアルギニンの様な他のポリカチオン類が使用される
ことができる。

ポリリジン水浴敵のに、、ＯＨ含肴龜、溶液のｐＨを（
＆ｌ！Ｉ頗のγミツ群のｐＫ値よりかなり高くするのに
役立ち、この状態（約１２以上のｐ’）’ｒｓポリリジ
シ―、相対的に電荷を帯びない状態にある。

この条件で、ホ′リリジンヲ＝、フルオロカルボン小滴
をポリリジン吸着に単分子層として吸収する表面にわた
って、より一層完全に被覆する。

一度、この安定した乳濁液が形成されると、過剰の水−
で□あるポリ′す′ジンや強塩基（’ｘ　ＯＨ）は、こ
の乳Ｎ４ｉＩＩから除去される。過剰の水層が初めに吸
引除去され、その後、０．１５ＭＮａ０Ｊ水溶液の５〜
６ｍ１３が添加され、その乳濁液とおだやかに混合され
る。過剰水層は再度吸引除去され、この操作は９．５〜
６回くり返される。それから、その操作！Ｊ　’ＮａＯ
，，ｅ’ｆ＃液を動物血清（ＰＨ７，４）を含有する完
全培地で置換し、それによって、フルオロカルボン小滴
が組ｍ培地に分散された希望の安定乳、液を作、たｅＫ
、ユ。培地パリ返ｇ’ｔｊ−る。゛、８低下の結果とし
て、介小滴上のポリリジンフィルムは、正に荷電するよ
うになり、培地中の動物血清蛋白（負に荷電してい７１
＋）’の一層上へのポリリジン吸着が増強される。この
血清蛋白の二番目の単分子層は、又、乳濁液の安定に寄
与し、この二重層ぽ、細胞年長の改良によりしつかりし
た蛋白被覆を供給する。

種々の血清量を有する種々の標準組織培養゛培地が、こ
の発明の実践に使用されることができるけ・れども、抜
擢された培地は、血清にＤｕｌｌｌ・ｏｏｏの変法のＩ
ｉａｇｌ・培地（ＤＭＩＩＭ）をプラスし″たものであ
る。ペニシ゛リン（１００単位／　鵬Ｊ　）とストレプ
トマイシン（１００μｆ　／　ｓＪ　）が受付ケタＤＭ
ＮＭＫ添加された。

その乳濁液へ−の細胞接種は、希値量の細胞浮遊液（完
全培地中に約２１！０ＸＩＯ細胞／　ｗＩＪ　）をその
乳濁液の上にピペットで重層することにより遂行される
。その細胞は、液体中に・沈み、乳＃ｉ［（図１の物質
１０の下層）中の分散相液体の蛋白被覆された小滴に接
触する。適切な雰囲気（空・気−９５襲、ｏｏ、ｔｌ、
相対湿度１００％）で３７℃で十分インキュページ璽ン
した後、細胞は各小満１１’上に固定された蛋白層の上
に広がり、生育し、数多く増加する。図２に略図で示し
た様に、蛋白質１３に付着した細胞１２はこの外表面の
領域の上で生育する。ここに述べた様に１層１４は以前
に応用された高分子物質のフィルムを意味し、生理学的
ｐＨで正荷電を帯びる（すなわち縁りカチオン）。層１
３と層１４との結合を安定化する乳濁液は、もちろん、
１文に述ぺた機な架橋剤の十分量で固定された血清蛋白
層から作られることができる。

大量の細胞増殖が希望゛される場合、その培地は、層１
６の使い尽くした培地を宛期的に＠引除責し、新鮮な滅
菌培地で置換することによって部分的に一層されること
ができる。

細胞培養が、円筒ウェル（直径７襲鵬）を持つ標準微量
滴定板で行なわれる場合、培地と蛋白被覆された分散層
小滴の０２　ｓＪ　（すなわち乳濁液）が、そのウェル
の中へ滴下された。次に、完全培地中の細胞浮遊液（上
の様Ｋ）の０．１−がその乳濁液の上に滴下された。ウ
ェルの容積の残余分は、完全培地で満たされ、ウェル中
の総量を約０４賜Ｊとする。

各々の希望期間のインキエベーシ冒ン後、細胞増殖の程
度は、接種乳濁液の少量をとり、その小滴を位相差顕微
鏡を使用して観察することによって容易に測定される。

細胞数の大量増加（４〜８倍）が、単−蛋白層で被覆さ
れた小滴や固定された蛋白層で被覆された小滴を用いる
ＢＹ−Ｔ２や３Ｔ３−Ｌｌの細胞で観察されていた６結
局、たいていの小滴は、蛋白層の上の繊維芽細胞生長の
一層でおおわれるようになった。

この発明の操作によって、蛋白被覆された分散層小滴に
よって供給された非常に大きな生育面積で生育された大
量の損傷していない細胞は、非常に簡素化され、十分に
収かくされつる。必要とされることは、乳濁液を破壊す
ること、遠心分離にかけること、その上に培地と分散層
（フッ素化炭化水素）との間に形成される界面での細胞
回収である。遠心機の彊さ一層、重力の６０００倍を使
用していた。この大きさの遠心機の強さは、おおよそ数
秒で乳濁液を正常に破壊する。その細胞は、不透明な塊
りとして層の境界ではっきりと可視でき、容易にピペッ
ト操作で除去される。これらの採収された細胞の生育力
は、これらの細胞のいくつかを、適当な細胞培養基質（
ＩＩＩ胞培養に関して処理されたポリスチレン）へ移植
して、その上に完全な細胞培地を供給することで容易に
示威される。

細胞生長の最善の結果が、３Ｔ３−Ｌｌ又は５Ｖ−Ｔ２
細胞゛及びポリリジンで被覆された小滴（直径１００〜
４００μｌ１１）や順に血清蛋白で被覆されたこれらの
ものを含有する分散層としてフルオロカルボン液体（ｙ
ｐ　Ｑ−７，０ＳＩＦ　Ｏ−ｔ　２　）を用いて得られ
た。行なわれたいくつかの他の細胞生長システムや観察
の例が表１に示されている。

細胞生長システムは、準備され作動条件は、１文に述べ
た様に設定される。小滴の大きさは、約１００−４００
μ隅の大きさの範１！にある。他の点が指摘されなけれ
ば、全百分率は容積で行う。

例１や２の観察時間は、２日と４日目であり、一方、例
３や４・の観察時間は、１７時間と２日であった。パラ
フィン油乳濁液の場合は、細胞培地のマトリ′ツクス中
のパラフィン油の小滴は、水性培地の平衡上に浮かべた
。

表　　　　　　１

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施態様を示す断面図で、容器と内容
物は分散相液体の小滴表明に細胞を成長させるためのも
のである。 第２図は組織培地浴中のタンノずり皮積分散相滴の拡大
断面図である。 （図中符号、２） １０を下層 １１：小滴 １２：細胞 １３：タンパク質層 １４：ポリマ一層 ズー勺ヅ　　　　　　プＺ濃 手続補正書（麗） 昭和５８年５月２５日 特許庁長官　　若　杉　和　夫　　　４ノ・１、事件の
表示 昭和５８年特許願第０１５３５３号 λ　発明の名称 組織培地での細胞の界面成長 ４、代理人〒１６６ ６、補正により増加する発明の数

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　下記工程より成る組織培地中の細胞を成長させる
   方法。 イ）第−液を第二液中で分散し多数のタンパク質皮櫃の
   小滴にする乳剤の製造工程。上記第二液は無菌の水性組
   織培地であり、上記第−液Ｇａ４細胞に対し毒性がなく
   上記第二液に比較的混和しないもの。 口）上記乳剤に生細胞を接触させる工程。 ハ）玉記小滴界ｌｊ上で細胞が十分に成長できるよう、
   上記乳剤の温度％ＰＱ、二酸化炭素濃度および酸素平衡
   条件二好適にして十分な時間にわたり培養する工程。 二）上記乳剤を分解する工程、および ホ）第−及び第二の液の間の界面から細胞を分離させる
   工程。 ２　下記工程からなる細胞クローン化のための方法。 イ）生細胞を無菌の水性組織培地に接触させる工程、　
   　− 口）細胞を接触させた上記組織培地の小滴を、水と相対
   的に混和せず上記細胞に対し毒性のない液体中でｍ濁す
   る工゛程、 ノリ　細胞を接触さ゛せた培地の個々の小滴内で細胞が
   十分に成長できるよう好適な温度、ｐＨ，二酸化炭素濃
   度および酸素平衡条件下で十分６時間培養したのち、１
   記非毒性液体より個★の小滴を分離させる工程、及　゛
   び 二）個々の小滴よりクローン化した細胞を分離させる”
   工程。 ３、　下記の工程よりなる細胞の成長方法。 イ）第−液を予め選んだ無菌゛の水性タンパク實溶液中
   で分散し多数の小滴にする乳剤の製造工程。上記第−液
   は生細胞に対し毒性がなく、相対的に水と混和せず水よ
   りかなり比處が大きく、上記の小滴は予め選ばれた上記
   タンパクにより皮覆したもの、 口）上記のタンパク皮覆小滴を沈降させる工程、 二）無菌の水性組織培地を上記のタンパク質皮櫨小滴と
   混合して第二乳剤を形成し、上記タンパク装置小滴が組
   織培地に接触させる工程、 ホ）上記第二乳剤に生細胞を接触させる工程、へ）上記
   小滴界面上で細胞が十分、に成長できるよう、１記第二
   乳剤の温度、ｐＨｓ二酸化炭素および酸素平衡条件を好
   適にして十分な時間培養する工程、 ト）上記第二乳剤を分解する工程、およびチ）組織培地
   と上記第−液の間に形成した界面から細胞を分離する工
   程。 ４　第−峻とそれに接する第二液の間に実質的に平らな
   界面が形成され、上記第−鍛は無酸の組織培地であり、
   上記第二液は生細胞に対し毒性を持たず、かつ上記第−
   液と相対的に混和しないものであって、細胞の成長が行
   なわれるタンパク質層が界面に沿って拡がる組織培地の
   中で細胞を成長させるシステムにおいて、凝固補助薬を
   上記タンパク質層に接触Ｊせることを特徴とする改良さ
   れた方法。 ５　第−猷をそれに接する第二液の間に実質的ンこ平ら
   な界面が形成され、上記第−液は無菌の組織培地であり
   、１紀第二液は生細胞に対し、毒性を持たずかつ上記第
   −液と相対的に混和しないものであって、細胞の成長が
   行なわ第１るタンパク質層が界面に沿って拡がる組織培
   地の中で細胞を改良させるシステムにおいて、上記界面
   が実質的に平板である代りに、乳剤を構成するため、第
   二液を第−液に分散し多数のタンパク皮讃小滴の集りの
   表面としたことを特徴とする改良された方法。