JPS60250256A - 細胞のスクリ−ニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特定の物質を分泌する細胞を不均質な細胞集団
から選択する方法に関する。より詳細には本発明は細胞
培養物（組換えＤＮＡおよびバイブリド′−マ（ｈｙｂ
ｒ　ｉｄｏｍａ　）融合生成物を含む）を、特定の物質
を分泌する生存可能な細胞に関してスクリーニングする
いっそう簡単な方法に関てる。

生物材料の産生および修飾におけろ最近の進歩（たとえ
ば遺伝子工学およびモノクローナル抗体（６） バイブリド゛−マ技術）により、特定の物質を産生する
個々の細胞を識別する必要性が生じた。たとえばモノク
ローナル抗体の産生には、不均質な細胞培養物（特定の
抗体な産生する細胞少なくとも１閘を含む〕と水久細ノ
抱株（たとえば骨髄肺細Ｊ抱）の融合を伴う。最良の条
件ですら融合技術はごく一部成功′１″ろにすぎない。

あろ治旧抱は融合せず、培養物中のある）ｉｌｌ！胞は
骨髄腫細胞とではなく相ｑに融合し、またある骨髄腫細
胞は相互に融合する。

１ことえ細胞培養物中の細胞てべてが骨髄腫と融合した
としても、融合産物のうち必要な物質ケ産生てろものは
ほとんどないであろう。従ってスクリーニング技術によ
り個々の融合生成物を選択てろ必要がある。現在用いら
れているスクリーニング法は、融合混合物から得た細Ｉ
伊？ミクロタイタープレート中で培養し、ミクロタイタ
ープレートの各区画の液体を必要な物質について検定し
、プラスの検定結果を与えた谷区画中の細胞火二次培養
することよりなる。この方法に伴う問題には、二次培養
のために分離てろ際に細胞に物理的損傷を（７） 与える可ｕし性があること、細胞の分離が困難であるこ
と、培養物の汚染の可能性があること、および異物（た
とえば細胞の断片、および高分子量の汚染物質）か必要
な物質についての検定の特異性に与えろ影響が含まれろ
。他の難点は、ある種のＩｐＨｌ　ノｍはミクロタイタ
ープレート中で必ずしも良好に生育しないことである。

組換えＤＮＡ技術も生存ｉＵ［な絹換え体（ｒｅｃｏｍ
−ｈｉｎａｎｔ）乞スクリーニングてろ必要がある。標
草的な組換え体産生技術には、プラスミドまたは他のベ
クター（媒介物）を細胞（普辿は原核細胞生物）に導入
てろことか含まれろ。プラスミドまたはベクターは、細
胞内で転写されて必要とする物質を産生じうろ遺伝子を
含む。バイブリド゛−マ技術に関しては、プラスミドも
しくはベクターと細胞との融合生成物の大部分が、必要
な物質を産生ｆ／；）生存可能な培養物を形成せず、従
ってスクリーニング法が必要となる。バイブＩｌドーマ
の識別に用いられるものと同様な技術は組換え技術に共
通であり、同様な付髄′ｆろ問題が提示される。

（８） 米国特許第４，６５２．８８３号明細書（１９８２年１
０月５日、フランクリン−リムの出願に対し交付；その
記述を参考のためここに引用する）は、生存町ａヒな、
１ｉｌｉ１胞（ハイブリドーマまたは遺伝学的に修飾さ
れた細胞を含む）を半−脅膜内に封入する方法を教示し
ている。封入ののち、カプセル内に置かれた状態で細胞
は健康で生存可１目であり、正常な代謝を行うことがで
き、それらが普辿に分圧てろ物質を分泌し、有糸分裂を
析うことができろ。

上記％許の広い記述によれば、カプセル膜の細孔寸法火
調整して細胞および高分子量の汚染物質の透過をＩＳｌ
止しうろことが最近の実験により示された。この方法で
カプセルの膜を関心のある物質に関″ｆろ検定を促進す
るｆ過材として用いろことができる。リムの特許のカプ
セル封入法は細胞の機械的損傷を防止てる助けとなり、
また細胞の取扱いを簡単にする。

従って、必要な物質を５ｆ〜する細胞を混合細胞培養物
から識別するための新規なスクリーニング法を提供する
ことが本発明の目的である。他の目（９） 的は必要なモノクローナル抗体を産生てるノ・イブＩＪ
ドーマを選択する方法を提供することである。

さらに他の目的は、必要な物質を分〜する遺伝学的に修
飾された細胞を識別てろ方法を提供てろことである。不
発明のさもに＠の目的は、関心のあり物質乞産生丁Φバ
イブＩＪド−マを、該物質を産生てろ細胞少なくとも１
個な含む細胞培養物から識別または選択てる方法を提供
てることである。

不発明のこれらおよび他の目的、ならびに特色は以下の
本発明の要約および記述から明らかであろう。

不発明は必要な物質を分泌′ｆろ特定の細胞をス／７１
Ｊ−ニングまたは識別’ｆろ方法を特色とする。

多数の細胞を含む不均質な細胞培養物な多数個のカプセ
ルにカプセル封入ｆる。細胞は必要な物質を分泌テる細
胞、たとえばリンパ球と永久細胞株（たとえば骨髄１厘
細胞）の融合により産生されたハイブリドーマ、または
遺伝学的に修飾された細胞、たとえば原核細胞と特定の
物質ケ細胞内転写により産生することに関しコード化さ
れた遺伝子（１０） を含有てろベクターとの融合生成物を含むいずれの培養
物であってもよい。カプセルは該物質に対しては透過性
であり、細胞に対しては不透過性である膜により規定さ
れろカプセル内容積をもつ。

膜はあらかじめ定められた童よりも大きな分子量をもつ
分子の透過も′１４ｉｌＩ限てろことができる。ハイフ
リド−マの場合、細胞は１０カプセル−１６に１個より
も多くないハイブリドーマを含む密度でカプセル封入さ
れていてもよい。これはやかてクローンを形成するであ
ろう。カプセル封入された細胞は多数の区画をもつ装置
内で培養され、各区画はカプセル外培地、好ましくは鑑
別生育培地を含む。

選ばれた細胞かカプセル内容積中で該物質を合成し、分
館し、この分館された物質が膜を通過ｌ−でカプセル外
培地中へ入る。各区画のカプセル外培地を関心のある物
質につき検定する。該物質に関しプラスの検定結果を示
て各区画からのカプセルにつき、細胞が識別されるまで
この処理を棟り返て。これらの区画は＋ＭＩＩ胞外培地
およびカプセルを保付するくぼみ（ｗｅｌｌ）であるこ
とか好ましい。

（１１） ハイブリドーマの場合、最初の融合処理からクローンを
生じることができろためスクリーニングが容易になり（
２個以上のハイブリドーマを含むカプセルはないので）
、安定な抗体分圧性ハイブリド−マの単画、が大幅に促
進されろ。

この方法で識別されたカプセルは免疫処理剤として用い
ろことができる。これによればカプセルを動物に注入し
、次いでこれが分館された物質に対才ろ抗体を産生し始
める。

識別されたカプセルを宿主動物に、たとえばマウスの腹
腔内に移植てろこともできろ。次いで分館された物質を
移植部位から、好ましくは移植に応答して宿主が産生じ
た体液から採取てろことかできろ。

本発明はその広い観点において、必要な物質を分館てろ
特定の細胞を得ろために細胞培養物をスクリーニングて
ろ方法を特色とてろ。不方法はハイブリドーマ技術に特
に有用である。リンパ球と永久細胞株（たとえば骨髄Ｉ
＋！　）との融合生成物は、どの細胞が必要なモノクロ
ーナル抗体を産生てる（１２） かを判定′ｆろためにスクリーニングされなければ７１
らないからであり。また不方法は組換えＤＮＡ技術にも
好適である。不発明によれば一般の技術よりも簡単な、
破壊性のより少ない方法でスクリーニング処理欠行うこ
とができろ。不発明は特定の物質を産生てろ固定依存性
細胞の識別に特に好適である。

まず、選択すべき細胞な昔む不均質な細胞培養９勿をイ
坪ろ。あらがじめｄ摺装された＊４１１胞培Ｉ４勿、た
とえばハイブリドーマ培養物もしくは凄伝学的に修飾さ
れた＋１ｉｆｌｌ胞株乞使用してもよく、またはこの目
的のために特に新たな培養物を調製してもよい。

ハイブリド−マ形成法の一例、たとえばＧ、ケーラーお
よびＣ。ミルシュタインにより報告されたもの（°あら
かじめ定められた特異性をもつ抗体ヲ号沁てろ融合細胞
の連続培養″ネイチャー２５６：４９５（１９７５））
は、たとえば少なくとも幾つかは必要な物質を産生てろ
牌臓由来リンパ球の培養物から出発している。この培養
物を常法により、たとえば牌１藏を金網から押し出てこ
とにより個々の細胞（１３） にが割する。閑ｆ１胞を永久細胞株（たとえば骨髄腫細
胞）と混相し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）融合
によりハイブリドーマを形成てろ。より詳細にはリンパ
球と骨髄腫細胞を融合培地、たとえばタルベツコ（Ｄｏ
　ｌ　ｂｅｃｃｏ　）の調製イーグル培地（ＤＭＥＭ）
中でインキュベートし、ＰＥＧ約４０ｑｂを鉦加する。

細胞なＰＥＧ溶液から取出し、スクリーニングの前に培
養物として増殖させる。骨髄肺細胞が抗生物質感受性で
あるか、または培地に添加物を要求″ｆるものであるこ
とが好ましい。

これにより鑑別生育培地（たとえば非融合細胞を死滅さ
せろ薬剤を含有する培地）を分離手段として用いろこと
ができる。生存可能なハイブリドーマが識別されると、
これらが必要な物質を産生じているか否かを判定する１
こめにさらにスクリーニングする必要があろう。

選択丁べき細胞を遺伝学的［修飾てろ場合、たとえばＦ
、ポリバーにより示された形成法（′新たなりローニン
グベヒクルの形成および特性決定■。

ｌ的りローニングシステム′”、ｇｅｎｅ　２　＋　９
５−（１４〕 １１３（１９７７））を採用１ろことができろ。

ゲラスミ１．’またはベクターを制限酵素の使用により
細胞内へ挿入し、この細胞を標準的な方法で培養てろ。

プラスミドまたはベクターは細胞により転写されて関心
のある物質を産生じりる遺伝子を営む。ハイブリド−マ
の場合のように、鑑別生育培地が細胞の選択に有用であ
る。たとえば必要な物質に対しコード化された遺伝子を
含むプラスミドは、融合生成物を非融合生成物から分別
しうろ遺伝子をも含む。たとえばプラスミドはりファマ
イシン感受性細胞に１１フアマイシン附性ヲ与工ろこと
ができ、これによりリファマイシンを含有てろ鑑別生育
培地をスクリーニングに用いろことができろ。

細胞のコロニーが形成されたのち１．紐１胞をカプセル
封入する。先きに引用したリムの特許に示される一般的
手法が好ましい。ミクロカプセルの細孔はリムの％許に
示されろように、ま１こさらに不明細書に示されろよう
に調′ＩＩ６することができる。

不明細書に記載の方法によれば、ＩｇＧ（分子量約（１
５） １６０．０００ダルトン）およびＩｇＭ（分子量約９０
０．０００ダルトン）の双方を分泌てろ細胞を、ＩｇＧ
　は膜の細孔を自由に通過させるがＩｇＭの通過は実質
上阻止てろカプセルに封入することが可能である。カプ
セルの膜は細胞および高分子量汚染物質の通過を阻止′
ｆるフィルターとして作用てろ。

前記のように、リムの特許明細書には好ましいカプセル
封入法が示されている。まず細胞培養物を微細な形に調
製しく周知の方法により）、維持および進行中の代謝過
程の支持に適した水性培地に懸濁てろ。適切な維持培地
、たとえばダルベツコのＰＢＳ培地（Ｃａ／Ｍｇ不含〕
は当業者に周知である。生理的に細胞と親和性の水溶性
物質（これを水不溶性となし、形状保持性、粘看性の一
時カプセルまたはゲル化した葉材を形成ｆろことができ
る）を培地に添加てな。次いで得られた溶液をｎ４１１
胞およびそれらの生育培地を共に含む液滴状となし、こ
れらの液滴をＩＭちに水不溶性となし、一時カプセルを
形成する。このゲル化可能な物質は（１６〕 無青性、水溶性の物質であって温度、ＰＨまたはイオン
環境の変化により、細胞の代謝過程に影響を与えろこと
なく水不溶性となるものでありうる。

好ましくはゲル化可曲な物質は多数の容易にイオン化し
うろ基（１ことえばカルボキシル基またをエアミノ基）
を含み、これらは反対の電荷乞もつ基を多数含むポリマ
ーと塩結合形成により反応しうろ。

現在好ましいゲル化斉１１は天然または合成の多糖類で
ある。不発明に用いられろ他の多ａ翅にはグアーゴム、
アラビアゴム、カラジーナン、ペクチン、トラガカント
コ゛ムおよびキサンクンゴムのｒ腋性画分が含まれろ。

これらの物質は陽イオンとの反応により゛′架橋”′し
て形状保持性の物質とな１ことができ、またイオン交換
または金属イオン封鎖剤により架橋イオン封鎖剤して再
溶解することができろ。

有効に使用ｆゐことができＴニゲル化可能な溶液は、１
．０〜１．５ｑｂ（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム溶液
中に約１０６個／ｍｌの細胞な含む。この溶液ケシエツ
トヘッド装置に押出てことにまり液滴状と（１７〕 なｆ。　ジェットヘッド装置は１、上部の空気取込ノズ
ルを備えた外被およびストッパーに合わせた細長い摩擦
中空体からなる。ステッピングポンプを備えた注射器（
たとえば１０１ｎｌの注射器）を、外板の長さを通で注
射針（たとえば内径０．０１インチ−約［１，２５ｍｍ
のテフロンコーティングし１こ注射針）と共に外被の頂
部に取付ける。外被の内部は、注射針の先端が定常な空
気の層流（エアナイフとして作用する）内に置かれろよ
うに設計されている。使用に際しては、カプセル封入す
ベキ材料を含む溶液を満たした注射器を外被の頂部に取
付け、ステッピングポンプを作動させて溶液の液滴を注
射針の先端へ漸増する力をかけて押しやる。各液滴は空
気流により“切断″され、ゲル化液中へ約２．５〜６．
５確落下し、ここで直ちに架橋イオンを吸収してゲル化
ｆろ。好ましいゲル化液はカルシウムイオン溶液、たと
えば塩水中の１．２４　（ｗ／ｖ）塩化カルシウムであ
る。注射針の先端と塩化カルシウム溶液の距離はアルギ
ン酸ナトＩＪウム／ｉ胞浴液が物理的に最も好ましい形
状である球形（最〔１８〕 大容積／表面績〕をとるの１に十分な程度である。

雷同の空気はストッパーの開「１を神で放出されろ。

ゲル化した形状保持性の回転楕円形の課てなわち一時的
ナカプセル（好ましくは直径５０ミクロンから数ミ＋）
メートルであゐ）は浴液中で別個の層として集合し、吸
引により回収できる。

次いで一１拵カブ七ルの表面層を架橋さぜろことにより
−ＩＪｋカプセルそ」１．ぞれの周りに永久的なＪｌｌ
ｊｊを形成させろ。好ましくは反対′重荷をもつ基多数
を営むポリマーの水浴液な用いて、ゲル化した素材を架
橋させる。カルボキシル化された、または他の酸性の多
糖類ケ使用して一時カプセルを形成てΦ場合、酸と反応
でろ基を含む多価陽イオン性物質、たとえばアミン、イ
ミンまたは了ミドが架橋剤として有用である。現在好ま
しい多価陽イオン性物質にはポリリシン、ポリエチレン
イミンおよびポリビニルアミンが含まれろ。多価ｉ易性
オン性物質はゲル化した素材の多価陰イオン性！Ｉｙｌ
質」二の酸性基と反応して堪結合型の架ａを形成する。

採用１−る系に応じて、この反応により形成された（１
９） 水入的カプセルと遊離陽イオン性基をふさぐ溶液とを反
応させろことが好ましい。これはたとえばカプセルを低
１８度のアルギン酸ナトリウム溶液ト反応させることに
よって行いうろ。

不光明に使用するために考案されたカプセルは、必要な
物質に膜を通過させ、一方これよりも萬い分子量の汚染
物質および細胞を膜内に保持てるのに必要な、分子量に
よゐ〃４過を与えるべく調整された膜をもつ。前記のよ
うにＩｇＧ　Ｙ自由に通過させ、一方ＩｇＭの通過は実
質的に妨げろカプセル封入ｒｉｙ、ｆろことができめ。

細孔寸法の調Ｉｎ補助てろ新しい２方法が開発された。

第１は多層法に基づ（ものであり、第２は水化現象に基
づくものでアル。これらの方法のうち第１の場合は、ゲ
ル化した球体を異なるイオン強度または異なる濃度の多
価陽イオン溶液に浸漬ｆ句。ゲル化した球体の周りに沈
積し１こ物質の層は多層構造を形成で〇。１ことえば一
時カプセルゲ高分子重ポリＩＪシンの溶液に浸漬し、次
いで低分子量ボυリシンまたはポリビニルアミンの溶故
に浸漬１−る。２回目の（２０） 浸漬の効果は、Ｊｌ孔寸法の低下した第２のＪ向を形ノ
戎さぜることである。

第２の細孔寸法調整法は、アルギン酸塩のケル容偵かそ
の水化問に応じて異なり、水化度はそれらか平衡化して
いる余圧イオン溶液のイオン強度に依存ｆ勺という知見
に基づいて開発された。膨張したアルギン酸塩ゲル素材
の周りに形成されろ１嘆は膨張していないケル葉材の周
りの膜よりも均一であり。この現象を、慴なゲルの周り
に形成されろ膜はゲルを膨張させた場合無傷の状態を保
つという知見と合わぜろと、細孔寸法を増大させ、かつ
改良された膜を形成させる方法が得られる。

たとえば約２００．０００ダルトンの刊１孔寸法をもつ
膜（ＩｇＧを放出し、一方■ｇＭ乞保持てるのに十分）
は、ゲル化した素材を低イオン強度の１価陽イオンで平
衡化しかつ膨張させたのち、中程度の分子量の多価陽イ
オン性架橋剤を高密度の細胞含有ゲルの周りに使用する
ことにより形成できる。１価陽イオンの溶液はカルシウ
ムイオンを排除し、ゲルの水化度を尚め、これにより細
孔寸法（２１） を増大させる。

ここに示した方法によれば膜の透過性の制呻乞改良する
ことができろが、これらの方法により形成された膜は明
瞭な分子量による透過性のカットオフをもたない。個々
の膜の細孔は寸法が異なり、高分子量のが子の通過を絶
対的に阻止するものではない。むしろこれらの分子が膜
を通過するのはきわめて緩慢であるため、これらが膜を
横切るのが効果的に妨げられるのである。これらの細孔
は１嘆ヲ形成ｆる架橋した物質の間隙により規定される
、曲折した通路からなると考えられろ。高分子量ヲもち
、結果的に比較的大きな有効容積乞もつ分子は膜構造と
の衝突が比較的多く、これによりそれらが膜を通過する
のが妨げられろ。ここに示した定量的な透過性データは
すべて既知の分子量なもつ分子の経膜拡散の経験的知見
に基づく。

カプセル封入された細胞を数日間生育培地中で増殖させ
、次いで多数の区画をもつスクリーニング装置、たとえ
ば９６個のくぼみを有するミクロタイタープレートまた
は軟質寒天に入れろ。好ま（２２） （−＜は各区画に約１０〜１００（１ｉ！ｉｆのカプセ
ルな入れる。必要な物質を産生する細胞は該物質を合成
し、カプセルの膜を横切ってカプセル外培地中へ分〃１
−ろ。各区画のカプセル外培地を常法により、ｆことえ
ばＲ，Ｉ　Ａま１こは酵素アッセイにより該物質の分舘
につき検定１−る。不方法をプラスの検定結果を与えろ
各区画のカプセルにつき、選ばれた細胞が識別されるま
で繰り返すことかできろ。可能７ｒらばとの反復工程は
くぼみ当たりカプセル１個の密度で行うべきであり。こ
の密度でＱ工、プラスのアッセイはいずれも、関心のあ
る物質ケ分〆２てΦカプセル封入細胞がそのミクロツｌ
ブセル内にあることを示す。

例 了ゾトノゝクター（Ａ、ｚｏｔｏｂａｃｔｏｒ　）ニト
ロゲナーゼで免疫処理しｆこｌ−３ＡＴ、Ｂ／Ｃマウス
からの肺臓細胞とＢＡ、ＬＢ／Ｃマウス骨髄肺細胞株、
０Ｍ３５７Ｄの融合ニより、アゾトバクタ−ニトロゲナ
ーゼに対するＩｇＧ抗体を分圧・てろ細胞株を確立した
。

ＩｇＧを分圧しない骨肺肺細胞系列はヒユーマン（２３
〕 ジエ不テイツク・ミュータントｅセル・レボジトリ−か
ら購入された。

ＢＡ、Ｔ、Ｂ／Ｃハイブリドーマ（Ｃ２５と表示〕を１
５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中の土３４％（Ｗ／Ｖ　）
アルギン酸ナトリウム（Ｎａ　Ｇ　、ケルコ）ＶＣ懸濁
した。粘稠な浴液な１０ｍ１の注射器に移し、次いで前
記のジェットヘッド型液滴形成装置に乗せた。

液滴ば１５０ｍＭ塩化ナト１１ウム溶液中の１．２循（
Ｗ／Ｖ）塩化カルシウムと接触するどとによりゲル化し
Ｔこ。ケル化し１こ球体は別個の相を形成し、吸引によ
り採取された。ゲル化した球体を１５０ｍＭ塩化すトリ
ウムで３回洗浄し、次いで室温においてポリ−Ｌ　’＋
シン（シグマ、分子量６５，０００ダルトン〕の１．８
７５　ｍｅ／ｍｌ溶液中で６分間インキュベートした。

インキュベーションののち、カプセル’ｉ　５　ｍ　Ｍ
　（Ｊ−ＩＥ　Ｓ緩衝液（２−Ｎ−シクロへキシルアミ
ノエタンスルホン酸、シグマ、ＰＨ１５，０，２４（ｗ
／ｖ）塩化カルシウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウム
中）２５ｍｌ中で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中の０．
２％（ｗ／ｖ）塩化カルシラ（２４） ム中で１回、そして１５０ｍＭ塩化ナト１７ウム中で１
面洗浄した。次いでカプセルをさらに４分間、室温で１
５０ｍＭｍ化ナトリウ化生トリウム中％（ｗ／ｖ）Ｎａ
Ｇ中においてインキュベートすることにより後コーティ
ングＬ、１５０ｍＭ４化ナトリウム中で１回洗浄し、さ
ら［１５分間室温で１５０ｍＭ塩化ナトリウム中の５５
ｍＭクエン酸ナトリウム中においてインキュベートした
。この溶液をデカントし、新たな１５０ｍＭ塩化ナトリ
ウム中の５５ｍＭクエン醒ナトリウムで置換した。

カプセル１個温でさらに６分間、インキュベートし、１
５０ｍＭ塩化ナトリウムで２回洗浄し、ダルベツコ（Ｄ
ｕｌｂｅｃｃｏ　）　の調製イーグル培地（高グルコー
ス）で１回、次いでウシ胎仔血−１（Ｆｅ２、フロー・
ラボラトリーズ）２０係ならびにペニシリン、ストレプ
トマイシン、グルタミン１ｍＭおよびメルカプトエタノ
ール５Ｘ１０　Ｍ’Ｙ含有テろダルベツコの調製イーグ
ル培地（高グルコース）で１回洗浄した。この方法で製
造したカプセルはＩｇＧに対して透過性であったが、Ｉ
ｇＭ　に対しく２５） ては実質的に不透過性であった。

カプセル封入された細胞を培養フラスコ中で数日間増殖
させ、次いで２４個のくぼみのあるミクロタイタープレ
ート中に生育培地と共に、カプセル２０容量係および増
殖培地８０容量係の濃度で分散させた。約３日間のイン
キュベーションののち各くぼみのカプセル内およびカプ
セル外培地を、分ｌヒされた抗アゾトバクターニトロゲ
ナーゼにつき下記の方法を用いて試験した。プラスの検
定結果を示す（ぼみは生育培地を含む新たな２４個のく
ぼみのあるミクロタイター中で、抗アゾトバクターニト
ロゲナーゼ産生ハイブリドーマが識別されるまで再培養
した。

下記の検定を抗アゾトバクターニトロゲナーゼ測定に用
いた。９６個のくぼみのあるリンプロＥＩＡブレー１・
の穴Ｙ　ＩＪン酸酸塩緩衝会食塩液ＰＢＳ）中の１０μ
９７ｍ１アゾトバクターニトロゲナーゼ溶液１００μｌ
で被覆した。４℃で一夜インキユベートしたのち、過剰
のリン酸塩緩衝化食塩ｇを振り落とし、くぼみＹＰＢＳ
溶液中の１ｑｂウシ血清（２６〕 アルブミン（ＢＳＡ−ＰＢＳ）溶液で後被覆した。

１時間後にＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を振り落としり。

ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を用いて試料を希釈し、ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ中の精裂抗ニトロゲナーゼ１μｇ／　ｍｌ　溶液を
希釈することにより標準ａを調製した。試料を６７°Ｃ
で１時間インキュベートし、次いでくぼみなＰＢＳで６
回洗浄した。ＢＳＡ−ＰＢＳ中のパーオキシダーゼと共
役したヤギ抗マウスＩｇＧの１　：　１０００希釈液を
各くぼみに添加した。室温で２時間インキュベートした
のち各くぼみ’ＹＰＢＳで５回洗浄した。５５Ｍクエン
酸ナトリウム（ＰＨ４、５）　中４　ｍ９／ｍｅオルト
フェニレンジアミン、０．０２％の（ｖ／ｖ）過酸化水
素１００μ７に各くぼみに添加した。１５分後に４Ｎ・
ＨＣｌ１００μｌの添加により反応を停止した。プレー
）Ｙプレート読取器上で抗ニトロゲナーゼ活性の呈色に
つき読み取った。

以上の実施例から明らかなように、ここに記載した方法
によれば、必要な物質を産生てろ細胞を簡単に選ぶこと
ができる。ここに記載した方法以（２７〕 外の変更および修正も不発明の実施に有用であることは
当業者には認識されるであろう。このような他の変更お
よび修正も特許請求の範囲に含まれろ。

（２８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１Ｍ胞培養物を、必要とする物質を分泌する選ばれ
   た細胞に関してスクリーニングでる方法であって、 Ａ、該細胞培養物の細胞を多数のカプセルに封入し、そ
   の際各カプセルは該物質に対しては透過性であるが該細
   胞に対しては不透過性である１戻により規定されろカプ
   セル内容積を有し二Ｂ、上記のカプセル封入された細胞
   馨、それぞれカプセル外培地を含有する多数の区画を規
   定する手段内に分配し； Ｃ１選ばれた細胞にカプセル内容積中で該物質を合成お
   よび分泌させ； Ｄ８分詑された物質に膜を通過させ； Ｅ、各区画のカプセル外培地を該物質に関して検定し：
   そして Ｆ、工程Ｅでプラスの検定結果を与える区画から（１〕 のカプセルにつき、選ばれた細胞を含むカフ−セルが識
   別されるまで工程Ｂ−ＥＹ繰り返て諸工程からなる方法
   。 （２）　統計的にカプセル内容積中の生存可能な細胞の
   密度がカプセル当たり１個の細胞よりも多くない、特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 （３１選ばれた細胞がリンパ球と永久細胞株との融合生
   成物からなる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （４）永久細胞株が骨髄腫細胞からなる、特許請求の範
   囲第６項に記載の方法。 （５）選択された細胞がハイブリドーマからなる特許請
   求の範囲第６項に記載の方法。 （６）ハイブリドーマが種間融合生成物からなる特許請
   求の範囲第５項に記載の方法。 （７）該物質がモノクローナル抗体からなる、特許請求
   の範囲第５項に記載の方法。 （８）選択された細胞が遺伝学的に修飾された細胞であ
   る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （９）遺伝学的に修飾された細胞が原核細胞と該（２） ！ｒ！／ｌＪ質に対してコード化された発現可ａ目な遺
   伝子を含むベクターとの融合生成物からなる、特許請求
   の範囲第８ノ真に記載の方法。 ＋Ｉ　ｉｌ）　カフーセル外培地が選ばれた細胞、に対
   １−ろ生育培地からなる、特許−８肯５１〈の範囲第１
   唄盲己載の方法。 （１１）該区画かカプセルおよびカプセル外培地を保有
   しうろくぼみな有する、特許請求の範囲第１瑣に記載の
   方法。 （１２）膜が該物質に対して透過性であり、かつあらか
   じめ定められ１こ値よりも大きな分子量をもつ分子およ
   び上記細胞に対して実質的に不透過性である、特許請求
   の範囲第１唄に記載の方法。 １１３）　識別され１こカプセルな動物に注入して必要
   な物質に対する免疫応答を誘発させ小付加的な工８を含
   む、特許請求の範囲第１」口に記載の方法。 （１４）　さらに、識別されたカプセル乞宿主動物内に
   移植し、必要な物質を含む体液を宿主動物から採取てろ
   付加的な工程な含む、特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 （３） （１５）必要な物質ケ分躯ｆろ選ばれた細胞を不均質な
   細胞集団から識別才ろ方法であって、１、　必要な物質
   を産生する細胞少なくとも１個を含む多数の細胞を永久
   細胞株と融合させて、融合した細ノ煎からなる不均質な
   細胞集団を調製し；２、多数のカプセル内に該集団を封
   入し、その際各カプセルはカプセル内容積を規定てろ膜
   からなり、該膜は該物質に対して透過性であり、かつ融
   合した細胞に対しては不透過性であり；６　カプセル封
   入された細胞を、該物質を分７！１２′する細胞の進行
   中の代謝を支持しうろカプセル外培地をそれぞれ含む多
   数の区画を規定′ｆろ手段内に分配し： ４．１大ばれた細胞にカプセル内容積中で該物質を合成
   および分館させ： ５、分圧された該物質に膜を通過させ；６、各区画のカ
   プセル外培地を該物質に関して検定し；そして Ｚ　工程６でプラスの検定結果を与えろ区画からのカプ
   セルにつき、選ばれた細胞な含むカプセ（４） ルが識別されるまで工程６〜６を繰り返す工程からなる
   方法。 （１６）統計的にカプセル内容積中の細胞の密度がカプ
   セル当たり１個の細胞よりも大きくない、特許請求の範
   囲第１５項に記載の方法。 （１７）　永久細胞株が骨髄腫細胞からなる、特許請求
   の範囲第１５項に記載の方法。 （１８）　多数の細胞がリンパ球からなる、特許請求の
   範囲第１７項に記載の方法。 （１！１　融合した細胞がハイブリドーマからなる、特
   許請求の範囲第１８項に記載の方法。 ＋２０）　該区画がカプセルおよびカプセル外培地を保
   有しうろくぼみからなる、特許請求の範囲第１５項に記
   載の方法。 （２１）カプセル外培地が選ばれた細胞に対する生育培
   地からなる、特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 （２２）生育培地が鑑別生育培地からなる、特許請求の
   範囲第２１項に記載の方法。 Ｃ１３＋　膜が該物質に対して透過性であり、かつあ（
   ５） らかじめ定められた値よりも大きな分子量をもつ分子お
   よび上記融合細胞に対して実質的に不透過性である、特
   許請求の範囲第１５項に記載の方法。 シ旬　さらに、識別されたカプセルを動物に注入して必
   要な物質に対する免疫応答を誘発させる付／ＪＯ的な工
   程を含む、特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 （２５）さらに、識別されたカプセルを宿主動物に移植
   し、必要な物質を含む体液を該宿主動物から採取てろ付
   加的な工程を含む、特許請求の範囲第１５項に記載の方
   法。