NL8500451A - Werkwijze voor het screenen van cellen. - Google Patents

Description

~^ NL 32442-Kp/cs *'

Werkwijze voor het screenen van cellen.

De uitvinding heeft betrekking op de selectie van een cel, die een bepaalde stof afscheidt uit een heterogene celpopulatie. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het eenvoudiger screenen van 5 celcultures, waaronder recombinant DNA en hybridomafusie-producten, voor levensvatbare cellen, die een specifieke stof uitscheiden.

Recente vooruitgang bij de productie en modificatie van biologisch materiaal, bijvoorbeeld genetische engineering 10 en monoklonale antilichaam-hybridomatechnologie, heeft geleid tot de noodzaak van identificatie van afzonderlijke cellen, die bepaalde stoffen produceren. Zo omvat bijvoorbeeld de monoklonale antilichaamproductie het fuseren van een heterogene celculture, met daarbij ten minste één cel, die het 15 specifieke antilichaam produceert, met een immortale cellijn, bijvoorbeeld een myeloma. Zelfs onder de beste omstandigheden is de fusietechniek slechts ten dele succesvol; sommige cellen fuseren niet, sommige cellen uit de culture fuseren met elkaar in plaats van met de myelomacellen, terwijl sommige * 20 myelomacellen onderling fuseren. Aangenomen, dat alle cellen van de celculture met myeloma fuseren, dan nog zouden slechts enkele van de fusieproducten de beoogde stof produceren. Dientengevolge is er behoefte aan een screeningstechniek voor het selecteren van specifieke fusieproducten. Een vaak toegepaste 25 screeningstechniek bestaat uit het kweken van cellen uit fusiemengsel in microtiterplaten, het bepalen van de vloeistof van elk compartiment van de microtiterplaten voor de van belang zijnde stof, en het subkweken van de cellen in elk compartiment met een positieve bepaling. Problemen, die ge-30 paard gaan met deze procedure zijn de mogelijkheid van fysische beschadiging van de cellen bij het afzonderen voor het subkweken, de problemen, die gepaard gaan met het scheiden van de cellen, de mogelijkheid van verontreiniging van de cultures en de invloed.van materiaal van buitenaf, bijvoor-35 beeld celfragmenten en verontreinigingen met hoog molecuul- gewich£‘op de specificiteit van de bepaling van de van belang

BAD ORIGINAL

br η η λ s 1 - 2 - " ' “'· zijnde stof. Een ander probleem is, dat bepaalde types cellen niet zo goed groeien in microtiterplaten..

Recombinant DNA-technologie vereist eveneens de screening van levensvatbare recombinanten. De standaard re-5 combinantvormingstechnologie omvat de introductie van een . plasmide of een andere vector in een cel, gewoonlijk een pro-karyotisch organisme. Het plasmide of de vector bevat een gen, dat in de cel kan worden aangezet tot de vorming van de van belang zijnde stof. Evenals bij de hybridomatechnologiè 10 zal een groot percentage van de fusieproducten van de plas-miden of vectoren en de cellen geen levensvatbare cultures . vormen, die de beoogde stof produceren, hetgeen betekent, dat een screeningsproces noodzakelijk is. Soortgelijke technieken als die gebruikt worden voor dè identificatie van hybridoma’s 15 zijn normaal bij recombinanttechnologie, waarbij zich soortgelijke bijkomende problemen voordoen.

Het Amerikaanse octrooischrift No. 4.352.883, verleend op 5 oktober 1982, ten name van Franklin Lim, beschrijft een werkwijze voor het inkapselen van levensvatbare cellen, 20 waaronder hybridoma's of genetisch gemodificeerde cellen binnen een semipermeabel membraan. Na inkapseling zijn de cellen gezond, levensvatbaar, hebben het vermogen om normaal door te gaan met metabolisme, scheiden de materialen af, die zij normaal afscheiden en kunnen mitosis ondergaan na het 25 onderbrengen in de capsules. Recente experimenten hebben aangetoond volgens de ruime beschrijving van het octrooischrift, dat het mogelijk is de afmetingen van de poriën van het cap-sulemembraan te beheersen, terwijl de doorgang van cellen en verontreinigingen met hoog molecuulgewicht voorkomen wordt.

30 Op die manier is het mogelijk, het membraan van de capsule te gebruiken als een filtreermiddel, hetgeen de bepaling van de van belang zijnde stof bevordert. De inkapseltechniek volgens het Lim-octrooi is gunstig voor het voorkomen van mechanische beschadiging van de cellen en vereenvoudigt de hantering van 35 cellen.

Dientengevolge is het een doel *van de uitvinding het verschaffen van een nieuwe screeningstechniek voor het identificeren van cellen, die een van belang zijnde stof afschei-BAD OfttGiMALeen gemengde celculture. Een ander doel van de uit-Λη ·”·!»Λι·ηπ te h&+· wrsrhaffen van een werkwijze voor het selec- _ '' * - 3 - teren van hybridoma'sdie een van belang zijnde monoklonaal antilichaam produceren. Een verder doel is het verschaffen van een werkwijze voor het identificeren van genetisch gemodificeerde cellen, die een van belang zijnde stof afscheiden.

5 Een ander doel van de uitvinding is het verschaffen van een werkwijze voor het identificeren of selecteren van hybridoma's, die een beoogde stof produceren uit een celculture met daarin ten minste één cel, die de stof produceert. Deze en andere doelen en aspecten van de uitvinding zullen duidelijk worden 10 uit de volgende beschrijving.

De uitvinding beoogt een werkwijze voor het screenen of identificeren van een geselecteerde cel, die een beoogde stof afscheidt. Een heterogene celculture met daarin een groot aantal cellen, wordt ingekapseld in een groot aantal 15 capsules. De celculture kan elke culture zijn, die een cel is, die in staat is de beoogde stof af te scheiden, bijvoorbeeld een hybridoma, gevormd door fuseren van een lymfocyte en een immortale cellijn, zoals een myeloma, of een genetisch gemodificeerde cel, zoals een fusieproduct van een .20 prokaryotische cel en een vector met daarin een gen, dat codeert voor de productie van de beoogde stof door intracellulaire omzetting. De capsules hebben een intracapsulair volume, gevormd door een membraan, dat permeabèl is voor de stof, doch impermeabel voor de cellen. Het membraan kan boven-25 dien de doorgang van moleculen met een molecuulgewicht groter dan een voorafbepaalde waarde beperken. In het geval van hy-bridoma's kunnen de cellen worden ingekapseld bij een dichtheid, die niet meer dan één hybridoma in elke tien capsules bevat; hetgeen dan een kloon zou vormen. De ingekapselde cel-30 len worden gekweekt in een apparaat met verscheidenen compartimenten, waarbij elk compartiment een extracapsulair medium bevat, bij voorkeur een differentieel grpeimedium. De geselecteerde cel synthetiseert en scheidt de stof in het intra-capsulaire volume af, terwijl de afgescheiden stoffen via het 35 membraan terechtkomen in het extracapsulaire medium. Het extracapsulaire medium van elk compartiment wordt onderzocht op de van belang zijnde stof, terwijl het proces wordt herhaald met de capsules uit elk compartiment onder oplevering BAD oSféiliSK1 P°sitieve bePalin9 voor de stof zolang de geselec- o K η η λ c 4 - A - teèrde cel wordt geïdentificeerd. De compartimenten zijn bij-voorkeur putjes, waarin zich bevinden het extracapsulaire medium en capsules. In het geval van hybridoma's bevordert de mogelijkheid van de vorming*' van een kloon uit de oorspron-5 kelijke fusieprocedure de screening, aangezien geen capsule meer dan' één enkel hybridoma bevat, en leidt tot grote ver- ! snelling van de isolatie van stabiele, antilichaam-afscheidende hybridoma's.

De in dit proces geïdentificeerde capsules kunnen 10 worden gebruikt als een immuniserend middel, waarbij de capsules worden ingespoten in een dier, dat vervolgens het anti-lichaam produceert tegen de afgescheiden stof.

De geïdentificeerde capsules kunnen ook worden geïmplanteerd in een gastdier, bijvoorbeeld in de peritoneale 15 holte van een muis. De afgescheiden stof kan dan vervolgens worden gewonnen uit de implantatieplaats, bij voorkeur uit de vloeistof, die als reactie op de implantatie door de gastheer is geproduceerd.

In de ruimste zin des woords beoogt de onderhavige 20 uitvinding een werkwijze voor het screenen van een celculture voor een bepaalde cel, die een van belang zijnde stof afscheidt. Het proces is in het bijzonder geschikt in hybridoma- / technologie, aangezien fusieproducten van lymfocyten en een immortale cellijn, bijvoorbeeld een myeloma, gescreened dient 25 te worden voor het bèpalen welke cel het van belang zijnde monoklonale antilichaam produceert. Evenzeer is het proces zeer geschikt voor recombinant DNA-technologie. De uitvinding maakt het uitvoeren van het screenen eenvoudiger onder minder destructie dan bij de gebruikelijke technieken. De uitvinding 30 is in het bijzonder geschikt voor het identificeren van veranker ingsafhankelijke cellen, die een bepaalde stof produceren .

Eerst wordt de heterogene celculture, die de te selecteren cel bevat, verkregen. Een eerder bereide celculture, 35 bijvoorbeeld een hybridomaculture of genetisch gemodificeerde cellijn, kan worden gebruikt of er kan een nieuwe culture worden bereid speciaal voor de werkwijze. Een voorbeeld van een hybrldomavormingstechniek, zoals gerapporteerd door en C. Milstein, "Continuous Culture of Fused Cells ’ ^ c ^j~j.-s Cnar>ï f i rï fv" . Nature 256: - 5 - 495 (1975), gaat uit van een culture, bijvoorbeeld lymfocyten van een milt, waarvan ten minste sommige de beoogde stof produceren. De culture wordt ingedeeld in afzonderlijke cellen onder gebruikmaking van conventionele technieken, bijvoor-5 beeld door milt door een metalen zeef te persen. De cellen worden vermengd met een immortale cellijn, bijvoorbeeld een myeloma, terwijl de hybridoma's worden gevormd door poly-ethyleenglycol (PEG)-fusie. Meer in het bijzonder worden de lymfocyten en myeloma geïncubeerd in een fusiemedium, zoals 10 Dulbecco's gemodificeerd Eagle’s medium (DMEM), waaraan ca. 40% PEG wordt toegevoegd. De cellen worden verwijderd uit de PEG-oplossing en worden gekweekt als een culture voorafgaande aan het screenen. Bij voorkeur is het myeloma gevoelig voor antibiotica en is het noodzakelijk, dat aan het medium toe-15 voegsels worden toegevoegd waarbij een differentieel kweek-medium, bijvoorbeeld een medium met daarin geneesmiddelen, die niet gefuseerde cellen doden, kan worden gebruikt als separatie-inrichting. Na het identificeren van de levensvatbare hybridoma’s kan een verdere screening noodzakelijk zijn 20 voor het vaststellen of zij de beoogde stof produceren.

Indien de gekozen cel genetisch wordt gemodificeerd, kan men gebruik maken van een vormingsprocedure, zoals be-‘ schreven door F. Bolivar et al., Construction /and Characterization of New Cloning Vehicles, II, a multipurpose cloning 25 system, Gene 2, 95-113 (1977). Een plasmide of vector wordt ingebracht in een cel onder gebruikmaking van restrictie- enzymen, waarbij de cel wordt gekweekt onder gebruikmaking de van standaardprocedures. Het plasmide of^vector bevat een gen, dat kan worden omgezet door de cel, zodanig dat de beoogde 30 stof wordt geproduceerd. Zoals in geval van de hybridoma's is een_differentieel groeimedium geschikt voor celselectie.

Zo kan bijvoorbeeld de plasmide, die het gen bevat, dat codeert voor de beoogde stof, ook een gen bevatten, dat het fusieproduct differentieert uit niet-fusieproducten, bijvoor-35 beeld, waarbij het plasmide rifamycineresistentie aan een rif-gevoelige cel kan meegeven onder gebruikmaking van een rif-bevattend differentieel groeimedium voor het screenen.

Na vorming van de celkolonie worden de cellen inge-BADORlt^S^t1* De al9emene techniek, zoals in het eerder geciteerde Λ c λ Λ /. S i - 6 -

Lim-octrooi beschreven, verdient de voorkeur. De afmetingen van de poriën van de microcapsules kunnen beheerst worden, zoals in het Lim-octrooi beschreven en zoals hier nader toegelicht. Overeenkomstig het hierin beschrevene is het mogelijk 5 cellen in te kapselen, die zowel. IgG (molecuulgewicht ca.

160.000 'daltons) als IgM (molecuulgewicht ca. 900.000 daltons) binnen de capsules afscheiden, welke capsules de vrije doorgang van IgG door de membraanporiën mogelijk maken, terwijl de doorgang van IgM praktisch wordt voorkomen. Het capsule-10 membraan fungeert als een filter, en belet de doorgang van cellen alsmede hoogmoleculaire verontreinigingen en cellen.

Zoals boven vermeld, is de voorkeursinkapselings-techniek beschreven in het Lim-octrooi. De celculture wordt eerst bereid in een fijnverdeelde vorm (overeenkomstig be-15 kende technieken) en gesuspendeerd in een waterig medium, geschikt voor het handhaven en onderhouden van aan de gang zijnde metabolische processen. Geschikte handhavingsmedia zijn bijvoorbeeld Dulbecco's PBS (Ca/Mg vrij) zijn de deskundige bekend. Een in water oplosbare stof, die fysiologisch 20 verenigbaar is met de. cel en die in water onoplosbaar kan.worden gemaakt onder vorming van een vormbehoudend, coherente tijdelijke capsule of gegeleerde massa, wordt aan het medium / toegevoegd. De verkregen oplossing wordt dan tot druppels gevormd met daarin de cellen tezamen met hun groeimedium, 25 terwijl de druppels bnmiddellijk water-onoplosbaar worden gemaakt onder vorming van de tijdelijke capsules. Het geleer-bare materiaal kan een niet-toxisch, water-oplosbaar materiaal zijn, dat doorverandering in temperatuur, pH of iono-geen milieu water-onoplosbaar wordt gemaakt zonder nadelige 30 invloed op de metabolische processen van de cellen. Bij voorkeur bevat het geleerbare materiaal verscheidène gemakkelijk ioniseerbare groepen, bijvoorbeeld carboxyl- of aminogroepen, die een reactie kunnen aangaan met de polymeren, die verscheidene groepen met de tegengestelde lading onder vorming 35 van zoutbanden.

De thans voorkeur verdienende geleerbare materialen zijn natuurlijke of synthetische polysacchariden, bij voorkeur natfiumalginaat. Andere volgens de uitvinding bruikbare ^^^poi^Jacchariden zijn zure fracties van guargom, arabische ------- ---*--!~~ vranrrapsnfh onin en xanthaan gom.

* ' - 7 -

Deze materialen kunnen "verknoopt" worden door reactie met kationen onder vorming van vormbehoudende massa's, die opnieuw in oplossing kunnen worden gebracht door verwijdering van de verknopende ionen 4por ionenuitwisseling of een se-5 guesteermiddel.

Een geleerbare oplossing, die met succes werd ge- 6 bruikt, bevat ca. 10 cellen/ml in 1,0-1,5% (gew./vol.) na-triumalginaatoplossing. De oplossing wordt tot druppels gevormd, bijvoorbeeld door het forceren van de’oplossing door 10 een straalkopapparaat. Het straalkopapparaat bestaat uit een huis met een boven luchtinlaatmondstuk en een lange holle lichaamfrictie, ondergebracht in een stop. Een spuit, bijvoorbeeld een 10 ml spuit, voorzien van een doseerpomp, is aangebracht bovenop het huis met een naald, bijvoorbeeld een 15 0,025 cm I.D. Teflon-beklede naald, die de lengte van het huis doorloopt. Het inwendige van het huis is zodanig ontworpen, dat de punt van de naald is onderworpen aan een constante laminaire luchtstroom, die als een luchtmes fungeert.

Bij gebruik wordt de spuit, gevuld met de oplossing, die het 20 in te kapselen materiaal bevat, aangebracht bovenop het huis, waarna de doseerpomp wordt geactiveerd voor het incrementeel forceren van druppels van de oplossing naar de punt van de naald. Elke druppel wordt "afgesneden" door de' luchtstroom en valt ca. 2,5-3,5 cm in een geleeroplossing, waar de drup-25 pel onmiddellijk wordt gegeleerd door absorptie van verknop ings ionen. De voorkeursgeleeroplossing is een calcium-ionoplossing, bijvoorbeeld 1,2% (gew./vol.) calciumchloride in een zoutoplossing. De afstand tussen de punt van de naald en de calciumchlorideoplossing is groot genoeg om het raoge-30 lijk te maken, dat de natriumalginaat/celoplossing de meest gunstige fysische vorm aanneemt, namelijk een bolvorm (maximaal volume/oppervlakte) . Lucht in de buis stroomt weg via een opening in de stop. De geleerde vormbehoudende bolvormige massa's of tijdelijke capsules, die bij voorkeur tussen 50 35 microns en enkele millimeters in diameter liggen, verzamelen zich in een oplossing in de vorm van een afzonderlijke fase en kunnen door afzuigen worden gewonnen.

Dan wordt een permanent membraan gevormd rondom elke bad ofttófteiljke capsule door verknopen van de oppervlaktelagen van ft 0 0 4 5 1 -8-.

de tijdelijke capsule. Bij voorkeur wordt een waterige oplossing van een polymeer met verscheidene groepen van de tegenovergestelde lading gebruikt voor het verknopen van de gegeleerde massa’s. Indien gecarboxyleerde of andere zure 5 polysacchariden worden gebruikt voor de vorming van de tijdelijke capsule, zijn polykationogene materialen met daarin zure reactieve groepen, zoals aminen, iminen of amiden, ge-• schikt als verknopingsmiddelen. De thans de voorkeur verdienende polykationogene materialen zijn polylysine, polyethyleen-10 amine en polyvinylamine. De polykationogene materialen reageren met zuurgroepen op het polyanionogene materiaal van de gegeleerde massa onder vorming van zóutbinding-type verknopingen. Afhankelijk van het gebruikte systeem kan het voordelig zijn de door deze reactie gevórmde permanente capsule te 15 laten reageren met een oplossing, die de vrije kationogene groepen bezet, bijvoorbeeld door omzetting van de capsule met een oplossing van een lage concentratie natriumalginaat.

Capsules, die zijn ontworpen voor toepassing in de onderhavige uitvinding, hebben membranen, die zodanig zijn 20 opgebouwd, dat zij de vereiste filtratie verschaffen door

molecuulgewicht nodig voor het passeren van het membraan door de beoogde stof, terwijl verontreinigingen met hoger molecuulgewicht en cellen in het membraan achterblijven. 'Zoals eerder genoemd, kunnen capsules worden gevormd voor het mogelijk 25 maken van vrije doorgang van IgG, terwijl doorgang van IgM

praktisch voorkomen wordt. Er zijn twee nieuwe technieken ontwikkeld voor het bevorderen van de beheersing van de poriënafmetingen, waarvan een gebaseerd is op een meerdere laag-techniek en de tweede op een hydratatieverschijnsel. Volgens 30 de eerste van deze technieken worden de gegeleerde bollen ondergedömpeld in verschillende ionensterkte of verschillende concentratie polykationogene oplossingen. Lagen van materialen, die zijn afgezet rondom de gegeleerde bollen, vormen meerdere laagstructuren. Zo kunnen bijvoorbeeld tijdelijke 35 capsules worden ondergedompeld in een oplossing van polylysine met hoog molecuulgewicht, gevolgd"door een polylysine of polyvinylamine-oplossing met een laag molecuulgewicht. Het effect van de tweede onderdompeling is het vormen van een BADCMüStlÊlMembraan, dat de poriënafmeting doet af nemen.

- 9 -

De tweede pofiënafmetingbeheersingstechniek maakt gebruik van de observatie, dat alginaatgelen variëren in volume afhankelijk van hun hydratatie, die op zijn beurt afhankelijk is van de ionensterkte van de metaalionoplossing, 5 waarin zij in evenwicht waren. Een membraan, gevormd rondom een geëxpandeerde alginaatgelmassa is uniformer dan die welke gevormd is rondom niet-geëxpandeerde gelmassa's. Dit verschijnsel, gekoppeld aan de observatie dat membranen, gevormd rondom dichte gelen de neiging hebben intact te blijven wan-10 neer het gel wordt geëxpandeerd, leidt tot een methode van vergroten van de poriënafmetingen en het vormen van verbeterde 'membranen. Zo kan bijvoorbeeld een membraan met een poriënafmeting van ca. 200.000 daltons (voldoende voor het loslaten van IgG, terwijl IgM wordt tegengehouden) worden gevormd onder 15 gebruikmaking van een. kationogene verknoper met een middelmatig molecuulgewicht rondom een celbevattend gel met hoge dichtheid na het in evenwicht brengen en expanderen van de gegeleerde massa met een eenwaardig kation met lage ionogene sterkte. De eenwaardige kationoplossing verwijdert calcium-20 ionen en verhoogt de mate van hydratatie van het gel, waarbij de poriëngrootte toeneemt.

Ofschoon de hier beschreven technieken in staat zijn de membraanpermeabiliteitsbeheersing te verbeteren, hebben de aldus gevormde membranen geen scherpe molecuulge-25 wichtspermeabiliteitswaarden. De poriën van elk bepaald membraan variëren in afmeting en houden moleculen met hoog molecuulgewicht niet volledig tegen. Daarentegen is de doorgang van deze moleculen door het membraan zo langzaam, dat zij op effectieve wijze worden belemmerd om het membraan te passeren. 30 Aangenomen wordt, dat de poriën kronkelige kanalen zijn, die zijn gevormd door tussenruimtes tussen de verknoopte materialen, die het membraan vormen. Moleculen met een hoog molecuulgewicht en daarmee gepaard gaande hogere effectieve volumes hebben meer collisies met de membraanstructuur, waar-35 bij hun doorlating door het membraan wordt belemmerd. Alle kwantitatieve permeabiliteitsgegeven, zoals hier beschreven, zijn gebaseerd op empirische waarnemingen van transmembraan-diffusie van moleculen met een bekend molecuulgewicht.

BAD ORIGINAL De ingekapselde cellen worden gedurende verscheidene _. # λ .Λ 3 ï? Λ - 10 - dagen gekweekt in een kweekmedium en vervolgens overgebracht in een screeningsapparaat met meerdere compartimenten, bijvoorbeeld een microtiterp laat of zachte agar met zesennegentig putjes erin. Bij voorkeur ca. 10-100 capsules per compar-5 timent. De stof-producerende cel synthetiseert en scheidt de stof af via het membraan van de capsule in het extracapsu-laire medium. Het extracapsulaire medium van elk compartiment wordt onderzocht op de stof onder gebruikmaking van gebruikelijke technieken, bijvoorbeeld RIA- of enzymtechniek. Het 10 proces kan worden herhaald met capsules uit elk compartiment onder oplevering van een positieve waarde totdat de geselecteerde cèl is geïdentificeerd. Indien mogelijk dient een her-halingsstap plaats te vinden bij een dichtheid van één capsule per putje. Bij die dichtheid toont elke positieve ana-15 lyse, dat de ingekapselde cel, die de beoogde stof afscheidt, zich bevindt in de microcapsule.

VOORBEELD I

Een cellijn, die IgG antilichamen tegen Azotobacter nitrogenase afscheidt, werd verkregen door polyethyleenglycol-20 fusie van de miltcellen van een BALB/c-muis geïmmuniseerd met Azotobacter nitrogenase en een BALB/c-muis myelomacellijn, GM 3570. De myelomacellijn, die geen IgG produceert, werd betrokken van de Human Genetic Mutant Cell Repository.

De BALB/c-hybridoma (aangegeven met C25) werd ge-25 suspendeerd in 1,34% (gew./vol.) natriumalginaat (NaG-Kelco) in 150 mM natriumchlorideoplossing. De visceuze suspensie werd overgebracht in een 10 ml spuit en vervolgens op een straalkop-druppelvormend apparaat, zoals eerder beschreven.

De druppels werden gegeleerd door ze in aanraking te brengen 30 met een 1,2% (gew./vol.) calciumchloride in 150 mM natriumchlorideoplossing. De gegeleerde bolletjes vormden een afzonderlijke fase en werden verzameld door afzuigen. De gegeleerde bolletjes wérden drie keer gewassen met 150 mM natrium-chloride en vervolgens gedurende 6 min geïncubeerd bij kamer-35 temperatuur in een 1 ,875 mg/ml oplossing*van poly-L-lysine (Sigma, molecuulgewicht 65.000 daltons). Na incubatie werden de capsules gewassen met 25 ml 5 mM CHES-buffer, (2-N-cyclo-PJ!!$lüM:noethaansulfzonzuur - Sigma in 0,2% (gew./vol.) cal-«’.--j--!- -- -icn mM «afrïntnrhlnride ), pH 7,5, een keer in I « ...

0,2% (gew./vol.) ca'lciumchloride in 150 mM natriumchloride en · een keer in 150 mM natriumchlorideoplossing. De capsules werden vervolgens geïncubeerd gedurende nog eens 4 min bij kamertemperatuur in 0,06% (gew./vol.) NaG in 150 mM natrium-5 chloride, een keer gewassep. in 150 mM natriumchloride en nog eens 15 min geïncubeerd bij kamertemperatuur in een 55 mM natriumcitraat in 150 mM natriumchlorideoplossing. De oplossing werd gedecanteerd en vervangen door vers 55 mM natriumcitraat in natriumchloride. De capsules werden geïncubeerd 10 bij kamertemperatuur gedurende nog eens 6 min en vervolgens twee keer gewassen met 150 mM natriumchloride, een keer met Dulbecco's gemodificeerd Eagle’s medium (hoge glucose) en een keer met Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (hoge glucose) met 20% foetaal kalverserum (FCS-Flow Laboratories) 15 erin alsmede penicilline, streptomycine, 1 mM glutamine en -5 5 x 10 M mercaptoethanol. De door deze procedure gevormde capsules waren permeabel voor IgG doch praktisch impermeabel voor IgM.

De cellen in de capsules werden gedurende verschei-20 dene dagen gekweekt in een kweekkolf en vervolgens gedisper-geerd in een microtiterplaat met 24 putjes tezamen met het groeimediurn bij een concentratie van ca. 20 vol.% capsules en 80 vol.% kweekmedium. Na ca. drie dagen incubatie werden de monsters onderzocht op anti-Azotobacter nitfogenase onder 25 gebruikmaking van de hierna beschreven procedure. De putjes, die een positieve analyse gaven, werden opnieuw gekweekt in nieuwe microtiterplaten met 24 putjes met het kweekmedium totdat er levensvatbare hybridoma's, die anti-Azotobacter nitro-genase produceerden, werden waargenomen.

30 De volgende proef werd gebruikt voor het bepalen van de anti-Azotobacter nitrogenase-productie. De putjes van een Linbro jSIA-plaat met 96 putjes werden bedekt met een 100 μΐ van een 10 yg/ml oplossing van Azotobacter nitrogenase in een fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Na incuberen geduren-35 de de nacht bij 4°C werd de overmaat PBS-oplossing afgeschud en de putjes werden opnieuw bekleed met een 1% BSA in PBS-oplossing. Na een uur werd de BSA-PBS-crplossing afgeschud. Monsters werden verdund onder gebruikmaking van de BSA-PBS-oplossing,terwijl standaards werden bereid door verdunning BAD 1 yg/ml oplossing van gezuiverde anti-nitrogenaseop- a r η n a * 1 - 12 -

lossing in BSA-PBS. De monsters liet men gedurende een uur bij 37°C incuberen, waarna de putjes drie keer met PBS werden gewassen. In elk putje werd een 1 :1000 verdunning van ge.it-anti-muis IgG geconjugeerd met».peroxidase in BSA-PBS toege-5 voegd. Na een twee uur durende incubatie bij kamertemperatuur werd elk putje vijf keer gewassen met PBS, waarbij aan elk putje 100 μΐ van een 4 mg/ml orthofenylemediamine, 0,02% (gew./vol.) waterstofperoxide in 55 mM natriumcitraat, pH

4,5, aan elk putje werd toegevoegd. Na 15 min werd de reactie 10 gestopt door toevoeging van 100 μΐ 4N HC1. De platen werden afgelezen op een plaataflezer voor kleurbepaling van anti-nitrogenase-activiteit.

Uit het voorgaande voorbeeld blijkt duidelijk, dat de hier beschreven werkwijze een vereenvoudigde selectie van 15 een cel, die een beoogde stof produceert, mogelijk maakt. De deskundige zal het duidelijk zijn, dat andere varianten en modificaties van de hier beschreven technieken te gebruiken zijn voor de praktijk van de uitvinding. Dergelijke varianten en modificaties worden geacht te vallen binnen de be-20 schermingsomvang van de conclusies.

/

BAD ORIGINAL

Claims (24)

1. Werkwijze voor het screenen van een celculture voor een geselecteerde cel, die een beoogde stof afscheidt, met het kenmerk, dat: A. de cellen van de celculture worden ingekapseld 5 in een hoeveelheid van capsules, waarbij de capsule bestaat uit een intracapsulair volume, omgeven door een membraan, dat permeabel is voor de stof, doch impermeabel voor de cellen; B. de ingekapselde cellen worden ovérgebracht in een inrichting met verscheidene compartimenten, waarvan elk 10 een extracapsulair medium bevat; C. men de geselecteerde cel de stof in het intracap-sulaire volume laat synthetiseren en afscheiden; D. de afscheiden stof het membraan passeert; E. het extracapsulaire medium van elk compartiment 15 op de stof wordt geanalyseerd; F. de stappen B-E worden herhaald met de capsules uit een compartiment, die een positieve analyse in stap E hebben totdat een capsule met de geselecteerde cellen erin wordt geïdentificeerd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat statistisch de dichtheid van levensvatbare cellen in het intracapsulaire volume niet groter is dan één cel per capsule.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken- 25 merk, dat de geselecteerde cel een fusieproduct van een lymfocyte en een immortale cellijn is.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken merk, dat de immortale cellijn een myeloma is.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken- 30 merk, dat de geselecteerde cel een hybridoma is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het ken merk, dat de hybridoma een cross-species-fusieproduct is.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het ken merk, dat de stof een monoklonaal antilichaam is.

8. Werkwijze volgens conclusie 1r met het ken merk, dat de geselecteerde cel een genetisch gemodificeerde cel is. Werkwijze volgens conclusie 8, met het ken- BAD ORIGINAL J merk, dat de genetisch gemodificeerde cel een fusieproduct ó k π λ /. c a - 14 - van een prokaryotische cel en een vector, die een uitdrukkelijke gencodering voor deze stof bevat, is.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken- ‘n. merk, dat het extracapsulairè medium een groeimedium voor 5 de geselecteerde cel is.

11. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat de compartimenten putjes bevatten, die de capsules en het extracapsulaire medium kunnen vasthouden.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken- 10 merk, dat het membraan permeabel is voor de stof en praktisch impermeabel voor moleculen met een molecuulgewicht groter dan een voorafbepaalde waarde en voor de cellen.

13. Werkwijze volgens conclusie .1, met het ken- m e r k, dat de geïdentificeerde capsule wordt ingespoten in 15 een dier voor het induceren van een immune respons tegen de beoogde stof.

14. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat de geïdentificeerde capsule wordt geïmplanteerd in een gastdier en de vloeistof met de beoogde stof erin 20 wordt gewonnen uit het gastdier.

15. Werkwijze voor het identificeren van een geselecteerde cel, die een beoogde stof afscheidt uit eeji heterogene celpopulatie, met het kenmerk, dat: 1. een veelheid van cellen, waarvan tenminste één 25 cel de beoogde'stof produceert, wordt gefuseerd met een im- mortale cellijn teneinde een heterogene populatie van cellen met daarbij samengesmolten cellen te produceren? 2. de populatie wordt ingekapseld in meerdere capsules, waarbij elke capsules is voorzien van een membraan, 30 dat een intracapsulair volume omgeeft, welk membraan permeabel is voor de stof en impermeabel voor de samengesmolten cellen; 3. de ingekapselde cellen worden ondergebracht in verscheidene compartimenten, waarbij elk compartiment een 35 extracapsulair medium bevat, dat in staat is het aan de gang zijnde metabolisme van een cel, die de stof afscheidt, te onderhouden; BAD ORIGINAL ^ 9ese-*-ecteeri^e cel gelegenheid wordt gegeven de stof te synthetiseren en af te scheiden in het intra- -“ - 15 - capsulaire volume; 5. men de afgescheiden stof door het membraan laat passeren; 6. het extracapsulaire medium van elk compartiment 5 wordt onderzocht op de stof'; en 7. de stappen 3-6 worden herhaald met de capsules uit ëen compartiment, die in stap 6 een positief resultaat geven totdat een capsule, die de geselecteerde cel bevat, wordt geïdentificeerd.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het k e n m e r k, dat statistisch de dichtheid van de cellen in het intracapsulaire volume niet groter is dan één cel per capsule.

17. Werkwijze volgens conclusie 15, met het 15 kenmerk, dat de immortale cellijn een myeloma is.

18. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat verscheidene cellen lymfocyten zijn.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat de gefuseerde cellen een hybridoma zijn.

20. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat de compartimenten putjes bevatten, die de capsules en het extracapsulaire medium kunnen vasthouden'.

21. Werkwijze volgens conclusie 15, m e t h e t k e n m e r k, dat het extracapsulaire medium een kweek-25 medium voor de geselecteerde cellen bevat.

22. Werkwijze volgens conclusie 21, met het kenmerk, dat het kweékmedium een differentieel kweek-medium is.

23. Werkwijze volgens conclusie 15, met het 30 kenmerk, dat het membraan permeabel is voor dé"stof en praktisch impermeabel is voor de moleculen met een molecuul-gewicht groter dan een voorafbepaalde waarde en voor de gefuseerde.cellen.

24. Werkwijze volgens conclusie 15, met het 35 kenmerk, dat de geïdentificeerde capsule wordt ingespoten in een dier voor het induceren \&an een immune respons tegen de beoogde stof..

25. Werkwijze volgens conclusie 15, met het ken m“e r k, dat de geïdentificeerde capsule wordt geïm- BAD ORIGINAL S 5 (1 (U ί 1 «i - 16 - planteerd in een gastdier, waaruit een vloeistof, die de beoogde stof bevat, wordt verzameld. / BAD ORIGINAL