JPS58148898A - Ｄｎａ等合成装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発ｄＡはＤＮＡ等合成装置に夷し、特に、不石定な
試薬溶液を用時調製して反応器に供給し、１）ＮＡ′Ｐ
ｋＬＮＩｋ合成ＯＴ症をＤＮＡ等合成装置に関する。

ＤＮＡの合成法として、いわゆるジエステル法、トリエ
ステル法、ホスファイト法と改良＠展がなさル、さらに
これらの方法を利用し、固形支持庫を用いる固形支持庫
法が各種の利点を何することから多用されるに到ってい
る。そしてこれらの方法によってＤＮＡ合成と行う装置
も各種提案されている。これらＤ装置は、いずれも反応
器に複数の拭褒溶液ｔｌ−ＰＩＴ尼のす顕で供給してｉ
）Ｎムを合成するという点で共通している。

一方、ＤＮＡ合成に用いる試ａ卓液には不安定なものが
ある。たとえばホスホトリエステル法で用いる縮合剤、
容液、ホスホモノトリアゾリド法で用いるヌクレオチド
試４署液、ホスファイト法で用いるスクレオヂド試薬Ｉ
８液などは不安定で、調製後数時間以内に使用しな＃−
ｆｎばならないものであるＯ そこで、従来のこの檀の装置では、ＤＮＡの合成を始め
る際に亡の都度オペレータが試薬溶液を調映し、装置Ｖ
ｃ上セツトなければならない不便があった。もつとも実
際には前もってＡ擬し、セットして２〈こと４行われて
いたが、ｔ″の場合、安定な合成を行えない？それかめ
つ九。

この発明の発明者は、鋭意研究の結果、公知のＤＮＡ等
合等値成績１１ｔ″改良ことに１虜した。　−かくして
、この発明によれば、反６器に複数の試薬溶液を所定Ｄ
＋銅で供給してｉ）Ｎム等の合成を行う装置１ｖｃｗい
て、種数の試薬もしくは溶媒を別＠にまたは同時に供給
して試嗅１ｄ液を調製町−な試薬１１１液＃ＪＩ４鏝用
各４を１以上風曙するとともに、そのｊｊｊ４＃！用谷
４でｄ４製した試薬溶液を反応器に供給する試薬溶液供
給手段を無端したＤＮＡ等合成装置が提供される。

この発明の装置の主な％徴は、（Ｉ）装置自身が試薬・
霧液Ａｌｌ製のための手段を興備してνす、これによ＃
７装−内で用時調袈可雇となること、２よび（＃）その
、４１１彊した試薬溶液が装置自身のもつ供給手段によ
り反応ａｖＣ供給されることにるる。

以Ｆ１図に示す夷―例に基いて、この発明を詳説する。

ただし、これによりこの発明が限定されるものではない
。

第１図に示す（１）は、この発明の一実ｍｎであり、ホ
スホトリエステル法によるＤＮＡ徽量自動合成装置でち
る。

反応器（２）は内ｔｌｌｙｍｒ　高さ１０■の円筒状の
本陣（３）の上方にす抄ばＳ）抹フランジ（４）を設け
た容器である。すりばち状フラ／／（４）には、多数の
試薬・＃液等供給＋１１７）ノズルが一層された伶（５
）が装着されている。そこで、本体（３）の頭部開口が
試４溶液等＠給口（６）となる。本体（３）の内部Ｙ方
にはガラスフィルタのごときフィルタ（７）が嵌着され
、さらに底部には排液口（８）が設けられている。フィ
ルタ（ｎは、ポリスプレ／、シリカビーズのごとき支持
体（９）を載置できる（通過さぞない）もので、試薬虐
１！１．　＄１．　　ガスｔ−ａ過させるものである。

フィルタ（７）の上Ｆ４ｇ！間が反応Ｓ（転）にな−、
約４５０μＩの容積の空間である。

ｑ毒〜嬶は溶媒で、それぞれ反応用溶媒としてピリジン
、乾１１１ｆｌｉ媒としてテトラヒトＱ７う／（ＴｆＩ
Ｆ）、洗浄用溶媒としてインプロパツールと塩化メチＶ
／の温合液である。

鱒は保鏝基説−用試液で、インプロパツールと虐ｆヒメ
チレンの温合溶媒に臭化亜虐を廖解し九廖液である。（
６）はマスキング用試薬で、無水酢酸とピリジ／の温合
液でろる。鱒はマスキングＩ＠−合剤で、ジメチルアミ
ノピリジンとピリジンの温合液でめる〇 上紀廖媒ＩＪＩ〜（至）νよび試薬溶液榊〜−は、１票
ガス圧によってそれぞれｔｆ（ロ）〜＠Ｊｔ介して反応
器（２）に供給されうる。弁−は１素ガスを反応ｉｆ＋
　（２）内へ直接供給する片でるり、鱒は排液片、（至
）は排気升でるる。これらの弁０〜Ｃ４は、マイクロコ
ンピュータのごとき制御回路（至）でその作動を制御さ
れる。なり、硼素ガスは塩化カルシウムのごとき乾燥剤
−で乾燥されている。

オペレータは、操作車（至）を介して制御回路（支）と
対話を行いうる。

ａｍ用容！ｎ、ｍ、４．・・・は、内容量１００μＩ〜
５００ｓ１位の１ｆ状容器４．（至）、（ト）、・・・
とシリコンゴＡ＊プ＃ム一、＠、（至）、・・・とから
なっている。セプタム（２）、−９（至）、・・・は、
脱着自在であり、かつ溶媒供給用ニードル−などを外部
から挿通しうるものでろる。これら！ｌｌｌ１用容器４
．鴫、（至）、・・・は、制御回路−にて作−を制御さ
れるター／テーブルに）上のホルダ一孔（至）＋　４・
・・に保持されている。

ターンテーブル（至）によって所定位置に４！Ｈ１ｌ＋
され九１４−用容器（至）には、ニードル上下機構−に
よってニードル（至）〜（至）が挿通される。その場合
、ニードル−は１素ガスの供給と排気とを行い、ニード
ル（至）は溶媒を供給し、ニードル（至）は内ｓｕｎ、
＊を４１−出すものでるる。

シリンジポンプ−は、プランジｆ駆動機構ｇ４によって
そのグラ／ジャ（４６ＪＬ）を駆動される。そして、斧
−を介してピリジン（ロ）を吸入し、斧−を介して＃Ｉ
Ｉ用容ｒＩ＠へそのピリジンを吐出する。

シリジンボンブーは、ブランツヤ駆＃ＩＩ機構（至）に
よってそのグラ／ジャ（４１ａｌ）を駆＃にされ、仲−
を介して＃−用容ＷｋＡ内の溶液を吸入し、斧−を介し
て反応器（２）へ吐出する。あるいは、弁−を介して他
のａＩｌｌｌＩｌ用容器に吐出する。

ニードル上下機構（至）、プラノジャ駆＊＊＊（至）１
弁−〜−の作動は、制御回路＠によって制御される。

１）Ｎムの合成に際しては、前もって反応器（２）内１
ｃＤＮムの末端１分のみを結合した支持体（１１）を入
れると共に、調製用容器４．・局、四、・・・に緒墨伏
態のヌクレオチド試薬（ト）と縮合剤［１−４−＠−ト
リメチルベンゼンスルホニル−３−二）（１９アゾリド
（Ｍ８ＮＴ））（至）を交互に入れてｐ〈。これらはい
ずれも粉末である。支持体（９）の量は、たとえば支持
体Ｌｇ）がポリスプレ／８Ｉ停の場合には盈０ダ〜５０
ダが適当である。ヌクレオチド試薬（イ）のｔは、支持
体ＶＣ＠合している翼クレオシドに対し８〜５当敏が適
当である。支持体（９）がポリスチレン粉体でヌクレオ
シドの債合盪がｏ、ｌ鳳ｍｏｌ／ｆの場合、支持体ｉｐ
当りに七ツマ−で４００ダ、ダイマーで７００ダ位が適
当であり、縮合剤（Ｂ）Ｖｉ同嫌の場合支持本１１当り
に５ｏｏｑ泣が適当である。ヌクレオチド試痰淘は、塩
基の違いによってモノ？−の場合で４４　ｆｌｍＴｏる
が、これらを、ＩＩｌ斃用客用容器れ分けてνく１績は
目的ｔ）Ｎムの環部配列のシーケンスと同じにり、？ν
〈。ダイマーやトリマーあるいはこれらの１合を用いる
場合も同皺である〇 ヒ記貰りレオチド試薬四と縮合剤（至）のセットは、Ｄ
Ｎム合成を実ｉｌＩにスタートする時鰯より以前であれ
ば庄原に行ってよい。何故ならば、いずれも繍１状喝で
上ッ卜されるので、不安定でないからである。

この装置（１）の基本的な―作はホスホトリエステル法
を用いた公知のむの棚の装置と原理的ＫＭじであるので
全般的説明は省略し、特徴のるる合成工種の動作につい
ての４＃脱する。

合成工種では、制御回路働け、ｔＦ−をよびプラノジャ
駆＃に礪１１１ＪＩを作−してシリンジメンブー内にピ
リジンｌＪ拳を少緻吸入し、弁−一を作動してそのピリ
ジンＱ拳を調製用容ａ四に供給する。ピリジンｔＪ１の
鍵は支持体（・）の量に基いて定めるのが好ましく、た
とえば支持体（９）がポリスチレン粉末の場合１ｆＴｏ
九９に５ｄ位とするのが好ましい。調製用ｇ器四内のヌ
クレオチド試薬淘はピリジン０１に溶解するので、所定
時間後には祠＊ＩｆＩｓｓ・層内はヌクレオチド試薬溶
液０ｆｃ１にる。第１図はこの状態をらられして匹る。

次にｍｓ＊＊ａは、斧−１斧−ｐよびプラノ−ジャ駆動
機構−を作−してシリ７ジポンプ鴎内に買クレオチド試
薬溶液０を吸入する。ついでニードル上Ｆ嫌構−と作動
してニードル（至）〜−を一製用容器四から引抜き、タ
ーンテーブル（至）を回転して次のＩＪＩ４Ｉｌ用ｓａ
Ａを所定位置に移−し、ニードル（〜Ａをその調製用容
４４に挿通する。次いでシリンジポンプ−内のヌクレオ
チド試薬溶液＜ａｔ　ｔ　、１１１１製用搏器−内に供
給し、縮合剤（均を溶解する。

所定時間後にはｆＩ１４製・Ｉ容器、ｄ内は、スクレオ
チド試４四と縮合剤（Ｂ）とを含む試薬溶液となるので
、芹−２−１（ロ）を作動してその試４ｍ液を反４５器
（２）に供給する。

これによって反応４（２）内で縮合反応が生じ、新友な
ヌクレオチドがＤＮＡの末ｍｓ＋に連結されることにな
る。

さて上記実施例のＵＳム黴量自−合成装置（１）Ｋよル
ば、縮合剤のＭ　Ｓ　Ｎ　’ｒ　（Ｂ）は安定な績１状
−でストックされ、不安定な溶液状趨にされるのは使用
される１藺でろる。従って任意の時間にＬ）Ｎム合成を
始めても確実に安定な合成が行われることになり、大変
便利になる。すなわちＯＮム合成を始める都度試ｓｌ＃
液ｔ−調製しなくてもすむようになり渫子がｆＩＩ段Ｉ
Ｃ容易になる。

な♂、上記績１Ｉｔ（１）では、反応器（２）の反応部
端を小塵化すると共に、フィルタ（７）の上に支持体（
荀を載置し、上方から試＃＆溶液ａ瑠〜（至）を供給し
、底部から排液するように反応器（２）を構成している
。そこで排液弁−を閉じたｔま試薬溶液を上方から供給
すれば、その試薬溶液は支持体（９）に含まれてこれを
廖濶すると共にフィルタ（７）より上の反応部輪重にと
どまって下方へ落ちない。従って、供給し九全ての試薬
省液が反応に参加し、デッドスペースに看まるものが無
くなる。このｍＬ供論量は最低量（支持体体積の５〜７
倍位）で光分にな−１また反応を促進するために反応器
を一盪するなどの温合・接触操作も無用になっている。

また、新丸なヌクレオチドを連結する反応の前に反応ａ
（り内を＃Ｌｗａ＃４溶媒たとえばＴｋｉｌｌ（至）で
洗浄乾犠すると共に乾量ガスでグローして短時間で反応
１！　（Ｚ＞内を完全乾量できるように構成されてν９
、この−乗、縮合反応を阻害する水分を完全ｖｃ繍去で
きるので反応効率が下がらず、余分な試薬を必要としな
い。

Ｉｉ！ｆ局、上記実施例のＤＮム欽量自−合成装置（１
）は、多くの一点から無駄をなくし九装置である。

変形例としては、反応器（２）をロート状にしたもの、
錦秋にしたもの、また反応部の内容積を８０μｍ〜８０
　Ｏｓｌの間で変化しえものが挙げられる。また固体支
持体としてにａｔ−Ｆ・ｇスチレン、シリカゲル、ポリ
アクリルモル７オリドなどを用いたものが挙げられる０
これらの支持体は粒径ｇｏ−ｓｏｏｓｍｓ度のも（７）
カ好ましい。

さらに他の変形例としては、反応器（２）の栓（５）を
シリコンゴムセプタムとし、試ＩＥ＃液などの供給をニ
ードルを挿通して行うようにしたものが挙げられる。ま
え逆に調製用容ａ四、４．・層、・・・を固定位置とし
、それぞれに栓を設け、その栓にニードルＡ〜（至）と
同じ働きをするノズルを各々固設したものが挙げられる
。

他の実施例としては、ホスホモノトリアゾリド法やホス
ファイト法、あるいはジエステル法によるＤＮム等合成
装置にこの発明を適用し丸ものが挙げられる。

ホスホモノトリアゾリド法に適用する場合を鵠起装置（
１）　を基本にして説明すると、第１図に２１て斧−を
ピリジンａ拳のタンクにＩＩＩＩ！せずに＠えなり／り
ｖｃＩＩ絖し、その夕／夕にリン酸化試＠えとえば０−
クロロフェニルホスホロジトリアゾリドを入れてそれを
膚ＩＩＦ＠容Ｓ（至）、（２）、・・・に供給できるよ
うにする。ｔえ中成の翼りＶオプト鱒導体をｌ的１）Ｎ
ムの塩基配列のシーケンスと合わせ九顆（ｌｅａ邸ｅ（
塩基）はアデニン、グアニン、シトジノもしくはチミ／
〕 シリンジポンプ−、プランジャ駆−機構（至）、弁−は
省いてよい。Ａｌｌに際しては、（１）式Ｏ寓タレオプ
ト鱒導体１０に対し０−クロロフェニルホスホロジトリ
アゾリド９〜ｔｏｔｍえて所定時間反応させスクレオチ
ド試＊＊液とする。このヌクレオチド試薬溶液は不安定
であるが、（１）式Ｏ買タレオチドー導体とＯ−クロロ
フェニルホスホロジトリアゾリドはそれぞれ安定でろる
から所望の効果が得られる。

ホスファイト法に適用する場合を同嫌に説明すると、弁
−をピリジンＤＩの夕／りに接続せずにＴＨＩ’＠のタ
ンクに接続する。まえ調製用容器場。

ＤＮムの塩基配列のシーケンスと合わせた願で入れてν
く。

（Ｂａｓｅ（塩基）はアデニン、グアニン、シトシンも
しくはデミン〕 シリンジポンプ＠、プランジャ駆ｌｌｂ機構（至）、弁
−は省いてよい。調製に醸しては、（Ｉ）式のヌクレオ
チド試薬にＴ■！を加えて真タレすチドｉｉｃ薬廖液と
する。

以上のａ＃４から［）ｌされるように、この発明０１）
Ｎム等合成装置によれば、不安定な試薬溶液は用時に１
１１Ｉｌされて使用されることになる。そこで藺もって
賦４＠をセツティングして？いても確実に安定な合成を
行える効果がＴｏＬ保守画からも望ましいものとなる。

まえ途中で反応をストップした場合も、残つえ賦１［Ｏ
１１収が可−で６秒、４価な試薬を＾費することがない
。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のＤＮム等合威装置の一実論例でろる
１）ＮＡ黴量自−合成装置の構成Ｉｌ明図、第２図は同
装置の―作の７０−チャート図である。 （１）−・・ＤＮム黴量自勅調ｌＩｌ値装、（呻・・・
反応器、　　　　Ｑｌ−・反応用溶媒、■・・・制御回
路、ｇ４（至）（至）−一調製用容器、−〜−・・・ニ
ードル、　（至）・・・ニードル上下機構、Ｉａｕｅ・
・・グツ／ジャ駆＊＊構、 −一・・・シリンジポンプ、 両・・・翼クレオチド試薬、（均・・・縮合剤、０・・
・ヌクレオチド試薬溶液。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ２反応器に複数の試薬溶液を所定の十頓で供給してｌ
   ）Ｎム等の合成を行う装置に２いて、複数の試薬もしく
   は溶媒１別−にまたは同時に供給して試薬溶液をｌｌ１
   ｌＩ１１町艶な試薬溶液調製用ｇ器を１以上残漬すると
   ともに、その嘴製用ｄ器でＡ＠Ｉ、九試薬宴液を反応器
   に供給する試薬害液供給手段ｆ：成−したことを特徴と
   するＤＮム等合成装置。 ２、　　、Ｊｌｌ用各４が、層脱ロエ叱なゴムセプタム
   部を有する市閉町ｈ８な容４でろり、試栗廖液供給手段
   が、反応器に固設された吐出ノズル、前記セプタム部に
   挿脱”Ｔ総なニードル、七のニードルより調輌用＄６内
   の試薬溶液を吸入しＩＩｌ記吐出ノズルから吐出しうる
   送液手段、２よび一製用各６が痕数の１合にそれらＶＣ
   対しニードルを相対移動しニードルを挿脱する移一手段
   からなるものである特許請求のＩ［−鎮１項記−の装置
   。 ａ、　　Ｓ＊用用益４、着脱打錠なゴム七ブタ五Ｓｔ有
   し、液状試薬もしくは溶媒を供給されるノズルと内椰か
   ら試薬溶液を吸入されろノズルとを固設さｎ九密閉町姥
   な！！！器でめり、試県嬉液哄給手段が、反応器ｖｃ（
   舗設された吐出ノズルＳ′ｓ″よびｍ記嘴製用容器のノ
   ズルから試薬溶液を吸入し前記吐出ノズルから吐出しう
   る送１［そ段からなるもので娶る特許請求の範囲第１嘱
   妃峨のｔ！置。 ４、反応４が、上Ｓにゴムセプタム部を有し１内部下方
   にυＮ八へ合成哨の１参支持体ｔ−１１町−でかつ試薬
   溶液を４遍しうるフィルタを何し。 底部に排液口１＊する密閉可屈な容器でろセ、ｄ４１１
   ｍ容器が、着脱ｑｆ７Ａなゴふセプタム部を有する゛酒
   閉ａＴ庇な容器で６９、拭県虐液供給手家が、溶媒もし
   くは液状試薬のタンクに固設されたノズル、前記セプタ
   ム部に挿脱ａｌ艷なニート。 ル、前記ノズルよ抄溶媒もしくは液状試薬を徴人し前記
   ニードルから吐出ＯＴ舵でかつそのニードルから試薬・
   官液を吸入し吐出しうる送液手段。 νよびニードルを前記反応器や調製用ｇ器に対して相対
   ！１ｆＩｈシ二一ドルを挿脱するａｍ手段からなるもの
   である特許請求の範８第１項記載の装置。