JPS58101696A - 抗生物質の単離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトマインス菌株から構成される装置ハヘネム（
ｃａｒｂａｐａｎｅｍ　）構造、例えばチェナマイシン
（ｔｈ１θｎａｍｙｃｉｎ）基およびオリパン１％１（
ｏｌｉｖａｎｉｃａ、ｃｉｃｌ）基を有するβ−ラクタ
ム抗生物質は抗微生物活性が特別に高いことそして作用
範囲が広い点で際立っている。この群の抗生物質は同時
に種々の起原のβ−ラクタマーセの高度に有効な抑制剤
または不活性化剤である。醗酵溶液からこれらの物質を
単離することはそれらが化学的に極度に不安定なので著
しく困難である。例えば、中程度のｐＨ範囲（ＰＦ（６
〜８）の水溶液中における化学的分解の半減期はチェナ
マイシンでは条件の如何により０．３−６時間（「Ｊ、
Ａｎｔｉｂｉｏｔ、ｊ＠５２巻第１〜１２貞（１９７９
年）〕であり、そしてオリパン酸では４〜２７時間［ｒ
　Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔ、　Ｊ第３２巻第２９５〜３０
４頁（１９７９年）〕である。

この不安定性は単離および濃縮の過程ＶＣおいて出現す
るような比較的＾い抗生物質濃度に際してさらになお強
められる。その結果、単離操作の経過中に抗生物質活性
が多く失われる。この損失は、醗酵溶液中における活性
が生成物産生が最高に達した後および終了後に非常に速
かに低下するという事実によりさらに高捷り、このこと
はとりわけ高められた醗酵温度（２８〜′５０℃）で増
強されたカルバはネム抗生物質の不安定性に帰せられた
。単離の開始時に通常の方法で実施されるストレプトマ
イシス菌糸体の濾過は、速かに充分冷却され得ない比較
的大きい醗酵バッチにおいて特に多大なる活性損失をき
たす。従ってこの分野において慣用のイオン交換体を用
いる第１番目の濃縮工程（引用文献参照）の後では活性
回収率は１０〜４０％である。

それゆえ前記抗生物質の醗酵過程を生成物産生の最高時
に停止し、そして全活性を直接安定化された形態に変換
することが望ましい。

今や驚くべきことＶＣ１抗生物質を生成物産生の最高時
に適当なイオン交換樹脂に吸着させそしてこの樹脂を醗
酵溶液から分離することにより、醗酵を所望の時点で中
断しそして安定化された形態に変換できることが見出さ
れた。

吸着は例えば醗酵溶液中に抗生物質活性を結合するイオ
ン交換樹脂を加えそしてこの醗酵溶液分例えば冷水で希
釈することにより速かに約１〜１０℃、好ましくは１〜
６℃に冷却することで遂行されうる。

なお、好ましいのは、イオン交換樹脂を１〜１０℃、好
ましくは１〜６℃の冷水中に懸濁させそして醗酵溶液を
この懸濁液中にポンプで送ることであり、その場合速か
な冷却および抗生物質活性の即座の結合が達成される。

２次的効果として醗酵溶液が同時に水で希釈される。

イオン交換樹脂としては本発明の場合好ま１７−５　＝ くは中程度ない１７強度の塩基性を有しそしてわずかな
交叉結合および多孔性構造を有する陰イオン交換樹脂例
えばダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）　１ｘ２、アンバーラ
イト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　）工ＲＡ−４０１８、アン
バ−ライト’ＩＲＡ−９００が適当である。

醗酵溶液および菌糸体からの交換体の分離は前記のよう
に希釈された醗酵溶液から沈降（析出）させることによ
り遂行されうる。他の実施態様においては、イオン交換
体および菌糸体を含有する希釈された醗酵溶液を、イオ
ン交換体を保有しそして菌糸体を通過せしめる適当な篩
、例えば振動篩〔例えば［バーフルックス（ｐｅｒｆ１
ｕｘ■月〕を通して濾過する。

できるだけ沈降時間を少くするには、樹脂の厚さが菌糸
体のそれより相当厚いイオン交換体を選択するべきであ
る。その他、商業上の樹脂においてはできるだけ粒子直
径が大きいこと、　６− 例えば３００〜８００μに相当する２０〜２５メツシユ
であることが必要である。

適当な樹脂を使用しそして前記方法により操作するなら
ば醗酵溶液中に産生された活性の９０係以上がイオン交
換体に結合される。樹脂は直ちに慣用の方法でさらに処
理されうるが捷たけ過剰の水分を吸引濾過した後冷凍さ
れそしてまた操作に使用されるまで約−２０′Ｃで貯蔵
されうる。この状態で、結合された抗生物質は少くとも
２〜３か月間安定である。

抗生物質活性を単離するにはイオン交換樹脂を既知方法
で塩浴液例えば塩化ナトリウム、酢酸すＩ・リウム″Ｌ
！たは塩化カリウムを用いて溶離する。その場合約５５
〜８０％に達ｌ−うるｍ離収情を＾めるために場合によ
り水と混和（〜うる有機溶媒例えばメタノール、インプ
ロパツールまたｄアセトンが好ましくは２０〜８０％の
濃度第１の精製工程の縮収率は醗酵溶液中の活性に基い
て約５０〜７５係に達する。

チェナマイシンおよびオリパン酸抗生物質の活性は適当
な試験用細菌例えば大腸菌、枯草菌を用いる微生物学的
試験（寒天拡散試験、混濁測定試験）により常法で測定
されうる。好都合な迅速試験と【、ては例えば新規な色
原体たるβ−ラクタマーゼ基質ＰＡＤＡＣおよびＣＥｊ
Ｎ’ｌ’Ａ　［Ｐ。

５ｃｈｉｎｄｌｅｒ氏他ｒ２１ｔｈ工ｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎ　Ａｎｔｉｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａ、ｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈ
ｅｒａｐｙＪ抄録（１９８１年発行）参照〕によるβ−
ラクタマーゼ抑制剤作用の測定が特に適する。この方法
ＶＣより測定された活性は酵素抑制剤単位（ｕｇ５０／
ｍｅ　）として示される。

以下の例により本発明を駁、明する。

例　　１ 数種のオリパン酸成分を産生じそして醗酵〔例えばｊ　
、Ｔ、Ａｎｔｌ、ｂｌ、ｏｔ。１第５２巻第２９５〜３
０４頁（１９７９年）参照〕に際して４２時間後に酵素
抑制剤単位で測定して最大活性１５ｏｎ；５［１／ｒｎ
ｌ（＝　１５００００υＥ５０）に達するストレプトマ
イセス ’ｆ−　Ｎ，を拌および同時に冷却しつつ冷水の添加に
より６℃に冷却し、この時点で陰イオン交換ｓＩ脂（ｒ
ダウエックスＩＸ４Ｊ２０〜５０メツシュ）３００？を
加える。３０分後に醗酵溶液を底部に排出口を有するＰ
斗形容器に入れそして交換体樹脂を析出させる。充分に
沈降させた後、底部から取り出された樹脂から菌糸体残
留物を除去するために水で傾瀉洗浄しそして常法例えば
溶離によりさらに処理する。この樹脂は１３８００ｏ［
］Ｅ５０（９２％）を含有し、分離されたｔ田酵溶液中
には１２０００　ｕｍ５０（８％）が一　９　− 測定される。得られた吸着質を冷却および攪拌下［５０
％アセトン中の６％ＫＣｔ溶液１．２ｔと共に処理しそ
してこの樹脂を３時間後に濾過により分離する。溶出溶
液は９３０００　［ＪＥ５０（６２係）を含有しており
そ１〜で常法によりさらに処理されつる。

例　　２ ストレプトマイセスＹ　５６３３Ａ菌株の醗酵溶液１７
５ｔを３８５００００ＵＥ５０に相幽する２２．ＯＵＢ
５　０　／　ｍｌ！の最太抗生物質活件に到達した後１
σちに、陰イオン交換体アンバーライトＩＲＡ−４０１
　８　（　２　０〜５０メツシユ）６ｔを６℃の水４０
０を中ＶＣ懸濁して含有する底部弁を備えた受は容器中
にポンプで送る。１時間攪拌後、樹脂を約３０分間沈降
させそしてこれを受は容器の底部弁から１　５　０　１
１のメツシュ幅を有する篩・２通して取り出す。面上に
保有される交換体樹脂を容器中で菌−１　　（１　− 糸体部分が除去されるまで冷水（６℃〕で傾瀉洗浄しそ
して吸引沖過して表面を乾燥させる。

この樹脂（３，６ｈ）は３６２００００ＵＥ５０（９４
係）を含有しており、醗酵溶液中にはなお２３００００
ｕｉ５０（６％）が含有される。

かくして得られた吸着質ｉｉ’　−２［３’Ｃで少くと
も２ｔ月間活性を失なうことなく貯絨されうる。

溶離を行うにはイオン交換樹脂を冷却用ジャケットを有
するカラムに充填しそして冷却（６℃）下に５（ｌアセ
トン中の６俤塩化カリウム溶液を用いて溶離する。５０
０＋Ｊずつのフラクションを抑制剤試験においてその活
性について検査する。主活性部分（２４６２００００に
５０−６８係）はフラクション１２〜２０の中に存在す
る。これらフラクションを合し、高真空下に濃縮して０
．９ｔとす【７、ぞしてダイヤイオン（Ｄｉａｉｏｎ）
ＨＰ　−２０吸着用樹脂６ｔを含有する冷却されたカラ
ムに加えそして活性を冷水で溶離させる。

２１３６０ＤＯＴ［５０＝５９係を含有する活性な塩不
含フラクション（１０〜１４）を合しそして凍結乾燥す
る。ここで得られた粗製抗生物質混合物を既知方法でさ
らに精製する。

例　　６ 、ｔ　リバン［ｓ＝生性ストレプトマイセス第弟妹５６
３３Ａを栄養溶液３を中で常法により培養しそしてこの
醗酵溶液が３８時間後に生成物の最大産生に達すると水
６を中のアンバーライトＩＲＡ−４０１８（２０〜５０
メツシユ）９０ｔの４℃に冷却し友懸濁液中に加えそし
て樹脂を例１記載の方法で分離する。この樹脂は醗酵溶
液中に測定された活性の９０係を含有する。

活性部分を溶離するにはアンバーライ）　ＩＲＡ−４０
１８をカラム（２，５ｘ３０ｃｒｎ）中に充填しそして
活性部分を５０％アセトンおよび５０％アセトン中のｆ
３　％　ＫＣｌの線状勾配を用いて溶離する（各フラク
ション９２０ｍ１）。主要な活性は゛フラクション１１
〜２１中に見出され、溶離収綾ｒ１５５憾である。

特許出願人　　ヘキスト・アクナエンゲセルシキット１
３−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）産生された抗生物質をその生成物産生の最高時にお
   いて適当なイオン交換樹脂に吸着させ、それにより安定
   化された形態に変換しそしてこの樹脂を醗酵溶液から分
   離することを％徴とする、醗酵溶液からの化学的に不安
   定なカルバはネム（ｃａｒｂａｐｅｎθｍ）抗生物質の
   単離法。 ２）イオン交換樹脂として中程塵ないし強度の塩基性を
   有する陰イオン交換体を使用することを特徴とする、前
   記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）陰イオン交換樹脂が好ましくは２０〜５０メツシユ
   の粒子寸法を有することを特徴とする、前記特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ４）イオン交換樹脂を適当な時点で醗酵浴液に加えそし
   てこの溶液を迅速に冷却することを特徴とする、前記特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ５）冷水中に懸濁されたイオン交換樹脂を含有する受は
   容器中に［９酵溶液をポンプ給送することを特徴とする
   、前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６）陰イオン交換体を沈降により醗酵溶液から分離する
   ことを特徴とする、前記特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ７）陰イオン交換体を保持するが菌糸体を通過せしめる
   適当な篩で濾過することにより醗酵溶液から陰イオン交
   換体を分離することｅ％徴とする、前記特許請求の範囲
   第１項記載の方法。