JPH1180196A - ＬｃｋＳＨ３ドメイン結合蛋白質及びそれをコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＬｃｋＳＨ３ドメインに結合する蛋白質を見
出し、それをコードする遺伝子を取得してその一次配列
を明らかにし、さらにその遺伝子を利用して前記蛋白質
を産生させる。 【解決手段】 下記の（Ａ）又は（Ｂ）の蛋白質。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有す
るアミノ酸配列を有し、かつＬｃｋＳＨ３ドメインに結
合する性質を有する蛋白質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はＬｃｋＳＨ３ドメイ
ンに結合しＴ細胞受容体からの信号伝達の制御に関与す
る新規な蛋白質及びそれをコードする遺伝子、並びに該
遺伝子を含有する形質転換体による該蛋白質の生産方
法、当該蛋白質あるいは遺伝子を用いた特異的抗体産生
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｔ細胞受容体からの細胞内情報伝達は、
液性免疫から細胞性免疫まで多岐にわたる様々なエフェ
クター反応の引き金としての大切な役割を担っている。
このＴ細胞受容体からの細胞内情報伝達系を修飾するこ
とにより、これまで治療が困難であった癌、自己免疫疾
患といった病気に対処が可能になると思われる。すなわ
ち癌の治療としては、Ｔ細胞受容体からの細胞内情報伝
達を増強することによって免疫系の癌細胞に対する応答
を高めるといったことが考えられる。また、多発性硬化
症、リュウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデスなど
といった自己免疫疾患においては、Ｔ細胞受容体からの
細胞内情報伝達を遮断することで免疫系の過剰な反応を
抑制することができる。

【０００３】Ｔ細胞に特異的に発現するプロテインチロ
シンキナーゼＬｃｋは、Ｔ細胞受容体からの細胞内情報
伝達系において中心的な役割を果たすことが知られてお
り（Ｃｅｌｌ ７０：５８５−５９３，１９９２）、Ｓ
Ｈ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、キナーゼドメインと呼
ばれる３つの領域より構成されている。このうち、キナ
ーゼドメインがＴ細胞の活性化に必須であることが示さ
れて以来（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１１３６−１１３
８，１９９４）、免疫抑制剤としてのＬｃｋのチロシン
キナーゼ阻害剤の探索が進められてきたが、未だ特異的
な化合物は発見されていない。本発明者らは先に、Ｔ細
胞活性化情報伝達経路の詳細な機構の解明を目指して鋭
意研究をおこなってきた結果、Ｔ細胞の活性化にはＬｃ
ｋのＳＨ３ドメインも同様に必要不可欠であることを見
いだしている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：７
１５１−７１６０，１９９６）。その機能として、Ｔ細
胞活性化情報伝達に関与する分子を、ＳＨ３ドメインを
介してＴ細胞受容体直下のチロシンンキナーゼを主体と
する複合体へ導入する可能性が示唆されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、特異性の高
いＴ細胞受容体からの情報伝達経路の作用機序を利用し
た医薬開発、およびその情報伝達蛋白質の変異に起因す
る異常を検出する遺伝子診断に利用するための遺伝子配
列の情報を得ることを目的とし、そのためにＬｃｋＳＨ
３ドメインに結合する蛋白質を見出し、それをコードす
る遺伝子を取得してその一次配列を明らかにし、さらに
はその遺伝子を利用して前記蛋白質を産生させることを
課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、かかる目
的に有用な新規な蛋白質、すなわちＰａｌ１を見いだ
し、当該蛋白質をコードする遺伝子を初めて単離した。
さらに、そのＤＮＡ塩基配列およびそれにより推定され
るアミノ酸配列を明らかにし、またこの遺伝子の一部あ
るいは全体を発現ベクターに組み込み形質転換体を得
て、その形質転換体により本蛋白質を産生させることに
成功した。さらに、産生させた蛋白質をウサギに免疫す
ることで本蛋白質に対する抗体を取得することに成功
し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明の要旨
は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）の蛋白質に存する。

【０００６】（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有
する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有す
るアミノ酸配列を有し、かつＬｃｋＳＨ３ドメインに結
合する性質を有する蛋白質。

【０００７】また本発明は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）の
いずれかの蛋白質をコードするＤＮＡ断片を提供する。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有す
るアミノ酸配列を有し、かつＬｃｋＳＨ３ドメインに結
合する性質を有する蛋白質。

【０００８】上記ＤＮＡ断片として具体的には、下記の
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ断片が挙げられる。 （ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片。 （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬｃｋ
ＳＨ３ドメインに結合する性質を有する蛋白質をコード
するＤＮＡ断片。

【０００９】また本発明は、上記ＤＮＡ断片又はその一
部を含む組換え発現ベクター、及びさらにタグ配列をコ
ードするＤＮＡ断片を含み、前記ＤＮＡ断片又はその一
部がコードするポリペプチドとタグ配列との融合蛋白質
を発現する組み換え発現ベクター、を提供する。

【００１０】本発明はさらに、上記組み換え発現ベクタ
ーで、宿主細胞を形質転換させて得られた形質転換体、
及び上記形質転換体を培養し、その培養物から前記ポリ
ペプチド又は融合蛋白質を採取することを特徴とする、
ＬｃｋＳＨ３ドメイン結合蛋白質の生産方法を提供す
る。

【００１１】本発明はまた、前記（Ａ）又は（Ｂ）の蛋
白質又はその一部に結合する抗体を提供する。さらに本
発明は、配列番号１に示す塩基配列の少なくとも一部に
相補的な配列を有する１０塩基以上の長さからなるＤＮ
Ａ断片又はＲＮＡ断片であって、前記（Ａ）又は（Ｂ）
の蛋白質のｍＲＮＡを検出し得る核酸プローブを提供す
る。

【００１２】本発明はまた、上記抗体及び／又は核酸プ
ローブを用いてＬｃｋＳＨ３ドメイン結合蛋白質の発現
を調べることを特徴とする免疫系の病態の評価法を提供
する。以下、上記（Ａ）又は（Ｂ）の蛋白質を「Ｐａｌ
１」又は「本発明の蛋白質」、該蛋白質をコードするＤ
ＮＡ断片を「本発明のＤＮＡ断片」ということがある。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の蛋白質Ｐａｌ１は、配列表配列番号２に示すア
ミノ酸配列を有する。Ｐａｌ１は、例えば、本発明によ
りＰａｌ１をコードするＤＮＡ断片が得られたので、こ
のＤＮＡ断片を微生物や培養細胞等に導入して発現させ
ることによって得ることができる。

【００１４】Ｐａｌ１をコードするＤＮＡは、例えば、
次のような方法によって、ヒトのｃＤＮＡライブラリー
から得られる。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｊｕｒｋａｔ
細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １５２；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１３３：１２３−１２８，１９８５）等のヒト細胞から
ｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製
し、ファージベクターあるいはプラスミドベクター等の
適当なベクターに連結することにより得られる。ｍＲＮ
Ａの精製及びｃＤＮＡライブラリーの調製は、公知の方
法によって行うことができる。また、ＺＡＰ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社）のような市販のキットを用いることもできる。

【００１５】ベクターとしてλファージベクターを用い
た場合は、例えばギガパック・ゴールド（プロメガ・バ
イオテック社）などのイン・ビトロ・パッケージング・
キットを説明書に従い使用し、いわゆるイン・ビトロ・
パッケージングを行えば、組換えλファージＤＮＡを有
するλファージ粒子を得ることができる。上記のＺＡＰ
Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔには、イン・
ビトロ・パッケージング用の試薬も含まれている。ま
た、ベクターとしてプロモーターを有する発現ベクター
を用い、ライブラリーＤＮＡで適当な宿主を形質転換す
ると、ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを発現させる
ことができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓベクタ
ーは、ｌａｃプロモーター及びβ−ガラクトシダーゼの
構造遺伝子（ｌａｃＺ）の一部を含み、ＥｃｏＲＩ部位
にｃＤＮＡがｌａｃＺと同一のフレームで挿入される
と、ｃＤＮＡがコードするポリペプチドとβ−ガラクト
シダーゼの一部との融合蛋白質がｌａｃプロモーター制
御下で発現する。

【００１６】ｃＤＮＡライブラリーから、ＬｃｋＳＨ３
ドメインに結合する性質を有する蛋白質をコードするク
ローンを選択するには、ファーウェスタンブロットを行
えばよい。すなわち、例えば、λｃＤＮＡライブラリー
のプラークをメンブレンにレプリカし、これにＬｃｋＳ
Ｈ３ドメインと適当な蛋白質（タグ蛋白質）との融合蛋
白質、タグ蛋白質に対する抗体、この抗体に対する標識
化二次抗体を、順次結合させ、標識を検出することによ
って、ＬｃｋＳＨ３ドメインに結合するポリペプチドを
産生するクローンを選択することができる。このような
プローブとしては、ＬｃｋＳＨ３ドメインとグルタチオ
ン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質
が挙げられる。

【００１７】選択されたクローンから、目的のクローン
をさらに選択するには、上記プローブ（ワイルドタイ
プ）の他に、例えばＬｃｋの１１２番目のプロリンをロ
イシンに置換した変異体とＧＳＴの融合蛋白質、及びＧ
ＳＴ蛋白質をプローブとしてファーウェスタンブロット
を行い、ワイルドタイプのＬｃｋＳＨ３ドメインとＧＳ
Ｔの融合蛋白質とのみ結合するクローンを選択すればよ
い。Ｌｃｋの１１２番目のプロリンをロイシンに置換し
たＬｃｋＳＨ３ドメインの遺伝子を導入したＪｕｒｋａ
ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体からの情報伝達を著しく阻害さ
れる。このＬｃｋの１１２番目のプロリンは、ＳＨ３ド
メインにリガンドが結合するポケットの位置に相当する
ので、この変異によりリガンドが結合できなくなり、そ
の後の情報伝達が阻害されると考えられる。したがっ
て、前記変異体を使用することにより、ＳＨ３ドメイン
の真のリガンド結合部位に結合するタンパク質を選択す
ることが可能となると考えられる。

【００１８】次に、得られたクローンからｃＤＮＡ断片
を回収し、塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、Sa
ngerらのジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Vol.74, 5463(1977)］によって行うことができる。配列
の決定はＡＢＩ３７３Ａ（アプライド・バイオ・システ
ムズ社）のような自動シークエンサーによって行うこと
もできる。その結果、オープンリーディングフレームが
得られない場合には、さらに完全長を有するｃＤＮＡク
ローン又は全長に満たない部分を補完するｃＤＮＡクロ
ーンを再度選択する。これらのクローンの選択は、上記
にようにして得られたｃＤＮＡクローンをプローブと
し、前記と同様にして調製したｃＤＮＡライブラリー又
は市販のヒトｃＤＮＡライブラリー等の公知のライブラ
リーから、ハイブリダイゼーションにより選択すること
によって行うことができる。

【００１９】上記のようにして、後記実施例で取得され
たＰａｌ１をコードするＤＮＡ断片の塩基配列、及びこ
のＤＮＡ断片がコードするＰａｌ１のアミノ酸配列を、
配列番号１及び２に示す。

【００２０】本発明の蛋白質は、配列番号２に示すアミ
ノ酸配列を有する蛋白質の他、ＬｃｋＳＨ３ドメインに
結合する性質を有する限り、配列番号２に示すアミノ酸
配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠
失、挿入又は転移を有するアミノ酸配列を有するものも
包含する。ここで数個のアミノ酸の欠失とは、本発明の
蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白
質の部分ペプチドであってもよいことを含む。例えば、
配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質は、プロ
セシングを受けてＰａｌ１成熟タンパク質を生成する可
能性が高いが、本発明のタンパク質には、このようなプ
ロセシングを受けたＰａｌ１も含まれる。

【００２１】また、本発明のＤＮＡは、配列番号２に示
すアミノ酸配列を有する蛋白質の他、ＬｃｋＳＨ３ドメ
インに結合する性質を有する限り、配列番号２に示すア
ミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置
換、欠失、挿入又は転移を有するアミノ酸配列を有する
蛋白質をコードするＤＮＡを包含する。このようなＤＮ
Ａは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＤＮＡ又
はこれを有する細胞に変異処理を行い、これらのＤＮＡ
若しくは細胞又は自然突然変異株若しくは変種から、例
えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列又はその一部
の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡを選択することによって、
得ることができる。ここでいう「ストリンジェントな条
件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、
非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。こ
の条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を
示せば、相同性が高い核酸同士、例えば９０％以上の相
同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより
相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙
げられる。

【００２２】上記のようにして得られる、特定の部位又
は未知の部位が変異した改変ＤＮＡ断片を、適当な細胞
で発現させ、その発現産物について、ＬｃｋＳＨ３ドメ
インに結合する性質を調べ、そのような性質を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡを選択することにより、目
的のＤＮＡを取得することができる。また、アミノ酸配
列が改変されたＰａｌ１をコードするＤＮＡは、例えば
部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されるように本発明のＤＮＡの塩
基配列を改変することによっても得られる。

【００２３】上記のようにして得られるＰａｌ１をコー
ドするＤＮＡ断片又はその一部を発現ベクターに挿入
し、得られる組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形
質転換し、その形質転換体を培養し、その培養物からＰ
ａｌ１を採取することによって、Ｐａｌ１を生産するこ
とができる。Ｐａｌ１をコードするＤＮＡ断片の全長を
用いた場合には完全なＰａｌ１が、Ｐａｌ１をコードす
るＤＮＡ断片の一部を用いた場合には、Ｐａｌ１の部分
ペプチドが得られる。さらに、前記組換え発現ベクター
が、Ｐａｌ１をコードするＤＮＡ断片又はその一部に加
えて、タグ配列をコードするＤＮＡ断片を同一フレーム
で含む場合には、Ｐａｌ１又はその部分ペプチドとタグ
配列との融合蛋白質が得られる。このような融合蛋白質
は、タグ配列に対する特異的なリガンドを用いることに
より、容易に精製することができる。例えば、タグ配列
としてＧＳＴを用いた場合は、Ｐａｌ１とＧＳＴとの融
合蛋白質は、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマ
シア社）を用いて精製することができ、精製された融合
蛋白質を、トロンビンで消化することによってＰａｌ１
を切り出すことができる。また、タグ配列として、ヒス
チジンが６個以上並んだアミノ酸配列、いわゆるヒスチ
ジンタグを用いる場合には、ＴＥＶプロテアーゼや第１
０因子により特異的に切断される配列をヒスチジンタグ
とＰａｌ１の間に組み込むことにより、キレートカラム
で融合蛋白質を精製した後に、ＴＥＶプロテアーゼ又は
第１０因子で消化して、Ｐａｌ１を切り出すことができ
る。プロテアーゼによる切断後は、Ｐａｌ１をＨＰＬＣ
等により分離、精製することができる。

【００２４】発現ベクター及び組換え発現ベクターを導
入する宿主は、通常の遺伝子組換え技術を用いたヒト蛋
白質の生産に用いられるものであれば特に制限されない
が、宿主細胞に適したプロモーターを含むものが用いら
れる。例えば、宿主がＣｏｓ７細胞、Ｊｕｒｋａｔ等の
ヒト細胞の場合にはｐＢＫ−ＣＭＶ ｐｈａｇｅｍｉｄ
ｖｅｃｔｏｒ、ｐＤＲ２等が、大腸菌（エシェリヒア
・コリ(Escherichia coli)）等の細菌の場合には、ｐＦ
Ｔ−３ａ等が、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母
の場合にはｐＢＩ１０１等が挙げられる。また、発現ベ
クターは、宿主細胞に形質転換した際の選択マーカーを
含んでいてもよい。

【００２５】組換え発現ベクターによる宿主細胞の形質
転換は、宿主細胞が動物細胞の場合には、ＤＥＡＥ−デ
キストラン法、リン酸カルシウムによるトランスフェク
ション法等が用いられる。上記のようにして得られる形
質転換体を培養し、その培養物からＰａｌ１又はその部
分ペプチドを採取することによって、Ｐａｌ１又はその
部分ペプチドが得られる。このＰａｌ１又はその部分ペ
プチドを抗原として用い、通常の抗体の取得法と同様に
してウサギ等の動物を免疫し、その動物から血清を調製
するか、又はその動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞
とを融合してハイブリドーマを得、そのハイブリドーマ
を培養し、培養液から免疫グロブリンを採取することに
よって、Ｐａｌ１又はその部分ペプチドに結合するポリ
クローナル抗体又はモノクローナル抗体が得られる。ま
た、Ｐａｌ１又はその部分ペプチドで鳥類を免疫し、該
鳥類が産卵した卵の卵黄から免疫グロブリンを採取する
ことによっても、Ｐａｌ１又はその部分ペプチドに結合
する抗体が得られる。

【００２６】上記のようにして得られる抗体を用いる
と、Ｐａｌ１を免疫学的に測定することができる。測定
法としては、抗原を免疫学的に測定するのに通常用いら
れている方法、例えば競合法やサンドイッチ法等による
酵素免疫測定法（ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法）、蛍光免疫
測定法（ＦＩＡ法）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ法）、あるいは凝集法等を適用することができる。こ
れらの各方法の操作、手順等は常法に従って行えばよ
い。Ｐａｌ１の測定に用いる試料としては、リンパ節、
末梢血リンパ球、脾臓等が挙げられる。

【００２７】また、Ｐａｌ１をコードするＤＮＡ配列の
少なくとも一部に相補的な配列を有する１０塩基以上の
長さからなるＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片をハイブリダイ
ゼーション用のプローブとして用いることにより、細胞
中に発現しているｍＲＮＡを検出することができる。対
照とする細胞としては、末梢血リンパ球が挙げられる。

【００２８】上記のようにして、免疫学的に、又はハイ
ブリダイゼーションにより、Ｐａｌ１の発現を調べるこ
とにより、免疫系の病態を評価することができる。

【００２９】

【実施例】以下の実施例により、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、以下の
実施例によって限定されるものではない。

【００３０】

【実施例１】 ｃＤＮＡライブラリーの調製 リンパ系白血病細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣ
Ｃ ＴＩＢ １５２；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１２
３−１２８，１９８５）のｃＤＮＡライブラリーを調製
した。ｃＤＮＡライブラリーの調製は、ＺＡＰ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社）を用いて行った。すなわち、Ｊｕｒｋａｔ細胞か
ら常法によって調製したポリＡ⁺ＲＮＡをオリゴｄＴを
プライマーとして用いてｃＤＮＡを合成し、続いて常法
に従い二本鎖ｃＤＮＡ合成を行った。この二本鎖ＤＮＡ
にＮｏｔＩ，ＥｃｏＲＩアダプターを結合し、これをＺ
ＡＰ ＥｘｐｒｅｓｓベクターのＥｃｏＲＩ部位に組み
込み、インビトロでパッケージングし、組換えラムダフ
ァージを得た。得られたｃＤＮＡライブラリーのバンク
サイズは約３×１０⁵の独立クローンであった。尚、前
記ベクター及びインビトロ・パッケージングに用いた試
薬類は、前記ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｃｔｏｒ
Ｋｉｔに含まれている。

【００３１】前記ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓベクターは、
ｌａｃプロモーター及びβ−ガラクトシダーゼの構造遺
伝子（ｌａｃＺ）の一部を含み、ＥｃｏＲＩ部位にコー
ド配列がｌａｃＺと同一のフレームで挿入されると、該
コード配列がコードする蛋白質とβ−ガラクトシダーゼ
の一部との融合蛋白質が発現する。

【００３２】

【実施例２】 ファーウェスタンブロットによるＬｃｋ
ＳＨ３ドメイン結合蛋白質をコードするｃＤＮＡクロー
ンの単離 上記ｃＤＮＡライブラリーからファーウェスタンブロッ
トによりＬｃｋＳＨ３ドメイン結合蛋白質をコードする
ｃＤＮＡクローンを選択するために、スクリーニング用
プローブとしてＬｃｋＳＨ３ドメインとグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質を作
製した。

【００３３】ＬｃｋＳＨ３ドメインをコードするＤＮＡ
を含むプラスミドｐＭＥＬｃｋ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６：７１５１−７１６０、１９９６）を鋳型
とし、配列番号３、４に示す塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲを行い、Ｌｃ
ｋＳＨ３ドメインをコードするＤＮＡ断片を取得した。
このＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、プ
ラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファルマシア社）のＢａ
ｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。得られたプラスミ
ドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂ
ｉｏｌ．，１８９， １１３−１３０ （１９８６））
を形質転換し、ＬｃｋＳＨ３ドメインとＧＳＴとの融合
蛋白質を大量に発現する形質転換体を得た。次に、この
形質転換体を１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β
−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ培地中で培養した後、
菌体を破砕し、この菌体破砕液の遠心上清からグルタチ
オンセファロース４Ｂ（ファルマシア社）を用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーにより、ＬｃｋＳＨ３ド
メインとＧＳＴとの融合蛋白質を精製した。

【００３４】上記のようにして得られたプローブを用い
て、ファーウェスタンブロットを行った。宿主大腸菌Ｘ
Ｌ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）
を０．２％マルトース、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄を含むＬ
Ｂ培地中に植え、３０℃で一晩振とう培養した。この大
腸菌を集菌し、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄を含むＳＭ（５．
８ｇ ＮａＣｌ， ２ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ， ５０
ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１
ｇ ゼラチン／１Ｌ 水）に懸濁した。この大腸菌の懸
濁液を、実施例１で作製したＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓの
ｃＤＮＡ発現ライブラリーのファージ溶液と、１チュー
ブあたり５００００ＰＦＵで混ぜ、さらにトップアガー
１０ｍｌを加えた後、１５０ｍｍシャーレ中のＬＢ寒天
培地に重層した。このシャーレを４２℃の恒温器で、６
〜８時間インキュベートし、プラークを形成させた。こ
のシャーレの培地上に、１ｍＭ ＩＰＴＧ水溶液に浸し
た後乾燥させたニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）をかぶせ、さらに
３７℃でインキュベートすることにより、発現した蛋白
質をフィルターにレプリカした。

【００３５】上記フィルターをＴＢＳＴ（０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．
６)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、２％スキムミル
ク含有ＴＢＳＴでブロッキング後、前記プローブ蛋白質
を１μｇ／ｍｌ、スキムミルクを１％の濃度で含むＴＢ
ＳＴ中で、４℃で一晩インキュベートした。この後、フ
ィルターに結合したプローブを可視化するために、抗Ｇ
ＳＴモノクローナル抗体（三菱化学生命科学研究所 藤
田 忍先生より恵与）を溶解したＴＢＳＴに室温で２．
５時間、続いて抗マウスＩｇ抗体−ＨＲＰ（ホースラデ
ィッシュパーオキシダーゼ）（ＺＩＭＥＤ社）溶液（Ｔ
ＢＳＴ中、１００００倍希釈）に室温で３０分、浸漬、
洗浄し、さらに、基質としてＢＣＩＰ（５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリルホスフェート）／ＮＢＴ（ニ
トロブルーテトラゾリウム）を加えて、発色反応させ
た。その結果、フィルター上にいくつかの陽性スポット
が形成され、ＬｃｋＳＨ３ドメイン結合蛋白質をコード
するｃＤＮＡクローン候補株が得られた。

【００３６】

【実施例３】 実施例２で得られたクローンのｃＤＮＡ
断片のサブクローニング及びその遺伝子産物のファーウ
ェスタンブロット 実施例２で得られた陽性クローンを純化し、各クローン
からｃＤＮＡ断片を単離し、プラスミドベクターｐＢＫ
−ＣＭＶへ挿入した。これらの操作は、ＺＡＰＥｘｐｒ
ｅｓｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔのマニュアルに従いヘル
パーファージを使って行った。構築したプラスミドによ
る大腸菌株ＸＬＯＬＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の形
質変換体を１ｍＭ ＩＰＴＧを添加したＬＢ培地中で培
養し、その破砕液についてファーウェスタンブロットを
行った。非変性状態での結合はドットブロットで、変性
状態での結合はＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のブロットで調べ
た。プローブとしては、前述のワイルドタイプのＬｃｋ
ＳＨ３ドメインとＧＳＴの融合蛋白質、Ｌｃｋの１１２
番目のプロリンをロイシンに置換した変異体とＧＳＴの
融合蛋白質（実施例２のプローブ蛋白質と同様にして作
製した）、及びＧＳＴ蛋白質を用いた。その結果、いく
つか得られたクローンの内ただ一つ（クローンγ）が、
ワイルドタイプのＬｃｋＳＨ３ドメインとＧＳＴの融合
蛋白質と、変性、非変性両状態で結合を示した。クロー
ンγはその他のプローブとは変性、非変性両状態でも結
合しなかった（図１、２）。尚、図１は、菌体破砕液を
フィルターに直接ブロットしたもの（非変性条件）であ
り、図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲルからフィルター
に蛋白質を移したもの（変性条件）である。こうして、
クローンγを目的とするＬｃｋＳＨ３ドメイン結合蛋白
質ｃＤＮＡクローンと特定した。このＬｃｋＳＨ３ドメ
イン結合蛋白質をＰａｌ１と命名した。

【００３７】

【実施例４】 塩基配列の決定 クローンγを挿入したプラスミドを常法（「モレキュラ
ークローニング」、コールドスプリングハーバーラボラ
トリー、８６−９６（１９８２））に従って調製し、制
限酵素地図の作成など、常法に従い解析した。また適当
な長さのｃＤＮＡ断片を適宜制限酵素により調製し、ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社）にサブクローニングした。塩基配列の決定はダイ
デオキシ法のキット（アマシャム社）を用いて、添付の
マニュアルに従って行った。この結果、得られたクロー
ンには開始コドンが存在しなかった。このため、５’側
のｃＤＮＡ断片をプローブとして、さら上流のスクリー
ニングを行った。

【００３８】

【実施例５】 Ｐａｌ１の完全長ｃＤＮＡクローンの取
得 宿主大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’またはＹ１０９
０ｒ^-を０．２％マルトース、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄を含
むＬＢ培地中に植え、３７℃で振とう培養した。大腸菌
を集菌し、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄を含むＳＭに懸濁し
た。この大腸菌の懸濁液を、実施例１で作製したＺＡＰ
ＥｘｐｒｅｓｓのｃＤＮＡ発現ライブラリーまたはλ
ｇｔ１１をベクターとするＪｕｒｋａｔ由来のｃＤＮＡ
ライブラリー（ＨＬ５００８ｂ，クローンテック社）の
ファージ溶液と、１チューブあたり５００００ＰＦＵで
混ぜ、さらにトップアガー１０ｍｌを加えた後、１５０
ｍｍシャーレ中のＬＢ寒天培地上に重層した。これらの
シャーレを３７℃の恒温器でインキュベートし、プラー
クを形成させ、培地上にナイロンフィルター（Ｃｏｌｏ
ｎｙ／Ｐｌａｑｕｅ Ｓｃｒｅｅｎ， ＮＥＮ社）をか
ぶせ、出現したプラークをフィルターにレプリカした。

【００３９】フィルターをアルカリ変性し、８０℃でベ
ークすることによりＤＮＡを固定した。１００μｇ／ｍ
ｌの鮭精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液
でブロッキング後、プローブ（^32P標識したクローン
λ）を１×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの濃度で含むハイブリダ
イゼーション中で、一晩ハイブリダイズさせた。この後
フィルターを取り出し、０．１×ＳＳＣ中での洗浄を６
５℃で数時間おこなった後にオートラジオグラフィーを
行った。この結果、フィルター上にいくつかの陽性スポ
ットが形成された。新しく取得したクローンの５’側の
ｃＤＮＡ断片をプローブとしてさらにスクリーニングを
行うことを繰り返し、さらに２つのクローン（クローン
γ１、クローンγ１３）を実施例１で示したライブラリ
ーより、１つ（クローンγｍ３）をクローンテック社の
ライブラリーより得た。この新たに取得した３つのクロ
ーンにより、オープンリーディングフレームがカバーさ
れ、完全長ｃＤＮＡが取得されたと判断した（図３）。
このｃＤＮＡの塩基配列の決定は実施例３の方法によっ
た。決定された塩基配列及びこの塩基配列がコードする
Ｐａｌ１蛋白質のアミノ酸配列を、配列番号１及び２に
示す。

【００４０】

【実施例６】 Ｐａｌ１蛋白質のホモロジー解析 Ｐａｌ１蛋白質のアミノ酸配列またＰａｌ１蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列をＥＭＢＬデータベースに対してホ
モロジー検索を行ったところ、上皮成長因子受容体、血
小板由来成長因子受容体によってチロシンリン酸化を受
けるＥｐｓ１５（ＥＧＦＲ ｐａｔｈｗａｙ ｓｕｂｓ
ｔｒａｔｅ ｃｌｏｎｅ ｎｏ．１５）中に含まれるＥ
Ｈドメイン（Ｅｐｓ１５ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａ
ｉｎ）にホモロジーを持つことがわかった。この領域の
アミノ酸レベルでのホモロジーは４２．４％であった。
また、Ｅｐｓ１５はＣｒｋのＳＨ３ドメインとも結合す
ることがわかっており、機能面でのＰａｌ１との類似性
も示唆された。

【００４１】

【実施例７】 Ｐａｌ１の完全長クローンの構築および
蛋白質発現用ベクターへの組み込み 実施例３及び実施例５に示したクローンγ、クローンγ
ｍ３、及び配列番号５、６に示す塩基配列を有する合成
オリゴヌクレオチドをアニーリングしたもの（９７０６
２３＋−）を用いて、完全長クローンのＣ末にＦｌａｇ
エピトープを連結した配列を得、これをＳＲαプロモー
ターを有する発現用プラスミドベクターｐＭＥ１８Ｓ
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９０：８９５７−８９６１，１９９３）に組み込ん
だ。詳細には以下のとおりである。

【００４２】実施例４でシークエンス用に構築したプラ
スミド２つを利用した。一つはＰａｌ１コーディング領
域をγ−ｐＢＫからＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入
したもの（γ２−ＫＳ）であり、もう一つはＰａｌ１コ
ーディング領域をγ−ｐＢＫからＰｓｔＩとＣｌａＩで
切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋のＰｓｔＩ
−ＣｌａＩ部位に挿入したもの（８００−ＫＳ）であ
る。Ｐａｌ１コーディング領域をγｍ３−ＫＳからＣｌ
ａＩで切り出したものをγ２−ＫＳからＰａｌ１コーデ
ィング領域の５’側をＣｌａＩで切断することにより排
除したベクター側に挿入しプラスミドＰａｌ１５’−Ｋ
Ｓを得た。また、Ｐａｌ１コーディング領域を８００−
ＫＳからＰｓｔＩとＸｍｎＩで切り出したもの及び９７
０６２３＋−をｐＭＥ１８ＳのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ部位
に挿入しプラスミドＰａｌ１３’−Ｆｌａｇ−ｐＭＥを
得た。最後に、Ｐａｌ１コーディング領域の５’側をを
Ｐａｌ１５’−ＫＳからＥａｇＩとＳｐｅＩで切り出し
たものとＰａｌ１３’−Ｆｌａｇ−ｐＭＥ１８ＳからＰ
ａｌ１コーディング領域の３’側およびＦｌａｇエピト
ープコーディング部位、ポリＡシグナルをＳｐｅＩとＳ
ａｃＩで切り出したものをｐＭＥ１８Ｓからスタッファ
ーを除いたベクターにＥａｇＩ、ＳａｃＩサイトで挿入
し、プラスミドＰａｌ１−Ｆｌａｇ−ｐＭＥを得た。

【００４３】

【実施例８】 形質転換体を用いたＰａｌ１蛋白質の産
生 実施例７で構築した発現ベクター（Ｐａｌ１−Ｆｌａｇ
−ｐＭＥ）を用いて、ＤＥＡＥ−デキストラン法により
Ｃｏｓ７細胞を形質転換した。この形質転換細胞をＤＭ
ＥＭ培地で培養し、培養上清について抗Ｆｌａｇ抗体Ｍ
２（コダック社）を用いたウェスタンブロットを行い、
Ｐａｌ１蛋白質が産生していることを確認した。

【００４４】

【実施例９】 抗Ｐａｌ１抗体の取得 抗Ｐａｌ１抗体を得るための抗原を作製するために、Ｐ
ａｌ１−部分（ＥＨドメイン）とＧＳＴとの融合蛋白質
を産生する大腸菌形質転換体を作製した。γ−ｐＢＫか
らＰａｌ１のＥＨドメインを含む部分を、はじめにＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断し突出末端をクレノー酵素で平滑末端
化した後、さらにＥｃｏＲＩで切り出し、ｐＧＥＸ−４
Ｔ−３のＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ部位に挿入した。このプ
ラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株
（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１８９， １１３−１
３０ （１９８６））を形質転換し、Ｐａｌ１のＥＨド
メインとＧＳＴの融合蛋白質（ＥＨ−ＧＳＴ）を大量に
発現する形質転換体を得た。

【００４５】次に、上記形質転換体を１ｍＭ ＩＰＴＧ
を含むＬＢ培地中で培養した後、菌体を破砕し、破砕液
の遠心上清からグルタチオンセファロース４Ｂを用いて
ＥＨ−ＧＳＴを精製した。さらに得られたＥＨ−ＧＳＴ
をＰＢＳ中で一晩トロンビンで切断することによりＥＨ
ドメインを得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製後、ウサギに２
回免疫した。最後の免疫１週間後血液を採取し、その血
清中に誘導されたＰａｌ１に対する抗体の存在をＥＨド
メインに対するウェスタンブロットによって確認した
（図４）。

【００４６】

【発明の効果】本発明により、新規なＬｃｋＳＨ３ドメ
イン結合蛋白質、及び該蛋白質をコードするＤＮＡが提
供される。本発明のＤＮＡは、ＬｃｋＳＨ３ドメイン結
合蛋白質の生産、該蛋白質に結合する抗体の製造に用い
ることができる。

【００４７】本発明の蛋白質を利用することにより、Ｔ
細胞が主役を担っている免疫反応の抑制あるいは強化を
特異的に制御する医薬の創製が可能になると期待され
る。また、当該蛋白質をコードする遺伝子の配列を利用
することにより、本蛋白質の遺伝子異常が原因となる疾
病の遺伝子診断が可能となると考えられる。

【００４８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：3176 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト セルライン：Jurkat 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：577..2967 配列 GCCGCTGTCA CTGTTGGTGC GGGCGCGTCG GGGCCGGGCC GGGGCACTGT AAATGGCGGC 60 GGAGGGAGGC GGAGCGGCGG CCACGCTCAG CCCAGATCCC CCGAAACTTT AGGTTCGAAG 120 CCCCACAACT TTCCGGGAAG CGCTGCCGCT CCGGAGGCGT GGACGGAAGG GGAAGCCGAG 180 GCGGGAAGTC TGGGGGAATC GGCAGGGAGC CGGGGAGACT CGAACCCGCG GCGGGGCGGA 240 GTCCGCCAGT GCCTCGCGCC TCCGCGGCCC CCGCCTCTTT CTCTGCACCC TCCCCGCGGC 300 CGGAGCCGGA GCCGGAGCCG GAGCCGTAGT CGCAGCCGCA GCCGCAGCCG CGCGCCGGGC 360 CTCGCAGGCA GCGGCGCGGC GAGCGCAGCC GGGCCCCCTC CTCGCGACCT CCGGGCCCTG 420 TTGCTCGGGC GCACCTGGCG CGTGTGAGGC CGGGGCCGGC GTTTTCGGGA AGCTAGCAGG 480 AGGCCGGGCC ACGCGCAGCC CCTGCCGGCC CAGGTTCCTG GGGCCGGGCC CCGAGTAGTG 540 CATGCGGGGC GGGGCGGCCG TGAGCCGGAG GCGAAG ATG GAA GGC TTA ACG CTG 594 Met Glu Gly Leu Thr Leu 1 5 AGC GAT GCG GAG CAG AAA TAC TAT TCA GAT CTC TTC TCC TAC TGC GAC 642 Ser Asp Ala Glu Gln Lys Tyr Tyr Ser Asp Leu Phe Ser Tyr Cys Asp 10 15 20 ATT GAG AGC ACC AAG AAG GTG GTG GTC AAC GGG CGG GTG CTG GAG CTG 690 Ile Glu Ser Thr Lys Lys Val Val Val Asn Gly Arg Val Leu Glu Leu 25 30 35 TTC CGG GCC GCG CAG CTG CCG AAC GAC GTG GTC CTA CAG ATC ATG GAG 738 Phe Arg Ala Ala Gln Leu Pro Asn Asp Val Val Leu Gln Ile Met Glu 40 45 50 CTT TGT GGT GCA ACA AGA CTT GGT TAT TTT GGA AGA AGT CAG TTC TAC 786 Leu Cys Gly Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Phe Gly Arg Ser Gln Phe Tyr 55 60 65 70 ATT GCT TTG AAA CTT GTA GCT GTT GCC CAG TCT GGT TTC CCT TTA AGA 834 Ile Ala Leu Lys Leu Val Ala Val Ala Gln Ser Gly Phe Pro Leu Arg 75 80 85 GTG GAA AGT ATA AAT ACA GTA AAG GAC CTT CCT CTG CCA AGA TTT GTT 882 Val Glu Ser Ile Asn Thr Val Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Phe Val 90 95 100 GCT TCA AAG AAT GAA CAG GAA TCT CGC CAT GCA GCC TCA TAT TCT TCA 930 Ala Ser Lys Asn Glu Gln Glu Ser Arg His Ala Ala Ser Tyr Ser Ser 105 110 115 GAT TCT GAA AAT CAA GGG TCG TAT TCT GGT GTA ATT CCC CCA CCA CCT 978 Asp Ser Glu Asn Gln Gly Ser Tyr Ser Gly Val Ile Pro Pro Pro Pro 120 125 130 GGC AGG GGG CAA GTG AAA AAG GGA TCC GTA AGC CAT GAT ACG GTT CAG 1026 Gly Arg Gly Gln Val Lys Lys Gly Ser Val Ser His Asp Thr Val Gln 135 140 145 150 CCT CGT ACA TCT GCA GAT GCA CAG GAA CCT GCA TCC CCA GTA GTT TCA 1074 Pro Arg Thr Ser Ala Asp Ala Gln Glu Pro Ala Ser Pro Val Val Ser 155 160 165 CCA CAG CAA TCC CCA CCA ACT TCT CCA CAC ACA TGG AGG AAG CAC AGC 1122 Pro Gln Gln Ser Pro Pro Thr Ser Pro His Thr Trp Arg Lys His Ser 170 175 180 CGT CAT CCC AGC GGT GGG AAT AGT GAG AGG CCT CTC GCG GGA CCT GGG 1170 Arg His Pro Ser Gly Gly Asn Ser Glu Arg Pro Leu Ala Gly Pro Gly 185 190 195 CCA TTT TGG TCT CCC TTT GGT GAA GCA CAA TCA GGT TCT TCT GCT GGT 1218 Pro Phe Trp Ser Pro Phe Gly Glu Ala Gln Ser Gly Ser Ser Ala Gly 200 205 210 GAT GCA GTG TGG TCA GGG CAT TCC CCA CCT CCA CCT CAA GAA AAC TGG 1266 Asp Ala Val Trp Ser Gly His Ser Pro Pro Pro Pro Gln Glu Asn Trp 215 220 225 230 GTC AGT TTT GCA GAT ACT CCA CCA ACC AGT ACT CTT TTA ACC ATG CAT 1314 Val Ser Phe Ala Asp Thr Pro Pro Thr Ser Thr Leu Leu Thr Met His 235 240 245 CCT GCT TCT GTC CAG GAC CAG ACA ACA GTA CGA ACT GTA GCA TCA GCT 1362 Pro Ala Ser Val Gln Asp Gln Thr Thr Val Arg Thr Val Ala Ser Ala 250 255 260 ACA ACT GCC ATT GAA ATT CGT AGG CAA TCC AGT AGT TAT GAT GAT CCC 1410 Thr Thr Ala Ile Glu Ile Arg Arg Gln Ser Ser Ser Tyr Asp Asp Pro 265 270 275 TGG AAA ATA ACA GAT GAA CAA AGA CAG TAT TAT GTA AAT CAG TTT AAA 1458 Trp Lys Ile Thr Asp Glu Gln Arg Gln Tyr Tyr Val Asn Gln Phe Lys 280 285 290 ACC ATT CAG CCT GAT CTA AAC GGA TTT ATT CCA GGA TCT GCA GCT AAA 1506 Thr Ile Gln Pro Asp Leu Asn Gly Phe Ile Pro Gly Ser Ala Ala Lys 295 300 305 310 GAG TTT TTT ACA AAA TCA AAA CTT CCT ATT CTT GAA CTT TCT CAT ATT 1554 Glu Phe Phe Thr Lys Ser Lys Leu Pro Ile Leu Glu Leu Ser His Ile 315 320 325 TGG GAA CTC TCA GAC TTT GAT AAA GAT GGT GCA TTG ACA CTG GAT GAG 1602 Trp Glu Leu Ser Asp Phe Asp Lys Asp Gly Ala Leu Thr Leu Asp Glu 330 335 340 TTT TGT GCT GCT TTT CAT CTG GTG GTT GCT AGG AAG AAT GGC TAT GAT 1650 Phe Cys Ala Ala Phe His Leu Val Val Ala Arg Lys Asn Gly Tyr Asp 345 350 355 TTA CCA GAA AAA CTT CCT GAA AGC TTA ATG CCC AAA CTG ATT GAT TTG 1698 Leu Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ser Leu Met Pro Lys Leu Ile Asp Leu 360 365 370 GAA GAT TCA GCA GAT GTT GGG GAT CAG CCA GGT GAG GTA GGT TAT TCA 1746 Glu Asp Ser Ala Asp Val Gly Asp Gln Pro Gly Glu Val Gly Tyr Ser 375 380 385 390 GGC TCT CCT GCT GAA GCT CCT CCA AGC AAG TCA CCA TCG ATG CCA TCA 1794 Gly Ser Pro Ala Glu Ala Pro Pro Ser Lys Ser Pro Ser Met Pro Ser 395 400 405 CTA AAC CAG ACA TGG CCT GAG CTG AAT CAG AGC AGT GAG CAG TGG GAG 1842 Leu Asn Gln Thr Trp Pro Glu Leu Asn Gln Ser Ser Glu Gln Trp Glu 410 415 420 ACA TTT AGT GAA CGC TCT TCA AGC TCA CAA ACT CTG ACC CAA TTT GAT 1890 Thr Phe Ser Glu Arg Ser Ser Ser Ser Gln Thr Leu Thr Gln Phe Asp 425 430 435 TCT AAC ATT GCA CCA GCT GAT CCT GAT ACT GCT ATT GTT CAT CCA GTT 1938 Ser Asn Ile Ala Pro Ala Asp Pro Asp Thr Ala Ile Val His Pro Val 440 445 450 CCC ATT CGT ATG ACT CCA AGC AAA ATC CAC ATG CAG GAA ATG GAA CTT 1986 Pro Ile Arg Met Thr Pro Ser Lys Ile His Met Gln Glu Met Glu Leu 455 460 465 470 AAA AGA ACT GGC AGC GAT CAT ACA AAT CCC ACT AGC CCA TTA CTT GTG 2034 Lys Arg Thr Gly Ser Asp His Thr Asn Pro Thr Ser Pro Leu Leu Val 475 480 485 AAA CCA TCT GAC CTT TTA GAA GAA AAT AAG ATA AAT TCA TCA GTG AAA 2082 Lys Pro Ser Asp Leu Leu Glu Glu Asn Lys Ile Asn Ser Ser Val Lys 490 495 500 TTC GCT TCT GGT AAT ACT GTA GCA GAT GGT TAC AGT AGT TCA GAC TCT 2130 Phe Ala Ser Gly Asn Thr Val Ala Asp Gly Tyr Ser Ser Ser Asp Ser 505 510 515 TTT ACT TCT GAC CCA GAA CAG ATC GGG AGC AAT GTA ACT CGT CAA AGG 2178 Phe Thr Ser Asp Pro Glu Gln Ile Gly Ser Asn Val Thr Arg Gln Arg 520 525 530 TCT CAT TCA GGA ACG TCG CCT GAT AAC ACT GCA CCA CCA CCT CCC CCT 2226 Ser His Ser Gly Thr Ser Pro Asp Asn Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro 535 540 545 550 CCA AGG CCA CAG CCC TCT CAT TCT AGA TCA TCA TCT TTA GAT ATG AAT 2274 Pro Arg Pro Gln Pro Ser His Ser Arg Ser Ser Ser Leu Asp Met Asn 555 560 565 CGG ACC TTT ACA GTC ACC ACA GGA CAA CAA CAG GCT GGA GTT GTT GCC 2322 Arg Thr Phe Thr Val Thr Thr Gly Gln Gln Gln Ala Gly Val Val Ala 570 575 580 CAT CCT CCT GCA GTG CCT CCA AGA CCA CAG CCC TCA CAG GCT CCT GGT 2370 His Pro Pro Ala Val Pro Pro Arg Pro Gln Pro Ser Gln Ala Pro Gly 585 590 595 CCT GCT GTG CAT CGC CCA GTG GAT GCC GAT GGC CTC ATA ACT CAC ACT 2418 Pro Ala Val His Arg Pro Val Asp Ala Asp Gly Leu Ile Thr His Thr 600 605 610 AGT ACC TCA CCT CAG CAG ATA CCA GAG CAA CCA AAT TTT GCA GAT TTC 2466 Ser Thr Ser Pro Gln Gln Ile Pro Glu Gln Pro Asn Phe Ala Asp Phe 615 620 625 630 AGT CAG TTT GAA GTA TTT GCT GCA TCA AAT GTA AAC GAC GAA CAA GAT 2514 Ser Gln Phe Glu Val Phe Ala Ala Ser Asn Val Asn Asp Glu Gln Asp 635 640 645 GAT GAA GCC GAG AAA CAT TCA GAA GTC CTG CCG GCT GAA AAA GCT TCT 2562 Asp Glu Ala Glu Lys His Ser Glu Val Leu Pro Ala Glu Lys Ala Ser 650 655 660 GAT CCT GCA AGT TCT CTT CGA GTT GCC AAA ACA GAT AGT AAA ACT GAA 2610 Asp Pro Ala Ser Ser Leu Arg Val Ala Lys Thr Asp Ser Lys Thr Glu 665 670 675 GAA AAG ACA GCT GCT AGT GCT CCT GCC AAT GTG AGC AAA GGC ACA ACA 2658 Glu Lys Thr Ala Ala Ser Ala Pro Ala Asn Val Ser Lys Gly Thr Thr 680 685 690 CCA CTT GCT CCA CCA CCT AAA CCT GTT CGA AGA AGA TTA AAA TCA GAA 2706 Pro Leu Ala Pro Pro Pro Lys Pro Val Arg Arg Arg Leu Lys Ser Glu 695 700 705 710 GAT GAA TTA AGG CCA GAA GTT GAT GAA CAT ACA CAA AAG ACG GGT GTC 2754 Asp Glu Leu Arg Pro Glu Val Asp Glu His Thr Gln Lys Thr Gly Val 715 720 725 TTA GCT GCT GTT CTT GCA TCA CAA CCT TCT ATT CCC AGA TCT GTT GGG 2802 Leu Ala Ala Val Leu Ala Ser Gln Pro Ser Ile Pro Arg Ser Val Gly 730 735 740 AAA GAT AAG AAA GCT ATT CAG GCA TCA ATT AGA CGT AAT AAG GAA ACC 2850 Lys Asp Lys Lys Ala Ile Gln Ala Ser Ile Arg Arg Asn Lys Glu Thr 745 750 755 AAC ACC GTT TTG GCC AGA TTG AAT AGC GAA TTG CAG CAA CAA TTA AAG 2898 Asn Thr Val Leu Ala Arg Leu Asn Ser Glu Leu Gln Gln Gln Leu Lys 760 765 770 GAT GTT CTT GAG GAG AGA ATT TCC CTG GAA GTT CAA CTG GAA CAA CTT 2946 Asp Val Leu Glu Glu Arg Ile Ser Leu Glu Val Gln Leu Glu Gln Leu 775 780 785 790 CGA CCA TTC TCT CAC CTA T AAGCCAATTG CCGTTAACTG TGAACATACT 2995 Arg Pro Phe Ser His Leu 795 TGTTTTTAAG TGGTTTTGGG TTCAAAGCCA ATTTGGAGAC CTAGACATTC AGCTCACTGC 3055 TTAACTCAAC ATTAAATTTT ATGATTCTGT TTTGCCCTAT ATGTTCACCG TTGTATTTAA 3115 GTATCTTTTA TTTTTTAATT TCGACAATAA AAAGGTCAGG ATGGCAAAAA AAAAAAAAAA 3175 A 3176

【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：796 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Gly Leu Thr Leu Ser Asp Ala Glu Gln Lys Tyr Tyr Ser Asp 1 5 10 15 Leu Phe Ser Tyr Cys Asp Ile Glu Ser Thr Lys Lys Val Val Val Asn 20 25 30 Gly Arg Val Leu Glu Leu Phe Arg Ala Ala Gln Leu Pro Asn Asp Val 35 40 45 Val Leu Gln Ile Met Glu Leu Cys Gly Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Phe 50 55 60 Gly Arg Ser Gln Phe Tyr Ile Ala Leu Lys Leu Val Ala Val Ala Gln 65 70 75 80 Ser Gly Phe Pro Leu Arg Val Glu Ser Ile Asn Thr Val Lys Asp Leu 85 90 95 Pro Leu Pro Arg Phe Val Ala Ser Lys Asn Glu Gln Glu Ser Arg His 100 105 110 Ala Ala Ser Tyr Ser Ser Asp Ser Glu Asn Gln Gly Ser Tyr Ser Gly 115 120 125 Val Ile Pro Pro Pro Pro Gly Arg Gly Gln Val Lys Lys Gly Ser Val 130 135 140 Ser His Asp Thr Val Gln Pro Arg Thr Ser Ala Asp Ala Gln Glu Pro 145 150 155 160 Ala Ser Pro Val Val Ser Pro Gln Gln Ser Pro Pro Thr Ser Pro His 165 170 175 Thr Trp Arg Lys His Ser Arg His Pro Ser Gly Gly Asn Ser Glu Arg 180 185 190 Pro Leu Ala Gly Pro Gly Pro Phe Trp Ser Pro Phe Gly Glu Ala Gln 195 200 205 Ser Gly Ser Ser Ala Gly Asp Ala Val Trp Ser Gly His Ser Pro Pro 210 215 220 Pro Pro Gln Glu Asn Trp Val Ser Phe Ala Asp Thr Pro Pro Thr Ser 225 230 235 240 Thr Leu Leu Thr Met His Pro Ala Ser Val Gln Asp Gln Thr Thr Val 245 250 255 Arg Thr Val Ala Ser Ala Thr Thr Ala Ile Glu Ile Arg Arg Gln Ser 260 265 270 Ser Ser Tyr Asp Asp Pro Trp Lys Ile Thr Asp Glu Gln Arg Gln Tyr 275 280 285 Tyr Val Asn Gln Phe Lys Thr Ile Gln Pro Asp Leu Asn Gly Phe Ile 290 295 300 Pro Gly Ser Ala Ala Lys Glu Phe Phe Thr Lys Ser Lys Leu Pro Ile 305 310 315 320 Leu Glu Leu Ser His Ile Trp Glu Leu Ser Asp Phe Asp Lys Asp Gly 325 330 335 Ala Leu Thr Leu Asp Glu Phe Cys Ala Ala Phe His Leu Val Val Ala 340 345 350 Arg Lys Asn Gly Tyr Asp Leu Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ser Leu Met 355 360 365 Pro Lys Leu Ile Asp Leu Glu Asp Ser Ala Asp Val Gly Asp Gln Pro 370 375 380 Gly Glu Val Gly Tyr Ser Gly Ser Pro Ala Glu Ala Pro Pro Ser Lys 385 390 395 400 Ser Pro Ser Met Pro Ser Leu Asn Gln Thr Trp Pro Glu Leu Asn Gln 405 410 415 Ser Ser Glu Gln Trp Glu Thr Phe Ser Glu Arg Ser Ser Ser Ser Gln 420 425 430 Thr Leu Thr Gln Phe Asp Ser Asn Ile Ala Pro Ala Asp Pro Asp Thr 435 440 445 Ala Ile Val His Pro Val Pro Ile Arg Met Thr Pro Ser Lys Ile His 450 455 460 Met Gln Glu Met Glu Leu Lys Arg Thr Gly Ser Asp His Thr Asn Pro 465 470 475 480 Thr Ser Pro Leu Leu Val Lys Pro Ser Asp Leu Leu Glu Glu Asn Lys 485 490 495 Ile Asn Ser Ser Val Lys Phe Ala Ser Gly Asn Thr Val Ala Asp Gly 500 505 510 Tyr Ser Ser Ser Asp Ser Phe Thr Ser Asp Pro Glu Gln Ile Gly Ser 515 520 525 Asn Val Thr Arg Gln Arg Ser His Ser Gly Thr Ser Pro Asp Asn Thr 530 535 540 Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Gln Pro Ser His Ser Arg Ser 545 550 555 560 Ser Ser Leu Asp Met Asn Arg Thr Phe Thr Val Thr Thr Gly Gln Gln 565 570 575 Gln Ala Gly Val Val Ala His Pro Pro Ala Val Pro Pro Arg Pro Gln 580 585 590 Pro Ser Gln Ala Pro Gly Pro Ala Val His Arg Pro Val Asp Ala Asp 595 600 605 Gly Leu Ile Thr His Thr Ser Thr Ser Pro Gln Gln Ile Pro Glu Gln 610 615 620 Pro Asn Phe Ala Asp Phe Ser Gln Phe Glu Val Phe Ala Ala Ser Asn 625 630 635 640 Val Asn Asp Glu Gln Asp Asp Glu Ala Glu Lys His Ser Glu Val Leu 645 650 655 Pro Ala Glu Lys Ala Ser Asp Pro Ala Ser Ser Leu Arg Val Ala Lys 660 665 670 Thr Asp Ser Lys Thr Glu Glu Lys Thr Ala Ala Ser Ala Pro Ala Asn 675 680 685 Val Ser Lys Gly Thr Thr Pro Leu Ala Pro Pro Pro Lys Pro Val Arg 690 695 700 Arg Arg Leu Lys Ser Glu Asp Glu Leu Arg Pro Glu Val Asp Glu His 705 710 715 720 Thr Gln Lys Thr Gly Val Leu Ala Ala Val Leu Ala Ser Gln Pro Ser 725 730 735 Ile Pro Arg Ser Val Gly Lys Asp Lys Lys Ala Ile Gln Ala Ser Ile 740 745 750 Arg Arg Asn Lys Glu Thr Asn Thr Val Leu Ala Arg Leu Asn Ser Glu 755 760 765 Leu Gln Gln Gln Leu Lys Asp Val Leu Glu Glu Arg Ile Ser Leu Glu 770 775 780 Val Gln Leu Glu Gln Leu Arg Pro Phe Ser His Leu 785 790 795

【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：No 配列 GGGGGGATCC CAAGACAACC TGGTTATCGC CCTGCAC 37

【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：YES 配列 GGGGGAATTC TCAAGGTTCA GGCTCCAGGC TGTTTGC 37

【００５２】配列番号：５ 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：YES 配列 ACTTCGACCA TTCTCTCACC TAGACTACAA GGACGACGAT CACAAGTAAT 50

【００５３】配列番号：６ 配列の長さ：54 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：NO 配列 CTAGATTACT TCTCATCGTC GTCCTTGTAG TCTAGGTGAG AGAATGGTCG AAGT 54

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のＰａｌ１蛋白質クローンγがワイル
ドタイプのＬｃｋＳＨ３ドメインとのみ結合することを
示す、非変性状態でのファーウェスタンブロットの結果
を表す図。ＸＬＯＬＲは形質転換前の大腸菌を、γ、
δ、ιはそれぞれの遺伝子で形質転換した大腸菌をあら
わす。プローブとしては、ワイルドタイプのＬｃｋＳＨ
３ドメインとＧＳＴの融合蛋白質、Ｌｃｋの１１２番目
のプロリンをロイシンに置換した変異体とＧＳＴの融合
蛋白質、及びＧＳＴ蛋白質を用いた。

【図２】 本発明のＰａｌ１蛋白質クローンγがワイル
ドタイプのＬｃｋＳＨ３ドメインとのみ結合することを
示す、変性状態でのファーウェスタンブロットの結果を
表す図（電気泳動写真）。プローブは図１と同様であ
る。

【図３】 本発明のＰａｌ１蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａおよび得られたクローンを模式的に表した図面であ
る。図中、太線の領域はオープンリーディングフレーム
（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ： ＯＲＦ）
を表し、白抜きの部分はＥＨドメインを表す。

【図４】 Ｐａｌ１のＥＨドメインをウサギに２回免疫
することにより誘導された抗体の存在をＥＨドメインに
対するウェスタンブロットによって示した図（電気泳動
写真）。パネルＡはＥＨ−ＧＳＴを１５％ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で調べた結果を示す。レーン
１：ＥＨ−ＧＳＴ、レーン２：ＥＨ−ＧＳＴのトロンビ
ン消化産物。図面中、ＥＨ−ＧＳＴ、ＥＨＤ、ＧＳＴは
それぞれＥＨドメインとＧＳＴの融合蛋白質、ＥＨドメ
イン、ＧＳＴ蛋白質をさす。パネルＢはパネルＡのレー
ン２と同等の泳動パターンの蛋白質をニトロセルロース
膜へ転写後、誘導された抗Ｐａｌ１抗体でウェスタンブ
ロットした結果を示す。レーン３：抗Ｐａｌ１抗体によ
りブロット、レーン４：無処理ウサギ血清でブロット。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の（Ａ）又は（Ｂ）の蛋白質。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
   くは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有す
   るアミノ酸配列を有し、かつＬｃｋＳＨ３ドメインに結
   合する性質を有する蛋白質。
2. 【請求項２】 下記の（Ａ）又は（Ｂ）のいずれかの蛋
   白質をコードするＤＮＡ断片。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
   くは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有す
   るアミノ酸配列を有し、かつＬｃｋＳＨ３ドメインに結
   合する性質を有する蛋白質。
3. 【請求項３】 下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡ断
   片である請求項２記載のＤＮＡ断片。 （ａ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片。 （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとスト
   リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬｃｋ
   ＳＨ３ドメインに結合する性質を有する蛋白質をコード
   するＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 請求項２もしくは請求項３記載のＤＮＡ
   断片又はその一部を含む組換え発現ベクター。
5. 【請求項５】 さらに、タグ配列をコードするＤＮＡ断
   片を含み、請求項２もしくは請求項３記載のＤＮＡ断片
   又はその一部がコードするポリペプチドとタグ配列との
   融合蛋白質を発現する組み換え発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項４又は５記載の組み換え発現ベク
   ターで、宿主細胞を形質転換させて得られた形質転換
   体。
7. 【請求項７】 請求項６記載の形質転換体を培養し、そ
   の培養物から前記ポリペプチド又は融合蛋白質を採取す
   ることを特徴とする、ＬｃｋＳＨ３ドメイン結合蛋白質
   の生産方法。
8. 【請求項８】 請求項６記載の形質転換体が、請求項５
   記載の組換え発現ベクターで形質転換されている場合、
   前記培養物から採取した融合蛋白質を、該融合蛋白質中
   のタグ配列に対する特異的なリガンドを用いて精製する
   ことを特徴とする、請求項７記載のＬｃｋＳＨ３ドメイ
   ン結合蛋白質の生産方法。
9. 【請求項９】 請求項１記載の蛋白質又はその一部に結
   合する抗体。
10. 【請求項１０】 配列番号１に示す塩基配列の少なくと
    も一部に相補的な配列を有する１０塩基以上の長さから
    なるＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片であって、請求項１記載
    の蛋白質のｍＲＮＡを検出し得る核酸プローブ。
11. 【請求項１１】 請求項９記載の抗体及び／又は請求項
    １０記載のプローブを用いてＬｃｋＳＨ３ドメイン結合
    蛋白質の発現を調べることを特徴とする免疫系の病態の
    評価法。