JPH1156369A - Ｐｐａｒのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法 - Google Patents
Ｐｐａｒのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法Info
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- JPH1156369A JPH1156369A JP9231084A JP23108497A JPH1156369A JP H1156369 A JPH1156369 A JP H1156369A JP 9231084 A JP9231084 A JP 9231084A JP 23108497 A JP23108497 A JP 23108497A JP H1156369 A JPH1156369 A JP H1156369A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
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- G01N2333/70567—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＰＰＡＲのアゴニスト及び／またはアンタ
ゴニストの新規な同定方法およびスクリーニング方法を
提供する。 【解決手段】 試験用細胞を被験物質と共存させ、試験
用細胞におけるＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依
存的な相互作用の被験物質による変化を、レポーター遺
伝子の発現を指標として検出し測定することからなる、
ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰ
ＡＲ）のアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法。
ゴニストの新規な同定方法およびスクリーニング方法を
提供する。 【解決手段】 試験用細胞を被験物質と共存させ、試験
用細胞におけるＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依
存的な相互作用の被験物質による変化を、レポーター遺
伝子の発現を指標として検出し測定することからなる、
ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰ
ＡＲ）のアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ペルオキシソーム
プロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニス
ト（作動薬）及び／またはアンタゴニスト（拮抗薬）の
新規なスクリーニング方法に関する。
プロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニス
ト（作動薬）及び／またはアンタゴニスト（拮抗薬）の
新規なスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】動植物の細胞中に見られる小器官である
ペルオキシソームは、コレステロールなどの脂質代謝や
吸収に関与する酵素群を含む。ペルオキシソームの増加
は食餌や生理的な要因によっても惹起されるが、抗脂血
薬（フィブレート類）、殺虫剤及びフタル酸類の可塑剤
などを含む構造的に多様な化合物群は、その投与により
肝臓や腎臓のペルオキシソームの大きさと数を劇的に増
加させると同時に、β−酸化サイクルに必要とされる酵
素の発現増加を介してペルオキシソームの脂肪酸代謝能
を高めることが知られており、ペルオキシソームプロリ
フェレータ（peroxisome proliferator）と呼ばれる。
このようなペルオキシソーム増加のメカニズムに関する
研究の中から、これら化合物群によって活性化される核
内受容体が同定されペルオキシソームプロリフェレータ
活性化受容体（peroxisome proliferator activated re
ceptor：ＰＰＡＲ）と名づけられた。
ペルオキシソームは、コレステロールなどの脂質代謝や
吸収に関与する酵素群を含む。ペルオキシソームの増加
は食餌や生理的な要因によっても惹起されるが、抗脂血
薬（フィブレート類）、殺虫剤及びフタル酸類の可塑剤
などを含む構造的に多様な化合物群は、その投与により
肝臓や腎臓のペルオキシソームの大きさと数を劇的に増
加させると同時に、β−酸化サイクルに必要とされる酵
素の発現増加を介してペルオキシソームの脂肪酸代謝能
を高めることが知られており、ペルオキシソームプロリ
フェレータ（peroxisome proliferator）と呼ばれる。
このようなペルオキシソーム増加のメカニズムに関する
研究の中から、これら化合物群によって活性化される核
内受容体が同定されペルオキシソームプロリフェレータ
活性化受容体（peroxisome proliferator activated re
ceptor：ＰＰＡＲ）と名づけられた。
【０００３】ＰＰＡＲは、その構造などから核内受容体
（核ホルモン受容体）スーパーファミリーの一員と考え
られている。他の核内受容体と同様、リガンドとの結合
により活性化され、標的遺伝子上流域に存在する応答配
列（ＰＰＲＥ：peroxisome proliferator response ele
ment）に結合して標的遺伝子の転写を活性化する。ＰＰ
ＡＲは、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ：retinoid X
receptor）とヘテロダイマーを形成し、このヘテロダ
イマーの形でＰＰＲＥに結合することが知られており、
また、他の核内受容体と同様、その転写活性化作用を発
揮するためには共役転写因子（コアクチベータ）群との
相互作用が必要であると考えられている。
（核ホルモン受容体）スーパーファミリーの一員と考え
られている。他の核内受容体と同様、リガンドとの結合
により活性化され、標的遺伝子上流域に存在する応答配
列（ＰＰＲＥ：peroxisome proliferator response ele
ment）に結合して標的遺伝子の転写を活性化する。ＰＰ
ＡＲは、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ：retinoid X
receptor）とヘテロダイマーを形成し、このヘテロダ
イマーの形でＰＰＲＥに結合することが知られており、
また、他の核内受容体と同様、その転写活性化作用を発
揮するためには共役転写因子（コアクチベータ）群との
相互作用が必要であると考えられている。
【０００４】これまで、 ＰＰＡＲα、 ＰＰＡＲδ（又
はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰＡＲγ
と称される３種のＰＰＡＲのサブタイプが同定され、そ
れらの遺伝子（ｃＤＮＡ）がクローニングされている
（Lembergerら、Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.、第12巻、第
335-363頁、1996年）。これら３種のうち、ＰＰＡＲγ
は特に脂肪組織で発現しており、脂肪細胞の分化に深く
関与する因子であるとされている(Tontonozら、Genes a
nd Development、第8巻、第1224-1234頁、1994年、Tont
onozら、Cell、第79巻、第1147-1156頁、1994年)。
はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰＡＲγ
と称される３種のＰＰＡＲのサブタイプが同定され、そ
れらの遺伝子（ｃＤＮＡ）がクローニングされている
（Lembergerら、Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.、第12巻、第
335-363頁、1996年）。これら３種のうち、ＰＰＡＲγ
は特に脂肪組織で発現しており、脂肪細胞の分化に深く
関与する因子であるとされている(Tontonozら、Genes a
nd Development、第8巻、第1224-1234頁、1994年、Tont
onozら、Cell、第79巻、第1147-1156頁、1994年)。
【０００５】一方、種々のチアゾリジンジオン誘導体
は、インスリン非依存性糖尿病(NIDDM：non-insulin-de
pendent diabetes melitus)のモデル動物で血糖降下作
用を示し、インスリン抵抗性解除作用を有する新しいNI
DDM治療薬として期待されている。これらチアゾリジン
ジオン誘導体はまた、ＰＰＡＲγのリガンドとして作用
しＰＰＡＲγを特異的に活性化することが、最近の研究
で明らかとなった（Lehmannら、Journal of Biologica
l Chemistry、第270巻、第12953−12956頁、1995年）。
このようなチアゾリジンジオン誘導体のＰＰＡＲγ活性
化能と遺伝性肥満マウスにおける血糖低下作用には強い
相関が見られることから、ＰＰＡＲγがチアゾリジンジ
オン誘導体の薬理作用の標的分子であろうと考えられて
いる（Willsonら、Journal of Medicinal Chemistry、
第39巻、第665-668頁、1996年）。このことはＰＰＡＲ
γの特異的発現の場である脂肪組織が、エネルギーバラ
ンス維持に重要な役割を果たす臓器であることとも関連
付けられ、これらの知見から、ＰＰＡＲγのアゴニスト
として特異的に作用する化合物は、糖尿病治療薬として
非常に有効であると考えられている。
は、インスリン非依存性糖尿病(NIDDM：non-insulin-de
pendent diabetes melitus)のモデル動物で血糖降下作
用を示し、インスリン抵抗性解除作用を有する新しいNI
DDM治療薬として期待されている。これらチアゾリジン
ジオン誘導体はまた、ＰＰＡＲγのリガンドとして作用
しＰＰＡＲγを特異的に活性化することが、最近の研究
で明らかとなった（Lehmannら、Journal of Biologica
l Chemistry、第270巻、第12953−12956頁、1995年）。
このようなチアゾリジンジオン誘導体のＰＰＡＲγ活性
化能と遺伝性肥満マウスにおける血糖低下作用には強い
相関が見られることから、ＰＰＡＲγがチアゾリジンジ
オン誘導体の薬理作用の標的分子であろうと考えられて
いる（Willsonら、Journal of Medicinal Chemistry、
第39巻、第665-668頁、1996年）。このことはＰＰＡＲ
γの特異的発現の場である脂肪組織が、エネルギーバラ
ンス維持に重要な役割を果たす臓器であることとも関連
付けられ、これらの知見から、ＰＰＡＲγのアゴニスト
として特異的に作用する化合物は、糖尿病治療薬として
非常に有効であると考えられている。
【０００６】しかしながら、現在までのところ、ＰＰＡ
Ｒ作用薬のスクリーニング方法として知られているもの
は、いずれも操作が煩雑で多検体の同時処理が難しいと
いう問題点を有する。
Ｒ作用薬のスクリーニング方法として知られているもの
は、いずれも操作が煩雑で多検体の同時処理が難しいと
いう問題点を有する。
【０００７】例えば、ＰＰＡＲ発現ベクターおよびＰＰ
ＡＲの応答配列（ＰＰＲＥ）に連結されたレポーター遺
伝子を含むレポータープラスミドを導入した動物細胞を
用い、この細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の変
化を指標として検体のＰＰＡＲ活性化能を調べる方法が
知られている（WO 96/22884、 Tontonozら、Genes and
Development、第8巻、第1224-1234頁、1994年）。ま
た、その改良法として、酵母の転写因子であるＧＡＬ４
のＤＮＡ結合領域とＰＰＡＲのリガンド結合領域とを結
合させた融合蛋白質発現用のベクター、及びＧＡＬ４の
応答配列（GAL4 binding element）に連結されたレポー
ター遺伝子を含むレポータープラスミドを導入した動物
細胞を用いる方法が知られている（WO 96/9633724、 Le
hmannら、Journal of Biological Chemistry、第270
巻、第12953−12956頁、1995年、 Willsonら、Journal
of Medicinal Chemistry、第39巻、第665-668頁、1996
年）。これらの方法では動物細胞に外来遺伝子を導入す
るが、遺伝子導入に際して染色体への組込みが起こると
その組み込まれた部位の影響を受ける場合があるため、
遺伝子が染色体の影響を受けない形質転換細胞を用いる
必要がある。このような形質転換動物細胞を取得し外来
遺伝子を安定して発現させることは技術的な困難を伴
う。また、これら方法における転写活性化には、宿主動
物細胞由来の共役転写因子やＲＸＲなどが関与すると考
えられるため、被験物質のＰＰＡＲに対する作用のみを
的確に検出できない可能性がある。
ＡＲの応答配列（ＰＰＲＥ）に連結されたレポーター遺
伝子を含むレポータープラスミドを導入した動物細胞を
用い、この細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の変
化を指標として検体のＰＰＡＲ活性化能を調べる方法が
知られている（WO 96/22884、 Tontonozら、Genes and
Development、第8巻、第1224-1234頁、1994年）。ま
た、その改良法として、酵母の転写因子であるＧＡＬ４
のＤＮＡ結合領域とＰＰＡＲのリガンド結合領域とを結
合させた融合蛋白質発現用のベクター、及びＧＡＬ４の
応答配列（GAL4 binding element）に連結されたレポー
ター遺伝子を含むレポータープラスミドを導入した動物
細胞を用いる方法が知られている（WO 96/9633724、 Le
hmannら、Journal of Biological Chemistry、第270
巻、第12953−12956頁、1995年、 Willsonら、Journal
of Medicinal Chemistry、第39巻、第665-668頁、1996
年）。これらの方法では動物細胞に外来遺伝子を導入す
るが、遺伝子導入に際して染色体への組込みが起こると
その組み込まれた部位の影響を受ける場合があるため、
遺伝子が染色体の影響を受けない形質転換細胞を用いる
必要がある。このような形質転換動物細胞を取得し外来
遺伝子を安定して発現させることは技術的な困難を伴
う。また、これら方法における転写活性化には、宿主動
物細胞由来の共役転写因子やＲＸＲなどが関与すると考
えられるため、被験物質のＰＰＡＲに対する作用のみを
的確に検出できない可能性がある。
【０００８】また、動物細胞やレポータ遺伝子を使わず
に直接ＰＰＡＲとリガンドとの結合を検出する方法とし
ては、ＰＰＡＲのリガンド結合領域とグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質
と、放射性同位元素で標識した被験化合物との結合およ
び拮抗を調べる方法が知られている （Willsonら、Jour
nal of Medicinal Chemistry、第39巻、第665-668頁、1
996年、Buckleら、Bioorganic & Medical Chemistry Le
tters、第6巻、第2121-2126頁、1996年）。また、最
近、他の核内受容体ＲＸＲなどと同様に、ＰＰＡＲも、
転写共役因子の一つであるＳＲＣ−１とリガンド依存的
に相互作用することが明らかにされ、この知見をもと
に、Kreyらは、ＰＰＡＲのリガンド結合領域とグルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タン
パク質と放射性同位元素で標識したＳＲＣ−１とを用い
て、被験化合物のリガンドとしての作用を検出する方法
を報告している（Kreyら、Molecular Endocrinology、
第11巻、第779-791頁、1997年）。しかし、これら方法
は、いずれも放射性同位元素による標識を用いるため危
険を伴うし、標識した化合物や転写共役因子の大量調製
は困難であるので処理能力にも限界がある。
に直接ＰＰＡＲとリガンドとの結合を検出する方法とし
ては、ＰＰＡＲのリガンド結合領域とグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質
と、放射性同位元素で標識した被験化合物との結合およ
び拮抗を調べる方法が知られている （Willsonら、Jour
nal of Medicinal Chemistry、第39巻、第665-668頁、1
996年、Buckleら、Bioorganic & Medical Chemistry Le
tters、第6巻、第2121-2126頁、1996年）。また、最
近、他の核内受容体ＲＸＲなどと同様に、ＰＰＡＲも、
転写共役因子の一つであるＳＲＣ−１とリガンド依存的
に相互作用することが明らかにされ、この知見をもと
に、Kreyらは、ＰＰＡＲのリガンド結合領域とグルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タン
パク質と放射性同位元素で標識したＳＲＣ−１とを用い
て、被験化合物のリガンドとしての作用を検出する方法
を報告している（Kreyら、Molecular Endocrinology、
第11巻、第779-791頁、1997年）。しかし、これら方法
は、いずれも放射性同位元素による標識を用いるため危
険を伴うし、標識した化合物や転写共役因子の大量調製
は困難であるので処理能力にも限界がある。
【０００９】以上のように、 ＰＰＡＲ作用薬のスクリ
ーニングを行うにあたり、簡便かつ精度のよい効率的な
スクリーニング方法が望まれていた。
ーニングを行うにあたり、簡便かつ精度のよい効率的な
スクリーニング方法が望まれていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ペル
オキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡ
Ｒ）のアゴニスト（作動薬）及び／またはアンタゴニス
ト（拮抗薬）の新規な同定方法およびスクリーニング方
法を提供することにある。
オキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡ
Ｒ）のアゴニスト（作動薬）及び／またはアンタゴニス
ト（拮抗薬）の新規な同定方法およびスクリーニング方
法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、転写共役
因子群のうち既にＰＰＡＲと相互作用することが知られ
ているＳＲＣ−１のほか、ＣＢＰ（CREB-binding prote
in）もＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用することを
独自に見出すとともに、共役転写因子のＰＰＡＲとの結
合領域を同定した。さらに、これらの知見をもとにし
て、ＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的な相互
作用を、酵母のTwo-hybridシステムを利用した方法で検
出する新しいＰＰＡＲ作用薬の同定およびスクリーニン
グ方法を完成するにいたった。
因子群のうち既にＰＰＡＲと相互作用することが知られ
ているＳＲＣ−１のほか、ＣＢＰ（CREB-binding prote
in）もＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用することを
独自に見出すとともに、共役転写因子のＰＰＡＲとの結
合領域を同定した。さらに、これらの知見をもとにし
て、ＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的な相互
作用を、酵母のTwo-hybridシステムを利用した方法で検
出する新しいＰＰＡＲ作用薬の同定およびスクリーニン
グ方法を完成するにいたった。
【００１２】すなわち、本発明は、試験用細胞を被験物
質と共存させ、試験用細胞におけるペルオキシソームプ
ロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）と転写共役因
子とのリガンド依存的な相互作用の被験物質による変化
を、レポーター遺伝子の発現を指標として検出し測定す
ることからなる、ＰＰＡＲのアゴニストまたはアンタゴ
ニストの同定方法である。
質と共存させ、試験用細胞におけるペルオキシソームプ
ロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡＲ）と転写共役因
子とのリガンド依存的な相互作用の被験物質による変化
を、レポーター遺伝子の発現を指標として検出し測定す
ることからなる、ＰＰＡＲのアゴニストまたはアンタゴ
ニストの同定方法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明においては、試験用細胞内
でのＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的相互作
用を検出する。ＰＰＡＲは、リガンドと結合することに
より活性型にコンフォメーションが変化して転写共役因
子との相互作用が起こる。すなわち、リガンド依存的相
互作用は、ＰＰＡＲのリガンド存在下で促進されるＰＰ
ＡＲと転写共役因子との結合である。
でのＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的相互作
用を検出する。ＰＰＡＲは、リガンドと結合することに
より活性型にコンフォメーションが変化して転写共役因
子との相互作用が起こる。すなわち、リガンド依存的相
互作用は、ＰＰＡＲのリガンド存在下で促進されるＰＰ
ＡＲと転写共役因子との結合である。
【００１４】ＰＰＡＲとしては、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲ
δ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰ
ＡＲγなどのサブタイプが知られており、本発明におい
てはこれらサブタイプのいずれをも用いることができ
る。これらのうち、ＰＰＡＲγは、抗糖尿病作用を有す
るチアゾリジンジオン誘導体の標的分子でありこれに対
する特異的作用薬を同定及びスクリーニングする方法は
糖尿病治療薬の研究開発に有用である。
δ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰ
ＡＲγなどのサブタイプが知られており、本発明におい
てはこれらサブタイプのいずれをも用いることができ
る。これらのうち、ＰＰＡＲγは、抗糖尿病作用を有す
るチアゾリジンジオン誘導体の標的分子でありこれに対
する特異的作用薬を同定及びスクリーニングする方法は
糖尿病治療薬の研究開発に有用である。
【００１５】ＰＰＡＲは、同じ分子種として同定される
もので、核内レセプターとしての生体内での機能を果た
すものであればいずれの種由来のものであってもよく、
例えばヒト、マウス、ラット、ハムスターなどの哺乳動
物由来のものの他、アフリカツメガエル由来のものなど
が挙げられる。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発
に利用する上ではヒト由来のものを用いることが好まし
い。
もので、核内レセプターとしての生体内での機能を果た
すものであればいずれの種由来のものであってもよく、
例えばヒト、マウス、ラット、ハムスターなどの哺乳動
物由来のものの他、アフリカツメガエル由来のものなど
が挙げられる。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発
に利用する上ではヒト由来のものを用いることが好まし
い。
【００１６】ＰＰＡＲα（Dreyerら、Cell、第68巻、第
879-887頁、1992年、Greenら、Nature、第347巻、第645
-650頁、1990年、Goettlicherら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA、第89巻、第4653-4657頁、1992年）、ＰＰＡＲδ
（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）（Dreyer
ら、Cell、第68巻、第879-887頁、1992年、Kliewerら、
Proc.Natl.Acad.Sci USA、第91巻、第7355-7359頁、199
4年、Amriら、Journal of Biological Chemistry、第27
0巻、第2367-2371頁、1995年、Xingら、Biochem.Biophy
s.Res.Commun.、第217巻、第1015-1025頁、1995年）及
び、ＰＰＡＲγ（Dreyerら、Cell、第68巻、第879-887
頁、1992年、Zhuら、Jounal of BiologicalChemistry、
第268巻、第26817-26820頁、1993年、Kliewerら、Proc.
Natl.Acad.Sci USA、第91巻、第7355-7359頁、1994年、
Mukherjeeら、Journal of Biological Chemistry、第27
2巻、第8071-8076頁、1997年、Elbrechtら、Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.、第224巻、第431-437頁、1996年、C
hemら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第196巻、第671
-677頁、1993年、Tontonozら、Genes & Development、
第8巻、第1224-1234頁、1994年、Aperloら、Gene、第16
2巻、第297-302頁、1995年）の遺伝子配列およびアミノ
酸配列はすでに報告されている。また、ＰＰＡＲγに
は、ＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２の二種のアイソフォ
ームが存在し、 ＰＰＡＲγ１はＰＰＡＲγ２と比較す
るとＮ末端側の３０アミノ酸が欠失しているが、その他
のアミノ酸配列は全く同じであり、いずれも脂肪組織に
発現していることが知られている。
879-887頁、1992年、Greenら、Nature、第347巻、第645
-650頁、1990年、Goettlicherら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA、第89巻、第4653-4657頁、1992年）、ＰＰＡＲδ
（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）（Dreyer
ら、Cell、第68巻、第879-887頁、1992年、Kliewerら、
Proc.Natl.Acad.Sci USA、第91巻、第7355-7359頁、199
4年、Amriら、Journal of Biological Chemistry、第27
0巻、第2367-2371頁、1995年、Xingら、Biochem.Biophy
s.Res.Commun.、第217巻、第1015-1025頁、1995年）及
び、ＰＰＡＲγ（Dreyerら、Cell、第68巻、第879-887
頁、1992年、Zhuら、Jounal of BiologicalChemistry、
第268巻、第26817-26820頁、1993年、Kliewerら、Proc.
Natl.Acad.Sci USA、第91巻、第7355-7359頁、1994年、
Mukherjeeら、Journal of Biological Chemistry、第27
2巻、第8071-8076頁、1997年、Elbrechtら、Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.、第224巻、第431-437頁、1996年、C
hemら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第196巻、第671
-677頁、1993年、Tontonozら、Genes & Development、
第8巻、第1224-1234頁、1994年、Aperloら、Gene、第16
2巻、第297-302頁、1995年）の遺伝子配列およびアミノ
酸配列はすでに報告されている。また、ＰＰＡＲγに
は、ＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２の二種のアイソフォ
ームが存在し、 ＰＰＡＲγ１はＰＰＡＲγ２と比較す
るとＮ末端側の３０アミノ酸が欠失しているが、その他
のアミノ酸配列は全く同じであり、いずれも脂肪組織に
発現していることが知られている。
【００１７】これらの報告の中で、他の核内受容体との
ホモロジーなどから推定して、ＰＰＡＲのリガンド結合
領域（ligand binding domain：ＬＢＤ）は、ＰＰＡＲ
αの場合、Ｎ末端側から約１６７番目から４６８番目ま
でのアミノ酸を含む領域に、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−
１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）の場合、Ｎ末端側から約１
３８番目から４４０番目までのアミノ酸を含む領域に、
そしてＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲγ２）の場合、Ｎ末端側か
ら約１７４番目から４７５番目までのアミノ酸を含む領
域に相当するものとされている。
ホモロジーなどから推定して、ＰＰＡＲのリガンド結合
領域（ligand binding domain：ＬＢＤ）は、ＰＰＡＲ
αの場合、Ｎ末端側から約１６７番目から４６８番目ま
でのアミノ酸を含む領域に、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−
１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）の場合、Ｎ末端側から約１
３８番目から４４０番目までのアミノ酸を含む領域に、
そしてＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲγ２）の場合、Ｎ末端側か
ら約１７４番目から４７５番目までのアミノ酸を含む領
域に相当するものとされている。
【００１８】ＰＰＡＲと転写共役因子（コアクチベータ
ー）との相互作用検出のためには、少なくともリガンド
結合領域含むポリペプチドを用いればよい。ＰＰＡＲの
リガンド結合領域含むポリペプチドを切り出して用いる
ことにより、非特異的な相互作用を排除できるので好ま
しい。
ー）との相互作用検出のためには、少なくともリガンド
結合領域含むポリペプチドを用いればよい。ＰＰＡＲの
リガンド結合領域含むポリペプチドを切り出して用いる
ことにより、非特異的な相互作用を排除できるので好ま
しい。
【００１９】本発明に用いる転写共役因子（コアクチベ
ーター）は、ＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用する
もの、すなわち、ＰＰＡＲのリガンド存在下でＰＰＡＲ
との相互作用が促進されるものであればよい。核内受容
体と相互作用すると考えられている転写共役因子として
は、例えば、ＣＢＰ、ＳＲＣ−１、ＲＩＰ１４０（Cava
illesら、EMBO Journal、第14巻、第3741-3751頁、1995
年）、ＴＩＦ１（Douarinら、EMBO Journal、第14巻、
第2020-2033頁、1995年、Vom Baurら、EMBO Journal、
第15巻、第110-124頁、1996年）、ＴＩＦ２（Voegel
ら、EMBO Journal、第15巻、第3667-3675頁、1996
年）、ＳＵＧ１（Vom Baurら、EMBO Journal、第15巻、
第110-124頁、1996年）、Ｐ３００（Chakravartiら、Na
ture、第383巻、第99-103頁、1996年）などが挙げら
れ、これらはＰＰＡＲともリガンド依存的に相互作用す
ることが期待できる。
ーター）は、ＰＰＡＲとリガンド依存的に相互作用する
もの、すなわち、ＰＰＡＲのリガンド存在下でＰＰＡＲ
との相互作用が促進されるものであればよい。核内受容
体と相互作用すると考えられている転写共役因子として
は、例えば、ＣＢＰ、ＳＲＣ−１、ＲＩＰ１４０（Cava
illesら、EMBO Journal、第14巻、第3741-3751頁、1995
年）、ＴＩＦ１（Douarinら、EMBO Journal、第14巻、
第2020-2033頁、1995年、Vom Baurら、EMBO Journal、
第15巻、第110-124頁、1996年）、ＴＩＦ２（Voegel
ら、EMBO Journal、第15巻、第3667-3675頁、1996
年）、ＳＵＧ１（Vom Baurら、EMBO Journal、第15巻、
第110-124頁、1996年）、Ｐ３００（Chakravartiら、Na
ture、第383巻、第99-103頁、1996年）などが挙げら
れ、これらはＰＰＡＲともリガンド依存的に相互作用す
ることが期待できる。
【００２０】これらのうち、ＣＢＰおよびＳＲＣ−１
は、各々本明細書の後記実施例およびKreyらの報告に示
された通り、ＰＰＡＲと相互作用することが確認されて
おり、本発明に好適に使用することができる。
は、各々本明細書の後記実施例およびKreyらの報告に示
された通り、ＰＰＡＲと相互作用することが確認されて
おり、本発明に好適に使用することができる。
【００２１】ＣＢＰ（CREB-binding protein）は、最初
ＣＲＥ（cAMP-regulated enhancer）に結合する転写因
子ＣＲＥＢ（cAMP-regulated enhancer binding protei
n）の共役転写因子（コアクティベーター）として同定
された蛋白質であり、その遺伝子およびアミノ酸配列も
知られている（Chriviaら、Nature、第365巻、第855-85
9頁、1993年；Kwokら、Nature、第370巻、第223-226
頁）。最近、ＣＢＰは、ＣＲＥＢとのみならず、核内受
容体ともリガンドの存在下で結合し共役転写因子として
働くこと、また、ＣＢＰのＮ末端部分が核内受容体との
相互作用に関与していることが明らかとなった（Kamei
ら、Cell、第85巻、第403-414頁、1995年）。ＣＢＰの
Ｎ末端部分がＰＰＡＲγともリガンド依存的に相互作用
することは、発明者らが独自に見いだした。
ＣＲＥ（cAMP-regulated enhancer）に結合する転写因
子ＣＲＥＢ（cAMP-regulated enhancer binding protei
n）の共役転写因子（コアクティベーター）として同定
された蛋白質であり、その遺伝子およびアミノ酸配列も
知られている（Chriviaら、Nature、第365巻、第855-85
9頁、1993年；Kwokら、Nature、第370巻、第223-226
頁）。最近、ＣＢＰは、ＣＲＥＢとのみならず、核内受
容体ともリガンドの存在下で結合し共役転写因子として
働くこと、また、ＣＢＰのＮ末端部分が核内受容体との
相互作用に関与していることが明らかとなった（Kamei
ら、Cell、第85巻、第403-414頁、1995年）。ＣＢＰの
Ｎ末端部分がＰＰＡＲγともリガンド依存的に相互作用
することは、発明者らが独自に見いだした。
【００２２】ＳＲＣ−１は、グルココルチコイド受容
体、エストロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体および
レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）などの核内受容体とリガ
ンド依存的に相互作用し、共役転写因子として働くこと
が知られており、その遺伝子およびアミノ酸配列も知ら
れている（Onateら、Science、第270巻、第1354-1357
頁、1995年）。また、Kreyらの報告（Molecular Endocr
inology、第11巻、第779-791頁、1997年）で、アフリカ
ツメガエル由来ＰＰＡＲのリガンド結合領域とＲＩ標識
したＳＲＣ−１とを用いた実験により、ＰＰＡＲもリガ
ンド依存的にＳＲＣ−１と相互作用することが示されて
いる。
体、エストロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体および
レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）などの核内受容体とリガ
ンド依存的に相互作用し、共役転写因子として働くこと
が知られており、その遺伝子およびアミノ酸配列も知ら
れている（Onateら、Science、第270巻、第1354-1357
頁、1995年）。また、Kreyらの報告（Molecular Endocr
inology、第11巻、第779-791頁、1997年）で、アフリカ
ツメガエル由来ＰＰＡＲのリガンド結合領域とＲＩ標識
したＳＲＣ−１とを用いた実験により、ＰＰＡＲもリガ
ンド依存的にＳＲＣ−１と相互作用することが示されて
いる。
【００２３】ＰＰＡＲとのリガンド依存的相互作用を検
出する際には、転写共役因子全体を用いてもよいが、少
なくともＰＰＡＲ結合領域（ＰＰＡＲとの結合に関与す
る領域）を含むポリペプチドを用いることもできる。転
写共役因子は一般に、分子量が大きく、その全体を使っ
た場合には蛋白質の発現が困難となる場合があるので、
この観点から適切な領域を選択して使用することが好ま
しい。
出する際には、転写共役因子全体を用いてもよいが、少
なくともＰＰＡＲ結合領域（ＰＰＡＲとの結合に関与す
る領域）を含むポリペプチドを用いることもできる。転
写共役因子は一般に、分子量が大きく、その全体を使っ
た場合には蛋白質の発現が困難となる場合があるので、
この観点から適切な領域を選択して使用することが好ま
しい。
【００２４】転写共役因子のＰＰＡＲ結合領域（ＰＰＡ
Ｒとの結合に関与する領域）は、核内受容体との結合領
域の位置が報告されていればその情報からＰＰＡＲ結合
領域を推定することができる。また、蛋白-蛋白質間相
互作用を検出する系（例えば酵母のtwo-hybrid システ
ムなど）を用いて、ある領域とＰＰＡＲとの相互作用の
有無を調べ、適切な領域を選択することができる。転写
共役因子がＣＢＰの場合、そのＮ末端部分（約１番目か
ら４５０番目までのアミノ酸を含む領域）付近にＰＰＡ
Ｒ結合領域が存在する。
Ｒとの結合に関与する領域）は、核内受容体との結合領
域の位置が報告されていればその情報からＰＰＡＲ結合
領域を推定することができる。また、蛋白-蛋白質間相
互作用を検出する系（例えば酵母のtwo-hybrid システ
ムなど）を用いて、ある領域とＰＰＡＲとの相互作用の
有無を調べ、適切な領域を選択することができる。転写
共役因子がＣＢＰの場合、そのＮ末端部分（約１番目か
ら４５０番目までのアミノ酸を含む領域）付近にＰＰＡ
Ｒ結合領域が存在する。
【００２５】本発明においては、ＰＰＡＲと転写共役因
子とのリガンド依存的相互作用を試験用細胞内でレポー
ター遺伝子の発現を指標として検出し、被験物質によっ
て起こる相互作用の変化を測定する。
子とのリガンド依存的相互作用を試験用細胞内でレポー
ター遺伝子の発現を指標として検出し、被験物質によっ
て起こる相互作用の変化を測定する。
【００２６】ＰＰＡＲ及び転写共役因子の相互作用に着
目しＰＰＡＲ自体の転写活性化作用を検出しないので、
ＰＰＡＲの転写活性化能発現に関与する哺乳動物固有の
種々の因子の存在を要しない。従って試験用細胞は、特
に哺乳動物細胞を用いる必要がない。細胞は、真核細胞
であればよく、例えば、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動
物細胞などが挙げられる。これらのうち、酵母細胞は培
養が容易で迅速に実施できる上、外来遺伝子の導入など
遺伝子組換え技術を適用するのが容易である点で有利で
ある。酵母細胞としては、サッカロマイセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）、チゾサッカロマイセ
ス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等、サッカ
ロマイセス属、チゾサッカロマイセス属等に属する微生
物の細胞株を用いることができる。
目しＰＰＡＲ自体の転写活性化作用を検出しないので、
ＰＰＡＲの転写活性化能発現に関与する哺乳動物固有の
種々の因子の存在を要しない。従って試験用細胞は、特
に哺乳動物細胞を用いる必要がない。細胞は、真核細胞
であればよく、例えば、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動
物細胞などが挙げられる。これらのうち、酵母細胞は培
養が容易で迅速に実施できる上、外来遺伝子の導入など
遺伝子組換え技術を適用するのが容易である点で有利で
ある。酵母細胞としては、サッカロマイセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）、チゾサッカロマイセ
ス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等、サッカ
ロマイセス属、チゾサッカロマイセス属等に属する微生
物の細胞株を用いることができる。
【００２７】試験用細胞は、通常、外来のＰＰＡＲ及び
転写共役因子を含むものが用いられる。内因性のＰＰＡ
Ｒやこれと相互作用する転写共役因子を有しない細胞を
用いることは、内因性の要素による影響を排除できるの
で好ましい。
転写共役因子を含むものが用いられる。内因性のＰＰＡ
Ｒやこれと相互作用する転写共役因子を有しない細胞を
用いることは、内因性の要素による影響を排除できるの
で好ましい。
【００２８】被験物質によって起こるＰＰＡＲと転写共
役因子との相互作用の変化は、two-hybrid システムを
利用した方法で効率よく測定することができる。
役因子との相互作用の変化は、two-hybrid システムを
利用した方法で効率よく測定することができる。
【００２９】Two-hybrid システムは、レポーター遺伝
子の発現をマーカーとして蛋白-蛋白質間相互作用を検
出する方法である（米国特許第5283173、およびProc.Na
tl.Acad.Sci. USA、第88巻、第9578-9582頁、1991
年）。多くの転写因子はＤＮＡ結合領域と転写活性化領
域という異なる機能をもった２つの領域に分割できる
が、two-hybridシステムでは、例えば２つの蛋白質XとY
の相互作用を調べるために、２種類の融合蛋白質、すな
わち、転写因子のDNA結合領域とXからなる融合蛋白質、
および、転写因子の転写活性化領域とYからなる融合蛋
白質を同時に酵母細胞内で発現させる。蛋白質XとYが相
互作用する場合には両者の結合により、２種類の融合蛋
白質が全体として１つの機能する転写複合体を形成し、
細胞の核内において、応答配列（response element）
（転写因子が特異的に結合するＤＮＡの部位）と結合し
てその下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性
化する。このように２つの蛋白質の相互作用をレポータ
ー遺伝子の発現（例えば遺伝子産物の酵素活性など）に
より検出することが可能となる。
子の発現をマーカーとして蛋白-蛋白質間相互作用を検
出する方法である（米国特許第5283173、およびProc.Na
tl.Acad.Sci. USA、第88巻、第9578-9582頁、1991
年）。多くの転写因子はＤＮＡ結合領域と転写活性化領
域という異なる機能をもった２つの領域に分割できる
が、two-hybridシステムでは、例えば２つの蛋白質XとY
の相互作用を調べるために、２種類の融合蛋白質、すな
わち、転写因子のDNA結合領域とXからなる融合蛋白質、
および、転写因子の転写活性化領域とYからなる融合蛋
白質を同時に酵母細胞内で発現させる。蛋白質XとYが相
互作用する場合には両者の結合により、２種類の融合蛋
白質が全体として１つの機能する転写複合体を形成し、
細胞の核内において、応答配列（response element）
（転写因子が特異的に結合するＤＮＡの部位）と結合し
てその下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性
化する。このように２つの蛋白質の相互作用をレポータ
ー遺伝子の発現（例えば遺伝子産物の酵素活性など）に
より検出することが可能となる。
【００３０】Two-hybrid システムは、通常、特定の蛋
白質と相互作用する未知蛋白質の遺伝子同定などに用い
られ、蛋白-蛋白質間相互作用の定性的な評価に用いら
れるのが一般的である。本発明者らは、このシステムを
利用してＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的な
相互作用を十分な感度で定量測定し、定量的評価が必須
となる受容体のアンタゴニスト／アゴニストの同定やス
クリーニングにも適用できる方法を完成した。
白質と相互作用する未知蛋白質の遺伝子同定などに用い
られ、蛋白-蛋白質間相互作用の定性的な評価に用いら
れるのが一般的である。本発明者らは、このシステムを
利用してＰＰＡＲと転写共役因子とのリガンド依存的な
相互作用を十分な感度で定量測定し、定量的評価が必須
となる受容体のアンタゴニスト／アゴニストの同定やス
クリーニングにも適用できる方法を完成した。
【００３１】本発明の一つの実施態様としては、（ｉ）
ＰＰＡＲの少なくともリガンド結合領域と転写因子の第
一の領域からなる第一の融合蛋白質をコードするもので
あって、該転写因子の第一の領域はＤＮＡ結合領域又は
転写活性化領域のいずれかである、第一の融合遺伝子、
（ｉｉ）ＰＰＡＲと相互作用する転写共役因子の少なく
ともＰＰＡＲ結合領域と転写因子の第二の領域からなる
第二の融合蛋白質をコードするものであって、該転写因
子の第二の領域は、転写因子の第一の領域がＤＮＡ結合
領域である場合には転写活性化領域であり、転写因子の
第一の領域が転写活性化領域である場合にはＤＮＡ結合
領域である、第二の融合遺伝子、及び（ｉｉｉ）該転写
因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列およびこれ
に連結されたレポーター遺伝子、を含む試験用細胞を用
い、これを被験物質と共存させ、試験用細胞におけるペ
ルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡ
Ｒ）と転写共役因子とのリガンド依存的な相互作用の被
験物質による変化を、レポーター遺伝子の発現を指標と
して検出し測定することからなる、ＰＰＡＲのアゴニス
トまたはアンタゴニストの同定方法が挙げられる。
ＰＰＡＲの少なくともリガンド結合領域と転写因子の第
一の領域からなる第一の融合蛋白質をコードするもので
あって、該転写因子の第一の領域はＤＮＡ結合領域又は
転写活性化領域のいずれかである、第一の融合遺伝子、
（ｉｉ）ＰＰＡＲと相互作用する転写共役因子の少なく
ともＰＰＡＲ結合領域と転写因子の第二の領域からなる
第二の融合蛋白質をコードするものであって、該転写因
子の第二の領域は、転写因子の第一の領域がＤＮＡ結合
領域である場合には転写活性化領域であり、転写因子の
第一の領域が転写活性化領域である場合にはＤＮＡ結合
領域である、第二の融合遺伝子、及び（ｉｉｉ）該転写
因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列およびこれ
に連結されたレポーター遺伝子、を含む試験用細胞を用
い、これを被験物質と共存させ、試験用細胞におけるペ
ルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（ＰＰＡ
Ｒ）と転写共役因子とのリガンド依存的な相互作用の被
験物質による変化を、レポーター遺伝子の発現を指標と
して検出し測定することからなる、ＰＰＡＲのアゴニス
トまたはアンタゴニストの同定方法が挙げられる。
【００３２】この実施態様において、ＰＰＡＲと転写共
役因子との相互作用検出のために用いられる転写因子
は、細胞内で転写活性化の機能を発揮し得る真核生物の
転写因子（ＰＰＡＲ以外）であれば特に限定されない
が、哺乳動物細胞由来の転写共役因子等の働きを必要と
せず、単独で効率よく酵母細胞内でも転写活性化能を発
揮するという観点から、酵母由来の転写因子を用いるこ
とが好ましい。
役因子との相互作用検出のために用いられる転写因子
は、細胞内で転写活性化の機能を発揮し得る真核生物の
転写因子（ＰＰＡＲ以外）であれば特に限定されない
が、哺乳動物細胞由来の転写共役因子等の働きを必要と
せず、単独で効率よく酵母細胞内でも転写活性化能を発
揮するという観点から、酵母由来の転写因子を用いるこ
とが好ましい。
【００３３】このような転写因子としては、例えば、酵
母のＧＡＬ４蛋白質（Keeganら、Science、第231巻、第
699-704頁、1986年、Maら、Cell、第48巻、第847-853
頁、1987年）、ＧＣＮ４蛋白質（Hopeら、Cell、第46
巻、第885-894頁、1986年）、ＡＤＲ１蛋白質（Thukral
ら、Molecular and Cellular Biology、第9巻、第2360-
2369頁、1989年）などが挙げられる。
母のＧＡＬ４蛋白質（Keeganら、Science、第231巻、第
699-704頁、1986年、Maら、Cell、第48巻、第847-853
頁、1987年）、ＧＣＮ４蛋白質（Hopeら、Cell、第46
巻、第885-894頁、1986年）、ＡＤＲ１蛋白質（Thukral
ら、Molecular and Cellular Biology、第9巻、第2360-
2369頁、1989年）などが挙げられる。
【００３４】転写因子のＤＮＡ結合領域は、応答配列に
対するＤＮＡ結合能は有するが、単独で転写活性化能を
有しないものであればよい。また、転写因子の転写活性
化領域は、転写活性化能は有するが、単独で応答配列に
対するＤＮＡ結合能を有しないものであればよい。
対するＤＮＡ結合能は有するが、単独で転写活性化能を
有しないものであればよい。また、転写因子の転写活性
化領域は、転写活性化能は有するが、単独で応答配列に
対するＤＮＡ結合能を有しないものであればよい。
【００３５】転写因子のＤＮＡ結合領域および転写活性
化領域は、例えばＧＡＬ４の場合、Ｎ末端側（およそ第
１番目から１４７番目までのアミノ酸を含む領域）及び
Ｃ末端側（およそ第７６８番目から８８１番目までのア
ミノ酸を含む領域）に各々存在することが知られてい
る。また、ＧＣＮ４の場合、Ｃ末端側（およそ第２２８
番目から２６５番目までのアミノ酸を含む領域）及びＮ
末端側（およそ第１０７番目から１２５番目までのアミ
ノ酸を含む領域）に各々存在することが知られている。
また、ＡＤＲ１の場合、Ｎ末端側（およそ第７６番目か
ら１７２番目までのアミノ酸を含む領域）及びＣ末端側
（およそ第２５０番目から１３２３番目までのアミノ酸
を含む領域）に各々存在することが知られている。
化領域は、例えばＧＡＬ４の場合、Ｎ末端側（およそ第
１番目から１４７番目までのアミノ酸を含む領域）及び
Ｃ末端側（およそ第７６８番目から８８１番目までのア
ミノ酸を含む領域）に各々存在することが知られてい
る。また、ＧＣＮ４の場合、Ｃ末端側（およそ第２２８
番目から２６５番目までのアミノ酸を含む領域）及びＮ
末端側（およそ第１０７番目から１２５番目までのアミ
ノ酸を含む領域）に各々存在することが知られている。
また、ＡＤＲ１の場合、Ｎ末端側（およそ第７６番目か
ら１７２番目までのアミノ酸を含む領域）及びＣ末端側
（およそ第２５０番目から１３２３番目までのアミノ酸
を含む領域）に各々存在することが知られている。
【００３６】応答配列は、転写因子に対応した応答配列
を用いればよく、転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得
るＤＮＡ配列が用いられる。転写因子に対応する応答配
列は、一般にその転写因子によって転写活性が制御され
る遺伝子の上流域に存在しているので、その領域を切り
出して用いることができる。あるいはその配列が知られ
ているのであれば、化学合成により対応するオリゴヌク
レオチドを合成して用いてもよい。
を用いればよく、転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得
るＤＮＡ配列が用いられる。転写因子に対応する応答配
列は、一般にその転写因子によって転写活性が制御され
る遺伝子の上流域に存在しているので、その領域を切り
出して用いることができる。あるいはその配列が知られ
ているのであれば、化学合成により対応するオリゴヌク
レオチドを合成して用いてもよい。
【００３７】例えば、転写因子としてＧＡＬ４を用いる
場合、応答配列としては、ＵＡＳg（ガラクトース代謝
遺伝子の上流域活性化部位：upstream activation site
ofgalactose genes）と称されるＧＡＬ４特異的なＤＮ
Ａ配列を用いることができる。ＵＡＳgは、ＧＡＬ１遺
伝子等ガラクトース代謝遺伝子の上流域に含まれるの
で、これらの領域を用いることができる。あるいは、Ｕ
ＡＳgに相当する塩基配列を、化学合成して用いてもよ
い。
場合、応答配列としては、ＵＡＳg（ガラクトース代謝
遺伝子の上流域活性化部位：upstream activation site
ofgalactose genes）と称されるＧＡＬ４特異的なＤＮ
Ａ配列を用いることができる。ＵＡＳgは、ＧＡＬ１遺
伝子等ガラクトース代謝遺伝子の上流域に含まれるの
で、これらの領域を用いることができる。あるいは、Ｕ
ＡＳgに相当する塩基配列を、化学合成して用いてもよ
い。
【００３８】応答配列の下流に配置されるレポータ遺伝
子は、一般に用いられるものであれば特に限定されない
が、安定でかつ活性の定量的測定が容易な酵素の遺伝子
などを用いることが好ましい。このようなレポータ遺伝
子としては、例えば、大腸菌由来のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、バクテリアトランスポゾン由来
のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子
（Ｌｕｃ）等があげられる。このうち大腸菌由来のベー
タガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）は、発色基質を
用いて可視光で容易に測定可能である点で好ましい。レ
ポータ遺伝子は、遺伝子本来のプロモータを有するもの
であってもよいし、プロモータ部分が他の遺伝子由来の
ものと置き換えられたものを用いることもできる。レポ
ータ遺伝子は、応答配列の下流に機能的に連結されてい
ればよい。
子は、一般に用いられるものであれば特に限定されない
が、安定でかつ活性の定量的測定が容易な酵素の遺伝子
などを用いることが好ましい。このようなレポータ遺伝
子としては、例えば、大腸菌由来のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、バクテリアトランスポゾン由来
のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子
（Ｌｕｃ）等があげられる。このうち大腸菌由来のベー
タガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）は、発色基質を
用いて可視光で容易に測定可能である点で好ましい。レ
ポータ遺伝子は、遺伝子本来のプロモータを有するもの
であってもよいし、プロモータ部分が他の遺伝子由来の
ものと置き換えられたものを用いることもできる。レポ
ータ遺伝子は、応答配列の下流に機能的に連結されてい
ればよい。
【００３９】第一の融合蛋白質は、ＰＰＡＲのリガンド
結合領域と転写因子の第一の領域（ＤＮＡ結合領域又は
転写活性化領域）を含み、第二の融合蛋白質は、転写共
役因子のＰＰＡＲ結合領域と転写因子の第二の領域（転
写活性化領域又はＤＮＡ結合領域）を含む。融合蛋白質
を構成する二種の領域はいずれが上流域に配置されてい
てもよい。融合蛋白質は、その必要機能を損なわない範
囲で付加的な構成、あるいは配列などの欠失や置換を有
していてもよい。
結合領域と転写因子の第一の領域（ＤＮＡ結合領域又は
転写活性化領域）を含み、第二の融合蛋白質は、転写共
役因子のＰＰＡＲ結合領域と転写因子の第二の領域（転
写活性化領域又はＤＮＡ結合領域）を含む。融合蛋白質
を構成する二種の領域はいずれが上流域に配置されてい
てもよい。融合蛋白質は、その必要機能を損なわない範
囲で付加的な構成、あるいは配列などの欠失や置換を有
していてもよい。
【００４０】転写因子の第一及び第二の領域は、両者が
一体となってはじめて応答配列と結合し遺伝子の転写を
活性化する機能を果たすものである。このためには、第
一の領域をＤＮＡ結合領域とした場合には、第二の領域
は転写活性化領域とし、第一の領域を転写活性化領域と
した場合には、第二の領域はＤＮＡ結合領域とする必要
がある。第一及び第二の領域は、両者が一体となった時
に機能を果たすものであれば、必ずしも同一の転写因子
に由来するものである必要はなく、異なる転写因子に由
来するものであってもよい。
一体となってはじめて応答配列と結合し遺伝子の転写を
活性化する機能を果たすものである。このためには、第
一の領域をＤＮＡ結合領域とした場合には、第二の領域
は転写活性化領域とし、第一の領域を転写活性化領域と
した場合には、第二の領域はＤＮＡ結合領域とする必要
がある。第一及び第二の領域は、両者が一体となった時
に機能を果たすものであれば、必ずしも同一の転写因子
に由来するものである必要はなく、異なる転写因子に由
来するものであってもよい。
【００４１】第一及び第二の融合蛋白質をコードする融
合遺伝子は通常の遺伝子組換え技術を用いて、設計し構
築することができる。第一及び第二の融合蛋白質を構成
するＰＰＡＲのリガンド結合領域、転写共役因子のＰＰ
ＡＲ結合領域、転写因子のＤＮＡ結合領域、及び転写因
子の転写活性化領域をコードするＤＮＡは、例えば、既
知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し
合成したプライマーやプローブを用い、ＰＣＲ（Polyme
rase Chain Reaction）法や合成プローブを用いるスク
リーニングなどにより、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤ
ＮＡを単離することができる。これら各領域をコードす
るＤＮＡを連結し、これを適当なプロモーターの下流に
連結することによりすることにより融合遺伝子を構築で
きる。各領域及びこれをコードするＤＮＡは、必要な機
能を損なわれない範囲で配列上の付加・欠失・置換など
が導入されていてもよい。
合遺伝子は通常の遺伝子組換え技術を用いて、設計し構
築することができる。第一及び第二の融合蛋白質を構成
するＰＰＡＲのリガンド結合領域、転写共役因子のＰＰ
ＡＲ結合領域、転写因子のＤＮＡ結合領域、及び転写因
子の転写活性化領域をコードするＤＮＡは、例えば、既
知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し
合成したプライマーやプローブを用い、ＰＣＲ（Polyme
rase Chain Reaction）法や合成プローブを用いるスク
リーニングなどにより、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤ
ＮＡを単離することができる。これら各領域をコードす
るＤＮＡを連結し、これを適当なプロモーターの下流に
連結することによりすることにより融合遺伝子を構築で
きる。各領域及びこれをコードするＤＮＡは、必要な機
能を損なわれない範囲で配列上の付加・欠失・置換など
が導入されていてもよい。
【００４２】得られた第一及び第二の融合遺伝子は、適
当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で
宿主細胞に導入すればよい。第一および第二の融合遺伝
子は、両者が一つのプラスミド上に含まれるよう構成し
てもよく、あるいは各々別々のプラスミド上に含まれる
よう構成してもよい。
当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で
宿主細胞に導入すればよい。第一および第二の融合遺伝
子は、両者が一つのプラスミド上に含まれるよう構成し
てもよく、あるいは各々別々のプラスミド上に含まれる
よう構成してもよい。
【００４３】応答配列およびこれに連結されたレポータ
ー遺伝子もまた、通常の遺伝子組換え技術を用いて、設
計、構築し、この構成をベクタープラスミド中に組込ん
だ上、得られた組換えプラスミドを宿主細胞中に導入す
ればよい。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに
組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
ー遺伝子もまた、通常の遺伝子組換え技術を用いて、設
計、構築し、この構成をベクタープラスミド中に組込ん
だ上、得られた組換えプラスミドを宿主細胞中に導入す
ればよい。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに
組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
【００４４】すべての構成を含む試験用細胞は、例え
ば、応答配列およびこれに連結されたレポーター遺伝子
が宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた宿主細胞に、
第一及び第二の融合遺伝子を含む一つ又は二つのプラス
ミドを導入することにより取得できる。
ば、応答配列およびこれに連結されたレポーター遺伝子
が宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた宿主細胞に、
第一及び第二の融合遺伝子を含む一つ又は二つのプラス
ミドを導入することにより取得できる。
【００４５】かくして得られた試験用細胞を、例えば被
験物質の存在下で培養し、レポーター遺伝子の発現によ
りＰＰＡＲと転写共役因子との相互作用を検出し測定す
る。被験物質がＰＰＡＲと結合し、その結合に依存して
転写共役因子との相互作用が生じるとき、レポーター活
性の増大が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲ
のアゴニストとして同定される。また、例えば被験物質
がＰＰＡＲと結合するが転写共役因子との相互作用を促
進しないとき、真のリガンドあるいはアゴニストとして
同定された薬物と共に系に加えると、真のリガンドある
いはアゴニストによって発現するレポーター活性の減少
が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲのアンタ
ゴニストとして同定される。
験物質の存在下で培養し、レポーター遺伝子の発現によ
りＰＰＡＲと転写共役因子との相互作用を検出し測定す
る。被験物質がＰＰＡＲと結合し、その結合に依存して
転写共役因子との相互作用が生じるとき、レポーター活
性の増大が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲ
のアゴニストとして同定される。また、例えば被験物質
がＰＰＡＲと結合するが転写共役因子との相互作用を促
進しないとき、真のリガンドあるいはアゴニストとして
同定された薬物と共に系に加えると、真のリガンドある
いはアゴニストによって発現するレポーター活性の減少
が観察される。このような被験物質はＰＰＡＲのアンタ
ゴニストとして同定される。
【００４６】本発明のうちＣＢＰとのリガンド依存的な
相互作用を検出し、該相互作用に対する被験物質の作用
を測定することを特徴とする方法の別の実施態様として
は、例えば、ＰＰＡＲとＣＢＰとのリガンド依存的相互
作用を、直接測定する方法がある。このような方法で
は、例えばＲＩなどで標識したＣＢＰもしくはそのＰＰ
ＡＲ結合領域を用い、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダー
ゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）
など適当なタグ蛋白質とＰＰＡＲのリガンド結合領域か
らなる融合タンパク質との結合を被験物質の存在下で直
接的に検出することで実施できる。
相互作用を検出し、該相互作用に対する被験物質の作用
を測定することを特徴とする方法の別の実施態様として
は、例えば、ＰＰＡＲとＣＢＰとのリガンド依存的相互
作用を、直接測定する方法がある。このような方法で
は、例えばＲＩなどで標識したＣＢＰもしくはそのＰＰ
ＡＲ結合領域を用い、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダー
ゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）
など適当なタグ蛋白質とＰＰＡＲのリガンド結合領域か
らなる融合タンパク質との結合を被験物質の存在下で直
接的に検出することで実施できる。
【００４７】本発明の方法により、例えばＰＰＡＲγに
対する作用薬のスクリーニングを行うことができる。Ｐ
ＰＡＲγのリガンドとしては、種々のチアゾリジンジオ
ン誘導体が同定されている他、アラキドン酸代謝物の一
つであるプロスタグランジン類の15d-PGJ2（15-deoxy-
△12,14-prostaglandin J2）が真のリガンドであると考
えられている（Cell、第83巻、第803-812頁および第813
-819頁、1995年）。従って、ＰＰＡＲγに対するアゴニ
ストの同定やスクリーニングの際には、15d-PGJ2を陽性
コントロールとして用いることができる。また、15d-PG
J2によるリガンド依存的相互作用の発現に対する阻害の
有無を調べることにより、ＰＰＡＲγに対するアンタゴ
ニストの同定やスクリーニングを実施することができ
る。
対する作用薬のスクリーニングを行うことができる。Ｐ
ＰＡＲγのリガンドとしては、種々のチアゾリジンジオ
ン誘導体が同定されている他、アラキドン酸代謝物の一
つであるプロスタグランジン類の15d-PGJ2（15-deoxy-
△12,14-prostaglandin J2）が真のリガンドであると考
えられている（Cell、第83巻、第803-812頁および第813
-819頁、1995年）。従って、ＰＰＡＲγに対するアゴニ
ストの同定やスクリーニングの際には、15d-PGJ2を陽性
コントロールとして用いることができる。また、15d-PG
J2によるリガンド依存的相互作用の発現に対する阻害の
有無を調べることにより、ＰＰＡＲγに対するアンタゴ
ニストの同定やスクリーニングを実施することができ
る。
【００４８】ＰＰＡＲγのアゴニストは、優れた血糖降
下作用を有する糖尿病治療薬として期待される。また、
ＰＰＡＲγが脂肪細胞の分化誘導因子であることから、
ＰＰＡＲγのアンタゴニストは抗肥満薬としての作用を
有することが期待される。
下作用を有する糖尿病治療薬として期待される。また、
ＰＰＡＲγが脂肪細胞の分化誘導因子であることから、
ＰＰＡＲγのアンタゴニストは抗肥満薬としての作用を
有することが期待される。
【００４９】また、ＰＰＡＲγに対する作用薬のスクリ
ーニングの際には、他のサブタイプ、すなわち、ＰＰＡ
ＲαやＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡ
ＡＲ）に対する作用も検定することにより、ＰＰＡＲγ
に対する選択性の高い薬物を選別することができる。
ーニングの際には、他のサブタイプ、すなわち、ＰＰＡ
ＲαやＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡ
ＡＲ）に対する作用も検定することにより、ＰＰＡＲγ
に対する選択性の高い薬物を選別することができる。
【００５０】以下、実施例をもって本発明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。
【００５１】なお、下記実施例において、各操作は特に
明示がない限り、「Molecular Cloning」［Sambrook,
J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T. 著、Cold Spring
Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊］に記載の
方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用い
る場合には市販品の指示書に従って使用した。
明示がない限り、「Molecular Cloning」［Sambrook,
J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T. 著、Cold Spring
Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊］に記載の
方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用い
る場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００５２】
実施例１ ＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作
用にもとづくＰＰＡＲγ作用薬スクリーニング系の構築 （１）ＰＰＡＲγ２及びＣＢＰの遺伝子の単離 ＰＰＡＲγ２のｃＤＮＡを、ヒト脂肪組織由来のcDNAラ
イブラリー（Clontech社製）からPCR法によって取得し
た。PCRには以下の後記配列表の配列番号１及び２に示
したプライマーを用いた。これらプライマーは、遺伝子
データベースGenbankのAccession番号D83233に記載され
たヒトＰＰＡＲγ２の遺伝子配列を元に設計し、プライ
マーの末端には、酵母発現ベクターに挿入するための制
限酵素認識部位を付加した。得られた1574塩基対断片は
開始コドンの前にSmaI認識部位、終止コドンの後にXhoI
認識部位を有しており、完全長のヒトＰＰＡＲγ2をコ
ードしている。
用にもとづくＰＰＡＲγ作用薬スクリーニング系の構築 （１）ＰＰＡＲγ２及びＣＢＰの遺伝子の単離 ＰＰＡＲγ２のｃＤＮＡを、ヒト脂肪組織由来のcDNAラ
イブラリー（Clontech社製）からPCR法によって取得し
た。PCRには以下の後記配列表の配列番号１及び２に示
したプライマーを用いた。これらプライマーは、遺伝子
データベースGenbankのAccession番号D83233に記載され
たヒトＰＰＡＲγ２の遺伝子配列を元に設計し、プライ
マーの末端には、酵母発現ベクターに挿入するための制
限酵素認識部位を付加した。得られた1574塩基対断片は
開始コドンの前にSmaI認識部位、終止コドンの後にXhoI
認識部位を有しており、完全長のヒトＰＰＡＲγ2をコ
ードしている。
【００５３】ＣＢＰのN末端部分のｃＤＮＡを、マウス
脂肪細胞から調製したRNAから逆転写反応により選られ
たcDNAから、PCR法によって取得した。PCRには以下の後
記配列表の配列番号３及び４に示したプライマーを用い
た。これらプライマーは、Chriviaらの文献（Nature、
第365巻、第855-859頁、1993年）に記載されたヒトＰＰ
ＡＲγ２の遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端
には、酵母発現ベクターに挿入するために制限酵素認識
部位を付加した。得られた1411塩基対断片は開始コドン
の前にBamHI認識部位、C末端にBglII認識部位を有して
おり、マウスＣＢＰの1から464番目のアミノ酸をコード
している。
脂肪細胞から調製したRNAから逆転写反応により選られ
たcDNAから、PCR法によって取得した。PCRには以下の後
記配列表の配列番号３及び４に示したプライマーを用い
た。これらプライマーは、Chriviaらの文献（Nature、
第365巻、第855-859頁、1993年）に記載されたヒトＰＰ
ＡＲγ２の遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端
には、酵母発現ベクターに挿入するために制限酵素認識
部位を付加した。得られた1411塩基対断片は開始コドン
の前にBamHI認識部位、C末端にBglII認識部位を有して
おり、マウスＣＢＰの1から464番目のアミノ酸をコード
している。
【００５４】（２）ＰＰＡＲγのリガンド結合領域とGA
L4のDNA結合領域からなる融合蛋白質発現ベクター構築 上記（１）で得られた1574塩基対のＰＰＡＲγ２遺伝子
を、その末端に設計したXhoI認識部位と塩基配列中に存
在するBamHI認識部位にて切断した。得られた断片を、
転写因子GAL4のDNA結合領域（GAL4の１から１４７番目
のアミノ酸残基）の遺伝子を含む酵母の発現ベクターpG
BT9（Clontech社製、酵母two-hybridシステム用ベクタ
ー）のBamHI-SalI部位に挿入した。これにより、ヒトＰ
ＰＡＲγ2の181番目のアミノ酸残基以降の部分（リガン
ド結合領域）とGAL4のDNA結合領域との融合タンパク質
を発現するためのプラスミドpGBT9-PPARγ2（図１Ａ）
を得た。
L4のDNA結合領域からなる融合蛋白質発現ベクター構築 上記（１）で得られた1574塩基対のＰＰＡＲγ２遺伝子
を、その末端に設計したXhoI認識部位と塩基配列中に存
在するBamHI認識部位にて切断した。得られた断片を、
転写因子GAL4のDNA結合領域（GAL4の１から１４７番目
のアミノ酸残基）の遺伝子を含む酵母の発現ベクターpG
BT9（Clontech社製、酵母two-hybridシステム用ベクタ
ー）のBamHI-SalI部位に挿入した。これにより、ヒトＰ
ＰＡＲγ2の181番目のアミノ酸残基以降の部分（リガン
ド結合領域）とGAL4のDNA結合領域との融合タンパク質
を発現するためのプラスミドpGBT9-PPARγ2（図１Ａ）
を得た。
【００５５】（３）ＣＢＰのＮ末端領域（ＰＰＡＲ結合
領域）とGAL4の転写活性化領域からなる融合蛋白質発現
ベクター構築 上記（１）で得られた1411塩基対のＣＢＰ遺伝子（Ｎ末
端領域）を、その末端に設計したBamHI認識部位とBglII
認識部位にて切断した。得られた断片を、ＧＡＬ４の転
写活性化領域（ＧＡＬ４の７６８から８８１番目のアミ
ノ酸残基）の遺伝子を含む酵母の発現ベクターpGAD424
（Clontech社製、酵母two-hybridシステム用ベクター）
のBamHI-BglII部位に挿入した。これにより、マウスＣ
ＢＰの1から464番目のアミノ酸残基までの部分（Ｎ末端
領域）とGAL4の転写活性化部位との融合蛋白質を発現す
るためのプラスミドpGAD424-CBP（図１Ｂ）を得た。
領域）とGAL4の転写活性化領域からなる融合蛋白質発現
ベクター構築 上記（１）で得られた1411塩基対のＣＢＰ遺伝子（Ｎ末
端領域）を、その末端に設計したBamHI認識部位とBglII
認識部位にて切断した。得られた断片を、ＧＡＬ４の転
写活性化領域（ＧＡＬ４の７６８から８８１番目のアミ
ノ酸残基）の遺伝子を含む酵母の発現ベクターpGAD424
（Clontech社製、酵母two-hybridシステム用ベクター）
のBamHI-BglII部位に挿入した。これにより、マウスＣ
ＢＰの1から464番目のアミノ酸残基までの部分（Ｎ末端
領域）とGAL4の転写活性化部位との融合蛋白質を発現す
るためのプラスミドpGAD424-CBP（図１Ｂ）を得た。
【００５６】（４）酵母の形質転換 酵母細胞株SFY526（Clontech社製）を用い、これに、上
記（２）及び（３）で得られた融合蛋白質発現プラスミ
ドpGBT9-PPARγ2及びpGAD424-CBPを導入した。細胞株SF
Y526（ゲノタイプは、MATa, ura3-52, his3-200, ade2-
101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, canr, gal4-5
42, gal80-538, URA3::GAL1-lacZ）は、GAL1とlacZの融
合遺伝子が染色体に組込まれており、GAL4遺伝子の欠損
変異を有している細胞株である（Bartelら、Bio Techni
ques、第14巻、第920-924頁、1993年）。形質転換は、
酢酸リチウム法により行い、それぞれのプラスミドの選
択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させ
た合成培地にて培養することにより選別を行って、それ
ぞれのプラスミドの一方のみが導入された形質転換株及
び両プラスミドが導入された形質転換株を得た。
記（２）及び（３）で得られた融合蛋白質発現プラスミ
ドpGBT9-PPARγ2及びpGAD424-CBPを導入した。細胞株SF
Y526（ゲノタイプは、MATa, ura3-52, his3-200, ade2-
101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, canr, gal4-5
42, gal80-538, URA3::GAL1-lacZ）は、GAL1とlacZの融
合遺伝子が染色体に組込まれており、GAL4遺伝子の欠損
変異を有している細胞株である（Bartelら、Bio Techni
ques、第14巻、第920-924頁、1993年）。形質転換は、
酢酸リチウム法により行い、それぞれのプラスミドの選
択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させ
た合成培地にて培養することにより選別を行って、それ
ぞれのプラスミドの一方のみが導入された形質転換株及
び両プラスミドが導入された形質転換株を得た。
【００５７】（５）ＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存
的相互作用の検出 上記（４）で得たpGBT9-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラ
スミドを含む酵母形質転換株あるいは一方のプラスミド
のみを含む酵母形質転換株を、YPD培地（液体培地）で
培養した。培養の際、培地中に、ＰＰＡＲγ2の生体内
でのリガンドである15-deoxy-△12,14-prostaglandin J
2をYPD培地で希釈したものを添加（もしくは無添加）し
た。15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2（以下15d-PGJ
2と略す）は、市販品（CAYMAN CHEMICAL社製、USA）を
用いた。培養は４〜５時間行った。培養後、酵母菌体を
遠心分離により回収し、β-ガラクトシダーゼ活性を測
定した。
的相互作用の検出 上記（４）で得たpGBT9-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラ
スミドを含む酵母形質転換株あるいは一方のプラスミド
のみを含む酵母形質転換株を、YPD培地（液体培地）で
培養した。培養の際、培地中に、ＰＰＡＲγ2の生体内
でのリガンドである15-deoxy-△12,14-prostaglandin J
2をYPD培地で希釈したものを添加（もしくは無添加）し
た。15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2（以下15d-PGJ
2と略す）は、市販品（CAYMAN CHEMICAL社製、USA）を
用いた。培養は４〜５時間行った。培養後、酵母菌体を
遠心分離により回収し、β-ガラクトシダーゼ活性を測
定した。
【００５８】その結果、15d-PGJ2を培地中に加えたこと
によりpGBT-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラスミドを含む
酵母でβ-ガラクトシダーゼ活性（ＬａｃＺ遺伝子発
現）の増大が観察された（図２Ａ）。また、このような
15d-PGJ2によるβ-ガラクトシダーゼ活性の増大は、15
d-PGJ2の濃度に依存して認められた（図２Ｂ）。これら
は、リガンド15d-PGJ2の存在によってＰＰＡＲγとＣＢ
Ｐのリガンド依存的相互作用がおこったことによると考
えられ、この結果から、ＣＢＰのＮ末端領域はＰＰＡＲ
と相互作用することが明らかとなった。また、この系で
ＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用が検出・
測定できるものと考えられた。
によりpGBT-PPARγ、pGAD424-CBPの両プラスミドを含む
酵母でβ-ガラクトシダーゼ活性（ＬａｃＺ遺伝子発
現）の増大が観察された（図２Ａ）。また、このような
15d-PGJ2によるβ-ガラクトシダーゼ活性の増大は、15
d-PGJ2の濃度に依存して認められた（図２Ｂ）。これら
は、リガンド15d-PGJ2の存在によってＰＰＡＲγとＣＢ
Ｐのリガンド依存的相互作用がおこったことによると考
えられ、この結果から、ＣＢＰのＮ末端領域はＰＰＡＲ
と相互作用することが明らかとなった。また、この系で
ＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作用が検出・
測定できるものと考えられた。
【００５９】次に、被験薬物として、次式
【００６０】
【化１】
【００６１】で示されるチアゾリジンジオン誘導体Ｔ−
１７４（化学名：５−〔〔２−（２−ナフタレニルメチ
ル）−５−ベンゾオキサゾリル〕メチル〕−２，４−チ
アゾリジンジオン）を用い、ＰＰＡＲγに対する作用を
調べた。
１７４（化学名：５−〔〔２−（２−ナフタレニルメチ
ル）−５−ベンゾオキサゾリル〕メチル〕−２，４−チ
アゾリジンジオン）を用い、ＰＰＡＲγに対する作用を
調べた。
【００６２】前記と同様にして、pGBT9-PPARγ、pGAD42
4-CBPの両プラスミドを含む酵母形質転換株あるいは一
方のプラスミドのみを含む酵母形質転換株を培養した。
但し、培養の際、培地中には15d-PGJ2にかえて、被験薬
物としてＴ−１７４を添加した。Ｔ−１７４は、特開昭
６４−５６６７５（実施例４９）記載の方法に準じて合
成したものを用いた。
4-CBPの両プラスミドを含む酵母形質転換株あるいは一
方のプラスミドのみを含む酵母形質転換株を培養した。
但し、培養の際、培地中には15d-PGJ2にかえて、被験薬
物としてＴ−１７４を添加した。Ｔ−１７４は、特開昭
６４−５６６７５（実施例４９）記載の方法に準じて合
成したものを用いた。
【００６３】その結果、pGBT-PPARγ、pGAD424-CBPの両
プラスミドを含む酵母でのみβ-ガラクトシダーゼ活性
の上昇が観察され（図３Ａ）、その作用はＴ−１７４の
濃度に依存した（図３Ｂ）。このように、Ｔ−１７４の
存在によりＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作
用が検出されたことから、Ｔ−１７４は、ＰＰＡＲγの
リガンドとして作用するアゴニストであると同定され
た。
プラスミドを含む酵母でのみβ-ガラクトシダーゼ活性
の上昇が観察され（図３Ａ）、その作用はＴ−１７４の
濃度に依存した（図３Ｂ）。このように、Ｔ−１７４の
存在によりＰＰＡＲγとＣＢＰのリガンド依存的相互作
用が検出されたことから、Ｔ−１７４は、ＰＰＡＲγの
リガンドとして作用するアゴニストであると同定され
た。
【００６４】Ｔ−１７４は、マウスの病態モデル（KK-A
γマウス）において、血糖降下作用を示すことが知られ
ている（特開昭６４−５６６７５及び特開平０２−１６
７２２５）。その作用点は明らかではなかったが、上記
の結果から、Ｔ−１７４の作用標的分子はＰＰＡＲγで
あることがわかった。
γマウス）において、血糖降下作用を示すことが知られ
ている（特開昭６４−５６６７５及び特開平０２−１６
７２２５）。その作用点は明らかではなかったが、上記
の結果から、Ｔ−１７４の作用標的分子はＰＰＡＲγで
あることがわかった。
【００６５】実施例２ ＰＰＡＲγとＳＲＣ−１のリガ
ンド依存的相互作用にもとづくＰＰＡＲγ作用薬スクリ
ーニング系の構築 ＳＲＣ−１の全領域のｃＤＮＡを、ヒト脂肪組織から調
製したcDNAライブラリーから、PCR法によって取得す
る。プライマーは、Onateらの文献（Science、第270
巻、第1354-1357頁、1995年）に記載されたヒトＳＲＣ
−１の遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端に
は、酵母発現ベクターに挿入するために制限酵素認識部
位を付加する。
ンド依存的相互作用にもとづくＰＰＡＲγ作用薬スクリ
ーニング系の構築 ＳＲＣ−１の全領域のｃＤＮＡを、ヒト脂肪組織から調
製したcDNAライブラリーから、PCR法によって取得す
る。プライマーは、Onateらの文献（Science、第270
巻、第1354-1357頁、1995年）に記載されたヒトＳＲＣ
−１の遺伝子配列を元に設計し、プライマーの末端に
は、酵母発現ベクターに挿入するために制限酵素認識部
位を付加する。
【００６６】これをＣＢＰのｃＤＮＡにかえて用い、前
記実施例１（２）及び（３）と同様にして、ＰＰＡＲγ
２のｃＤＮＡを酵母の発現ベクターpGBT9に、ＳＲＣ−
１のｃＤＮＡを酵母の発現ベクターpGAD424に各々挿入
して、ＰＰＡＲγのリガンド結合領域とGAL4のDNA結合
領域からなる融合蛋白質発現ベクター、及びＳＲＣ−１
の全領域とGAL4の転写活性化領域からなる融合蛋白質発
現ベクターを構築する。
記実施例１（２）及び（３）と同様にして、ＰＰＡＲγ
２のｃＤＮＡを酵母の発現ベクターpGBT9に、ＳＲＣ−
１のｃＤＮＡを酵母の発現ベクターpGAD424に各々挿入
して、ＰＰＡＲγのリガンド結合領域とGAL4のDNA結合
領域からなる融合蛋白質発現ベクター、及びＳＲＣ−１
の全領域とGAL4の転写活性化領域からなる融合蛋白質発
現ベクターを構築する。
【００６７】得られる二種の融合蛋白質発現プラスミド
を前記実施例１（４）と同様にして、GAL1とlacZの融合
遺伝子が染色体に組込まれていてGAL4遺伝子の欠損変異
を有している酵母細胞株SFY526に導入する。
を前記実施例１（４）と同様にして、GAL1とlacZの融合
遺伝子が染色体に組込まれていてGAL4遺伝子の欠損変異
を有している酵母細胞株SFY526に導入する。
【００６８】得られた形質転換株を用いて、前記実施例
１（５）と同様にして、ＰＰＡＲγとＳＲＣ−１のリガ
ンド依存的相互作用を検出する。
１（５）と同様にして、ＰＰＡＲγとＳＲＣ−１のリガ
ンド依存的相互作用を検出する。
【００６９】
【発明の効果】細胞内でのＰＰＡＲの転写活性化能を検
出する従来のＰＰＡＲ作用薬の同定方法では、細胞内因
性の共役転写因子やＲＸＲなどの関与を受けるが、本発
明の方法では、これらの関与がないので、被験物質のＰ
ＰＡＲに対する作用のみを的確に検出できる。また、本
発明の方法は、哺乳動物細胞を用いる必要がなく、酵母
細胞を用いることもできるので、培養操作が容易かつ迅
速に行える。さらに、放射性同位元素標識した被験化合
物や蛋白質を用いる必要もないので、安全かつ簡便であ
る。
出する従来のＰＰＡＲ作用薬の同定方法では、細胞内因
性の共役転写因子やＲＸＲなどの関与を受けるが、本発
明の方法では、これらの関与がないので、被験物質のＰ
ＰＡＲに対する作用のみを的確に検出できる。また、本
発明の方法は、哺乳動物細胞を用いる必要がなく、酵母
細胞を用いることもできるので、培養操作が容易かつ迅
速に行える。さらに、放射性同位元素標識した被験化合
物や蛋白質を用いる必要もないので、安全かつ簡便であ
る。
【００７０】本発明の方法によれば、多数の被験物質を
同時に処理することが可能で、しかも十分な感度と定量
性があるので、ＰＰＡＲのアゴニスト及びアンタゴニス
トの同定及びスクリーニングを効率よく良く行うことが
できる。
同時に処理することが可能で、しかも十分な感度と定量
性があるので、ＰＰＡＲのアゴニスト及びアンタゴニス
トの同定及びスクリーニングを効率よく良く行うことが
できる。
【００７１】
配列番号：１ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成プライマー） 配列 TCCCCCGGGT GCTGTTATGG GTGAAACTCT GGGAG 。
【００７２】配列番号：２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成プライマー） 配列 CCGCTCGAGA AATGTTGGCA GTGGCTCAGG ACTCT 。
【００７３】配列番号：３ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成プライマー） 配列 CGGGATCCGT ATGGCCGAGA ACTTGCTGGA CGGAC 。
【００７４】配列番号：４ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成プライマー） 配列 GAAGATCTTC TCTGTTGCCC TGCACCAACA GAACC 。
【図１】 使用したプラスミドｐＧＢＴ９−ＰＰＡＲγ
２及びｐＧＡＤ４２４−ＣＢＰの構成を示す模式図。
２及びｐＧＡＤ４２４−ＣＢＰの構成を示す模式図。
【図２】 ＰＰＡＲγ及びＣＢＰのリガンド依存的相互
作用を示した図。
作用を示した図。
【図３】 ＰＰＡＲγ及びＣＢＰの相互作用に対するＴ
−１７４の作用を示した図。
−１７４の作用を示した図。
Claims (11)
- 【請求項１】 試験用細胞を被験物質と共存させ、試験
用細胞におけるペルオキシソームプロリフェレータ活性
化受容体（ＰＰＡＲ）と転写共役因子とのリガンド依存
的な相互作用の被験物質による変化を、レポーター遺伝
子の発現を指標として検出し測定することからなる、Ｐ
ＰＡＲのアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法。 - 【請求項２】 試験用細胞の転写共役因子及びＰＰＡＲ
が外来の遺伝子に由来するものである請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 試験用細胞が、（ｉ）ＰＰＡＲの少なく
ともリガンド結合領域と転写因子の第一の領域からなる
第一の融合蛋白質をコードするものであって、該転写因
子の第一の領域はＤＮＡ結合領域又は転写活性化領域の
いずれかである、第一の融合遺伝子、（ｉｉ）ＰＰＡＲ
と相互作用する転写共役因子の少なくともＰＰＡＲ結合
領域と転写因子の第二の領域からなる第二の融合蛋白質
をコードするものであって、該転写因子の第二の領域
は、転写因子の第一の領域がＤＮＡ結合領域である場合
には転写活性化領域であり、転写因子の第一の領域が転
写活性化領域である場合にはＤＮＡ結合領域である、第
二の融合遺伝子、及び（ｉｉｉ）該転写因子のＤＮＡ結
合領域が結合し得る応答配列およびこれに連結されたレ
ポーター遺伝子、を含むものである請求項１記載の方
法。 - 【請求項４】 試験用細胞が酵母細胞である請求項１記
載の方法。 - 【請求項５】 ＰＰＡＲがＰＰＡＲγである請求項１記
載の方法。 - 【請求項６】 ＰＰＡＲγがヒト由来である請求項５記
載の方法。 - 【請求項７】 転写共役因子がＣＢＰ及びＳＲＣ−１か
ら選択されるものである請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 転写共役因子がＣＢＰである請求項１記
載の方法。 - 【請求項９】 転写因子が酵母のＧＡＬ４蛋白質である
請求項３記載の方法。 - 【請求項１０】 ＰＰＡＲとＣＢＰとのリガンド依存的
な相互作用を検出し、該相互作用に対する被験物質の作
用を測定することを特徴とするＰＰＡＲのアゴニスト又
はアンタゴニストの同定方法。 - 【請求項１１】 ＰＰＡＲのリガンド結合領域とＣＢＰ
の核内受容体結合領域の相互作用を検出する請求項１０
記載の方法。
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|---|---|---|---|
| JP23108497A JP4296608B2 (ja) | 1997-08-27 | 1997-08-27 | Ｐｐａｒのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法 |
| PCT/JP1998/003734 WO1999010532A1 (fr) | 1997-08-27 | 1998-08-24 | Procedes permettant d'identifier ou de cribler des agonistes et des antagonistes de ppar |
| AU87494/98A AU8749498A (en) | 1997-08-27 | 1998-08-24 | Methods for identifying or screening agonists for and antagonists to ppar |
| EP98938950A EP1057896B1 (en) | 1997-08-27 | 1998-08-24 | Methods for identifying or screening agonists for and antagonists to ppar |
| AT98938950T ATE333518T1 (de) | 1997-08-27 | 1998-08-24 | Verfahren zur identifizierug oder testung von agonisten für bzw. antagonisten gegen ppar |
| DE69835301T DE69835301T2 (de) | 1997-08-27 | 1998-08-24 | Verfahren zum identifizieren oder screenen von agonisten für und antagonisten gegen ppar |
| US09/514,247 US6365361B1 (en) | 1997-08-27 | 2000-02-28 | Method for identifying or screening agonist and antagonist to PPAR |
| US10/109,886 US7045298B2 (en) | 1997-08-27 | 2002-04-01 | Method for identifying or screening agonist and antagonist to PPAR |
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|---|---|---|---|
| JP23108497A JP4296608B2 (ja) | 1997-08-27 | 1997-08-27 | Ｐｐａｒのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法 |
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|---|---|
| JPH1156369A true JPH1156369A (ja) | 1999-03-02 |
| JP4296608B2 JP4296608B2 (ja) | 2009-07-15 |
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ID=16918043
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|---|---|---|---|
| JP23108497A Expired - Fee Related JP4296608B2 (ja) | 1997-08-27 | 1997-08-27 | Ｐｐａｒのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6365361B1 (ja) |
| EP (1) | EP1057896B1 (ja) |
| JP (1) | JP4296608B2 (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006518591A (ja) * | 2003-02-03 | 2006-08-17 | インペリアル カレッジ イノベーション リミテッド | 貯蔵脂肪のモジュレータのスクリーニング |
| JP2014014293A (ja) * | 2012-07-06 | 2014-01-30 | Kri Inc | Ｐｐａｒ活性物質検出形質転換酵母及びｐｐａｒ活性物質検出方法。 |
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|---|---|---|---|---|
| US6586189B2 (en) * | 1999-06-18 | 2003-07-01 | City Of Hope | Screening method for PPAR-γ ligands |
| US20020155472A1 (en) * | 2000-10-20 | 2002-10-24 | Czech Michael P. | Glucose transport-related genes and uses thereof |
| US20030104975A1 (en) * | 2001-06-14 | 2003-06-05 | Johan Auwerx | Cofactor-based screening method for nuclear receptor modulators and related modulators |
| AT500023B1 (de) * | 2001-09-27 | 2007-09-15 | Bmt Medizinische Forschung Und | Funktioneller screen für transskriptionsfaktoren |
| AU2003205230A1 (en) * | 2002-01-18 | 2003-09-02 | Incyte Genomics Inc. | Digenic mutations associated with severe insulin resistance and type 2 diabetes and their use in the diagnosis and treatment of diabetes |
| CA2474353A1 (en) * | 2002-01-23 | 2003-07-31 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for screening a drug ameliorating insulin resistance |
| WO2004005497A1 (ja) * | 2002-07-02 | 2004-01-15 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | インスリン抵抗性改善薬スクリーニング方法 |
| KR20050026508A (ko) * | 2002-07-24 | 2005-03-15 | 3-디멘져널 파마슈티칼즈 인코오포레이티드 | 리간드 확인 방법 |
| US7335481B2 (en) * | 2002-07-24 | 2008-02-26 | Christer Owman | Methods of identifying compounds that affect a fatty acid cell-surface receptor |
| KR100576575B1 (ko) * | 2003-09-16 | 2006-05-04 | 한국생명공학연구원 | 피피에이알감마에 대한 단일클론 항체, 특이 항체분비 융합세포주 및 항체를 이용한 염증, 암, 대사성 질환과 같은 질병 관련 조절인자를 검색하는 방법 |
| CN1303218C (zh) * | 2003-12-19 | 2007-03-07 | 中国科学院上海药物研究所 | 过氧化物酶体增长因子活化受体拮抗剂和激动剂的筛选方法 |
| US7307169B2 (en) * | 2004-01-05 | 2007-12-11 | Applera Corporation | Isotopically enriched N-substituted piperazines and methods for the preparation thereof |
| JP2007521806A (ja) * | 2004-01-16 | 2007-08-09 | セレス，インコーポレーテッド | 受容体ポリペプチドを有する植物細胞 |
| US7691823B2 (en) | 2004-03-05 | 2010-04-06 | University Of Massachusetts | RIP140 regulation of glucose transport |
| WO2006102426A2 (en) | 2005-03-21 | 2006-09-28 | Metabolex, Inc. | Methods for avoiding edema in the treatment of metabolic, inflammatory, and cardiovascular disorders |
| US9173875B2 (en) | 2006-04-11 | 2015-11-03 | Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center | Treatment for nicotine-induced lung disease using peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists |
| CN113308490B (zh) * | 2021-05-18 | 2023-02-28 | 华中农业大学 | 利用双荧光素酶报告基因系统及分子对接技术筛选PGC-1α小分子调控剂的方法 |
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| US5989808A (en) * | 1994-06-14 | 1999-11-23 | American Cyanamid Company | Identification of compounds affecting specific interaction of peptide binding pairs |
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1998
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- 2000-02-28 US US09/514,247 patent/US6365361B1/en not_active Expired - Lifetime
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2002
- 2002-04-01 US US10/109,886 patent/US7045298B2/en not_active Expired - Fee Related
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