KR100576575B1

KR100576575B1 - 피피에이알감마에 대한 단일클론 항체, 특이 항체분비 융합세포주 및 항체를 이용한 염증, 암, 대사성 질환과 같은 질병 관련 조절인자를 검색하는 방법

Info

Publication number: KR100576575B1
Application number: KR1020030064182A
Authority: KR
Inventors: 윤도영; 이해숙; 조민철; 이경애; 조경주; 강정우; 심정현; 임종석; 홍진태; 이희구; 최용경
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-09-16
Filing date: 2003-09-16
Publication date: 2006-05-04
Also published as: US20060140938A1; AU2003272102A1; KR20050027808A; WO2005026336A1; US7387895B2

Abstract

본 발명은 암, 염증, 대사성질환(비만, 당뇨)과 같은 난치성 질환의 진행정도에 관련된 PPARγ(Peroxisome Proliferated Activated Receptor gamma)의 기능 연구에 필수적인 PPAR 에 대한 특이 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포 주에 관한 것과 PPARγ특이 단일클론 항체를 이용한 PPARγ의 조절물질(리간드)를 탐색할 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 이미 상업적으로 보급된 PPARγ에 대한 단일클론 및 다 클론 항체는 여러 가지 실험의 이용에 있어서, 결합능이 약하고 불안정한 결과를 초래하기 때문에 여기에 안정한 결과를 획득할 수 있는 PPARγ의 단일클론 항체와 이를 이용하여 대사성질환(비만, 당뇨), 암, 염증에 PPARγ의 활성을 변화시킬 수 있는 조절물질들을 스크리닝할 수 있는 새로운 방법을 제공한다. 이러한 PPARγ의 단일클론항체와 이를 이용한 PPARγ활성조절물질 스크리닝 방법은 상업적으로 염증, 암, 대사성질환과 같은 질병 관련 PPARγ 조절물질을 스크리닝 하는데 이용함은 물론 나아가 이것의 기능분석을 위한 유용한 도구로 활용될 것이다.

비만, 당뇨, 암, 염증, PPARγ, 단일클론 항체, SRC-1, 효소면역활성측정 (ELISA)법.

Description

피피에이알감마에 대한 단일클론 항체, 특이항체분비 융합 세포주 및 항체를 이용한 염증, 암, 대사성질환과 같은 질병 관련 조절인자를 검색하는 방법{MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC AGAINST PPARγANTIGEN, HYBRIDOMA CELL LINE PRODUCING SAME AND METHOD FOR DETECTING FACTOR RELATION TO DISEASE OF INFLAMMATION, CANCER, AND METABOLISM THEREOF}

도 1은 본 발명의 항 PPARγ단일클론 항체에 대한 항원으로서 PPARγ중 아형 2를 클로닝 하여, His-융합형태로 대장균에서 발현시켜 분리 정제한 후 12% SDS-PAGE 상에서 확인한 결과로서,

(A)는 인간 리포마(lipoma)에서 mRNA를 분리한 다음, 역전사효소를 이용, cDNA를 확보한 후, PPARγ2 프라이머를 이용하여 cDNA를 증폭한 것을 1% 아가로스 겔 상에서 확인한 것이고,

(B)는 PPARγ2 단백질을 대장균에서 대량으로 생산하기 위해 대장균 발현 벡터에 PPARγ2를 클로닝 하는 모식도를 나타낸 것이고,

(C)는 대장균에서 His-융합 PPARγ2를 증폭, 분리, 정제한 후, 12% SDS-PAGE상에서 확인한 결과를 나타낸 것이고,

도 2는 PPARγ2에 특이적인 단일클론 항체의 항원에 대한 역가를 나타낸 그래프로서,

(A)는 GST-융합형 PPARγ2를 항원으로 사용하여 PPARγ에 대해 높은 친화성을 가진 것을 나타낸 것이고,

(B)는 PPARγ에 대한 단일클론 항체의 아형을 Isotyping Kit(ImmunoTypeTM Isotyping Kit, BD Bioscience)으로 확인한 결과를 나타낸 것이고,

도 3의 (A)는 항원-항체 반응을 인간과 생쥐의 His-융합 형 재조합 단백질을 이용하여 웨스턴 블랏팅 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, (B)는 현존하는 항 PPARγ항체들 중 여러 가지 실험방법에서 비 특이 반응 차단 용액 시약으로 사용되는 탈분유와 BSA와 반응하는 제품과 비교하여 본 발명자들에 의해 만들어진 Pγ48.34A 항체가 탈분유와 BSA와의 비 특이적인 반응이 없음을 웨스턴 블랏팅 방법으로 나타낸 것이고,

도 4의 (A)는 3T3-L1 생쥐 세포주를 이용하여 지방분화시 특히 많이 발현되는 PPARγ를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 것으로, 핵은 물론 세포질에서도 확인이 가능하며, (B)는 본 발명자들이 제작한 항 PPARγ단일클론 항체(Pγ48.34A)가 지방분화와는 무관하게 55kDa의 PPARγ를 면역 침강법 에서도 사용할 수 있음을 나타낸 것이며,

도 5는 본 발명의 PPARγ에 대한 단일클론 항체가 다른 아형의 PPARα, PPARδ/β와 교차 반응성이 있는지를 타사 제품의 PPARγ항체들을 이용하여 마우스의 조직별로 웨스턴 블랏팅의 패턴의 유사성을 통하여 교차 반응이 없음을 확인하고 더욱 민감하게 반응한다는 것을 나타낸 것으로,

(A)는 본 발명자들이 제작한 Pγ48.34A 단일클론 항체이고, (B)는 C 회사제 품(Calbiochem, cat. 516555)의 항 PPARγ다클론항체. (C)는 S 회사제품 (Santacruz, sc-7273)의 항 PPARγ단일 클론 항체를 나타내며,

도 6은 본 발명의 단일클론 항체와 GST-융합 PPARγ 단백질 그리고 His-융합 SRC-1(Steroid Receptor Coactivator-1) 단백질들을 이용하여 염증, 암, 대사성질환과 같은 질병 관련 PPARγ의 조절물질 탐색하기위한 효소 면역측정법(ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay)의 원리를 도식화 한 것이고,

도 7은 항 PPARγ단일클론 항체를 이용하여 GST-PPARγ와 상호 작용하는 His Steroid Receptor Coactivator(SRC-1)을 마이크로타이터 플레이트에 일정농도 (800ng/well)로 부착시킨 후 대장균에서 발현시킨 PPARγlysate의 다양한 농도와의 결합을 확인(A)함으로써, PPARγ의 농도의존적인 결합을 제시함. (B)는 PPAR 와 SRC-1의 결합들이 리간드로 잘 알려진 Indomethacin이 첨가되면 이들 결합력이 도 6의 모식도와 같이 증가한다는 결과이다. 동일한 단백질의 농도일 때 리간드의 농도 의존적으로 두 단백질의 결합력이 증가하는 것으로 보아 항 PPARγ단일클론 항체를 이용한 효소면역측정법은 염증, 암, 대사성질환과 같은 질병 관련 조절물질을 탐색하기 위한 좋은 도구가 될 수 있음을 확인할 수 있었다.

도 8은 엘라이자 시스템을 최적화하기 위해서 여러 방법으로 실험해 본 결과, His-SRC-1을 마이크로타이터 플레이트에 800ng/웰의 농도로 단백질을 부착시키고, GST-PPARγ를 함유하고 있는 대장균 lysate를 64배 희석. 리간드들의 농도 범위는 1uM, 10uM, 100uM를 사용하는 것이 최적의 조건인 것을 보여준 것이며, 특히 His-PPAR 를 사용하는 것 보다 GST-PPARγ를 사용하는 것이 더욱 더 좋은 결과를 얻을 수 있었고, Indomethacin를 각각 1uM, 10uM, 100uM를 처리하여 리간드의 농도에 의해서 PPARγ와 SRC-1 단백질들의 결합이 증가하는 것으로 나타났다.

PPAR(Peroxisom Proliferator Activated Receptor)이라는 단백질은 핵내 전사 인자형 수용체(nuclear receptor)로 알려져 있다. 퍼옥시좀(peroxisome)은 세포내 미세기관으로 산화작용에 관여하고, 간과 신장에 풍부하게 존재하며 세포내의 지방산을 산화시켜 과산화수소를 만들어 독성물질의 중화에 이용한다. 또한, 산화효소인 카탈라제(catalase)를 이용해 생성된 과다한 과산화수소를 물과 산소로 분해하는 기능을 가지고 있다. 퍼옥시좀 증식제(Peroxisome proliferator)는 퍼옥시좀(peroxisome)의 수를 증가시킬 수 있는 화합물을 말하며, 지방과 지방산, 고지혈증 치료제인 피브레이트(fibrate), 프로스타글란딘(prostaglandin) 등이 이에 속한다.

이러한 퍼옥시좀 증식제를 리간드로 하는 핵내 전사인자 수용체를 총칭하여 PPAR이라 부르며, PPARα, PPARδ/β, PPARγ로 나누는데, α는 주로 간에서 발현되고 지방산의 산화나 독성물질의 중화에 관여하며 염증반응에 연관이 있고, δ/β는 고루 분포되어 있으며 태아의 발달에 관련이 있는 것으로 밝혀져 있고, γ는 지방세포의 분화와 축적에 관여하는 것으로 알려져 있다.

최근 지방세포주에서 지방세포로 분화하는 과정에서 PPARγ의 발현이 증가되 는 것이 발견되었고, 분화 능력이 없는 섬유아세포에 PPARγ을 발현시키면 지방세포로 분화하는 것으로 보고 되었다. 특히, PPARγ2는 두 개의 동형상체(isoform)로 나누어지는데, PPARγ2는 지방세포에서만 특이적으로 많이 발현되는 것으로 보고 되어 있다. 그리고, 쥐의 PPARγ1의 mRNA는 8 개의 엑손들로 암호화되어 있는 반면, PPARγ2의 mRNA는 7개의 엑손들로 암호화되어 있다. 쥐의 PPARγ1 mRNA는 5`측의 비 번역 지역(5`untranslated sequence)이 두 개의 엑손에 암호화되어 있는 반면에, PPARγ2의 5`측의 비 번역 지역과 아미노기 말단의 부가적인 30개의 아미노산은 하나의 엑손에 암호화되어 있다. 두 가지 동형상체는 호환적인 프로모터(promotor) 사용과 서로 다른 스플라이싱(splicing)에 의해 나타나는데, 이러한 PPAR의 동형상체는 리간드의 다양성을 증가시키고 조직특이성 발현을 가능하게 한다(Zhu Y, et al, 1995).

한편, 제2형 당뇨병은 골격근조직, 간 조직 그리고 지방조직 등의 인슐린 저항성으로 특징 지워지는데, 이의 치료제 중에 TZD(thiazolidinediones) 부류인 글리타존(glitazone) 등은 2형 당뇨병의 실험쥐 모델에서 인슐린 분비를 자극함이 없이 글루코스 양을 낮추고 인슐린 저항성을 개선하게 하는 약으로서 1980대 초기에 처음으로 보고 되기 시작하였다.

이러한 제2형 당뇨병 치료제로서 글리타존들은 특이적인 PPARγ의 활성 증강 물질임이 밝혀지면서(Lehmann JM, et al. 1995), PPARγ의 리간드(활성 증강 물질)들이 인슐린 저항성을 개선시킬 수 있을 것이라고 보고 있다.

이러한 사실은 PPARγ활성 증강 물질의 치료학적 효과를 증명할 뿐만 아니 라, 본 발명자가 확립시킨 ELISA법에 의한 당뇨효용물질 스크린 시스템의 효용성도 시사한다고 본다.

한편, 지방세포에서 PPARγ의 활성이 근육과 간에서의 글루코즈 대사 작용에 어떻게 영향을 미치는 가를 알아보기 위해, 당뇨병 개선제로서 PPARγ활성 증강 물질(agonist)들의 기전들을 살펴보면, 첫째는 지방세포에서 PPARγ단백질은 근육과 간에서 글루코즈 대사 작용에 영향을 미치는 사이토카인 (cytokine)인 TNF-α나 호르몬인 렙틴(leptin)과 같은 내분비 신호 분자들의 방출을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이 두 신호분자들은 지방세포에서 PPARγ활성 증강 물질에 의해서 발현이 저해되어지는데, TNF-α는 인슐린 저항성을 상승시키고, 렙틴은 어떤 세포에서 인슐린 신호전달을 방해함이 발견(Cohen B, et al. 1996: Muller G, et al. 1997)되므로 인슐린 저항성을 가중화시킬 수 있다고 본다. 따라서, 이러한 두 신호분자들이 야기하는 인슐린 저항성은 PPARγ활성 증강 물질에 의해서 개선될 수 있다.

둘째는 PPARγ에 대한 활성 증강 물질의 과혈당증 억제효과 (antihyperglycmic effect)이다. 일반적으로 글루코즈와 지방산은 근육에서 에너지 기질로서 서로 경쟁하여, 지방산의 양이 증가되면 글루코즈의 소비가 저해되기 때문에, 유리 지방산의 증가와 글루코즈 합성 혹은 당신생 (gluconeogenesis)의 증가는 서로 관련이 있는 것으로 보여진다. 이때, PPARγ활성 증강 물질은 지방세포가 지방산을 흡수하고 저장되게 자극하여, 순환하는 트리글라이세라이드 (triglyceride)와 유리 지방산 양을 감소시킨다. 또한, PPARγ활성 증강 물질은 근육이나 간에서 지방산의 량을 낮추면서 글루코즈 대사작용에 간접적으로 영향을 미 치는 것으로 알려져 있다(Martin G, et al. 1998). 따라서, PPARγ활성 증강 물질은 근육이나 간에서부터 백색지방세포로의 지방산 흐름을 자극하고 에너지 분할에서 극적인 효과를 발휘하여 간에서의 당신생 감소와 근육에서 글루코즈 소비의 증가를 야기한다.

마지막으로 PPARγ는 지방세포에서보다는 낮은 발현 양이지만, 근육과 간에서도 발현되어 직접적인 활성화를 통해 그들의 당뇨병 개선효과를 발휘할 수 있다. 즉, 지방조직이 부족하게 만든 실험쥐에 PPARγ의 활성 증강 물질로서 트로글리타존을 처리하면 고혈당(hyperglycemia)을 감소시키고, 인슐린에 대한 감수성을 향상시키는 것으로 보고되어 있다. 이 기전은 지방세포와는 독립적인 경로를 통해 발생되는 PPARγ활성 증강 물질의 역할로 볼 수 있다(Burant CF, et al. 1997).

그리고, PPARγ2 활성 증강 물질들의 생리학적 효과들은 근육과 간을 포함한 다양한 조직에서 직접 혹은 간접적인 효과를 나타낸다.

또한, PPARγ는 죽종증(atheromatous lesions)에서 거품세포(foam cells)를 포함한 대식세포 (macrophage)들에서도 높은 수준으로 발현되는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 거품세포는 동맥 내벽에 파묻힌(embedded) 대식세포(macrophage)들이 콜레스테롤을 가지고 있는(cholesterol-laden) 세포로 전환된 것을 말하는데, 이와같이, 대식세포가 거품세포로의 전환은 동맥 경화의 발생의 결정적인 징후로 보고 있다.

상기 세포의 전환 과정은 CD36(세포표면분자 36), 스캐빈져 수용체 (scavenger receptor-A)와 같은 스캐빈져 수용체들에 의한 oxLDL 입자(particle)들의 유입(internalization)과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 최근 PPARγ도 이의 과정과 관련이 깊은 것으로 보고 되고 있다(Tontonoz P, et al. 1998).

일례로, 골수종 단세포 THP-1 (Hunman acute monocytic leukemia cell line) 세포주에 PPARγ와 RXRα(Retinoid X Receptor alpha)의 활성 증강 물질들을 처리하면 PPARγ2와 CD36의 발현을 유도하고 oxLDL의 흡수가 촉진되며, PPARγ의 활성 증강 물질을 실험쥐의 대동맥에 처리하면 CD36의 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다. 특히, oxLDL의 두 종류의 구성물질인 9-HODE 와 13-HODE는 PPARγ의 활성 증강 물질임이 확인되었다. 따라서, PPARγ는 대식세포들이 oxLDL로부터 유도된 지질들을 축적하는데 기여하는 oxLDL-PPARγ-CD36의 중요한 구성물질이다. 이런 결과들은 PPARγ의 활성 증강 물질들이 거품세포(foam cell)형성을 촉진할 가능성도 보이지만, 임상학적 자료들에 의하면 글리타존은 2형 당뇨 환자들에게서 종속적으로 나타날 가능성이 많은 동맥경화로부터 보호함을 보여준다. 이는 LDL(Low Density Lipoprotein) 수용체(recepetor)가 파괴된 쥐(동맥경화의 모델)에 로지글리타존과 GW784를 처리하면 CD36 발현이 증가에도 불구하고 죽종증(atheromatous lesion)형성을 저해하는 것으로 알려져 있기 때문이다.

최근 연구는 대식세포들로부터의 콜레스테롤 유출은 에너지 의존적 수송 단백질(energy-dependent transporter protein)들의 ATP 결합 카셋트(ATP binding cassette; ABC)류의 한 멤버인 ABCA1(ATP binding cassette A1)에 의해서 조절되어지는데, 대식세포와 다른 세망 내피세포(reticuloendothelial cells)에서의 콜레스 테롤 축적에 의해서 발생되는 탄지에르 병(tangier disease)을 가진 환자에서 ABCA1가 변이 되어 있음이 밝혀졌다. ABCA1유전자의 전사는 핵내 옥시테롤 수용체(nuclear oxysterol receptor), LXR(Liver X Receptor)에 의해서 조절되어지는데, PPARγ와 LXR의 활성 증강 물질들은 ABCA1의 발현을 유도하고, 쥐의 배아 줄기세포(embryonic stem cells)로부터 유도된 THP-1 세포주와 대식세포들로부터 콜레스테롤 유출을 촉진시키는데 함께 작용한다(Chawla A, et al. 2001).

또한, ABCA1 유전자는 PPARγ/RXR 헤테로다이머(heterodimer)의 직접적인 목적 유전자로 알려져 있고, PPARγ활성이 증가되면 LXRα발현을 야기한다. 이것은 ABCA1 발현증가와 콜레스테롤 유출을 이끌어낸다. 더구나 PPARγ는 대식세포에서 콜레스테롤 에스테르(ester)들의 유입과 유출을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이러한 효과는 HDL콜레스테롤로서, 간으로 유입되는 유리 콜레스테롤의 유출 증가와 공역적으로 대식세포들로의 흡수에 의한 동맥손상(aortic lesions)을 야기하는 oxLDL가 제거될 것이다. 특히, PPARγ의 활성 증강 물질은 인간에서 HDL(High Density Lipoprotein) 콜레스테롤을 생성시키고 대식세포와 상피세포(endothelial cell)로부터 콜레스테롤 유출을 증강시킴에 의해서 in vivo에서 동맥 경화의 발달을 방해할 것으로 보인다.

또한, 단핵구(monocyte)/대식세포(macrophage)들의 염증반응 조절에서 PPARγ의 폭넓은 역할이 있다.

15d-PGJ2와 글리타존을 포함한 PPARγ의 활성 증강 물질들을 단핵구나 대식세포에 처리하면 TNF-α, IL-6와 같은 염증 유발성 사이토카인들의 발현을 감소시 키고, 대식세포 활성을 저해한다. 그러나, 이때 PPARγ의 활성 증강 물질 농도는 다른 세포실험(cell-based assays)에서 PPARγ를 활성화시키는데 요구되는 농도와는 서로 다른 농도로 염증반응 저해 효과를 유도한다. 게다가 어떤 PPARγ의 잠재 활성 증강물질은 효과가 없는 반면에 15d-PGJ2는 in vitro 에서 단핵구 혹은 대식세포들의 사이토카인 생산에 대한 가장 강력한 저해제이다. 이것은 PPARγ 활성 증강물질의 항염증 효과는 PPARγ-독립적 기전(PPAR -independent mechanism)을 통해 매개될 수 있다는 것을 시사한다. 최근 몇 가지 연구는 이 가설을 지지하는데, 글리타존은 LPS(lipopolysaccharide)를 처리한 실험쥐에서 사이토카인 생산을 저해했으며, 몇 가지 서로 다른 PPARγ활성 증강 물질 (15D-PGJ2와 rosiglitazone)은 대식세포와 마찬가지로 PPARγ+/+가 많거나 혹은 PPARγ-/-가 거의 없는 배아줄기세포 (embryonic stem cell)에서도 사이토카인의 생산을 저해하는 것이 관찰되었다.

한편, 15d-PGJ2는 최근 NF-kB 활성을 저해하는 것으로 밝혀졌는데(Rossi A, et al. 2000: Straus DS, et al. 2000), NF-kB는 그것의 DNA 결합부위(DNA-binding domain)와 그것의 조절부위(regulatory subunit)인 IkB 키나아제를 공유 결합적 변형을 통해 급성 염증(acute inflammatory)반응을 일으킨다. 따라서, PPARγ가 백혈구에 의해 발생하는 급성 염증에는 효과가 없을 가능성들을 시사한다.

또한, 고혈압은 종종 비만과 2형 당뇨병 등을 동반하는 대사 작용 장애(metabolic defects) 중의 하나이다. 이것의 병인론(pathogenesis)은 복합적이고 혈압의 비정상 조절(dysregulation), 인슐린 감수성(insulin sensitivity), 혈관 기능(vascular function), 그리고 지질 대사 작용(lipid metabolism)과 연관된 다.

최근 유전적 분석에서 PPARγ의 돌연변이(dominant negative mutation)가 인간의 심각한 고혈압과 연관되어 있다는 것을 보여준다. PPARγ활성 증강 물질을 고혈압 동물모델과 당뇨환자에 처리했을 때 낮은 혈압을 나타내었지만, PPARγ활성 증강 물질이 항고혈압효과의 기초가 되는 기전에 관여한다는 것은 아직 알려져 있지 않다. 그러나, 글리티존이 당뇨병이 없는 사람과 인슐린 저항성과 관련되어 있지 않은 고혈압 동물 모델 등에서 혈압을 감소시킨다는 것은 PPARγ활성 증강 물질의 항고혈압 효과는 인슐린 감수성 활성(insuline-sensitizing actions)과 독립적인 것으로 사료된다.

그리고, PPARγ는 혈관 내 상피세포에서 발현되어지기 때문에, PPARγ활성 증강 물질은 뉴트리우레틱 펩타이드 C형(type C nutriuretic peptide), 엔도텔린 (endothelin), 그리고 플라스미노젠 활성 억제제(plasminogen activator inhibitor-1)와 같이 혈관 톤(vascular tone)의 유지와 연관이 있는 혈관 인자 (vascular factor)들의 발현 조절에 의해서 고혈압을 개선할 것(Itoh H, et al. 1999)으로 사료된다.

또한, PPARγ활성 증강 물질의 증식억제와 분화(pro-differentiation) 효과는 이들 화합물이 미분화된 종양 세포(de-differentiated tumour cells)의 증식 저해제로 사용될 수 있는 가능성을 제시한다. 이 가설은 면역 결핍 누드마우스(BNX triple immuno-deficient nude mice)에, 유방암 세포(Elstner E, et al. 1998), 전립선암 세포(prostate tumor cell; Kubota T, et al. 1998) 그리고 결장암세포 (Sarraf P, et al. 1998)들을 이식한 후 TZDs를 처리한 결과, 이들 종양세포들의 증식이 저해된다는 실험이 지지해 주고 있다.

이들 효과들은 비 지방세포 계열의 세포(nonadipogenic lineages colonic cell) 조차도 PPAR-매개 활성(PPAR-mediated activation)의 결과에 의한 분화 프로그램을 사용할 뿐만 아니라, 암의 발전을 저해한다는 것을 보여준다. 대조적으로 APC(adenomatous polyposis coli) 종양 억제제(tumour suppressor)를 암호화하고 있는 유전자의 한 copy가 파괴된 형질 전환된 실험쥐에서 인슐린 활성을 증진시키는데 요구되는 양보다 상당히 높은 양을 처리하면 PPARγ활성 증강 물질은 결장 종양의 발달을 촉진시킨다(Lefebvre AM, et al. 1998). 그렇지만 Sarraf와 그의 연구팀에 의해 연구된 인간 결장암 세포주는 정상과 기능이 소실된(malfunctioning) APC를 둘 다 가지는데, 이것은 실험쥐 모델에서 결장 세포(colonic cell) 증식에 대해 요구되는 밝혀지지 않은 인자들이 관여할 것으로 사료된다.

게다가 최근 Pilot의 연구는 PPARγ활성 증강 물질을 고형 지방 육종(solid liposarcoma)을 가진 환자에게 투여했을 때 항 종양성 전 분화단계(antineoplastic pro-differentiation)가 야기됨을 밝혔다. 이것은 암세포의 증식 속도를 감소시키는 것으로 보아 이 질병의 진행을 느리게 할 것으로 예상되어진다. 어떤 인간 결장암에서는 PPARγ의 돌연변이로 PPARγ의 기능이 상실됨이 보였다(Sarraf P, et al. 1999). PPARγ활성 증강 물질은 휴지기(growth arrest)를 유도하고 세포배양에서 인간 결장암세포들의 서로 다른 인자(marker)들의 합성을 유도한다. 이러한 발견은 PPARγ가 세포들의 암화(cellular transformation)를 방어한다는 것을 시사한다.

또한, PPAR의 활성 증강 물질들은 혈관신생(angiogenesis), 고형 종양의 성장(solid-tumor growth)에 대한 필수적인 과정, 그리고 전이(metastasis)과정의 저해제로서의 가능성들을 밝혀지고 있다. 따라서, 이러한 증거들은 PPARγ의 활성화는 암의 성장과 발달을 저해하고 이들의 리간드 혹은 활성 증강 물질은 치료학적 적용에 대한 새로운 목표를 제공해 줄 것이다.

한편, 이러한 물질들을 검출하기 위해 면역측정법을 사용한다.

일반적으로 항원 항체의 반응을 이용한 면역측정법은 측정하고자 하는 물질을 항원으로 하여 이에대한 특정항체를 만들어서 항원에 결합할 수 있도록 하고 이 결합체를 인지하여 기기를 써서 측정할 수 있는 여러 가지 표지를 사용하여 항원 항체의 결합여부와 결합정도를 측정함으로써 측정하고자 하는 생체물질을 정성, 정량하는 방법으로 알려져 있다.

이제까지 쓰이고 있는 생체물질의 면역측정 방법으로는 사용되는 표지의 종류에 따라 구분할 수 있는데, 방사성 동위원소를 표지로 이용하는 방사성 면역측정법(RIA)과 비방사성 동위원소, 예를 들면 효소나 형광물질을 표지로 이용하는 효소면역측정법(ELISA)과 형광면역측정법(FEIA)이 포함되는 비방사성 면역측정법을 들 수 있다.

이중 널리 쓰이고 있는 면역 측정방법은 방사성 면역측정법인데 이 방법은 정확하고 예민도가 높으며 측정이 간편하고 쉬우며 속도도 빠르다. 또한 측정할 수 있는 감마측정기와 베타측정기 등 기기의 가격도 그리 비싸지 않다는 여러 가지 장점을 가지고 있다.

그러나, 방사성 동위원소를 이용한 면역측정법의 가장 큰 단점은 인체에 해로운 방사성 폐기물이 많이 나온다는 것이며 방사성 동위원소의 사용량과 종류가 규정에 의해 제한되어 있는 불편함이 있다.

이러한 문제를 해결하기 위해 효소면역측정법(ELISA)이 사용되는데, 효소면역측정법은 표지 형식에 의해 직접 표지와 간접 표지로 나누어 진다.

직접 면역측정법은 가교제에 의해 항체 또는 항체의 단편에 직접 표지를 하는 방식이고, 간접 표지는 항체에 부착소(hapten)을 결합시키고, 이것을 인식하는 표지 성분을 사용하여 측정하는 방식이다.

흔히, 직접 표지에 사용되는 가교제는 N,N'-오르토페닐렌디말레이미드, 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산·N-숙신이미드에스테르, 6-말레이미도헥산·N-숙신이미드에스테르, 4,4'-디티오피리딘 등이 공지되어 있으며, 간접표지에 사용되는 헵틴은 비오틴, 디니트로페니르 피리독살 또는 플루오레사민 등이 공지되어 있으며, 이중 비오틴은 아비딘이나 스트렙트아비딘를 인식리간드로 사용하는 것이 공지되어 있다.

표지에 사용되는 효소는 일반적으로 서양고추냉이퍼옥시다아제가 주로 사용되고 있는데, 이는 많은 기질과 반응할 수 있고, 과옥소산법에 의해 용이하게 항체에 결합시킬 수 있기 때문이다.

표지된 효소를 확인하기 위해, 서양고추냉이퍼옥시다아제는 기질용액으로서 과산화수소(H₂O₂)를 사용하고, 발색제로서 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤조티아졸린설폰 산] 암모늄염(ABTS), 5-아미노살리실산, 오르토페닐렌디아민, 4-아미노안티피린, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 등을 사용하고, 알카리포스파타아제의 경우에는 기질로서 오르토니트로페닐포스페이트, 파라니트로페닐인산 등을 사용하고, β-D-갈락토시다아제를 사용하는 경우에는 기질로서 플루오레세인-디-(β-D-갈락토피라노시드), 4-메틸운베리페닐-β-D-갈락토피라노시드 등을 사용하는 것이 알려져 있다.

한편, 효소면역측정법은 플레이트에 고정하는 물질이 항체일 경우에는 샌드위치 효소면역측정법이라고 구분하기도 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 PPARγ에 대한 단일클론항체와 이를 생산하는 융합 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PPARγ에 대한 단일클론 항체를 이용하여 염증, 암은 물론 대사성 질환과 관련된 조절인자를 탐색하는 방법 및 이에 사용되는 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 인간 및 마우스의 PPARγ단백질과 특이적인 면역반응성을 가지고, 면역 글로블린 아형이 G_2a인 단일클론항체를 생산하는Pγ48.34A 세포주(KCTC 10482BP)를 제공한다.

다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 상기 세포주에 의해 생산되는 단일클론항체를 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 PPARγ의 활성보조인자를 플레이트에 코팅을 하고, 상기 플레이트에 PPARγ단백질과 암, 염증 또는 대사성질환조절물질을 함유한 샘플을 가하고, 상기 단일클론항체를 가하여 상기 PPARγ단백질과 결합시키고, 상기 단일클론항체에 대한 면역반응성을 가지고, 효소로 표지된 항체를 가하여 결합시키고, 상기 표지 물질을 검출하여 PPARγ단백질의 농도를 측정함으로써, 상기 샘플 내에 암, 염증 및 대사성 질환 조절 물질의 유무를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암, 염증 및 대사성 질환 조절 물질을 검출하는 방법을 제공한다.

더 나아가, 본 발명은 플레이트에 코팅된 활성보조인자 단백질 및 이에 결합할 수 있는 PPARγ단백질과 PPARγ단백질에 대한 특이적인 면역반응성을 가진 단일클론항체 및 상기 단일클론항체와 면역반응성을 가진 효소로 표지된 항체를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는, 효소면역측정법에 의해 암, 염증 및 대사성 질환 조절 물질을 검출하는 키트를 제공한다.

이때, 상기 PPARγ단백질은 PPARγ1 또는 PPARγ2일 수 있으며, 상기 활성보조인자는 SRC-1(Steroid Receptor Co-activator)이 바람직 하다.

본 발명을 상세히 설명하자면 다음과 같다.

본 발명은 염증, 암은 물론 대사성 질환(비만, 당뇨)과 관련된 PPARγ에 대해 특이성을 갖는 단일클론 항체와 이를 생산하는 융합 세포주를 제공하고, 이런 PPAR 에 대한 단일클론 항체를 이용해 PPAR 의 활성을 조절할 수 있는 활성조절물질을 탐색할 수 있는 탐색법 및 이를 이용한 키트를 제공한다.

이에, 본 발명은 PPARγ에 특이적으로 인식하는 단일클론 항체와 이를 생산하는 융합 세포주를 제조하기 위해서, 인간 지방종(lipoma)으로부터 PPARγ2의 cDNA를 분리 증폭 정제하고, 이를 대장균 발현 벡터에 이용하여 클로닝 한 후, 융합단백질(이하 His-PPARγ2과 GST-PPARγ2)로 대장균에서 발현시켜 니켈 비드로 순수 분리 정제함으로써 항체에 대한 항원으로 제조한다.

그리고, 융합세포주의 개발에 필요한 면역화된 마우스는 His-PPARγ2 가용성 단백질과 동량의 프로인트 완전 보조항원(Freund's complete adjuvant)을 유상화 될 때 까지 잘 혼합하여 마우스의 복강 내에 1차 면역 주사를 하고, 2주 뒤 마우스의 면역성을 높이기 위해 추가로 부스터 주사(booster injection)하는데, 이 때는 완전 보조항원을 사용하지 않고 불완전 보조항원 (Freund's incomplete adjuvant)를 동량으로 혼합하여 복강 내에 2회에 걸쳐 추가로 주사하여 얻는다.

상기 면역된 마우스로부터 적취한 비장세포와 세포융합 모세포인 NS-1 골수종 세포(myeloma cell)를 10:1의 비율로 혼합하고 폴리에틸렌글리콜을 넣어 세포융합을 시킨 다음, 융합된 세포들을 선별하기 위하여 HAT 배지에서 배양하면서 융합세포군들의 성장이 지속적으로 확인되면 HT 배지로 바꾸어 세포를 증식하고, HAT 배지에서 성장하는 융합세포군 중 PPARγ재조합 단백질 항원에만 특이적으로 반응하는 것을 효소면역측정법(ELISA)으로 선별한다.

선별된 융합 세포주는 단일클론이 되도록 제한희석법(limiting dilution)으로 희석하여 하나의 세포로부터 증식한 세포들로 이루어진 세포주를 확립한다.

확립된 본 발명의 세포주를 Pγ48.34A라 명명하였으며, 이를 2003년 6월 3일 에 한국생명공학연구원에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 10482BP를 부여 받았다.

상기 세포주를 마우스의 복강 내에 주사한 후 복수액을 채취함으로써 본 발명의 대량으로 단일클론항체를 생산한다.

본 발명에서 확립된 세포주가 분비하는 PPARγ 단백질에 대한 단일클론항체의 아형은 면역글로블린 G_2a 타입(IgG_2a)이며, 웨스턴 블랏팅 방법과 면역침전법으로 확인된 바와 같이, 본 발명자들의 개발한 세포주는 인간 및 마우스의 PPARγ에 대해 높은 특이성을 나타낸다. 또한 이미 상업적으로 이용되고 있는 다른 PPARγ 의 단일클론 및 다클론 항체들의 웨스턴 블랏팅 방법을 통해 PPAR의 다른 아형인 PPARα,δ,β등과는 교차 반응성이 없는 것으로 확인되었다.

본 발명은 PPARγ와 이의 활성 증강 물질로 알려진 SRC-1 단백질과의 결합에 있어서, PPARγ단백질의 형태전환을 유도하고, 상기 SRC-1과의 결합력에 영향을 주는 아고니스트 또는 안타고니스트 리간드의 특성을 활용하여, 본 발명의 단일클론 항체, PPARγ의 재조합 단백질 및 SRC-1 재조합 단백질과 검색할 시료로 부터 각종 염증, 암은 물론 대사상질환의 관련조절인자를 검색하는 효소면역측정법(ELISA)을 구축하였다.

이에 본 발명자는 대장균에서 SRC-1 재조합 단백질을 분리 정제하여 마이크로타이터 플레이터에 접착시키고, 대장균에서 생산된 GST 및 His-융합형으로 발현되는 인간 PPARγ2 가용성 분획과 반응시켜 천연물질 및 여러 가지 화학 물질에 의한 PPARγ2의 단백질내의 형태전환으로 야기되는 결합 능의 차이를 검색하는데 이 미 상업적으로 이용되는 다른 PPARγ항체들보다 본 발명자들이 개발한 PPARγ단일클론 항체를 이용하여 보다 정확하고 신빙성 있는 PPARγ조절인자를 탐색함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명을 각각의 실시 예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 이들 실시 예는 본 발명을 위해 예시하는 것으로 이에 한정된 것은 아니다.

[실시예 1] PPARγ재조합 단백질을 생산하는 발현벡터 제조 및 재조합 단백질의 분리 및 정제

우선 PPARγ에 대한 항원으로 재조합 단백질을 획득하기 위하여 인간 PPARγ2 유전자를 이용하였는데 이는 인간에서 분리한 지방세포에서 mRNA를 분리한 다음 역전사와 PCR 방법을 이용해 증폭된 PPARγ2의 cDNA를 획득하였다. 이를 발현벡터 pET28a(Novagen)를 BamH Ⅰ과 Xho Ⅰ 제한효소로 절단하고 결합효소를 첨가하여 16℃에서 5시간 동안 봉합함으로 PPARγ2 유전자를 갖는 발현벡터를 제조하였다.

pET28a 발현벡터는 발현하고자 하는 단백질에 6개의 히스티딘(Histidine) 잔기를 붙여 발현시킬 수 있는 것으로서, BL21( DE3) 대장균에 형질전환 시킨 후 이를 100㎍/㎖의 가나마이신(kanamycin) 항생제를 포함한 LB 배지에서 37℃ 로 진탕배양한 후 600nm에서 흡광도가 0.4에서 0.6까지 이르렀을 때 100mM IPTG (Isopropylthio-β-D-galactoside)를 첨가하여 20℃에서 밤새 배양하여 유전자의 발현을 유도하였다. 세포 배양액은 4℃, 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포를 수확한 후, 세포 분해용액(20mM Tris, pH 7.4, 300mM NaCl, 10mM Imidazo, 5㎍/㎖ aprotinin, 100 μM PMSF)을 넣어 초음파 파쇄기로 완전히 파열시킨 후 다시 한번 원심분리(4℃, 12000rpm, 30분)하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 히스티인 잔기에 친화성이 있는 NTA agarose(Peptrone) bead에 His-PPARγ2를 결합시킨 후 비특이적인 결합을 줄이기 위하여 세척용액(20mM Tris, pH 7.4, 300mM NaCl, 20mM Imidazol)으로 3회 세척하였다. Bead에 결합된 재조합 단백질 회수는 용출 용액(20mM Tris, pH 7.4, 300mM NaCl, 200M Imidazol)으로 분리하여 12% SDS-PAGE 젤에서 전기 영동시켜 분리하여 분자량이 55kDa인 His-PPARγ2 재조합 단백질을 확인하였다. 이의 결과는 도 1에 나타내었다.

[실시예 2] GST-융합 PPARγ2와 His-SRC-1 재조합 단백질들의 분리 및 정제

상기와 같이 PPARγ2 유전자가 발현벡터 pGEX4T-1(Pharmacia)에 클로닝되어 GST-PPARγ2 단백질을 생산하는 대장균 DH5α(pGEX4T-1/PPARγ2;KCTC 10190BP)를 사용하였다.

재조합 단백질의 고 발현을 확인하고 효율적인 생산 조건을 확인하여 대장균주를 배양한 다음 배양된 세포를 초음파로 파쇄하고 원심 분리하여 얻은 세포 상등액의 가용성 분획을 직접 사용하였다. 한편, SRC-1은 이미 생산된 SRC-1 비융합형 재조합 단백질을 생산하는 대장균 BL21(pET28a/SRC-1; KCTC 10191BP)를 배양하여 세포를 수확한 후 초음파로 파쇄하고 원심 분리하여 얻은 세포 상등액을 NTA agarose(Peptron Inc., Daejeon, Korea) bead에 His-PPAR 2를 결합시킨 후 비특이적인 결합을 줄이기 위하여 세척용액(20mM Tris, pH 7.4, 300mM NaCl, 20mM Imidazol)으로 3회 세척하였다. 비드(bead)에 결합된 재조합 단백질 회수는 용출용액(20mM Tris, pH 7.4, 300mM NaCl, 200mM Imidazol)으로 분리하여 정제 하여 사용하였다. 이들 모두의 발현 조건 및 방법은 실시예 1의 방법과 동일하고, 이로써 PPARγ2-SRC-1 결합능 검색방법이 수립되었고, PPARγ2-SRC-1 결합구조에 바탕을 둔 PPARγ2-SRC-1 결합에 영향을 끼칠 수 있는 신물질을 디자인 및 개발을 위한 효율적인 스크리닝 시스템으로 이용할 수 있게 되었다.

[실시예 3] 마우스의 면역화

융합세포주의 제조에 필요한 면역화된 마우스를 획득하기 위하여, 실시예 1에서 얻은 His-PPARγ2를 인산완충용액에 12시간 투석하고, 브레드포드법(Bradford method)으로 단백질의 농도를 측정하여 25㎍/100㎕가 되게 하고, 같은 부피의 프로인트 완전 보조항원(Complete Freund's complete adjuvant)을 유상화될 때까지 잘 혼합한 후 생후 6주가 된 Balb/c 마우스의 복강 내에 주사하였다. 2주 후, 첫 면역 주사한 것과 같은 양의 His-PPARγ2 재조합 단백질을 동량의 불완전 보조항원(Freund's incomplete adjuvant)과 혼합하여 일주일에 한 번씩 2회 주사하였다. 마지막 주사 3 내지 4일 후 마우스의 꼬리에서 소량의 피를 뽑아서 효소면역측정법(ELISA)으로 항체의 역가를 확인하고, 세포 융합에 앞서 1회 더 주사하였다.

[실시예 4] 세포융합

실시예 3과 같은 방법으로 면역화된 마우스를 경추 탈골하여 비장(spleen)을 꺼내어 지방조직을 제거한 후 조직 파쇄기(homogenizer)로 곱게 갈아, RPMI-1640 배지로 원심 분리하여 비장세포를 획득하였다. 이 때 깨끗한 비장세포를 얻기 위 하여 적혈구 분해용액을 사용하였으며, RPMI-1640 배지로 2회 반복하여 충분히 세척하였다. 한편, 세포융합하기 2주 전부터 세포융합 모세포인 NS-1 골수종 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 모세포인 NS-1 세포도 역시 RPMI-1640 배지를 이용하여 2회 원심 분리하여 세척하였다. 각각의 비장세포와 모세포의 세포수를 측정하여 7~10의 비율로 혼합하여 섞은 다음 다시 원심 분리하여 침전시켰다. 원심 분리관 내의 침전물을 손가락으로 가볍게 두드려 분산시키고, 차갑지 않은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG) 1㎖을 1분간에 걸쳐 천천히 첨가하면서 가볍게 흔들어 주고 RPMI-1640 배지를 50㎖ 까지 충분히 채워 다시 원심분리하고 2회에 걸쳐 세척을 더 해 주었다. 최종 침전물에 10% 소태아 혈청을 포함한 분리용 배지(HAT 배지)를 25~40㎖ 정도로 넣어 재 현탁시키고, 96웰(well) 마이크로타이터 플레이트에 200㎕씩 분주한 후 37℃에서 이산화탄소 세포배양기에 배양하였다.

[실시 예 5] 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포주 선별

실시예 4에서 융합한 세포를 2주 정도 배양한 후, 생성된 융합세포군 중에서 PPARγ에 특이적인 항체를 분비하는 융합세포들을 선별하기 위해 GST-융합 PPARγ2 재조합 단백질을 분리 정제하여 이를 항원으로 이용하여 효소면역측정법(ELISA)으로 스크리닝을 하였다. GST-융합 PPARγ2 재조합 단백질을 사용한 것은 마우스를 면역화 시킬 때 His-융합 PPARγ2 재조합 단백질을 항원으로 사용하였으므로 His에 특이적인 항체를 분비하는 융합세포를 배제하기 위함이다. (GST-융합 PPARγ2 재조합 단백질의 제조는 His-융합 단백질과 유사한 방법으로 제작되었으며, 실시예 2에 서 설명한 바와 마찬가지로 발현벡터로는 pGEX4T-1(Amersham Pharmacia)을 사용하였다.) 마이크로타이터 플레이터에 GST-융합형 PPARγ2 재조합 단백질을 각 웰당 50㎕(8㎍/㎖)씩 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 3% 탈지분유(skimmed milk)로 차단하였다. 이 플레이트에 융합세포의 배양액을 각 웰 당 50㎕씩 가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 인산완충용액(0.05% Tween-20 포함)으로 3회 세척하고 항-생쥐 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase: HRP; Sigma)를 가하여 역시 실온에서 1시간 반응시키고 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 넣어 발색시켜 파장 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험의 결과로부터 PPARγ2 재조합 단백질에 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 융합세포들을 우선 선별한 후, 이들을 대상으로 상기 과정을 여러 번 반복하여 여러 가지 융합세포들 중 가장 높은 결합력을 갖고 특이적으로 반응하는 융합세포 집단을 재 선별한 다음, 단일클론이 되도록 제한희석법으로 희석하여 최종적으로 하나의 세포로부터 유래한 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포주를 확립하였다. 이 세포주는 KCTC에 기탁하여 KCTC 10482BP로 등록하였다. 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포주(KCTC 10482BP)를 배양하여 효소면역측정법(ELISA)으로 항체의 역가를 측정하였다. 이의 결과는 도 2(A)에 나타내었다.

그리고, 면역용 마우스 단일클론항체 아형 검색 키트(Immuno-Type^TM Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit, BD Bioscience)로 단일클론 항체의 면역 글로블린 아형을 결정하였다. 도 2(B)에서 보여준 바와 같이 PPAR 에 대한 단일클론 항체의 면역 글로블린 아형은 G_2a로 확인할 수 있었다.

[실시예 6] 단일클론 항체의 대량생산

실시예 5에서 확립한 융합세포주로부터 PPARγ에 대한 단일클론 항체를 대량 생산하기 위하여, 우선 실험용 생쥐(Balb/c)에 불완전 보조항원(Freund's incomplete adjuvant)을 100㎕ 복강 내에 주사하였다. 1주일이 지난 다음 융합세포를 5×10⁶개 주사하고, 복강이 부풀어 오를 때 복수액을 채취하였다. 이 복수액은 높은 농도로 자란 융합세포를 포함하고 있으므로, 채취된 복수액을 10,000rpm으로 원심 분리하여 융합세포를 침전시킨 후, 상층액 만을 취하였다. 이 상층액을 프로틴 A 아가로즈 친화성 칼럼(Protein A agarose affinity column, Bio Rad)을 이용하여 분리한 후 인산완충용액에 투석하여 섭씨 영하 70℃에서 보관하였다.

[실시예 7] 본 발명의 PPARγ 단일클론 항체의 재조합 단백질과 세포주 및 조직에서의 PPAR 항원-항체 반응 확인

실시예 6에서 얻은 PPARγ단일클론 항체를 이용하여 재조합 단백질과 세포주는 물론 조직에 존재하는 55kDa 정도의 PPARγ를 확인하기 위해 웨스턴 블랏팅 방법을 이용하였다. His-융합형 인간과 마우스 PPARγ2 재조합 단백질을 분리 정제하지 않고 세포용해액(lysate) 즉, 실시예 1에서 보여준 바와 같이 세포분해용액을 이용하여 세포를 분해 시킨 후 원심 분리하여 얻은 상등액을 적당히 희석하여 12% SDS-PAGE로 분리하고 단백질을 막 필터에 옮겼다. 막 필터에 옮긴 다른 단백질이 보이는 비 특이적인 반응을 줄이기 위해 5% 탈지분유 용액으로 2시간 동안 차단시 켰다. 이 후 막 필터를 본 발명자들이 개발한 PPARγ단일클론 항체를 가하고 상온에서 1시간 반응시킨 다음 인산 완충 용액(0.05% Tween-20 첨가)으로 세척하고 알칼린포스파타제 용액으로 발색반응을 확인할 수 있는 효소가 부착된 토끼 항-마우스 IgG-AP(,Sigma)를 가하여 실온에서 1시간 더 반응시켰다. 충분히 세척된 막 필터를 알칼린포스파타제 용액(Bioneer)을 이용하여 발색시켜 그 결과를 확인하였다. 도 3 (A)에서와 같이 His에 결합하지 않고 인간 PPARγ에 특이적인 반응을 보였고, 도 3 (B)에서 본 바와 같이 본 발명자이 개발한 항 PPARγ단일클론 항체는 탈지분유 뿐만 아니라 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)에도 반응하지 않는 것을 확인하였다(시판중인 다른 PPARγ단일클론 항체는 BSA에 반응하는 것들도 있음). 따라서, 이는 비 특이적인 반응이 없으며 PPARγ에 매우 특이적인 항체임을 확인할 수 있었다.

재조합 단백질에서 뿐만 아니라 지방세포주인 생쥐 3T3-L1 세포주에서

PPARγ의 발현을 또한 확인할 수 있었다. 이는 재조합 단백질에서 확인할 수 없었던(도 3-A 참조) 마우스 PPARγ의 발현을 확인하였다. 상기 제시한 바와 같이 웨스턴 블랏팅 방법을 이용하였는데 3T3-L1 세포주를 분화시킨 것(1㎍/㎖ Insulin과 100 mM Indomethacin으로 15일 동안 분화시킴)과 그렇지 않은 것을 사용하였다. 이는 분화된 지방세포주에서 PPARγ가 더 많이 발현됨을 확인하기 위함이다. 세포의 세포질 및 핵을 용출 용액으로 얻은 다음, 동량의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리한 후 상기 제시한 동일한 방법을 이행하고, 발색은 ECL 용액(Pharmacia-Amersham)을 이용하여 형광발색 시켰다. 도 4(A)에서 제시한 바와 같이 분화된 마우스 세포주에 서 PPARγ을 확인할 수 있었다. 도 4(B)에서는 면역 침전법 (Immunoprecipitation)을 이용하여 PPARγ단일클론 항체의 생쥐 3T3-L1 세포주 에서의 항원-항체 반응을 확인할 수 있었다. 용출 용액으로 얻은 분화시킨 것과 분화시키지 않은 세포의 세포질과 핵 내의 단백질에 실시예 6에서 얻은 PPARγ단일클론 항체 5㎍을 넣어 4℃에서 1시간 반응시킨 후에 단백질 A-아가로즈(Roche) 비드를 10㎕ 넣고 4℃에서 30분 더 반응시켰다. 비드에 결합한 항원 항체 복합체를 용출 용액으로 3회 세척한 후에 원심 분리로 복합체만 얻은 후에 5X 샘플 용액을 넣고 끓는 물에 5분 끓여 12% SDS-PAGE로 분리하고 막 필터에 옮겨 PPARγ단일클론 항체로 웨스턴 블랏팅으로 도 4(B)와 같은 결과를 얻었다. 이로서 본 발명자가 제조한 PPARγ단일클론 항체는 면역 침전법에도 이용할 수 있음을 알 수 있다. 기존에 시판되고 있는 PPARγ 항체들과 비교하여 본 발명의 PPARγ단일클론항체(Pγ48.34A) 특이성과 결합능의 차이를 보기 위해서 생쥐의 다양한 조직들을 순수하게 적출하여, 세포용해액(20mM Hepes, 300mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 0.1% NP 40 으로 이루어지고 전체 pH는 7.5)으로 세포를 용해한 다음, 12000rpm의 속도로 원심분리 한 후 세포용해 상등액을 수거한다. 이 세포용해액을 브래드포드법으로 단백질 정량을 한 다음, 12% SDS-PAGE에 각각의 세포용해액 100㎍씩을 웰에 탑재하여 전기영동을 실시한 다음, 본 발명의 Pγ48.34A 항체와 Calbiochem 회사 제품(cat. 516555)의 PPARγ다클론항체, 그리고 Santacruz 회사제품(sc-7273)의 PPARγ단일 클론 항체를 이용해 각각 웨스턴 블랏법을 실행하였다. 실험결과, 도 5와 같이 본 발명의 Pγ48.34A 단일 클론 항체를 이용 했을 때, 타사제품과 비교하여 비 특이적 결합이 더욱더 적었으며, 결합 능도 더욱 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 8] PPARγ2 단백질과 SRC-1 단백질들의 세포내에서의 기작과 그 기작을 이용한 효소면역측정(ELISA)법의 원리

PPARγ2는 지방세포내에서 특이적으로 발현되며 파트너인 RXRα와 결합하여 헤테로다이머를 이루고 특이적인 유전자결합부위인 PPRE(PPAR Response Elements)에 결합한다. 이러한 복합체는 전사조절인자(transcriptional factor)들과 복잡하게 결합하여 목적유전자의 전사를 촉진시키는 전사활성 조절자(transcriptional regulator)이다. 이러한 기작은 PPARγ와 특이적으로 결합하는 친지질 소분자 리간드(hydrophobic low molecules, angonist)의 존재 유무에 따라 그들의 전사활성이 결정되어지는데, 만약 현재 알려진 PPAR 의 리간드인 15d-PGJ2, 혹은 TZD 류의 물질들과 결합하면 PPARγ단백질 자체의 형태전환으로 인해 그들의 활성 보조 인자들인 SRC-1단백질과의 결합력이 강해진다. 이들 리간드들은 PPARγ의 세포내에서의 생명력(half life)을 증가시켜 줄뿐만 아니라 이러한 활성보조인자들과의 결합으로 인해 목적유전자의 전사를 더욱더 증가시킨다. 이러한 PPARγ와 SRC-1의 결합력을 향상시킬 수 있는 리간드들은 PPARγ의 아고니스트(agonist)라 칭하고, 이들은 현재 항암제, 항염증제 등으로의 가능성이 더욱 증가되고 있고, 특히 TZD류 들은 제2형 당뇨병의 치료제로서 판매되고 있다. 이러한 세포내 기작들을 이용해 엘라이자(ELISA) 플레이트에서 보다 편리하고 많은 샘플을 수용할 수 있는 PPARγ 아고니스트 검색법 혹은 PPARγ리간드 검색법을 개발하였다. 이 검색법은 도 6에 나타낸 것처럼 SRC-1 단백질들을 ELISA 플레이트에 코팅한 다음, GST-PPARγ를 함 유한 대장균 용해액을 샘플과 함께 처리한 후, PPARγ단일클론 항체인 Pγ48.34A를 이용해 SRC-1과 PPARγ의 결합력을 확인하는 방법이다. 만약 처리한 샘플들 중에서 PPAR 의 아고니스트가 될 수 있는 물질이 있다면 이들의 결합력은 더욱 더 증가될 것이고, 결합력은 엘라이자 리더(ELISA reader)에 의해 대조군 보다 높은 수치로 나타날 것이다. 반면에 이들 결합을 억제하는 안타고니스트(antagonist)일 경우 이들 결합력은 엘라이자 리더에 의해 대조군 보다 낮은 수치로 나타날 것이다.

[실시예 9] 효소면역측정(ELISA)법에서 PPARγ2 농도 및 리간드 농도가 SRC-1과 PPARγ2 단백질간의 결합에 미치는 영향

PPARγ2 단백질 농도가 SRC-1과 PPARγ2 단백질간의 결합에 미치는 영향을 알아보기 위해 도 7(A)와 같이 0.8 ㎍/㎖의 SRC-1를 플레이트(plate)에 코팅시킨 후 GST-PPARγ2를 가진 대장균 용해액를 512배, 256배, 128배, 64배, 32배 16배, 8배, 그리고 4배를 희석시켜 첨가하여 실험하였다. 또한, 상기와 동일한 실험방법에 의해 3번 이상 실험하였으며, SRC-1과 결합하지 않는 GST-융합 단백질를 대조군으로 사용하였다. 도 7의 (A)와 같이, ELISA법에서 SRC-1과 PPARγ2 단백질간의 결합이 PPARγ2의 농도에 의존적임을 알 수 있었다. 또한, PPARγ2 리간드 농도가 SRC-1과 PPARγ2 단백질간의 결합에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 0.8 ㎍/㎖의 SRC-1을 플레이트에 코팅시킨 후 GST-PPARγ2를 가진 대장균 용해액을 64배 희석시켜 첨가한 다음, PPARγ2의 리간드인 인도메타신(indomethacin)을 서로 다른 농도로 첨가하여 반응시켰다.

그 결과, 도 7(B)와 같이 PPARγ2의 리간드인 인도메타신(indomethacin)의 농도에 의존적이었다. 역시 이 실험도 3번 이상의 결과들로 나타내었다.

[실시예 10] GST-PPARγ2 단백질 및 His-SRC-1 단백질의 가용성 분획간의 in vitro 결합 능을 PPAR 단일클론 항체를 이용해 PPAR 의 리간드를 탐색할 수 있는 시스템의 수립

SRC-1 단백질과 가용성 분획 내에 존재하는 PPARγ와의 결합 능을 ELISA법으로 검색하기 위해서, 대장균에서 분리한 니켈 비드로부터 용출시킨 His-SRC-1 단백질과 대장균에서 이미 생산 정제한 융합형 단백질을 각각 항원으로 사용하였다. His-SRC-1 단백질은 대략 800 ng/well의 농도에서 0.1 M 소디움 카보네이트 완충액(pH 9.6)으로 희석하였으며, 각 농도의 단백질용액은 ELISA용 플레이트에 100 ㎕/well씩 넣어서, 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 코팅된 플레이트는 PBS로 3회 세척 후 3% 탈지유-PBST 용액으로 4℃에서 하룻밤 혹은 상온에서 2시간 처리하였다. 여기에 GST-융합형 PPARγ2의 가용성 분획 32배 희석액을 50 ㎕/well을 첨가하고, PPARγ2의 활성 증강 물질(indomethacin; Indo)을 각각 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍씩 되도록 첨가한 후, 실온에서 1시간 천천히 흔들면서 결합 반응시킨 후 인산 완충 용액(0.05% Tween-20 첨가)으로 5회 세척하였다. His-SRC-1 단백질과 GST-융합형 PPARγ2 단백질의 결합을 확인하기 위해 1차 항체는 본 연구팀에서 개발한 PPARγ 단일클론 항체(P 48.34A)를 1:2000으로 PBST로 희석하여 사용하였으며, 2차 항체로는 항 생쥐 IgG-HRP 항체를 1:2000으로 PBST로 희석하여 사용하였다. 대조군으로서 PPARγ2의 활성 증강 물질을 녹였던 메탄올, DMSO (dimethylpolysiloxane, 제조사)를 PPARγ2의 리간드 대신 첨가한 후 같은 방법으로 실험한 결과, 대조군들에서 는 OD₄₉₀ 값의 큰 변화가 나타나지 않았다. 이러한 결과들은 도 8에 나타내었으며, 플레이트에 코팅된 SRC-1 단백질과 PPARγ2의 특이적인 결합은 PPAR 2의 리간드에 대한 특이적인 형태전환에 의해서 증강됨을 알 수 있었고, 이러한 원리를 이용함으로써 PPARγ2의 특이적인 조절물질들을 보다 쉽게 스크리닝 할 수 있는 ELISA 시스템을 수립하였다.

[실시예 11] ELISA 검색방법의 실용성 및 가치성

본 발명에 따른 검색방법은 종래의 검색방법과는 달리, 방사선 동위원소를 사용하지 않고, 보다 많은 샘플을 동시에 사용할 수 있으며, 보다 신속한 결과를 볼 수 있는 스크린 시스템에 관한 내용을 중심으로 한다. 이것은 방사선 동위원소 대신 항체를 사용하였고, 96개의 웰(well)을 사용함으로써 많은 종류의 샘플을 사용함이 가능해 졌으며, 효소에 의한 발색법 으로 수치화할 수 있기 때문에 이전의 실험방법보다 신속하게 결과들을 볼 수 있을 것이다.

이러한 편리함과 신속함은 다양한 기능성 식품에서의 탐색, 식물 추출물에서의 리간드 탐색 등에 대단한 효과가 기대된다. 본 검색 방법은 암 억제 및 염증 억제 그리고 비만 및 당뇨에 깊은 관련이 있는 PPARγ의 리간드의 탐색법이기 때문에 PPARγ의 전사활성 능력이 지질대사를 포함한 염증, 암과 관련이 깊기 때문에, 이들 질환에 효과가 기대되는 많은 물질들을 일차적으로 탐색할 수 있는 편리하고 신속한 검색법이다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 항염증, 항암 등에 영향을 끼치는 것으로 알려진 핵 내 전사 수용체(nuclear receptor)인 PPARγ와 전사보조인자인 SRC-1과의 결합력을 바탕으로 한 간단하고, 많은 샘플을 동시에 적용할 수 있으며, 방사선 동위원소를 사용하지 않는 암, 염증, 비만, 그리고 당뇨 조절물질의 일차적 탐색 방법이기 때문에, 향후, 암, 염증 및 대사성 질환의 개선제 및 치료제 개발에 보다 높은 경쟁력을 가질 수 있는 효과가 있다.

Claims

인간 및 마우스의 PPARγ단백질과 특이적인 면역반응성을 가지고, 면역 글로블린 아형이 G_2a인 단일클론항체를 생산하는 Pγ48.34A 세포주(KCTC 10482BP).
제 1항에 있어서, 상기 PPARγ단백질은 PPARγ1 또는 PPARγ2임을 특징으로 하는 단일클론항체를 생산하는 Pγ48.34A 세포주.
제 1항의 세포주에 의해 생산되는 단일클론항체.
(a) PPARγ의 활성보조인자를 플레이트에 코팅을 하고;

(b) 상기 플레이트에 PPARγ단백질과 암, 염증 또는 대사성질환조절물질을 함유한 샘플을 가하고;

(c) 제 3항에 기재된 단일클론항체를 가하여 상기 PPARγ단백질과 결합시키고;

(d) 상기 단일클론항체에 대한 면역반응성을 가지고, 효소로 표지된 항체를 가하여 결합시키고;

(e) 상기 표지 물질을 검출하여 PPARγ단백질의 농도를 측정함으로써

상기 샘플 내에 암, 염증 및 대사성 질환 조절 물질의 유무를 결정하는 단 계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암, 염증 및 대사성 질환 조절 물질을 검출하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 활성보조인자 단백질은 SRC-1인 것을 특징으로 하는 암, 염증 및 대사성 질환 조절 물질을 검출하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 샘플은 식물 추출물, 기능성 식품, 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 암, 염증 및 대사성 질환 조절 물질을 검출하는 방법.
플레이트에 코팅된 활성보조인자 단백질 및 이에 결합할 수 있는 PPARγ단백질과 PPARγ단백질에 대한 특이적인 면역반응성을 가진 제 3 항 기재의 단일클론항체 및 상기 단일클론항체와 면역반응성을 가진 효소로 표지된 항체를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는, 효소면역측정법에 의해 암, 염증 및 대사성 질환 조절 물질을 검출하는 키트.
제 7항에 있어서, 상기 활성보조인자 단백질은 SRC-1임을 특징으로 하는 암, 염증 및 대사성 질환 조절 물질을 검출하기 위한 키트.