JPH06233694A - RAR−γまたはRAR−γの特定のイソ型に特異的な抗体 - Google Patents

RAR−γまたはRAR−γの特定のイソ型に特異的な抗体

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JPH06233694A
JPH06233694A JP4295366A JP29536692A JPH06233694A JP H06233694 A JPH06233694 A JP H06233694A JP 4295366 A JP4295366 A JP 4295366A JP 29536692 A JP29536692 A JP 29536692A JP H06233694 A JPH06233694 A JP H06233694A
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rar
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セシル・ロシェット−エギーユ
Yves Lutz
イヴ・ルッツ
Michael Saunders
マイケル・ソーンダース
Isabelle Scheuer
イザベル・シュール
Marie-Pierre Gaub
マリー−ピエール・ゴーブ
Pierre Chambon
ピエール・シャンボン
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RUI PASUTOUULE SUTORASUBUULE AN, University of
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Louis Pasteur Strasbourg I
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Bristol Myers Squibb Co
ER Squibb and Sons LLC
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RUI PASUTOUULE SUTORASUBU, University of
RUI PASUTOUULE SUTORASUBUULE AN, University of
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Louis Pasteur Strasbourg I
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 レチノイン酸レセプター-γ(RAR-γ)の特
定のイソ型を結合するポリクローナル抗体及びモノクロ
ーナル抗体、並びにその製造法を提供する。またヒトR
AR-γを結合するがマウスRAR-γを結合しないモノ
クローナル抗体、あるいはRAR-γ1を結合するがR
AR-γ2を結合しないモノクローナル抗体を提供す
る。さらに、上記抗体を用いるRAR-γの特定のイソ
型の検出法をも提供する。 【効果】 上記の抗体及び検出法は、種々のRAR-γ
の発現の組織特異的様式を決定する際に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、マウスまたはヒトのレ
チノイン酸レセプター-ガンマ(RAR-γ)のどちらかに
選択的に結合する抗体の産出、上記抗体を産生するハイ
ブリドーマ、上記抗体を産生するハイブリドーマの作成
法、上記抗体を生産するべく動物を免疫化する際に使用
するポリペプチドに関する。
【0002】
【従来の技術と課題】
A.レチノイン酸レセプター-γ レチノイン酸(RA)はビタミンA代謝産物であり、天然
のモルフォゲンであることがわかっている(Madenら,Nat
ure 295:672-675(1982);Tickleら,Nature 296:564-566
(1982);Slack,J.M.W.,Nature 327:553-554(1987a);Sl
ack,J.M.W.,Trends Biochem.Sci.12:200-204(1987b);T
hallerら,Nature 327:625-628(1987))。モルフォゲンと
して、RAは脊椎動物の発生とホメオスタシスに重要な
役割を果している(Maden,M.,Trends Genet.1:103-104(1
985);Brockes,J.P.,Neuron 2:1285-1294(1989);Brock
es,J.P.,Nature 345:766-768(1990);Eichele,G.,Trend
sGenet.5:246-251(1989);Summerbellら,Trends Neuros
ci.13:142-147(1990)などの総説及びそれらに引用され
た文献を参照のこと)。RAは種々の培養細胞に対して
広範囲に及ぶ効果を発揮し、また生物の胚及び初期発生
中にも広範囲に及ぶ効果を発揮する。発生の過程でRA
は特定の遺伝子の発現様式に変化をもたらし(Wangら,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 80:5880-5884(1983);LaRosaら,
Proc.Natl.AcadSci.USA 85:329-333(1988);Murphyら,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5587-5591(1988);Vasios
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9099-9103(1989);Okam
otoら,Cell 60:461-472(1990);Simeoneら,Nature 346:
763-766(1990))、この事実はRAが遺伝子発現に直接的
に影響を及ぼし得ることを示している(Zelentら,EMBO
J.10:71-81(1991))。
【0003】最近、3種類の高度に関連する核レチノイ
ン酸レセプター(RAR-α、-β及び-γ)がヒト及びマ
ウスの両方で同定された(Giguereら,Nature 330:624-62
9(1987);Petkovichら,Nature 330:444-450(1987);Ben
brookら,Nature 333:669-672(1988);Brandら,Nature 3
32:850-853(1988);Krustら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA8
6:5310-5314(1989);Zelentら,Nature 339:714-717(198
9))。これらのレセプターは、リガンド誘導性転写エン
ハンサー因子として作用するステロイド/甲状腺ホルモ
ン核レセプターのスーパーファミリーに属することが示
されている(Evans,R.M.,Science 240:889-895(1988);G
reenら,Trends Genet.4:309-314(1988);Beato,M.,Cell
56:335-344(1989)などの総説を参照のこと)。
【0004】上記核レセプター・スーパーファミリーの
他の構成要素と同様に、RAR類もA〜Fと命名された
6領域からなるモジュール構造を有している(Krustら,E
MBOJ.,5:891-897(1986);Greenら,Trends Genet.,4:309
-314(1988))。このステロイドレセプター・ファミリー
に関して、領域C及びEがそれぞれDNA結合及びリガ
ンド結合の原因であること(Evans,R.M.,Science 240:88
9-895(1988);Greenら,T.I.G.4:309-314(1988))、また
A/B領域及びE領域が細胞型特異的かつプロモーター
特異的な別個のトランス活性化ドメイン(trans-activat
ion domain)を含有すること(Toraら,Nature 333:185-18
8(1988a);Toroら,EMBO J.,7:3371-3778(1988b);Tasse
tら,Cell 62:1177-1187(1990))が示されている。領域D
及びFの正確な役割はまだわかっていない。
【0005】最近、複数のヒト及びマウスRAR-γ c
DNAイソ型が特徴づけられた(Krustら,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 86:5310-5314(1989);Giguereら,Mol.Cell.B
iol.10:2335-2340(1990);Kastnerら,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 87:2700-2704(1990))。アンカードPCR(ancho
red PCR)(Lohら,Science 243:217-220(1989))及びcD
NAライブラリースクリーニング法を用いて、合計6種
類の新規mRAR-γcDNAイソ型(mRAR-γ2〜
γ7)が単離されている(Kastnerら,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87:2700-2704(1990))。
【0006】最初に特徴づけられたマウス及びヒトRA
R-γ1イソ型(以前はRAR-γ0と呼ばれていた;Gig
uereら,Nature 330:624-629(1987);Krustら,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86:5310-5314(1989);Zelentら,Nature
339:714-717(1989))を加えて合計7種類のRAR-γイ
ソ型は、共通するB〜F領域を持っている。しかし、こ
れらのイソ型の配列はA/B領域結合部の上流で異なっ
ている(Kastnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2700-27
04(1990)。
【0007】ヒト及びマウスRAR-α、β及びγは、
DNA結合ドメイン(領域C)及びレチノイン酸結合ドメ
イン(領域E)に対応する2つの領域において多数のアミ
ノ酸が一致する。しかしどの種においても、これらのレ
セプターはそのアミノ末端領域(領域A/B)及びカルボ
キシル末端領域(領域F)が著しく異なっている(Krust
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5310-5314(1989);Zele
ntら,Nature 339:714-717(1981))。これらの観測結果
は、これら3種のRARが機能的に異なり得、したがっ
て異なるRA応答性遺伝子群の発現を調節し得ることを
示唆している。
【0008】この考察は、各マウスRAR(mRAR)サ
ブタイプが成体組織中あるいは発育しつつある胚中で特
定の発現様式を示すことを明らかにした原位置ハイブリ
ッド形成(Dolleら,Nature 342:702-705(1989);Dolle
ら,Develop.110:1133-1151(1990);Ruberteら,Develop.
108:213-222(1990);Ruberteら,Develop.111:45-60(199
1))及びノーザンブロッティング(Krustら,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 86:5310-5314(1989);Zelentら,Nature 33
9:714-717(1989))によるRAR転写物の分布の分析によ
ってさらに支持される。具体的には、原位置ハイブリッ
ド形成によって決定された胚発生中のRAR-γ転写物
の局在性は、軟骨及び角質化偏平上皮の分化及び初期形
態形成中にRAR-γが重要な役割を果すことを示唆し
ている(Dolleら,Nature 342:702-705(1989);Dolleら,D
evelop.110:1133-1151(1990);Ruberteら,Develop.108:
213-222(1990);Ruberteら,Develop.111:45-60(199
1))。
【0009】マウス中に認められるRAR-γのうち最
も豊富に存在する2つのイソ型mRAR-γ1とmRA
R-γ2の間では、5'非翻訳領域(5'-UTR)とA領域
の配列が異なっている。ノーザンブロット分析によって
決定したところ、これらのイソ型が成体組織中及び胚発
生の過程で弁別的に発現することがわかった(Leroyら,E
MBO J.10:59-69(1991);Kastnerら,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87:2700-2704(1990))。
【0010】最近、RAR-αまたはRAR-βのどちら
かに特有の合成ペプチドに対するポリクローナル兎抗体
が作成された(Gaubら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3089
-3093(1989))。これらの抗体は、RA応答性前骨髄球性
白血病細胞系におけるRAR-αまたはβの発現の検出
及び位置測定に用いられた。
【0011】現在までのところ、組織中のRAR-γタ
ンパク質の位置を特定することはできていない。脊椎動
物の発生とホメオスタシスにおけるRAの役割を理解す
るためには、刺激に応答して特定のRAレセプターを発
現させる細胞型を特異的に同定する必要がある。
【0012】本発明は、RAR-γまたはRAR-γの特
定のイソ型を認識することができる抗体を提供する。こ
のような抗体は発生の過程と機序を理解するうえで重要
な用途を有するであろう。
【0013】B.皮膚組織におけるRAR発現 皮膚はRAにとって、正常な状態でも病的な状態でも主
要な標的器官であることがわかっている(Fuch E.Trends
Genet.4:277-281(1988);Dhouailly,D.ら,J.Embryol.E
xp.Morph.58:63-78(1980))。さらに、レチノイン酸がイ
ンビボ及びインビトロで上皮細胞の分化と維持に対する
効果を有することも立証されている(Lotan,R.,Biochem.
Biophys.Act.,605:33-91(1980);Robertsら,The Retino
ids,第2巻,209-286頁,Academic Press Orlando(198
4))。
【0014】レチノイドは放射状老人肌(actinally age
d skin)(Ellisら,Pharmacol.Skin.3:249-253(1989))、
様々な型の皮膚病(Gollnick,Dermatologica 175(1):182
-195(1987))、角質化の障害(Happleら,Dermatologica 1
75(1):107-124(1987))、リウマトイド関節炎(Brinckerh
offら,1985 Retinoids,Differentiation and Disease,P
itman,London(Ciba Foundation Symposium 113),191-21
1頁)、基底細胞癌腫(Peck,Dermatologica 175(1):138-1
44(1987))、及び全身性硬化症(Mauriceら,Pharmacol.Sk
in.3:235-239(1989))の治療に使用されてきた。さらに
レチノイドが免疫刺激活性を有すること(Dennert,1985
Retinoids,Differentiation and Disease,Pitman,Londo
n(Ciba Foundation Symposium 113),117-131頁)、表皮
末端分化を阻害すること(Lichtiら,1985 Retinoids,Dif
ferentiation and Disease,Pitman,London(Ciba Founda
tion Symposium 113),77-89頁)、膀胱における発癌を調
節すること(Hickら,1985 Retinoids,Differentiation a
nd Disease,Pitman,London(Ciba Foundation Symposium
113),168-190頁)、胚性癌腫細胞の分化を調節すること
(Shermanら,1985 Retinoids,Differentiation and Dise
ase,Pitman,London(Ciba Foundation Symposium 113),4
2-60頁)、気管上皮細胞の分化を調節すること(Jetten
ら,1985 Retinoids,Differentiation and Disease,Pitm
an,London(Ciba Foundation Symposium 113),61-76
頁)、新生物形質転換を阻害すること(Bertramら,1985 R
etinoids,Differentiation and Disease,Pitman,London
(Ciba Foundation Symposium 113),29-41頁)、抗炎症活
性を有すること(Neyら,Dermatologica 175(1):93-99(19
87))、及び黒色腫の成長を調節すること(Amosら,Pharma
col.Skin.3:29-36(1989))が明らかにされている。
【0015】レチノイドが刺激することのできる様々な
効果に関する分子的根拠が何であるかはまだわかってい
ない。1つの可能性は、レチノイドによって刺激される
様々な効果が、種々のRARレセプターまたは種々の組
織上のRARレセプターとレチノイドとの相互作用によ
って引き起こされるということである。本発明の抗体を
用いることによって、レチノイドと各クラスのレセプタ
ーとの相互作用を調べることが可能になった。このよう
な研究により、レチノイドによって刺激される生物学的
効果がより良く理解されるようになるであろう。例え
ば、レチノイドはいくつかの皮膚障害の効果的治療とし
て用いられており(Peck GL,The Retinoids,Robertsら,A
cademic Press,Orlando,391-411頁(1984);Kopenら,J.C
ell.Biol.,105:427-440(1987);Brownら,Differentiati
on 28:268-278(1985))、またRAR-γは現在までにそ
の発現が皮膚組織に限定されると同定された唯一のレチ
ノイン酸レセプターであるから(Zelentら,Nature 339:7
14-717(1989))、種々のRAレセプターの組織特異的な
発現様式を理解することにより、乾癬、皮膚癌、骨髄腫
及び他の着色皮膚病変などの皮膚障害のさらなる治療法
の基礎が提供されるであろう。
【0016】
【発明の構成】本発明は、1)マウスまたはヒトRAR-
γのどちらかに選択的に結合するが両方には結合しない
モノクローナルまたはポリクローナル抗体、2)RAR-
γ1に選択的に結合するがRAR-γ2には結合しない
モノクローナルまたはポリクローナル抗体、3)ヒト及
びマウスRAR-γの両方のF領域に選択的に結合する
モノクローナルまたはポリクローナル抗体、並びに4)
ヒト及びマウスRAR-γの両方のD2領域に選択的に
結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の作
成に基づく。
【0017】さらに本発明は、上記抗体すべての診断的
及び治療的使用法を提供する。
【0018】さらに本発明は、上記モノクローナル抗体
及びポリクローナル抗体の入手法を提供する。
【0019】さらに本発明は、Ab1γ1(A1)、Ab
2γ(mF)、Ab5γ(D2)及びAb4γ(hF)と命名
されたモノクローナル抗体を包含する。
【0020】また本発明は、上記モノクローナル抗体を
生産することができるハイブリドーマ細胞、検出できる
ようにラベルされた形態の上記抗体、固体支持体に固定
化された上記抗体をも提供する。
【0021】また本発明は、マウスまたはヒトRAR-
γのどちらかに選択的に結合することができるが両方に
は結合することができないポリクローナル抗体の製造法
であって、次の操作からなる方法を提供する: (a)動物をヒトRAR-γのF領域から選択されるポリ
ペプチドで免疫化し、(b)その動物から抗血清を単離す
る。
【0022】また本発明は、マウスまたはヒトRAR-
γのどちらかに選択的に結合することができるが両方に
は結合することができない抗体を生産するハイブリドー
マ細胞の作成法であって、次の操作からなる方法を提供
する: (a)動物をヒトRAR-γのF領域から選択されるポリ
ペプチドで免疫化し、(b)免疫化した上記の動物から単
離される脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合し、(c)融合した
脾臓細胞及び骨髄腫細胞に抗体産生ハイブリドーマ細胞
を形成させ、(d)ヒトRAR-γに選択的に結合するが
マウスRAR-γには結合しない抗体を生産するハイブ
リドーマ細胞について、上記ハイブリドーマ細胞をスク
リーニングする。
【0023】
【図面の説明】図1-Aウエスタンブロッティングによるモノクロー
ナル抗体及びポリクローナル抗体の特徴づけ 対照非トランスフェクトCOS-1細胞(レーン1、4、
7、10及び13)あるいはmRAR-γ1(レーン2、
3、5、6、8、9、14、15、16、18、20及
び22)、hRAR-γ1(レーン11及び12)またはm
RAR-γ2(レーン17、19、21及び23)発現ベ
クターでトランスフェクトしたCOS-1から細胞抽出
物を得た。これらの抽出物をSDS-PAGEによって
分画し、NCフィルター上に電気転写し、次いで、《材
料及び方法》の項に記述するように予め抗体枯渇処理を
行うか(レーン3、6、9、12及び15)あるいはこの
抗体枯渇処理を行わずに(レーン1、2、4、5、7、
8、10、11、13、14、16〜23)、モノクロ
ーナル抗体Ab1γ1(A1)(レーン1〜3、16及び
17)、Ab5γ(D2)(レーン4〜6、18及び1
9)、Ab2γ(mF)(レーン1〜9、20及び21)、
Ab4γ(hF)(レーン10〜12)または兎ポリクロー
ナル抗体RPγ(mF)(レーン13〜15、22及び2
3)で免疫プローブした。予め染色されている分子量標
準(Bethesda Research Laboratories社)の位置をキロダ
ルトンの単位で示す。
【0024】図1-B免疫沈降によるモノクローナル
抗体及びポリクローナル抗体の特徴づけ pSG5(レーン2〜7)、mRAR-γ1(レーン9〜1
4)またはmRAR-γ2(レーン17〜19)でトランフ
ェクトしたCOS-1細胞から得た抽出物を次の抗体を
用いて《材料及び方法》の項に記述するように免疫沈降
させた:RPγ(mF)(レーン4及び9)、Ab1γ1
(A1)(レーン5、10及び17)、Ab5γ(D2)(レ
ーン6、11及び18)、Ab2γ(mF)(レーン7、1
2及び19)、非反応性兎血清(Non Reactive Rabbit Se
rum:NRS)(レーン2及び13)、非反応性腹水(Non R
eactive Ascite:NRA)(レーン3及び14)。プロテ
インAセファロースビーズに結合した抗原-抗体錯体を
溶離させ、SDS-PAGEで分画し、NCフィルター
に電気転写した。そのフィルターをRPγ(mF)及び[
125I]-プロテインAと共にインキュベートすることに
より、免疫沈降した物質を免疫プローブした。陽性対照
として、mRAR-γ1(COS-γ1、レーン1、8、
15及び21)またはmRAR-γ2(COS-γ2、レー
ン16及び20)でトランスフェクトしたCOS-1細胞
の抽出物(10μgタンパク質)を前以て免疫沈降させる
ことなくゲルに添加し、次いで免疫プローブした。
【0025】図1-Cゲル遅延/シフト検定法を用い
た、インビトロで形成したRAR-β2プロモーターの
RAREとのDNA-タンパク質錯体に対する効果に基
づくモノクローナル抗体の特徴づけ mRAR-γ1(レーン1〜7)、mRAR-α1(レーン
8〜13)またはmRAR-β2(レーン14〜17)発現
ベクターでトランスフェクトしたCOS-1細胞から得
た抽出物5μgを用いて、ゲル遅延反応を行った。矢印
1はRARE-βプローブとの特異的錯体を示す。矢印
2は次のモノクローナル抗体の存在下で形成した移動し
た(シフトした)錯体を示す:Ab1γ1(A1)(レーン
3)、Ab2γ(mF)(レーン4、10及び16)、Ab
5γ(D2)(レーン5)、Ab9α(hF)(レーン6及び
11)、Ab7β2(A1)(レーン7、12及び17)、
非反応性腹水(NRA)(レーン13)。モノクローナル抗
体Ab9α(hF)及びAb7β2(A1)はそれぞれ、R
AR-α1のF領域のアミノ酸区分及びRAR-β2のA
1領域のアミノ酸区分に対応する合成ペプチドに対して
生じたものである。
【0026】図2F9細胞及びマウス胚中のRAR-
γイソ型の特徴づけ 図2-A免疫ブロッティング F9細胞(レーン1〜15)及びマウス胚(レーン16〜
22)の核抽出物(70μgタンパク質)をSDS-PAG
Eで分画し、NCフィルターに電気転写し、RPγ(m
F)(レーン1〜3、16〜20)、Ab1γ1(A1)(レ
ーン7〜9)、Ab5γ(D2)(レーン10〜12)、A
b2γ(mF)(レーン13〜15)で免疫プローブした。
抗体枯渇処理したRPγ(mF)(レーン4〜6及び2
1、22)を用いるインキュベーションも行った。24
時間レチノイン酸処理を行うか(レーン3、6、9、1
2及び15)あるいはこの処理を行わずに(レーン2、
5、8、11及び14)、F9細胞を試験した。マウス
胚を第11.5日(レーン17)、第13.5日(レーン1
8及び22)、第14.5日(レーン19)及び第17.5
日(レーン20)に試験した。陽性対照として、mRAR
-γ1でトランスフェクトしたCOS-1細胞(COS-γ
1)の抽出物を平行して処理した(レーン1、4、7、1
0、13、16及び21)。
【0027】図2-B免疫沈降によるマウス胚中のR
AR-γの特徴づけ 第14.5日のマウス胚の核抽出物(1mgタンパク質)を
モノクローナル抗体Ab1γ1(A1)(レーン3)、Ab
2γ(mF)(レーン4)及びAb5γ(D2)(レーン5)で
免疫沈降させた。プロテインAセファロースビーズに結
合した抗原-抗体錯体を溶離させ、SDS-PAGEで分
画し、NCフィルターに電気転写した。そのフィルター
をRPγ(mF)及び[125I]プロテインAと共にインキ
ュベートすることにより、免疫沈降したmRAR-γタ
ンパク質を免疫プローブした。陽性対照として、mRA
R-γ1(レーン1及び6)及びmRAR-γ2(レーン2
及び7)でトランスフェクトしたCOS-1細胞の抽出物
(10μgタンパク質)を前以て免疫沈降することなく直
接ゲルに添加し、次いで免疫プローブした。矢印はmR
AR-γ1の位置を示す。
【0028】図2-C免疫沈降による未分化F9細胞
中のRAR-γの特徴づけ F9細胞の核抽出物(1mgタンパク質)をモノクローナル
抗体Ab1γ1(A1)(レーン3)、Ab2γ(mF)(レ
ーン4)、Ab5γ(D2)で免疫沈降させた。免疫沈降
したRAR-γタンパク質を、RPγ(mF)を用いてB
欄に記述してように免疫プローブした。mRAR-γ1
(レーン1及び6)またはmRAR-γ2(レーン2及び
7)でトランスフェクトしたCOS-1細胞の抽出物(1
0μgタンパク質)を陽性対照として直接ゲルに添加し
た。太い矢印と細い矢印はそれぞれmRAR-γ1及び
mRAR-γ2対照の位置を示す。
【0029】図3アルカリ性ホスファターゼ処理によ
ってmRAR-γ1タンパク質の電気泳動移動度が増大
する mRAR-γ1でトランスフェクトしたCOS-1細胞の
抽出物をAb2γ(mF)モノクローナル抗体(レーン3
〜6)を用いて免疫沈降させ、プロテインAセファロー
スビーズ上に固定化した抗原-抗体錯体を、10mM リン
酸ナトリウムの存在下(レーン6)または非存在下(レー
ン4及び5)で、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(CI
P)と共に(レーン5及び6)またはCIPなし(レーン
4)でインキュベートした。次に、非処理の免疫沈降物
(レーン3)及びインキュベートした免疫沈降物(レーン
4〜6)を可溶化し、電気泳動にかけ、NCフィルター
に電気転写した。そのフィルターをRPγ(mF)及び[
125I]-プロテインAと共にインキュベートすることに
より、mRAR-γ1タンパク質を同定した。平行し
て、mRAR-γ1(レーン2及び7)またはmRAR-γ
2(レーン1及び8)発現ベクターでトランスフェクトし
たCOS-1細胞の抽出物を前以て免疫沈降することな
く処理した。
【0030】図4mRAR-γ1のリン酸化 図4-A pSG5(レーン4、5、8及び9)またはmRAR-γ
1発現ベクター(レーン2、3、6及び7)でトランスフ
ェクトしたCOS-1細胞をレチノイン酸の存在下また
は非存在下で[32P]を用いてラベルし(《材料及び方
法》の項を参照のこと)、Ab2γ(mF)による免疫沈
降で分析した。電気泳動及びNCフィルターへの電気転
写の後、免疫沈降したリン酸化されたタンパク質をオー
トラジオグラフィーによって可視化し(レーン6〜9)、
同じNCフィルターをRPγ(mF)と共にインキュベー
トした後アルカリ性ホスファターゼでラベルした抗ウサ
ギ抗体で処理することにより同定した(レーン2〜5)。
対照として、mRAR-γ1でトランスフェクトしたC
OS-1細胞の抽出物(10μgタンパク質)を平行して処
理し、電気ブロットした(レーン1)。
【0031】図4-B COS-1細胞を次のキメラ発現ベクターでトランスフ
ェクトした:GAL4-Exon(8)(レーン1及び
2)、GAL4-RAR-γ1(A/B)(レーン3及び
4)、GAL4-RAR-γ1(EF)(レーン5及び6)、
GAL4-RAR-γ1(DEF)(レーン7及び8)。[32
P]でラベルした後、これらの抽出物をモノクローナル
抗体AbF3で免疫沈降させた(《材料及び方法》の項
を参照のこと)。免疫沈降物を溶離させ、電気泳動にか
け、NCフィルターに電気転写した。これらのリンタン
パク質をオートラジオグラフィーによって分析し(レー
ン2、4、6及び8)、同じNCフィルターをAbF3
と共にインキュベートしてアルカリ性ホスファターゼで
ラベルした抗マウス抗体を用いて顕在化させることによ
り同定した(レーン1、3、5及び7)。矢印はキメラ発
現ベクターによって生産されるタンパク質の位置を示
す。星印(*)は混入した免疫グロブリンを示す。
【0032】図5RAR-γ抗体を作成するために使
用した合成ペプチドのアミノ酸配列(一文字コード) RAR-γ1及びRAR-γ2(それぞれ458アミノ酸
長及び447アミノ酸長のタンパク質であり、マウスと
ヒトで長さが等しい)を模式的に表し、A〜Fと命名さ
れた6つの領域を示す。RAR-γ1とRAR-γ2は互
いにそのN-末端A領域(RAR-γ1についてはA1、
RAR-γ2についてはA2)のみが相違する。RAR-
γ抗体を作成するために使用した合成ペプチドのアミノ
酸配列(一文字コード)を記載する。ペプチド配列に付し
た数字は、RAR-γイソ型の配列におけるそれぞれの
アミノ酸残基の位置に対応する。マウスRAR-γとヒ
トRAR-γの間で異なるアミノ酸を示してある。
【0033】図6プロテインキナーゼリン酸化部位モ
チーフ RAR-γ1(Kempら,T.I.B.S. 15:342-346(1990)を参照
のこと)のA/B及びD領域のアミノ酸配列中の考え得
るリン酸化認識モチーフの位置を、いくつかのプロテイ
ンキナーゼについて示す。リン酸受容体セリンを星印
(*)で示す。プロテインキナーゼに関する特異性決定因
子が知られている場合は、決定因子残基に下線を付す。
数字は推定上の認識モチーフの最初のアミノ酸の位置を
示す。
【0034】
【好ましい態様の説明】本発明は、1)マウスまたはヒ
トRAR-γのどちらかに選択的に結合するが両方には
結合しないモノクローナルまたはポリクローナル抗体、
2)RAR-γ1に選択的に結合するがRAR-γ2には
結合しないモノクローナルまたはポリクローナル抗体、
3)ヒト及びマウスRAR-γの両方のF領域に選択的に
結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、並
びに4)ヒト及びマウスRAR-γの両方のD2領域に選
択的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗
体の作成に基づく。
【0035】本発明の抗体にはモノクローナル抗体及び
ポリクローナル抗体並びにこれらの抗体の断片が含まれ
る。
【0036】本発明の第1の態様は、マウスまたはヒト
RAR-γのどちらかに選択的に結合するが両方には結
合しない抗体を提供する。
【0037】ある抗体がヒトRAR-γに結合する能力
を有するがマウスRAR-γに結合する能力を有さない
場合、あるいはその反対に、あの抗体がマウスRAR-
γに結合する能力を有するがヒトRAR-γに結合する
能力を有さない場合、その抗体を、マウスまたはヒトR
AR-γのどちらかに選択的に結合するが両方には結合
しないという。このような抗体の一例はマウスモノクロ
ーナル抗体Ab4γ(hF)である。この抗体はヒトRA
R-γに結合するが、マウスRAR-γには結合しない。
【0038】さらなる態様として、RAR-γ1に選択
的に結合するがRAR-γ2には結合しない抗体を開示
する。このような抗体はRAR-γ1に結合するが、R
AR-γ2には結合しないであろう。このような抗体の
一例はマウスモノクローナル抗体Ab1γ1(A1)であ
る。
【0039】さらなる態様として、マウス及びヒトRA
R-γの両方のF領域に選択的に結合する抗体を開示す
る。このような抗体はRAR-γのF領域にのみ結合
し、RAR-γの他の領域には結合しないであろう。こ
のような抗体の一例はマウスモノクローナル抗体Ab2
γ(mF)である。
【0040】さらなる態様として、マウス及びヒトRA
R-γの両方のD2領域に選択的に結合する抗体を開示
する。このような抗体はRAR-γのD2領域のみを結
合し、RAR-γの他の領域を結合しないであろう。こ
のような抗体の例はマウスモノクローナル抗体Ab5γ
(D2)である。
【0041】さらに、本発明は本明細書に開示する抗体
の擬人化型をも包含する。本発明の擬人化抗体は、キメ
ラ化やCDR移植など当該技術分野で知られている手法
の1つを用いて作成することができる。
【0042】本発明のもう1つの態様として、上記の抗
体を検出できるようにラベルする。放射性同位体(例え
125Iまたは14Cなど)、アフィニティーラベル(例え
ばビオチン、アビジンなど)、酵素ラベル(例えば西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼな
ど)、蛍光性ラベル(例えばFITCやローダミンな
ど)、常磁性原子などを使用することによって、抗体を
検出できるようにラベルすることができる。このような
ラベル化を達成する方法は当該技術分野でよく知られて
いる。例えばSternberger,L.A.ら,J.Histochem.Cytoche
m 18:315(1970)、Bayer,E.A.ら,Meth.Enzym.62:308(197
9)、Engval,E.ら,Immunol.109:129(1972)、Goding,J.
W.,J.Immunol.Meth.13:215(1976)などを参照のこと。
【0043】本発明のもう1つの態様として、上述の抗
体を固体支持体に固定化する。このような固体支持体の
例には、ポリカーボネートなどのプラスチック、アガロ
ース及びセファロースなどの炭水化物、アクリル樹脂、
並びにポリアクリルアミド及びラテックスビーズなどが
含まれる。このような固体支持体に抗体を結合させるた
めの技術は当該技術分野でよく知られている(Weir,D.M.
ら,“Handbook of Experimental Immunology",第4版,Bl
ackwell Scientific Publications,Oxford,England,第1
0章(1986);Jacoby,W.D.ら,Meth.Enzym.34,Academic Pr
ess,N.Y.(1974))。
【0044】また本発明は上述の抗体を生産することが
できるハイブリドーマをも提供する。ハイブリドーマ
は、特定のモノクローナル抗体を分泌することができる
不死化された細胞系である。このようなハイブリドーマ
細胞系の例には受託機関ATCCに寄託されている11
B11(HB188)及びJ11d.2(TIB183)細
胞系が含まれる。
【0045】本発明のもう1つの態様として、試験試料
中のRAR-γまたはRAR-γの特定のイソ型の発現を
同定する方法を提供する。本発明の試験試料には細胞、
細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物、あるいは血
液、血清、血漿または尿などの生物学的液体が含まれ
る。いかなる細胞または組織も試験試料として使用でき
るが、最も好ましい試験試料は皮膚細胞から得られる。
【0046】具体的には、本法は、試験試料がRAR-
γまたはRAR-γの特定のイソ型の1つを含有するか
否かを同定する方法を提供する。
【0047】詳細に述べると、本法は、試験試料を上述
の抗体の1つと共にインキュベートし、その抗体が試験
試料に結合するか否かを検定することからなる。抗体を
試験試料と共にインキュベートする条件は様々である。
インキュベーション条件は、検定で使用する形式、使用
する検出法、及び検定で使用する抗体のタイプ及び性質
に依存する。本発明の抗体を使用することができるよう
に市販の免疫学的検定形式(放射線免疫検定法、酵素結
合イムノソルベント検定法、拡散に基づくオクタロニ
ー、またはロケット免疫蛍光検定法など)を適合させる
ことがいずれの場合も容易であることは、当業者に理解
されるであろう。このような検定法の例はChard,T.,“a
n Introduction to Radioimmunoassay and Related Tec
hniques",Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The
Netherlands(1986);Bullock,G.R.ら,“Techniques in
Immunocytochemistry",Academic Press,Orlando,FL 第
1巻(1982),第2巻(1983),第3巻(1985);Tijssen,P.,“Pr
actice and Theory of Enzyme Immunoassays:Laborato
ry Techniques in Biochemistry and Molecular Biolog
y",Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Nethe
rlands(1985)に認められる。
【0048】上述の方法で使用する試験試料は、検定形
式、検出方法の性質及び検定すべき試料として使用する
組織、細胞または抽出物によって様々であろう。最も好
ましくは、試験試料を皮膚組織または細胞から誘導する
であろう。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調
製する方法は当該技術分野でよく知られており、これら
の方法を使用する系に適合する試料が得られるように適
合させることは容易である。
【0049】本発明のさらなる態様として、1)マウス
またはヒトRAR-γのどちらか一方に選択的に結合す
るが両方には結合しないモノクローナル抗体、2)RA
R-γ1に選択的に結合するがRAR-γ2には結合しな
いモノクローナル抗体、3)ヒト及びマウスRAR-γの
両方のF領域に選択的に結合するモノクローナル抗体、
並びに4)ヒト及びマウスRAR-γの両方のD2領域に
選択的に結合するモノクローナル抗体を製造するための
方法を提供する。
【0050】一般的にモノクローナル抗体を調製する技
術は当該技術分野でよく知られている(Campbell,A.M.,
“Monoclonal Antibody Technology:Laboratory Techn
iquesin Biochemistry and Molecular Biology",Elsevi
er Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(19
84);St.Grothら,J.Immunol.Methods 35:1-21(1980))。
【0051】ヒトRAR-γに選択的に結合するがマウ
スRAR-γには結合しない抗体の好ましい作成法とし
て、ヒトRAR-γのF領域から得られるアミノ酸配列
を有するポリペプチドを、そのペプチドがマウスRAR
-γのF領域の対応する配列とは異なるアミノ酸残基を
少なくとも1つは含有するように選択し、これを動物を
免疫化する際に使用する抗原とする。このような抗体の
作成に最も好ましいペプチドは、配列番号2のアミノ酸
配列を有するSP25ペプチドである。
【0052】詳細に記述すると、選択したポリペプチド
で動物(マウス、兎など)を免疫化する。免疫化の方法は
当該技術分野でよく知られている。このような方法には
該ポリペプチドの皮下注射または腹腔内注射が含まれ
る。免疫化に使用するポリペプチドの量が、免疫化する
動物、該ポリペプチドの抗原性及び注射部位によって変
化するであろうことは、当業者に理解されるであろう。
【0053】ペプチドの抗原性を増大させるために、ポ
リペプチドを修飾するか、あるいはアジュバント中のポ
リペプチドを投与してもよい。ポリペプチドの抗原性を
増大させる方法は当該技術分野でよく知られている。こ
のような方法には、抗原を異種タンパク質(グロブリン
またはβ-ガラクトシダーゼなど)に結合させることや、
免疫化の際にアジュバントへの封入を用いることなどが
含まれる。
【0054】モノクローナル抗体については、免疫化し
た動物から脾臓細胞を取り出し、SP2/0-Ag14
骨髄腫細胞などの骨髄腫細胞と融合させ、モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ細胞にする。
【0055】望ましい特徴を有する抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞を同定するためには、当該技術分野でよ
く知られているいくつかの方法のいずれを用いることも
できる。これらには、ELISA検定法、ウエスタンブ
ロット分析、または放射線免疫検定法(Lutzら,Exp.Cell
Res.175:109-124(1988))を用いてハイブリドーマをス
クリーニングすることが含まれる。
【0056】目的の抗体を分泌するハイブリドーマをク
ローン化し、当該技術分野で知られている方法(Campbel
l,A.M.,“Monoclonal Antibody Technology:Laborator
y Techniques in Biochemistry and Molecular Biolog
y",Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Nethe
rlands(1984))を用いてそのクラスとサブクラスを決定
する。
【0057】ポリクローナル抗体については、抗体を含
有する抗血清を免疫化した動物から単離し、上述の方法
の1つを用いて、望ましい特異性を有する抗体の存在に
ついてスクリーニングする。
【0058】RAR-γ1に選択的に結合するがRAR-
γ2には結合しない抗体を作成するための好ましい方法
として、RAR-γ1のA1領域から得られるアミノ酸
配列を有するポリペプチドを、そのA領域のアミノ酸配
列がRAR-γ2のA2領域の対応する配列とは異なる
アミノ酸残基を少なくとも1つは含有するように選択
し、これを動物を免疫化する際に使用する抗原とする。
このような抗体を作成するために最も好ましいペプチド
は、配列番号1のアミノ酸配列を有するSP15ポリペ
プチドである。
【0059】マウス及びヒトRAR-γの両方のF領域
に選択的に結合する抗体を作成するための好ましい方法
として、RAR-γのF領域から得られるアミノ酸配列
を有するポリペプチドを、そのペプチドのアミノ酸配列
が、マウス及びヒトRAR-γ F領域の両方に共通のア
ミノ酸残基であって、かつ、該レセプターの他の領域と
は配列が少なくとも1アミノ酸以上異なるアミノ酸残基
を含有するように選択し、これを上述のように動物を免
疫化する際に抗原として使用する。このような抗体の作
成に最も好ましいペプチドは配列番号3のアミノ酸配列
を有するペプチドSP14である。
【0060】マウス及びヒトRAR-γの両方のD2領
域に選択的に結合する抗体を作成するための好ましい方
法として、RAR-γのD2領域から得られるアミノ酸
配列を有するポリペプチドを、そのペプチドのアミノ酸
配列が、マウス及びヒトRAR-γ D2領域の両方に共
通のアミノ酸残基であって、かつ、該レセプターの他の
領域とは配列が少なくとも1アミノ酸以上異なるアミノ
酸残基を含有するように選択し、これを上述のように動
物を免疫化する際に抗原として使用する。このような抗
体を作成するために最も好ましいペプチドは、配列番号
4のアミノ酸配列を有するSP81ポリペプチドであ
る。
【0061】当業者には理解されるであろうが、上述の
方法はRAR-γ1に選択的に結合するがRAR-γ2に
は結合しない抗体を作成するために使用できるばかりで
なく、RAR-γ2に選択的に結合するがRAR-γ1に
は結合しない抗体を作成するためにも、あるいはRAR
-γの他の特定のサブタイプのいずれかに選択的に結合
する抗体を作成するためにも同様に使用できる。具体的
には、望ましい特異性を有する抗体を作成することを望
む場合、まずKrustら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5310
-5314(1989)、Giguereら,Mol.Cell.Biol.10:2335-2340
(1990)、Kastnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2700-2
704(1990)に開示されている種々のRAR-γの配列を分
析し、次に、他のRAR-γイソ型とは対応する配列が
少なくとも1アミノ酸以上異なるペプチド配列を目的の
イソタイプから選択し、次いで、そのペプチド配列を上
述のように免疫原として使用する。
【0062】本発明のもう1つの態様として、上述の検
定を行うのに必要な試薬類をすべて含有するキットを提
供する。
【0063】具体的には、本発明は、1以上の容器を厳
重に固定するための区画されたキットであって、(a)マ
ウスまたはヒトRAR-γのどちらかに選択的に結合す
るが両方には結合しない抗体、RAR-γ1に選択的に
結合するがRAR-γ2には結合しない抗体、マウスま
たはヒトRAR-γのF領域に選択的に結合する抗体、
またはRAR-γのD2領域に選択的に結合する抗体、
の1つを含有する第1の容器、及び(b)洗浄試薬類及び
第1の容器から得られる結合した抗体の存在を検出する
ことができる試薬類、の1以上を含有する1以上の他の
容器、からなるキットを提供する。
【0064】詳細に記述すると、区画されたキットは、
試薬類が独立した容器に入っているあらゆるキットを包
含する。このような容器には、小さいガラス容器、プラ
スチック容器、あるいはプラスチックまたは紙の小片
(ストリップ)が含まれる。このような容器によって、試
料類及び試薬類が相互に混入しないように1区画から他
の区画へ試薬を効率的に輸送することが可能になり、ま
た各容器の試薬または溶液を定量的な方法で1区画から
他の区画に添加することができる。このような容器に
は、試験試料を受容するための容器、検定で使用する抗
体を含有する容器、洗浄試薬(例えばリン酸緩衝化食塩
水、Tris緩衝液など)を含有する容器、並びに結合
した抗体を検出するために使用する試薬を含有する容器
が含まれるであろう。
【0065】検出試薬の種類にはラベルされた第2抗体
が含まれ、またその反対に1次抗体がラベルされている
場合には、ラベルされた抗体と反応することができる発
色団試薬、酵素試薬、または抗体結合性試薬が含まれ
る。当該技術分野でよく知られている確立されたキット
形式の1つに本発明の抗体を容易に組み込めることは、
当業者には容易に理解されるであろう。
【0066】本発明のもう1つの態様として、RARレ
セプター類の特定のタイプまたは部分集合と相互作用す
る化合物を同定するための方法を提供する。
【0067】詳細に記述すると、細胞または組織を試験
化合物と共にインキュベートするにあたり、試験化合物
単独と共に、及び本発明または同時係属米国特許出願第
07/646527号(本明細書の一部を構成する)の抗
体の1以上の存在下でインキュベートする。試験化合物
の結合を直接的あるいは間接的に監視することができ
る。抗体存在下及び抗体非存在下での結合のレベルを決
定する。種々の抗体のそれぞれが阻害する結合のレベル
を比較することにより、試験化合物が利用したレセプタ
ーを決定することができる。
【0068】ここに本発明を一般的に記述し終えたが、
以下の実施例を参照することにより、上記の物質及びそ
れを得る方法がより容易に理解されるであろう。以下の
実施例は例示のために記載するのであって、特に明記し
ない限り、本発明の限定を意図するものではない。
【0069】
【実施例】
《材料及び方法》DNA構築物 マウスまたはヒトRAR遺伝子コード配列RAR-α
1、RAR-β2及びRAR-γ1(以前はそれぞれRA
R-αφ、RAR-βφ及びRAR-γφと呼ばれていた)
を含有するプラスミドに関する記述は過去になされてい
る(Petkovichら,Nature 330:444-450(1987);Brandら,N
ature 332:850-853(1988);Krustら,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 86:5310-5314(1989);Zelentら,Nature 339:714-
717(1989))。mRAR-γ2発現ベクターの構築は既に
報告されている(Kastnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
7:2700-2704(1990))。ベクターGAL4-Exon7-F
(Websterら,EMBO J.8:1441-1446(1989))中のヒトエスト
ロゲンレセプター(hER)エクソン7を、mRAR-γ
1のアミノ酸1〜89(A/B領域)をコード化する26
5bpのXhoI-KpnI断片で置換することにより、GA
L4/RAR-γ1(A/B)キメラを構築した。GAL
4(1-147)とRAR-γ1 A/B領域の間のリンカ
ーはIGRPPRAである。同様に、hERエクソン7
をそれぞれ782bpのXhoI-KpnI断片(mRAR-γ
1のアミノ酸201〜458)及び917bpのXhoI-K
pnI断片(mRAR-γ1のアミノ酸156〜458)で
置換することにより、GAL4-RAR-γ(EF)及び
(DEF)構築物を作成した。GAL4-RAR-γ(EF)
及び(DEF)キメラもそのリンカー領域にアミノ酸IG
RPPRAを含有する。mRAR-γ1 XhoI-KpnI
カセットは、選択した位置にXhoI及びKpnI制限部位
を導入するべく部位特異的突然変異誘発処理を2回行う
ことによって予め修飾しておいたmRAR-γ1クロー
ンから得た。上記3種のキメラ構築物はhER(F領域)
のアミノ酸553〜595をカルボキシル末端抗原性標
識としてコード化しており、この抗原性標識に対するモ
ノクローナル抗体(AbF3)は既に作成されている(Roc
hette-Eglyら,Genes Develop.4:137-150(1990))。
【0070】細胞培養及びトランスフェクション 1mlあたりに5% 胎児ウシ血清、500単位 ペニシリ
ン、400μg ゲンタマイシン及び100μg ストレプ
トマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地中で
9cm直径のペトリ皿を用いてCOS-1細胞を生育させ
た。過去に記述されているようにリン酸カルシウム技術
を用いることにより細胞をトランスフェクトした(Brand
ら,Nature 332:850-853(1988))。トランスフェクション
では、皿1枚あたりの全DNA量を20μgに調節する
ために、マウスRAR-γ1、γ2、α1またはβ2発
現ベクター(5μg)と共にプラスミド担体DNA(Bluesc
ribe)を用いた。F9EC細胞を生育させ、表示する場
合にはレチノイン酸(10-7M)で24時間処理した。
【0071】ペプチドの合成、抗血清及びモノクローナ
ル抗体の調製 ヒト及びマウスRAR-γ1のcDNAから推定した合
成ペプチドSP15(マウスまたはヒトRAR-γ1のA
1領域)、SP14(全mRAR-γイソ型のF領域)、S
P81(全ヒト及びマウスRAR-γイソ型のD2領域)
及びSP25(全hRAR-γイソ型のF領域)(図5を参
照のこと)をFmoc化学を用いて固相で合成し(ABI
モデル431Aペプチド合成装置)、アミノ酸分析によ
って確認し(分析装置ABI420A-20A-130A
システム)、追加したNH2-末端外システイン残基を通
して二官能性試薬MBS(Aldrich社)を用いてオボアル
ブミン(Sigma社)にカップリング(結合)した。兎の免疫
化及び抗血清調製については過去に記述されている(Gau
bら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3089-3093(1989))。モ
ノクローナル抗体調製のために、8週齢の雌Balb/
cマウスにカップリングした抗原100μgを腹腔内注
射した。融合の4日前に陽性マウスに抗原(100μg)
を追加免疫し、その後脾臓を摘出するまで毎日10μg
を(静脈内及び腹腔内経路で)追加免疫した。基本的にS
t.GrothとScheidegger(1989)(St.Grothら,J.Immunolgy
Methods 35:1-21(1980))の方法に従って脾臓細胞をSp
2/0-Ag14骨髄腫細胞と融合させた。結合してい
ないペプチドを抗原として用いて、培養上清をELIS
Aでスクリーニングした。次に、Lutzら(1988)(Lutzら,
Experimental Cell Reseach 175:109-124(1988))の記述
に従って、RAR-γ1 cDNAでトランスフェクトし
たCOS-1細胞について陽性培養を免疫蛍光及びウエ
スタンブロッティングで試験した。RAR-γ1を特異
的に認識する抗体を分泌するハイブリドーマを軟寒天上
で2回クローン化した。各ハイブリドーマを血清非含培
地SFRI-4(SFRI,フランス)にも適合させた。腹
水生産のために、プリスチンで予備処理した(pristine-
primed)Balb/cマウスに2×106細胞を注射し
た。イソタイピング・キット(Amersham社)を用いてクラ
ス及びサブクラス決定を行った。SFRI培養上清及び
腹水の両方をモノクローナル抗体供給源として用いた。
【0072】培養細胞及びマウス胚からの全細胞抽出物
及び核抽出物の調製 全細胞抽出物(WCE)を全面成長したCOS-1細胞の
トランスフェクション培養から調製した。冷却したPB
Sで細胞を洗浄し、かき集め、遠心分離した。ガラス製
Dounce Bホモジナイザー(ペッスル上下動20回)を用い
て、20mM モリブデン酸ナトリウム、0.6M KCl、
1.5mM EDTA、1mM PMSF及びPIC(プロテア
ーゼ阻害因子カクテル:各0.5μg/mlのロイペプチ
ン、アプロチニン、ペプスタチン、アンチトリプシン及
びキモスタチン)を含有する10mM Tris-HCl(p
H8)2体積中でペレットを4℃でホモジナイズした。
105,000xg、4℃で1時間の遠心分離後、セン
トリコン30微量濃縮器(Amicon社,アメリカ)を通して
限外濾過することにより、上清を濃縮した。グリセロー
ルを最終濃度25%になるように添加し、抽出物を分注
して−80℃に保存した。核抽出物(NE)を調製するた
めに、洗浄した細胞を、まずガラス製Dounce Bホモジナ
イザー(上下動15回)を用いて緩衝液A(20mM Tri
s-HCl(pH8)、1mM MgCl2、20mM KCl、
1mM DTT、0.3mM PMSF、PIC)中4℃で溶解
した。1500xg、4℃で5分間の遠心分離後、その
粗核ペレットを2回洗浄し、高塩緩衝液B(0.6M KC
l及び25% グリセロールを含有すること以外は緩衝
液Aと同じ)に再懸濁し、Dounce B(上下動20〜30
回)を用いてホモジナイズした。氷上で穏やかにボルテ
ックスしながら核タンパク質の抽出を行った。105,
000xgで1時間の遠心分離後、微量濃縮器(上記参
照のこと)を用いて上清を濃縮し、分注し、液体窒素中
で凍結させた。マウス胚を交尾後(p.c.)11.5、1
3.5、14.5及び17.5日の時点で集め、場合によ
り粗核ペレットを1.7M ショ糖クッション上で遠心分
離(1500gで30分間)することによってさらに精製
しその界面で回収したことを除いて、同じ手法に従って
核抽出物を調製した。Bradford(1976)(Bradford,M.M.,A
nal.Biochem 72:248-254(1976))の方法でタンパク質を
定量した。
【0073】免疫ブロッティング 全細胞抽出物または核抽出物から得たタンパク質(10
〜70μg)をSDS-PGAE(10% ポリアクリルア
ミド)で分画し、先例(Gaubら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86:3089-3093(1989))に従ってニトロセルロース(NC)
フィルター上に電気転写し、以下のように免疫プローブ
した。上記NCフィルターをPBS-3% 無脂肪粉末乳
中で“遮断”した後、PBSで適切に希釈した兎ポリク
ローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体と共に3
7℃で2時間インキュベートした。0.05% ツウィー
ン20を含有するPBS中で充分洗浄し、PBS-0.3
% 無脂肪粉末乳中で洗浄した後、[125I]でラベルされ
たプロテインAまたは[125I]でラベルされたヤギ抗マ
ウス免疫グロブリン(Amersham社)と共にフィルターを2
0℃で90分間インキュベートした。PBS/ツウィー
ン20で充分洗浄した後、フィルターを乾燥し、オート
ラジオグラフィーにかけた。特に明記する場合には、ア
ルカリ性ホスファターゼと結合した免疫グロブリン(ヤ
ギの抗ウサギまたは抗マウス免疫グロブリン,Jackson I
mmuno Research)を使用し、NBT/BCIP基質キッ
ト(Pierce社)を用いて染色を行った。カップリングした
ペプチド(20μg)を点在させたニトロセルロース(N
C)フィルターと共にインキュベートすることによって
抗血清から特異的抗体を枯渇させることにより、反応の
特異性をチェックした。
【0074】ゲル遅延検定法 RAR-β遺伝子のRARE(de Theら,Nature 343:177-
180(1990))に対応する野生型及び突然変異型二本鎖オリ
ゴデオキシヌクレオチド(それぞれRARE-β及びRA
RE-βm)をNicholsonら(1990)(Nicholsonら,EMBO J.
9:4443-4454(1990))に記述されているように用いて、Ga
rner及びRevzin(1981)(Garnerら,Nucl.Acids Res.9:304
7-3060(1981))の記述と同様の移動度シフト検定を行っ
た。20mMTis-HCl(pH7.5)、100mM KC
l、1mM MgCl2、0.1mM EDTA、0.5mM DT
T、10% グリセロール、4μg ポリ(dI-dC)及び
0.2ng(約20,000cpm)の二本鎖[32P]-5'末端ラ
ベル化合成RAREオリゴデオキシヌクレオチド、さら
に必要であれば1μlの腹水抗体(1/3に希釈したも
の)を含有する反応混合物20μl中で核抽出物(通常5
μgタンパク質)をインキュベートした。ラベルされたオ
リゴデオキシヌクレオチドを添加する前に、ポリ(dI-
dC)及び核抽出物をまず4℃で15分間インキュベー
トした。氷上でさらに15分間インキュベートした後、
必要であれば抗体を添加し、その混合反応液を氷上に1
5分間維持した後、ゲルに添加した。遊離のDNAとD
NA-タンパク質錯体を、0.5xTBE(45mM Tri
s塩基、45mM ホウ酸、2mM EDTA)中の5% ポリ
アクリルアミドゲル上で分割した。
【0075】免疫沈降 まず、最終体積1mlの10mM Tris-HCl(pH7.
5)、1mM EDTA、0.1% トリトンX100(緩衝
液C)中で一定に撹拌しながら4℃で1時間、非免疫血
清または対照腹水を用いて、細胞抽出物(50μgタンパ
ク質)を予備吸着処理した。次に、プロテインAセファ
ロースCL-4Bビーズ(Pharmacia社,Upsala,Sweden)を
添加し(緩衝液C中で50%(v/v)のスラリー状にした
もの100μl)、さらに1時間インキュベートした。遠
心分離によって無関係なタンパク質-IgG-プロテイン
Aセファロース錯体をペレット化した後、その上清中に
回収される“吸着処理した”抽出物を3μlの免疫血清
または腹水と共に4℃で1時間インキュベートした。モ
ノクローナル抗体(IgG1カッパ)を用いる場合には、
ブリッジとしてウサギ抗マウスIgG画分(1.8μg,J
ackson Immuno Research)と共にさらに1時間インキュ
ベートする必要があった。次にプロテインAセファロー
スビーズを4℃で1時間添加した。遠心分離後、ペレッ
トを緩衝液Cで4回洗浄した。電気泳動試料緩衝液(5
0mM Tris-HCl(pH6.8)、2%SDS、10
% グリセロール、100mM β-メルカプトエタノール
及び0.001% ブロモフェノールブルー)50μl中で
100℃で10分間インキュベートすることにより、抗
原-抗体錯体を溶離させた。次いで、上述のように免疫
ブロッティングを行った。
【0076】免疫沈降物のアルカリ性ホスファターゼ処
100mM Tris-HCl緩衝液(pH9.8)、1mM M
gCl2、0.1mM ZnCl2、PIC、および20単位
のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(Boehringer,Mannhe
im社)を含有するホスファターゼ反応混合物 100μl
に免疫沈降物を懸濁した。表示した場合には、リン酸ナ
トリウム 10mMを加えた。37℃で3時間のインキュ
ベーションを行った後、遠心分離し、洗浄し、電気泳動
試料緩衝液を添加し、加熱し、電気泳動し、免疫ブロッ
ティングを行った。
【0077】リン酸ラベル化 まず24時間トランスフェクトしたCOS-1細胞をリ
ン酸塩を欠くダルベッコ変法イーグル培地で終夜欠乏さ
せた後、[32P]-(1mCi/2ml,約2.106細胞)を用い
て37℃で4時間ラベル化した。細胞単層を氷冷PBS
中で6回洗浄し、緩衝液A中で5回連続して凍結(−8
0℃)及び融解することにより溶解した。8000x
g、4℃で20分間の遠心分離後、その上清を上述の免
疫沈降にかけた。免疫錯体からタンパク質を溶離させ、
SDS-PAGE電気泳動で分離し、NCフィルターに
電気転写した。リン酸化されたタンパク質をオートラジ
オグラフィーによって可視化した。同じフィルターを特
異的抗体と共にインキュベートし、次いでアルカリ性ホ
スファターゼでラベルされた第2抗体で上述のように処
理することにより、タンパク質をmRAR-γであると
同定した。
【0078】《結果》 A)ヒト及びマウスRAR-γイソ型に特有の合成ペプ
チドに対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗
体の調製 N-末端A領域(RAR-γ1についてはA1、RAR-γ
2についてはA2)の配列のみが互いに異なるRAR-γ
1及びγ2イソ型はマウスとヒトの間で長さもアミノ酸
配列も高度に保存されており、長さは同一であり、アミ
ノ酸配列はまさにC-末端の領域を除いて極めて類似し
ている(Krustら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5310-5314
(1989);Kastnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2700-2
704(1990);図5をも参照のこと)。RAR-γイソ型と
RAR-α及びβイソ型の間の主な相違点は、N-末端の
A領域、中央のD2領域及びカルボキシ末端のF領域中
にその位置が特定されている(Zelentら,Nature 339:714
-717(1989);Krustら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5310
-5314(1989);Kastnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2
700-2704(1990))。そこで既知のエピトープに対応する
特異的抗体を得るために、すべてのRAR-γイソ型に
特有であるか(領域D2及びF)もしくはRAR-γ1に
特有である(領域A1)(図5を参照のこと)潜在的に免疫
原性のアミノ酸配列を選択した。これらのペプチドのう
ちの2種(SP15及びSP81、それぞれ領域A1及
びD2に対応する)はヒトとマウスの間で完全に保存さ
れており、一方、他の2種(SP25及びSP14、共
に領域Fに対応する)は3または4アミノ酸が異なって
いる。
【0079】これら4種のペプチドはマウス中で抗原性
を示し、特異的ハイブリドーマの産出をもたらした。免
疫ブロッティング及び免疫沈降で得られた反応の強度に
基づき、各ペプチドに対応するクローンを1クローンづ
つ選択した:SP15[Ab1γ1(A1)]、SP14
[Ab2γ(mF)]、SP25[Ab4γ(hF)]及びSP
81[Ab5γ(D2)]。ELISAを用いて調べたとこ
ろ、各クローンはその同族体(cognate)を特異的に認識
したが、他のペプチドを認識しなかった(データ非開
示)。4種の抗体はすべてIgG1カッパであると同定
された。ペプチドSP14、SP15及びSP25はウ
サギ中でポリクローナル抗体の産出をももたらしたが、
最も強い反応を与えたSP14に対するポリクローナル
抗体[RPγ(mF)]のみをさらに詳細に調べた。
【0080】B)免疫ブロッティング、免疫沈降及びゲ
ルシフト検定によるクローン化ヒト及びマウスRAR-
γタンパク質の特異的検出 1.免疫ブロッティング トランスフェクトしたCOS-1細胞によって生産され
るクローン化マウスまたはヒトRAR-γタンパク質を
ウエンタンブロット上で特異的に顕在化させる能力につ
いて、ウサギポリクローナル抗血清並びにモノクローナ
ル抗体を試験した(《材料及び方法》の項を参照のこ
と)。ヒトまたはマウスRAR-γ1イソ型のどちらかを
発現させるベクターでトランスフェクトしたCOS-1
細胞の全細胞抽出物(WCE)をSDS-PAGEで分画
し、ニトロセルロース(NC)フィルター上に電気ブロッ
トした。そのフィルターを特異的モノクローナル抗体ま
たはウサギの抗血清と共にインキュベートした後、それ
ぞれ[125I]-プロテインAまたは[125I]-抗マウス免疫
グロブリンを用いることによって抗体-抗原錯体を顕在
化させた(図1A)。
【0081】mRAR-γ1発現ベクターでトランスフ
ェクトしたCOS-1細胞の抽出物の場合、SP14ウ
サギ抗血清RPγ(mF)だけでなく、モノクローナル抗
体Ab1γ1(A1)、Ab5γ(D2)及びAb2γ(m
F)も、約51kDaの見かけ上の分子質量を有する特異的
に強くラベルされたシグナルをもたらした(図1A、レ
ーン2、5、8、14)。この見かけ上の分子質量は、
cDNAから推定されるmRAR-γ1タンパク質の分
子質量(Mr=50,347;Krustら,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 86:5310-5314(1989))と極めてよく一致してい
る。より低い見かけ上の分子質量と細胞抽出物によって
様々な強度を有する別の特異的シグナルがモノクローナ
ルAb1γ1(A1)の場合に検出されたことに注意しな
ければならない(図1A、レーン2;図2A、レーン7
をも参照のこと)。同様に、モノクローナルAb2γ(m
F)及びポリクローナルRPγ(mF)では、より高い見
かけ上の分子量(及び様々な強度)を有する別の小さい特
異的シグナルが認められた(図1A、レーン8及び1
4;図2A、レーン1及び3をも参照のこと)。モノク
ローナル抗体Ab4γ(hF)ではラベル化が検出できな
かった(データ非開示)。hRAR-γ1でトランスフェ
クトしたCOS-1細胞の抽出物の場合、Ab4γ(h
F)(図1A,レーン11)だけでなく、Ab1γ1(A
1)、Ab2γ(mF)及びAb5γ(D2)(データ非開
示)を用いたウエスタンブロッティングによっても、類
似の特異的51kDaシグナルが顕在化した。しかし、R
Pγ(mF)抗血清はこのヒトクローン化レセプターを認
識しなかった(データ非開示)。
【0082】《材料及び方法》の項に記述した方法で腹
水及び抗血清から特異的抗体を枯渇させた場合、上記の
特異的シグナルのすべてがもはや認められなくなった
(図1A、レーン3、6、9、12、15)。オボアルブ
ミンを単独で用いる類似の競争実験は特異的シグナルの
強度に影響を及ぼさなかった(データ非開示)。トランス
フェクトしなかったCOS-1細胞の抽出物を用いて行
ったウエスタンブロット上には特異的ラベル化が認めら
れず(図1A、レーン1、4、7、10、13)、このこ
とはこれらの細胞中のRAR-γ1タンパク質の発現レ
ベルが極めて低いことを示唆している。さらに、マウス
またはヒトRAR-α1もしくはマウスまたはヒトRA
R-β2のいずれかでトランスフェクトしたCOS-1細
胞から得た抽出物を用いたところ、上記抗体との交差反
応が認められず(データ非開示)、このことは本抗体がR
AR-γ1タンパク質に特異的であることを示してい
る。しかし、予期されるように、Ab5γ(D2)、Ab
2γ(mF)及びRPγ(mF)はmRAR-γ2でトラン
スフェクトしたCOS-1細胞から得た抽出物とも特異
的に反応し、約48kDaの見かけ上の分子量を有するタ
ンパク質を顕在化させた(図1A、レーン19、21、
23)。いくつかの例では、約45kDaの見かけ上の分子
量を有する特異的反応体タンパク質が選択されて、この
48kDa分子種は著しく減少した(例えば図1Bのレーン
16及び22、図2Bのレーン5並びに図2Cのレーン
2及び9を参照のこと)。対照的に、これらの抽出物中
に存在するmRAR-γ2タンパク質はAb1γ1(A
1)によって認識されず、このことはmRAR-γ2イソ
型中に異なるA領域(A2)が存在することと合致する
(上を参照のこと)(図1A、レーン17)。
【0083】これらの結果は、モノクローナル抗体Ab
2γ(mF)及びAb5γ(D2)がヒト及びマウスRAR
-γタンパク質の両方に存在する対応するエピトープを
特異的に認識し、一方、Ab4γ(hF)抗体がhRAR
-γイソ型中に存在する対応するエピトープを特異的に
認識することを立証している。逆に、ポリクローナル抗
血清RPγ(mF)はマウスRAR-γ(mF)イソ型中に
存在する対応するエピトープのみを認識する。これらの
結果は、モノクローナル抗体Ab1γ1(A1)はヒト及
びマウスRAR-γ1イソ型中に存在する対応するエピ
トープと特異的に反応するが、ヒト及びマウスRAR-
γ2イソ型中のエピトープとは反応しないことをも示し
ている。
【0084】2.免疫沈降 RPγ(mF)だけでなく3種のモノクローナル抗体[A
b1γ1(A1)、Ab2γ(mF)及びAb5γ(D2)]
もmRAR-γ1でトランスフェクトしたCOS-1細胞
の全細胞抽出物からmRAR-γ1を特異的に免疫沈降
させたことが(図1B)、続いて行ったウエスタンブロッ
ティングによって示された(図1B、レーン9〜12)。
予想どおり(上を参照のこと)、mRAR-γ2でトラン
スフェクトした細胞から得た抽出物をAb1γ1(A1)
で免疫沈降させた場合には特異的シグナルが認められず
(図1B、レーン17)、一方、同じ抽出物とAb5γ
(D2)またはAb2γ(mF)を用いた場合にはシグナ
ルが観測された(図1B、レーン18及び19)。またや
はり予期されるように、RPγ(mF)はhRAR-γ1
でトランスフェクトした細胞の抽出物からhRAR-γ
1を免疫沈降させず、一方、Ab4γ(hF)はそれを行
ったがその効率はAb1γ1(A1)またはAb5γ(D
2)またはAb2γ(mF)より低かった(データ非開
示)。前免疫非反応性血清(NRS)または対照非反応性
腹水(NRA)を用いて免疫沈降を行った場合(図1B、
レーン13及び14)あるいは親発現ベクターpSG5
でトランスフェクトした細胞抽出物を用いて免疫沈降を
行った場合(図1B、レーン4〜7)にはシグナルが観測
されなかったので、上述のシグナルはいずれの場合も特
異的であった。さらに、ウエスタンブロッティング操作
を抗体枯渇処理した腹水または血清を用いて行った場合
には、シグナルが特異的に消失した(データ非開示)。免
疫沈降性ウサギ免疫グロブリンに対応する小シグナルが
時折現れた(非開示のデータ及び図1Bのレーン4)。
【0085】3.ゲルシフト検定 RAR-γイソ型に関する本抗体の特異性を確認するた
めに、RAR-β2プロモーターのRA応答要素(RAR
E)(de Theら,Nature 343:177-180(1990);Sucovら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 87:5392-5396(1990);Nicholson
ら,EMBO J.9:4443-4454(1990);Zelentら,EMBO J.10:71
-81(1991))を含有する[32P]-ラベル化オリゴデオキシ
ヌクレオチド(RARE-β、《材料及び方法》の項を参
照のこと)を用いてゲルシフト/遅延検定を行った。m
RAR-γ1でトランスフェクトしたCOS-1細胞の抽
出物を用いると特異的錯体が得られ(図1C、レーン2
の矢印1)、この特異的錯体は上記オリゴヌクレオチド
が突然変異型(RARE-βm、《材料及び方法》の項を
参照のこと)の場合には消失した(図1C、レーン1)。
【0086】モノクローナル抗体(Ab1γ1(A1)及
びAb2γ(mF))の添加後、上記の錯体はよりゆっく
り移動する分子種にシフトした(図1Cの矢印2)。しか
し、このようなシフトの誘発に関するAb5γ(D2)の
効果はより低かった(図1C、レーン5)。同様に、Ab
1γ1(A1)(Nicholosonら,EMBO J.9:4443-4454(1990)
を参照のこと)またはAb4γ(hF)(Vasiosら,EMBO J.
10:1149-1158(1991)を参照のこと)の添加は、hRAR-
γ1でトランスフェクトした細胞の抽出物で得られたプ
ローブ-レセプター錯体のシフトをもたらした。予想ど
おり、mRAR-γ2でトランスフェクトした細胞を用
いた場合に生成したプローブ-レセプター錯体はAb2
γ(mF)及びAb5γ(D2)で明らかにシフトしたが、
Ab1γ1(A1)によるシフトは認められなかった(デ
ータ非開示)。対照的に、mRAR-α1[Ab9α(h
F)]またはmRAR-β2[(Ab7β2(A1)]のどちら
かに特異的なモノクローナル抗体は、mRAR-γ1を
発現するCOS1細胞を用いて得られたプローブ-RA
R錯体のシフトを誘発しなかった(図1C、レーン6及
び7)。さらに、mRAR-γ1に対して生じたモノクロ
ーナル抗体はいずれも、mRAR-α1またはmRAR-
β2を発現するCOS-1細胞を用いて得られたプロー
ブ-RAR錯体のシフトを誘導しなかったので(図1Cの
レーン10及び16及び非開示データ)、これらの抗体
がRAR-γ1イソ型に特異的であることが確認され
た。
【0087】C)F9胚性癌腫細胞及びマウス胚中のR
AR-γイソ型の検出 上述のように特徴づけられるRAR-γ抗体のすべてが
マウスF9胚性癌腫細胞及びマウス胚中のRAR-γイ
ソ型の存在を検出できるか否かを調べた。mRAR-γ
1メッセンジャーRNA及びmRAR-γ2メッセンジ
ャーRNAは実際にF9細胞中及び種々の発生段階にお
けるマウス胚中で発見されている(Zelentら,Nature 33
9:714-717(1989);Kastnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
87:2700-2704(1990))。mRAR-γイソ型の存在の可能
性を、まずF9細胞(RAで処理したものまたは非処理
のもの)またはマウス胚から得た核抽出物を用いるウエ
スタンブロッティングで調べた。モノクローナル抗体A
b1γ1(A1)、Ab5γ(D2)及びAb2γ(mF)を
使用した場合、シグナルが検出されなかった(図2Aの
レーン7〜15及び非開示データ)。しかしRPγ(m
F)抗血清を用いた場合、予期された51kDaのクローン
化RAR-γ1分子ではなく、85kDaの見かけ上の分子
量を有するタンパク質に対応するシグナルが検出された
(図2Aのレーン2及び3並びに17〜20,矢印)。抗
血清の抗体枯渇処理後にはこのシグナルが消失したので
(図2A、レーン5及び6及び22)、このシグナルは特
異的であり、類似の交差反応性エピトープを保持する8
5kDaタンパク質に対応するのであろう。モノクローナ
ル抗体でシグナルが得られなかったことは、これらの抗
体によって認識されるエピトープがF9細胞及びマウス
胚中で翻訳後に修飾されるという可能性、および/また
は、合成されるRAR-γタンパク質の量がウエスタン
ブロッティングで検出するには少なすぎるという可能
性、を示唆するものであった。
【0088】これについて調べるために、同じ細胞抽出
物及び胚抽出物を用いて免疫沈降実験を行った。マウス
胚の核抽出物をAb1γ1(A1)(図2Bのレーン3)、
Ab2γ(mF)(図2Bのレーン4)またはAb5γ(D
2)(図2Bのレーン5)で免疫沈降させた後、RPγ(m
F)を用いるいことにより、ウエスタンブロット上で、
予期されるRAR-γ1分子量(51kDa、太い矢印)を有
するタンパク質が顕在化した。これらのシグナルを検出
するためには約1mgの核タンパク質を免疫沈降させる必
要があったことに注意すること。しかし、抗体枯渇処理
したRPγ(mF)でNCフィルターを顕在化させた場合
これらのシグナルが消失したので(データ非開示)、これ
らのシグナルは特異的であった。F9細胞抽出物を用い
た場合、1mgの核タンパク質からAb2γ(mF)(図2
C、レーン4)及びAb5γ(D2)(図2C、レーン5)
によって2つのシグナル(RAR-γ2の分子質量(約4
8kDa)またはそれより小さい分子質量(約42kDa)に類
似する分子質量に対応する)が特異的に免疫沈降した。
しかし、F9細胞抽出物をAb1γ1(A1)(図2C、
レーン3)で免疫沈降させた場合にはシグナルが認めら
れなかった(図2C、レーン3)。F9細胞をRAで24
時間処理しても、あるいは処理しなくても、同じパター
ンが観測された(データ非開示)。さらに、得られたシグ
ナルは上記3種のモノクローナル抗体を同時に添加して
も増大しなかった(データ非開示)。
【0089】D)マウスRAR-γ1のリン酸化 複数の電気泳動的分子種がCOS-1細胞中で作られた
mRAR-γ1タンパク質に認められ、抗体Ab1γ1
(A1)、Ab2γ(mF)及びRPγ(mF)によって顕在
化した(図1A及び2A)。このことは翻訳後修飾が起こ
っている可能性を示唆している。タンパク質のリン酸化
はしばしばSDS-PAGE中の移動度を変化させる。
そこで、トランスフェクトしたCOS-1細胞中で合成
されたmRAR-γ1のAb2γ(mF)免疫沈降物を、
ホスファターゼ阻害剤リン酸ナトリウムの存在下または
非存在下でウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(CIP)で
処理した。阻害剤の非存在下では、CIP処理によって
mRAR-γ1の移動度が非処理の対照と比べて増大し
た(図3、レーン4及び5)。阻害剤の存在下でホスファ
ターゼ処理した後では、この効果がもはや認められなか
った(図3、レーン6)。
【0090】これらの結果を確認するために、本発明者
らはRAR-γ1のリン酸化状態とリン酸化に対するレ
チノイン酸処理の効果を調べた。mRAR-γ1でトラ
ンスフェクトしたCOS-1細胞を、RA(10-7M)の存
在下または非存在下で[32P]-オルトリン酸塩を用いて
ラベルし、そのRAR-γ1タンパク質を特異的モノク
ローナル抗体Ab2γ(mF)で免疫沈降させた。51kD
aの見かけ上の分子質量を有するリン酸化されたタンパ
ク質であって、RAR-γ1に対応するリン酸化された
タンパク質(RPγ(mF)及びアルカリ性ホスファター
ゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体を用いて、同じNCフィルター
上で免疫ブロッティングすることによって決定した)が
検出された(図4A、レーン2、3、6及び7)。4時間
のRA処理後にリン酸化強度の変動は認められなかった
(図4A、レーン6と7を比較せよ)。親発現ベクターp
SG5でトランスフェクトしたCOS-1細胞中にはリ
ン酸化されたタンパク質が検出できなかった(図4A、
レーン4、5、8及び9)。これらの結果は、RAR-γ
1タンパク質がリン酸化された状態で存在することを示
している。
【0091】RAR-γ1のどこがリン酸化されたかを
調べるために、本発明者らはキメラタンパク質Gal4
-RAR-γ1(A/B)、Gal4-RAR-γ1(EF)及
びGal4-RAR-γ1(DEF)をコード化する3つの
発現ベクターを構築した。これらのキメラタンパク質で
は、Gal4(1-147)DNA結合ドメインがそれぞ
れmRAR-γ1のA/B領域、EF領域またはDEF
領域に融合している。これらのキメラタンパク質はエス
トロゲンレセプター(ER)のF領域をも含有する。この
領域に対する免疫沈降性モノクローナル抗体(AbF3)
は既に作成されている(Richotte-Eglyら,Genes Develo
p.4:137-150(1990))。
【0092】COS-1細胞をトランスフェクトし、[32
P]でラベルし、モノクローナル抗体AbF3を用いて
キメラタンパク質を免疫沈降させた。電気泳動後、免疫
ブロッティングによって予期されたキメラタンパク質が
顕在化した(図4B、レーン1、3、5及び7の矢印;
Gal4-Exon(8)は、ER領域Fに融合したGa
l4 DNA結合ドメインを含有するキメラタンパク質
である(Websterら,EMBOJ.8:1441-1446(1989)を参照のこ
と)。同じNCフィルターのオートラジオグラフィーに
よって、Gal4-RAR-γ1(A/B)及びGal4-
RAR-γ1(DEF)発現ベクターによってコード化さ
れているタンパク質がリン酸化されたこが明らかになっ
た(図4B、レーン4及び8)。Gal4-RAR-γ1
(DEF)のリン酸化はRA処理による影響を受けなかっ
た(非開示データ)。しかし、Gal4-RAR-γ1(E
F)発現ベクターによってコード化されているタンパク
質はRAの存在下または非存在下でラベル化されなかっ
た(図4B、レーン6)。このことは、D領域がリン酸化
部位を含有し、かつ、EF領域がリン酸化部位を含有し
ないことを示している。Gal4-Exon(8)タンパ
ク質には[32P]ラベル化が伴わなかった。このことは、
エストロゲンレセプターのF領域並びにGal4-DN
A結合ドメインがリン酸化されなかったことを示してい
る(図4B、レーン2)。
【0093】《考察》本研究において、本発明者らは、
RAR-γイソ型に対する抗ペプチド抗体の産出、特徴
づけ及び使用を記述した。A1領域[Ab1γ1(A
1)]、D2領域[Ab5γ(D2)]及びF領域[Ab2γ
(mF)及びAb4γ(hF)]に対する4種類のモノクロ
ーナル抗体及びマウスF領域に対する1種類のウサギポ
リクローナル抗血清[RPγ(mF)]が得られ、これらの
抗体は主要なRAR-γ1イソ型に特異的であった。こ
れらの抗体はすべて、RAR-γ1でトランスフェクト
したCOS-1細胞の核抽出物中の51kDaタンパク質を
免疫沈降させ、免疫ブロッティングによってこのタンパ
ク質を特異的に認識する。この見かけ上の分子質量はR
AR-γ1 cDNA配列から予想されるとおりである(K
rustら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5310-5314(198
9))。この51kDaタンパク質は核局在性を有し、細胞質
ゾル抽出物中には存在しないことを、RAR-γ1でト
ランスフェクトした細胞の免疫染色によって確認した
(非開示データ)。さらに、DNA結合検定において、こ
れらの抗体は、トランスフェクトしたCOS-1細胞の
抽出物とRAR-β2プロモーターのRA応答性要素(R
ARE-β2)との間に生じた錯体の移動度を特異的に遅
延させた。これらの結果は、本発明者らの抗ペプチド抗
体が、RAR-γ1 cDNAを含有する発現ベクターで
トランスフェクトした細胞中で生産されるRAR-γ1
タンパク質の対応するエピトープを特異的に認識するこ
とを示す。D2領域[Ab5γ(D2)]及びF領域[Ab
2γ(mF)、Ab4γ(hF)及びRPγ(mF)]に対す
る抗体はRAR-γ2イソ型をも認識したが、Ab1γ
1(A1)はRAR-γ2イソ型を認識しなかった。この
ことはRAR-γ2イソ型中に異なるA領域(A2)が存
在することと合致する。
【0094】3種類のモノクローナル抗体Ab1γ1
(A1)、Ab2γ(mF)及びAb5γ(D2)はヒトまた
はマウスRAR-γタンパク質を認識した。しかし、ポ
リクローナル兎抗体RPγ(mF)は、モノクローナル抗
体Ab2γ(mF)を与えたペプチドと同じペプチドSP
14(マウスF領域)に対して生じさせたにもかかわら
ず、マウスRAR-γイソ型を特異的に認識し、対応す
るヒト型を認識しなかった。逆に、Ab4γ(hF)は、
抗原として使用したペプチドSP25(ヒトF領域)の配
列が対応するマウス型の配列(SP14)と重なるアミノ
酸残基を含有するにもかかわらず、ヒトRAR-γタン
パク質に特異的である。
【0095】これらの抗体は、マウス胚及びF9胚性癌
腫細胞の核抽出物中の内因性RAR-γイソ型の検出を
可能にした。どちらの場合も、免疫ブロッティングでは
mRAR-γタンパク質が検出できなかったが、大量(1
mgタンパク質)の核抽出物からmRAR-γタンパク質を
免疫沈降させることができた。したがって、内因性mR
AR-γイソ型はマウス胚及びF9細胞中では少量で存
在すると思われる。mRAR-γ1イソ型に対応する分
子種(51kDa)が、A1、D2またはF領域のいずれか
に対するモノクローナル抗体によってマウス胚核抽出物
から特異的に免疫沈降した。F9細胞核抽出物では、R
AR-γ2イソ型の分子量に対応する分子量(48kDa)を
有するRAR-γ種が、より小さい分子量(42kDa)を有
する第2の分子種と共に免疫沈降した。mRAR-γ転
写物について過去に報告されているように(Kastnerら,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2700-2704(1990))、これら
のシグナルの強度はF9細胞のRA処理による影響を受
けなかった。これらの分子種はAb2γ(mF)及びAb
5γ(D2)によって特異的に免疫沈降し、Ab1γ(A
1)によって免疫沈降しなかったので、これらはイソ型
mRAR-γ2とこのイソ型のタンパク質加水分解産物
に対応すると思われる。あるいは、分子量が小さい方の
分子種がイソ型mRAR-γ5および/またはmRAR-
γ6(これらはF9細胞中には極めて少量しか存在しな
いようではあるが(Kastnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
87:2700-2704(1990)))に対応することも考えられる。こ
れらの可能性を調べるためには、mRAR-γ2イソ型
に対する特異的抗体を用いたさらなる研究が必要であ
る。
【0096】本抗体を用いることによって、RAR-γ
1が翻訳後に修飾されることを立証することができた。
mRAR-γ1はステロイドホルモンレセプター(Auricc
hio,F.,J.Steroid Biochem.32:613-622などの総説を参
照のこと)と同様にリンタンパク質であると思われる。
糖コルチコイド及びプロゲステロンレセプター(Hoeck
ら,J.Biol.Chem.264:14396-14402(1989);Dennerら,J.B
iol.Chem.265:16548-16555(1990a))またはGal4(Myl
inら,Genes Develop.3:1157-1165(1989))、熱ショック
転写因子(Sorgerら,Cell 54:855-864(1988))、アデノウ
イルスE1Aタンパク質(Dumontら,J.Virol.63:987-991
(1989);Smithら,J.Virol.63:1569-1577(1989))、オク
タマー転写因子(Tanakaら,Cell 60:375-386(1990))、c
AMP応答性転写因子CREB(Gonzalezら,Mol.Cell.B
iol.11:1306-1312(1991))及びFos(Ofirら,Nature 34
8:80-82(1990))などの他の転写因子について過去になさ
れた記述と同様に、インビトロホスファターゼ処理によ
って、mRAR-γ1が電気泳動的により速く移動する
型に変換された。さらにmRAR-γ1はインビボで、
RAの存在下でも非存在下でも、[32P]によってラベル
され得た。Gal4(1-147)DNA結合ドメインを
mRAR-γ1のA/B、EFまたはDEF領域に融合
させたキメラ構築物を利用することにより、本研究者ら
はRAR-γ1のA/B及びD領域がリン酸化部位を含
有することを発見した。DNA結合ドメイン(領域C)も
リン酸化され得るか否かはまだ調べていない。
【0097】RAR-γ1のリン酸化された残基の正確
な位置はまだわかっていないが、本研究者らは、A/B
領域及びD領域の両方がこのタンパク質のなかで、環状
AMP依存性キナーゼ(*X)、プロリン依存性キ
ナーゼ(X*X)、カゼインキナーゼI(XX*)、
カゼインキナーゼII(*XX*XX*XX
)、及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(X*X
XXX)などのプロテインキナーゼに関する共通リン
酸化モチーフ(Kempら,T.I.B.S.15:342-346(1990)及び図
6を参照のこと)に属するセリン残基のほとんどを含有
する部分に対応することに注目する。A/Bドメインに
おけるリン酸化は糖コルチコイドレセプター(Hoeckら,
J.Biol.Chem.265:5403-5408(1990))及び甲状腺ホルモン
レセプター(Goldbergら,EMBO J.7:2425-2433(1988);Gl
ineurら,Oncogene 4:1247-1254(1989))についても報告
されている。さらに、セリン残基のリン酸化はプロゲス
テロンレセプターのN-末端領域及び中央のD領域(DN
A結合ドメインとホルモン結合ドメインの間)の両方で
も観察されている(Dennerら,J.Biol.Chem.265:16548-16
555(1990a))。しかし、ホルモンの存在下でリン酸化が
増大するというプロゲステロンレセプターについて観測
された事実(Dennerら,Science 250:1740-1743(1990b))
とは対照的に、RAR-γ1のリン酸化はRAの存在と
は無関係に起こる。
【0098】RAR-γの機能に対するリン酸化の考え
得る効果についてはまだわかっていない。これに関し
て、本研究者らは、核レセプタースーパーファミリーの
他の要素の機能に対するリン酸化の役割(上記の文献を
参照のこと)がまだ発見されていないことに注目する。
転写因子CREBについて最近提唱されたように(Gonza
lezら,Mol.Cell.Biol.11:1306-1312(1991))、リン酸化
がRAR-γの3次構造に影響を及ぼし、それによって
転写活性化機能の“顕在化”がもたらされるということ
も考えられる。また核局在化シグナル(NLS)にカゼイ
ンキナーゼII部位が隣接しているSV40T抗原につい
て示されたように(Rihsら,EMBO J.10:633-639(1991))、
リン酸化がRAR-γの核輸送の速度を制御するのかも
しれない。これに関して、本研究者らは、RAR-γの
D領域がNLSに対応し得る塩基性アミノ酸の区分と共
にカゼインキナーゼII部位を含有していることに注目す
る。この可能性や他の可能性を調べるためには明らかに
RAR-γ中の潜在的リン酸化部位の部位特異的突然変
異誘発処理が必要である。
【0099】《上述の方法を用いて作成された抗体の要
約》次の表は、上述の方法を用いて作成した抗体、その
抗体を作成する際に使用したペプチド、及びその抗体の
特異性の一覧表である。
【表1】
【表2】
【表3】
【0100】寄託した態様は本発明の一側面を明示する
ための例に過ぎず、機能的に等価なすべての抗体及び細
胞系は本発明の範囲に包含されるので、本発明は、寄託
された細胞系及び上述の例によってその範囲を限定され
るべきでない。上述の態様や当該技術分野で示されてい
る態様に加えて様々な変法も本発明の予期するところで
ある。そのような変法は本願の特許請求の範囲に包含さ
れるものと見なされる。
【0101】
【配列表】
【0102】配列番号:1 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Phe Glu His Leu Ser Pro Ser Phe Arg Gly Leu Gly 1 5 10
【0103】配列番号:2 配列の長さ:14 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Gln Pro Gly Pro His Pro Asn Ala Ser Ser Glu Asp Glu Val 1 5 10
【0104】配列番号:3 配列の長さ:16 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ser Ser Glu Asp Glu Ala Pro Gly Gly
Gln Gly Lys Arg Gly Gln Ser 1 5
10 15
【0105】配列番号:4 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Lys Glu Glu Gly Ser Pro A
sp Ser Tyr Glu Leu Ser 1 5
10
【0106】配列番号:5 配列の長さ:16 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ser Ser Glu Asp Glu Val Pro Gly Gly Gln Gly Lys Gly Gly Leu Lys 1 5 10 15
【0107】配列番号:6 配列の長さ:14 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Lys Pro Gly Pro His Pro Lys Ala Ser Ser Glu Asp Glu Ala 1 5 10
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明のモノクローナル抗体及びポリクロー
ナル抗体をウエスタンブロッティング(A)、免疫沈降
(B)、及びゲル遅延/シフト検定(C)によって特徴づけ
た実験データ。
【図2】 F9細胞及びマウス胚中のRAR-γイソ型
を免疫ブロッティング(A)及び免疫沈降(B及びC)によ
って特徴づけた実験データ。
【図3】 mRAR-γ1タンパク質のリン酸化処理が
電気泳動の移動度に与える影響を表す実験データ。
【図4】 mRAR-γ1のリン酸化状態を分析した実
験データ。
【図5】 RAR-γ1及びRAR-γ2の構造の模式図
と本発明の抗体を調製する際に使用した合成ペプチドの
アミノ酸配列。
【図6】 RAR-γ中の推定プロテインキナーゼリン
酸化認識部位。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/53 D 8310−2J 33/577 B 9015−2J // C12N 15/06 (C12P 21/08 C12R 1:91) C07K 99:00 (71)出願人 592236245 サントル・ナシオナル・ドゥ・ラ・ルシェ ルシュ・シアンティフィク CENTRE NATIONAL DE LARECHERCHE SCIENTI FIQUE フランス75794パリ、セデックス16、リ ュ・ミケランジュ3番 (71)出願人 592228893 ユニベルシテ・ルイ・パストゥール・スト ラスブール・アン UNIVERSITE LOUIS PA STEUR, STRASBOURG I フランス67070ストラスブール・セデック ス、リュ・ブレーズ・パスカル4番 ボワ ット・ポスタル1032/エフ (71)出願人 591008971 イー・アール・スクイブ・アンド・サン ズ・インコーポレイテッド E.R. SQUIBB & SONS, INCORPORATED アメリカ合衆国08543−4000ニュージャー ジー州プリンストン、ローレンスビル−プ リンストンロード(番地の表示なし) (72)発明者 セシル・ロシェット−エギーユ フランス67000ストラスブール、リュ・ヴ ォルテール4番 (72)発明者 イヴ・ルッツ フランス67000ストラスブール、プラス・ サン・ニコラ・オゾンドゥ3番 (72)発明者 マイケル・ソーンダース フランス67540オストヴァルド、リュ・ド ゥ・キルシュフェルド2番 (72)発明者 イザベル・シュール フランス675000アグノー、リュ・デザビア トゥール36番 (72)発明者 マリー−ピエール・ゴーブ フランス67000ストラスブール、リュ・ド ゥ・リュニベルシテ38番 (72)発明者 ピエール・シャンボン フランス67113ブレセン、リュ・デュ・ド クトゥール・アルベール・シュヴェゼール 4番

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 マウスRAR-γまたはヒトRAR-γの
    いずれかに選択的に結合するが両方には結合しない抗
    体。
  2. 【請求項2】 ヒトRAR-γに対して選択的である請
    求項1の抗体。
  3. 【請求項3】 マウスモノクローナル抗体Ab4γ(h
    F)である請求項2の抗体。
  4. 【請求項4】 RAR-γ1に選択的に結合するがRA
    R-γ2には結合しない抗体。
  5. 【請求項5】 ヒトRAR-γ1およびマウスRAR-γ
    1の両方に結合する請求項4の抗体。
  6. 【請求項6】 マウスモノクローナル抗体Ab1γ1
    (A1)である請求項5の抗体。
  7. 【請求項7】 マウスRAR-γのF領域およびヒトR
    AR-γのF領域の両方に選択的に結合する抗体。
  8. 【請求項8】 マウスモノクローナル抗体Ab2γ(m
    F)である請求項7の抗体。
  9. 【請求項9】 マウスRAR-γのD2領域およびヒト
    RAR-γのD2領域の両方に選択的に結合する抗体。
  10. 【請求項10】 マウスモノクローナル抗体Ab5γ
    (D2)である請求項9の抗体。
  11. 【請求項11】 検出できるようにラベルされた請求項
    1から請求項10までの抗体。
  12. 【請求項12】 固体支持体に固定化された請求項1か
    ら請求項11までの抗体。
  13. 【請求項13】 マウスRAR-γまたはヒトRAR-γ
    のいずれかを選択的に結合するが両方には結合しない抗
    体を産生するハイブリドーマ。
  14. 【請求項14】 該抗体がヒトRAR-γに対して選択
    的である請求項13のハイブリドーマ。
  15. 【請求項15】 該抗体がマウスモノクローナル抗体A
    b4γ(hF)である請求項14のハイブリドーマ。
  16. 【請求項16】 RAR-γ1に選択的に結合するがR
    AR-γ2には結合しない抗体を産生するハイブリドー
    マ。
  17. 【請求項17】 該抗体がヒトRAR-γ1およびマウ
    スRAR-γ1の両方に結合する請求項16のハイブリ
    ドーマ。
  18. 【請求項18】 マウスモノクローナル抗体Ab1γ1
    (A1)を産生する請求項17のハイブリドーマ。
  19. 【請求項19】 マウスRAR-γのF領域およびヒト
    RAR-γのF領域の両方に選択的に結合する抗体を産
    生するハイブリドーマ。
  20. 【請求項20】 マウスモノクローナル抗体Ab2γ
    (mF)を産生する請求項19のハイブリドーマ。
  21. 【請求項21】 ヒトRAR-γのD2領域およびマウ
    スRAR-γのD2領域の両方に選択的に結合する抗体
    を産生するハイブリドーマ。
  22. 【請求項22】 マウスモノクローナル抗体Ab5γ
    (D2)を産生する請求項21のハイブリドーマ。
  23. 【請求項23】 RAR-γまたはRAR-γの特定のイ
    ソ型を発現させる細胞を同定する方法であって、(a)
    RAR-γ、RAR-γの特定のイソ型、またはRAR-
    γの特定の領域に選択的に結合する抗体と共に細胞をイ
    ンキュベートし、(b)該抗体が該細胞に結合するか否
    かを検出する、ことからなる方法。
  24. 【請求項24】 RAR-γまたはRAR-γの特定のイ
    ソ型を発現させる細胞を同定する方法であって、(a)
    RAR-γ、RAR-γの特定のイソ型、またはRAR-
    γの特定の領域に選択的に結合する抗体と共に細胞の膜
    抽出物またはタンパク質抽出物をインキュベートし、
    (b)該抗体が該抽出物に結合するか否かを検出する、
    ことからなる方法。
  25. 【請求項25】 試験試料中のRAR-γまたはRAR-
    γの特定のイソ型を同定する方法であって、(a)RA
    R-γ、RAR-γの特定のイソ型、またはRAR-γの
    特定の領域に選択的に結合する抗体と共に該試験試料を
    インキュベートし、(b)該抗体が該試験試料に結合す
    るか否かを検出する、ことからなる方法。
  26. 【請求項26】 該抗体がAb1γ1(A1)、Ab2γ
    (mF)、Ab5γ(D2)、Ab4γ(hF)からなる群か
    ら選択される請求項23、請求項24または請求項25
    の方法。
  27. 【請求項27】 該細胞または該試験試料が皮膚組織で
    あるか、もしくは皮膚組織から誘導される請求項23、
    請求項24または請求項25の方法。
  28. 【請求項28】 ヒトRAR-γ1に特異的に結合する
    ポリクローナル抗体を調製する方法であって、(a)ヒ
    トRAR-γ1に特有のペプチドで動物を免疫化し、
    (b)該動物中で生産される該抗体を単離する、ことか
    らなる方法。
  29. 【請求項29】 該ペプチドがRAR-γ1のA1領域
    から単離される請求項28の方法。
  30. 【請求項30】 該ペプチドがSP15ペプチドである
    請求項29の方法。
  31. 【請求項31】 ヒトRAR-γを特異的に結合するポ
    リクローナル抗体を調製する方法であって、(a)ヒト
    RAR-γに特有のペプチドで動物を免疫化し、(b)
    該動物中で生産される該抗体を単離する、ことからなる
    方法。
  32. 【請求項32】 該ペプチドがヒトRAR-γのF領域
    から単離される請求項31の方法。
  33. 【請求項33】 該ペプチドがSP25ペプチドである
    請求項32の方法。
  34. 【請求項34】 ヒトRAR-γまたはマウスRAR-γ
    のいずれかのF領域に特異的に結合するポリクローナル
    抗体を調製する方法であって、(a)RAR-γのF領
    域から得られるペプチドで動物を免疫化し、(b)該動
    物中で生産される該抗体を単離する、ことからなる方
    法。
  35. 【請求項35】 該ペプチドがSP14ペプチドである
    請求項34の方法。
  36. 【請求項36】 ヒトRAR-γのD2領域およびマウ
    スRAR-γのD2領域の両方を特異的に結合するポリ
    クローナル抗体を調製する方法であって、(a)RAR
    -γのD2領域から得られるペプチドで動物を免疫化
    し、(b)該動物中で生産される該抗体を単離する、こ
    とからなる方法。
  37. 【請求項37】 該ペプチドがSP81ペプチドである
    請求項36の方法。
  38. 【請求項38】 配列番号1のアミノ酸配列を有するペ
    プチド。
  39. 【請求項39】 配列番号2のアミノ酸配列を有するペ
    プチド。
  40. 【請求項40】 配列番号3のアミノ酸配列を有するペ
    プチド。
  41. 【請求項41】 配列番号4のアミノ酸配列を有するペ
    プチド。
  42. 【請求項42】 配列番号5のアミノ酸配列を有するペ
    プチド。
  43. 【請求項43】 配列番号6のアミノ酸配列を有するペ
    プチド。
  44. 【請求項44】 アジュバントに含まれている請求項3
    8、請求項39、請求項40、請求項41、請求項4
    2、または請求項43のいずれかのペプチド。
  45. 【請求項45】 1以上の容器を厳重に固定するために
    区画されたキットであって、(a)請求項1から請求項
    13までのいずれかの抗体を含有する第1の容器、およ
    び、(b)洗浄試薬類及び第1の容器から得られる結合
    した抗体の存在を検出することができる試薬類の1以上
    を含有する1以上の他の容器、からなるキット。
JP4295366A 1991-11-04 1992-11-04 RAR−γまたはRAR−γの特定のイソ型に特異的な抗体 Withdrawn JPH06233694A (ja)

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US789912 1991-11-04
US07/789,912 US5663303A (en) 1991-11-04 1991-11-04 Antibodies specific for retinoic acid receptor-γ

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