CN113308490B - 利用双荧光素酶报告基因系统及分子对接技术筛选PGC-1α小分子调控剂的方法 - Google Patents

利用双荧光素酶报告基因系统及分子对接技术筛选PGC-1α小分子调控剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用双荧光素酶报告基因系统及分子对接技术筛选PGC‑1α小分子调控剂的方法。通过构建PGC‑1α启动子序列的双荧光素酶报告基因载体，筛选直接激活PGC‑1α表达的小分子调控剂，同时对启动子序列进行截短，筛选出能够直接被小分子调控剂激活的核心启动子区域；对这段序列的DNA片段双螺旋结构进行模拟并采用分子对接的技术进一步分析调控剂与PGC‑1α启动子区域的结合位点，并针对不同的结合位点构建突变体进行双荧光素酶活性检测，从而确定小分子调控剂与PGC‑1α启动子结合的具体位点。本发明有助于新型PGC‑1α小分子调控剂的药物研制。

Description

利用双荧光素酶报告基因系统及分子对接技术筛选PGC-1α小 分子调控剂的方法
技术领域
本发明属于分子生物学、细胞生物学领域，涉及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)小分子调控剂的筛选方法，尤其是一种利用双荧光素酶报告基因系统和分子对接技术筛选PGC-1α小分子调控剂的方法。
背景技术
PGC-1α是PGC-1家族中的一员，最初从棕色脂肪组织中分离出来，并被定义为一种与过氧化物酶体增殖物激活受体相互作用的蛋白，是一种有效的线粒体生物合成和呼吸作用的激活剂。PGC-1α可以参与多种调节机制，例如它可以调节葡萄糖的代谢，对寒冷刺激和长期饥饿做出反应，它可能参与了机体的衰老和癌症的发生，PGC-1α的异常表达，对于心血管疾病、糖尿病和神经退行性病变的发生是十分重要的。PGC-1α蛋白增加的激活线粒体生物合成，广泛激活线粒体基因的表达，调控多种ROS代谢解毒酶(SOD-1，SOD-2，GPX-1，CAT)和线粒体UCP-2的表达，降低细胞内的ROS水平和氧化应激损伤。此外，PGC-1α在大脑区域特别丰富，例如大脑皮层、纹状体和苍白球、黑质。PGC-1α在多种神经系统损伤中具有保护作用。PGC-1α缺陷型小鼠在某些大脑区域(尤其是纹状体)表现出海绵状病变，并表现出神经系统疾病，例如明显的活动过度、肌阵挛、肌张力障碍、惊吓反应过度和频繁的四肢紧握。PGC-1α的激活或过表达能有效减轻神经退行性疾病的严重性。近年来的许多研究显示，多种天然产物均可以激活PGC-1α的表达而发挥其药理作用。然而这些研究仅在基因和蛋白水平进行了验证，没有进行准确的结合转录分析，不能确定天然产物是否直接激活PGC-1α的转录。因此，进一步的研究和探讨PGC-1α的靶标药物有助于新型治疗PGC-1α障碍的药物研制。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够高效、特异性地筛选PGC-1α小分子调控剂的方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
首先，根据人PGC-1α基因的启动子序列，构建双荧光素酶报告基因载体并转染hBMEC细胞。转染24小时后，加入小分子化合物，24小时后，裂解细胞，检测细胞裂解液的萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性比值，与未加入小分子化合物的对照组相比较，检测其对PGC-1α的调控效果。然后，构建不同长度人PGC-1α基因启动子区域的截短体报告基因载体，根据截短体筛选的片段，用Avogadro软件模拟人PGC-1α基因启动子截短片段“TTCTGCTAATAGTGTGTTGGTATTTTTCCCTCAGTTCACAGACATTCTTGATTTCAAA ACGCAAACTACACAACCCAGGGCACTAGGGTTGGAATTCAATG”的DNA的二级结构，用SYBYL软件对小分子调控剂及人PGC-1α基因启动子截短片段进行分子对接，筛选具体结合位点。最后，通过构建不同位点人PGC-1α基因启动子区域的突变体报告基因载体，确定小分子调控剂与PGC-1α启动子结合的具体位点。
具体步骤如下：
(1)根据人PGC-1α基因序列构建不同启动子的双荧光素酶报告基因载体，加入小分子化合物并检测双荧光素酶活性，筛选出能够直接激活PGC-1α启动子的小分子调控剂；
(2)将能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子序列进行不同长度截短，并构建双荧光素酶报告基因载体，加入小分子调控剂并检测双荧光素酶活性，筛选出能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子截短体，从而确定小分子调控剂激活PGC-1α转录的核心启动子区域；
(3)Avogadro软件模拟PGC-1α基因启动子截短片段；
(4)用SYBYL软件对小分子调控剂及PGC-1α基因启动子截短片段进行分子对接，筛选小分子调控剂与PGC-1α基因启动子的结合位点；
(5)根据分子对接结果，针对不同的结合位点构建突变体并进行双荧光素酶活性检测，从而确定小分子调控剂与PGC-1α启动子结合的具体位点。
其中，步骤(1)中，所述人PGC-1α基因具有8个不同的转录本，对这8个转录本分析后，有4个不同的启动子，根据这4个不同的启动子序列设计引物并构建双荧光素酶报告基因载体。
优选地，所述4个启动子的引物序列如SEQ ID No.1-8所示，其中能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子的引物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
其中，步骤(2)中，首先将能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子序列进行4个不同长度的截短，通过检测双荧光素酶活性确定启动子区域，然后再将启动子区域进一步截短，最终确定小分子调控剂激活PGC-1α转录的核心启动子区域。
优选地，所述小分子调控剂激活PGC-1α转录的核心启动子区域的序列如SEQ IDNo.23所示。
其中，步骤(4)中，所述具体结合位点位于PGC-1α启动子DNA双螺旋的大沟中，所述小分子调控剂与启动子54-55(-1100bp～-1000bp)位碱基和71-73(-1100bp～-1000bp)位碱基以氢键作用方式结合。
其中，步骤(5)中，构建54-55(-1100bp～-1000bp)位碱基和71-73(-1100bp～-1000bp)位碱基突变体并验证其活性，其中54-55位碱基突变不能降低启动子活性，而71-73位碱基突变能使启动子活性降低。
本发明进一步提供一种用于筛选PGC-1α小分子调控剂的人PGC-1α基因启动子片段，所述启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，该片段中的54-55(-1100bp～-1000bp)位碱基和71-73(-1100bp～-1000bp)位碱基能以氢键作用方式结合PGC-1α小分子调控剂，且54-55位碱基突变不能降低活性，而71-73位碱基突变能使活性降低，因此71-73位碱基是小分子调控剂与PGC-1α启动子结合的具体位点。
本发明的有益效果是：
本发明首次将分子对接技术与双荧光素酶报告基因技术相结合，筛选直接激活PGC-1α的小分子调控剂，并通过截短体、突变体等角度阐述人PGC-1α启动子序列与小分子调控剂结合的具体位点。本发明的双荧光素酶报告基因系统和合理设计减少了由于实验操作过程、转染效率和细胞状态差异引起的实验误差，使得结果准确性更高。PGC-1α对多种疾病具有保护作用，筛选出的小分子调控剂可以作为先导化合物，为开发治疗以PGC-1α为靶点的多种疾病的药物奠定了基础。
附图说明
图1：人PGC-1α的4个不同启动子报告基因载体的质粒图谱。A-D分别为启动子PPH1、PPH2、PPH3、PPH4。
图2：不同药物对PGC-1α不同启动子双荧光素酶活性检测。
图3：小分子调控剂3-131的化学结构式。
图4：启动子第一次截短体示意图。
图5：小分子调控剂对PGC-1α启动子第一次截短体的双荧光素酶活性检测。
图6：启动子第二次截短体示意图。
图7：小分子调控剂对PGC-1α启动子第二次截短体的双荧光素酶活性检测。
图8：分子对接预测小分子调控剂与PGC-1α的结合位点。
图9：突变体的构建及小分子调控剂与PGC-1α启动子核心区域结合位点的双荧光素酶活性检测。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明进行说明，本文使用的所有技术和科学术语具有于本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景部分所介绍，PGC-1α在多种疾病中起保护作用，但是基于PGC-1α的天然化合物激动活剂通常是在基因和蛋白水平进行了验证的高表达，没有进行准确的结合转录分析，不能确定天然产物是否直接激活PGC-1α的转录。因此，本发明的目的是提供一种基于PGC-1α为靶点的化合物筛选方法，并将其与分子对接技术相结合，确定结合位点，为开发以PGC-1α为靶点的药物奠定基础。
本发明利用构建PGC-1α启动子序列的双荧光素酶报告基因载体，筛选直接激活PGC-1α表达的小分子调控剂，发现只有小分子化合物3-131可以提高PPH2的荧光活性。接着对启动子序列进行截短，发现当启动子区域为P7(-1100bp～-1000bp)时，双荧光素酶的活性极显著的增强，启动子具有较强的转录活性，说明这段序列是3-131激活PGC-1α转录的核心启动子区域。
本发明对这段序列的DNA片段双螺旋结构进行模拟并采用分子对接的技术进一步分析3-131与PGC-1α启动子区域的结合位点，发现3-131主要位于PGC-1α启动子DNA双螺旋的大沟中与54-55(-1100bp～-1000bp)位碱基和71-73(-1100bp～-1000bp)位碱基以氢键作用方式结合。进一步构建这两个位点的突变载体，结果显示54-55位碱基突变不能降低双荧光素酶的活性，而71-73位碱基突变后，双荧光素酶活性较P7降低了70％。
综上所述，小分子调控剂与PGC-1α转录起始位点上游-1100bp～-1000bp(71-73位碱基)直接结合，激活PGC-1α的转录。同时，小分子调控剂与-1100bp～-1000bp片段中的71-73位碱基以氢键的形式结合而激活PGC-1α的转录活性。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例对本申请进行详细的说明。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行。
实施例PGC-1α小分子调控剂的筛选
1.材料与试剂
1.1材料
本试验所使用的细胞系是人脑微血管内皮细胞hBMEC细胞。
1.2主要试剂
双荧光素酶报告基因试剂盒
Figure BDA0003070869060000052
Reporter Assay System，货号E1910，购自美国Promega公司；lipo8000TM转染试剂：货号C0533，购自上海碧云天生物技术有限公司。
2.实验方法
2.1细胞培养
hBMEC细胞是人脑微血管内皮细胞系，细胞呈铺路石状，贴壁生长。使用RPMI-1640完全培养液(含有10％FBS，1％谷氨酰胺，1％双抗，1％非必须氨基酸，1％维生素，1％丙酮酸钠)，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
2.2载体构建
a.引物的设计
检索NCBI后发现，人的PGC-1α有8个不同的转录本，而仅有4个不同的启动子，分别构建这4个不同的启动子的载体，命名为PPH1、PPH2、PPH3、PPH4，据此而设计扩增此序列的引物，前面加上pGL3表达载体上含有而PGC-1α启动子区不含有的酶切位点序列，因此引物前加的酶切位点为Kpn I和Xho I，引物序列如表1和SEQ ID No.1-8所示：
表1 PCR扩增PGC-1α启动子区引物
Figure BDA0003070869060000051
Figure BDA0003070869060000061
注：下划线标明的是同源臂，加粗的是酶切位点。
b.PCR克隆PGC-1α基因启动子序列
以hBMEC细胞基因组DNA为模板，通过PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)高保真酶进行PCR克隆PGC-1α基因CDS区，PCR扩增反应体系如表2所示：
表2 PCR克隆PGC-1α启动子的反应体系
Figure BDA0003070869060000062
反应混合物涡旋，轻微离心后，于Bio-Rad PCR仪进行PCR扩增，设置程序为：step1，3min at 98℃；step2，10s at 98℃，15s at 55℃，1min at 72℃，共40个循环；step3，5min at 72℃。1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带，切胶回收。
c.按照说明书方法进行双酶切、连接pGL3表达载体、转化和提质粒得到pGL3-PGC-1α双荧光素酶报告基因表达载体(图1)。
2.3 pGL3-PGC-1α转染到hBMEC细胞
按照说明书方法进行。
2.4双荧光素酶活性的检测及分析
转染后细胞于37℃，5％CO2培养箱培养24h后，加入小分子化合物，继续培养24h后按照试剂盒方法测荧光素酶活性(图2)。
2.5不同长度截短体构建
为了探究PGC-1α的核心启动子区域，本研究使用高保真酶，以PPH2载体为模板分段扩增PGC-1α启动子区域序列(命名为P1-P7)，引物序列如表3和SEQ ID No.9-22所示。为了构建双荧光报告载体系统，在PCR片段扩增过程中在其上下游分别引入KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点。产物经胶回收后，利用双酶切与线性化的pGL3-Basic载体进行连接，构建启动子活性验证的双荧光报告载体，命名为pGL3-P(N)(图4、图6)。分别培养hBMEC细胞，当细胞汇合度为80％时，将启动子活性验证的双荧光报告载体分别进行细胞转染。转染48h后，分别收集hBMEC细胞，进行双荧光素酶活性分析(图5、图7)。
表3人PGC-1α启动子区域序列克隆引物
Figure BDA0003070869060000071
Figure BDA0003070869060000081
注：下划线标明的是同源臂，加粗的是酶切位点。
2.6生物信息学分析具体结合位点
a.DNA结构的模拟
DNA二级结构模拟：应用Avogadro软件对PGC-1α启动子核心DNA序列进行DNA二级结构的模拟。(1)打开Avogadro界面，点击Build>Insert>DNA/RNA，在Insert NucleicAcids对话框中，DNA/RNA Builder中选择DNA，Sequence中输入启动子核心区域的DNA序列，其余参数默认，点击“Insert”；(2)File>Save as，选择PDB(*.pdb)格式，即保存DNA的二级结构。
b.分子对接
(1)处理核酸及配体
1)打开Surflex-Dock界面，点击File>Import File>选中保存的DNA二级结构，点击OK，即Surflex-Dock界面中呈现DNA的双螺旋结构。
2)点击Selection>Select atoms，在Atom Expression对话框中，选中除Residues外的其他成分，点击OK；在Edit>Delete>Selected，即删除除Residues外的其余成分；Edit>Hydrogens>Add All Hydrogens，即给DNA双螺旋结构进行加氢处理；File>Export File，在Save Molecule对话框中，Format选择PDB格式，点击save，即对处理后的DNA双螺旋结构进行保存。
3)应用ChemDraw Ultra 8.0进行化合物结构的绘制并保存为mol格式；打开Surflex-Dock界面，点击File>Import File>选中保存的化合物mol格式，点击OK，在弹出的Spreadsheet对话框中勾选化合物，鼠标右击，选中put structures into Mol Areas，即Surflex-Dock界面中呈现化合物的结构；File>Export File，在Save Molecule对话框中，Format选择mol2格式，点击save，即对自动加氢处理后的化合物结构进行保存。
4)点击Applications>Ligand preparation>Setup，点击"…"导入3)保存的mol2格式的化合物文件，在Preparation Protocol中选择Surflex for searching，FinalFormat中选择SYBYL-mol2格式输出，即对化合物进行了结构的优化处理。
(2)设定对接口袋
1)打开Surflex-Dock界面，点击Applications>Docking suite>Dock Ligand，确认"Docking mode"为"Surflex-Dock(SFXC)"，在Docking Mode区域里点击Define，打开Surflex-Dock(SFXC)对话框。
2)在Surflex-Dock(SFXC)对话框中将Receptor文件格式设为mol2，点击"…"按钮，从打开的文件管理器窗口选择处理后的DNA.mol2文件并点击OK确认，在ProtomolGeneration Mode中选择Automatic模式，点击Generate，点击OK产生Surflex-Dock SFXC文件。
(3)指定待对接的配体并提交作业
1)重新打开Surflex-Dock界面，点击Applications>Docking Suite>DockLigands，确认"Docking mode"为"Surflex-Dock(SFXC)"，在Docking Mode区域里点击"…"按钮，选择设置好的sfxc文件。在Ligand Source区域，设置配体文件格式为Mol2，点击"…"，选择一个待对接的配体文件(…Final.mol2格式)。
2)取消对Perform CScore Calculations的勾选。
3)设置作业名称，点击OK，提交作业。
(4)查看对接结果
1)打开Surflex-Dock界面，点击Applications>Docking Suite>AnalyzeResults。
2)在Results Browser界面，点击jobname右侧的"…"，打开作业目录。
3)在配体列表框内查看对接打分和配体的最高得分对接构象。
4)点击SYBYL主界面的File>Import File，读入配体文件，观察对接前后配体构象、位置的差异。
5)点击配体列表框内上方的Table，然后点击配体文件，可以查看配体对接后输出的全部构象及打分详情。
(5)对接结果保存
1)打开Surflex-Dock界面，点击Applications>Docking Suite>AnalyzeResults。在Results Browser界面，点击jobname右侧的"…"，打开作业目录。在配体列表框内选择化合物，在窗口中双击选中对应的配体，在View中选择Site对应的DNA，界面中即显示DNA与化合物的相互作用图。
2)点击Edit>Merge。在Molecule Area界面中选中DNA结构(如M1:PGC)，点击OK，即将配体对接到DNA结构中。
3)点击File>Export File。在Save Molecule界面中选中DNA结构(如M2:PGC)，修改Format为PDB格式，在File中重新命名融合后的DNA和化合物复合体。
(6)对接结果的可视化分析
1)打开PyMOL软件界面，点击File>Open，即打开需要分析的DNA与化合物复合物。选中蛋白点击S>line,点击H>Carton,点击C>element改变DNA双链和化合物的颜色。
2)选中配体，sele中点击A>find>polar contacts>to others excludingsolvent，界面中即显示化合物与DNA碱基相互作用的氢键。
3)选中与化合物相互作用的DNA碱基，sele中点击show>sticks,在all中点击Hide>line，即只显示化合物与相互作用的碱基；可通过点击C>element改变DNA碱基和化合物的颜色。
4)选中DNA碱基，sele中点击label>residues即显示DNA碱基的名称；点击Wizard>Measurement，即可显示氢键的距离；点击Display>Background>White，即可将界面的背景色更改为白色；选中All，点击S>surface，即DNA双链以surface的形式进行显示；点击Setting>Transparency>surface>60％，即可将Surface的DNA碱基进行透明化处理；在Mouse Mode中将Viewing改成Editing即可对DNA碱基的Label以及氢键距离的位置等进行调整；5)调整DNA与化合物结合的页面至合适的位置，命令框输入命令“png image.png,width＝4000,height＝2400,dpi＝300,ray＝1”点击回车键，File>Export image As>PNG，即保存最终的对接结果图(图8)。
2.7突变体构建及活性位点验证
为了验证PGC-1α的核心启动子区域结合位点，根据SYBYL X-2.0分析的突变位点设计的突变引物见表4，本研究使用高保真酶
Figure BDA0003070869060000101
HS DNA Polymerase(TaKaRa)，以pGL3-P7为模板别扩增PGC-1α启动子区域序列(命名为mutation 1-2)。1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带。
表4人PGC-1α启动子区域序列突变引物
Figure BDA0003070869060000111
注：下划线表示突变位点。
Dpn I酶的消化:模板质粒P7是来源于大肠杆菌，经甲基化修饰，而PCR产物是在体外合成，不含有甲基化，因此经过Dpn I酶的的作用，可以消化掉含有甲基化修饰的模板质粒。按照以下体系对PCR产物进行处理。
表5Dpn I酶的反应体系
Figure BDA0003070869060000112
按照上述体系加入相应试剂后混匀，轻微离心以除去气泡，在PCR仪上设置反应条件：37℃，30min；4℃，forever。
转化和测序：将Dpn I消化后的产物，转化至大肠杆菌中。
质粒提取：对测序正确的突变载体，进行无内毒素质粒的抽提。
质粒转染及双荧光素酶报告基因活性检测：培养hBMEC细胞，当细胞汇合度为80％时，将启动子活性验证的双荧光报告载体分别进行细胞转染。转染48h后，分别收集hBMEC细胞，进行双荧光素酶活性分析(图9)。
3.实验结果
3.1直接激活PGC-1α的小分子化合物筛选
转染24h后，加入3-131、3-139、4-186、4-216这4种小分子化合物或加入ZLN005(已知的PGC-1α转录激活剂)孵育24h后，按照试剂盒方法进行双荧光素酶活性检测，结果如图2。结果显示，与pGL3-Basic组相比，3-131处理组PPH2的启动子双荧光素酶的活性极显著的增强，其他启动子双荧光素酶活性无显著变化。此外，其他化合物处理组，启动子双荧光素酶活性也无显著变化。结果说明，小分子化合物3-131(图3)可以激活PPH2的启动子活性，而ZLN005无法激活任意启动子活性，这与之前报道的ZLN005对PGC-1α启动子的激活具有细胞特异性的结果一致。
3.2分析3-131在PGC-1α启动子的结合区域
为了进一步研究3-131激活PGC-1α的核心启动子区域，本发明对PGC-1α的第二个启动子PPH2进行了不同片段的截短，具体截短的片段如图4。对这4个不同的启动子截短体进行载体构建，分别命名为P1、P2、P3、P4，测序正确后按照试剂盒方法进行双荧光素酶活性检测，结果如图5。当启动子区域为P2(-1400bp～-1000bp)、P3(-2000bp～-1000bp)和P4(-2000bp～-500bp)时，双荧光素酶的活性极显著的增强，启动子具有较强的转录活性。通过对P2、P3和P4序列的分析得出结论，3-131主要通过激活转录起始位点上游-1400bp～-1000bp，说明这段序列是3-131激活PGC-1α转录的核心启动子区域。
根据上述结果，本发明对转录起始位点上游-1400bp～-1000bp进行进一步的截短，具体截短的片段如图6。对这3个不同的启动子截短体进行载体构建，分别命名为P5、P6、P7，测序正确后进行转染及双荧光素酶报告基因试验，结果如图7。当启动子截短至转录起始位点上游-1400bp～-1250bp和-1250bp～-1100bp时，与pGL3-Basic组相比，双荧光素酶活性没有出现显著变化，这说明启动子在这段序列没有转录活性。当启动子区域为P7(-1100bp～-1000bp)时，双荧光素酶的活性极显著的增强，启动子具有较强的转录活性。通过对P5、P6和P7序列的分析得出结论，3-131主要通过激活转录起始位点上游-1100bp～-1000bp，说明这段序列是3-131激活PGC-1α转录的核心启动子区域。
3.3确定3-131与PGC-1α启动子结合的具体位点
分子对接结果显示，3-131主要位于PGC-1α启动子DNA双螺旋的大沟中与54-55(-1100bp～-1000bp)位碱基和71-73(-1100bp～-1000bp)位碱基以氢键作用方式结合(图8)。进一步构建这两个位点的突变载体，结果显示54-55位碱基突变不能降低双荧光素酶的活性，而71-73位碱基突变后，双荧光素酶活性较P7降低了70％(图9)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 利用双荧光素酶报告基因系统及分子对接技术筛选PGC-1α小分子调控剂的方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctatcgata ggtaccacct cagaagaacc tctgagaagc atc 43
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acttagatcg cagatctcga gccttgggga ggtctcatct gctg 44
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctatcgata ggtacccctt gagggcagag ccaatgacct ttgtcc 46
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acttagatcg cagatctcga ggttgcacat gtcccacgcc atccag 46
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctatcgata ggtaccgaca gcctacattt tcttgattat ttttac 46
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acttagatcg cagatctcga gttcaccaac cagagcagca cactgc 46
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctatcgata ggtaccatta gctatcttat tctgtgattc ttgt 44
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acttagatcg cagatctcga gtggaggggt gccgtcaggc atggag 46
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctatcgata ggtacccctt gagggcagag ccaatgacct ttgtcc 46
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acttagatcg cagatctcga gtttacctga aaacaatccc ccagttacct a 51
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tctatcgata ggtaccatta ttatcaagta aaagaattga gctgatt 47
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acttagatcg cagatctcga gcattgaatt ccaaccctag tgccctgggt tg 52
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctatcgata ggtacccctt gagggcagag ccaatgacct ttgtcc 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acttagatcg cagatctcga gcattgaatt ccaaccctag tgccctgggt tg 52
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctatcgata ggtacccctt gagggcagag ccaatgacct ttgtcc 46
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acttagatcg cagatctcga gaacgtgtat tccctaagaa ctctttaatt c 51
<210> 17
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctatcgata ggtaccatta ttatcaagta aaagaattga gctgatt 47
<210> 18
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acttagatcg cagatctcga gttcctgtaa catgacagtg gtctgactta ac 52
<210> 19
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tctatcgata ggtaccgtgt ttttccactg tgtccagtac cttgagt 47
<210> 20
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acttagatcg cagatctcga gatattcaat tcctgagctt tactttctat ta 52
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tctatcgata ggtaccttct gctaatagtg tgttggtatt tttccct 47
<210> 22
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acttagatcg cagatctcga gcattgaatt ccaaccctag tgccctgggt tg 52
<210> 23
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttctgctaat agtgtgttgg tatttttccc tcagttcaca gacattcttg atttcaaaac 60
gcaaactaca caacccaggg cactagggtt ggaattcaat g 101

Claims (8)

1.一种用于筛选PGC-1α小分子调控剂的人PGC-1α基因启动子片段，其特征在于：所述启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，该片段中的54-55位碱基和71-73位碱基能以氢键作用方式结合PGC-1α小分子调控剂，且54-55位碱基突变不能降低启动子活性，而71-73位碱基突变能使启动子活性降低，
所述PGC-1α小分子调控剂的结构式如下：
Figure 487118DEST_PATH_IMAGE001
。
2.权利要求1所述启动子片段的获得方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）根据人PGC-1α基因序列构建不同启动子的双荧光素酶报告基因载体，加入小分子化合物并检测双荧光素酶活性，筛选出能够直接激活PGC-1α启动子的小分子调控剂；
（2）将能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子序列进行不同长度截短，并构建双荧光素酶报告基因载体，加入小分子调控剂并检测双荧光素酶活性，筛选出能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子截短体，从而确定小分子调控剂激活PGC-1α转录的核心启动子区域；
（3）Avogadro软件模拟PGC-1α基因启动子截短片段；
（4）用SYBYL软件对小分子调控剂及PGC-1α基因启动子截短片段进行分子对接，筛选小分子调控剂与PGC-1α基因启动子的结合位点；
（5）根据分子对接结果，针对不同的结合位点构建突变体并进行双荧光素酶活性检测，从而确定小分子调控剂与PGC-1α启动子结合的具体位点。
3.如权利要求2所述启动子片段的获得方法，其特征在于：步骤（1）中，所述人PGC-1α基因具有8个不同的转录本，对这8个转录本分析后，有4个不同的启动子，根据这4个不同的启动子序列设计引物并构建双荧光素酶报告基因载体。
4.如权利要求3所述启动子片段的获得方法，其特征在于：所述4个启动子的引物序列如SEQ ID No.1-8所示，其中能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子的引物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
5.如权利要求2所述启动子片段的获得方法，其特征在于：步骤（2）中，首先将能够直接被小分子调控剂激活的PGC-1α启动子序列进行4个不同长度的截短，通过检测双荧光素酶活性确定启动子区域，然后再将启动子区域进一步截短，最终确定小分子调控剂激活PGC-1α转录的核心启动子区域。
6.如权利要求5所述启动子片段的获得方法，其特征在于：所述小分子调控剂激活PGC-1α转录的核心启动子区域的序列如SEQ ID No.23所示。
7.如权利要求2所述启动子片段的获得方法，其特征在于：步骤（4）中，所述小分子调控剂与PGC-1α启动子的结合位点位于PGC-1α启动子DNA双螺旋的大沟中，所述小分子调控剂与序列如SEQ ID No.23所示PGC-1α启动子的54-55位碱基和71-73位碱基以氢键作用方式结合。
8.如权利要求7所述启动子片段的获得方法，其特征在于：步骤（5）中，构建序列如SEQID No.23所示PGC-1α启动子的54-55位碱基和71-73位碱基突变体并验证其活性，其中54-55位碱基突变不能降低启动子活性，而71-73位碱基突变能使启动子活性降低。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533996A (zh) * 2012-01-04 2012-07-04 南通大学附属医院 确定人april基因启动子、转录因子结合位点的方法及用途
CN104561323A (zh) * 2015-01-13 2015-04-29 中山大学 利用双荧光素酶报告基因系统筛选upr小分子调控剂的方法
CN108018301A (zh) * 2017-12-12 2018-05-11 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 确定miR-27a基因的核心启动子及其内转录因子Myod结合位点的方法
CN110004144A (zh) * 2019-03-06 2019-07-12 中国农业大学 猪小肠上皮细胞表达的pgc启动子及其应用
CN110426512A (zh) * 2019-05-21 2019-11-08 南京大学 区分过氧化酶激活增殖受体γ完全激动剂、部分激动剂、拮抗剂活性的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4296608B2 (ja) * 1997-08-27 2009-07-15 田辺三菱製薬株式会社 Ｐｐａｒのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法
EP1284291A4 (en) * 2000-05-25 2005-06-08 Yamanouchi Pharma Co Ltd PROMOTER OF HUMAN PGC-1

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533996A (zh) * 2012-01-04 2012-07-04 南通大学附属医院 确定人april基因启动子、转录因子结合位点的方法及用途
CN104561323A (zh) * 2015-01-13 2015-04-29 中山大学 利用双荧光素酶报告基因系统筛选upr小分子调控剂的方法
CN108018301A (zh) * 2017-12-12 2018-05-11 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 确定miR-27a基因的核心启动子及其内转录因子Myod结合位点的方法
CN110004144A (zh) * 2019-03-06 2019-07-12 中国农业大学 猪小肠上皮细胞表达的pgc启动子及其应用
CN110426512A (zh) * 2019-05-21 2019-11-08 南京大学 区分过氧化酶激活增殖受体γ完全激动剂、部分激动剂、拮抗剂活性的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of a novel genetically modified bioluminescent-bacteria-based assay for detection of fluoroquinolones in animal-derived foods;Guyue Cheng等;《Anal Bioanal Chem》;20141030;第7899-7910页 *
Identification and characterization of phytocannabinoids as novel dual PPARα/γ agonists by a computational and in vitro experimental approach;Enrico D"Aniello等;《BBA - General Subjects》;20190103;第586-597页 *

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