JPH11512436A - ニトロソ化ヘモグロビンおよびその治療上の使用 - Google Patents

ニトロソ化ヘモグロビンおよびその治療上の使用

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JPH11512436A JP9512108A JP51210897A JPH11512436A JP H11512436 A JPH11512436 A JP H11512436A JP 9512108 A JP9512108 A JP 9512108A JP 51210897 A JP51210897 A JP 51210897A JP H11512436 A JPH11512436 A JP H11512436A
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Abstract

(57)【要約】 Ｓ−ニトロソチオール（ＲＮＳＯ）は、ヘムを不活性化することなく、ヘモグロビン（Ｈｂ）のβ９３システイン残基にＮＯ基を供与しうる。ＨｂのＳ−ニトロシル化は、酸素およびヘムの酸化状態のアロステリックコントロール下にある。Ｓ−ニトロソヘモグロビン（ＳＮＯ−Ｈｂ）からのＮＯ基放出は、細胞内の低分子量のチオールによってさらに促進され、ＲＮＳＯを生成し、ＲＮＳＯは赤血球から輸送されて血圧および血小板活性化を制御することができる。ＳＮＯ−Ｈｂは、ＨｂのＳ−ニトロソチオールとの反応によって生成され得る。この方法は、ヘムの酸化を回避する。チオール基のみに特異的ではなく、Ｈｂをより多くニトロソ化する他の方法を用いてもよく、該方法は、該方法の生成物または中間生成物としてポリニトロソ化メトＨｂを製造してもよい。様々な型のＳＮＯ−Ｈｂおよびそれらの組み合わせ（オキシ、デオキシ、メト；特に、Ｓ−ニトロシル、または様々な程度のニトロソ化もしくはニトロ化）は、酸素化し、フリーラジカルを捕捉し、組織にＮＯ+基を放出することが望ましい動物またはヒトに投与され得る。また、チオールおよび／またはＮＯ供与剤を投与して、ＮＯ+基の転移を充進することができる。ＳＮＯ−Ｈｂまたは他のニトロソ化型もしくはニトロ型のＨｂによって治療する状態の具体例としては、虚血損傷、高血圧、アンギナ、再灌流損傷および炎症、ならびに血栓症によって特徴付けられる障害があげられる。

Description

【発明の詳細な説明】 ニトロソ化ヘモグロビンおよびその治療上の使用 関連出願 本出願は、米国特許出願第６０／００３，８０１号に対して優先権を主張する １９９６年３月１５日に出願された米国特許出願第０８／６１６，３７１号の一 部継続出願である１９９６年６月２０日に出願された米国特許出願第０８／６６ ７，００３号に対して優先権を主張し、これらの出願の教示は、その全体が参照 によって合体される。発明の背景 ヘモグロビン（Hb）とO2、CO2、NOなどといった小さな拡散性リガンドとの相 互作用はその金属中心とアミノ末端で起こることが知られている。肺と全身の微 小脈管構造で起こるO2/CO2送達機能はアロステリックに制御される。環境に対す るそのような反応が、NOの場合にもあてはまることは知られていない。具体的に 述べると、Hb（Fe）はNOの作用範囲の制限に関与するが(Lancaster J.R.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，91:8137-8141（1994）；WoodおよびGarthwaite，J．N europharmacol.，33:1235-1244(1994))、NOはHbの機能性を生理学的に有意なほ どには変更しないと考えられている。しかし、この仮定に基づく速度論的モデル 研究によれば、脈管構造中の遊離NOの大半はHbによって捕捉されるはずである（ Lancaster 1994）。したがって、仮に平静な器官ではそうでないとしても、アテ ローム性動脈硬化症に認められるような酸化剤ストレス（oxidant stress）が加 われば、NOの定常状態レベルはグアニル酸シクラーゼなどの標的酵素に対するKm よりも低くなるだろう（Lancaster 1994）。これらの考察は、NOがどのようにし てその生理活性を発揮するのかという根本的な疑問を生じさせる。 このパラドックスに対する１つの回答は、一酸化窒素が、NO様の血管弛緩因子 活性を持つが(Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:444-448( 1992))、高濃度の血中Hbによる拡散的制約を受けないＳ−ニトロソチオール（RS NO）生成傾向に見出すことができる(Gaston，B.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．US A，90:10957-10961(1993))。具体的に述べると、RSNOのNO基は、NOそのものとは 異なるニトソニウム（NO+）性を持つ。NOがなしえない一定の機能を引き出す能 力をRSNOが持っていることは、ますます理解されつつある(DeGroote，M.A.ら，P roc．Natl．Acad．Sci．USA，92:6399-6403（1995）；Stamler，J．S.，Cell，7 8:931-936(1994))。また、タンパク質中の-SNO基が、おそらくはリン酸化と同様 のシグナル伝達機能を果たすという可能性も考慮されている（Stamler，J.S．ら ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:444-448（1992）；Stamler，J.S.，Cell，7 8:931-926(1994)）。タンパク質のＳ−ニトロシル化はタンパク質機能を調節す ることができるが（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:444-4 48（1992）；Stamler，J.S.，Cell，78:931-936(1994)）、細胞内でのＳ−ニト ロソタンパク質の同定（調節的翻訳後修飾の必須条件）は、これまでのところ実 証されていない。 ヘモグロビンは２つのアルファサブユニットと２つのベータサブユニットから なる四量体である。ヒトHbでは、各サブユニットが１つのヘムを含有し、ベータ （β）サブユニットは反応性の高いSH基（cys β93）をも含有する(Olson，J.S. ，Meth．in Enzymology，76:631-651（1981）；Antonini,E．およびBrunori，M ．Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands（American Els evier Publishing Co.，Inc.，ニューヨーク）の29〜31頁(1971))。これらのシ ステイン残基は、その機能はまだ不明であるが、種間で高度に保存されている。 NO（一酸化窒素）は、数ある機能の中でも特に血圧を下げ血小板機能を阻害す る生物学的「伝達分子」である。NOは内皮から血管平滑筋および血小板へ自由に 拡散し、神経単位のシナプスを横切って生理的反応を引き起こす。条件によって は、NOと細胞および血清中に存在する他の成分との反応によって、毒性の中間体 と産物が、感染性生物の増殖を阻害するのに有効な組織内局所濃度で生成しうる 。したがって、NO又はその生理活性型の有効濃度を投与する方法は、ある種の医 学的障害に有益であろうと考えることができる。 血小板活性化は、血液凝固および血栓症素因の本質的な要素である。また、血 小板の活性化は、局所的な血栓症が痛みを伴う発症の中枢であると考えられる鎌 状赤血球症などの血液異常において見られる。したがって、血小板凝集の阻害は 、心臓発作、鼓動、末梢血管疾患およびショック（転移血管内凝集）における重 要な治療目標である。研究者らは、前記疾患段階の全てにおける酸素送達を促進 するために人工ヘモグロビンを与える試みをなしている。しかしながら、最近オ ルソン（Olson）および共同研究者らによって指摘されたように、非誘導ヘモグ ロビンの投与は、血管損傷部位での血小板活性化を導く（オルソン，Ｓ．Ｂ．(O lson，S．b.)ら、Circulation 93:327-332（1996））。この主要な問題は、専門 家を、無細胞非誘導ヘモグロビンが血管疾患または凝固異常を有する患者におけ る重大な危険を提起すると結論する方向に導いている（マーカス，Ａ．Ｊ．（Ma rcus，A．J.）およびＪ．Ｂ．ブロークマン(J．B．Broekman)、Circulation 93: 208-209（1996））。新規な酸素キャリアーの提供方法および／または血小板活 性化の阻害方法は、血管疾患を有する患者またはさもなければ血栓症の危険のあ る患者に利益があるであろう。発明の概要 本発明は、ヘムの酸化を回避する方法におけるＨｂとＳ−ニトロソチオールと の反応による、ＳＮＯ−Ｈｂの生成方法に関する。また、本発明は、該方法の工 程に依存して、ヘムのＦｅが酸化されてもよく、または酸化されなくてもよいヘ モグロビンのニトロソ化誘導体（チオールまたは金属でのニトロシル化を含む） およびニトロ化誘導体の製造方法を含む。また、本発明は、酸素を送り込むこと 、遊離ラジカルを捕捉すること、または組織にＮＯ+を放出することが望ましい 状態に対する治療方法に関する。その様々な型およびその組合せのＳＮＯ−Ｈｂ （オキシ、デオキシ、メト、具体的にはＳ−ニトロシル化、または様々な程度で のニトロソ化もしくはニトロ化）は、これらの方法において動物またはヒトに投 与し得る。また、チオールおよび／またはＮＯ供与剤を投与して、ＮＯ+基の転 移を促進することができる。ヘモグロビンのニトロソ化型もしくはニトロ化型に よる処置対象の状態の具体例としては、虚血損傷、高血圧、アンギナ、再灌流損 傷および炎症ならびに血栓症によって特徴付けられる疾患などがあげられる。図面の簡単な説明 図1A〜1Dは、実施例１に記載の異なる型のHbの分光グラフである。 図2Aは、Ｓ−ニトロシル化によるSNO-Hbの生成を経時的に示すグラフである。 図2Bは、オキシ型およびデオキシ型SNO-Hbの分解を経時的に示すグラフである 。 図3Aは、赤血球に対するＳ−ニトロソシステインの負荷を経時的に示すグラフ である。挿入図は、実施例３に記載するHbの形態の一連の分光グラフである。 図3Bは、ウサギ大動脈環を実施例３に記載の種々の薬剤で処理した後に、その 大動脈環の等尺性緊張（isometric tone）を記録した一連の軌跡である。 図4Aは、実験に使用したHbの濃度に対するウサギ大動脈環の張力の変化を表わ すグラフである。 図4Bは、実験に使用したHbの濃度に対するウサギ大動脈環の張力の変化を表わ すグラフであり、ここでは、グルタチオンをも加えて、その効果を図4Aと比較検 討した。 図4Cは、時間に対する生成Ｓ−ニトロソグルタチオン/出発SNO-Hb濃度の比を 表わすグラフであり、オキシ型およびメト型HbからグルタチオンへのNO基転移の 速度を示している。 図4Dは、負荷赤血球から輸出されたＳ−ニトロソチオール種の経時変化を表わ すグラフである。 図５は、様々な用量のオキシHb（▲）、SNO-オキシHb（■）またはSNO-メトHb （●）を与えた後のラットの平均動脈血圧を示すグラフである。 図6A〜6Fは、麻酔した犬にＳ−ニトロソヘモグロビンを投与した後の、血圧（ 図6Aおよび6B）、冠状動脈直径（図6Cおよび6D）および冠状動脈流量（図6Eおよ び6F）を記録した一連の軌跡である。 図７Ａは、血小板凝集における非修飾ＨｂＡ0の効果を図示したグラフである 。血小板の凝集の最大の範囲は、血小板とプレインキュベートされたＨｂＡ（１ ０ｎＭ〜１００μＭ）の濃度に対してプロットされている。実験は、実施例９の ように行なわれた。各データポイントでプロットされた垂直の棒は、標準偏差を 示している。 図７Ｂは、血小板凝集におけるＳ−ニトロソ（オキシ）ヘモグロビンの効果を 図示したグラフである。血小板の凝集の正規化した最大の範囲は、血小板とプレ インキュベートされたＨｂＡ（１０ｎＭ〜１００μＭ）の濃度に対してプロット されている。 図７Ｃは、Ｓ−ニトロソ（メト）ヘモグロビンによる血小板の抗凝集効果を図 示したグラフである。 図８は、実施例１０でアッセイされた、１０8個の血小板と相互作用する１、 １０および１００μＭ濃度の天然Ｈｂ、ＳＮＯ−オキシＨｂまたはＳＮＯ−メト Ｈｂに対するｃＧＭＰ（グアノシン３’，５’−サイクリックリン酸）の量を示 す棒グラフである。 図９Ａは、実施例１１記載のように処置されたＨｂＡ0のスペクトル（吸光度 対ナノメーターでの波長）を示すグラフである。スペクトルＡと比較したスペク トルＢの最大吸光度の波長におけるシフトは、ＨｂＡ0へのＮＯ基の付加の程度 を図示する。 図９Ｂは、実施例１１記載の１００倍過剰のＳ−ニトロソグルタチオンで処置 されたＨｂのスペクトルを示すグラフである。 図９Ｃは、実施例１１記載の過剰のＳ−ニトロソシステインで処置されたＨｂ Ａ0のスペクトルを示すグラフである。 図９Ｄは、１００倍過剰のＳ−ニトロソシステインで処置されたラットＨｂの スペクトルを示すグラフである。スペクトルＡは、さらに亜ジチオン酸塩で処理 されなかったニトロソ化Ｈｂを示す；スペクトルＢは、さらに亜ジチオン酸塩で 処理されたニトロソ化Ｈｂを示す。 図９Ｅは、１００倍過剰のＳ−ニトロソシステイン（上の曲線）または１０倍 過剰のＳ−ニトロソシステイン（真ん中の曲線）のいずれかとＨｂＡ0を反応さ せることによる、時間とニトロソ化Ｈｂ産物の増加とを図示したグラフである。 ＨｂＡ0を、１００μＭのイノシトールヘキサホスフェートとプレインキュベー トしたのちに、１０倍過剰のＳ−ニトロソシステインと反応させた（下の曲線、 三角形のポイント）（実施例１１参照）。 図１０は、○：１００ｎｍｏｌ／ｋｇ ＳＮＯ−Ｈｂ、●：１０００ｎｍｏｌ ／ｋｇ ＳＮＯ−Ｈｂ、または■：１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ 非誘導Ｈｂでのラ ットの注射ののちのラットの尾状核被殻において測定された血液流における、時 間とパーセンテージの変化とを図示したグラフである（実施例１２参照）。 図１１は、試験されたヘモグロビンのモル濃度の対数の関数としてプロットさ れた、ウサギ由来の大動脈環の張力におけるパーセンテージの変化を図示したグ ラフである（実施例１３参照）。●：ＣＹＳＮＯ／Ｈｂが１：１の比でＳ−ニト ロソシステインで処置されたＨｂ、○：ＣＹＳＮＯ／Ｈｂが１０：１の比でＣＹ ＳＮＯで処置されたＨｂ、◆：１００：１の比でＣＹＳＮＯで処置されたＨｂ。発明の詳細な説明 生理学に関するヘモグロビンの役割 肺循環路（右心室インポート（inport）−左心室）を横切って起こる赤血球の SNO-Hb含量の増大は、Hb分子が肺でＳ−ニトロシル化されることを示唆している 。肺（Gastonら，(1993)）と血液（Scharfstein，J．S.ら，J．Clin．Imvest．9 4:1432-1439(1995)）に認められる内因性RSNOからHbのSH基へのNO基の選択的転 移は、これらの発見を実証するものである。それにもかかわらず、生体内で機能 するＳ−ニトロシル化の機構はわかっていない。肺床を横切って起こるHb（FeII ）NOレベルの対応する減少は、NOの除去またはヘムからcys β93への分子内転移 に関する肺の役割を示す。総合すると、これらのデータは、COとCO2の排出およ びO2の取り込みを含むことが既に知られている呼吸器系内の小分子とHbとの機能 調節的相互作用のリストを拡大することになる。Hbの酸素化は、cys β93のNOに 関連する反応性を増大させる構造変化をもたらすので、O2はHb Ｓ−ニトロシル 化のアロステリックエフェクターであると見なすことができる。これは、このタ ンパク質に関して新たに発見されたアロステリック機能である。 SNO-Hb濃度の動脈- 静脈差は、このタンパク質が全身循環系でNO基供与体とし て作用することを示唆している。SNO-Hbが血管運動の緊張状態（vasomotor tone ）を調節する機能を果たすことは十分に示されている。血圧の制御が行われる微 小循環系では、赤血球が内皮表面と緊密に接触する。これらの条件下で、Hbは脈 管構造に作用して、遊離NOの定常状態レベルを急激に減少させることにより動脈 抵抗が増大しやすい状態にすることができる（Lancaster，J．R.，(1994)）。こ の原理は、無細胞Hbを点滴した時に起こる血圧の上昇に寄与すると考えられる（ Vogel，W.M．ら，Am．J．Physiol.，251:H413-420(1986); Olsen，S.B．ら，Cir culation 93:329-332（1996））。しかし、このような一過性の高血圧応答は、 それに続いてSNO-Hbが生成し、それがこの効果を打ち消すこと（これは天然に存 在する濃度における血圧の低下によって証明される）と一致するだろう。したが って、SNO-Hbの合成と代謝を支持するという赤血球の能力は、正常な血流にとっ て重要だと言えるだろう。 この方向の推論から、哺乳動物は微小循環系で十分なNO送達を確保するために ユニークな分子機構を採用したはずだと考えられる。本発明中の結果は、Hbが、 NOホメオスタシスを達成するために、電子的切替え機構とコンフォメーション的 切替機構の両方を発展させたことを示唆している。具体的に述べると、SNO-Hb（ FeII）O2の金属中心によるNO捕捉は、そのメト（FeIII）への変換によって感知 されるだろう（図1B）。この電子的事象は、NO基の放出を伴うSNO-Hbの分解をも たらすだろう（図3A、3B、4A）。このようにして、SNO-HbのNO関連活性は、捕捉 されたNOの量によって部分的に決定されるだろう。NOの放出が脱酸素化によって 促進されることが観察されたので、O2圧の変化はNOの送達を調節する機能をも果 たすのかもしれない。このアロステリック効果は、組識のO2不足を制限するよう に働くのもしれない。このモデルによれば、NO基の放出は毛細管血流を調節して O2送達が増大するように作用するだろう。 タンパク質中のＳ−ニトロソチオール基は、NOの代謝および細胞機能の調節と 関連付けられている（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:444 -448（1992）；Stamler，J.S.，Cell，78:931-936(1994)）。赤血球中のSNO-Hb の同定は、細胞内Ｓ−ニトロソタンパク質の最初の証明であり、細胞調節に関す るかかる蛋白質の役割をさらに確信させるものである。放出された遊離のNOがHb 自身によって即座に捕捉される場合(Lancaster，J.R.，(1994))、SNO-Hbがどの ようにして血管を弛緩させるのかという疑問が生じる。これについては、RSNO活 性がチオール受容体へのニトロシル（NO+）転移を伴う（これはNO関連活性を金 属中心での不活化から保護する機能を果たす）ことを示す研究(Scharfstein，J. S．ら，(1994); Arnelle，D．R.およびStamler，J.S.，Arch．Biochem．Biophys ．318;279-285（1995）；Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89: 7674-7677(1992))が注目に値する。本明細書に示した発見は、グルタチオンとの Ｓ−ニトロソチオール/チオール交換（GSNOが生成する）が赤血球内で起こるら しいこと、そしてそれがヘムの酸化状態とリガンドによるその占有によって左 右されるらしいことを示している。デグルート（DeGroote）とその共同研究者ら は、GSNOが細菌で一定の活性を発揮するには、無傷のジペプチド（すなわちＳ− ニトロソシステイニルグリシン）がその細胞膜を横切って輸送される必要がある ことを示した（DeGroote，M.A.ら，(1995)）。本明細書に示すデータは、この枠 組みを、真核細胞をも含むように広げるものである。EDRFによるカリウムチャン ネルのチオール依存的活性化が報告されていることから（Bolotina，V.M.ら，Na ture，368:850-853(1994)）、赤血球によって輸出されるGSNOや関連するチオー ル運搬体（Kondo，T．ら、Methods in Enzymology，Packer，L.編，Academic Pr ess，252:72-83(1995)）も、原形質膜内または原形質膜でシグナル伝達を起こす のかもしれない（Stamler，J.S.，Cell，78:931-936(1994)）。もう１つの可能 性も考慮する価値がある。すなわち、Hbがcys β93を介して赤血球膜と会合する という報告(Salhany，J．M.およびGaines，K．C.，Trends in Biochem．Sci.， １月，13〜15(1981))は、接触している内皮表面に対して、おそらくはSNO/SH交 換によって、NO基を直接供与するような位置に、Hbを置くことになるだろう。他 のＳ−ニトロソタンパク質によって媒介されるシグナル伝達では、細胞表面相互 作用が機能しているようである（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，89:444-448（1992）；Stamler，J.S.，Cell，78:931-936(1994)）。 高度に保存されたHbのcys β93残基は、金属中心の酸素化と酸化傾向に影響を 及ぼすことが示されており、またこのタンパク質の物理化学的性質にも影響する ことが示されている(Garel，C．ら，Biochem．123:513-519(1982)；Jocelyn，P. C.，ら，Biochemistry of the SH Group，243頁，Academic Press，London; (19 72); Craescu，C.T.，J．Biol．Chem．261:14710-14716(1986); Mansouri，A.， Biochem．Biophys．Res．Commun.，89:441-447(1979))。それにもかかわらず、 長年探究されてきたそれらの生理学的機能はまだ謎のままである。本明細書に記 載の研究は、cys β93がNO関連シグナルを血管壁に伝達する機能を果たすという 、Hbの新しい感知および調節機能を示唆している。具体的に述べると、すべ ての哺乳類と鳥類に共通するcys β93の生理学的機能は、アロステリック制御の 下に、ヘムによって捕捉され得ないNO関連生理活性を送達することである。した がって、これらのデータは、赤血球内Hbがその回路の微環境によってシンク（吸 収体）としてもドナー（供与体）としても参加する、NO基の動的回路を明らかに するものである。このような観察結果は、遊離NOの拡散的な分布と反応のみに基 づく概念的骨格（Lancaster，J.R.，(1994)；WoodおよびGarthwaite，(1994)） から生じるパラドックスに解答を与え得る。またこれは、一酸化窒素シンターゼ やグアニル酸シクラーゼなどの他のチオールおよび金属含有（ヘム）タンパク質 にも及ぶ意味を包含し得る。 本明細書に報告する発見は、直接的な治療的意味を持ちうる。すなわち、血中 Hbによる不活化ゆえのNO関連活性の喪失に関する懸念（Lancaster，J.R.,(1994) ）は、アロステリック制御を受けるRSNOの存在によって回避される。SNO-Hbは、 金属中心におけるNO捕捉がもたらす無細胞Hb調製品の有害な高血圧特性を持たな い。SNO-Hbを含有することによって血液を模倣する無細胞Hb溶液は、代用血液と して使用することができる。その他の態様 本発明の主題は、ニトロソ化剤を細胞に負荷する方法に関し、これを赤血球に 関して図3Aに例示するが、本発明の方法は、より普遍的な方法で行なうことがで きる。好適なインキュベーションのpH条件とインキュベーションの温度条件は、 例えばpH範囲７〜９（pH 8が好ましい）、温度範囲25〜37℃である。赤血球につ いては、Ｓ−ニトロシル型Hbの生成を制限するために、１〜３分の短いインキュ ベーション時間が好ましい。しかし、ニトロソ化剤の細胞内濃度は1 mMに達しう る。 ニトロソ化剤はNO+の良好な供与体であり、かつ、標的とする細胞タイプの細 胞膜を通過して拡散しうるべきである。すなわち、Ｓ−ニトロソタンパク質とは 対照的に低分子量でなければならない。Ｓ−ニトロソ-N-アセチルシステイン、 Ｓ−ニトロソシステイニルグリシン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソホ モシステイン、有機硝酸、有機亜硝酸、金属ニトロシル錯体その他、Methods in Nitric Oxide Research（Freelisch，M．およびStamler，J.S．編；Wiley,英国 チチェスター（1996））の71〜119 頁「Donors of Nitrogen Oxides」（この章 の内容はすべて参照により本明細書に合体される）に定義されるニトロソ化剤が その例である。ニトロソ化剤は金属含有タンパク質上の異なる反応基に対して異 なる活性を持つ。ニトロソ化剤は、Hbのヘム鉄の酸化が最小となり、システイン 上に認められるようなチオール基をニトロシル化する活性が最大となるように選 択することができる。 これらの低分子量ニトロソ化剤を赤血球中で使用することにより、NO関連活性 を組識に送達することができる。さらに、ニトロソ化剤による赤血球の処理は、 赤血球のO2送達能を増大させるのにも役立つ。また、このような赤血球の処理に より、循環系中で酸素フリーラジカルを捕捉することも見込まれる。したがって 、例えば（赤血球を単離する最小限の方法として）患者から全血を採取した後、 その患者の体外での操作によって赤血球にＳ−ニトロソロチオールを負荷し、該 赤血球を同じ患者に再導入することができ、それにより、組識の異常なO2代謝、 酸素関連毒性、異常な血管緊張、異常な赤血球接着、または赤血球による異常な O2送達を特徴とするようないくつかのタイプの疾患および医学的障害を治療する ことができる。かかる疾患には、虚血性損傷、高血圧症、ショック、アンギナ、 発作、再潅流損傷、急性肺損傷、鎌状赤血球貧血、住血吸虫症、マラリアなどが あるが、これらに限るわけではない。かかる「負荷」赤血球の使用は、例えば代 用血液療法や、移植用器官などの生きた器官の保存にも及ぶ。場合によっては、 別人に由来する負荷赤血球で患者を処置することが適当なこともあるだろう。 本明細書では、この処置法の作用機序の具体例として、鎌状赤血球貧血を考察 する。鎌状赤血球患者は、急性胸部症候群や肝機能不全などの臨床的症候群とし て顕在化する血管閉塞性クリーゼをしばしば起こす。凝血体質をもたらす内皮細 胞機能不全と赤血球に内在する機能不全は共に、主要な病因である。分子レベル では、VCAMのような血管接着分子の発現が増大して、異常なヘモグロビンを含有 する鎌状赤血球の接着を促進する。したがって、内皮細胞でのサイトカイン発現 を減じ、内皮機能を増進し、赤血球の鎌状化を減衰させることが、主要な治療目 的となる。しかし、現在用いられている治療法は概して不成功に終わっている。 赤血球に細胞内NO供与体S−ニトロソチオール類を負荷するこの新規方法には 、酸素親和力を増大させ（これはそれ自体またそれだけで赤血球の鎌状化を減衰 させるはずである）、赤血球に血管拡張活性と抗血小板活性（これらは血管閉塞 性クリーゼを反転させるはずである）を与えるという効果がある。さらに、一酸 化窒素は、内皮細胞表面での接着分子の発現を減じることにより、内皮機能を回 復させるはずである。 本明細書には、Ｓ−ニトロソチオール類その他のニトロソ化剤を赤血球に負荷 することを伴う鎌状赤血球病の治療の新規治療法の手掛かりを記述する。２例の 治療法を挙げる。第１の治療法では、患者自身の赤血球を体外でＳ−ニトロシル 化し（これにより「負荷」赤血球を得る）、次いでその患者に与える。第２の方 法は、赤血球に浸透できるＳ−ニトロソシステインのような薬剤を患者に直接投 与することである。 いくつかの疾患または障害には、NO負荷赤血球の投与が特に望ましい。酸素化 状態から脱酸素化状態に変化すると、あるいはヘム鉄の酸化状態が還元された状 態（FeII）から酸化された（FeIII）状態に変化すると、NOがヘモグロビンのチ オール基から放出され、それが速やかにグルタチオンに転移して、Ｓ−ニトロソ グルタチオンが生成する。赤血球は高濃度のグルタチオンを含むことが知られて いる。Ｓ−ニトロソグルタチオンはNOを効率よく組識に送達する。 もう１つの側面として、本発明は、薬剤の標的となる細胞内でチオール基のＳ −ニトロシル化を引き起こす薬剤を、感染した哺乳動物に投与することによる、 感染症の治療法でもある。例えば、リンパ球への浸透性が高いＳ−ニトロソチオ ールを、HIV に感染した患者に投与することができる。HIV に対するこのような 処置は、患者から単離した血液に対して生体外で用いることもできる。もう１つ の応用では、感染が細菌感染であり、抗細菌剤として使用するＳ−ニトロソチオ ールは、宿主細胞への浸透性と比較して、標的細菌細胞への浸透性が非常に高い ものである（例えばDeGroote，M.A.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:6399-6 403（1995）を参照のこと）。別法として、ニトロソチオール類を赤血球内の熱 帯熱マラリア原虫の処理に使用することもできる。 本発明のもう１つの態様は、１以上の金属原子を含有するタンパク質を、その 金属の酸化状態を変えたり、その金属原子にNOを結合させるなどの修飾をその金 属に加えることなく、そのタンパク質が１以上のチオール基でＳ−ニトロシル化 されるように、特異的に修飾する方法である。これは、金属に結合したタンパク 質のチオール基と特異的に反応するニトロソチオール類のようなNO+特性を持つ 試薬（例えば実施例4A参照）を使用することによって達成できる。 ヘモグロビンの場合、このニトロソ化法はそのヘムに作用しない。SNO-Hb（SN O-Hb（FeII）O2）は、四量体あたり２つまでのSNO 基とHb（FeII）O2から、ヘム FeをFeIIからFeIIIに酸化することなく合成することができる。これに対し、Hb （FeII）O2を過剰の一酸化窒素または亜硝酸塩と共にインキュベートすると、メ トヘモグロビン（HbFe［III］）が迅速（実施例1B）かつ有意な程度に生成する 。Hb［FeII］を一酸化窒素と共にインキュベートすると、NOがヘムにすばやく結 合し、Hb（FeII）NOが有意な程度に生成する（実施例1A）。 Hb（FeII）O2からSNO-Hb（FeII）O2が生成する速度はさらに速いが（実施例2A 参照）、例えば実施例1CのようにＳ−ニトロソグルタチオンやＳ−ニトロソシス テインをHb（FeII）と共にインキュベートしてSNO-Hb（FeII）を得るなどにより 、対応するSNO-デオキシHb型を得ることもできる。 血管拡張に対する種々の形態のHbの効果（収縮効果、拡張効果または中性効果 ）は、次の３つの要因に依存する：１）ヘムのFeが酸化されているかどうか、２ ）ヘムにO2が結合しているかどうか（すなわち、タンパク質のコンフォメーショ ンがＲ状態にあるか、Ｔ状態にあるかによって決まる酸素化状態）および３）チ オールがNO+の転移を促進するに足る濃度で存在するかどうか。 第１の要因の重要性は図4Aに示されている。Hb（FeII）O2とSNO-Hb［FeII］O2 は血管収縮因子として作用するが、SNO-Hb［FeIII］（FeIIがFeIIIに酸化された メト型）は血管拡張因子として作用する。図4Aは、ヘムに結合した酸素を持ちSN O/Hb比が２であるSNO-Hb［FeII］O2が強力な血管収縮因子として作用することを 示している。 SNO-Hb（FeII）も血管拡張因子である。図2Bは、第２の要因を説明するもので あり、RSNOの分解および転移速度が、オキシ状態にあるSNO-Hbよりもデオキシ状 態にあるSNO-Hbの方がはるかに速いことを示している。 SNO-HbのNO+供与特性が酸素濃度にどのように依存するかがわかる。SNO-Hbは 酸素濃度の低い部位または酸化条件下にある部位で酸素を放出する。SNO-Hbはそ のNO基を放出して、１）ヘムFeのFeIIIへの酸化または２）脱酸素化によるヘム からのO2の喪失のいずれかによる血管拡張を引き起こす。図2Bには、NOがデオキ シ状態でもっともよくSNO-Hbから転移除去されることが示されている。虚血では 、SNO-Hbが脱酸素化し、その後速やかにNOの喪失が起こる。このデータから、1S NO/SNO- メトHbの比を持つSNO-メトHbは、2SNO/SNO- オキシHbの比を持つSNO-オ キシHbより強力な血管拡張因子であることがわかる。HbのＳ−ニトロシル化がR 状態（オキシコンフォメーション）を誘導することに注目すべきである。したが って、1SNO/SNO- オキシHbの比を持つ１つのSNO-オキシHb分子は、0.1SNO/SNO- オキシHbの比を持つ10分子のSNO-オキシHbより効力が弱いことになる。 第３の要因は図4Bに示す結果によって例証される。これらの結果は、SNO-Hb（ FeII）O2とSNO-Hb（FeIII）の血管拡張因子効果のチオールによる増強を証明し て いる。SNO-Hbから低分子量ニトロソチオール類へのNO+の転移は、Hbがオキシ状 態にあるときと比べてデオキシ状態にあるときの方が効率がよく（図2B）、また 、オキシ状態にあるときと比べてメト状態にあるときの方が効率がよい（図4C） 。 NOは、SNO-HbからNO+（ニトロシルカチオン）として放出または転移される。S NO-HbのSNO 基はNO+特性を持つ。SNO-HbからのNO+の転移は、グルタチオンなど の小さなチオール類に対して最も効率よく起こり、ヘムが酸化されている場合（ SNO-メトHb）または該SNO-Hbがデオキシ状態にある場合に最も効率がよい。 これらの発見がもたらす本発明の一態様は、小分子量チオール類をある形態の SNO-Hbと共に、NOの生理作用を必要とする哺乳動物に同時投与することにより、 SNO-Hbから小さなチオール種へのNO+の転移を増大させ、それによって組識にNO 生理活性を送達する治療法である。NO放出の効果をさらに増大させるためには、 メトHbまたはデオキシHb（または等価なコンフォメーションまたはスピン状態） のSNO-型をチオールと共に投与することが好ましい（例えば図2Bを参照のこと） 。SNO-メトHbとSNO-オキシHbの混合物、およびさらにチオールをも含む混合物を 使用することもできる。これら成分の組成および比率は、その疾患状態に依存す る。例えば、O2送達とNO送達の両方を増大させるには、SNO-オキシHbを使用する ことができる。例えば急性呼吸障害症候群のように、O2のさらなる送達が望まし くない場合は、メトHbおよびデオキシHbのSNO-型が特に好ましい。別法として、 SNO/Hbの比率を調節することによって、O2放出を調節することもできる。 図4Aの血管環バイオアッセイのデータは、図５のイン・ビボのデータとよく一 致している。実施例５に記載の実験の結果から、Hb（FeII）O2（オキシHb）がイ ン・ビトロと同様にイン・ビボでも血圧の上昇を引き起こすことが確認される。 SNO-Hb（FeIII）（SNO-メトHb）は、イン・ビトロおよびイン・ビボで血圧の低 下を引き起こす。SNO-Hb（FeII）O2（SNO-オキシHb）は、対応する血管環バイオ アッセイで認められた張力の増大とは対照的に、イン・ビボでは血圧に対して無 視 しうる程度の効果しか持たない。SNO-オキシHbの場合、そのイン・ビボの効果は 中性である。これは、ヘムに結合されることになるNOが引き起こす収縮効果が、 脱酸素化時のNOの放出によって相殺されるということによって説明できる。した がって、SNO-オキシHbは血圧に最小限の効果しか与えずにO2を送達することがで きる。 本明細書に記載の結果を知れば、血管に対して収縮効果または拡張効果を持つ 、あるいは血管に対して何の効果も持たない、予測されたNO放出特性を持つHbタ ンパク質を合成することができる。もう１つの選択は、酸素化型を作製して、そ れをO2送達が望ましい医学的状態に投与するか、脱酸素化型を作製して、それを O2送達が望ましくない医学的状態に投与するかの選択である。 特定の望ましいO2およびNO送達特性を持つ様々な修飾Hbを生産することができ る。例えば、Ｒ状態にあるHbまたはＲ構造（オキシHb）は、いくつかの既知の方 法により、Ｔ状態またはＴ構造（デオキシHb）に変換することができる。これは 、例えばイノシトール六リン酸とHbとの反応によって行なうことができる。また 当業者には、例えばカルボキシペプチダーゼでHbを処理することなどにより、Ｒ 状態にあるHbを製造できることも知られている。同様に、フェリシアン化物や亜 硝酸塩を使用してメトHbを合成できることも知られている。 Ｔ状態に固定されたHb分子の製造は、NOの運搬体よりはむしろNOの生理活性供 与体の形態で存続するRSNO-Hb の合成を可能にする。Ｒ状態に固定されたHbは、 １分子あたりに最大量のNOを保持するRSNO-Hb を合成するための基質として使用 できる。 本発明のもう１つの態様は、O2放出とNO放出を制御するために、Hbの１以上の チオール基が、ある程度に、特異的にＳ−ニトロシル化されている１以上の形態 のHbからなる代用血液である。処置されるべき状態には、NOもしくはO2送達が望 まれる状態、NOもしくはO2利用が望まれる状態、またはNOもしくはO2が過剰な状 態がある。例えば、過剰な酸素フリーラジカルと過剰なNO・の存在を特徴とする 医学的状態では、SNO-HbのヘムとSNO-Hbによって放出されるNOの両方が、酸素フ リーラジカルを捕捉するのに役立つ。ヘムFeは酸素フリーラジカルとNO・を捕捉 する過程で酸化され、NOはチオールへの供与によって酸化型Hbからの非毒性RSNO+ の形で放出される。例えば炎症と再潅流損傷は、過剰なNO生産と過剰な酸素フ リーラジカルを特徴とする。種々の形態のHbは酸素ラジカルと遊離NOを捕捉し、 NOを毒性でない形態に変換する。 本発明のさらなる態様は、ニトロソ化Hb型からなる代用血液の投与に基づく、 生理活性型のNOもしくはO2の送達またはその両方が有益な状態の治療法である。 例えば、SNO-Hbは心筋梗塞の処置に有用である。SNO-HbはNOを供与し、血管を広 げておく効果を有する。SNO-Hbは低酸素圧で脱酸素化して、酸素を送達すると共 に同じ部位でNOを放出し、それによって血管拡張を引き起こす（例えば実施例７ および図6A〜6Fを参照のこと）。SNO-Hbの投与と同時に、またはその前後に、チ オールを投与することによっても、これらの効果を増大させることができる。例 えば、心筋梗塞を処置する目的には、低いSNO/SNO-Hb比を持つ高濃度または高投 与量のSNO-Hbがふさわしい。別法として、SNO-メトHbをこの目的に使用すること もできる。 もう１つの側面として、本発明は、SNO-Hbまたは他の型のニトロソ化Ｈｂを、 そうしなければＳ−ニトロシル化されていないHbにおけるオキシHbからメトHbへ の変換によって消費されるであろうニトロソ血管拡張薬（例えばニトログリセリ ン）と同時投与することにより、NO供与体療法を強化する方法でもある。 血小板活性化は、多数の事象および血小板の内皮下層などの非血小板表面への 粘着に応答して起きる反応によって明らかにされる。膜リン脂質を加水分解する 一連の事象の進行におけるトロンビン、エピネフリンまたはコラーゲンのセット などのアゴニストの結合は、アデニル酸シクラーゼを阻害し、細胞内カルシウム に移動性を持たせ、非常に不可欠な細胞内蛋白質をリン酸化する。活性化に続い て、血小板は、その顆粒含有物を血漿に分泌し、次に近接した血小板の止血栓へ の結合を許容させる（Harrison's Principles of Internal Medicine，第１２版 、Ｊ．Ｄ．ウィルソン，(J．D．Wilsson,)ら編、マクグロー−ヒル社(McGraw-Hi ll，Inc.)、ニューヨーク、１９９１参照）。 血栓は、血管または心臓中に形成された血の病理学的な凝固である。それは、 その最初の位置に付着したままでもよいし、または今まであった位置から移動し 、循環系内の新規な部位に移動してもよい。血栓塞栓症は、今まであった位置か ら移動した血栓または血栓の一部が部分的にまたは完全に血管を閉塞し、影響が 及ぼされた組織への酸素輸送を妨げる時に起こり、ついには組織壊死を生じる。 傷害が血管の表面に起こっている部位は、特に血栓の形成を受けやすい。これ らの部位としては、内皮への傷害、血管の狭くなったところもしくは血管の狭窄 、またはアテローム性動脈硬化症プラーク蓄積が起きている血管の内部表面にあ る部位があげられる。 ＮＯは、血栓形成の初期段階を調節する生理学的物質として定義されるいくつ かの内皮由来血栓制御因子の１つである。特に、ＮＯは、考えられるに、血小板 グアニル酸シクラーゼを活性化することにより、内皮細胞表面における血小板粘 着、活性化および補充を減少させ、これを達成し、それによって、血小板細胞内 ｃＧＭＰを増加させ（スタンラー，Ｊ．Ｓ．(Stamler，J．S.)ら、Circ．Res．6 5:789-795(1989)）、Ｃａ2+レベルを減少させる。ＮＯおよびプロスタサイクリ ン(prostacylcin)プロスタグランジン（ＰＧ）Ｉ2は、共同的に作用して、内皮 下層マトリックスのコラーゲン繊維からの血小板解離を阻害および積極的に媒介 する。また、プロスタサイクリンと違い、ＮＯは、血小板粘着を阻害する。さら に、血小板はＮＯを合成し、Ｌ−アルギニン−ＮＯ経路は、内在性の負のフィー ドバック機構として作用して、血小板反応性を制御する。ＮＯは、白血球と血管 壁との相互作用に伴われ、好中球凝集を阻害し得る（review article、デービス ，Ｍ．Ｇ．（Davies，M．G.）ら、British Journal of Surgeny 82:1598-1610(1 995)参照）。 ＮＯは、多数の方法において抗アテローム形成である（例えば、キャンディパ ン，Ｒ．Ｃ．（Candipan，R．C.）ら、Arterioscler．Thromb．Vasc．Biol．16: 44-50，1996．）。ＮＯは、平滑筋増殖を阻害し、ＬＤＬ（低密度リポ蛋白質） 酸化および他のオキシダント関連過程を弱める。 ヘモグロビンは、そのＮＯ捕捉特性の結果としてアテローム性動脈硬化症なら びに血栓症を促進する。このヘモグロビンの限界は、一酸化窒素に対する高い親 和性から得られる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＮＯは、血小板凝集ならびにコラー ゲン繊維、内皮細胞マトリックスおよび単分子層への粘着の有力な阻害剤である （ラドムスキー，Ｍ．Ｗ．（Radomski，M．W.）ら、Br．J．Pharmacol．92:181- 187（1987）；ラドムスキー，Ｍ．Ｗ．(Radomski，M．W.)ら、Lancet 2:1057-10 58(1987)；ラドムスキー，Ｍ．Ｗ．(Radomski，M．W.)ら、Biochem．Biophys．R es．Commun．148:1482-1489（1987））。ＮＯは、血小板におけるｃＧＭＰレベ ルを上昇させ、それによって、血小板結合フィブリノーゲン分子を減少させ、細 胞内Ｃａ++流動および血小板分泌を阻害する（メリオン，Ｂ．Ｔ．（Mellion，B ．T.）ら、Blood 57:946-955(1981)；メンデルソン，Ｍ．Ｅ．(Mendelson，M．E .)ら、J．Biol．Chem．165:19028-19034（1990）；リーベルマン，Ｅ．（Lieber man，E.）ら、Circ．Res．68:1722-1728(1991)）。Ｈｂによる一酸化窒素の捕捉 は、その分子が血小板を阻害するのを妨げる。この説明は、ｉｎ ｖｉｖｏ研究 により支持されている（クレジシー，Ｋ．(Krejcy，K.)ら、Arterioscler．Thro mb．Vasc．Biol．15:2063-2067（1995））。 図７Ａ〜７Ｃに示された結果（実施例９参照）は、ＳＮＯ−Ｈｂなどのニトロ ソ化ヘモグロビンを、増加した血小板析出、活性化ならびに血栓形成または血小 板および凝固蛋白質の消耗の結果として起きる急性の血液凝固事象の治療に用い 得ることを示している。かかる合併症は、当業者に公知であり、例えば、心筋梗 塞、肺血栓塞栓症、大脳血栓塞栓症、血栓静脈炎および不安定アンギナ、ならび に前述の障害の結果として直接的または間接的いずれかで起きるいかなる追加の 合併症があげられるが、これらに限定されるものではない。 また、ＳＮＯ−Ｈｂおよび他のニトロソ化ヘモグロビンを予防的に用いて、例 えば、血栓症の個人歴もしくは家系図を有する患者、アテローム性動脈硬化性血 管症を有する患者、慢性うっ血性心不全を有する患者、悪性疾患を有する患者、 または妊娠した患者もしくは手術後の固定された患者などの再発の血栓症の危険 のある患者における血栓の発生を妨げることができる。 ＮＯは、ｃＧＭＰを生成する可溶性のグアニル酸シクラーゼを活性することが 知られている。ｃＧＭＰは、血小板凝集の阻害を媒介する。実施例１０の結果は 、この血小板凝集の阻害がｃＧＭＰ単独ではなく、さらにいくつかの他の機構に よって媒介されているかもしれないことを立証している。 特定の化合物または条件は、四量体の２つの可変的な四次構造、Ｔ構造または Ｒ構造のいずれかに対するＨｂのアロステリック平衡遷移におけるシフトを起こ すことが知られている（例えば、ペルツ，Ｍ(Perutz，M.)、Mechanisms of Coop erativity and Allosteric Regulation in Proteins，Cambridge University Pr ess、ケンブリッジ大学、イギリス、１９９０の７〜２８頁参照）。これらは、 例えば、異型のリガンドＨ+、ＣＯ2、２，３−ジホスホグリセリン酸（２，３− ＤＰＧ）およびＣｌ-であり、その濃度は酸素親和性を調節する。異型のリガン ドは、Ｔ構造を特異的に安定化し、強いる追加の水素結合を形成することによっ て酸素親和性を低くする。アロステリック平衡に影響する他の化合物としては、 イノシトールヘキサホスフェート（ＩＨＰ）およびベザフィブレート（bezafibr ate）およびクロフィブレートなどのフィブリン酸誘導体などがあげられる。フ ィブリン酸誘導体、抗脂血症剤は、デオキシヘモグロビンと結合するが、オキシ ヘモグロビンとは結合しないことがわかっている。それらは、ＤＰＧ結合部位と は異なる中央の腔にある部位と結合することによってＴ構造を安定化させる。ベ ザフィブリン酸塩に関連する他のアロステリック因子は、合成されている。Ｒ構 造を特異的に安定化するリガンドは、酸素親和性を増加させ、Ｔ構造を安定化す るリガンドは、逆である。他のリガンドは、ヘムのスピン状態に影響するかもし れない。例えば、デオキシヘモグロビンおよびメトヘモグロビンにおいて、鉄は 高スピン鉄（Ｓ＝２）で、５つ配位結合する；オキシヘモグロビンおよびシアン ーメトＨｂにおいて、鉄は低スピン鉄（Ｓ＝０）で、６つ配位結合する；H2O が ６番目のリガンドであるとき、メトヘモグロビンも高スピンである。図７Ｃにみ られる血小板凝集のＳ−ニトロソ−メトヘモグロビンによる阻害は、高スピンコ ンホメーションにおける促進された能力と一致する。ヘモグロビンのアロステリ ック平衡状態またはスピン状態をコントロールするかかる物質は、ヒトまたは動 物に投与して、特定のアロステリック構造および／またはスピン状態の形成を促 進してもよいし、特定のアロステリック構造および／またはスピン状態を安定化 してもよい。 血小板阻害の目的で、ＮＯを送達するために必要とされるＨｂの投与量を滴定 して、血圧の劇的な変化を生じさせない効果的な量のＮＯが提供される。治療の 目的が酸素を送達することであるならば、Ｈｂは、血圧の低下を回避するために 血液単位で投与してもよい。治療の目的が発作を緩和することであるならば、心 筋梗塞に与えられる量と比較して、ごくわずかのHbしか投与され得ない。心筋梗 塞に与えられる量と比較して、Ｈｂは非常にわずかしか投与されない。発作に対 しては、より重要な目標は、酸素を送達することよりもむしろＮＯを送達するこ とである。好ましくは、連続的注入または１日あたり数回の注入を用いてもよい 。実施例１２（図１０参照）は、ラット脳における血液流でのＳＮＯ−Ｈｂ（Ｆ ｅII）Ｏ2の効果が２０分間にわたって持続することを示す；他の実験において は、効果は１時間までの間みられた。血圧効果および血小板阻害効果の間に相関 があるが、血小板阻害は、血圧効果を生じるために必要とされるよりも低いＮＯ 濃度で起き、一般的により長く続く。 実施例１１は、Ｓ−ニトロソチオールを用いて、ＮＯ基をヘモグロビンのシス テイン残基のチオール基だけでなく、ヘモグロビン分子の他の反応部位にも付加 することができることを示す。実施例１１のニトロソ化反応の生成物は、Ｈｂ四 量体あたり２個以上のＮＯ基を有するヘモグロビン分子であった。ＮＯの付加の 正確な部位は、確かめられていないが、ＮＯ付加が金属などのＨｂ内のチオール 基および様々な他の求核性部位で起きることが期待される。チオール基に関して 、反応部位は、チオシン残基およびアミン、ならびに他の求核性中心である。 他の蛋白質におけるニトロソ化反応は、以前に研究されている（Simon，D．I ．，ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:4736-4741(1996)）。蛋白質を修飾し てニトロソ蛋白質を製造する方法は、当該分野において公知であり、例えば、３ ７℃で１５分間０．５Ｍ ＨＣｌ（酸性化された NO2 -）中でＮａＮＯ2に蛋白質 を曝露する方法などがあげられる。他の方法としては、１００ｍＭリン酸ナトリ ウム、ｐＨ７．４中の蛋白質のヘリウム脱酸素化溶液を透析チューブ内に入れ、 １５分間透析物中にバブリングしたＮＯガスに蛋白質を曝露することである（St amler，J．S．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:444-448(1992)；また、ニト ロソ化のさらなる方法を提供するWilliams，D．L．H．Nitrosation，Cambridge University Press，New York（1988）参照）。 これらの方法により、複数のＮＯ関連修飾（ニトロソ化、ニトロシル化または ニトロ化から得られた「ＮＯ基」または「ＮＯ生物学的等価物」）は、Ｈｂにお いて求核性部位で行なわれ、求核性部位としては、チオール、アルコールにおい てみられるような求核性酸素原子、アミンにおいてみられるような求核性窒素原 子、またはヘム鉄などがあげられてもよい。Ｈｂのニトロソ化、ニトロシル化ま たはニトロ化を促進する作用剤は、「ＮＯまたはＮＯ+供与剤」として考えるこ とができる。かかる修飾の生成物は、例えば、-SNO、-SNO2、-ONO、ONO2、-CNO 、-CNO2、-NNO、-NNO2、-FeNO、-CuNO、-SCuNO、SFeNOなどの基ならびにそれら の異なるイオン化型および酸化派生型などの基を有していてもよい（ヘモグロビ ンのＣｕ++による酸化について、Winterbourne，C.，Biochemistry J．165: 141-148(1977)）。蛋自質におけるＮＯ基のスルフィドリル残基への共有結合は 、Ｓ−ニトロシル化として定義される；ＮＯ基のＦｅなどの金属への共有結合は 、ニトロシル化と呼ばれる。通常の求核中心へのＮＯの結合は、ニトロソ化と呼 ばれる。このように、ニトロソ化ヘモグロビンという用語は、ＳＮＯ−Ｈｂおよ びＨｂ（ＦｅII）ＮＯ、ならびにチオールおよび金属に加えて他の部位でニトロ ソ化された他の型のヘモグロビンを含む。さらに、Ｈｂは、ニトロ化されてもよ い。複数の異なるタイプの求核部位でニトロソ化および／またはニトロ化されて いるＨｂ（それぞれ、ポリニトロソ化、つまりチオールおよび他の求核部位に付 加されたＮＯ等価物を有する；またはポリニトロ化と呼ぶ）は、ニトロソ基転移 反応ならびに循環系における異なる速度および発生する異なる能力でのＮＯおよ びその生物学的等価物放出を可能にする。 これらならびに他のニトロソ化反応およびニトロ化反応は、ある範囲までのへ ムＦｅの酸化を起こすことができる。しかしながら、ある程度の少ない酸化は、 許容可能である。少ない程度までの酸化であれば、ニトロソ化Ｈｂは、いまなお 治療剤として有用である。ニトロソ化ＨｂのＯ2送達機能よりもむしろＮＯ送達 機能がより望ましい適用に対しては、ヘム鉄の広範囲の酸化が許容可能である。 ヘム鉄の酸化を回避することが望ましいならば、ヘムを除去し、蛋白質に対し て必要な化学的反応を行って望ましい範囲までニトロソ化し、ヘムを修飾された ヘモグロビン産物中に再配置することが可能である（ヘムの除去および再配置に ついて、Antonini，E.およびBrunori，M.，Hemoglobin and Myoglobin in their Reactions with Ligands，Elsevier，New York，1971を参照）。 実施例１および２に示したように、低分子量ＲＮＳＯ種への短時間の曝露など のヘムを酸化しない条件下でのニトロソ化に加え、他の方法を用いて、ヘムＦｅ が酸化されないニトロソ化ヘモグロビンを生成することができる。例えば、組み 換え法によってαグロビン鎖およびβグロビン鎖を生成し、それらを所望の程度 までニトロソ化し、次に該鎖をヘムと会合させて機能的ニトロソ化四量体を形成 する（例えば、１９９０年５月１０日に出願され、１９９６年３月１３日に公表 された欧州特許出願ＥＰＯ第７００９９７号、「ヘモグロビンおよびそのアナロ グの細菌および酵母における製造」）。 最終産物としてメトＨｂ型を製造することなく、αグロビン鎖およびβグロビ ン鎖をニトロソ化する他の方法は、無傷のＨｂの分子を所望の程度までニトロソ 化し、それによってヘムＦｅを酸化させ、次にメトヘモグロビンリダクターゼま たはナトリウムシアノボロヒドリド（cyanoborhydride）などのシアノボロヒド リドのいずれかでニトロソ化Ｈｂを処理することによってヘムＦｅを還元する方 法である。 本明細書で使用するヘモグロビンまたはHbという用語には、突然変異型、化学 修飾型、融合タンパク質のような遺伝子改変型、あるいは欠失型などといった変 種型が含まれる。また、あらゆる動物種のHbおよびそれらの変種型も含まれる。 これらの変種Hbの生物学的特性および/または化学的特性は、動物中に天然に認 められるヘモグロビンの特性とは異なってもよい。 NOが生物学的系中で一酸化窒素ガスとしてだけではなく、種々の酸化還元型で も存在し、またＳ−ニトロソタンパク質、Ｓ−ニトロソアミノ酸その他のＳ−ニ トロソチオール種を含みうるＳ−ニトロソチオール類のような、一酸化窒素の生 理活性付加物としても存在することは理解されるだろう（Stamler，J.S.，Cell ，78:931-936(1994)）。 代用血液は、酸素の運搬および/または送達、NOの運搬および/または送達、フ リーラジカルの捕捉などといった、哺乳動物に認められる天然血液の１以上の機 能を果たす生物適合性の液体でありうる。代用血液は、哺乳動物中に注入された 時に天然の血液の１以上の機能を果たすような液体の１以上の成分からなっても よい。代用血液の例には、種々の形態のヘモグロビン製剤がある。かかる製剤は 、ニトロソ基転移を行う、低分子量のチオール、ニトロソチオールまたはＮＯ 供与剤などの他の生理活性成分をも含んでいてもよい。 医学的処置に使用される本発明の化合物と治療用製剤は、当業者が決定できる 適当な組成物中で、治療上の有効量で使用されるものとする。その医学的障害に 冒された部位または系に最も適した投与法は、当該技術分野で知られている。好 適な化合物は、生理活性成分と共に、当業者に公知の担体、安定化剤または不活 性成分を含んでいてもよい。 本発明の目的の「治療上の有効量」という用語は、その意図する目的を達する のに効果的なニトロソ化Ｈｂおよび／またはニトロソ化作用剤の量をいう。個体 によって変化を必要とするが、投与する各化合物の効果的な量の最適範囲の決定 は、当業者の技術の範囲内である。イヌ、ヒヒまたはラットなどの実験動物を用 いて、投与量を決定できる。通常、有効量の組成物または調製物を提供するため に必要な投与量は、当業者によって調整され、レシピエントの年齢、健康、肉体 状態、性、体重、症状の程度、処置の頻度ならびに所望の効果の性質および範囲 に依存して変化する。当業者は、従来の考察を用いることにより（例えば、適当 な従来の薬理学的プロトコルを利用することにより）、特定の患者に対する投与 量を決定することができる。必要ならば、好適な医薬担体を、治療用組成物に使 用する作用成分と混合してもよい。 本発明を以下の実施例でさらにより詳しく説明する。実施例 実施例１：NOおよびRSNOのHbとの相互作用 NOやRSNOなどの天然に存在するN-オキシド（Gaston，B.ら，(1993); Scharfst ein，J.S．ら，J．Clin．Invest.，94:1432-1439（1994）；Clancy，R.M.ら，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA，91:3680-3684（1994））は、Hbとの反応に関して、 著しく異なることが観察された。NOは、極めて迅速にデオキシHb（Hb［FeII］） に結合して比較的安定なHb［FeII］NO錯体を形成し（図1A）、オキシHb（Hb［Fe II］O2）をメトヘモグロビン（Hb［FeIII］）と硝酸塩に変換し（図1B）、過去 の報告（Olson,（1981）；Toothill，C.，Brit．J．Anaesthy.，39:405-412（19 67））を追認している。これに対し、RSNO種は、Hbのスルフヒドリル基とのニト ロソ基転移反応に参加してＳ−ニトロソヘモグロビン（SNO-Hb）を生成すること がわかり、デオキシHbまたはHb（FeII）O2いずれかのヘム中心とは反応しなかっ た（図1Cおよび1D）。 Ａ．NO のデオキシHbとの相互作用 一酸化窒素の濃度を増大させると、Hb（FeII）のインキュベーションにおいて 、デオキシHb（Hb［FeII］）のHb（FeII）NOへの変換が観察される。ａ．デオキ シHb。ｂ、ｃ、ｄ．それぞれ比率が1:1 、2:1 および10:1のNOとHb（FeII）の反 応混合物。反応生成物Hb（FeII）NOは、実質上、NOの添加の瞬間に（すなわち、 装置の不感時間以内に）生成した。 Ｂ．NO のオキシHbとの相互作用 NOの濃度を増大させると、オキシHbのインキュベーションにおいて、オキシHb （Hb［Fe［II］O2）のメトHb（HbFe［III］）への変換が観察される。ａ．オキ シHb。ｂ、c、ｄ．それぞれ比率が1:1、2:1および10:1のNOとオキシHbを含有す る反応混合物。メトヘモグロビンの生成は、NOの添加の瞬間に（すなわち、装置 の不感時間以内に）起こった。 Ｃ．Ｓ−ニトロソチオール類のデオキシHbとの反応 GSNO（表示）またはＳ−ニトロソシステイン（CYSNO）のデオキシHbとのイン キュベーションにおいて、Hb（FeII）のSNO-Hb（FeII）への変換が観察される。 RSNOのHbのヘム官能基との相互作用は（あったとしても）ほとんどない。ａ．デ オキシHb。ｂ、ｃ、ｄ．それぞれ比率が1:1 、2:1 および10:1のGSNOとHb（FeII ）の反応混合物。スペクトルは、ｂとｃでは60分間のインキュベーションの後、 ｄでは15分後に記録した。反応生成物をさらに分析したところ、いずれの場合に も、ほどほどの量のSNO-Hbの生成が認められた。60分の時点でのｂ、ｃおよびｄ におけるSNO-Hb（S-NO/Hb）の収率は、それぞれ2.5%、5%および18.5%であった（ 図1Dおよび図2Aを参照）。 Ｄ．Ｓ−ニトロソチオール類のオキシHbとの相互作用 GSNO（表示）またはCYSNOのオキシHbとのインキュベーションにおいて、Hb（F eII）O2のSNO-Hb（FeII）O2への変換が観察される。Hb（FeII）O2のヘム中心に おけるGSNO（またはCYSNO）の反応は（あったとしても）ほとんどない。すなわ ち、ヘムに対するO2結合能は、RSNO種によって影響されない。ａ．オキシHb。ｂ 、ｃ、ｄ．それぞれ比率が1:1 、2:1 および10:1のGSNOとオキシHbの反応混合物 。スペクトルは、分光光度計中で60分間のインキュベーション後に記録した。反 応生成物をさらに分析したところ、いずれの場合にも、SNO-Hbの生成が認めれら れた。スペクトルｂ、ｃおよびｄにおけるSNO-Hbの収率は、それぞれ5%、10%お よび50%（S-NO/Hb）であった。他の５回の測定では、S-NO/Hb の収率は、GSNO（ pH7.4、Hbに対して10倍過剰）を用いた場合で0.37±0.06、CYSNO を用いた場合 で約2SNO／四量体（1.97±0.06）であった（下記参照）。最後に記したこれらの データは、ヒトHbA が滴定可能なSH基を２つ含有するという報告と合致している 。方法 ヒトHbA0は、既に記述されているようにして赤血球から精製した(Kilbourn，R .G.ら，Biochem．Biophy．Res．Comm.，199:155-162(1994))。一酸化窒素溶液は 厳密に脱気し、一般的な手法（Beckman，J.S．ら，Methods in NitricOxide Research，FeelischおよびStamler 編，Wiley Chichester，英国（1996））に従 って精製し、飽和溶液を気密シリンジに移した。Hbの脱酸素化は、過剰の亜ジチ オン酸塩の添加（NO研究）、もしくはツンベルグ管での脱気によるHb（FeII）O2 の還元（RSNO研究；RSNO種は亜ジチオン酸塩と反応するため）によって行なった 。RSNO種は既に記述されているように合成した(Gaston，B.ら，(1993); Arnelle およびStamler，(1995))。HbA0とのインキュベーションは、リン酸緩衝液pH7.4 、0.5mM EDTA中で行なった。SNO-Hbの定量は、セファデックスG-25カラムでタン パク質を精製した後、Saville の方法（Gaston，B.ら，(1993); Stamler，J.S． ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:444-448（1992））に従って行なった。溶 液中の遊離NOxを分析するSaville 法には、スルファニルアミドとのジアゾ化反 応と、それに続く発色団N-（ナフチル）エチレンジアミンとのカップリングが必 要である。低分子量S-NO複合体はいずれもこの精製過程には耐えず、すべての活 性は沈澱可能な蛋白質であった。反応とスペクトルは、Perkin Elmer UV/Vis Sp ectrometer，Lambda 2Sを用いて行なった。実施例２：Hb Ｓ−ニトロシル化の調節に関するO2のアロステリック機能 Hbの酸素化は、アルキル化試薬に対するcys β93の反応性を増大させるコンフ ォメーション変化を伴う（Garel，C．ら，J．Biochem.，123:513-519（1982）； Jocelyn，P.C.，Biochemistry of the SH Group，Academic Press,ロンドン，24 3 頁（1972）；Craescu，C.T．ら，J．Biol．Chem.，261:14710-14716(1986)） 。この効果の生理学的意義は決して確立されていなかった。HbのＳ−ニトロシル 化速度がコンフォメーション状態に著しく依存することが観察された。オキシコ ンフォメーション（Ｒ状態）では、Ｓ−ニトロシル化がデオキシコンフォメーシ ョン（Ｔ状態）よりも速かった（図2A）。Ｓ−ニトロシル化の速度は、どちらの コンフォメーションでも、アルカリ条件（これは、アルカリ条件下でなければＣ 末端のヒスチジン146 βによって反応から遮蔽されているcys β93を露出させる 傾向がある）によって加速された（すなわちpH9.2 での速度＞pH7.4での速度） 。このヒスチジン残基を拘束している塩橋（asp β94---hisβ146）は高pHで緩 やかになる。これらのデータは、Ｒ状態に伴うチオール反応性の増大が、少なく とも部分的には、コンフォメーションが誘導するpKの変化よりはむしろ、NOの接 触が改善されることに由来することを示唆している。 Ａ．酸素化はHbのＳ−ニトロシル化を加速する Ｓ−ニトロソシステイン（CYSNO）によるHb Ｓ−ニトロシル化の速度は、デ オキシ状態（Hb［FeII］）よりもオキシコンフォメーション（Hb［FeII］O2）に ある場合の方が速い。方法 インキュベーションは、タンパク質（50μM）に対して10倍過剰のCYSNO を用 いて、曝気した2%ホウ酸塩、0.5mM EDTA中（オキシHb）、もしくは迅速なO2排気 後のトノメーター中（デオキシHb）で行なった。表記の時間に、試料をG-25カラ ム（リン酸緩衝食塩水、0.5mM EDTA、pH7.4で予め平衡化）に通して迅速に脱塩 してCYSNO を除去し、Saville の方法（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad． Sci．USA，89:444-448（1992））によってSNO-Hbを分析した。 Ｂ．脱酸素化はHbの脱ニトロシル化を加速する RSNO分解（および転移）の速度は、オキシ状態［SNO-Hb（FeII）O2］よりもデ オキシコンフォメーション［SNO-Hb（FeII）］にある場合の方がはるかに速い。 SNO-Hb（FeII）の分解は、過剰のグルタチオンの存在によってさらに加速される 。我々の測定の不感時間（約15秒）以内に、SNO-Hb（FeII）の大部分がGSNOに変 換された。方法 PBS（0.5mM EDTA、pH7.4）中のHbを、空気下（オキシ）または予めO2を排気し たトノメーター中（デオキシ）でインキュベートした。SNO-Hb（FeII）O2分解は Saville の方法（Saville，B.，Analyst，83:670-672（1958））によって測定し た。SNO-Hb（FeII）の自発的分解を、Hb（FeII）NOの生成により、分光測光法で 追跡した。グルタチオンとのニトロソ基転移反応は、タンパク質（50μM）に対 して100倍過剰のグルタチオンを添加することによって行ない、その反応混合物 を嫌気条件下に直ちに処理し、迅速なTCA沈澱を行い、上清中のRSNOを分析した 。NO基転移の速度は速すぎて、この研究で使用した標準的方法では正確には測定 できなかった。実施例３：生理学的系におけるHbのシステイン残基とのNO関連相互作用 Hbは、主として赤血球に含まれることから、細胞内タンパク質のＳ−ニトロシ ル化を起こす可能性のある機構を探究した。酸素化したラット赤血球のＳ−ニト ロソシステインとのインキュベーションにより、極めて迅速な細胞内SNO-Hb（Fe II）O2の生成が起こった（図3A）。Hbの迅速な酸化は、これらの条件下で観察さ れなかった。また、赤血球内SNO-Hbは、赤血球をＳ−ニトロソホモシステインま たはＳ−ニトロソシステイニルグリシンで処理した場合にも生成したが、Ｓ−ニ トロソグルタチオン（GSNO）で処理した場合には生成しなかった。したがって、 RSNOの赤血球接触は、チオール基特異的である。酸素化した赤血球をNOにさらす と、主としてメトHb生成が起こった。内皮由来弛緩因子（EDRF）とヘモグロビン 内皮依存性弛緩のHb媒介的阻害は、一般にNO応答のマーカーとして使用されて いる。Hbの金属中心またはチオール中心との反応は、NO/EDRF（内皮由来弛緩因 子）応答の減衰をもたらすはずであるから、本発明者らは、阻害の分子的根拠を 解明しようとした。β93チオール基がN-エチルマレイミド（NEM）で遮断されて いるHb調製品、またはヘムがシアンメト（FeIIICN）誘導体化によって遮断され ているHb調製品を大動脈環バイオアッセイで調べ、それらの活性を天然Hbの活性 と比較した。シアンメト-Hb とNEM-Hbは共に、血管緊張の増大を引き起こし、ア セチルコリン（EDRF）が媒介する弛緩を減衰させた（図3B）。しかし、天然Hbは 、修飾されたHb調製品のいずれよりも有意に有効であった（図3B）。総合すると 、これらの研究は、Hbのチオール基と金属基が共にそのNO関連活性に寄与するこ とを示唆している。HbにおけるＳ−ニトロソチオールの生成を立証するために、 胸部大動脈の2cm 切片をタイゴン管に挿入し、そのタイゴン管を通して、Hb（4 μM）およびACh（2μM）を含む3cc のクレブス溶液をローラーポンプで循環（1. 5cc/分×５分）させるバイオアッセイを用いた。流出液を分析（Gaston，B.ら， (1993)）したところ、５実験中５実験でSNO-Hb（20±4nM ）の生成が認められた 。 Ａ．赤血球内HbのＳ−ニトロシル化 ラット赤血球をＳ−ニトロソシステイン（ヘム（5mM）に対して等モル；リン 酸緩衝液pH7.4、25℃）と共にインキュベートすると、細胞内SNO-Hb（FeII）O2 が迅速に生成する。メトHbは迅速には生成しない。G-25カラムを通して細胞内RS NO種を分離すると、ほとんどの時点で、低分子量Ｓ−ニトロソチオール（例えば GSNO）として存在するのはわずかな割合にすぎないことがわかる。60分までに、 Hbの４つの利用可能なSH基のうち３つがＳ−ニトロシル化される（ラットHbは４ つの反応性SH基を含有することに注意）。挿入図は、ラット赤血球から単離した SNO-Hbのスペクトルおよびそれに関連する分析を示す。スペクトルＡは、G-25ク ロマトグラフィー後に赤血球から単離したSNO-Hbのスペクトルである。Ａを亜ジ チオン酸塩で処理するとS-NO部分の還元が起こって遊離のNOが放出され、それが デオキシHbによって自己捕捉されてHb（FeII）NOが生成する（亜ジチオン酸塩が 同時にHbを脱酸素化することに注意）（スペクトルＣ）。このスペクトル（Ｃ） は、四量体あたり約３個のS-NOの化学量論を示している。比較のために、四量体 あたり４個のNOを含有するHb（FeII）NOのスペクトルを示す（挿入図、スペクト ルＢ）。方法 表記の間隔で、赤血球を遠心分離によって迅速にペレット化し、３回洗浄し、 ４℃の脱イオン水中で溶解し、その細胞質画分をG-25カラムに通して迅速に脱塩 した。細胞内SNO-Hbを、Saville の方法（Gaston，B.ら，(1992); Stamler，J.S ．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:444-448（1992））で測定し、前記のよ うに分光法（挿入図）で確認した。 Ｂ．EDRF/Hb 相互作用の分子的根拠 EDRF応答に対する天然Hbの効果を、チオールまたはヘム中心がそれぞれアルキ ル化もしくはシアンメト誘導体化によって遮断されているHb調製品と比較した。 いずれのHb調製品も収縮を引き起こしたが、天然Hb（SH中心と金属中心が共に自 由に相互作用できる）による収縮が最も著しかった。同様に、アセチルコリン（ ACh）が媒介する弛緩も、天然Hbによって最も効率よく阻害された。シアンメトH b（CN-Hb）（ヘムが反応から遮断されている）とNEM-Hb（チオール基がN-エチル マレイミドによってアルキル化されている）では、弛緩が阻害される程度が低か った。これらのデータは、Hbのヘムとβ93SH基の両方が、EDRF応答の反転に寄与 することを例証している。同様の条件下でEDRFから生成するSNO-Hbの直接測定は 、本文（the text）に記述されている。方法 ウサギの胸部大動脈を3mm の環に切断し、等尺性緊張の測定用の力変換器（モ デルFT03、Grass Instruments、マサチューセッツ州クインシー）に取り付けた スターラップに装着した。このバイオアッセイ系の詳細は、既に記述されている (Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:444-448(1992))。シアン メトHbは、ヒトHbAから、公表された手法（Kilbourn，R.G.ら，Biochem．Biophy s．Res．Comm.，199:155-162(1994)）に従って調製した。HbA をN-エチルマレイ ミドでアルキル化した後、G-25セファデックスに通して脱塩して、過剰のNEM を 除去した。修飾されていないHbcys β93の除去は、Hg含有アフィニティーカラム を通すことによって達成した。遊離SH基のアルキル化は、5,5'-ジチオ- ビス［2 -ニトロ安息香酸］を用いて確認した。 実施例４：SNO-Hb血管活性の伝達 動脈赤血球は生理学的に重要な２つの形態のヘモグロビン、Hb（FeII）O2とHb （FeIII）を含有する（Antoniniら（1971））。赤血球内HbのＳ−ニトロソチオ ール含量に関する動脈- 静脈差は、NO基が赤血球輸送の間に放出されることを示 唆している。これらの発見から、おそらくはヘムの酸化還元状態とリガンドによ るその占有が、機能的結果に影響を与えるのだろうという可能性が生じる。興味 深いことに、血管環バイオアッセイで調べた場合、SNO-Hb（FeII）O2は、あまり 強くないNO様活性を持つことがわかった。すなわち、SNO-Hb（FeII）O2が引き起 こす収縮は、天然Hb（FeII）O2の場合より少なく、Ｓ−ニトロシル化がHbの収縮 作用を一部反転させることを示した（図4A）。これに対し、SNO-Hb（FeIII）は 、血管拡張因子であることがわかった（図4A）。遊離のNOがHb（FeII）O2または Hb（FeIII）の存在下に弛緩因子活性を全くもたなかったことは注目に値する（ 記載なし）。 赤血球はmM濃度のグルタチオンを含有する。RSNO種間の平衡はRSNO／チオール 交換によって迅速に確立されるので（Arnelle，D．R.およびStamler，J．S.，Ar ch．Biochem．Biophy.，318:279-285(1995)）、SNO-Hbの血管活性をグルタチオ ンの存在下で再評価した。図4Bは、グルタチオンがSNO-Hb（FeII）O2とSNO-Hb（ FeIII）両方の血管拡張因子活性を強化したことを示している。これらの条件に おけるGSNO生成（化学的実験とバイオアッセイ試験によって確認した）は、この 効果の完全な説明となるようであった。さらに速度論的な分析を行なったところ 、グルタチオンが関与するニトロソ基交換は、SNO-Hb（FeII）O2よりもSNO-Hb（ FeIII）との平衡により強く偏っていることがわかった（図4C）。赤血球におけ るSNO-Hbの定常状態レベルに関する発見（表２および図3A）からすると、これら の結果は、１）天然に存在するRSNO種とHb（cys β93）の間の平衡が生理学的条 件下ではSNO-Hb側にあること、２）SNO-HbとGSH が関与するニトロソ基転換反応 が赤血球内で起こるらしいこと（これらの研究において、SNO-Hbを負荷した赤血 球中 に低分子量RSNO種がみられた）、および３）Hbの金属中心の酸化が平衡をGSNO側 に移動させ、それによって生理活性に影響を与える可能性があることを示唆して いる。 SNO-HbからのNO基放出のもう１つの機構を探求した。SNO-Hbのレベルに関する 動脈- 静脈差から、S-NO結合の安定性が脱酸素化に付随するHbコンフォメーショ ンの変化によって調節されるのかもしれないという可能性が生じた。この可能性 を試験するために、SNO-Hb（FeII）O2とSNO-Hb（FeIII）からのNO基放出速度を 比較した。脱酸素化はSNO-Hbの分解速度を増大させることがわかった（図2B）。 これらの速度は、GSNOを与える反応ではグルタチオンにより著しく加速された（ 図2B）。結果は、O2- 金属相互作用がS-NO親和力に影響を与えることを示してお り、Hbの新しいアロステリック機能を示唆している。 SNO-Hbが生理学的な意義を持つには、そのNO関連活性が赤血球膜を横切って伝 達されなければならない。SNO-Hbを含有する赤血球を生理学的緩衝液中でインキ ュベートし、細胞外RSNO種の蓄積を経時的に測定することにより、この可能性を 調査した。図4Dは、赤血球が低分子量の（トリクロロ酢酸沈澱可能な）Ｓ−ニト ロソチオール種をこれらの条件下に輸出することを示している。重要なことに、 これらの実験における溶血の程度がわずか（＜0.5%）であり、溶解に関する補正 はRSNO放出速度に有意な影響を与えなかった。これらの結果により、赤血球内で 低分子量RSNO種とタンパク質RSNO種の間に平衡が存在すること、および細胞内に 位置することが、血管壁へのNO関連活性の伝達に関して制限的な因子ではないら しいことが確認される。 Ａ．異なるSNO-Hb調製品の濃度−作用応答 Hb（FeII）O2（▲）の収縮作用は、Ｓ−ニトロシル化によって一部反転される ことがわかる（SNO-Hb［FeII］O2（■）；Hb（FeII）O2に対してＡＮＯＶＡでP= 0.02）（図4A参照）。SNO-Hb（SNO-Hb[FeIII](●)）の金属中心の酸化は、この タンパク質を、他のＳ−ニトロソタンパク質種（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，89:444-448（1992））と同等の効力を持つ血管拡張因子に変 換する（SNO-Hb［FeII］O2に対してＡＮＯＶＡでＰ＜0.0001）。比較のため、Hb （FeIII）の収縮特性を示す(□)；各データポイントにつきｎ＝6〜17。方法 この血管環バイオアッセイの詳細は公表されている(Stamler，J.S．ら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，89:444-448(1992))。SNO-Hb（FeII）O2調製品は、Hb （FeII）O2タンパク質に対して10倍過剰のＳ−ニトロソシステイン（CYSNO）を 使用して合成（2%ホウ酸、0.5mM EDTA、約15分保温）した後、セファデックスG- 25カラムを通して脱塩を行なった。CYSNO は、0.5N HCl、0.5mM EDTA中で合成し た後、0.5mM のEDTAを含む1Mリン酸緩衝液中で中和（1:1 ）した。SNO-Hb（FeII I）調製品は同様の手法で、ただしHb（FeIII）を出発物質として、調製した。後 者はHb（FeII）O2を過剰のフェリシアン化物で処理した後、G-25カラムに通して 脱塩することにより合成した。SNO-Hb濃度は分光法で確認し、Ｓ−ニトロソチオ ール含量はSaville の方法（Stamler，J.S．ら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA，8 9:444-448(1992)）によって決定した。S-NO／四量体化学量論は、どちらのSNO-H b調製品についても約2 だった。ヘムの酸化はuv- 分光測光法では検出不可能だ った。 Ｂ．グルタチオンによるSNO-Hb作用の増強 バイオアッセイ槽にグルタチオン（100 μM）を添加すると、SNO-Hb（FeII）O2 （■）とSNO-Hb(FeIII)(●)に対する用量- 応答が共に増強される（図4B参照。 ｎ＝６〜12；ａの各軌跡と比較してどちらの場合もＡＮＯＶＡによりｐ＜0.0001 ）。グルタチオンは、いくつかの実験で基礎緊張に対して一時的な影響を持ち、 Hb（FeII）O2（▲）に対する応答には有意な影響を与えなかった。 Ｃ．SNO-Hb とグルタチオンの間のニトロソ基交換 SNO-Hb（100 μM）からグルタチオン（10mM）へのNO基転移の速度を、SNO-Hb （FeII）O2（オキシ）とSNO-Hb（FeIII）（メト）について示す（ｎ＝５）。デ ータは、出発SNO-Hb濃度に対する生成したGSNOの量として表わしてある。この転 移は、SNO-Hb（FeII）O2よりもSNO-Hb（FeIII）の場合の方が速く（ＡＮＯＶＡ によりｐ＜0.002）、GSNO/SNO-Hb 平衡がメトHbの生成によりGSNO側にシフトす ることが示唆される。方法 GSNOが生成するチオール/SNO-Hb 交換は、トリクロロ酢酸沈澱後にしたがって 、化学的に立証された（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:4 44-448(1992)）（ｎ＝５）。これらの結果は、別個の実験で、反応混合物をG-25 カラムに通して分離した後、残存するSNO-Hb濃度を測定することによって検証し た。 Ｄ．赤血球によるＳ−ニトロソチオール種の輸出 SNO-Hbを含有するヒト赤血球が、経時的に低分子量RSNO種を輸出することを示 している。溶血は、１時間で０〜＜0.5%の範囲にあって、RSNO放出速度とは相関 せず、測定された細胞外RSNOのごく一部の原因にしかならなかった。方法 遠心分離によって保存用ヒト赤血球を得、洗浄し、5mM SNOCYSを含むリン酸緩 衝食塩水（0.5mM EDTA、pH7.4）中に１時間再懸濁した。これにより、0.5 S-NO ／四量体の化学量論を持つSNO-Hb（FeIIO2/FeIII混合物）を含む赤血球調製品が 得られる。次に、その赤血球を繰返し洗浄することにより、残存するCYSNOを除 去し（確認した）、その赤血球をクレブス溶液中（1:4 ）でインキュベートした 。細胞外RSNOの蓄積を、Saville の方法（Saville，B.，Analyst，83:670-672（ 1958））で経時的に測定した。遠心分離の後、赤血球上清を分光法で分析するこ とにより、溶血を測定した。実施例５：in vivo でのSNO-Hb生理活性 無細胞Hbの全身投与は、高血圧応答をもたらすが、これはNOがヘムによって捕 捉されるからであるとされている（Vogel，W.M．ら，Am J．Physiol.，251:H413 -H420(1986); Olsen，S.B．ら，Circulation，93:329-332(1996)）。SNO-Hbがこ の有害な影響を持たないかどうかを決定するため、また、NO放出のin vitro機構 が in vivo環境にも及ぶかどうかを調べるため、麻酔したラットの大腿静脈にボ ーラスとして注入したHbとSNO-Hbに対する応答を比較した。図５に示すように、 Hb（FeII）O2（200nmol/kg）は、平均動脈圧に20±3mmHg の上昇をもたらした（ ｎ＝４；Ｐ＜0.05）。これに対して、SNO-Hb（FeII）O2は、高血圧作用を示さず 、SNO-Hb（FeIII）は、低血圧応答を引き出した（図５）。したがって、これら の化合物の in vivoでの特性は、in vitroで認められたもの（図4A）とよく似て いる。さらに、赤血球の生理学的応答が無細胞Hb調製品と同等であることを立証 するために、SNO-Hbを含有する赤血球を、L-NMMA（50mg/kg ）で予備処置して内 因性RSNO種を枯渇させたラットの大腿静脈に注射した。正常なラットに認められ るレベルと同等なSNO-Hbレベル（0.1 〜0.5 μM）で、SNO-Hb含有赤血球は、低 血圧応答を引き出したが（8 ±1mmHg ；平均±SEM ；ｎ＝９）、天然（SNO-Hb枯 渇）赤血球はそのような応答を引き出さなかった(Ｐ＝0.001)。これら約10% の 平均血圧変化は、人間の高血圧と正常血圧を区別する変化にほぼ相当し、いくつ かの抗高血圧治療の治療範囲内にある。HbとSNO-Hbの効果はいずれも（無細胞で あるか、赤血球内に含まれるかにかかわらず）一過性であり、このことは、Hbの Ｓ−ニトロシル化とSNO-Hbの代謝が in vivoで起こって、それが血圧の復旧をも たらしていることを示唆している。S-NO／ヘム化学量論がほぼ1:50,000である血 液中でのSNO-Hbの生理活性は、Hb（Fe）不活化に対するこのNO関連活性の抵抗性 の劇的な実例である。無細胞HbとSNO-Hbの in vivo効果 スプレーグ・ドーリーラットの大腿静脈に2 〜200nmol/kgのHb（FeII）O2を（ ボーラスとして）投与すると、平均動脈圧が用量依存的に上昇することが示され る。200nmol/kgでは、平均動脈圧が25mmHg（20±3mmHg ；ｎ＝４；Ｐ＜0.05）上 昇した。血圧の上昇は、10 〜15分以内に反転した。（同じ用量範囲での）SNO-H b（FeII）O2注入は、明白な血圧変化を引き起こさず、Hb（FeII）O2によって誘 発される高血圧を改善することが示される。より高い投与量でも、同様の応答が 認められた。これに対し、SNO-Hb（FeIII）注入は、最高投与量（200nmol/kg） で平均動脈圧の有意な低下（前108 ±5mmHg；後74±6mmHg 、ｎ＝５；Ｐ＜0.05 ）を引き起こした。高血圧応答は、一過性の傾向があり、10分間で血圧が正常化 した。血圧の減少は、SNO-Hbを含有する赤血球の注射でも認められた。方法 ラットをペントバルビタールの腹膜内注射によって麻酔し、局所切開により、 大腿動脈と大腿静脈を確保した。次に、動脈にカニューレを挿入し、Gould 記録 計を取り付けたViggo Spectramed圧力変換器を用いて、血圧を連続的に監視した 。データの取得にはIBM PC（DATA Q Codas）を使用した。実施例６：Ｓ−ニトロソチオール種の赤血球への負荷 ラット赤血球をＳ−ニトロソシステイン（ヘム（5mM）に対して等モル；リン 酸緩衝液pH7.4 、25℃）と共にインキュベートすると、細胞内Ｓ−ニトロソチオ ール種の迅速な生成が起こる。メトHbは迅速には生成しない。細胞内容物をG-25 カラムに通して分離すると、赤血球内低分子量S−ニトロソチオール、例えばＳ −ニトロソグルタチオン（GSNO）の生成が確認される。２分までに、mM程度のGS NOを得ることができる。RSNO のアッセイ法 Ｓ−ニトロソシステイン（5mM）処理した赤血球を遠心分離によりすばやくペ レット化し、３回洗浄し、４℃の脱イオン水中で溶解し、その細胞質画分をG-25 カラムに通してすばやく脱塩する。細胞内RSNOはSavilleの方法で測定し、分光 法で確認することができる。負荷赤血球からの血圧に対する効果 （SNO-RBC を調製するために）Ｓ−ニトロソシステイン（S-nitroscysteine） で処理し、スプレーグ・ドーリーラットの大腿静脈に導入した赤血球は、用量依 存的に平均動脈圧を低下させた。SNO-Hbが0.3 μM（内因性in vivo SNO-Hb濃度 ）でアッセイされた赤血球の場合、動脈圧は8 ±1mmHg（９回の実験に関する平 均±SEM ；非処置赤血球対照と比較してｐ＜0.001）低下した。SNO-Hbで0.5 μM と測定された赤血球の場合、動脈圧が10mmHg低下した。SNO-Hbが0.1 μM（内因 性SNO-Hb濃度未満）で測定された赤血球の場合は、動脈圧が6mmHg 低下した。非 処置赤血球の投与は、動脈血圧に何の効果も持たないか、もしくはわずかに上昇 させた。L-モノメチル-L- アルギニン（L-NMMA；50mg/kg）の投与は、約20mmHg の血圧上昇を引き起こした。負荷赤血球のボーラス投与による血圧の変化は、15 〜20分間持続した。その他の方法 ラットをペントバルビタールの腹膜内注射によって麻酔し、局所切開により大 腿動脈と大腿静脈を確保した。次に、動脈にカニューレを挿入し、Gould記録計 を取り付けたViggo Spectramed圧力変換器を用いて、血圧を連続的に監視した。 データの取得にはIBM PC（DATA Q Codas）を使用した。実施例７：冠状動脈血管拡張、冠状動脈流および血圧に対するSNO-Hbの効果 SNO-Hbを実施例4Aに記述したように合成した。反応の完了は、実施例4Aに記載 のように決定した。24頭の健康な雑種犬（25〜30kg）を静脈内チアミラルナトリ ウム（60〜80mg/kg）で麻酔し、第４肋間腔に左開胸術を施した。左過剰耳より 遠位の左回旋冠状動脈を最小限切開した。一対の7-MHz 圧電性結晶（1.5 ×2.5m m、15〜20mg）をダクロン裏材に取り付け、切開した血管部分の反対側表面の動 脈血管外膜を 6-0プロレンで縫合した。オシロスコープ監視とオンライン音波測 微法（ソノミクロメーター120-2、Triton Technology,カリフォルニア州サンデ ィエゴ）を用いて、適切な結晶位置を確保した。パルスドップラー流量プローブ （10MHz、加圧帯型）を結晶より遠位に埋め込んだ。膨張型気球閉塞具も流量プ ローブより遠位に設置した。結晶と閉塞具の間にある回旋動脈の全ての分岐を結 紮した。ヘパリンナトリウム充填ポリビニルカテーテルを、尖から左心室腔内に 、過剰耳から左心房に、左内胸動脈から上行大動脈に挿入した。カテーテル、管 および線材は、首の付け根にある皮下嚢までくぐらせた。 10〜15日の回復期間後に、カテーテルと線材を全身麻酔下に体外に出し、２〜 ３日後に、各犬にSNO-Hb（0.4mg）のボーラス注射を与えて血管応答を評価した 。5%未満の心外膜冠状血管拡張を示した２頭の犬を以降の試験から除外し、別の 技術的理由で２頭を除外した。 犬を緩く拘束して外側横臥位に目をさましたまま横たわらせながら、調教し、 研究した。実験室は薄暗く照明し、静かに保った。大動脈圧、左心室端- 拡張期 圧dP/dt 、冠状動脈外径および冠状動脈流を連続的に監視した。10頭に、0.1ml のSNO-Hb溶液（50nM/kg ）を左心房カテーテルから注射した。脈管構造に対する 溶媒の潜在効果を確かめるために、蒸留水中の30% エタノール0.1ml を賦形剤対 照として与えた。注射の間に、位相性冠状血流（phasic coronary blood flow） と冠状動脈直径を注射前のレベルに戻らせた（最低15分間）。注射間に15分の間 隔を置くと、反復注射に変化が起こらなかった。コンダクタンス血管（conducta nce vessels）に対するSNO-Hbの直接的血管拡張効果と潜在的な流量媒介性の間 接的血管拡張効果を評価するため、冠状血流が注射前のレベルかそれよりわずか に低く維持されるように可調式閉塞具を一部膨張させながら、10頭中６頭に投与 を繰返した。塩化アセチルコリン（Sigma Chemical）に対する応答を、SNO-Hbの 場合と同様の操作を行なった後、10頭の別の群で評価した。 心外膜冠状動脈直径、冠状血管流、心拍数、大動脈および左心室端- 診断圧(d iagnostic pressure)を各SNO-Hb注射の前後で比較した。冠状動脈寸法と血流の 最大変化を、増大するSNO-Hb投与量の関数として表した。増大する投与量に対す る冠状動脈寸法の応答は、下記の等式で記述しうる独特なＳ字型用量- 応答曲線 に従った： ［式中、KDは薬物- 受容体複合体解離定数であり、最大応答の50% が達成される 投与量（EC50）である］。各動物で、その用量- 応答曲線に対して非線型最小二 乗回帰（r2＞0.90）を行なった。この回帰は上記の等式に束縛された。回帰から 、個々の動物それぞれに対して、最大応答値とKD値が得られた。次に、これらの 値の平均値を計算し、各試験群について平均KDと最大応答を得た。これらの値を 用いて平均曲線を作成し、平均用量-応答値と共にプロットした（図6A〜6Fを参 照のこと）。実施例８：血液におけるＳ−ニトロソヘモグロビンとニトロシル（FeII）- ヘモ グロビンの内因性レベル SNO-Hbが血液中に天然に存在するかどうか、また天然に存在するならば、その O2輸送能との関係および赤血球のニトロシル化ヘム含量を決定するために、赤血 球のＳ−ニトロソチオールおよびニトロシル−ヘム含量をアッセイするための分 析法を開発した（表２）。麻酔したラットの左心室から直接穿剌によって動脈血 を得、頚静脈（juglular vein）と下大静脈から静脈血を得た。次に、赤血球か らHbを精製し、RSNO含量と（FeII）NO含量を測定した。動脈血には有意なレベル のSNO-Hbが含まれていたが、静脈血では実質上検出できなかった（表２）。NOシ ンターゼ阻害因子Ｎω−モノメチル-L- アルギニン（L-NMMA）を注入（50mg/kg ）した45分後に行なった測定は、SNO-Hbと総Hb-NOの枯渇を示した（それぞれ82 および52±18% ；ｎ＝３〜５；ｐ＜0.05）。これらのデータは、多少の環境的寄 与は排除されないものの、SNO-Hbの内因性起源を確立するものである。SNO-Hbに ついて認められた動脈- 静脈分布は、Hb（FeII）NOの場合は逆転し、Hb（FeII） NOは、部分的に脱酸素化された（静脈）赤血球中に、より高い濃度で検出される （図２）。したがって、ニトロシル化されたタンパク質チオールとヘムの比率は 、血液の酸素化状態に依存するようである。これらの発見と一致して、Wennmalm とその共同研究者らは、Hb（FeII）NOが主として静脈（部分的に脱酸素化された ）血液中で生成することを示している(Wennmalm，A.ら，Br．J．Pharmacol.，10 6(3):507-508(1992))。しかし、Hb（FeII）NOの in vivoレベルは、一般的には 低すぎて（EPR で）検出することができず、SNO-HbはEPR サイレントである（す なわち常磁性でない）。したがって、光分解- 化学発光法は、重要な技術的進歩 を意味する。というのは、これが、正常な生理学的条件でHbに対するNO結合を定 量的かつ機能的に評価することができる最初の方法論だからである。方法 麻酔したスプレーグ・ドーリーラットの左心室（動脈血）および頚静脈（静脈 血）から血液を得た。同等の静脈値は下大静脈由来の血液中にも得られた。赤血 球細胞を800gで遠心分離することによって単離し、４℃のリン酸緩衝食塩水中で ３回洗浄し、0.5mM EDTAを含む脱イオン水４倍量を添加することにより溶解し、 Penefskyの方法に従って４℃で、G-25カラムにすばやく通して脱塩した。24匹の ラットで、Hb試料を２等分した後、それらを、Bradfordの方法で測定したタンパ ク質濃度に対して10倍過剰量のHgCl2で処理し、もしくは処理しなかった。SNO-H bとHb（FeII）NOの測定は、下記の光分解−化学発光法によって行なった。さら に12匹のラットで、HgCl2処理後に亜硝酸塩をアッセイすることにより、SNO-Hb の存在をさらに確認した。具体的に述べると、試料（HgCl2を含むものと含まな いもの）を４℃で１時間、Amicon-3（セントリコンフィルター、分子量カットオ フ3,000）に通して分離し、低分子量画分を0.5N HCl中の１μM グルタチオンを 含む気密シリンジに集めた。これらの条件下で、存在する亜硝酸塩はすべて、Ｓ −ニトロソグルタチオンに変換され、それを光分解- 化学発光法で測定した（検 出限界約1nM）。SNO-Hbはすべての動脈試料中に存在し、この方法で決定された レベル（286 ±33nM）は実質上同一で、表２に示すレベルと統計学的に相違しな かった。静脈血では、SNO-Hbが検出不能（0.00±25nM）で、そのレベルは上記の レベルと統計学的に相違しなかった。Ｓ−ニトロソヘモグロビンのアッセイ法 高感度な光分解- 化学発光法を使用した。多少類似するアッセイ法が、生物学 的系中のRSNO種（Ｓ−ニトロソチオール種）を測定するために使用されている（ Gaston，B.ら，(1993); Stamler，J.S．ら，(1992)）。この方法では、NOをチオ ールから光分解的に遊離させ、それをオゾンとの反応により化学発光分光計で検 出する。これと同じ操作原理は、ニトロシル- 金属化合物からのNOの切断（およ び測定）にも使用できる（Antonini，E.およびBrunori，M．Hemoglobin and Myo globin in Their Reactions with Ligands，American Elsevier Publishing Co. ，Inc.，ニューヨーク，(1971)の29〜31頁）。光分解セル内の流速を調節するこ とにより、Hb（FeII）NOのNOリガンドの完全な光分解を達成することができる。 SNO-Hb、Hb（FeII）NOおよびＳ−ニトロソグルタチオンの合成調製品から作成し た標準曲線は、直線（Ｒ＞0.99）で、実質上重ね合せることができ、約1nM の感 度限界を示した。２つの分析基準、すなわち１）SNO-Hbからの信号は、10倍過剰 のHgCl2で試料を予備処理することによって除去されたが、Hb（FeII）NOは、水 銀試験に対して耐性であったこと、および２）HgCl2によるSNO-Hbの処理は（一 般的なグリース反応により）定量的な収量で亜硝酸塩を生じるが、Hb（FeII）NO を同様に処理しても亜硝酸塩は生じないことによって、SNO-HbとHb（FeII）NOが 確実に識別されることを発見した。UV/VIS分光法により、NOが過剰のHgCl2の存 在下にヘムに結合したままであることが確認された。実施例９：Ｓ−ニトロソヘモグロビンによる血小板凝集の阻害 ヒトHbA0の調製方法は、実施例１の「方法」の段落に記載したものである。SN O-Hb（FeII）O2の製造方法は、実施例２Ａに記載したものである。SNO-Hb（FeII I）O2の製造方法は、実施例１に記載したものである（実施例１のＢ、Ｃ部分お よび「方法」参照）。ＳＮＯ−ヘモグロビンの定量は、Savilleの方法（Saville ，B.，Analyst，83:670-672（1958））および実施例８の「Ｓ−ニトロソヘモグ ロビンのアッセイ法」に記載されたアッセイにしたがって実施例１のようにした 。 少なくとも１０日間３．４ｎＭのクエン酸ナトリウムで抗凝固された静脈血を 、アセチルサリチル酸またはいかなる他の血小板活性剤を消費していないボラン ティアから得た。血小板に富む血漿を１５０×ｇで２５℃で１０分間遠心分離し て調製し、回集後２時間以内に用いた。血小板数をクールターカウンター（モデ ルＺＭ）で測定しすると、１．５〜３×１０8／ｍｌであった。 血小板に富む血漿の凝固を、標準的な比濁計技術で測定したところ、結果が出 血時間と相関していることが示された。血小板のアリコート（０．３ｍｌ）を３ ７℃でインキュベートし、ＰＡＰ−４攪拌機（Biodata，Hatsboro，PA）中で１ ０００ｒｐｍで攪拌した。ヘモグロビンを、血小板と１０分間プレインキュベー トし、５μＭ ＡＤＰで凝集を誘導した。凝集を、光透過率の最大速度および変 化の程度を測定することによって定量し、ヘモグロビンの非存在下で行なった対 照凝集と比較した正規化値として表現した。 凝集アッセイの結果を図7A、7Bおよび7Cに示す。標準偏差を縦棒で示す。SNO- Hb（FeII）O2は、試験した高濃度での血小板凝集のいくらかの阻害を起こした。 また、SNO-Hb（FeIII）は、１μＭおよびそれ以上の濃度で存在すると、SNO-Hb （FeII）O2よりもはるかに大きな程度まで、血小板凝集を阻害する。実施例１０：ｃＧＭＰに対するＳＮＯ−Ｈｂの効果 血小板に富む血漿（ＰＲＰ）をヘモグロビン、ＳＮＯ−オキシＨｂ、またはＳ ＮＯ−メトＨｂのいずれかと５分間インキュベートし、その後０．５ｍｌの氷冷 トリクロロ酢酸を１０％になるまで添加して、アッセイを終了した。上清のエー テル抽出を行なって、トリクロロ酢酸を除去し、無水酢酸での試料のアセチル化 を用いてアッセイの感度を増加させた。サイクリックＧＭＰの測定をラジオイム ノアッセイによって行った（Stamler，J．S.ら、Circ．Res．65:789-795(1989) ）。 結果を図８に示す。試験したＨｂの全濃度について（１、１０および１００μ Ｍ）、SNO-Hb（FeIII）について測定したｃＧＭＰの濃度は、天然Ｈｂのものよ り小さかった。実施例１１：Ｈｂのポリニトロソ化 Ａ． HbA0（オキシ）を、Ｓ−ニトロソグルタチオン／HbA0の比が６．２５でＳ −ニトロソグルタチオンと、ｐＨ７．４で２５℃で２４０分間インキュベートし 、セファデックスＧ−２５カラムで脱塩した。亜ジチオン酸塩存在下（スペクト ルＢ、図9A）および非存在下（スペクトルＡ、図9A）でスペクトル測定を行なっ た。スペクトルにおけるシフトは、四量体あたり２個のＳＮＯ基であることを示 す。 Ｂ． HbA0を、蛋白質に対して１００倍過剰量のＳ−ニトロソグルタチオンと、 ｐＨ９．２で２４０分間インキュベートした後、Ｇ−２５カラムで脱塩した。次 に、一部を亜ジチオン酸塩で処理した。図9Bのスペクトルは、Ｈｂが複数の部位 でニトロソ化されていることを示す。 Ｃ． HbA0を、四量体に対して１００倍過剰量のＳ−ニトロソシステインと、ｐ Ｈ７．４で２５℃で５〜２０分間インキュベートした。種々の時間の処理後、蛋 白質をＧ−２５カラムで脱塩し、亜ジチオン酸塩で処理した。スペクトルは、時 間とともにＨｂのポリニトロソ化が進むことを示している（図9CのスペクトルＡ 〜Ｆ）。１００倍過剰量のＳ−ニトロソシステインとの処理の５分後、四量体あ たり０．０９個のＮＯ基が付加されていた（図9CのスペクトルＡ）；２０分後、 少なくとも４個のＮＯ基が付加されていた（図9CのスペクトルＦ）。中間点で、 四量体あたり０．４個のＮＯ基（図9CのスペクトルＢ）、１．５８個のＮＯ基（ 図9CのスペクトルＣ）、２．７５個のＮＯ基（図9CのスペクトルＤ）、２．８２ 個のＮＯ基（図9CのスペクトルＥ）が付加されていた。 Ｄ． ラットHbを、四量体に対して１００倍過剰量のＳ−ニトロソグルタチオン と、ｐＨ７．４で３時間インキュベートした。次に、蛋白質をＧ−２５カラムを 通して脱塩した。脱塩した蛋白質の一部を亜ジチオン酸塩で処理した（図9Dのス ペクトルＢ；スペクトルＡの蛋白質を亜ジチオン酸塩で未処理にしておいた。） 。図9DのスペクトルＢは、ＲＮＯｓ／Ｈｂの比が６であることを示す。 Ｅ． 時間でHbA0をのニトロソ化の程度をトラッキングしたタイムコース実験を 行なった（図9E）。HbA0の処理を、１０倍過剰量のＳ−ニトロソシステインとｐ Ｈ７．４で２５℃で、または同じ条件下で１００倍過剰量のＳ−ニトロソシステ インと行なった。ＳＮＯおよびＮＯの分析をSaville の方法およびJia，L．ら， Nature 380:221-226（1996）によって行なった。これらの条件下で、ヘムは、極 度に酸化された；速度は時間に依存した。 １０倍過剰量のＳ−ニトロソシステインでの処理は、HbA0の２つの反応性シス テイン残基のチオール基のみをニトロシル化する。イノシトール６リン酸は、ア ロステリック平衡をＴ構造（通常デオキシ型）側にシフトさせることが知られて いる。１００倍過剰量のＳ−ニトロソシステインでの処理は、さらなる基をニト ロソ化する；つまり、産物は、四量体あたり２個以上のＮＯ基を有する。実施例１２：血液流におけるSNO-Hb（FeII）O2の効果 SNO-Hb（FeII）O2は、ＳＮＯ／Ｈｂの比が２であり、Ｓ−ニトロソチオールと の反応によって（HbA0から）調製される。２１％の酸素を呼吸するラットを、図 １０（白丸、ＳＮＯ−Ｈｂ（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）；黒丸、ＳＮＯ−Ｈｂ（１ ０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）；黒四角、非修飾Ｈｂ（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ））に 示すようにHbA0から調製したＨｂで注射した。各実験あたり３匹のラットを用い た。血液流をＨ2クリアランス法を用いて脳において測定した；微小電極を脳の 定位に置いた。付随したＰＯ2測定は、組織ＰＯ2が２０であることを示した。し たがって、ＳＮＯ−Ｈｂは、正常の生理条件下での脳への血液流を改善し、一方 、天然Ｈｂは、血液流を減少させた。ＮＯ基放出は、局所組織酸素低下によって 促進された。実施例１３：ウサギ大動脈の張力におけるSNO-Hb（FeII）O2、SNO-Hb（FeIII） および(NO)x -Hb(FeIII)の効果 ヘモグロビンを、Ｈｂ四量体に対して１：１、１０：１または１００：１いず れかのＳ−ニトロソシステインで１時間処理し、実施例４のように進めた。１： １および１０：１過剰で行なった反応の産物を、Saville アッセイおよび標準的 な分光光学的方法によってアッセイした。１：１の比で行なった反応の産物は、 ＳＮＯ−Ｈｂ（Ｆｅ）Ｏ2であり、ＳＮＯ−Ｈｂ（ＦｅIII）は、ＣＹＳＮＯ／四 量体が１０：１過剰での反応ののちにみられた。 大動脈環バイオアッセイを、実施例４に記載のように行なった。ＣＹＳＮＯ／ Ｈｂ四量体が１００：１の比を用いた反応の産物は、ヘムに付着したＮＯならび に２個のＳＮＯを含んでいた。１００：１のＣＹＳＮＯ／Ｈｂ産物の能力は、SN O-Hb（FeIII）のものよりはるかに優れており、ポリニトロシル化を示している （図11参照）。 均等物 当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細書に記載されている本発 明の特定の態様に対して多くの均等物を認識するか、または確認することができ るであろう。そのようなおよび他のすべての均等物は、以下の請求の範囲に含ま れるものとする。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年９月１７日 【補正内容】 ２３．ＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2を含有してなる溶液に器官を保存する工程を 含む、切り取った器官の保存を向上させる方法。 ２４．ＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2を含有してなる調製物をヒトに投与する工程 を含む、鎌状赤血球貧血を有するヒトの治療方法。 ２５．該調製物がＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2およびチオールを含有してなる請 求項２４記載の方法。 ２６．該調製物がＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2およびＳ−ニトロソチオールを含 有してなる請求項２４記載の方法。 ２７．ニトロソ化ヘモグロビンを含有してなる有効量の調製物を患者に投与する 工程を含む、一酸化窒素代謝および酸素代謝の異常により特徴付けられる疾患ま たは医学的状態を有する患者の治療方法。 ２８．該疾患または医学的状態が心臓疾患、肺疾患、鎌状赤血球貧血、発作、敗 血症または臓器移植からなる群より選ばれる請求項２７記載の方法。 ２９．ヘムＦｅがＦｅII状態であるニトロソ化ヘモグロビンまたはニトロ化ヘモ グロビンを含有してなる代用血液。 ３０．ニトロソ化ヘモグロビンまたはニトロ化ヘモグロビンを含有してなる組成 物の治療上有効量を投与する工程を含む、動物またはヒトにおける血小板活性化 または血小板粘着から生じる障害の治療方法。 ３１．該障害が心筋梗塞、肺血栓塞栓症、大脳血栓塞栓症、血栓静脈炎、敗血症 および不安定アンギナからなる群より選ばれる請求項３０記載の方法。 ３２．ニトロソ化ヘモグロビンを含有してなる組成物の治療上有効量を投与する 工程を含む、動物またはヒトにおける血栓形成の阻止方法。 ３３．ヘモグロビンのアロステリック平衡またはスピン状態をコントロールする 物質を含有してなる組成物を、治療上有効量で投与する工程を含む、動物または ヒトにおける血小板活性化の制御方法。 ３４．該物質がヘモグロビンのアロステリック状態をＲ構造からＴ構造へ変換す る請求項３３記載の方法。 ３５．水溶液中でヘモグロビンをヘモグロビン四量体に対して過剰のＳ−ニトロ ソチオールと混合し(combining)、得られた混合物(combination)をニトロソ化が ヘモグロビン上の複数の部位で起きるのに適した条件下で維持する工程を含む、 ポリニトロソ化ＳＮＯ−ヘモグロビンの生成方法。 ３６．ヘモグロビンをＮＯ供与化合物と混合し、得られた混合物をニトロソ化ま たはニトロ化が起きるのに適した条件下で維持し、それによってポリニトロソ化 ＳＮＯ−ヘモグロビンまたはポリニトロ化ＳＮＯ−ヘモグロビンを生成し、選択 的にＦｅIIIをＦｅIIに還元する試薬と該ポリニトロソ化ＳＮＯ−ヘモグロビン またはポリニトロ化ＳＮＯ−ヘモグロビンを反応させる工程を含む、ヘムＦｅが ＦｅII状態であるポリニトロソ化ＳＮＯ−ヘモグロビンまたはポリニトロ化ＳＮ Ｏ−ヘモグロビンの生成方法。 ３７．選択的にＦｅIIIをＦｅIIに還元する試薬がシアノボロヒドリドである請 求項３６記載の方法。 ３８．選択的にＦｅIIIをＦｅIIに還元する試薬がメトヘモグロビンリダクター ゼである請求項３６記載の方法。 ３９．ポリニトロソ化ＳＮＯ−ヘモグロビンを含有してなる組成物。 ４０．酸素の非存在下、ｐＨ７．４で過剰のＳ−ニトロソグルタチオンをＨｂ〔 ＦｅII〕とインキュベートする工程を含む、チオール基で特異的にＳ−ニトロシ ル化されるＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕の製造方法。 ４１．酸素の存在下、ｐＨ７．４で過剰のＳ−ニトロソグルタチオンをＨｂ〔Ｆ ｅII〕Ｏ2とインキュベートする工程を含む、チオール基で特異的にＳ−ニトロ シル化されるＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2の製造方法。 ４２．酸素の非存在下、ｐＨ７．４で過剰のＳ−ニトロソシステインをＨｂ〔Ｆ ｅII〕とインキュベートする工程を含む、チオール基で特異的にＳ−ニトロシル 化されるＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕の製造方法。 ４３．酸素の存在下、ｐＨ７．４で過剰のＳ−ニトロソシステインをＨｂ〔Ｆｅ II〕Ｏ2とインキュベートする工程を含む、チオール基で特異的にＳ−ニトロシ ル化されるＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2の製造方法。 ４４．酸素の非存在下、２％ほう酸塩中ｐＨ７．４〜９．２で過剰のＳ−ニトロ ソシステインをＨｂ〔ＦｅII〕とインキュベートする工程を含む、チオール基で 特異的にＳ−ニトロシル化されるＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕の製造方法。 ４５．酸素の存在下、２％ほう酸塩中ｐＨ７．４〜９．２で過剰のＳ−ニトロソ システインをＨｂ〔ＦｅII〕Ｏ2とインキュベートする工程を含む、チオール基 で特異的にＳ−ニトロシル化されるＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2の製造方法。 ４６．ニトロソ化ＳＮＯ−Ｈｂ（ＦｅII）Ｏ2またはニトロ化ＳＮＯ−Ｈｂ（Ｆ ｅII）Ｏ2を含有してなる代用血液。 ４７．ニトロソ化ＳＮＯ−Ｈｂ（ＦｅII）またはニトロ化ＳＮＯ−Ｈｂ（ＦｅII ）を含有してなる代用血液。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３３ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３３Ｆ ６３９ ６３９Ｃ 31/10 31/10 35/14 35/14 Ｚ 38/16 Ｃ０７Ｋ 14/805 // Ｃ０７Ｋ 14/805 Ａ６１Ｋ 37/14 (31)優先権主張番号 ０８／６６７，００３ (32)優先日 1996年６月20日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．低分子量のニトロソ化剤を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類の細胞への ＮＯの送達方法。 ２．低分子量のＮＯ供与剤を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類のヘモグロビ ンのＯ2送達能の増強方法。 ３．低分子量のニトロソ化剤を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類の酸素フリ ーラジカルの捕捉方法。 ４．ニトロソ化ヘモグロビンおよび低分子量のチオールまたはＮＯ供与剤を含有 してなる組成物で器官を灌流する工程を含む、生存器官のエックス・ビボ（ex v ivo）の保存方法。 ５．下記工程： ａ）患者の赤血球を単離する工程； ｂ）該患者の赤血球をＳ−ニトロソチオールで処理する工程；および ｃ）該赤血球を該患者に再投与する工程 を含む、患者の血液で生じる疾患（blood borne disease ）の治療方法。 ６．血液で生じる疾患がマラリアである、請求項５記載の方法。 ７．ニトロソ化剤を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類の疾患または医学的障 害の治療方法。 ８．ニトロソ化剤が標的細胞に迅速に入るように選ばれる請求項７記載の方法。 ９．該疾患または医学的障害がショック、アンギナ、発作、再潅流損傷、急性肺 損傷、鎌状赤血球貧血および赤血球の感染からなる群より選ばれる請求項７記載 の方法。 １０．ヘムＦｅの検出可能な酸化なしでＳ−ニトロシル化されたＳＮＯ−Ｈｂ〔 ＦｅII〕Ｏ2を含有してなる組成物。 １１．酸素の存在下で過剰のニトロソ化剤を精製ヘモグロビンとインキュベート する工程を含む、チオール基で特異的にＳ−ニトロシル化されたＳＮＯ−Ｈｂ〔 ＦｅII〕Ｏ2の製造方法。 １２．ニトロソ化剤が低分子量のＳ−ニトロソチオールである請求項１１記載の 方法。 １３．ヘムＦｅの検出可能な酸化なしでＳ−ニトロシル化されたＳＮＯ−Ｈｂ〔 ＦｅII〕を含有してなる組成物。 １４．酸素の非存在下で過剰のニトロソ化剤を精製ヘモグロビンとインキュベー トする工程を含む、チオール基で特異的にＳ−ニトロシル化されたＳＮＯ−Ｈｂ 〔ＦｅII〕の製造方法。 １５．ニトロソ化剤が低分子量のＳ−ニトロソチオールである請求項１４記載の 方法。 １６．ヘム鉄の酸化状態および酸素化状態に対して選ばれた、低分子量のチオー ルまたはニトロソチオールおよびヘモグロビンまたはニトロソ化ヘモグロビンの 混合物を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類における、様々な酸化還元型の、 酸素およびＮＯの送達の制御方法。 １７．ニトロソ化ヘモグロビンを含有してなる代用血液を哺乳類に投与する工程 を含む、哺乳類におけるＮＯの送達方法。 １８．代用血液がニトロソ化ヘモグロビンおよび低分子量のＳ−ニトロソチオー ルを含有してなる、請求項１７記載の方法。 １９．ニトロソ化ヘモグロビンを含有してなる代用血液を哺乳類に投与する工程 を含む、哺乳類における酸素フリーラジカルおよびＮＯ・の捕捉方法。 ２０．ニトロソ化ヘモグロビンを哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類における 血圧の低下方法。 ２１．疾患が心臓疾患、脳疾患、血管疾患、アテローム性動脈硬化症、肺疾患、 および炎症からなる群より選ばれる、ニトロソ化型またはニトロ化型のヘモグロ ビンを哺乳類に投与する工程を含む哺乳類の疾患の治療方法。 ２２．医学的状態が発作、アンギナおよび急性呼吸困難からなる群より選ばれる 、ニトロソ化型のヘモグロビンを哺乳類に投与する工程を含む哺乳類の医学的状 態の治療方法。 ２３．ＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2を含有してなる溶液に器官を保存する工程を 含む、切り取った器官の保存を向上させる方法。 ２４．ＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2を含有してなる調製物をヒトに投与する工程 を含む、鎌状赤血球貧血を有するヒトの治療方法。 ２５．該調製物がＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2およびチオールを含有してなる請 求項２４記載の方法。 ２６．該調製物がＳＮＯ−Ｈｂ〔ＦｅII〕Ｏ2およびＳ−ニトロソチオールを含 有してなる請求項２４記載の方法。 ２７．ニトロソ化ヘモグロビンを含有してなる有効量の調製物を患者に投与する 工程を含む、一酸化窒素代謝および酸素代謝の異常により特徴付けられる疾患ま たは医学的状態を有する患者の治療方法。 ２８．該疾患または医学的状態が心臓疾患、肺疾患、鎌状赤血球貧血、発作、敗 血症または臓器移植からなる群より選ばれる請求項２７記載の方法。 ２９．ニトロソ化ヘモグロビンまたはニトロ化ヘモグロビンを含有してなる代用 血液。 ３０．ニトロソ化ヘモグロビンまたはニトロ化ヘモグロビンを含有してなる組成 物の治療上有効量を投与する工程を含む、動物またはヒトにおける血小板活性化 または血小板粘着から生じる障害の治療方法。 ３１．該障害が心筋梗塞、肺血栓塞栓症、大脳血栓塞栓症、血栓静脈炎、敗血症 および不安定アンギナからなる群より選ばれる請求項３０記載の方法。 ３２．ニトロソ化ヘモグロビンを含有してなる組成物の治療上有効量を投与する 工程を含む、動物またはヒトにおける血栓形成の阻止方法。 ３３．ヘモグロビンのアロステリック平衡またはスピン状態をコントロールする 物質を含有してなる組成物を、治療上有効量で投与する工程を含む、動物または ヒトにおける血小板活性化の制御方法。 ３４．該物質がヘモグロビンのアロステリック状態をＲ構造からＴ構造へ変換す る請求項３３記載の方法。 ３５．水溶液中でヘモグロビンをヘモグロビン四量体に対して過剰のＳ−ニトロ ソチオールと混合し(combining)、得られた混合物(combination)をニトロソ化が ヘモグロビン上の複数の部位で起きるのに適した条件下で維持する工程を含む、 ポリニトロソ化ヘモグロビンの生成方法。 ３６．ヘモグロビンをＮＯ供与化合物と混合し、得られた混合物をニトロソ化ま たはニトロ化が起きるのに適した条件下で維持し、それによってポリニトロソ化 ヘモグロビンまたはポリニトロ化ヘモグロビンを生成し、選択的にＦｅIIIをＦ ｅIIに還元する試薬と該ポリニトロソ化ヘモグロビンまたはポリニトロ化ヘモグ ロビンを反応させる工程を含む、ヘムＦｅがＦｅII状態であるポリニトロソ化ヘ モグロビンまたはポリニトロ化ヘモグロビンの生成方法。 ３７．選択的にＦｅIIIをＦｅIIに還元する試薬がシアノボロヒドリドである請 求 項３６記載の方法。 ３８．選択的にＦｅIIIをＦｅIIに還元する試薬がメトヘモグロビンリダクター ゼである請求項３６記載の方法。 ３９．ポリニトロソ化ヘモグロビンを含有してなる組成物。
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