【発明の詳細な説明】
In vivo糖尿病試験
本発明は、免疫系に影響を及ぼす細胞仲介性疾患または細胞仲介性疾患素質の
診断用の薬剤を製造するための、自己反応性物質の使用に関する。
リウマチ様関節炎および若年型糖尿病（IDDM）などの自己免疫疾患の発病にお
ける分子の関連の解明はこの数年で急速に進展し、現在ではこれらの疾患の早期
診断および原因療法のための具体的な適用が明らかになっている。
これらの疾患の発病には、遺伝的素因の他に環境要因もまた役割を演じている
ことが現在確立されている。遺伝的リスク要因のレベルでは、例えばIDDMの場合
、MHC II型抗原の２，３の対立形質のみがこの疾患に密接に関係している。した
がって、これらの対立形質を分析することによって、IDDMについてのリスクグル
ープを確定することが可能である（例えば、Thomsonら、Am.J.Hum.Genet.43(198
8),799-816、またはToddら、Nature 329(1987),599-604）。
IDDMの発症に関与する環境要因はおそらく外因性免疫活性ペプチド配列である
と思われる。これに関連して、中でも内因性構造に部分的に相同なウイルス抗原
が議論されてきた。特別な環境下では、特に出生後の時期において、食物を介し
て摂取されたウシ血清アルブミンなどの抗原が内因性構造への相同性に起因して
免疫応答を誘導し、自己攻撃過程を開始することが可能になる。
IDDMにおける疾病の経過については、細胞毒性リンパ球による膵臓β細胞の進
行性破壊が典型的である。この過程はグルコース代謝の障害がはっきりと現れる
ずっと以前に開始する。糖尿病の症状発現が検出され得る時点では、β細胞の80
％以上がすでに破壊されている。したがって、疾患者に原因治療を提供するため
には、リスク保持者について早期段階においてこれらの自己攻撃性Ｔ細胞を検出
することができることがきわめて重要であろう。
現在では、自己免疫疾患における内因性組織破壊は初めは非常に緩やかに進行
することが確立されている。この過程の初期段階において、自己攻撃性Ｔ細胞は
おそらく１つまたは２，３の自己抗原のみを認識すると思われる。Ｉ型糖尿病の
動物モデル（NODマウス）についてのKaufmanら（Nature 368(1993),69-72）およ
びTischら（Nature 368(1993),72-78）の刊行物によって、これらのマウ
ス系における自然発生糖尿病の場合、最初のＴ細胞仲介自己免疫反応はグルタミ
ン酸デカルボキシラーゼを対象にすることが示された。この過程において、最初
は、NODマウス中では、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）のＣ末端におけ
る１−２のエピトープのみが認識される。上述のように、この段階では、パーイ
ンスリティス（perinsulitis）がすでに検出可能であるのとは対照的に、グルコ
ース代謝の変化はまだ検出することができない。自己攻撃性Ｔ細胞によって認識
されるGADのペプチドのスペクトルが広がるのは、疾患がさらに進行してからで
ある。糖尿病が発症したときには、例えばペリフェリン（peripherin）、熱ショ
ックタンパク質HSP 65およびカルボキシペプチダーゼHなどのその他の島細胞抗
原に対する前活性化Ｔ細胞を検出することも可能である。
ヒトにおいても、Ｉ型糖尿病の発病の原因としてGADに対する免疫応答が関係
していることの証拠がある。したがって、例えば糖尿病前症の約80％においてGA
Dに対する自己抗体を検出することができる。ただし、これらの自己抗体の病因
的役割は低いものと評価される。むしろ、Ｉ型糖尿病においては、Ｔリンパ球に
よる膵臓β細胞の進行性破壊があるものと推定される。これらのGADに対するＴ
リンパ球はいくつかの研究グループによってすでに検出されている（Harrisonら
、J.Clin.Invest.89(1992),1161；Honeymanら、J.Exp.Med.177(1993),535）。こ
れらのグループによって発見されたＴリンパ球はアミノ酸208−404を含むGAD 67
kd分子のペプチド断片と反応した。
EP-A-O 519 469はヒトGAD 65 kd分子からの自己免疫反応性ポリペプチド類を
開示している。これらのポリペプチドは以下のアミノ酸配列を有する：
Ｘ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−（ＴまたはＥ）−Ｋ−Ｚ
［式中、Ｘは１−10個のアミノ酸から選択される任意の配列であり、Ｚは１−８
個のアミノ酸から選択される任意の配列である］
欧州特許出願第95 100 764.5号もまた、ヒトGAD 65由来の自己反応性ペプチド
配列およびこれらのペプチドを含有する医薬組成物を提示している。ここでは免
疫系に影響を与える疾患もしくは疾患素質、または腫瘍疾患もしくは腫瘍疾患素
質の診断のための薬剤を製造するためのこの医薬組成物の使用についても記載さ
れている。
本発明の目的の１つは、一方において患者の不快度が可能なかぎり少なく、他
方において迅速で信頼性のある診断が可能な、細胞仲介性免疫系疾患、特に自己
免疫疾患のための診断方法を提供することであった。
この目的は、細胞仲介疾患または細胞仲介疾患素質の診断用の薬剤の製造のた
めに自己反応性物質を使用することによって達成され、この薬剤は、皮内または
皮膚内投与され、診断は適用部位における陽性反応の有無に基づいて行われるこ
とを特徴とする。
本発明にしたがう診断方法は、細胞仲介免疫用の一般的試験のために使用され
る現在市場で入手し得る方法とは、これらの試験が、患者がすでにさらされた例
えば精製タンパク質誘導体（PPD）、破傷風トキソイド、キャンディダ（Candida
）などの外来の抗原を使用する点で、異なっている。これらの試験は被験者の免
疫系の全般的状態を判定するのに使用される。細胞仲介性免疫系疾患は診断され
ない。
アレルギー反応を判定するために使用される皮刺テストなどのその他の広く使
用されている試験においては、抗原は皮内投与されない。Ｔ細胞仲介性でない陽
性反応は４時間以内に検出することができ、小結節の出現ではなくて表面の腫大
の出現によって特徴付けられる。
本発明は自己反応性物質に対する細胞仲介性免疫反応の発生をin vivoで検出
するための方法を提供する。この細胞仲介性免疫反応は特定の免疫系の疾患、特
に自己免疫疾患、またはこうした疾患の素質の存在を示す。さらにこの細胞仲介
性免疫反応は腫瘍疾患またはこれらの素質の存在をも示すことができる。
本発明に従う方法に好適な自己反応性物質または自己抗原は、核酸、脂質、糖
類、ポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよびこれらの複合体、例えばペプチ
ドとMHC分子またはそのペプチド結合誘導体などのポリペプチドとの複合体、な
どの天然、合成または組換え物質である。さらに好適な自己反応性物質として、
特異的な免疫原性のエピトープ、断片、類似体、擬似体または例えば化学的修飾
によって製造される誘導体、および前記の物質の混合物がある。自己反応性物質
は、そのままで、または例えばリポペプチドの形態などの担体に結合した形態で
投与することができる。自己反応性物質は単独でまたは副刺激成分もしくはアジ
ュバントなどの補助物質とともに投与することができる。自己抗原は、天然源か
ら、組換えＤＮＡ技術によって、または例えばペプチド固相合成などの合成法に
よって製造することができる。
内因性抗原という意味での自己反応性物質の他に、外来抗原であるけれども免
疫学的に自己抗原に関係がある自己反応性物質を使用することもまた可能である
。こうした外来抗原の例は、内因性タンパク質由来の自己反応性ペプチド配列に
相同性を有するペプチドである。具体例としては、内因性グルコース輸送体GLUT
-2の配列領域Q-I-G-P-G-P-I-P-W（aa 412-420）中に相同な領域を有するウシβ
カゼインＡ由来の配列L-V-Y-P-G-P-I-P-N（aa 60-68）のペプチド、およびグル
タミン酸デカルボキシラーゼの配列領域R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K-G-M（aa 155-16
7）中に相同性を有するコクサッキー（Coxsackie）ウイルスタンパク質P2-C由来
の配列K-V-K-I-L-P-E-V-K-E-K-H-E（aa 33-45）のペプチドがある。
本発明に従う方法はそれぞれの自己抗原の皮内投与、および投与部位における
局所陽性細胞反応の有無の判定を含む。この陽性反応はＴ細胞仲介免疫反応にと
って特徴的な時間に判定する。この時間は好ましくは、投与後少なくとも24時間
、特に好ましくは投与後の24時間〜１週間の間、最も好ましくは投与後の40〜80
時間の間である。
陽性反応は好ましくは投与部位における小結節の出現を含むものであり、目視
観察および／または触診によって定性的に、そしてまた超音波または写真法によ
って定量的に判定することができるものである。
その一方で、上記陽性反応の産生物、例えば投与の部位で白血球などの浸潤性
細胞によって放出されるγインターフェロンなどのサイトカイン、を測定するこ
ともまた可能である。
本発明に従う方法は自己免疫疾患または自己免疫疾患素質の診断に特に好適で
ある。
本発明に従う方法によって診断することができる自己免疫疾患の例としては、
真性糖尿病、特にＩ型糖尿病（IDDM）、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、バセ
ドウ病、強直性脊椎炎、急性前部ぶどう膜炎、グッドパスチャー症候群、重症筋
無力症、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、免疫性甲状腺炎、硬皮症、ク
ローン病、シェーグレン症候群、ライター症候群、炎症性腸疾患、またはグレー
ヴス病である。本発明に従う方法は特に好ましくはIDDM、リウマチ様関節炎また
は多発性硬化症などのＴ細胞仲介性疾患の診断に使用され、そして本発明による
方法は最も好ましくはIDDMの診断に使用される。
例えばIDDMを診断するために使用される自己反応性物質はグルタミン酸デカル
ボキシラーゼ（GAD）65 kdまたは67 kd、チロシンホスファターゼ（38 kd抗原）
、カルボキシペプチダーゼH、インスリン、熱ショックタンパク質、38 kdインス
リン分泌顆粒タンパク質またはこれらの部分である。ヒトGAD 65 kdまたはこれ
らのペプチド部分配列は自己反応性物質として特に好ましく使用される。
しかし、その他の自己免疫疾患に対する、類似した診断への適用もまた可能で
ある。こうした自己免疫疾患の例は、例えばミエリン塩基性タンパク質またはそ
のプロテオリピドタンパク質に対して反応性のＴ細胞を判定することができる多
発性硬化症、例えばコラーゲンII型、サイトケラチン、E.coli由来のdnaJタンパ
ク質およびHsp 65に対して反応性のＴ細胞を判定することができるリウマチ様関
節炎、ならびに甲状腺ペルオキシダーゼに対して反応性のＴ細胞を判定すること
ができるバセドウ病である。重症筋無力症の場合は、アセチルコリン受容体また
はその他の関連する自己反応性物質に対して反応性のＴ細胞を判定することが可
能である。エリテマトーデスの場合は、HSP 90に対するＴ細胞があり、グレーヴ
ス病の場合はTSH受容体に対するものがある。
一般的に、免疫系に影響を与えるすべての疾患について、例えば動脈硬化症の
場合などでも、診断を適用することが可能である。この場合、この疾患は熱ショ
ックタンパク質 HSP 65に対する免疫応答に関係することが証明された（Xuら、
Lancet 341,8840(1993),255-259）。
さらに別の応用は、腫瘍抗原と反応するＴ細胞の診断用検出である。この例は
黒色腫患者から単離された黒色腫関連抗原MAGE１に対するＴ細胞である（Vander
Bruggenら、Science 254(1991),1643-1647）。これらのＴ細胞は、細胞の塊が
まだ小さすぎて従来の方法では腫瘍がまだ検出されない段階で、すでに検出する
ことができる。抗腫瘍予防接種を監視するために、さらにより特異的に反応
するＴ細胞を使用することもできると考えられる。
さらに、自己反応性物質に類似した結合をするペプチド、ペプチド誘導体また
は分子を使用することもまた可能である。IDDMの診断については、GAD、特にヒ
トGAD 65 kd由来の１もしくは数個のペプチドまたはペプチド誘導体、あるいは
これらから誘導されたペプチド擬似体を使用するのが好ましい。
IDDMの診断のために、下記のものを含むペプチドまたはペプチド誘導体が特に
好ましく使用される：
(a) アミノ酸配列（I）
D-V-N-Y-A-F-L-H-A-T-D-L-L-P-A-C-D-G-E-R,
(b) アミノ酸配列（II）
S-N-M-Y-A-M-M-I-A-R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K,
(c) アミノ酸配列（III）
N-W-E-L-A-D-Q-P-Q-N-L-E-E-I-L-M-H-C-Q-T,
(d) アミノ酸配列（IV）
T-L-K-Y-A-I-K-T-G-H-P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G,
(e) アミノ酸配列（V）
P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G-L-D-M-V-G-L-A-A-D-W,
(f) アミノ酸配列（VI）
T-Y-E-I-A-P-V-F-V-L-L-E-Y-V-T-L-K-K-M-R,
(g) アミノ酸配列（VII）
F-F-R-M-V-I-S-N-P-A-A-T-H-Q-D-I-D-F-L-I
(h) アミノ酸配列（VIII）
G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A,
(i) アミノ酸配列（IX）
E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K,
(j) 図１または２に示されるアミノ酸配列の１つ、
(k) ６アミノ酸以上の長さを有する、(a)〜(i)に示すアミノ酸配列の部分領域、
および／または、
(l) (a)〜(j)に示すアミノ酸配列と本質的に同等なMHC分子に対する特異性
および／または結合親和性を有するアミノ酸配列。
アミノ酸配列(I)〜(VII)はヒトGAD 65 kdのアミノ酸残基86-105(I)，246-265(
II)，146-165(III)，166-186(IV)，176-195(V)，206-225(VI)および556-575(VII
)に相当する。このアミノ酸配列I-VIIを配列表中、配列番号１−７に示す。
アミノ酸配列（VIII）はヒトGAD 65 kdのアミノ酸残基266-290に相当し、アミ
ノ酸配列（IX）はヒトGAD 65 kdのアミノ酸残基306-325に相当する。図１および
２に示すアミノ酸配列もヒトGAD 65 kdの部分配列である。図１および２のアミ
ノ酸配列を配列表中、配列番号８−28に示す。アミノ酸配列（VIII）およびアミ
ノ酸配列（IX）を配列表中、配列番号29および30に示す。
驚くべきことに、ヒトGAD 65の前記の領域を含むペプチドが最近発見されたＩ
型糖尿病から単離されたＴ細胞サブ集団と特異的に反応することがわかった。し
たがって、本発明によるペプチドはその使用によってＩ型糖尿病を非常に初期に
診断することができる、初期自己エピトープである。
アミノ酸配列(I)−(IX)は、完全アミノ酸配列がBuら（Proc.Nat.Acad.Sci.USA
89(1992),2115 ff．）によって記載されている、ヒトグルタミン酸デカルボキ
シラーゼ（GAD）の65 kdイソ型からの部分領域である。アミノ酸配列(I)−(IX)
は、Ｉ型糖尿病患者の末梢血からのＴ細胞系を取り出し、続いてブタ脳からのGA
Dまたは組換えヒトGADでin vitroで刺激し、そしてヒトGAD配列から誘導された
合成ペプチドを使用した増殖アッセイにおいてこれらのＴ細胞系を試験すること
によって、発見された。
このペプチドは化学的方法を使用する既知の合成法によって製造することがで
き、またはこれらのペプチドをコードするＤＮＡ配列をクローン化して好適な宿
主細胞中、特にE.coli中に発現させることによる、遺伝子操作によって製造する
ことができる。
６アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、特に好ましくは10アミノ酸以上
、および最も好ましくは15アミノ酸以上の長さを有する、特定のアミノ酸配列(I
)−(IX)または図１もしくは２に示すアミノ酸配列の部分領域を有するペプチド
もまた好ましい。本発明によるペプチドの最少の長さは、MHC分子を認識し、こ
れに特異的に結合し、そして対応するＴ細胞受容体と反応する能力によって決め
られる。
GADから誘導され、MHCに結合する、本発明に従うペプチドの断片の最大の長さ
は好ましくは100アミノ酸、特に好ましくは50アミノ酸、および最も好ましくは2
5アミノ酸である。
前記のペプチドの他、前記の配列と本質的に同等なMHC分子に対する特異性お
よび／または結合親和性を有し、好ましくは前記のアミノ酸配列から置換、欠失
または個々のアミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の短い切片あるいは類似の様式
で結合する修飾物質の挿入によって誘導される、ペプチドを使用することも可能
である。
特に本発明は、配列は前記のアミノ酸配列に完全には対応しないが、その代わ
りに同一のまたは密接に関連する“アンカー位置”のみを有するペプチド変異体
にも関する。ここでの用語“アンカー位置”とは、MHC分子、特にクラスDR3,DR4
またはDQのMHC分子への結合に必須のアミノ酸残基を意味する。DRB10401結合主
要部に対するアンカー位置は、例えばHammerら、Cell 74(1993),197-203に記載
されている。こうしたアンカー位置は本発明に従うペプチド中に保存されている
か、または場合によっては、化学的に非常に密接に関連する側鎖を有するアミノ
酸残基によって（例えばアラニンがバリンによって、ロイシンがイソロイシンに
よって、およびその逆に）置換されている。本発明に従うペプチドのアンカー位
置はMHC分子に対する結合能力について前記の特定のペプチドの変異体を試験す
ることによって、簡単な手法で決定することができる。本発明に従うペプチドの
特徴は、MHC分子に対して前記のペプチドと本質的に同等な特異性および／また
は結合親和性を有することである。これらのペプチドから誘導されたペプチドは
当初のペプチドまたはそれらの部分的配列に対して、好ましくは30％以上、特に
好ましくは50％以上、そして最も好ましくは60％以上相同な配列を有することが
好ましい。
特定のペプチドの変異体の例はヒトGAD 67由来の対応する相同なペプチド断片
であり、この完全アミノ酸配列もまた上記Buらによって記載されている。
「MHC分子に対する本質的に同等な特異性および／または結合親和性」という
用語には、好ましくは８−15アミノ酸の長さの短いペプチドの場合に特に見られ
るような、アミノ酸配列(I)−(VIII)または図１もしくは２に示すアミノ酸配列
に比較して改善された結合特異性および／または親和性も含まれる。
本発明はペプチド誘導体にも関する。この用語には１または数個のアミノ酸が
化学反応によって誘導されたペプチドが含まれる。本発明に従うペプチド誘導体
の例としては、特には、骨格および／または反応性アミノ酸側鎖基、例えば遊離
アミノ基、遊離カルボキシル基および／または遊離水酸基が誘導体化された分子
がある。アミノ基の誘導体の具体例はスルホンアミドまたはカルボキシアミド、
チオウレタン誘導体およびアンモニウム塩、例えば塩酸塩である。カルボキシル
基の誘導体の例は塩、エステルおよびアミドである。ヒドロキシル基の誘導体の
例はＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体である。本発明に従う「ペプチド誘導
体」という用語には１または数個のアミノ酸が20の“標準的”アミノ酸の天然に
出現するかまたは天然または非天然のアミノ酸相同体で置換されているものも含
まれる。こうした相同体の例は、4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリシン、
3-メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチン、β−アラニンおよび4-アミノ酪
酸である。
その他の好適なペプチド誘導体はペプチドと自己抗原とともに投与される補助
剤成分、（例えば脂質）との複合体または共有結合体である。この場合、ペプチ
ドはリポペプチドとしても使用される。
本発明は、MHC結合性ペプチド断片が大きい方のポリペプチド単位の１成分で
あるポリペプチドであって、好ましくはそのMHC結合性ペプチドとそのポリペプ
チド単位の残りの部分間との連結があらかじめわかっている切断点、例えばプロ
テアーゼ切断部位を有している、ポリペプチドをも包含する。
本発明は、MHC分子に対して前記ペプチドまたはペプチド誘導体と本質的に同
等な特異性および／または結合親和性を有する擬似ペプチド物質にも関する。擬
似ペプチド物質またはペプチド擬似体はMHC分子との相互作用においてペプチド
に代替することができ、天然のペプチドに比較して、より高度の代謝安定性、改
善された生体利用性および長期化された作用期間を有する化合物である。ペプチ
ド擬似体の調製方法はGiannis and Kolter,Angew.Chem.105(1993),1303-1326,
Leeら、Bull.Chem.Soc.Jpn.66(1993),2006-2010およびDorschら、Kontakte(Dar
mstadt)(1993)(2),48-56に記載されている。本発明に従うペプチド擬似体の調製
に関して、これらの参考文献の開示を引用する。
さらに別の好適な自己反応性物質は、１つ以上のペプチド、ペプチド誘導体ま
たはペプチド擬似体と１つ以上のMHC分子またはMHC分子のペプチド結合性誘導体
とを含有する複合体である。この複合体において、好ましくは10-7l/mol以上、
特に好ましくは10-8−10-9l/molの範囲の結合定数を有する１個のペプチド、ペ
プチド誘導体またはペプチド擬似体が１個のMHC分子またはMHC分子のペプチド結
合性誘導体に結合している。あるいはまた、ペプチド、ペプチド誘導体またはペ
プチド擬似体が例えば光連結剤を介してMHC分子に共有結合的に連結したものま
たは共有結合した遺伝的ペプチド−MHC融合体とすることもできる。こうしたペ
プチド−MHC融合タンパク質は好ましくはHLA-DRベータ鎖および遺伝学的にこれ
らに融合した自己反応性ペプチドを含有する。この複合体は特に好ましくはMHC
クラスII分子またはこれらのペプチド結合誘導体を含有する。
MHCクラスII分子をコードする遺伝子のヌクレオチド配列がCorellらによって
発表されている（Mol.Immunol.28(1991),533-543）。この発表の内容をここに引
用する。
“MHC分子のペプチド結合性誘導体”という用語には、天然MHC分子のタンパク
質加水分解性切断または組換えＤＮＡ技術によって調製されるMHC分子の断片で
あって、ペプチド結合特性を本質的に保持させているものが含まれる。この用語
は、ペプチド結合に関与するMHC部分の他にさらに別のポリペプチド成分を含有
する融合タンパク質を含むものとしても解釈される。
ペプチド−MHC複合体は、好ましくはペプチドを含まないMHC分子またはMHC分
子誘導体を本発明に従うペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド擬似体と結合
させることによって調製される。ペプチドを含まないMHC分子は、例えば、結合
しているペプチドを解離させるために天然MHC分子の折りたたみを解除し、ペプ
チドがなくなったMHC分子を再び折りたたむことによって調製することができる
（Dornmair and McConnel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990),4134-4138およびW
O 91/14701参照）。ペプチドとMHC分子との複合体のその他の調製方法が欧
州特許出願第95 100 7764.0号に記載されている。この開示をここに引用する。
本発明は、活性成分として例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプ
チド誘導体、ペプチド擬似体および／またはペプチド−MHC複合体などの自己反
応性物質を含有し、場合によってはアジュバントまたはその他の通常の医薬添加
剤と組み合わせた組成物を、これらを皮内投与することを含む診断方法において
使用することにも関する。この組成物は、その外、Ｔ細胞上の表面分子CD-28に
結合することができる、例えばIL-2およびIL-4などのサイトカインならびに／ま
たは表面抗原B7（Wiss-Corayら、Eur.J.Immunol.23(1993),2175-2180；Freeman
ら、Science 262(1993),909-911）などの補助刺激成分を含有してもよい。補助
刺激成分の存在によって、この組成物の診断効果を改善および／または改変する
ことができる。
さらに、本発明に従う方法において、陽性および／または陰性の対照を使用し
た追加の判定を実施することもまた好ましい。陰性の対照として、例えば、ヒト
血清アルブミンなどの非反応性ポリペプチドまたは添加剤、例えば緩衝液のみを
含有する調製品を使用することができる。陽性対照抗原として、例えば、結核菌
を培養した培養液からの精製タンパク質誘導体（PPD）（例えば、Statens Serum
Institute,Copenhagen Denmarkから市販されている）または多くのヒトにおい
て強いＴ細胞刺激の原因となることが知られている破傷風トキソイドを使用する
ことができる。
本発明の或る態様において、自己反応性物質をアジュバントとともに投与する
ことも好ましい。好適なアジュバントの例は、水酸化アルミニウム、不完全フロ
インドアジュバント、リン酸アルミニウムおよびペプチドと連結する（リポペプ
チド）のに好適な脂質である。
自己反応性物質を、例えば26Gサイズの針を有する通常の皮下注射器を使用す
るなどの既知の方法で投与することができる。自己反応性物質を含有する組成物
を好ましくは免疫系の細胞に自己抗原を提供するのに最も好適な身体の好適な部
位に、20μl−500μl、好ましくは50μl−200μlの量を皮内投与する。例えば、
IDDMを診断するためには、前腕部（前側）に注射することができる。
組成物中の自己抗原の濃度は各場合において使用する自己抗原によって広い範
囲に変更することができる。濃度１−100μg/ml、特に５−20μg/mlが好ましく
使用される。
さらに、自己反応性物質を含有する調製物を保持する１つのチャンバー、陽性
対照用の調製物を保持する１つのチャンバーおよび陰性対照用の調製物を保持す
る１つのチャンバーを含む装置で投与を実施することもまた可能である。こうし
た装置は例えば自己反応性物質を含有する調製物を保持するためのチャンバーを
２−10含ませることができる。この装置は簡単な方法でいくつかの自己反応性物
質を同時に試験するのに使用することができる。
本発明のさらに別の主題は、好ましくは投与部位範囲の組織サンプル由来のＴ
細胞を含有するサンプルを自己反応性物質と接触させて、Ｔ細胞のこの物質との
反応を判定することからなる、特異的Ｔ細胞サブ集団の判定である。Ｔ細胞のこ
の自己抗原との特異的反応は、例えばＴ細胞の増殖の増加によって検出すること
ができ、これは放射能の取り込みによって測定することができる。他方、標識自
己抗原を例えば可溶性MHC分子との複合体形態で使用することによって、Ｔ細胞
の反応を直接判定することもできる。この態様において、自己反応性物質は好ま
しくはこれに連結させて蛍光標識基とともに使用する。評価を例えばFACS分析に
よって実施することができる。これは、Ｔ細胞をＴ細胞特異的抗体に連結させた
第１の蛍光マーカーと接触させ、その後第２の蛍光マーカーに連結させた自己抗
原と接触させ、２重に標識された細胞の存在を蛍光光度分析によって判定するも
のである。このようなやり方で、自己抗原との反応性によって特徴づけられるＴ
細胞サブ集団が測定される。場合によっては、この方法に前活性化したＴ細胞の
選別、例えばIL-2とインキュベートし、そして／またはIL-2受容体抗体とインキ
ュベートし、続いて例えば免疫磁気法を使用して抗体結合細胞を分離することに
よる、IL-2受容体陽性Ｔ細胞の選択的富化が含まれる。他方、前活性化した細胞
を、Ｔ細胞と自己抗原を接触させた後、最初に選別することができる。
この方法の改変法として、前活性化した自己反応性Ｔ細胞、すなわち表面マー
カーとしてIL-2受容体を有するＴ細胞の、非活性化自己反応性Ｔ細胞、すなわち
IL-2受容体を有しないＴ細胞に対する比率を測定することも可能である。
本発明のさらに別の主題は、自己抗原と反応するＴ細胞サブ集団の単離である
。こうした方法において、投与部位の範囲から取り出したＴ細胞を含有する組織
サンプルを自己抗原と接触させ、この自己抗原と反応するＴ細胞を同定し、そし
て場合によってはこれらをその他のＴ細胞から分離する。この場合において、Ｔ
細胞を自己抗原と接触させる前および／または接触後に、前活性化Ｔ細胞、すな
わちIL-2受容体を含有するＴ細胞を選別することも可能である。こうした方法に
おいて、例えばMHC分子との複合体の形態の自己抗原を担体上に固定化した形態
で使用し、陽性反応Ｔ細胞のその他のＴ細胞からの分離を簡単化することができ
る。Ｔ細胞系はこの方法で単離したＴ細胞サブ集団から再刺激によって確立する
ことができる。これらの自己反応性Ｔ細胞系を次に患者の免疫化に使用すること
ができる。
特異的Ｔ細胞サブ集団を同定するための診断方法において、自己抗原の代わり
にMHCペプチド複合体の作用を模倣する抗イディオタイプ抗体を使用することも
可能である。こうした抗体は、（例えばマウス中で）ある抗体を製造するため、
免疫源として特定の抗原に特異的なＴ細胞サブ集団を使用することによって、ま
たは自己抗原に対する第１の抗体を最初に製造し、その後第１の抗体に対する抗
イディオタイプ抗体を製造することによって、容易に得ることができる。
Ｔ細胞を単離する代わりに、これらのin vivoで活性化されたＴ細胞の生成を
同定することによって、特異的Ｔ細胞を同定することもできる。これは、組織サ
ンプルを（例えば細いニードルアスピレートによって）採取し、この中に含まれ
るサイトカインを測定することによって、達成することができる。あるいは、各
種のサイトカインに対する抗体を固定化したプラスター（plaster）を長期間適
用することによって、サイトカインをin situ測定することができる。サイトカ
インは不溶性の着色生成物を生成する酵素基質を使用して、この生成物を直接読
み取るかまたはスキャナーを使用する、通常の固相イムノアッセイ法によって、
検出される。
最後に、本発明は、
(a) 製剤上許容される組成物の形態での１以上の自己反応性物質、
(b) 場合によって、製剤上許容される組成物の形態での１以上の対照物質、
(c) 上記自己反応性物質および上記対照物質の皮内投与用の装置、および
(d) 場合によって、試験結果の診断的評価用装置、
を含む、細胞仲介性疾患またはその素質のin vivoでの診断用の試薬キットに関
する。
自己反応性物質および対照物質のための組成物は好ましくはアジュバントなら
びに場合によってはその他の一般的な医薬担体物質、希釈剤および添加剤を含有
する。
図１および２、ならびに配列表の配列番号１−30とともに、以下の実施例によ
って、本発明をさらに明らかにするつもりである。
図１は、ヒトGAD 65 kd由来の自己反応性アミノ酸配列を示す。
図２は、ヒトGAD 65 kd由来の別の自己反応性アミノ酸配列を示す。
配列番号１−７は、ヒトGAD(I)−(VII)由来の自己反応性アミノ酸配列を示す
。
配列番号８−11は、図１のヒトGAD 65 kd由来の自己反応性アミノ酸配列を示
す。
配列番号12−28は、図２のヒトGAD 65 kd由来の自己反応性アミノ酸配列を示
す。
配列番号29および30は、ヒトGAD（VIII）および（IX）由来の自己反応性アミ
ノ酸配列を示す。
実施例 １（比較例）
In vitro 試験
最近IDDMに罹患した患者８人および健常者12人から末梢静脈血を採取した。フ
ィコールハイパーク密度勾配遠心分離によって、末梢血リンパ球を単離し、
a)試験抗原としての組換えヒトGAd 65 kd；
b)陽性対照抗原としての精製タンパク質誘導体（PPD）；
c)陰性対照抗原としてのヒト血清アルブミン（HSA）：
とともに、in vitro刺激用に使用した。
培養液（RPMI 1640培地、５％ヒト血清、２mmol/lグルタミン、10U/mlペニシ
リン、10μg/mlストレプトマイシンおよび50nmol/l 2−メルカプトエタノール）
100μl中で、前記の抗原の存在下または培養液のみで、96ウェルの丸底プレ
ートのウェルで、37℃、５％ＣＯ2で５日間、末梢血リンパ球（PBL）１×105を
インキュベートした。
５日後、各ウェルに、0.5μCi 3Hチミジンを含有するRPMI 1640培地20μlを添
加した。16時間インキュベートを続け、その後細胞を収穫した。液体シンチレー
ション計数によって、チミジンの取り込みを測定した。結果を刺激指数として示
す（SI、すなわち、抗原存在下でのcpmを抗原の不在下、すなわち培地のみでのc
pmで割った値）。
個々の抗原に対するIDDM患者および対照者からのリンパ球の増殖反応を表１お
よび２に要約する。
この試験の統計学的分析によって、最近IDDMと診断された患者からのPBLのrhG
AD 65 kd存在下での増殖は4.7を超えるSI（対象者の平均＋2 SD）で、陽性とみ
なすことができることが示された。
したがって、IDDM患者の50％（患者２，３，７および８）において、in vitro
でrhGAD 65 kdに対するＴ細胞の反応が観察された。GADに対する抗体が患者１，
２，４および８において検出されたが、患者３および５では検出されなかった。
患者６および７はGADに対する抗体について試験しなかった。対照者はGAd 65 kd
に反応しなかった。
糖尿病患者および対照者は、対照のHSAおよびPPDに対する反応において、統
計学的に有意な差異を全く示さなかった。
実施例 ２
in vivo 試験
実施例１のIDDM患者８人の右前腕部に濃度10μg/mlのrhGAD 65 kd 100μlを皮
内注射した。
この抗原は１％ HSAを含有する生理食塩水pH 7.3で希釈した。陰性対照として
、右上腕部に濃度10μg/mlのHSAの同一容積（100μl）を注射した。
IDDM患者８人の内５人に、陽性対照抗原としてPPDを使用した。すべての患者
に陰性対照としてHSAを使用した。
In vivo診断のため、投与部位における小結節の形成（皮膚の厚さの特異的な
増加）を陽性反応とみなした。診断は投与の48時間後に実施した。投与部位範囲
の超音波測定によって、結果を確認し、定量した。副反応は観察されなかった。
この試験の結果を表３に示す。
試験したIDDM患者８人の内、５人がrhGAD 65に陽性反応した。
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(72)発明者 スタール，ペーター
ドイツ連邦共和国 ディー−82347 ベル
ンリード，ヒルテンシュトラーセ 12
(72)発明者 キエントシュ−エンゲル，ローズマリー
ドイツ連邦共和国 ディー−82340 フェ
ルダフィング，オーミラーシュトラーセ
９エー
(72)発明者 ジュン，グンター−ゲルハルド
ドイツ連邦共和国 ディー−72076 テュ
ビンゲン，オウフ ダー モーゲンステル
18
(72)発明者 ポツィリ，パオロ
イタリア国 アイ−00135 ロム，ビア
バロムブローザ 40
(72)発明者 ドニー，フレデリック
ドイツ連邦共和国 ディー−82377 ペン
ツバーグ，イン ダー オウ 10