JPH11508877A

JPH11508877A - バチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔ．）による半翅目害虫の制御

Info

Publication number: JPH11508877A
Application number: JP9502132A
Authority: JP
Inventors: ブライアンストックホフ; クリストファーコンラン
Original assignee: マイコーゲンコーポレーション
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-08-03
Also published as: EP0830062A1; WO1996039843A1; EP0830062B1; US5723440A; BR9608601A; DE69626509D1; ES2194108T3; NZ312327A; AU6383496A; CA2221240A1; AU713376B2; KR19990021942A; ATE233485T1; US5885963A

Abstract

(57)【要約】本発明は、半翅目害虫を制御するためのバチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis;B.t)内毒素の使用に関する。特に、B.t.の201T6株、B.t.の変種イスラエレンシス(israelensis)、およびそれらのδ-内毒素について開示する。これらの菌株および毒素を、半翅目害虫または該害虫の環境、例えば植物に投与することにより害虫を制御することが可能である。好ましい態様において、B.t.毒素を発現するよう、植物を形質転換させる。

Description

【発明の詳細な説明】バチルス・チューリンギエンシス(B.t.)による半翅目害虫の制御関連出願の相互参照本出願は、1995年6月7日に提出された特許出願第08/475,924号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、半翅目害虫を制御する方法に関する。特に、予期せぬことに、半翅目害虫、例えばリーガス・ヘスペルス(Lygus hesperus)を制御するバチルス・チューリンギエンシス(B.t.)のδ-内毒素が発見された。発明の背景土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）(B.t.) は、グラム陽性で、胞子を形成する細菌であり、パラ胞子的（parasporal）な結晶蛋白質の封入体を特徴とする。これらの封入体は、しばしば、特殊な形状の結晶として顕微鏡で見ることができる。この蛋白質は、病原生物に対して非常に毒性が強く、特異的な毒素活性を示すことがある。ある種のB.t.毒素遺伝子が単離されて配列が決定されており、組み換えDNAによるB.t.産物が製造され、使用が認められている。さらに、遺伝子工学技術を用いてこれらのB.t.内毒素を農業環境に取り入れさせるために、害虫抵抗性に関する内毒素遺伝子を用いて遺伝子工学的に改良した植物を用いたり、安定化した微生物細胞そのものをB.t.内毒素の運搬体として用いることを含む、新しい方法が開発中である(Gaertner，F.H.，L ．Kim［1988］TIBTECH 6:S4〜S7)。このように、単離されたB.t.内毒素が、商業上の価値を持ちつつある。 15年前まで、B.t.農薬の商業的な利用は、鱗翅目(毛虫)の害虫に対してだけという、狭い範囲に大きく制限されていた。バチルス・チューリンギエンシス・クルスタキ変種（Bacillus thuringiensis var．kurstaki）から調製された胞子および結晶が、長い間、鱗翅目(毛虫)用の殺虫剤として商業的に用いられてきた。例えば、B.チューリンギエンシス・クルスタキHD-1変種（B．thuringiensis var ．kurstaki HD-1）は、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を示すδ-内毒素と呼ばれるδ内毒素の結晶を産生する。しかし、近年になって、研究者たちは、ずっと広い範囲の害虫に特異性を有するB.t.農薬を発見した。例えば、別のB.t.種、すなわちB.t.イスラエレンシス変種（B.t．var．israelensis）およびB.t．テネブリオニス変種（B.t．var．tene brionis）(M-7、B.t．san diegoとしても知られている)が、それぞれ、双翅目と鞘翅目の昆虫を制御するために商業的に用いられてきた(Gaertner，F.H.[1989] 「殺虫性蛋白質の細胞内輸送システム：生きているまたは死んでいる微生物(Cel lular Derivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms)」Controlled Derivery of Crop Protection Agents，R.M．Wil kins編、TaylorおよびFrancis，New York and London，1990，245〜255)。また、[Couch,T.L.(1980)「バチルス・チューリンギエンシスイスラエレンシス変種の蚊病原性(Mosquito Pthogenicity of Bacillus thuringiensis var．israelen sis)」、Deveropments in Industrial Microbiology 22:61〜76]および[Beegle, C.C.,(1978)「農業生態系における昆虫生産性細菌の使用(Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems)」、Developments in Industrial Microbiology 2 0:97〜104]を参照のこと。[Kriegら、Klieg,A.，A.M.Huger，G.A.Langenbruch， W.Schnettter［1983］Z．ang．Ent．96:500〜508]は、バチルス・チューリンギエンシス・テネブリオニス変種（Bacillus thuringiensis var．tenebrionis）が鞘翅目の２種の甲虫に対して有効であると説明している。これらは、コロラド・ジャガイモ甲虫のレプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemline ata）および甲虫アゲラスチカ・アルニ（Agelastica alni）である。最近、新しいB.t.の亜種が同定され、活性δ内毒素蛋白質をコードする遺伝子が単離された(Hofte,H.，H.R.Whiteley［1989］Microbiological Reviews 52(2) :242〜255)。ヘフテ（Hofte）およびウィトリー（Whiteley）は、B.t.結晶蛋白質遺伝子を４種類に大別した。これらは、CryI(鱗翅目特異的)、CryII(鱗翅目および双翅目特異的)、CryIII(鞘翅目特異的)、およびCryIV(双翅目特異的)である。プレフォンテインら(Prefontaine,G.，P.Fast，P.C.K.Lau，M.A.Hefford，Z.H annna，R.Brosseau［1987］Appl．Envirol．Microbiol．53(12):2808〜2814)は、鱗翅目に有効な遺伝子を分類する上で有用なプローブの説明をしている。他の害虫に特異的に有毒な菌株が発見されたことも報告されている(Feitelson,J.S. ，J.P ayne，L.Kim［1992］Bio/Technology 10:271〜275)。 B.t.結晶毒素は、一般にプロ毒素であり、活性のある毒素を生成するするためには、一定の物理化学的な条件(すなわち、pH、酸化還元、イオン強度)か、一定のプロテアーゼの作用、またはその両者が必要だと考えられている(Hofteおよび Whiteley,前記)。ほとんどの場合は、昆虫が毒素を活性化する条件を提供するが、至適な活性(Jacquet,J.，R.Hutter，P.Luthy［1987］「バチルス・チューリンギエンシスデルタ内毒素の特異性(Specificity of Bacillus thuringiensis del ta-endotoxin)」Appl．Environ．Microbiol．53:500〜504)を得、または活性を検出する(Lambert,B.，H.R.Hofte，K.Annys，S.Jansens，P.Soetaert，M.Pefero en［1992］「鞘翅目幼虫に対してサイレントな活性を有する新規のバチルス・チューリンギエンシス殺虫性結晶蛋白質(Novel Bacillus thuringiensis insectic idal crystal protein with a silent activity against coleopteran larvae) 」Appl.Environ.Microbiol．58:2536〜2542)ために、予め可溶化ないし蛋白分解されていることが必要な場合も報告されている。 B.t.結晶蛋白質遺伝子の大腸菌におけるクローニングおよび発現が、発表文献に開示されている(Schnepf,H.E.，H.R.Whiteley［1981］Proc．Natl．Sci．USA 78:2893〜2897)。米国特許第4,448,885号および米国特許第4,467,036号はいずれも、B.t.結晶蛋白質の大腸菌における発現を開示している。米国特許第4,797,27 6号および第4,853,331号は、さまざまな環境で鞘翅目害虫を制御するために用いることができるB.チューリンギエンシス（B．thuringiensis）のテネブリオニス (tenebrionis)菌株(M-7、B.t．san diegoとしても知られている)を開示している。米国特許第4,918,006号は、双翅目害虫に対して活性を有するバチルス・チューリンギエンシス・イスラエレンシス（B.t．var．israelensis）毒素を開示しており、約27 kDの蛋白質およびその断片が、双翅目に対する効果に関与することが報告されている。米国特許第4,849,217号は、アルファルファ・ゾウムシ（a lfalfa weevil）に対して活性を有するB.t.菌株を開示している。米国特許第5,1 51,363号および米国特許第4,948,734号は、線虫に対する活性を有するある種のB .t.菌株を開示している。多くの研究と資源の投入の結果、新しいB.t.菌株およびB.t.菌株の新しい利用に関する他の特許が発行されている。しかし、新しいB. t.菌株の発見と、既知のB.t.菌株の新しい利用は、依然として経験に依存する予測不可能な技術のままである。半翅目は、今日までB.t.δ-内毒素によって効果的に制御することができなかった昆虫の主要な群である。数多くの半翅目害虫の種、中でもリーガス(Lygus) 種により、毎年甚大な植物被害および経済的な損失がもたらされている。半翅目は、経済的損失をもたらす目のトップを占めている。「アーネット(Arn ett),R.H．Jr．([1985]American Insects，Van Nostrand Reinhold Co.，Inc.， NY)」参照。すべての半翅目の中で、ミリッド(mirids)(半翅目:Miridae;Lygusを含む)は、穀物害虫として最も悪名が高い。食い荒らしによる傷害により植物が弱ると言うのが、植物病伝播の一つの様式である。L.ヘスペルス(hesperus)の他に害虫となるリーガス(Lygus)には、L.リネオラリス(lineolaris)(Beauv.)、L. プラテンシス(pratensis)(L.)、L.ルグリペンニス・ポップ(rugulipennis Popp) 、および通常の緑色カプシド(リーガス・パブリナス(Lygus pabulinus)(L.))がある。この属のメンバーは、木綿、馬鈴薯、砂糖大根、セロリー、豆、桃、リンゴ、ムラサキウマゴヤシ(alfalfa)、ナシ、西洋スモモ、マルメロおよび様々の苗木、観賞植物および蔬菜の上など、多方面で見いだされる。具体的なミリッド(M irid)害虫には、以下のものが含まれる：馬鈴薯とアブラナ(brassicas)(例えば、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、ちりめんキャベツ(kale)、芽キャベツ、かぶら)の害虫である、馬鈴薯カプシドカロコリス・ノルベジカス(Calocori s norvegicus)(Gmel.)；人参、セロリ、アメリカぼうふう(parsnip)、パセリおよびイノンド(dill)の害虫である、干草虫(stack bug)(ニンジン植物虫[carrot plant bug]とも言う)オルトプス・カンペストリス(Orthops campestris)(L.)；リンゴ、スグリ(currants)および西洋スグリの害虫である、リンゴカプシドプレシオコリス・ルジコリス(Plesiocoris rugicollis)(Fall.)；トマトの害虫である、トマト虫キルトペルティス・モデスタス(Cyrtopeltis modestus)(Distant)；タバコの害虫である、吸血ハエキルトペルティス・ノテイタス(Cyrtopeltis not atus)(Distant)；芝草に有害で、特にゴルフ場の芝に対する害が顕著な白斑のあるノミバッタ(flea hopper)スパナゴニカス・アルボファシアタス(Spanagonicus albofasciatus)(Reuter)；砂糖大根の害虫である、さいかちの樹(honeylocust p lant)虫ディアフィノコリス・クロリオニス(Diaphnocoris chlorionis)(Say)；栽培および野生タマネギの害虫である、タマネギ植物虫ラボピディコラ・アリイ(Labopidicol a allii)(Knight)；木綿に見いだされる木綿ノミバッタシューダトモセリス・セリエイタス(Pseudatomoscelis seriatus)(Reuter)；時に、木綿および豆科植物の害虫となる敏捷な植物昆虫アデルフォコリス・ラピダス(Adelphocoris rapidu s)(Say)；しばしば庭園作物の害虫となる4本縞の植物昆虫ポエシロカプサス・リネエイタス(Poecilocapsus lineatus)(Fabricius)。その他の半翅目害虫には、以下のものが含まれる：トウモロコシ、サトウモロコシ、小麦、きび、米、大麦、ライ麦、およびオート麦の害虫である、リゲイデ(Lygaeidae)(種虫科): ナンキンムシ(chinch bug)( ブリッサス・ロイコプテラス(Blissus leucopterus)(Say))；アブラナ、砂糖大根および馬鈴薯の害虫である、ナンキンムシモドキ(Nysius spp.、例えば、N.エリセ(ericae)、N.raphanus Howard)。ペンタトマイデ(Pentatomidae)(ヘッピリムシ科): 褐色のヘッピリムシユーシスタス・サーバス(Euschistus servus(Say))は、木綿の害虫である。緑色のヘッピリムシニザラ・ヴィリデュラ(Nezara viridula(L.))は、苗木一般、特に野菜および豆科植物の害虫である。ユーリガスター(Eurygaster)種、例えばE.アウストリカ(austrica)(Schr.)およびE.インテグリセプス(integriceps)(Put.)(小麦盾虫(wheat shield bug)、サン(Sunn)害虫、センムシ(Senn bug))は、小麦および大麦を攻撃する。コレイデ(Coreidae)(カメムシ[squash bug]科): アナザ・トリスティス(Anasa tristis)(DeGreer)(カメムシ)は、カボチャの局所的な害虫であり、A．アルミゲラ(armigera)(Say)(有角カメムシ)は、時々栽培キュウリの害虫となる。ピリョコリデ(Pyrrhocoridae)(赤虫red bugおよびホシカメムシ科): ホシカメムシジスデルカス・サチュリラス(Dysdercus suturellus)(Herrich-Schaeffer) は、木綿の害虫である。ティンギデ(Tingidae)(レース虫[lace bug]科): コリテュカ・アーキュエイタ( Corythucha arcuata)(Say)は、しばしば、バラ、カエデ、リンゴおよび栗の害虫となる。コリテュカ(Corythucha)種には、その他、木綿レース虫、菊レース虫、ニレレース虫およびサンザシレース虫が含まれる。ベロストマティデ(Belostomatidae)(巨大タガメ[water bug]科): この科のメンバーは、魚を襲い血を吸うことで知られており、魚の孵化場で害虫になる可能性がある。レデゥビデ(Reduviidae)およびキミシデ(Cimicidae)(それぞれ、オオサシガメ (kissing bug)およびトコジラミ(bed bug)を含む)のメンバーは、哺乳類を咬み、ヒトに感染性の疾病を伝播させる。半翅目の消化器系は、昆虫の中では幾つかの点で通常と異なる。ある加水分解性消化酵素、例えばトリプシンが欠如しており、中腸に囲食膜がなく、そ嚢(cro p)がない。これらの特徴は、食餌が液体性であること、摂食が吸い込み様式であることを反映しており、進化論的な制約を受けている。食餌、摂食様式、および消化生理学および生化学における差違のため、食葉性昆虫に対し殺虫作用を有する蛋白質が、液体摂取性の半翅目にも効果があるだろうと期待することは必ずしも当を得ていない。 1991年1月9日に寄託されたバチルス・チューリンギエンシス PS201T6、NRRL B -18750、またはそのδ-内毒素は、ある種の害虫に活性であることがすでにわかっている。例えば、B.t.PS201T6の使用について開示されている、米国特許第5,2 73,746号、第5,298,245号、および第5,302,387号を参照のこと。B.t.PS123D1菌株は、欧州特許第0 409 438号に開示されている。B.t.PS71M3菌株は、欧州特許第0 626 809号および米国特許第5,273,746号に開示されている。上記特許には、 B.t.菌株を半翅目害虫の制御に使うことは開示されていないし、その様な示唆もない。本発明の実施により、化学的殺虫剤に代わって、半翅目害虫を制御するもう一つの選択肢が提供される。これにより、環境により優しい昆虫管理が可能となり、殺虫剤に対する耐性を管理するための手段も提供される。発明の簡単な概要本発明は、半翅目害虫を制御するためのバチルス・チューリンギエンシス(B.t .)のδ-内毒素の使用に関する。本明細書中で詳細に例示されているのは、半翅目害虫リーガス・ヘスペルス(Lygus hesperus)を制御するための、B.t.PS201T6菌株およびそれに由来する毒素の使用である。B.t.イスラエレンシス(israelensis )変異株および毒素の使用についても説明されている。本発明には、例示されている菌株および毒素と実質的に同じ殺虫作用を有する、例示的B.t.菌株および毒素の変異型の利用も含まれる。これらの変異型には、突然変異微生物が含まれる。突然変異種を作製する方法は、微生物学の分野においては周知である。紫外線およびニトロソグアニジンのような化学的突然変異誘発物質がこの目的のために広く使われている。本発明に従い、B.t.毒素を発現するよう形質転換された組換え宿主を用いることもできる。これらの組換え宿主は、例えば、微生物であっても良いし植物であってもよい。本発明に従い、半翅目害虫は、B.t.菌株自身、B.t.菌株の変異種、該菌株から得られたδ-内毒素、菌株の培養物から作られた市販の調製物、またはこの菌株のDNAによって作出される毒素を用いて制御することができる。一つの態様において、毒素は、別の宿主で形質転換されたDNAによって作出してもよい。一つの好ましい態様において、形質転換宿主は、植物である。配列の簡単な説明配列番号：１は、PS201T6の約30 kDaの毒素をコードするヌクレオチド配列である。配列番号：２は、PS201T6の、約30 kDaの毒素の推定アミノ酸配列である。配列番号：３は、約25 kDaの短縮(truncated)201T6毒素のアミノ酸配列である。発明の詳細な開示本発明は、δ-内毒素の半翅目昆虫による摂取と言う形での、該害虫とバチルス・チューリンギエンシス(B.t.)δ-内毒素との接触を含む、半翅目害虫を制御する新規な方法の発見に関する。詳細に例示されているのは、PS201T6として知られているB.t.菌株由来の毒素の使用である。半翅目害虫を制御するための、バチルス・チューリンギエンシスイスラエレンシス変異株(Bacillus thuringiensi s var．israelensis)(B.t.i.)由来の毒素の使用も例示されている。バチルス・チューリンギエンシスPS201T6菌株は、生物学的に純粋な形では、B .t．HD-1と比較して、以下のような特徴を有する。 B.t.のイスラエレンシス(israelensis)変種は、当業者には良く知られており、容易に認識される。B.t.のイスラエレンシス種と一般に結びつけれている特徴には、双翅目活性、H14血清型、および約28〜33 kDaの蛋白質と、通常約70 kDa と130 kDaの付加的な蛋白質とを含む蛋白質パターンが含まれる。イスラエレンシス(Israelensis)型の毒素を発現する他のB.t.変種も、本発明に従って用いることができる。これらの毒素は、B.t.i.によって産生される毒素と同様の大きさで、双翅目活性を含む同様の活性プロフィールを有する。例えば、B.t．モリソニ変株(var.morrisoni)8a、8b血清型は、B.t.i.型の毒素を発現すると報告されている。この様な菌株の1例はPS71M3である。本明細書で用いられる「バチルス・チューリンギエンシスイスラエレンシス変異株(Bacillus thuringiensis var ．israelensis)毒素」という語には、B.t.i.によって発現される毒素に類似または関連しているが、B.t.の別の変種によって偶然にも発現された毒素が含まれる。 PS123D1と名付けられた菌株は、本発明で、有用なB.t.i.菌株として、詳細に例示されている。半翅目害虫の制御で特に関心がもたれるのは、B.t.i.菌株の約 28〜33 kDaの毒素、または好ましくはこの毒素の修飾型である。本発明の態様の一つとして、半翅目を制御するための、28 kDa PS123D1毒素の短縮型(truncated )の使用が含まれる。その具体例は、N末端から取られたアミノ酸を有する、約25 kDaの短縮型毒素である。本明細書で用いられる短縮型(truncated)毒素は、B.t .培養上清の処理および／またはB.t.培養株を、内因性プロテアーゼの有利な効果の結果、活性型毒素が産生されるような適当な条件下で増殖させることにより得られる。他の修飾、例えばB.t.i.毒素の可溶化をもたらす修飾も、活性の極めて高い毒素を得るのに利用できる。バチルス・チューリンギエンシス菌株PS123D1は、生物学的に純粋な状態のとき、以下の性質を有する。この出願で開示されている培養菌は、合衆国イリノイ州61604ピオリア市ノース大学通り1815、北部地域研究センター、農業研究サービス特許培養物コレクション(NRRL)に寄託されている。本培養菌は、特許庁長官によって、37 CFR 1.14および35 U.S.C．122により権利付与されるべきと決定された者に対して、この特許出願が係属する期間、培養菌の入手が可能なことが保証されている条件の下で寄託されている。本特許出願に相当する出願またはその継続出願が提出されている外国の特許法で要求されているところにしたがい、寄託菌を入手することが可能である。しかし、寄託菌を入手できることが、行政行為によって付与された特許権を逸脱して、本発明を実施する許可を与えるものではないことを理解さるべきである。さらに、本寄託培養物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の条項、すなわち、寄託された試料の供給の請求が最後になされてから5年間以上、またいずれの場合も寄託された日付から30年間以上、または培養物の開示を行いうる特許の実施期間中は、汚染されることなく生存を図るために必要な注意をできる限り払って貯蔵されるべきであるという条項に従って、貯蔵され、一般に入手可能な状態に置かれる。寄託者は、寄託物の条件が原因で、請求があっても受託者が試料を供給できないときには、寄託物を交換する義務があることを承認している。本寄託培養物を一般的に利用することに対するあらゆる制約は、それらを開示する特許の認可によって、取り消されることなく解除される。本発明の一つの好ましい態様において、B.t.PS201T6菌株由来の毒素を半翅目害虫の制御を果たすために用いる。もう一つの好ましい態様では、PS201T6毒素は、活性化される。毒素は、例えば、天然に存在する化合物または培養物から産生される化合物の作用による該毒素の活性化を促進するような条件下で微生物を培養することによって、活性化することができる。活性化は又、バチルス・チューリンギエンシスPS201T6株の培養物またはその上清に、ある化合物を加えることによっても達成される。該化合物は、該毒素への直接作用によりまたは第2の化合物の作用を促進することにより、該毒素の活性化に関与する。付加的化合物としては、例えば、プロテアーゼまたは培養もしくは上清のpHを上げるような化合物がある。バチルス・チューリンギエンシスPS201T6は、米国特許第5,273,746号が公布されたため、現在では制限なく一般入手することが可能である。プラスミドpMYC23 62は、PS201T6由来の130 kDaの毒素をコードする遺伝子を含む。プラスミドpMYC 2357は、PS201T6由来の30 kDaの毒素をコードする遺伝子を含む。PS201T6由来の遺伝子クローニングの実例に関するこれ以上の情報については、欧州特許出願第 0 708 830号および国際公開公報第95/02694号に記載されている。PS71M3由来の遺伝子クローニングのその他の例は、国際公開公報第95/02694号および欧州特許出願第0 457 498号に記載されている。遺伝子および毒素本発明の一つの態様において、半翅目害虫に対して活性な B.t.毒素をコードする遺伝子が、適当な宿主を形質転換させるために用いられる。本発明に係る有用な遺伝子および毒素には、全長配列だけでなく、特に例示された毒素の殺虫活性特性を保持している、これらの配列の断片、異型、変異体および融合蛋白質も含まれる。本明細書において用いられるように、遺伝子の「異型」または「変異」という語は、同じ毒素をコードするヌクレオチド配列、または同等の殺虫活性を有する毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において用いられるように、「等価的毒素」という語は、標的害虫に対して、請求の範囲の毒素と同じか、本質的に同じ生物学的活性を有する毒素を意味する。いくつかの方法を用いて、半翅目に有効な毒素をコードする遺伝子を同定し得ることができることは、本開示の有用性から当業者には明らかであると思われる。該遺伝子は、上記の培養細胞寄託機関に寄託されている菌株から得てもよい。また、これらの遺伝子、またはその一部もしくは変異体を、例えば遺伝子合成機を用いて合成して作成することもできる。遺伝子の変異体は、点突然変異を作出する標準的な技術を用いて、容易に構築することができる。また、標準的な手順にしたがって、市販のエクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて、これらの遺伝子の断片を作成することもできる。例えば、Bal31のような酵素および部位特異的突然変異誘発を用いて、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを規則正しく切り出すことができる。また、さまざまな制限酵素を用いて、活性断片をコードする遺伝子を得ることもできる。これらの毒素の活性断片を直接的に得るために、プロテアーゼを用いてもよい。等価的毒素、および/またはこれらの等価的毒素をコードする遺伝子は、B.t. 菌株および/またはDNAライブラリーから、本明細書によって提供される指示に従って得ることができる。本発明の殺虫毒素を得るために、多くの方法がある。例えば、本明細書において開示され、請求の範囲に記載されている殺虫毒素に対する抗体を用いて、蛋白質の混合物の中から別の毒素を同定、分離することができる。特に、最も定常的で他のB.t.毒素と最も明瞭に識別される毒素部位に対して抗体を作製することができる。そして、これらの抗体を用いて、免疫沈降もしくは酵素結合免疫測定法(ELISA)、またはウェスタン・ブロッティングによって、特徴的な活性を有する等価的毒素を特異的に同定することができる。本明細書において開示される毒素もしくは等価的毒素、またはこれらの毒素の断片に対する抗体は、当業における標準的な手法を用いて容易に調製することができる。そして、これらの毒素をコードする遺伝子を微生物から得ることができる。例示された毒素の殺虫活性を保持している断片および等価物も、本発明の範囲内にある。また、遺伝子コードの縮重のため、さまざまに異なったDNA配列が、本明細書に開示されたアミノ酸配列をコードすることができる。同じ毒素、または本質的に同じ毒素をコードする代替DNA配列を作成することは、当業者の技術の範囲内に当然含まれる。これらの変異DNA配列は、本発明の範囲内にある。本明細書において用いられるように「本質的に同じ」配列という語は、アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を有し、蛋白質の殺虫活性に実質的に影響しない配列を意味する。本発明の毒素および遺伝子を同定するための、さらに別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブを用いることによる。これらのプローブは、検出のための手段を有するヌクレオチド配列である。当業者によく知られているように、プローブ分子と核酸試料部分が、二分子間で強い結合を形成することによりハイブリダイズすれば、プローブと試料部分は、実質的に相同であると合理的に推定できる。プローブによる検出方法は、ハイブリダイゼーションが起きたか否かを既知の条件で判定するための方法を提供する。このようなプローブ解析は、本発明の毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして用いられるヌクレオチド部分は、標準的な方法により、DNA合成機を用いて合成することができる。これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとして用いることもできる。組換え宿主本明細書に開示されている菌株が有する毒素をコードする遺伝子を、広い範囲の微生物宿主または植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子を発現させると、毒素が直接的または間接的に産生される。例えば、シュードモナスなどの適当な微生物宿主を用いて、該微生物を害虫のいる場所に散布し、そこで増殖させ、害虫に摂取させることができ、その結果、害虫を制御できる。または毒素遺伝子を有する微生物を、毒素活性を持続させ、細胞を安定させる条件の下で処理することができる。処理した細胞は、毒素活性を維持しているため、標的害虫の周囲に散布することができる。微生物細胞の処理の方法は、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されている。遺伝子の維持および発現を安定させる条件の下で、毒素をコードするB.t.遺伝子を、微生物の宿主の中に導入するために、さまざまな方法が利用できる。これらの方法は、当業者によく知られており、例えば米国特許第5,135,867号に開示されており、これは本明細書に参照として包含される。さらに、殺虫性毒素を産生する能力をこれらの植物に付与するため、植物にB. t.遺伝子を導入するための材料および方法は、当技術分野で周知である。一つの好ましい態様において、選択された植物宿主における最適安定性および発現を促進するためにB.t.遺伝子は修飾される。これに関して、米国特許第5,380,831号が、参照として本明細書に組み込まれる。変異体当業において周知の方法によって、本明細書に記載されている菌株から変異体を作成できる。例えば、菌株をエチルメタンスルホン酸(EMS)突然変異誘発によって、胞子を形成しない変異体を得ることができる。当業において周知の方法によって、紫外光およびニトロソグアニジンを用いて変異体を作出できる。以下は、本発明を実施するための実験方法を例示した実施例である。これらの実施例は、本発明を制限するものではない。別記されない限り、すべてのパーセントは重量比であり、溶液の割合は容量比である。実施例1-B.t.PS201T6系統の培養 B.t.菌株PS201T6系統の継代培養液を用いて、以下のペプトン、グルコース、塩類培地に接種する。細菌培養用ペプトン 7.5 g/l グルコース 1.0 g/l KH₂PO₄ 3.4 g/l K₂HPO₄ 4.35 g/l 塩類溶液 5.0 ml/l CaCl₂溶液 5.0 ml/l 塩類溶液(100 ml) MgSO₄・7H₂O 2.46 g MnSO₄・H₂O 0.04 g ZnSO₄・7H₂O 0.28 g FeSO₄・7H₂O 0.40 g CaCl₂溶液(100 ml) CaCl₂・2H₂O 3.66 g pH 7.2 塩類溶液およびCaCl₂溶液は、フィルター滅菌して、接種するときに、オートクレーブして調製した培地に加える。フラスコは、30℃、回転培養器中200 rpm で64時間インキュベートする。上記の方法は、当業において周知の方法によって、大型発酵器に合わせて、容易に容量を増加させることができる。上記の発酵によって得られたB.t.胞子と結晶は、当業において周知の方法によって分離することができる。頻繁に用いられる方法は、回収した発酵培地に分離技術、例えば、遠心分離を行うことである。実施例2-活性化201T6毒素(201T6-D)の産生 201T6毒素の切断をもたらす様々な方法により、活性化201T6毒素を作出することができる。この点に関しては、国際公開公報第95/02693号を参照のこと。この様な方法の1つでは、PS201T6の培養株を遠心分離で回収し、プロナーゼE(pronas e E)(シグマケミカル社(Sigma Chemical Company)、P-5147 XIV型細菌プロテアーゼ、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来)を0.5mg/m l含む0.1 Na₂CO₃/NaHCO₃ pH 11.0に、最初の培養容積の1/9〜1/25倍量で再懸濁した。懸濁液を撹拌しながら、37℃で一晩インキュベートした。「透析懸濁液」を得るため、懸濁液を、50〜100倍容の蒸留水または0.1 M Na₂CO₃/NaHCO₃ pH 9. 5に対し、液を2回交換して透析した。 0.1 M Na₂CO₃/NaHCO₃ pH 9.5による透析から得られた懸濁液を遠心して細胞、胞子、および砕片を除く。「濾過上清」を得るため、ワットマンのガラス微細繊維フィルター、0.8ミクロンセルロースアセテートフィルター、および0.2 ミクロンセルロースアセテートフィルターによる濾過で、胞子および砕片の更なる精製を行うことができる。加工処理した毒素の乾燥調製物は、濾過の前または後に、50〜100倍容の蒸留水に対し、液を2回換えて透析した後、凍結乾燥することにより調製した(凍結乾燥、プロナーゼ(pronase)処理毒素)。実施例3-活性化201T6毒素の作出のための別の方法 PS201T6の培養株を遠心分離で回収し、0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃、0.5％ 2-メルカプトエタノール、pH 11.0に、最初の培養容積の1/9〜1/25倍量で再懸濁した。懸濁液を室温で、約2時間インキュベートした。細胞、胞子、および砕片を除去するために懸濁液を遠沈した。「濾過上清」を得るために、ワットマン(Whatman) ガラス微細繊維フィルター、0.8 ミクロンセルロースアセテートフィルター、および0.2 ミクロンセルロースアセテートフィルターによる濾過により、胞子および砕片の更なる精製を行った。「透析懸濁液」を得るために、懸濁液を2回、50 〜100倍容の蒸留水または0.1 M Na₂CO₃/NaHCO₃ pH 9.5に対して透析した。加工処理した毒素の乾燥調製物は、濾過の前または後に、50〜100倍容の蒸留水に対し2回透析した後、凍結乾燥することにより調製した。この方法で調製された材料は、本明細書中では201T6-Dと呼ぶ。実施例4-半翅目害虫リーガス・ヘスペルス(Lygus hesperus)に対するB.t.菌株の活性 L.ヘスペルス(hesperus)の5匹の新生(≦1週齢)幼虫を、横にガス交換のための 2つのピンホールを備える1.0 ozのプラスティック分別コップ(Fabrikal社)に入れた。液性排泄物を吸収させるため、スコット・マイクロワイプ(Scott MICROWIP ES )組織の小片をコップの底に置いた。蓋の代わりに、間に200 μlの試験液を入れた2枚のパラフィルムを開口部に張り渡した。「自動処理された」 B.t．PS201T 6細胞培養ブイヨン(実施例3に記述されているように、内在するプロテアーゼで活性化されている)を、L.ヘスペルス(hesperus)の成虫に与えた。自動処理されたブイヨンには、約4.5 mg/mlの毒素が含まれると推定された。ブイヨン1 mlを1 5％蔗糖液で100 mlに希釈した。それによって生ずる45 μg/ml溶液の200 μlを試験液として使用した。昆虫は、3日間給餌した。3日後の死亡率を飢餓状態の昆虫の死亡率と比較し、対照昆虫から、毒素を含まない15％蔗糖液の「ブランク(b lank)」が得られた。3日後に、B.t．PS201T6 45 μg/mlの活性を確かめた上で、 2日後に10 μg/mlの活性を定めるための実験を引き続き行った。代表的な結果を表3および4に示す。実施例5-半翅目昆虫リーガス・リネオラリス(Lygus lineolaris)に対する、B.t.P S201T6菌株の活性濾紙生物検定法に代わるものとして、昆虫には、試験混合液で飽和させた、「 SCOTCH BRITE」またはそれと同等の物質を与えた。「スコッチブライト(SCOTCH BRITE)」メッシュ材は、バイオラド社(BioRad)の「ミニトランス-ブロット(MINI TRANS-BLOT)」細胞繊維パッド(8x11 cm)を、一辺が、約0.5 cmの立方体に切ったものである。立方体を試験溶液で飽和させ、その1つを、L.リネオラリス(lineol aris)成虫1匹と共に、1.25 ozの「ソロ(SOLO)」カップ社(Cup Company)のプラスティック製スフレカップの中に置く。容器はスフレカップの蓋で密閉し、充分な換気が行われるようカップか蓋に数個のピンホールを作る。昆虫は、自由に摂食させ、4日後に死亡率を測定する。試験液は、蛋白質試料またはブランクに、濾過滅菌した(0.2 μm)蔗糖液を、最終試験溶液で所望の蛋白質濃度および10％蔗糖を得るのに必要な量加えて調製した。蛋白質は、実施例3に記述したようにして入手できる。蔗糖溶液を濾過滅菌する前に、摂食を促進する視覚刺激を与えるために、食品グレードの緑色野菜色素(Iris Co.)を加えた。摂食は、すぐ見られ、色をつけた試験液を含むキューブを与えると数分以内で、昆虫が、吻針をキューブ網の中に挿入しているのが見られた。その少し後、通常、給餌開始数分以内に、色の付いた排泄物が認められた。結果は表5に示してある。用量は、μｇ毒素/mL食餌で表してある。緩衝液ブランク対照およびBSA対照は、陰性対照として用いた。緩衝液ブランクは、1000μg/m l処理のバックグラウンドと同等の濃度になるようにした。BSA対照は、食餌mL当たり500 μgになるようにした。実施例6-B.t.i.由来の有効毒素 123D1 28 kDa毒素のN末端の部分を取り除くと、その作用の有効性を上昇させるように、この毒素が有利に活性化された。アミノ酸の削除は、トリプシンもしくは他の適当な酵素、または酵素混合液、例えば、プロナーゼおよびB.t.培養液中に存在する内生の蛋白質などで処理して行うことができる。本明細書で提供される指示を用いて、別の生物学的に有効な断片を得ることもできる。本開示によって利益を受ける当業者は、B.t.毒素の活性を最適にするために、 B.t.培養菌を増殖させるために用いられる特別な培地を修正できることを容易に理解されると思われる。例えば、培養培地を調整したり、変更したりして、細胞の密度を調節することができる。また、プロテアーゼを含む培地を用いて、B.t. 毒素の活性を上昇させることができる。実施例7-毒素遺伝子の植物への挿入本発明の1つの局面は、半翅目害虫に対して活性な毒素をコードする遺伝子で、植物を形質転換させることである。形質転換植物は、半翅目による攻撃に対し抵抗性になる。本明細書で開示されているように、殺虫性の毒素をコードする遺伝子は、当技術分野では周知の様々な技術を用いることによって植物細胞に挿入することができる。例えば、大腸菌の複製系と形質転換細胞の選択を可能にするマーカーとを含む多くのクローニング・ベクターが、高等植物への外来遺伝子の挿入のための調製に利用可能である。ベクターには、例えば、pBR322、pUC系、M13mp系、pACY C184などが含まれる。従って、B.t.毒素をコードする配列を、適当な制限部位でベクターに挿入することができる。生じたプラスミドは大腸菌の形質転換に用いられる。大腸菌細胞は、適当な栄養培地の中で培養してから、回収し溶解させる。プラスミドは回収する。配列解析、制限解析、電気泳動、およびその他の生化学-分子生物学的手法が、解析の手段として、一般的に行われる。各操作の後で、使用したDNA配列を切断し次のDNA配列と結合させることができる。プラスミドの各配列は同じプラスミドまたは別のプラスミドでクローン化することができる。所望の遺伝子を植物に挿入する方法によっては、他のDNA配列が必要となることもある。例えば、植物細胞の形質転換にTiまたはRiプラスミドが用いられる場合には、TiまたはRiプラスミドのT-DNAの、少なくとも右の境を、多くの場合には右および左の境を、挿入されるべき遺伝子の隣接領域として結合させなければならない。植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用は、集中的に研究されており、欧州特許第120 516号に、充分に記述されている;Hoekema(1985)In: The Binary Plan t Vector System，Offsetdurkkerij Kanters B.V.，Alblasserdam、第5章;Frale yら，Crit.Rev.Plant Sci．4:1〜46;およびAnら(1985)EMBO J．4:277〜287。挿入されたDNAは、一度ゲノムに組み込まれると、そこでは比較的安定で、原則としてもう一度出てくるということはない。通常カナマイシン、G 418、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、または特にクロラムフェニコールのような殺菌剤または抗生物質に対する抵抗性を形質転換植物に付与する選択マーカーを含んでいる。従って、個別に用いられたマーカーにより、挿入されたDNAを含まない細胞ではなく、形質転換細胞を選択することが可能となる。植物宿主細胞にDNAを挿入するための多くの方法が利用できる。これらの方法には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)またはアグロバクテイリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を形質転換物質に用いた、T-DNAによる形質転換、融合、注射、バイオリスティックス(微細粒子照射)、または電気的穿孔法およびその他の可能な方法が含まれる。形質転換にアグロバクテリウムを用いる場合は、挿入するDNAを特定のプラスミド即ち中間ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかに、クローニングしなければならない。中間ベクターは、T-DNAの配列と相同な配列による相同的組換えで、TiまたはRiプラスミドに組み込むことができる。TiまたはRiプラスミドは、T-DNAの移入(transfer)に必要なvir領域も含んでいる。中間ベクターはアグロバクテリウムの中で自律複製できない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドを使って、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに移入することができる(接合)。バイナリーベクターは、大腸菌でもアグロバクテリウムでも自律複製できる。バイナリーベクターは、選択マーカー遺伝子とリンカー、またはT-DNAの右および左の境界領域で枠取りされたポリリンカーとを含む。それらを、直接アグロバクテリウムへ形質転換させることができる(Holstersら[1978］Mol.Gen.Genet．163:181〜 187)。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウムは、vir領域を有するプラスミドを含んでいなければならない。Vir領域は、植物細胞へのT-DNAの移入に必要である。付加的なDNAが含まれていても良い。その様にして形質転換された細菌を、植物細胞の形質転換に用いる。植物細胞へのDNAの移入には、植物外植片( explant)を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacien s)またはアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)と共に培養するのが便利である。選択のための抗生物質または殺菌剤を含む適当な培地の中で、感染した植物材料(例えばいくつかの葉、茎の切片、根、およびプロトプラストまたは懸濁培養した細胞)から、完全な植物体を再生させることもできる。次に、その様にして得られた植物について、挿入されたDNAの有無を調べることができる。注射および電気的穿孔の場合には、プラスミドに関して特別に要求されることはない。例えばpUC誘導体のような普通のプラスミドを使うことが可能である。形質転換細胞は植物体中で普通の様式で増殖する。それらは、生殖細胞を形成し、形質転換された特性を後代植物に伝達することができる。これらの植物は通常の様式で育成し、同じ形質転換遺伝因子を有する植物または別の遺伝因子を有する植物と交配させることができる。生じたハイブリッド個体は、対応した表現型を有する。本発明の好ましい態様において、植物は、コドン使用が植物に最適化された遺伝子を用いて形質転換される。例えば米国特許第5,380,831号を参照のこと。短縮(truncated)毒素をコードする植物も便利に用いられる。典型的な短縮毒素は、毒素全長の約55〜80％をコードする。当技術分野では、植物に用いる合成B.t. 遺伝子を作製する方法も知られている。実施例8-新規B.t.遺伝子の昆虫ウイルスへのクローニング多くのウイルスが昆虫に感染することが知られている。これらのウイルスには、例えば、バキュロウイルスおよび昆虫ポックスウイルスが含まれる。本発明の一つの様態において、本明細書に記述されている様に、半翅目に活性な遺伝子を、昆虫ウイルスのゲノムに入れ、ウイルスの病原性を高めることもできる。B.t. 毒素遺伝子を有する昆虫ウイルスを構築する方法は周知であり、当業者には、容易に実行可能である。これらの方法は、例えばメリーウェザー(Merryweather)らによって記述されている(Merryweather，A.T.，U.Weyer，M.P.G.Harris，M.Hirs t，T.Booth，R.D.Possee[1990]J.Gen.Virol.71:1535〜1544)およびMartensら(Ma rtens,J.W.M.，G.Honee，D.Zuidema，J.W.M．van Lent，B.Visser，J.M.Vlak[19 90]Appl.Environmental Microbiol．56(9):2764〜2770)。本明細書に開示された実施例および態様は、具体例を示すことのみを目的とするものと理解されるべきで、当業者は、これらを考慮することによりさまざまな修正および変更を思いつくであろうが、それらも本願の本旨および範囲に含まれ、添付の請求の範囲に含まれるものと理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07）

Claims

【特許請求の範囲】 1.害虫または害虫の環境へ半翅目害虫の制御に有効な量のバチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis，B.t.)δ-内毒素を投与することを含む、半翅目害虫を制御する方法。 2.バチルス・チューリンギエンシスイスラエレンシス変異株(Bacillus thuri ngiensis var.israelensis)由来のδ-内毒素に、半翅目害虫を接触させることを含む、請求項1記載の方法。 3.PS201T6、PS123D1、PS71M3、およびそれらの変異株からなる群より選択されるバチルス・チューリンギエンシス単離株由来のδ-内毒素に、半翅目害虫を接触させることを含む、請求項1記載の方法。 4.バチルス・チューリンギエンシスδ-内毒素が、全長の毒素または半翅目に対する活性を有するその断片である、請求項1記載の方法。 5.バチルス・チューリンギエンシス毒素が活性化毒素である、請求項3記載の方法。 6.活性化がバチルス・チューリンギエンシスPS201T6株毒素の短縮によってなされる、請求項4記載の方法。 7.B.t.毒素がPS201T6由来である、請求項1記載の方法。 8.半翅目害虫がリーガス・ヘスペルス(Lygus hesperus)である、請求項1記載の方法。 9.半翅目害虫がリーガス・リネオラリス(Lygus lineolaris)である、請求項1記載の方法。 10.半翅目害虫が摂食する植物組織にB.t.δ-内毒素が発現されるよう、植物ゲノムにB.t.の殺虫性構造遺伝子を挿入することによって、植物において半翅目害虫にバチルス・チューリンギエンシスδ-内毒素が投与される、請求項1記載の方法。 11.B.t.遺伝子が、PS201T6毒素または半翅目に対する活性を有する断片またはその変異型をコードするものである、請求項10記載の方法。