BRPI9816295B1 - Method of control of infestation of a soybean plant by an insect of the tortricidae family - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE CONTROLE DE INFESTAÇÃO DE UMA PLANTA DE SOJA POR UM INSETO DA FAMÍLIA TORTRICtDAE'.

Dividido do PI 9803639-4, depositado em 03,03.1998 DESCRIÇÃO

1.0 ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

1.1 CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere, de uma maneira geral, aos processos de proteção de plantas de soja de infestação de insetos e, em particular, infestação por espécies de Epinotia, incluindo E. aporema. Também são descritas as plantas de soja transgênicas, que compreen-dem um gene de Bacillus thuringiensis, que confere resistência da planta aos insetos da família das Tortricidae.

1.2 DESCRIÇÃO DA TÉCNICA AFIM

1.2.1 MERCADO DA SOJA E INFESTAÇÃO NA AMÉRICA DO SUL O cultivo de soja constitui o produto agrícola mais economicamente importante na Argentina, contabilizando mais do que 50% do comércio externo gerado por aquele setor como exportações. De todos os produtos vegetais comercializados no País - cerca de US$350 milhões - entre 45 e 50% são aplicados no cultivo de soja, que recebe metade e um-terço do valor dos herbicidas e inseticidas, respectiva mente. A grande parte dos inseticidas é usada para combater pestes da ordem dos Lepidópteros e mais do que 90% deles apresentam baixa ou muito pouca seletividade para os inimigos naturais. A importância dos Lepidópteros nas sojas é determinada pelas suas localizações na estrutura da planta, estado fenológico no qual atacam, frequência dos ataques, nível de população, natureza do dano e capacidade de consumo. Importantes pestes dos Lepidópteros em sojas incluem os membros da família das Tortricidae, incluindo Epinotia aporema.

De acordo com a sequência cronológica de ataque dos Lepidópteros, durante o desenvolvimento da cultura de soja, essas espécies se encaixam no perfil de infestação das sojas na América do Sul da seguinte maneira: A Elasmopalpus lignosellus é caracterizada pela sua associação com condições de alta temperatura e seca na primavera. Nos últimos 25 anos tem aparecido a cada 8-10 anos, com dano significativo porque reduz consideravelmente a capacidade de sustentação das plantas, especialmente em soja no segundo período de semeadura. Nos anos nos quais há ataque, usa-se excessiva e irracionalmente altas doses de inseticidas altamente tóxicos.

Agrotis ipsilon, Porosagrostis gipaitina e lagartas relacionadas não representam um problema para a cultura de soja em condições de semeadura normais; embora, durante os primeiros tempos de semeadura, tenham sido registrados ataques dessas pestes que requerem controle de inseticida, usando, frequentemente, inseticidas piretróides em doses relativamente baixas.

Spodoptera frugiperda é uma peste de desfolhação, que está presente em anos quentes, secos, no segundo período de semeadura. Verificou-se que está associada com as ervas daninhas herbáceas (relva Aleppo, grama, capim, etc.), sobre as quais começa o seu ataque em pequenos pedaços de terra, movendo-se posteriormente repentinamente para a cultura, quando as larvas ficam maiores e atingem, consequentemente, o máximo de consumo foliar. 0 tempo de ataque varia de emergência a V4-5. A cobertura insuficiente da cultura quando do ataque e a exposição da peste torna possível alcançar um bom controle com os inseticidas piretróides em doses muito baixas.

Heliothis spp. ataca, frequentemente, culturas de soja em 3 momentos bem definidos em VI-V4 e R5-R7 de enchimento do grão, agindo como um agente de corte no primeiro caso e como um consumidor de sementes e vagens no segundo. É uma peste esporádica que raramente requer medidas de controle.

Epinotia aporema é caracterizada por ataque da cultura nos estados vegetativos precoces V3 a R5, afetando os brotos terminais e axilares na fase vegetativa e flores, vagens e sementes na fase de reprodução. 0 seu dano não é o dano típico dos agentes de desfolhação, mas é caracterizado por extermínio da estrutura afetada, tornando-se uma peste direta quando ataca nos estados reprodutivos (flores de vagens), provocando importantes reduções de rendimento. Devido às características de hábito de abrir túneis, é um dos Lepidópteros que requer as doses de inseticida mais altas para que seja controlado. Na maior parte dos casos, as misturas de inseticidas piretróides e fosforados de alto impacto ambiental são usados. Em anos de grande infestação, foram observados casos de resistência aos inseticidas monocrotofos e metamidorfos ao nível do campo.

Rachiplusia nu é outro desfolhador típico, que, usualmente, invade nos estágios vegetativos avançados V4-5 até a floração. É um desfolhador autóctone que ataca outras culturas tais como girassol, alfafa, amendoim e linho. Quando coloniza a cultura de soja, é controlada por inimigos naturais (principalmente, parasitóides e agentes entomopatogênicos), que, geralmente, evitam que o início do dano seja cruzado. Os inseticidas piretróides são frequentemente usados para controlá-lo.

Loxotege spp. constituem pestes que estão presentes nos estados vegetativos prematuros e a incidência deles é, frequentemente, associada com as condições de seca e de altas temperatura. 0 dano é caracterizado pela produção, além da perda de área foliar, de um enrolamento das folhas jovens, em consequência da preparação de um cartucho com os fios de seda finos. Esse tipo de dano é mais sério do que apenas a perda de massa foliar, uma vez que a capacidade fotossintética da área foliar remanescente diminui, resultando em um retardo apreciável no crescimento da planta.

Anticarsia gemmatalis manifesta a sua população máxima na área central do sul da província de Santa Fé, do meio de fevereiro ao fim de março, coincidindo com o estágio de enchimento de grama do cultivo de soja, tempo no qual é mais suscetível à desfolhação. Além disso, em determinados períodos essa espécie pode atacar as vagens, transformando-se uma peste indireta em uma peste direta e, desse modo, os inícios de tratamento variam consideravelmente. Na área central do norte, o seu pico de população é 30-45 dias mais cedo e 2 aplicações de inseticidas devem ser feitas para evitar danos. Essa peste é naturalmente controlada por agentes entomopatogênicos, especialmente o fungo Nomuraea ryleyi, que pode atingir níveis epizoóticos de infestação (dose a 100%). Normalmente, esses picos de infestação ocorrem quando a peste excede o limiar do dano. Para controlá-la, são frequentemente usados inseticidas piretróides.

Spilosoma virginica é um desfolhador mais comum nas províncias argentinas ao norte de Buenos Aires, atingindo máximos de população em março durante o estágio critico da cultura à desfolhação. É um desfolhador importante não tanto em virtude da sua abundância nas culturas, mas por causa da alta ingestão foliar, comparado com os outros desfolhadores. Outros Lepidópteros que, esporádica ou continuamente, colonizam a cultura de soja com níveis de infestação muito baixos, sem incidente econômico, incluem Colias lesbia e Spodoptera latifascia. 0 consumo pelas espécies desfolhadoras mais importantes, expresso em cm2 de área foliar, varia consideravelmente. Por exemplo, C. lesbia 75 cm2, R. nu 102 cm2, S. frugiperda 171 cm2, A. gemmatalis 105 cm2, S. virginica 199 cm2 e S. latifascia 299 cm2. Essas diferenças devem ser consideradas, quando ocorrem ataques simultâneos de mais do que um desfolhador, quando o limiar do dano é definido.

1.2.2 PROCESSOS DE CONTROLE DE INFESTAÇÃO DE PLANTAS DE SOJA A bactéria do solo gram-positiva B. thuringiensis é bem conhecida pela sua produção de cristais parasporais proteináceos, ou δ-endotoxinas, que são tóxicas a uma variedade de larvas Lepidópteros, coleópteras e dipteras. A B. thruringiensis produz proteínas cristais durante esporulação, que são especificamente tóxicas a determinadas espécies de insetos. Muitas diferentes linhagens de B. thuringiensis têm mostrado produzir proteínas cristais inseticidas. As composições compreendendo linhagens de B. thuringiensis, que produzem proteínas tendo atividade inseticida, têm sido usadas comercialmente como inseticidas ambientalmente aceitáveis, em virtude da toxicidade delas ao inseto alvo específico e não-toxicidade às plantas e outros organismos não-alvo.

Os cristais de δ-endotoxina são tóxicos às larvas dos insetos por ingestão. A solubilização do cristal no intestino médio do inseto libera a forma protoxina da δ-endotoxina que, na maior parte dos casos, é subseqüentemente processada a uma toxina ativa pela protease do intestino médio. As toxinas ativadas reconhecem e se ligam à margem de mato do epitélio do intestino intermediário do inseto através das proteínas receptoras. Foram isolados inúmeros receptores de proteínas cristais putativos de determinadas larvas de insetos (Knight et al., 1995/ Gill et al., 1995/ Masson et al., 1995). A ligação das toxinas ativas é seguida pela intercalação e agregação das moléculas da toxina, para formar poros dentro do epitélio do intestino intermediário. Esse processo acarreta desequilíbrio osmótico, tumefação, lise das células que revestem o epitélio do intestino intermediário e eventual mortalidade de larvas. A resistência da planta e o controle biológico são táticas centrais de controle na grande maioria dos programas de aperfeiçoamento de inseticida aplicados às mais diversas culturas. Não existem, atualmente, cultivadores de soja que sejam significativamente resistentes aos desfolhadores e nenhum programa de controle biológico para injetar pestes da família Tortricidae. 0 meio tradicional de controle de infestação de Lepidópteros de sojas tem sido a aplicação tópica dos inseticidas à superfície da planta.

Ibarra et al. (1992) mostraram que a infestação por E. aporema de sojas deve ser controlada através de aplicações tópicas de uma composição de proteína cristal de B. thuringiensis, sozinha ou em combinação com as aspersões de pesticidas químicos. Especificamente, os inseticidas tópicos contendo a variante alesti de B. thuringiensis e a variante kurstaki de B. thuringiensisforam efetivos contra os estágios larvais de E. aporema e provocaram mortalidade retardada de pupas.

Com o advento de técnicas genéticas moleculares, vários genes de δ-endotoxina foram isolados e as suas sequências de DNAs determinadas. Esses genes têm sido usados para construir determinados produtos de B. thuringiensis geneticamente engenheirados, que têm sido aprovados para uso comercial. Os recentes desenvolvimentos têm mostrado que os novos sistemas de transferência de δ-endotoxina desenvolvidos, incluindo as plantas que contêm e expressam os genes de δ-endotoxina geneticamente engenheirados. A patente U.S. 5.550.365 (especificamente incorporada por referência na presente descrição) descreve um processo para sintetização de genes de plantas, para otimizar o nivel de expressão da proteína a qual o gene sintetizado codifica. Stewart et al. (1996) discutem um processo de controle de espécies Pseudoplusia e Anticarsia dos Lepidópteros de infestação de soja, ambos pertencendo à família Noctuidae dos insetos Lepidópteros, por transformação das plantas de soja com CrylAc. A atividade da proteína CrilAc não foi antes investigada contra quaisquer espécies dos Tortricidae da família dos Lepidópteros, que inclui espécies, tal como E. aporema, que são pestes de interesse comercial em várias regiões, incluindo as áreas da América do Sul, tais como Argentina, Brasil, Paraguai, Uruguai, Chile e Bolívia. 1.3 DEFICIÊNCIAS NA TÉCNICA ANTERIOR 0 que falta na técnica anterior é um processo de controle de infestação de plantas de soja pelos membros da família Tortricidae e, em particular, pelos membros do gênero Epinotia, incluindo E. aporema. Também faltam na técnica anterior as plantas de soja transgênicas, que são resistentes ao ataque por insetos dessa família. 2.0 SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção busca superar as deficiências na técnica anterior, proporcionando vários meios de abordagem do problema de infestação de plantas de soja pelos insetos da família Tortricidae. Uma modalidade da invenção se relaciona com uma planta de soja que tinha sido transformada com um gene codificando um polipeptídio Cryl, que confere à planta de soja transformada resistência a um inseto da família Tortricidae. A invenção proporciona ainda um processo de controle de infestação de Tortricidae de plantas de soja, por transformação da planta com um gene codificando um polipeptídio de δ-endotoxina ativo aos Tortricidae, de modo que o peptídio é expresso na planta. Também se descreve um processo de produção de uma planta de soja, bem como uma célula de planta de soja individual, resistente a um inseto da família Tortricidae e, em particular, os membros do gênero Epinotia (incluindo E. aporema), por transformação da planta ou ca célula individual com um gene codificando um polipeptídio de δ-endotoxina ativo aos Tortricidae, de modo que o polipeptídio é expresso na planta.

2.1 PLANTAS DE SOJA RESISTENTES AOS TORTRICIDAE A invenção diz respeito a uma planta de soja transgênica, que tinha sido transformada com um ou mais genes codificando polipeptídio(s) de δ-endotoxina ativo(s) aos Tortricidae, que confere(m) resistência à infestação pelos membros Tortricidae, incluindo aqueles do gênero Epinotia. A resistência às espécies E. aporema de Epinotia é especificamente contemplada pela invenção e é o ímpeto para a construção da soja transgênica reivindicada, como Epitotia aporema, é uma espécie particularmente economicamente devastadora das plantas' de soja de infestação pela família Tortricidae em áreas tais como a América do Sul e, particularmente, nas regiões da Argentina, Brasil, Paraguai, Uruguai, Chile e Bolívia.

Os membros da família Tortricidae incluem os gêneros Choristoneura (incluindo C. biennis, C. fumiferana [erva daninha de broto de espruce], C. pinus [erva daninha de broto de pinheiro] e C. rosaceana [enrolador de folha em banda oblíqua]); Epinotia (incluindo E. aporema, E. atristriga, E. columbia, E. criddleana, E. leucantha, E. miscana, E. nanana, E. removana, E. rubiginosana, E, silvertoniensis, E. solicitana, E. vertumnana, E. tedella, E. tenerana e E. zandana); Ctenopseustis (incluindo C. filieis, C. fraterna, C. herana, C. obliquana e C. servana); Epiphyas (incluindo E. postvittana); Leucotenes (incluindo L. coprosmae) e Planotortix (incluindo P. avicennae, P. excessana, P. flammea, P. notophaea, P. octo, P. octoides e P. puffin). A presente invenção descreve uma planta de soja transformada com um segmento de ácidos nucléicos transformada com um segmento de ácidos nucléicos CrylAc. 0 ácido nucléico CrylAc é, de preferência, um gene codificando um polipeptídio CrylA e, particularmente, um gene codificando um polipeptídio CrylAc de SEQ ID NO.: 2. Em uma modalidade preferida, o segmento de ácidos nucléicos é proporcionado pela SEQ ID NO.: 1 ou compreendido dentro do SEQ ID NO.: 3 ou SEQ ID NO.: 4. No entanto, os inventores contemplam que qualquer gene codificando um polipeptídio de δ-endotoxina ativo aos Tortricidae pode ser útil na preparação da presente invenção, particularmente aquelas sequências de codificação de polipeptídio Cryl identificadas na Tabela 1, são contempladas pelos inventores como sendo particularmente úteis para proporcionar ambos os polipeptídios mutagenizados nativos e específicos de sítio, tendo atividade contra insetos Tortricidae, insetos do gênero Epinotia, incluindo E. aporema.

Os inventores também contemplam que o uso da sequência de genes cry, descrita na SEQ ID NO.: 1, ou a sequência de genes cry compreendida dentro de um vetor tendo a sequência de SEQ ID NO.: 3 ou SEQ ID NO.: 4, é possível identificar outros genes que codificam outras δ-endotoxinas tendo atividade Tortricidae, que seria útil no controle de infestação Tortricidae em sojas. Esses segmentos de ácido nucléico podem ser prontamente identificados por meios convencionais tais como, mas não limitados a hibridização Southern, que é discutida em detalhes na presente descrição. Os inventores contemplam que de fato qualquer ácido nucléico codificando um polipeptídio de δ-endotoxina ativo aos Tortricidae seria útil no controle desses insetos em uma planta transgênica adequadamente transformada. As sequências exemplificativas conhecidas por codificar as proteínas cristais, que podem ser úteis na geração de plantas de soja transgênicas resistentes à infecção por insetos Tortricidae, incluem as sequências de genes codificando o polipeptídio cristal identificadas na Tabela 1 e descritas nas SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 19, SEQ ID NO.: 21, SEQ ID NO.: 23, SEQ ID NO.: 25, SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 29, SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 33, SEQ ID NO.: 35, SEQ ID NO.: 37, SEQ ID NO.: 39, SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 43, SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 47, SEQ ID NO.: 49, SEQ ID NO.: 51, SEQ ID NO.: 53, SEQ ID NO.: 55, SEQ ID NO.: 57, SEQ ID NO.: 59, SEQ ID NO.: 61, SEQ ID NO.: 63, SEQ ID NO.: 65, SEQ ID NO.: 67, SEQ ID NO.: 69, SEQ ID NO.: 71, SEQ ID NO.: 73, SEQ ID NO.: 75, SEQ ID NO.: 77, SEQ ID NO.: 79, SEQ ID NO.: 81, SEQ ID NO.: 83, SEQ ID NO.: 85, SEQ ID NO.: 87, SEQ ID NO.: 89, SEQ ID NO.: 91, SEQ ID NO.: 93, SEQ ID NO.: 95, SEQ ID NO.: 97, SEQ ID NO.: 99, SEQ ID NO.: 101, SEQ ID NO.: 103, SEQ ID NO.: 105, SEQ ID NO.: 107, SEQ ID NO.: 109, SEQ ID NO.: 111, SEQ ID NO.: 113, SEQ ID NO.: 115, SEQ ID NO.: 117, SEQ ID NO.: 119, SEQ ID NO.: 121, SEQ ID NO.: 123, SEQ ID NO.: 125, SEQ ID NO.: 127 e SEQ ID NO.: 129. Os polipeptidios particularmente preferidos para expressão em células de soja transformadas incluem as sequências de aminoácidos dos polipeptídio Cryl descritos nas SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 16, SEQ ID NO.: 18, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 22, SEQ ID NO.: 24, SEQ ID NO.: 26, SEQ ID NO.: 28, SEQ ID NO. : 30, SEQ ID NO. : 32, SEQ ID NO. : 34, SEQ ID NO.: 36, SEQ ID NO.: 38, SEQ ID NO.: 40, SEQ ID NO.: 42, SEQ ID NO. : 44, SEQ ID NO. : 46, SEQ ID NO.: 50, SEQ ID NO.: 52, SEQ ID NO.: 54, SEQ ID NO.: 56, SEQ ID NO.: 58, SEQ ID NO.: 60, SEQ ID NO. : 62, SEQ ID NO.: 64, SEQ ID NO.: 66, SEQ ID NO.: 68, SEQ ID NO.: 70, SEQ ID NO.: 72, SEQ ID NO.: 74, SEQ ID NO.: 76, SEQ ID NO.: 78, SEQ ID NO.: 80, SEQ ID NO.: 82, SEQ ID NO.: 84, SEQ ID NO.: 86, SEQ ID NO.: 88, SEQ ID NO.: 90, SEQ ID NO.: 92, SEQ ID NO.: 94, SEQ ID NO.: 96, SEQ ID NO.: 98, SEQ ID NO.: 100, SEQ ID NO.: 102, SEQ ID NO.: 104, SEQ ID NO.: 106, SEQ ID NO.: 108, SEQ ID NO.: 110, SEQ ID NO.: 112, SEQ ID NO.: 114, SEQ ID N0.: 116, SEQ ID NO.: 118, SEQ ID NO.: 120, SEQ ID NO.: 122, SEQ ID NO.: 124, SEQ ID NO.: 126, SEQ ID NO.: 128 e SEQ ID NO.: 130.

Os meios para transformação de uma célula de planta e preparação de uma linha de célula transgênica são bem conhecidos na técnica e são discutidos na presente descrição. 0 segmento de ácidos nucléicos com o qual a planta de soja na presente invenção é transformada pode ser operativamente ligado a um promotor e expressar o segmento de ácidos nucléicos em uma célula hospedeira. Nessas modalidades, o segmento de ácidos nucléicos pode ser compreendido dentro de um vetor recombinante, tal como um plasmídeo, um cosmideo, um fago ou um vetor viral. Os vetores exemplificativos incluem os vetores pMON21142 e pMON21140 (descritos nas SEQ ID NO.: 3 e SEQ ID NO.: 4). Os vetores virais, os plasmídeos, os cosmídeos e os fagos, para uso na transformação dessas células vão, naturalmente, compreender genericamente os operones ou as sequências derivadas de genes da presente invenção, nativas ou derivadas sinteticamente e, particularmente, aqueles codificando as proteínas cristais descritos. Esses constructos de DNAs podem ainda incluir estruturas, tais como promotores, intensificadores agentes de ligações múltiplas, peptídios de trânsito ou ainda sequências de genes que têm atividade positiva ou negativamente reguladora nos genes de interesse particulares, se desejado. 0 segmento de DNAs ou gene pode codificar uma proteína nativa ou cristal modificada, que vai ser expressa nas células recorabinantes resultantes, e/ou que vai conferir um fenótipo aperfeiçoado à planta regenerada. As sequências de ácidos nucléicos otimizadas para expressão em plantas foram descritas no pedido de patente internacional WO 93/07278 (especificamente incorporado por referência na presente descrição).

Uma "planta de soja transgênica", como usado na presente descrição, é uma planta de soja que foi geneticamente modificada para conter e expressar sequências de DNAs heterólogas como proteínas. Como especificamente exemplificado na presente descrição, uma planta de soja transgênica é geneticamente modificada para conter e expressar uma sequência de DNAs heteróloga, operativamente ligada a, e sob o controle regulatório, de sequências de controle transcripcionais, que funcionam em células ou tecido de planta de soja ou em plantas de soja como um todo. Uma planta transgênica também se refere à progênie da planta transgênica inicial, em que essa progênie contém e é capaz de expressar a sequência de codificação heteróloga, sob o controle regulatório das sequências de controle de transcrição expressíveis na planta descritas na presente descrição. "Progênie” de uma planta de soja transgênica, como essa palavra é usada na presente invenção, inclui qualquer prole ou descendência da planta transgênica, ou qualquer planta subseqüente que tenha o transformador na sua linhagem. Progênie não é limitada a uma geração, mas preferivelmente abrange os descendentes do transformador, desde que contenha ou expresse o transgene. As sementes contendo os embriões transgênicos, bem como as sementes das plantas transgênicas e da sua prole ou dos seus descendentes, também são partes importantes da invenção.

Uma outra modalidade da presente invenção inclui uma variedade de linhas de plantas de soja transformadas. Entre essas especificamente transformadas pelos inventores e encontradas como sendo resistentes aos Tortricidae são as linhas 707, 721, 723, 725, 726 e 727.

2.2 TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

Outro aspecto importante da invenção se refere a um processo de proteção de culturas de soja de infestação por insetos da família Tortricidae, dos estágios de desenvolvimento larval ao adulto. O processo compreende a transformação de uma planta de soja com um constructo de gene codificando um polipeptídio de δ-endotoxina ativo aos Tortricidae, de modo que a planta expressa a proteína e a infestação por Tortricidae é controlada. O polipeptídio pode ser um dos polipeptídios de B. thuringiensis Cryl, incluindo os polipeptídio CrylA e os polipeptídio CrylAc. Uma modalidade preferida da presente invenção compreende uma planta incorporando um gene que codifica o polipeptídio com a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO.: 2. Alternativamente, o polipeptídio conferindo atividade pode ser qualquer um dos vários polipeptídios de δ-endotoxina ativos aos Tortricidae, que são homólogos à sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO.: 2 e que tem a capacidade de controlar ou exterminar os membros da família Tortricidae, incluindo E. aporema. Os meios de identificação dos polipeptídios que são homólogos àqueles descritos na SEQ ID NO. : 2 são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, embora, em uma modalidade, esses polipeptídios possam ser identificados por reação cruzada com os anticorpos específicos para o polipeptídio da SEQ ID NO.: 2, polipeptídios que são conhecidos como tendo homologia de aminoácido significativa por análise de bases de dados por computador, ou por ensaios para atividade inseticida contra insetos, tal como E. aporema. Esses ensaios são conhecidos por aqueles versados na técnica, embora um ensaio exemplificativo seja proporcionado no Exemplo 5.2. Alternativamente, a proteína cristal, usada na preparação de plantas de soja transgênicas resistentes aos Tortricidae, pode incluir qualquer uma das sequências de proteínas Cryl, ou os genes que as codificam. Essas proteínas são identificadas na Tabela 1 e descritas nas SEQ ID NO.: 5 - SEQ ID NO.: 130.

Adicionalmente, a invenção proporciona um processo de extermínio de insetos da família Tortricidae, dos estágios larval ao adulto, pelas células de plantas de soja comendo/ingerindo insetos, que tenha sido transformadas com um polipeptídio de δ- endotoxina ativo aos Tortricidae e nas quais o peptidio é expresso. A velocidade na qual as Tortricidae são controladas pode variar, dependendo das espécies particulares de soja transformadas, da quantidade de material vegetal consumido pelo inseto e da quantidade de δ-endotoxina expressa na planta, célula de planta ou de tecidos de planta particulares transformados, que são ingeridos pelo inseto. Também, fatores tais como os fatores ambientais, que afetam o crescimento ou a expressão da planta do polipeptidio in planta, podem contribuir para o grau de controle ou extermínio dos insetos que ingerem as células da planta. Os inventores contemplam que a faixa de controle ou extermínio pode variar, embora, prevê-se que a faixa seja tipicamente de cerca de 50% a cerca de 60%, e de cerca de 60% a cerca de 70, e de cerca de 70% a cerca de 80%, e de cerca de 80% a cerca de 90%, e de cerca de 90% a cerca de 95%, e de cerca de 95% a cerca de 100%. De preferência, a velocidade de extermínio dos insetos é de 80% ou superior e, em alguns casos, até e incluindo 100% de extermínio. O processo de plantas transgênicas é bem conhecido na técnica. Em geral, o processo compreende a transformação de uma célula hospedeira adequada com um segmento de DNAs, que contém um promotor ligado a uma região de codificação, que codifica uma proteína B. thuringiensis Cryl. Essa região de codificação é genericamente operativamente ligada a uma região de terminação de transcrição, na qual o promotor é capaz de ativar a transcrição da região de codificação na célula e, por conseguinte, proporcionar à célula a capacidade de produzir a proteína recombinante in vivo. A construção e a expressão de genes de B. thuringiensis sintéticos em plantas foi descrito em detalhes nas patentes U.S. 5.500.365 e 5.380.831 (cada uma delas especificamente incorporada por referência na presente descrição).

Contempla-se que em alguns casos o genoma de uma planta transgênica da presente invenção vai ser aumentado por meio da introdução estável de um ou mais transgenes codificando um polipeptídio de δ-endotoxina ativo aos Tortricidae e, particularmente, uma δ-endotoxina CrylAc, tal como aquela identificada na SEQ ID NO.: 2. Em alguns casos, mais do que um transgene vai ser incorporado no genoma da célula de planta hospedeira transformada. Esse é caso quando um segmento de DNA codificando a proteína cristal é incorporado no genoma dessa planta. Em determinadas situações, pode ser desejável ter um, dois, três, quatro ou ainda mais polipeptídios de δ-endotoxina ativos aos Tortricidae (nativos ou engenheirados recombinantemente) incorporados e estavelmente expressos na planta transgênica transformada. Igualmente, em algumas situações pode ser necessário engenheirar uma planta que tem um ou mais transgenes de endotoxina ativos aos Tortricidae incorporados no genoma, bem como genes codificando outros polipeptidios inseticidamente ativos. Um beneficio dessa planta transgênica é a capacidade de controlar mais do que um inseto ou familia.

Um gene preferido, tal como aquele descrito na SEQ ID NO.: 1, que pode ser introduzido inclui, por exemplo, uma sequência de DNA codificando uma proteína cristal de origem bacteriana. As sequências de ácidos nucléicos altamente preferidas são aquelas obtidas de B. thuringiensis, ou qualquer uma daquelas sequências que tenha sido geneticamente engenheiradas para diminuir ou aumentar a atividade inseticida da proteína cristal nessa célula hospedeira transformada. Ainda que os inventores tenham mostrado que um polipeptídio CrylAc nativo codificando um gene possa ser transformado em uma planta de soja, para expressar um polipeptídio CrylAc, contempla-se que em determinadas modalidades a sequência nativa vai ser bem provável de ser modificada, para proporcionar um constructo de DNA "plantado", que tenha sido alterado para permitir a expressão da sequência derivada de bactérias in planta. 0 meio para alterar o emprego de códon nas plantas é bem conhecido por aqueles versados na técnica e é discutido em detalhes na presente descrição. A presente invenção também abrange uma semente produzida pela planta transformada, uma progênie dessa semente e uma semente produzida pela progênie da planta transgênica original, produzida de acordo com o processo acima. Essa progênie e semente vão ter um transgene de proteína cristal estável, estavelmente incorporado no seu genoma e essas plantas de progênie vão herdar as características produzidas pela introdução de um transgene estável em um modo Mendeliano. Todas essas plantas transgênicas, tendo incorporados nos seus genomas segmentos de DNA transgênicos codificando a proteína CrylAc da SEQ ID NO.: 2 são aspectos dessa invenção.

2.3 PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA DE PLANTA DE SOJA RESISTENTE AOS TORTRICIDAE

Em outra modalidade, a invenção se refere a um processo de produção de uma célula de soja e, em particular, uma célula de soja compreendida dentro de uma planta transgênica, resistente à infestação por Tortricidae, especialmente E. aporema. Os meios para a transformação de sojas são conhecidos por aqueles versados na técnica, embora, em uma modalidade a transformação foi obtida por meio do uso do processo mediado por agrobactérias.

Os detalhes dos processos de transformação mediados por agrobactérias e alternativos de transformação são discutidos em detalhes na presente descrição.

2.4 CONCESSÃO DE RESISTÊNCIA À INFESTAÇÃO POR

TORTRICIDAE A invenção também descreve um processo de concessão de resistência à infestação por Epinotia em plantas de soja transgênicas. Esse processo compreende genericamente a expressão em uma célula de soja transgênica de um constructo de DNA codificando um polipeptidio de δ-endotoxina ativo aos Tortricidae, de modo que o polipeptidio seja expresso para controlar a infestação por Tortricidae. Os inventores transformaram a linha de células A3237 com pMON241140 e pMON211424. Os meios para seleção para a resistência são descritos em detalhes na Seção 4.6.1.

Os inventores contemplam que o ensaio de alimentação descrito na Seção 5.2 possa ser útil na identificação de outros segmentos de DNA, que codificam os polipeptidios de uso nos presentes processos. Alternativamente, outros processos de ensaio de alimentação para Tortricidae e, particularmente, E. aporema, podem ser usados na identificação dos transformadores, que são inseticidamente resistentes à infestação.

Os processos de determinação da sensibilidade de insetos em δ-endotoxinas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, embora, os ensaios envolvendo os ensaios biológicos de insetos, nos quais os insetos são alimentados ao tecido da planta ou são colocados diretamente na planta, podem ser particularmente úteis.

3.0 BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos a seguir formam parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda determinados aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor entendida por referência a um ou mais desses desenhos, em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas na presente descrição.

Figura 1. Mortalidade em laboratório das larvas do estágio 1 de E. aporema alimentadas com folíolos de soja transgênica de B. thuringiensis, semeada nas localidades de Bragado e Salto, Argentina.

Figura 2. Mortalidade em laboratório das larvas do estágio 3 de E. aporema alimentadas com folíolos de soja transgênica de B. thuringiensis, semeada nas localidades de Bragado e Salto, Argentina.

Figura 3. Plantas tolerantes em laboratório às larvas do primeiro estágio de E. aporema alimentadas com folhas de soja transgênica de B. thuringiensis, semeada nas localidades de Bragado e Salto, Argentina.

Figura 4. Plantas tolerantes em laboratório às larvas do terceiro estágio de E. aporema alimentadas com folhas de soja transgênica de B. thuringiensis, semeada nas localidades de Bragado e Salto, Argentina.

Figura 5. Infestação média de E. aporema nos materiais transgênicos de B. thuringiensis infectados artificialmente em abrigos no campo, na localidade de Bragado, Argentina.

Figura 6. Infestação média de plantas transgênicas de B. thuringiensis com larvas de E. aporema expostas às populações naturais dessa peste, na localidade de Bragado, Argentina.

Figura 7. Infestação média de plantas transgênicas de B. thuringiensis com larvas de E. aporema expostas às populações naturais dessa peste, na localidade de Salto, Argentina.

Figura 8. Mortalidade de larvas do estágio 2 de E. aporema alimentadas com vagens de soja transgênica gue demonstraram, previamente, a expressão do gene B. thuringiensis no estágio vegetativo, nas localidades de Salto e Bragado, Argentina.

Figura 9. Comparação do percentual de plantas tolerantes em laboratório com aquelas danificadas em condições naturais por E. aporema na localidade de Salto, Argentina.

Figura 10. Comparação do percentual de plantas tolerantes em laboratório com aquelas danificadas em abrigos com infestação artificial e em condições naturais por E. aporema na localidade de Bragado, Argentina.

Figura 11. Plasmideo exemplificativo para transformação de plantas de soja com um gene CrylAc.

4.0 DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS 4.1 SÍNTESE E ISOLAMENTO DE UM SEGMENTO DE ÁCIDOS NUCLÉI- COS CODIFICANDO UM POLIPEPTÍDIO DE δ-ENDOTOXINA

Os processos para construção e expressão de genes de B. thuringiensis sintéticos em plantas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos em detalhes na patente U.S. 5.500.365 (especificamente incorporada por referência na presente descrição). A presente invenção contempla o uso de uma variedade de genes de B. thuringiensis na transformação de plantas de soja, para conferir resistência aos Tortricidae. Entre os genes de B. thuringiensis considerados como sendo úteis estão os genes Cryl, especialmente aqueles genes caracterizados como CrylA e, particularmente especialmente, aqueles caracterizados como polinucleotídeos de B. thuringiensis codificando δ-endotoxina de CrylAc. Uma listagem atual das δ-endotoxinas de B. thuringiensis de Cryl conhecidas é incluída na Tabela 1. Os inventores contemplam que qualquer um dos nucleotídeos incluídos na lista pode conferir resistência aos Tortricidae, quando integrado no genoma da, e expresso pela, planta de soja transgênica. TABELA 1 δ-ENDOTOXINAS CRY1, NÚMERO DE ACESSO AO BANCO DE GENES E NOMENCLATURA REVISTAa a Adaptado de: httpp://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html Como usado na presente descrição, os genes "sintéticos" codificando as δ-endotoxinas de B. thuringiensis Cryl são aqueles preparados de uma maneira envolvendo qualquer tipo de isolamento ou manipulação genética. Isso inclui o isolamento do gene do seu estado de ocorrência natural, manipulação do gene como por modificação de códon (como descrito na presente descrição) ou mutagênese especifica de local (como descrito na presente descrição), truncamento do gene ou qualquer outro processo de isolamento ou de manipulação.

4.2 SONDAS E BASES

Em outro aspecto, as informações das sequências de nucleotideos proporcionadas pela invenção permitem a preparação de sequências de DNAs relativamente curtas, tendo a capacidade de hibridizar especificamente nas sequências de genes dos polinucleotideos selecionados descritos na presente descrição. Nesses aspectos, as sondas de ácido nucléico de um comprimento apropriado são preparadas com base na consideração de uma sequência de genes codificando polipeptidio de δ-endotoxina selecionada, por exemplo, uma sequência como aquela apresentada na SEQ ID NO.: 1. A capacidade dessas sondas de ácido nucléico para hibridizar, especificamente, a uma sequência de genes codificando polipeptidio de δ-endotoxina, faz com que elas sejam de utilidade particular em várias modalidades. De uma forma mais importante, as sondas podem ser usadas em vários ensaios para detectar a presença de sequências complementares em uma dada amostra.

Em determinadas modalidades, é vantajoso usar bases de oligonucleotídeos. A sequência dessas bases é elaborada usando um polinucleotídeo da presente invenção para uso em detecção, amplificação ou mutação de um segmento definido de um gene de proteína cristal de B. thuringiensis, usando tecnologia PCR®. Os segmentos de genes codificando polipeptídios de δ-endotoxina relacionados de outras espécies também podem ser amplificados por PCR usando essas bases.

Para proporcionar algumas das vantagens, de acordo com a presente invenção, uma sequência de ácidos nucléicos preferida, empregada para os estudos ou ensaios de hibridização, inclui as sequências que são complementares a pelo menos uma extensão de nucleotídeos de 14 a 30 ou tão longa quanto de uma sequência de codificação de proteína cristal, tal como aquela mostrada na SEQ ID NO. : 1. Um tamanho de pelo menos 14 nucleotídeos de comprimento ajuda a assegurar que o fragmento vai ser de um comprimento suficiente para formar uma molécula duplex, que é tanto estável quanto seletiva. As moléculas tendo sequências complementares em relação às extensões maiores do que 14 bases em comprimento são geralmente preferidas. Para aumentar a estabilidade e a seletividade do hibrido e, desse modo, aumentar a qualidade e o grau de moléculas híbridas específicas obtidas, geralmente, vai-se preferir elaborar moléculas de ácido nucléico tendo extensões complementares de genes de 14 a 20 nucleotídeos, ou mesmo mais longas quando desejado. Esses fragmentos podem ser prontamente preparados por, por exemplo, síntese direta do fragmento por meio químico, por aplicação de tecnologia de reprodução de acido nucléico, tal como tecnologia PCR das patentes U.S. 4.683.195 e 4.683.202 (cada uma delas especificamente incorporada por referência na presente descrição) , ou por excisão de fragmentos de DNAs selecionados de plasmídeos recombinantes contendo insertos apropriados e sítios de restrição adequados.

4.3 VETORES DE EXPRESSÃO A presente invenção também contempla um vetor de expressão, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. Desse modo, em uma modalidade um vetor de expressão é uma molécula de DNA isolada e purificada, compreendendo um promotor operativamente ligado a uma região de codificação que codifica um polipeptídio da presente invenção, cuja região de codificação é operativamente ligada a uma região de terminação de transcrição, na qual o promotor ativa a transcrição da região de codificação.

Como usado na presente descrição, o termo "operativamente ligado" significa que um promotor é conectado a uma região de codificação de tal maneira que a transcrição da região de codificação é controlada e regulada por aquele promotor. Os meios para ligar operativamente um promotor a uma região de codificação são bem conhecidos na técnica.

Os promotores que funcionam em bactérias são bem conhecidos na técnica. Os promotores exemplificativos e preferidos para as proteínas cristal de Bacillus incluem os promotores sigA, sigE e sigK. Alternativamente, os próprios promotores de genes codificando as proteínas cristal recombinantes podem ser usados.

Quando um vetor de expressão da presente invenção vai ser usado para transformar uma planta de soja, um promotor é selecionado pelo fato de que tem a capacidade de ativar a expressão em plantas de soja. Os promotores que funcionam em plantas também são bem conhecidos na técnica. São úteis na expressão dos polipeptídios em plantas os promotores que são induzíveis, virais, sintéticos, constitutivos, como descrito (Poszkowski et al., 1989; Odell et al., 1985) e regulados temporalmente, regulados espacialmente e regulados espacial e temporalmente (Chau et al., 1989).

Um promotor também é selecionado pela sua capacidade de direcionar as células de plantas transformadas ou a atividade transcricional das plantas transgênicas para a região de codificação. Os genes estruturais podem ser ativados por vários promotores em tecidos de plantas. Os promotores podem ser quase que constitutivos, tal como o promotor CaMV 35S, ou promotores específicos de tecido ou desenvolvidamente específicos, afetando dicotilédones ou monocotilédones.

Quando promotor é um promotor quase que constitutivo, tal como CaMV 35S, os aumentos na expressão de polipeptídios são encontrados em vários tecidos de plantas transformadas (por exemplo, calo, folha, semente e raiz). Alternativamente, os efeitos da transformação podem ser direcionados para os tecidos de plantas específicas, por uso de vetores integrantes de plantas contendo um promotor específico de tecido.

Um promotor específico de tecido exemplificativo é o promotor lectina, que é específico para tecido de semente. A proteína Lectina em sementes de soja é codificada por um único gene (Lei), que é apenas expresso durante maturação da semente e monta a cerca de 2% a cerca de 5% do mRNA de semente total. 0 gene e o promotor especifico de tecido lectina foram inteiramente caracterizados e usados para direcionar a expressão específica de semente em plantas de tabaco transgênicas (Vodkin et al., 1983; Lindstrom et al., 1990).

Um vetor de expressão contendo uma região de codificação, que codifica um polipeptídio de interesse, é engenheirado para estar sob controle do promotor lectina e cujo vetor é introduzido nas plantas usando, por exemplo, um processo de transformação de protoplasto (Dhir et al., 1991). A expressão do polipeptidio é direcionada especificamente às sementes da planta transgênica.

Uma planta transgênica da presente invenção produzida de uma célula de planta, transformada com um promotor especifico de tecido, pode ser cruzada com uma segunda planta transgênica desenvolvida de uma célula de planta, transformada com um diferente promotor especifico de tecido, para produzir uma planta transgênica hibrida que apresenta os efeitos de transformação em mais do que um tecido específico.

Os promotores específicos de tecido exemplificativos são sintetase de sacarose de milho 1 (Yang et al., 1990), de-hidrogenase de álcool de milho 1 (Vogei et al., 1989), complexo de colheita leve de milho (Simpson, 1986), proteína de choque térmico de milho (Odell et al., 1985), carboxilase RuBP de subunidade pequena de ervilha (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983), sintase de manopina de plasmídeo Ti (McBride e Summerfelt, 1989), sintase de nopalina de plasmídeo Ti (Langridge et al., 1989), isomerase de calcone de petúnia (Van Tunen et al., 1988), proteína rica em glicina de feijão 1 (Keller et al., 1989), transcrito CaMV 35s (Odell et al., 1985) e patatina de Batata (Wenzler et al., 1989). Os promotores preferidos são o promotor de vírus mosaico de couve-flor (CaMV 35S) e o promotor de carboxilase RuBP de subunidade pequena S-E9. A seleção de em qual vetor de expressão e, basicamente, em qual promotor uma região de codificação de um polipeptidio é operativamente ligada depende, diretamente, das propriedades funcionais desejadas, por exemplo, o local e o ajustamento da expressão da proteína e da célula hospedeira a ser transformada. Essas são limitações bem conhecidas inerentes na técnica de construção de moléculas de DNA recombinantes. No entanto, um vetor útil na prática da presente invenção é capaz de direcionar a expressão da região de codificação do polipeptidio ao qual é operativamente ligado.

Os vetores típicos úteis para a expressão de genes em plantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluem os vetores derivados do plasmídeo indutor de tumor (Ti) de Agrobactéria tumefaciens descritos (Rogers et al., 1987). No entanto, inúmeras outros sistemas de vetores integrantes da planta são conhecidos por funcionar em plantas, incluindo o vetor de controle de transferência pCaMVCN descrito (Fromm et al., 1985). pCaMVCN (disponível da Pharmacia, Piscataway, NJ) inclui o promotor CaMV 35S de vírus mosaico de couve-flor.

Nas modalidades preferidas, o vetor usado para expressar o polipeptidio inclui um marcador de seleção, que é efetivo em uma célula de planta, de preferência, um marcador de seleção resistente a drogas. Um marcador resistente a drogas preferido é o gene, cuja expressão resulta em resistência à canamicina; isto é, o gene quimérico contendo o promotor de sintase de nopalina, região não-transladada 3' de sintase de nopalina e de fosfotransferase de neomicina Tn5 II (nptll) descritas (Rogers et al., 1988) . A polimerase de RNA transcreve uma sequência de DNA de codificação através de um sitio na qual ocorre a poliadenilação. Tipicamente, as sequências de DNAs localizadas umas poucas centenas de pares de base a jusante do sitio de poliadenilação servem para terminar a transcrição. Essas sequências de DNAs são referidas na presente descrição como regiões de terminação de transcrição. Essas regiões são requeridas para poliadenilação eficiente de RNA mensageiro transcrito (itiRNA) .

Os meios para preparação de vetores de expressão são bem conhecidos na técnica. A expressão (vetores de transformação) usados para transformar plantas e os processos de produção desses vetores são descritos nas patentes U.S. 4.971.908, 4.940.835, 4.796.061 e 4.757.011 (cada uma delas é na presente descrição incorporada por referência). Esses vetores podem ser modificados para incluir uma sequência de codificação de acordo com a presente invenção.

Foram desenvolvidos vários processos para ligar operativamente o DNA aos vetores, via terminais coesivos ou extremidades embotadas complementares. Por exemplo, conjuntos de homopolímeros complementares podem ser adicionados ao segmento de DNA a ser inserido e ao DNA do vetor. 0 vetor e o segmento de DNA são então unidos por ligação de hidrogênio entre as pontas homopoliméricas complementares para formar moléculas de DNA recombinantes.

Uma região de codificação que codifica um polipeptidio tendo a capacidade de conferir atividade inseticida a uma célula é, de preferência, um gene de codificação de polipeptidio de· δ-endotoxina de B. thuringiensis. Nas modalidades preferidas, esse polipeptidio tem a sequência de resíduo de aminoácidos de SEQ ID NO.: 2 ou um equivalente funcional de uma ou mais dessas sequências. De acordo com essas modalidades, uma região de codificação compreendendo a sequência de DNA de SEQ ID NO.: 1 também é preferida. Os genes de codificação de polipeptidio de δ-endotoxina CrylAc específicos, que foram mostrados como transformando com sucesso plantas de soja e conferindo resistência a uma Tortricidae, são aqueles genes compreendidos dentro dos vetores de plasmideos ΡΜΟΝ21140 e pMON21142.

4.4 CÉLULAS DE PLANTAS E PLANTAS TRANSGÊNICAS

TRANSFORMADAS

Um planta de soja transformada com um vetor de expressão da presente invenção também é contemplada. Uma planta de soja transgênica derivada dessa célula transgênica ou transformada também é contemplada. Os processos para transformação de DNA de células de plantas incluem transformação de planta mediada por Agrobactéria, transformação de protoplastos, transferência de genes em pólen, injeção em órgãos reprodutores, injeção em embriões imaturos e bombardeamento de partículas. Cada um desses processos tem vantagens e desvantagens distintas. Desse modo, um processo particular de introdução de genes em uma linhagem de planta particular pode não ser necessariamente o mais efetivo para outra linhagem de planta, mas é bem conhecido quais processos são úteis para uma linhagem de planta particular. Há muitos processos para introdução da transformação de segmentos de DNA em células, mas não são todos adequados para transferir DNA para as células de plantas de soja. Acredita-se que os processos adequados incluam virtualmente qualquer processo por meio do qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como infecção por A. tumefaciens e Agrobactéria relacionada, transferência direta de DNA, tal como, por exemplo, por transformação de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh et al., 1993), por apreensão de DNA mediada por dessecação/inibição, por eletroporação, por agitação com fibras de carboneto de silício, por aceleração de partículas revestidas com DNA, etc. Em determinadas modalidades, os processos de aceleração são preferidos e incluem, por exemplo, bombardeamento de microprojéteis e assemelhados. A tecnologia para a introdução de DNA nas células é bem conhecido por aqueles versados na técnica. Quatro processos gerais para transferência de um gene para as células foram descritos: (1) processos químicos (Graham e van der Eb, 1973); (2) processos físicos, tais como microinjeção (Capecchi, 1980), eletroporação (Wong e Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) e o canhão de genes (Johnston e Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) vetores virais (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis e Anderson, 1988a; 1988b) e mecanismos mediados por receptor (Curiel et al., 1991; 1992; Wagner et al·., 1992).

4.4.1 ELETROPORAÇÃO A aplicação de pulsos elétricos de alta voltagem breves a várias células de plantas e de animais propicia a formação de poros de dimensão de nanômetros na membrana do plasma. 0 DNA é colocado diretamente no citoplasma da célula, através desses poros ou em consequência da redistribuição dos componentes da membrana que acompanha o fechamento dos poros. A eletroporação pode ser extremamente eficiente e pode ser usada para expressão transiente de genes clonados e para o estabelecimento de linhas de células que conduzem cópias integradas do gene de interesse. A eletroporação, em contraste com a transfecção mediada por fosfato de cálcio e a fusão de protoplasto, propicia frequentemente linhas de células que conduzem uma, ou no máximo umas poucas, cópias integradas do DNA estranho. A introdução de DNA por meio de eletroporação é bem conhecida por aqueles versados na técnica. Nesse processo, determinadas enzimas degradadoras de paredes, tais como enzimas degradadoras de pectina, são empregadas para tornar as células recipientes alvo mais suscetíveis à transformação por eletroporação do que as células não-tratadas. Alternativamente, as células recipiente são feitas mais suscetíveis à transformação por ferimento mecânico. Para realizar a transformação por eletroporação, pode-se empregar tecidos friáveis, tal como uma suspensão de cultura de células, ou calos embriogênicos, ou alternativamente, pode-se transformar embriões imaturos ou outros tecidos organizados diretamente. Degradaria-se parcialmente as paredes das células das células selecionadas por exposição delas às enzimas degradadoras de pectina (pectoliases) ou ferir mecanicamente de uma forma controlada. Essas células seriam então recipientes para transferência de DNA por eletroporação, que pode ser conduzida nesse estágio e as células transformadas depois identificadas por uma seleção ou protocolo de classificação adequados dependentes da natureza do DNA recém-incorporado.

4.4.2 BOMBARDEAMENTO DE MICROPROJÉTEIS

Um outro processo vantajoso para transferir os segmentos de DNA de transformação para as células de plantas é o bombardeamento por microprojéteis. Nesse processo, as partículas podem ser revestidas com ácidos nucléicos e transferidas para as células por uma força de propulsão. As partículas exemplificativas incluem aquelas compreendidas de tungstênio, ouro, platina e assemelhados.

Uma vantagem do bombardeamento de microproj éteis, além de ser um meio efetivo de transformar estavelmente reprodutivelmente as células de plantas, é que nem o isolamento dos protoplastos (Cristou et al., 1988) nem a suscetibilidade da infecção de Agrobactéria são requeridos. Uma modalidade ilustrativa de um processo para transferir DNA para células de plantas por aceleração é um Sistema de Transferência de Partículas Biolistics, que pode ser usado para propelir as partículas revestidas com DNA ou células através de uma peneira, tal como uma peneira de aço inoxidável ou peneira de Nytex, sobre uma superfície de filtro coberta com as células cultivadas na planta em suspensão. A peneira dispersa as partículas, de modo que elas não são transferidas para as células recipientes em grandes agregados. Acredita-se que uma peneira interposta entre o aparelho de projétil e as células a serem bombardeadas reduz o tamanho do agregado de projéteis e pode contribuir para uma frequência mais alta de transformação, por redução do dano infligido nas células recipientes por projéteis que são muito grandes.

Para o bombardeio, as células em suspensão são, de preferência, concentradas nos filtros ou no meio de cultura sólido. Alternativamente, os embriões imaturos ou outras células alvo podem ser dispostos no meio de cultura sólido. As células a serem bombardeadas são posicionadas a uma distância apropriada abaixo do placa de obstáculo de macroprojéteis. Se desejado, uma ou mais peneiras também são posicionadas entre o dispositivo de aceleração e as células a serem bombardeadas. Por meio do uso de técnicas apresentadas na presente descrição podem ser obtidos até 1.000 ou mais focos de células expressando transientemente um gene marcador. 0 número de células em um foco, que expressa o produto gene exógeno 48 horas pós-bombardeamento, varia, frequentemente, de 1 a 10 e em média de 1 a 3.

Na transformação por bombardeio, pode-se otimizar as condições de cultura pré-bombardeio e os parâmetros de bombardeio, para produzir os números máximos de transformadores estáveis. Tanto os parâmetros físicos quanto os biológicos para o bombardeamento são importantes nessa tecnologia. Os fatores físicos são aqueles que envolvem a manipulação de precipitado de DNA/microprojétil, ou aqueles que afetam o vôo e a velocidade de quaisquer dos macro- ou microprojéteis. Os fatores biológicos incluem todas as etapas envolvidas na manipulação de células, antes e imediatamente após o bombardeamento, o ajuste osmótico das células alvo, para ajudar a aliviar o trauma associado com o bombardeamento, e também a natureza do DNA de transformação, tal como DNA linearizado ou plasmídeos superenrolados intactos. Acredita-se que as manipulações de pré-bombardeamento são especialmente importantes para a transformação bem-sucedida de embriões de plantas imaturos.

Consequentemente, contempla-se que pode-se desejar ajustar os vários parâmetros de bombardeamento em estudos em pequena escala para otimizar por completo as condições. Pode-se desejar particularmente ajustar os parâmetros físicos, tais como distância do vão, distância do vôo, distância do tecido e pressão de hélio. Pode-se também otimizar os fatores de redução de trauma (TRFs) por modificação das condições que influenciam o estado fisiológico das células recipientes e que podem, portanto, influenciar as eficiências de transformação e de integração. Por exemplo, o estado osmótico, a hidratação do tecido e o estágio ou o ciclo de célula da subcultura das células recipientes pode ser ajustado para transformação ótima. A execução de outros ajustes de rotina vão ser conhecidos por aqueles versados na técnica à luz da presente descrição.

Os processos de transformação mediada por partícula são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. A patente U.S. 5.015.580 (na presente descrição especificamente incorporada por referência) descreve a transformação de sojas usando essa técnica.

4.4.3 TRANSFERÊNCIA MEDIADA POR AGROBACTÉRIA A transferência mediada por agrobactéria é um sistema amplamente aplicável para a introdução de genes em células de plantas, porque o DNA pode ser introduzido nos tecidos de planta integrais, evitando assim a necessidade para regeneração de uma planta intacta de um protoplasto. O uso de vetores de integração de planta mediados por Agrobactéria, para introduzir DNA em células de plantas, é bem conhecido na técnica. Consultar, por exemplo, os processos descritos (Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987). A engenharia genética de plantas de algodão usando transferência mediada por Agrobactéria é descrita na patente U.S. 5.004.863 (na presente descrição especificamente incorporada por referência); a transformação similar de plantas de alface é descrita na patente U.S. 5.349.124 (na presente descrição especificamente incorporada por referência) a transformação mediada por Agrobactéria de soja é descrita na patente U.S. 5.416.011 (na presente descrição especificamente incorporada por referência). Ainda mais, a integração do Ti-DNA é um processo relativamente preciso resultando em poucos rearranjos. A região do DNA a ser transferido é definida pelas sequências limites e o DNA interposto é usualmente inserido no genoma da planta como descrito (Spielman et al., 1986; Jorgensen et al., 1987).

Os vetores de transformação por Agrobactéria são capazes de replicação em E. coli, bem como Agrobactérias, propiciando manipulações convenientes como descrito (Klee et al., 1985). Além do mais, recentes avanços tecnológicos nos vetores para a transferência de genes mediada por Agrobactéria têm aperfeiçoado a disposição dos genes e dos sítios de restrição nos vetores, para facilitar a construção de vetores capazes de expressar vários genes de codificação de polipeptídios. Os vetores descritos (Rogers et al., 1987) possuem regiões de múltiplos agentes de ligação convenientes por um promotor e um sítio de polialdenilação para expressão direta de genes de codificação de polipeptídios inseridos e são adequados para as presentes finalidades. Além disso, Agrobactéria contendo tanto genes Ti armados e desarmados podem ser usados para as transformações. Naquelas variedades de plantas nas quais a transformação mediada por Agrobactéria é eficiente, é o processo selecionado por causa da natureza fácil e definida da transferência de genes. A transformação mediada por Agrobactéria de discos de folhas e outros tecidos, tais como cotilédones e hipocótilos parece ser limitada às plantas que a Agrobactéria naturalmente infecta. A transformação mediada por Agrobactéria é mais eficiente em plantas dicotiledôneas. Poucos monocotilédones parecem ser hospedeiros naturais para Agrobactéria, embora as plantas transgênicas tenham sido produzidas em aspargos usando vetores de Agrobactéria como descrito (Bytebier et al., 1987). Portanto, grãos de cereais comercialmente importantes, tais como arroz, milho e trigo, devem, usualmente, ser transformados usando processos alternativos. No entanto, como mencionado acima, a transformação de aspargo usando Agrobactéria também pode ser obtida (consultar, por exemplo, Bytebier et al., 1987).

Uma planta transgênica formada usando processos de transformação com Agrobactéria contém, tipicamente, um único gene em um cromossomo. Essas plantas transgênicas podem ser referidas como sendo heterozigóticas para o gene adicionada. No entanto, visto que o uso da palavra "heterozigótica" implica, usualmente, na presença de um gene complementar no mesmo local do segundo cromossomo de um par de cromossomos e não há qualquer agente em uma planta contendo um gene adicionado como o da presente descrição, acredita-se que um nome mais preciso para essa planta é um agente de segregação importante, porque o gene exógeno adicionado segrega independentemente durante a mitose e a meiose.

Uma planta transgênica particularmente preferida é uma que é homozigótica para o gene estrutural adicionado; isto é, uma planta transgênica que contém dois genes adicionados, um gene no mesmo local em cada cromossomo de um par de cromossomos. Uma planta transgênica homozigótica pode ser obtida por acasalamento sexual (individualidade) de uma planta transgênica segregadora independente, que contém um único gene adicionado, germinando parte da semente produzida e analisando as plantas resultantes produzidas para o gene de atividade de interesse relativa a um controle (nativo, não-transgênico) ou uma planta transgênica segregadora independente.

Duas diferentes plantas transgênicas podem ser acasaladas para produzir prole que contém dois genes exógenos adicionados segregando-se independentemente. A individualidade de progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigóticas para ambos os genes exógenos adicionados que codificam um polipeptidio de interesse. O retrocruzamento a uma planta parental e o acasalamento nãõ-parental com uma planta transgênica também são contemplados. A transformação de protoplastos de plantas pode ser obtida usando os processos baseados na precipitação de fosfato de cálcio, tratamento com poli (etileno glicol), eletroporação e combinações desses tratamentos (consultar, por exemplo, Potrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Fromm et al., 1985; Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988). A aplicação desses sistemas em diferente idioplasma de planta depende da capacidade de regenerar essa variedade de planta particular dos protoplastos. Os processos ilustrativos para a regeneração de cereais de protoplastos são descritos (consultar, por exemplo, Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986).

Para transformar idioplasma de planta, que não pode ser regenerado com sucesso de protoplastos, outros modos de introdução de DNA em células ou tecidos intactos podem ser utilizados. Por exemplo, a regeneração de cereais de embriões ou explantes imaturos pode ser feita como descrito (Vasil, 1988). Além disso, "canhão de partículas" ou tecnologia de microprojétil de alta velocidade podem ser utilizados (Vasil, 1992).

Usando essa última tecnologia, o DNA é conduzido através da célula e a para o citoplasma sobre a superfície de pequenas partículas metálicas como descrito (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; Kawata et al., 1988). As partículas metálicas penetram através de várias camadas de células e permitem assim a transformação de células dentro dos explantes de tecidos.

4.5 EXPRESSÃO DE GENES EM PLANTAS 0 fato que o uso de códon de planta lembra mais estreitamente aquele dos seres humanos e de outros organismos superiores do que os organismos unicelulares, tais como bactérias, genes bacterianos não-modifiçados são frequentemente expressos em células de plantas transgênicas. A preferência global aparente para o teor GC na posição do códon foi descrita em detalhes por Murray et al. (1989). Os 207 genes de planta descritos nesse trabalho permitiram a compilação das preferências de códon para os aminoácidos nas plantas. Esses autores descrevem a diferença entre o uso de códon em monocotilédones e dicotilédones, bem como as diferenças entre os genes codificados por cloropasto e aqueles que são codificados nucleares. Utilizando as tabelas de frequência do códon proporcionadas, aqueles versados na técnica podem engenheirar essa sequência bacteriana, para expressão em plantas por modificação das sequências de DNAs, para proporcionar uma predisposição de códon para G ou C na terceira posição. 0 trabalho por Diehn et al. (1996) detalha a modificação de sequência de genes derivados de procariotes para permitir a expressão em plantas. Iannacone et al. (1997) descrevem a transformação de berinjela com um gene B. thuringiensis geneticamente engenheirado codificando uma endotoxina da classe cry3. Utilizando as sequências que evitam as sequências de polialdenilação, as sequências AT TA e os sítios de junção, um gene sintético foi construído que permitia a expressão da toxina codificada in planta. A expressão de proteína fluorescente verde de medusa em tabaco transgênico foi descrita por Rouwendal et al. (1997). Usando um gene sintético, a predisposição do códon na terceira posição para C+G foi criada para permitir a expressão do gene heterólogo in planta.

Futterer et al. (1997) e Futterer e Hohn (1996) descrevem os efeitos da sequência de mRNA, sequências de líderes, mensagens policistrônicas e motivos de sítios de ligação de ribossomos internos, na expressão em plantas. A modificação dessas sequências pela construção de genes sintéticos permitiu a expressão de mRNAs virais nas células de plantas transgênicas.

Embora tenha sido feito um grande progresso recentemente com relação à preparação de plantas transgênicas, que expressam proteínas bacterianas, tais como proteínas cristal de B. thuringiensis, os resultados da expressão de genes bacterianos nativos em plantas são frequentemente desapontadores.

Diferentemente da genética microbial, pouco era conhecido pelos geniticistas de plantas antigos em relação aos fatores que afetavam a expressão heteróloga de genes estranhos em plantas. Recentemente, no entanto, vários fatores potenciais têm sido implicados como responsáveis em graus variáveis para o nível de expressão de proteína de uma sequência de codificação particular. Por exemplo, os cientistas agora sabem que mantendo um nível significativo de um mRNA particular na célula é realmente um fator crítico. Infelizmente, as causas para os baixos níveis de estado estacionário de proteínas estranhas codificando mRNA são muitas. Primeiro, a síntese de RNA de comprimento integral pode não ocorrer a uma alta frequência. Isso podería, por exemplo, ser provocado por uma terminação prematura de RNA durante transcrição, ou devido a um processamento de mRNA inesperado durante a transcrição. Em segundo, a célula da planta pode produzir RNA de comprimento integral, que é depois processado (emenda, adição de poliA) no núcleo de uma maneira que cria um mRNA não-funcional. Se o RNA não é adequadamente sintetizado, terminado e polialdenilado, não pode se movimentar para o citoplasma para translação. De modo similar, no citoplasma, se os mRNAs têm meias-vidas reduzidas (que são determinadas pelas suas sequências primário ou secundária), vai-se produzir insuficiente produto de proteína. Além disso, há um efeito, cuja magnitude é incerta, de eficiência de transladação na meia-vida do RNA. Além disso, cada molécula de RNA se dobra em uma estrutura particular, ou talvez família de estruturas, que é determinada pela sua sequência. A estrutura particular de qualquer RNA pode propiciar menor ou maior estabilidade no citoplasma. A estrutura de per si é, provavelmente, um determinante do processamento de mRNA no núcleo. Infelizmente, é impossível prever, e praticamente impossível determinar, a estrutura de qualquer RNA (exceto para tRNA) in vitro ou in vivo. No entanto, é provável que se alterando dramaticamente a sequência de um RNA, vai-se ter um grande efeito na sua estrutura dobrado. É provável que a estrutura de per si, ou as características estruturais particulares, também desempenham um papel na determinação da estabilidade do RNA.

Para superar essas limitações na expressão de genes estranhos, os pesquisadores identificaram sequências e sinais particulares nos RNAs, que têm o potencial para ter um efeito específico na estabilidade do RNA. Em determinadas modalidades da invenção, há, portanto um desejo de otimizar a expressão dos segmentos de ácido nucléico descritos em planta. Um processo particular de fazer isso é por alteração do gene bacteriano, para remover sequências ou motivos, que diminuem a expressão em uma célula de planta transformada.

As sequências particularmente problemáticas são aquelas que são ricas em A+T. Infelizmente, uma vez que a B. thuringiensis tem um genoma rico em A+T, as sequências de genes de proteínas cristal devem ser, frequentemente, modificadas para expressão ótima em uma planta. 0 motivo da sequência ATT TA (ou AUUUA como aparece em RNA) tem sido implicado como uma sequência desestabilizadora em mRNA de células de mamíferos (Shaw e Kamen, 1986). Muitos RNAs de vida curta possuem regiões não-transladadas 3' ricas em A+T e essas regiões têm, frequentemente, a sequência ATTTA, algumas vezes presentes em múltiplas cópias ou como multímeros (por exemplo, ATTATTA...). Shaw e Kamen (1987) mostraram que a transferência da extremidade 3' de um mRNA instável para um RNA estável (globina ou VAI) diminuiu, dramaticamente, a meia-vida de RNA estável. Mostraram ainda que um pentâmero de ATTTA tinha um efeito desestabilizante profundo em uma mensagem estável e que esse sinal poderia exercer o seu efeito, se fosse localizado na extremidade 3' ou dentro de uma sequência de codificação. No entanto, o número de sequências ATTTA e/ou o contexto da sequência em que ocorrem também parecem ser importantes na determinação se funcionam como sequências desestabilizadoras. Shaw e Kamen (1987) mostraram que um trímero de ATTTA tinha muito menos efeito do que um pentâmero na estabilidade de mRNA e um dimero ou um monômero não tinham qualquer efeito na estabilidade (Shaw e Kamen, 1987). Notar que os multimeros de ATTTA, tal como um pentâmero, criam, automaticamente, uma região rica em A+T. Isso foi mostrado como sendo um efeito citoplásmico, não nuclear. Em outros mRNAs instáveis, a sequência ATTTA pode estar presente em apenas uma única cópia, mas é frequentemente contida em uma região rica em A+T. Dos dados de células animais recolhidos até hoje, parece que a ATTTA é, pelo menos em alguns contextos, importante na estabilidade, mas não é ainda possível prever que ocorrências de ATTTA são desestabilizadoras, ou sequência quaisquer desses efeitos são prováveis de serem observados em plantas.

Alguns estudos na degradação de mRNA em células animais também indicam que a degradação de RNA pode começar em alguns casos com o ataque nucleolitico nas regiões ricas em A+T. Não é claro se essas decomposições ocorrem nas sequências ATTTA. Também há exemplos de mRNAs que têm estabilidade diferencial, dependendo do tipo de célula na qual são expressos ou do estágio dentro do ciclo da célula no qual são expressos. Por exemplo, mRNAs de histona são estáveis durante a síntese de DNA, mas instáveis se a síntese de DNA é rompida. A extremidade 3' de alguns mRNAs de histona parece ser responsável por esse efeito (Pandey e Marzluff, 1987). Não parece ser mediado por ATTTA, nem é claro o que controla a estabilidade diferencial desse mRNA. Outro exemplo é a estabilidade diferencial de mRNA IgG em linfócitos B durante maturação de célula B (Genovese e Milcarek, 1988) . Um exemplo final é a instabilidade de um mRNA de globina β-talesêmica mutante. Em células de tutano de osso, nas quais esse gene é normalmente expresso, o mRNA mutante é instável, enquanto que o mRNA do tipo nativo é estável. Quando o gene mutante é expresso nas células HeLa ou L in vitro, o mRNA mutante não apresenta qualquer instabilidade (Lim et al., 1988). Todos esses exemplos proporcionam evidência de que a estabilidade do mRNA pode ser mediada por fatores específicos de tipo de célula ou ciclo de célula. Além do mais, esse tipo de instabilidade não é ainda associada com as sequências específicas. Devido a essas incertezas, não é possível prever que os RNAs são propensos a serem instáveis em uma determinada célula. Além do mais, mesmo o motivo ATTTA pode agir diferencialmente, dependendo da natureza da célula na qual o RNA está presente. Shaw e Kamen (1987) registraram que a ativação de proteína quinase C pode bloquear a degradação mediada por ATTTA. A adição de um filamento de poliadenilato à extremidade 3' é comum para a maior parte dos mRNAs eucarióticos, tanto vegetais quanto animais. A visão atualmente aceita da adição poliA é que o transcripto nascente se estende além do terminal 3' maduro. Contido dentro desse transcripto são sinais para polialdenilação e formação da extremidade 3’ mais adequada. O processamento na extremidade 3' envolve a decomposição do mRNA e adição de poliA à extremidade 3' madura. Por busca das sequências de consenso próximas ao trato de poliA em ambos os mRNAs vegetais e animais, tem sido possível identificar as sequências de consenso, que são aparentemente envolvidas na adição de poliA e decomposição da extremidade 3'. As mesmas sequências de consenso parecem ser importantes para ambos esses processos. Esses sinais são, tipicamente, uma variação na sequência AATAAA. Em células animais, algumas variantes dessa sequência, que são funcionais, foram identificadas; em células vegetais, parece ser uma faixa estendida das sequências funcionais (Wickens e Stephenson, 1984; Dean et al., 1986).Porque todas essas sequências de consenso são variações de AATAAA, são todas sequências ricas em A+T. Essa sequência é, tipicamente, encontrada 15 a 20 bp, antes do trato de poliA em um mRNA maduro. Os estudos em células animais indicam que essa sequência é envolvida tanto na adição de poliA quanto na maturação 3'. As mutações direcionadas para sítios nessa sequência podem dilacerar essas funções (Conway e Wickens, 1988; Wickens et al., 1987). No entanto, observou-se que as sequências de até 50 a 100 bp 3' para o sinal de poliA putativo também são requeridas; isto é, um gene que tem uma AATAAA normal, mas'foi substituído ou dilacerado a jusante não atingiu um polialdenilado adequado (Gil e Proudfoot, 1984; Sadofsky e Alwine, 1984; McDevitt et al., 1984). Isto é, o próprio sinal de poliA não é suficiente para um processamento completo e adequado. Não é ainda conhecido que sequências a jusante especificas são requeridas além do sinal de poliA, ou se há uma sequência especifica que tem essa função. Portanto, as análises da sequência podem apenas identificar sinais de poliA potenciais.

Em mRNAs naturais, que são polialdenilados normalmente, observou-se que a quebra desse processo, por alteração do sinal de poliA ou de outras sequências no mRNA, podem ser obtidos efeitos profundos no nível do mRNA funcional. Observou-se isso em vários mRNAs naturais, com resultados que são até então específicos de genes.

Mostrou-se que em mRNAs naturais, a polialdenilação é importante no acúmulo de mRNA e que a quebra desse processo pode produzir níveis de mRNA significativos. No entanto, existe conhecimento insuficiente para prever o efeito das alterações em um gene normal. Em um gene heterólogo, é ainda mais difícil prever as consequências. No entanto, é possível que os sítios putativos identificados sejam disfuncionais. Isto é, esses sítios podem não agir como sítios de poliA adequados, mas em vez disso funcionam como sítios anormais que originam mRNAs instáveis.

Em sistemas de células animais, a AATAAA é de longe o sinal mais comum identificado nos mRNAs a montante do poliA, mas pelo menos quatro variantes também foram encontradas (Wickens e Stephenson, 1984) . Em plantas, não foram feitas muitas análises, mas é claro que podem ser usadas sequências múltiplas similares à AATAAA. Os sítios das plantas na Tabela 2 chamados grandes ou pequenos se referem apenas ao estudo de Dean et al. (1986), que analisaram apenas três tipos de genes de plantas. A designação de sítios de polialdenilação como grandes ou pequenos se refere apenas à frequência das suas ocorrências como sítios funcionais em genes naturais que foram analisados. No caso de plantas, essa é uma base de dados muito limitada. É difícil prever com qualquer certeza que um sítio designado grande ou pequeno é mais ou menos propenso a funcionar, parcial ou completamente, quando encontrado sem um gene heterólogo, tais como aqueles codificando os polipeptídios de δ-endotoxina da presente invenção. TABELA 2 SÍTIOS DE POLIALDENILAÇÃO EM GENES DE PLANTAS A presente invenção proporciona um processo para a preparação de genes vegetais sintéticos, cujos genes podem expressar os seus produtos de proteínas em níveis significativamente mais altos do que os genes do tipo natural.

Como descrito acima, a expressão dos genes B. thuringiensis nativos em vegetais é, frequentemente, problemática. A natureza das sequências de codificação dos genes B. thuringiensis os distinguem dos genes vegetais, bem como muitos outros genes heterólogos expressos em plantas. Em particular, os genes B. thuringiensis são muito ricos (~62%) em adenina (A) e timina (T), enquanto que os genes vegetais e muitos outros genes bacterianos, que foram expressos em plantas, são da ordem de 45-55% de A+T.

Devido à degeneração do código genético e ao número limitado de seleções de códons para qualquer aminoácido, a maior parte do "excesso" de A+T das sequências de codificação estruturais de algumas espécies de Bacillus é encontrada na terceira posição dos códons. Isto é, os genes de algumas espécies Bacillus têm A ou T como o terceiro nucleotideo em muitos códons. Desse modo, o teor de A+T pode determinar em parte a tendência do uso dos códons. Além disso, é claro que os genes evolvem para a função máxima no organismo no qual evolvem. Isso significa que as sequências de nucleotideos encontradas em um gene de um organismo, no qual não desempenham qualquer papel, exceto codificar uma extensão particular de aminoácidos, têm o potencial de serem reconhecidas como elementos de controle de genes em outro organismo (tais como promotores ou terminadores transcricionais, sítios de adição de poliA, sítios de união de intróns ou sinais de degradação de mRNA específicos). Talvez seja surpreendente que esses sinais mal lidos não sejam uma característica mais comum de expressão de genes heterólogos, mas isso pode ser explicado em parte pelo teor de A+T relativamente homogêneo (~50%) de muitos organismos. Esse teor de A+T mais a natureza do código genético esclarecem as constrições da probabilidade de ocorrência de qualquer sequência de oligonucleotídeos particular. Desse modo, um gene de E. coli com um teor de A+T de 50% é muito mais provável de conter qualquer segmento rico em A+T particular do que um gene de B. thuringiensis.

Tipicamente, para obter expressão de nível alto dos genes de δ-endotoxina em vegetais, a sequência de codificação estrutural existente ("gene estrutural"), que codifica a δ-endotoxina, é modificada por remoção de ATTTA e dos sinais de polialdenilação putativos por mutagênese direcionada por sitio do DNA compreendendo o gene estrutural. É particularmente preferido que substancialmente todos os sinais de polialdenilação e as sequências de ATTTA sejam removidos, embora sejam observados níveis de expressão melhorados com apenas a remoção parcial de qualquer uma das sequências identificadas acima. Alternativamente, se um gene sintético é preparado, que codifica a expressão da proteína objeto, os códons são selecionados para evitar a sequência ATTTA e os sinais de polialdenilação putativos. Para os propósitos da presente invenção, os sinais de polialdenilação putativos incluem, mas não são limitados necessariamente a AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ΑΤΑΔΑΑ, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA e CATAAA. Na substituição das sequências ATTTA e dos sinais de polialdenilação, os códons são, de preferência, utilizados, que evita os códons que são raramente encontrados em genomas de plantas. A sequência de DNAs selecionada é varrida para identificar as regiões com mais do que quatro nucleotideos de adenina (A) ou timina (T) . As regiões A+T são varridas para os sinais de polialdenilação vegetais potenciais. Embora a sequência de cinco ou mais nucleotideos de A ou T consecutivos elimina a maior parte dos sinais de polialdenilação, se não há mais do que um dos sinais de polialdenilação pequenos identificados dentro de dez nucleotideos entre si, então a sequência de nucleotideos dessa região é, de preferência, alterada para remover esses sinais, enquanto mantém a sequência de aminoácidos codificada original. A segunda etapa é considerar os cerca de 15 a cerca de 30 ou mais ou menos resíduos de nucleotideos circundando a região rica em A+T identificadas na etapa um. Se o teor de A+T da região circundante é menor do que 80%, a região deve ser examinada para os sinais de polialdenilação. A alteração da região à base de sinais de polialdenilação é dependente de (1) o número de sinais de polialdenilação presentes e (2) a presença de um grande sinal de polialdenilação de planta. A região estendida é examinada para a presença de sinais de polialdenilação de plantas. Os sinais de polialdenilação são removidos por mutagênese direcionada por sitio da sequência de DNAs. A região estendida também é examinada para múltiplas cópias da sequência ATTTA, que também são removidas por mutagênese.

Também se prefere que as regiões compreendendo bases Α+Γ ou bases G+C consecutivas podem ser rompidas, uma vez que se prevê que essas regiões têm uma probabilidade mais alta, para formar estrutura de grampo de cabelo devido à auto-complementaridade. Portanto, a inserção de pares básicos heterogêneos reduziria a probabilidade de formação de estrutura secundária auto-complementar, que são conhecidos por inibirem a transcrição e/ou a translação em alguns organismos. Na maioria dos casos, os efeitos adversos podem ser minimizados por uso de sequências que não contêm mais do que cinco A+T ou G+C consecutivos.

4.6 PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS RESISTENTES A INSETOS

Desse modo, a proporção de um gene codificando um polipeptidio de interesse (isto é, uma proteína cristal bacteriana ou um polipeptídio de δ-endotoxina tendo atividade inseticida contra os membros da Tortricidae, tais como Epinotia e, em particular, E. aporema) pode ser aumentada em plantas de soja, por transformação dessas plantas usando processos de transformação, tais como bombardeio de partículas (Maddock et al., 1991). 0 DNA também pode ser introduzido nas plantas por transferência direta de DNA no pólen, como descrito (Zhou et al., 1983; Hess, 1987). A expressão de genes de codificação de polipeptídios pode ser obtida por injeção do DNA nos órgãos reprodutivos de uma planta, como descrito (Pena et al., 1987) . O DNA também pode ser diretamente injetado nas células de embriões imaturos e na reidratação de embriões dessecadas, como descrito (Neuhaus et al., 1987; Benbrook et al., 1986).

4.6.1 SELEÇÃO DE CÉLULAS TRANSFORMADAS

Após efetuar a transferência de DNA exógeno para as células recipiente, as próximas etapas geralmente se relacionam com a identificação das células transformadas para posterior cultura e regeneração da planta. Como mencionado na presente descrição, para aperfeiçoar a capacidade de identificar os transformadores, pode-se desejar empregar um gene marcador selecionável ou classificável como, ou além de, o gene expressível de interesse. Nesse caso, poderia-se então genericamente testar a população de células potencialmente transformadas, por exposição das células em um agente ou agentes seletivos, ou poderia-se classificar as células para a característica do gene marcador desejado.

Uma modalidade ilustrativa dos processos para a identificação das células transformadas envolve a exposição das culturas transformadas em um agente seletivo, tal como um inibidor, um antibiótico, um herbicida metabólicos ou assemelhados. As células que foram transformadas e possuem estavelmente integrado um gene marcador conferindo resistência ao agente seletivo usado, vão crescer e se dividir na cultura. As células sensíveis não vão ser tratáveis para cultura posterior. Um exemplo de um gene marcador preferido confere resistência ao glisofato. Quando esse gene é usado como um marcador selecionável, a cultura de células transformadas putativamente é tratada com glisofato. Após tratamento, as células transgênicas vão estar disponíveis para posterior cultura enquanto que as células sensíveis, ou não-transformadas, não vão. Esse processo é descrito na patente U.S. 5.569.834, que é especificamente incorporada na presente descrição por referência. Outro exemplo de um sistema marcador selecionável preferido é o sistema NPTII-canamicina, por meio do qual a resistência ao antibiótico de canamicina é conferida (patente U.S. 5.569.834). De novo, após a transformação com esse sistema, células transformadas vão estar disponíveis para posterior cultura, mediante tratamento com canamicina, enquanto que as células não-transformadas não vão. Todos os testes contemplados são não-destrutivos e as células transformadas podem ser cultivadas ainda seguinte à identificação. Outro marcador classificável, que pode ser usado é a codificação de gene para proteína fluorescente verde.

Ainda se contempla que as combinações de marcadores classificáveis e selecionáveis vão ser úteis para a identificação de células transformadas. Em alguns tipos de células ou tecidos, um agente de seleção, tal como glisofato ou canamicina, pode não proporcionar uma atividade de extermínio suficiente, para reconhecer claramente as células transformadas, ou podem provocar uma inibição não-seletiva substancial dos transformadores e os agentes não-transformantes similares, fazendo assim com que a técnica de seleção não seja efetiva. Propõe-se que a seleção com um composto inibidor de crescimento, tal como glisofato, em concentrações abaixo daquelas que propiciam 100% de inibição, seguida por classificação do tecido de crescimento para expressão de um gene marcador classificável, tal como canamicina, permitiría que fossem recuperados os transformadores dos tipos de células ou de tecido que não são propícios para seleção sozinhos. Propõe-se que as combinações de seleção e classificação pode propiciar que sejam identificados os transformadores em uma variedade mais ampla de tipos de células e de tecidos.

4.6 REGENERAÇÃO DOS TRANSFORMADORES 0 desenvolvimento ou a regeneração de plantas de protoplastos de planta única ou de várias explantes é bem conhecido na técnica (Weissbach e Weissbach, 1988). Essa regeneração e processo de crescimento incluem, tipicamente, as etapas de seleção de células transformada, cultura dessas células por meio do uso de desenvolvimento embriônico por meio do estágio de plantio enraizado. Os embriões transgênicos são similarmente regenerados. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são depois plantados em um meio de crescimento vegetal adequado, tal como um solo. 0 desenvolvimento ou a regeneração de plantas contendo o gene exógeno estranho, que codifica um polipeptideo de interesse introduzido de explantes de folha, pode ser atingido por processos bem conhecidos na técnica, como descrito (Horsch et al., 1985). Nesse procedimento, os transformadores são cultivados na presença de um agente de seleção e em um meio que induz a regeneração de brotos na linhagem da planta sendo transformada como descrito (Fraley et al., 1983). Em particular, a patente U.S. 5.349.124 (relatório descritivo incorporado por referência na presente descrição) detalha a criação de células de alface transformadas geneticamente e de plantas resultantes delas, que expressam proteínas cristal híbridas conferindo atividade inseticida contra as larvas Lepidópteros a essas plantas.

Esse procedimento produz, tipicamente, brotos dentro de dois a quatro meses e esses brotos são depois transferidos para um meio indutor apropriado contendo o agente seletivo e um antibiótico para evitar crescimento bacteriano. Os brotos que enraizaram na presença do agente seletivo para formar plantados são depois transplantados no solo ou em outros meios para permitir a produção de raízes. Esses procedimentos variam, dependendo da linhagem de planta particular empregada, essas variações sendo bem conhecidas na técnica.

De preferência, as plantas regeneradas são auto-polinizadas, para proporciona plantas transgênicas homozigóticas, ou pólen obtido de plantas regeneradas é cruzado com plantas de crescimento de semente de linhas agronomicamente importantes, de preferência, inatas. Contrariamente, pólen de plantas dessas linhas importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção, contendo um polipeptídeo desejado, é cultivada usando processos bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

Uma planta transgênica dessa invenção tem uma maior proporção de uma região de codificação (por exemplo, iam gene cryl) , que codifica um polipeptideo de δ-endotoxina ativo aos Tortricidae. Uma planta transgênica preferida é um agente de segregação independente e pode transmitir esse gene e a sua atividade para a sua progênie. Uma planta transgênica particularmente preferida é um homozigoto para esse gene e transmite esse gene para toda a sua prole no acasalamento sexual. A semente de uma planta transgênica pode ser crescida no campo ou em estufa e as plantas transgênicas sexualmente maduras resultantes são auto-polinizadas, para gerar verdadeiras plantas de reprodução. A progênie dessas plantas se torna verdadeiras linhas de reprodução, que são avaliadas para maior capacidade inseticida contra Tortricidae e, em particular, membros Tortricidae do gênero Epinotia e, especialmente, E. aporema, de preferência, no campo, sob amplas condições ambientais. 4.7 ENSAIOS PARA E. APOREMA As plantas de soja transformadas de acordo com a presente invenção podem ser avaliadas para a resistência delas aos membros da família Tortricidae por meio de vários ensaios. Em um processo preferido, usa-se um ensaio de folha para avaliar a concentração de inseticida da planta transformada, como descrito nos Exemplos 5.1 e 5.2. Esse tipo de ensaio pode ser usado para avaliar a taxa de controle ou de extermínio, que é feito pela célula ou planta de soja transformada. Pode ser usado para determinar essa taxa contra vários estágios de desenvolvimento nos estágios larvais de insetos.

Outros ensaios podem ser usados para determinar, entre outras coisas, o grau de expressão do polipeptideo de δ-endotoxína, a eficiência relativa de vários transgenes cryl, ou a concentração relativa dos vetores usados na produção de planta de soja transgênica. Adicionalmente, vários ensaios podem ser usados para determinar que linhas de soja são mais efetivamente transformadas por um gene de codificação de polipeptideo de δ-endotoxina Cryl.

4.8 ISOLAMENTO DE GENES E FRAGMENTOS DE GENES HOMÓLOGOS

Os genes e as δ-endotoxinas de acordo com a presente invenção incluem não apenas as sequências de comprimento integral descritas na presente descrição, mas também fragmentos dessas sequências, ou proteínas de fusão, que conservam a atividade inseticida característica das sequências especificamente exemplificadas na presente descrição.

Deve ser evidente para uma pessoa versada na técnica que as δ-endotoxinas inseticidas podem ser identificadas e obtidas por meio de vários meios. Os genes específicos, ou partes deles, podem ser obtidos de um depositório de cultura, ou construídos sinteticamente, por uso de uma máquina de genes. As variações desses genes podem ser facilmente construídas usando técnicas padronizadas para a produção de mutações pontuais. Também, os fragmentos desses genes podem ser produzidos, usando exonucleases ou endonucleases disponíveis comercialmente acordo com procedimentos usuais. Por exemplo, enzimas, tal como Bal 31, ou mutagênese direcionada por local podem ser usadas para cortar, sistematicamente, os nucleotídeos das extremidades desses genes. Também, os genes que codificam os fragmentos ativos podem ser obtidos usando várias outras enzimas de restrição. As proteases podem ser usadas para obter, diretamente, fragmentos ativos dessas δ-endotoxinas.

As δ-endotoxinas equivalentes e/ou os genes codificando essas δ-endotoxinas também podem ser isoladas de linhagens de Bacillus e/ou de bibliotecas de DNA, usando os ensinamentos proporcionados na presente descrição. Por exemplo, os anticorpos para as δ-endotoxinas descritos e reivindicados na presente descrição podem ser usados para identificar e isolar outras δ-endotoxinas de uma mistura de proteínas. Especificamente, os anticorpos podem ser cultivados nas partes das δ-endotoxinas que são mais constantes e mais distintas de outras δ-endotoxinas de B. thuringiensis. Esses anticorpos podem ser depois usados para identificar especificamente as δ-endotoxinas equivalentes com a atividade inseticida característica por imunoprecipitação, ensaio imunológico ligado a enzima (ELISA) ou manchamento Western.

Um outro processo para identificação de δ-endotoxinas e genes da presente invenção é por meio do uso de sondas de oligonucleotídeos. Essas sondas são sequências de nucleotideos tendo uma marcação detectável. Como é bem conhecido na técnica, se a molécula da sonda e a amostra de ácido nucléico hibridizam por formação de uma forte ligação entre duas moléculas, pode-se assumir razoavelmente que a sonda e a amostra são, essencialmente, idênticas. 0 marcador detectável da sonda proporciona um meio para a determinação de uma maneira conhecida se a hibridização ocorreu. Essa análise por sonda proporciona um processo rápido para identificação de genes de δ-endotoxina formicidas da presente invenção.

Os segmentos de nucleotideos, que são usados como sondas acordo com a invenção podem ser sintetizados por uso de sintetizadores de DNA usando procedimentos usuais. No uso dos segmentos de nucleotideos como sondas, a sonda particular é marcada com qualquer marcador adequado conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo os marcadores radioativos e não-radioativos. Os marcadores radioativos típ icos incluem 32P, 125I, 35S ou assemelhados. Uma sonda marcada com um isótopo radioativo pode ser construída de uma sequência de nucleotideos complementar à amostra de DNA por uma reação de translação de entalhe, usando uma Dnase e uma polimerase de DNA. A sonda e a amostra podem ser então combinadas em uma solução tampão de hibridização e mantidas a uma temperatura apropriada até ocorrência de recozimento. Depois, a membrana é lavada para ficar isenta de materiais estranhos, deixando a amostra e as moléculas da sonda ligadas tipicamente detectadas e quantificadas por autorradiografia e/ou contagem por cintilação líquida.

Os marcadores não-radioativos incluem, por exemplo, ligantes tais como biotina ou tiroxina, bem como as enzimas, tais como as hidrolases e as peroxidases, ou os vários agentes de quimioluminescência, tal como luciferina, ou compostos fluorescentes como fluoresceina e os seus derivados. A sonda também pode ser marcada em ambas as extremidades com diferentes tipos de marcadores para facilidade de separação, como, presente descrição, por uso de um marcador isotópico na extremidade mencionada acima e um marcador de biotina na outra extremidade. A formação e a estabilidade do duplex dependem da complementaridade entre os dois filamentos de um híbrido e, como observado acima, um determinado grau de acasalamento impróprio pode ser tolerado. Portanto, as sondas da presente invenção incluem as mutações (tanto simples quanto múltiplas), deleções, inserções das sequências descritas e as suas combinações, em que as ditas mutações, inserções e deleções permitem a formação de híbridos estáveis com o polipeptídeo alvo de interesse. As mutações, inserções e deleções podem ser produzidas em uma determinada sequência de polinucleotídeos de muitas maneiras, por processos atualmente conhecidos para uma pessoa versada na técnica e talvez por outros processos que podem ficar conhecidos no futuro.

As variações potenciais nas sondas listadas é devido, em parte, à redundância do código genético. Por causa da redundância do código genético, mais do que um tripleto de nucleotídeo de codificação (códon) pode ser usado para a maior parte dos aminoácidos usados para produzir proteínas. Portanto, diferentes sequências de nucleotídeos podem codificar um aminoácido particular. Desse modo, as sequências de aminoácidos das Ô-endotoxinas de B. thuringiensis e dos peptideos podem ser preparadas por sequências de nucleotídeos equivalentes codificando a mesma sequência de aminoácidos da proteína ou peptídeo. Consequentemente, a presente invenção inclui essas sequências de nucleotídeos equivalentes. Também, as sequências inversas ou complementares são um aspecto da presente invenção e podem ser facilmente usadas por uma pessoa versada na técnica. Além de se ter mostrado que as proteínas de estrutura e função identificadas podem ser construídas por alteração da sequência de aminoácidos, se essas alterações não alteram a estrutura secundária da proteína (Kaiser e Kezdy, 1984). Desse modo, a presente invenção inclui os mutantes da sequência de aminoácidos ilustrada na presente descrição, que não alteram a estrutura secundária da proteína, ou se a estrutura é alterada, a atividade biológica é substancialmente mantida. Além do mais, a invenção também inclui mutantes de organismos hospedando toda ou parte da δ-endotoxina codificando um gene da invenção. Esses mutantes podem ser produzidos por técnicas bem conhecidas por pessoas versadas no ramo. Por exemplo, a irradiação UV pode ser usada para preparar mutantes de organismos hospedeiros. Da mesma forma, esses mutantes podem incluir células hospedeiras asporogenosas, que também podem ser preparadas por procedimentos bem conhecidos na técnica. 4.9 MUTAGÊNESE ESPECÍFICA DE SÍTIO A mutagênese específica de sítio é uma técnica útil na preparação de peptídeos individuais, ou de proteínas ou peptídeos equivalente biologicamente funcionais, por meio de mutagênese específica do DNA básico. A técnica proporciona ainda um pronta capacidade de preparar e testar as variantes da sequência incorporando, por exemplo, uma ou mais das considerações precedentes, por introdução de uma ou mais sequências de nucleotídeos no DNA. A mutagênese específica de sitio permite a produção dos mutantes por meio do uso de sequências de oligonucleotídeos especificas, que codificam a sequência de DNAs da mutação desejada, bem como um número suficiente de nucleotideos adjacentes, para proporcionar uma sequência de bases de tamanho e complexidade de sequência suficientes para formar um duplex estável sobre ambos os lados da junção de deleção sendo atravessada. Tipicamente, uma base de cerca de 17 a 25 nucleotideos de comprimento é preferida, com cerca de 5 a 10 resíduos sobre ambos os lados da junção da sequência sendo alterada.

Em geral, a técnica de mutagênese específica de sítio é bem conhecida na técnica, como exemplificado por várias publicações. Como vai ser apreciado, a técnica emprega tipicamente um vetor de fago, que existe em uma forma de filamento simples e de filamento duplo. Os vetores típicos úteis na mutagênese direcionada por sítio inclui os vetores, tal como fago M12. Esses fagos são facilmente comercialmente disponíveis e o uso deles é geralmente bem conhecido por aqueles versados na técnica. Os plasmídeos de filamento duplo também são rotineiramente empregados em mutagênese direcionada por sítio, que elimina a etapa de transferência do gene de um plasmídeo para um fago.

Em geral, a mutagênese direcionada por sítio acordo com a presente descrição é primeiramente realizada por obtenção de um vetor de filamento único ou de fusão entre si de dois filamentos de um vetor de filamento duplo, que inclui dentro da sua sequência uma sequência de DNAs que codifica o peptídio desejado. Uma base de oligonucleotideo portando a sequência mudada desejada é preparado, geralmente sinteticamente. Essa base é depois recozida com o vetor de filamento simples e submetido às enzimas de polimerização do DNA, tal como o fragmento I Klenow de polimerase E. coli, para completar a síntese do filamento portando a mutação. Desse modo, um heteroduplex é formado, em que um filamento codifica a sequência não-mudada original e o segundo filamento porta a mutação desejada. Esse vetor heteroduplex é então usado para transformar células apropriadas, tais como células de E. coli, e os clones são selecionados, que incluem os vetores recombinantes portanto a disposição da sequência mudada. A preparação de variantes de sequências dos segmentos de DNA codificando os peptídeos, usando mutagênese direcionada por sítio, é proporcionada como um meio de produção de espécies potencialmente úteis e não se menciona como sendo limitante, pois há outras maneiras nas quais as variantes da sequência de peptídeos e as sequências de DNAs as codificando podem ser obtidas. Por exemplo, os vetores recombinantes codificando a sequência de peptídeos desejada podem ser tratados com agentes mutagênicos, tal como hidroxilamina, para obter as variantes das sequências. Esses procedimentos podem alterar, favoravelmente, as características bioquímicas e biofísicas da proteína ou o seu modo de ação. Essas incluem, mas não são limitadas a: 1) formação de δ-endotoxina aperfeiçoada, 2) estabilidade da proteína aperfeiçoada ou degradação de protease reduzida, 3) reconhecimento e ligação de receptor de membrana de inseto aperfeiçoados, 4) oligomerização ou formação de canais aperfeiçoados no endotélio do intestino médio do inseto e 5) atividade inseticida ou especificidade inseticida aperfeiçoadas, devido a qualquer uma das razões mencionadas acima. 4.10 EQUIVALENTES FUNCIONAIS BIOLÓGICOS A modificação e as alterações podem ser feitas na estrutura dos peptídeos da presente invenção e nos segmentos de DNA que os codificam e ainda obter uma molécula funcional que codifica uma proteína ou um peptídeo com características desejáveis. A seguir, encontra-se uma discussão com base na mudança dos aminoácidos de uma proteína para criar uma molécula de segunda geração equivalente, ou mesmo aperfeiçoada. Nas modalidades particulares da invenção, as proteínas cristal alteradas são contempladas como sendo úteis para aumentar a atividade inseticida da proteína e, consequentemente, aumentar a atividade inseticida e/ou a expressão do transgene recombinante em uma célula vegetal. As alterações dos aminoácidos podem ser alcançadas por alteração dos códons da sequência de DNAs, acordo com os códons apresentados na Tabela 3.

Por exemplo, determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda apreciável da capacidade de ligação interativa com as estruturas, tais como, por exemplo, regiões de ligação de antígeno ou sítios de ligação sobre moléculas de substratos. Uma vez que são a capacidade interativa e a natureza de uma proteína que definem a atividade funcional biológica da proteína, determinadas substituições na sequência de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de proteínas e, naturalmente, na sua sequência de codificação de DNA básica e no entanto obter uma proteína com propriedades similares. Os inventores contemplam, assim, que várias mudanças podem ser feitas nas sequências de peptídeos, sem perda apreciável das suas utilidade ou atividade biológica.

Na produção dessas mudanças, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice de aminoácido hidropático em conferir função biológica interativa em uma proteína é, de uma maneira geral, entendida na técnica (Kyte e Doolittle,1982, incorporada por referência na presente descrição). Aceita-se que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, o que, por sua vez, define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e ou assemelhados.

Cada aminoácido recebeu um índice hidropático, com base nas características de hidrofobicidade e carga (Kyte e Doolittle,1982), que são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina ((+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (- 3.5) ; glutamina (-3,5); aspartato (3,5); asparagina (- 3.5) ; lisina (-3,9) e arginina (-4,5). É conhecido na técnica que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice hidropático similar e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína biológica funcionalmente equivalente. Na produção dessas mudanças, a substituição dos aminoácidos, cujos índices hidropáticos estão dentro de ±0,5, são ainda particularmente preferidos.

Também deve ser entendido na técnica que a substituição de aminoácidos similares pode ser feita efetivamente com base na hidrofobicidade. A patente U.S. 4.554.101, incorporada por referência na presente descrição, indica que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com uma propriedade biológica da proteína.

Como detalhado na patente U.S. 4.554.101, os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos aos resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina ( + 0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteina (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (- 2,5); triptofan (-3,4).

Deve-se entender que um aminoácido. pode ser substituído por outro tendo um valor de hidrofilicidade similar e ainda obter uma proteína biologicamente equivalente e, em particular, imunologicamente equivalente. Nessas mudanças, a substituição de aminoácidos, cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2, é a preferida, aqueles que estão dentro de ±1 são particularmente preferidos e aqueles dentro de ±0,5 são especialmente preferidos.

Como descrito acima, as substituições de aminoácidos são, portanto, genericamente baseadas na similaridade relativa dos substituintes de cadeias laterais de aminoácidos, por exemplo, a hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e assemelhados deles. As substituições exemplificativas, que consideram várias das características anteriores, são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina e valina, leucina e isoleucina. 4.11 TAXONOMIA DOS LEPIDÓPTEROS Os inventores contemplam que outros membros da Ordem dos Lepidópteros podem ser efetivamente controlados ou exterminados por ingestão de uma parte da planta de soja transgênica, que compreende um ou mais dos polipeptideos Cry mencionados e descritos na presente descrição. Pode ser possível que muitas das espécies de insetos mencionadas na Tabela 4 e Tabela 5 vão ser particularmente suscetíveis ao extermínio via ingestão das enaotoxinas mencionadas. TABELA 4 TAXONOMIA DOS LEPIDÓPTEROS DA SUBORDEM GLOSSATA, INFRA-ORDEM NEOLEPIDÓPTEROS 1 A ordem dos Lepidópteros também contém a subordem Aglossata, representada pela espécie Agathiphaga queenslandensis (traça dâmara) na família Agatiphagidae. TABELA 5 TAXONOMIA DOS LEPIDÓPTEROS DAS SUBORDENS HETEROBATHMIINA E ZEUGLOPTERA

5.0 EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Aqueles versados na técnica devem apreciar que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam as técnicas descobertas pelo inventor, para funcionar bem na prática da invenção e podem ser, desse modo, consideradas, como constituindo os modos preferidos para a prática dela. No entanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente descrição, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas, que são descritas, e ainda obter um resultado similar ou assemelhado, sem que se afaste do espírito e do âmbito da invenção. 5.1 EXEMPLO 1 - TRANSFORMAÇÃO DE SOJA E EXPRESSÃO DE CRY1AC EM E. APOREMA DE CONTROLE E. aporema (Walsingham) (Lepidópteros: Tortricidae) e A. gemmatalis (Hübner) e Rachiplusia nu (Guenee) (Lepidópteros: Noctuidae) são as grandes pestes dos Lepidópteros que atacam sojas na Argentina. Os testes em campo foram conduzidos durante o período 1996 - 1997, para demonstrar que a expressão da proteína CrylAc em plantas de soja protegeríam as plantas dos ataques nocivos pelas pestes alvo. Nesses testes, E. aporem (uma broca de caule) e A. gemmatalis (um desfolhador) foram selecionados como as pestes alvo. As plantas transformadas, bem como as plantas de controle negativas, foram expostas às populações artificialmente induzidas (controladas) das pestes alvo. As plantas transformadas e os controles também foram expostos às populações de insetos naturais (não-controladas) em cada sitio de campo. 0 dano pelas populações de E. aporema controladas foi estimado em 30 - 90% nas plantas de controle, enquanto que as plantas transformadas não sofreram, virtualmente, qualquer dano. Nenhuma desfolhação detectável foi observada nas plantas de controle ou transformadas expostas às populações de A. gemmatalis controladas. No entanto, essas linhas de soja transformadas tinham apresentado anteriormente em biotestes de laboratório serem protegidas de A. gemmatalis. Nas plantas expostas às populações de insetos não-controladas, E. aporema provocou um dano estimado em 50 - 90% nos controles, enquanto não se observou, virtualmente, qualquer dano nas plantas transformadas com o gene CrylAc. Os desfolhadores, incluindo A. gemmatalis e Spilosoma virginica (Fabricius) provocaram uma desfolhação estimada em 25% nos controles, enquanto que uma desfolhação estimada em 0 - 10% foi observada nas plantas transformadas. Os dados de laboratório para E. aporema no tecido coletado das plantas no campo se correlacionam com as observações no campo. Essas observações indicam que o conceito de controle de infestação de E. aporema de plantas de soja pela transformação de soja com CrylAc é válido.

5.1.2 ESTERILIZAÇÃO DE SEMENTE USANDO LAVAGEM COM

CHLOROX

Foram adicionadas sementes a um frasco Schott limpo. Elas foram depois enxaguadas em uma lavagem de Tween-20 por ~ 30 segundos; depois, enxaguadas sob água corrente comum por ~ 2 minutos. Chlorox 50% recém-preparado foi adicionado com 2 gotas de Tween-20® às sementes. As sementes foram depois esterilizadas por 15 minutos; o frasco de sementes foi sacudido várias vezes durante o processo de esterilização. O Chlorox foi depois decantado e as sementes foram enxaguadas 5 vezes com água destilada estéril. As sementes foram depois transferidas para cápsulas Petri estéreis e uma polpa de Captan® foi adicionada às sementes. As sementes foram deixadas permanecer nas cápsulas por 15 - 30 minutos. Em alguns genótipos, pode ser necessário adicionar uma combinação de Captan® e Benlate® para um controle de fungos mais amplo. Quando se usou Linha Hartz H4994, foi necessário adicionar ambos os fungicidas. Para a Linha Asgrow A3237, apenas o uso de Captan® foi necessário como um fungicida e deixando-se as sementes encharcar por 30 minutos.

5.1.3 ESTERILIZAÇÃO DE SEMENTES USANDO CLORO GASOSO Cápsulas de Petri de 100 x 25 cm foram cheias aproximadamente à metade com sementes de soja e as cápsulas foram cobertas com as tampas. As cápsulas Petri contendo as sementes foram colocadas em um dessecador plástico (Dessecador Plástico Auclavável de Nalgene), que foi depois colocado em uma capela. Foram adicionados 200 ml de Chlorox a um béquer de vidro. O béquer foi depois preso no centro do dessecador. Foram adicionados 2 ml de ácido clorídrico concentrado ao béquer contendo o Chlorox. O dessecador foi coberto com uma cobertura de abóbada clara, depois ligado a uma linha de vácuo interna. A linha de vácuo foi ativada (linha interna vai propiciar 3,06 - 3,33 kPa - 23 - 25 mm Hg) . A fixação do dessecador foi então fechada e a mangueira de vácuo desconectada. As sementes foram deixadas permanecer por 16-24 horas na capela de fumos. Foi importante liberar o vácuo após um período de 16 - 24 horas na capela de fumos e remover a cobertura do dessecador na capela de fumos, para permitir escapamento do gás. As cápsulas de Petri contendo as sementes foram depois colocadas na capela de fluxo lamelar estéril e cobertas com uma mistura de Captan® (~ 1 g/500 ml) que era 50% em peso. As sementes foram deixadas encharcar por 10 - 15 minutos. Foram depois removidas da mistura de Captan® e colocadas em um meio de germinação. A menos que indicado de outro modo, as sementes nesse exemplo foram esterilizadas por esse processo com cloro gasoso.

5.4.1 GERMINAÇÃO

As sementes foram transferidas sobre meio B50 (aproximadamente 15 sementes por lâmina). Uma cinta de borracha foi colocada em torno de uma pilha de 5 lâminas e um saco plástico sobre a parte de topo da pilha. As sementes foram colocadas em um ambiente quente a 25°C por 5-6 dias.

5.1.5 PRÉ-TRATAMENTO A FRIO

As sementes germinadas foram colocadas no gabinete deli (4°C) por pelo menos 24 h antes da excisão das explantes (as sementes podem permanecer no frio por 7 dias - observou-se o crescimento continuo das sementes ao ponto no qual as tampas foram empurradas).

5.1.6 PREPARAÇÃO BACTERIANA

As bactériâs foram retiradas do congelador sobre lâminas LBSCK (contendo meio LB mais 1,0 ml de espectinomicina, 0,5 ml de cloroanfenicol, 0,5 ml de canamicina por 500 ml de meio) ; as bactérias foram depois incubadas à temperatura ambiente ou em uma incubadora a 27°C; as bactérias cresceram em 2 - 4 dias. As bactérias foram retiradas do congelador a cada 3-4 semanas. Uma lâmina fresca da lâmina de congelamento foram retiradas 2-3 dias antes do ajuste experimental. Um a dois dias antes da inoculação das explantes, 1 laço de bactéria foi transferida de uma placa recém-tirada a um tubo de cultura contendo 2 ml de meio YEP. Os seguintes antibióticos foram adicionados após autoclavagem: 1,0 ml de espectinomicina, 0,5 ml de cloroanfenicol, 0,5 ml de canamicina por 500 ml de meio. NOTA: Volumes maiores de bactérias podem ser crescidos usando a mesma fórmula básica de 1 laço de bactéria por 2 ml de YEP. O tubo contendo as bactérias em YEP foi mantido em vórtice, para dispersar o aglomerado de bactérias. As bactérias foram depois colocadas no dispositivo de rotação (quando da execução de uma cultura de um dia, as bactérias foram iniciadas em torno de 7:00a.m.; se executando uma cultura de dois dias, as bactérias poderíam ser iniciadas mais tarde no dia; as bactérias foram deixadas girar de um dia para o outro). A tarde antes da inoculação dos explantes, 4 -6 ml (2-3 tubos) da cultura bacteriana foram adicionados a 50 ml de meio ABSCK em frascos estéreis, depois do que foram sacudidos de um dia para o outro. As culturas bacterianas de um dia para o outro foram depois transferidas para um tubo de centrífuga e girado por 10-15 min a 2.000 rpm à temperatura ambiente. Uma pelota se formou no fundo do tubo e o sobrenadante ficou um pouco nebuloso (sob condições normais, 30 ml de cultura bacteriana foram pipetados em um tubo cônico de 50 ml) . Para tomar as leituras de OD, o espectrofotômetro foi mantido a 660 nm; as culturas bacterianas foram diluídas 1:10, antes de tirar uma leitura; as culturas com uma leitura final de 0,3 a 0,6 foram buscadas. Se o OD final variou, notou-se para aquele experimento particular. As bactérias foram diluídas com um meio de concentração 1/10, que contém os seguintes: sais B5 1/10, vitaminas B5 1/10, ferro 1/10 (sequestreno) , BAP 7,5 μια, glicose 30 g/1, acetosiringona 200 VM, ácido galacturônico 1 mM, MES 20 mM, pH 5,4. As culturas bacterianas foram sacudidas em um dispositivo de sacudimento rotativo, enquanto que os explantes eram preparados para infecção.

5.1.7 EXCISÃO E INOCULAÇÃO DE EXPLANTES

Os explantes de cotiledôneo foram preparados da seguinte maneira: a) remover o revestimento da semente da planta nova germinada; b) cortar o hipocótilo ~ 0,5 cm do leito e descartar a parte inferior; c) dividir os cotiledôneos abertos, de modo que o hipocótilo seja dividido na metade; d) remover as folhas primárias e a região apical; e) fazer pelo menos 5 incisões com bisturi (cortes) em linha com o eixo do embrião no local da axila do cotiledôneo; o broto axilar deve ser destruído com a incisão; f) preparar os cotiledôneos de 2 lâminas de plantas novas germinadas; g) colocar os cotiledôneos em uma cápsula de Petri (100 x 25 mm) e adicionar ~ 10-15 ml da cultura bacteriana diluída; h) incubar os explantes na cultura bacteriana por 1 hora; i) remover a cultura bacteriana dos explantes; j) transferir os explantes para uma co-cultura lâmina-à-lâmina os explantes com o lado plano para baixo.

5.1.8 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS DE CO-CULTURA/PERÍODO DE

CO-CULTURA 5 ml do meio de co-cultura foram adicionados a 1 camada de filtro de · papel Whatman estéril em uma cápsula de Petri de 100 x 15 mm; o meio de co-cultura continha sais B5 1/10, vitaminas B5 1/10, ferro 1/10 (sequestreno), BAP 7,5 μπι, glicose 30 g/1, acetosiringona 200 μΜ, ácido galacturônico 1 mM, MES 20 mM, pH 5,4. A eficiência da transformação foi de ~ 3 vezes mais elevada, quando a glicose não foi adicionada ao meio de co-cultura. Os cotiledôneos foram co-cultivados em um ambiente quente a 23°C por um fotoperíodo de 18 h no claro/6 h no escuro (ou em percíval com o mesmo fotoperíodo); as lâminas foram colocadas em um saco plástico, que foi subseqüentemente fechado com pinos de tecidos ou banda de borracha. O período de co-cultura durou idealmente 3-4 dias. Após a co-cultura, os explantes foram lavados em uma solução aquosa estéril de 500 mg/1 de ticarcilina e 100 mg/1 de •cefotaxima (sais B5 1/10, vitaminas B5 1/10 e BAP 7,5 μΜ pH 5,6 foi usado com o meio de lavagem).

5.1.9 CULTURA

Os explantes foram rotineiramente cultivados em um meio de cultura à base de B5 com BAP 7,5 μΜ mais 500 mg/1 de ticarcilina, 100 mg/1 de cefotaxima mais/menos o agente seletivo. O meio de seleção para as primeiras 3 semanas foi BS/B5 RAP 7,5 μΜ + glifosato 0, 075 roM, ou no caso de seleção Kan, o mesmo plano basal mais 225 mg/1 de canamicina. As lâminas foram seladas com fita 3M branca em um ambiente quente ou em um percival a 25°C em um ciclo de 18 h no claro/6 h no escuro. As culturas foram transferidas para um meio fresco a cada três semanas para seleção de glifosato e a cada duas semanas para seleção de canamicina.

5.1.10 ALONGAMENTO

No ponto de tempo de 2-3 semanas, as culturas foram rotineiramente transferidas para o meio de alongamento consistindo de meio de planta lenhoso McCown (WPM) mais 1 mg/1 de zeatina ribosida, 0,5 mg/1 de ácido giberílico (GA3) , 0,1 mg/1 de ácido indol acético, BAP 2,5 μΜ, 500 mg/1 de ticarcilina, 100 mg/1 de cefotaxima, glifosato 0, 075 mM ou 225 mg/1 de canamicina. Micronutrientes Integrais 4X mais 2 g/1 de prolona foram adicionados nesse ponto de tempo. Os pecíolos não foram cortados e os explantes não foram podados no ponto de tempo de 2-3 semanas. No ponto de tempo de 6 semanas, os pecíolos e os cotiledôneos foram removidos, bem como qualquer material morto/seco. As culturas foram transferidas para WPM mais micros integrais 4X mais 2 g/1 de prolina mais 1 mg/1 de zeatina ribosida, 0,5 mg/1 de ácido giberílico (GA3), 0,1 mg/1 de ácido indol acético, 500 mg/1 de ticarcilina, 100 mg/1 de cefotaxima, glifosato 0,05 mM ou 225 mg/1 de canamicina. Os transgênicos foram identificados após as primeiras 6-12 semanas de cultura para Asgrow; levou aproximadamente 12-16 semanas para identificar um transgênico da Linha Hartz H4994; o período de tempo para a identificação transgênica putativa pode variar com outros genótipos. Os transgênicos putativos foram mantidos no meio acima por 2-4 semanas, antes de serem transferidos para o meio de enraizamento. Isso serviu como um anteparo dos brotos putativos. O meio de enraizamento era MSB5 mais 500 mg/1 de ticarcilina, 100 mg/1 de cefotaxima. As plantas também foram enraizadas em MSB5 de meia-concentração (Tabela 6).

5.1.11 LINHAS DE SOJAS EXPERIMENTAIS

Quatro linhas de sojas, que tinham sido transformadas com pMON21140 (FMV/CVP4/CP4/E93'//ArabSSU/CTPl/crylAc/7S3') (Figura 12), e duas linhas de sojas, que tinham sido transformadas com pMON21142 (NOS/NPTII-128//ArabSSU/CTPl/crylAc/7S3' ) (Figura 13), foram usadas como linhas experimentais para os ensaios no campo. Os controles negativos usados foram uma isolina das linhas transformadas, bem como uma linha Asgrow. As plantas RI das seis linhas transformadas foram previamente mostradas em ensaios biológicos em laboratório como sendo protegidas tanto de A. gemmatalis quanto de P. includens (MacRae e Kolacz, 1997) e foram usadas sementes R2 em segregação dessas plantas nos ensaios no campo.

5.1.12 DESCRIÇÃO DOS SÍTIOS NO CAMPO

Os ensaios no campo foram conduzidos em duas estações DeKalb na Argentina: Bragado e Salto (Província de Buenos Aires). Em cada sítio, um abrigo de tela foi construído e dividido em duas seções iguais com um divisor de tela. Uma abertura selada com Velcro em cada extremidade proporcionava acesso a cada lado do abrigo. Havia quatro lotes replicados dentro de cada seção do abrigo de tela, mais quatro lotes replicados foram do abrigo de tela. Cada lote consistia de uma fileira de cada uma das seis linhas experimentais mais os dois controles negativos. Todos os lotes replicados foram distribuídos aleatoriamente. Cada fileira foi plantada com 20 sementes originárias de uma planta de uma linha particular. As infestações controladas foram obtidas por introdução de A. gemmatalis crescida em laboratório em um lado do abrigo de tela e E. aporema crescida em laboratório no outro lado. As infestações descontroladas foram obtidas por exposição dos lotes fora do abrigo de tela às populações de insetos naturais.

5.1.13 OBSERVAÇÕES NOS ENSAIOS NO CAMPO

5.1.13.1 BRAGADO A infestação controlada de E. aporema foi muito forte, com os controles apresentando um dando estimado em 90%. A maior parte das plantas transformadas não apresentou, virtualmente, qualquer dano, mas umas poucas plantas danificadas foram observadas dentro das linhas transformadas e representam, provavelmente, agentes de expressão negativos resultantes da segregação. A população controlada de A. gemmatalis não produziu uma infestação - foram observadas traças adultas no abrigo de tela, mas nenhuma desfolhação detectável foi observada nos controles ou no IPS. Isso indica que as condições dentro do abrigo de tela não eram adequadas para infestação. Nas infestações descontroladas, a E. aporema produziu um dano estimado em 90% nos controles. As plantas transformadas não mostraram de novo, virtualmente, qualquer dano desse inseto. Os insetos de desfolhação provocaram cerca de 25% de desfolhação nos controles e de 0-10% nas plantas transformadas. Não pôde ser determinado com certeza que inseto ou insetos provocaram a desfolhação observada, embora, grandes larvas de S. virginica (Fabricius) fossem comuns nos lotes. Essa espécie é uma peste de menor incidência, ocasional de soja e não é suscetível à proteína CrylAc, como A. gemmatalis.

5.1.13.2 SALTO A infestação controlada de E. aporema não foi tão forte quanto a observada em Bragado e o dano por esse inseto foi estimado em 30% nos controles. As plantas transformadas não foram, virtualmente, danificadas. A infestação controlada de A. gemmatalis foi de novo mal-sucedida, com nenhuma desfolhação detectável observada nos controles ou nas plantas transformadas. Nas infestações descontroladas, o dano por E. aporema foi estimado em 50% nos controles, enquanto que as plantas transformadas não apresentaram, virtualmente, qualquer dano desse inseto. Os insetos de desfolhação provocaram uma desfolhação estimada em 25% nos controles e de 0-5% nos agentes de transformação. Como foi observado em Bragado, grandes larvas de S. virginica eram comuns nos lotes.

5.2 EXEMPLO 2 — AVALIAÇÃO DE IDIOPLASMA DE SOJA TRANSGÊNICA PARA O CONTROLE DE TORTRICIDAE

Para avaliar a eficiência do controle de insetos por soja transformada com gene CrylAc, o comportamento dos materiais de soja transgênica contra o ataque de E. aporema foi analisado em três condições: laboratório, abrigos de tela no campo com infestação artificial e no campo com populações naturais de peste dos Lepidópteros. Foi desenvolvida uma metodologia para avaliação, nas condições laboratoriais e nos abrigos de tela no campo, desses materiais contra o ataque de E. aporema e A. gemmatalis.

Os estudos foram conduzidos em 2 localidades: Salto e Bragado (Buenos Aires). Com os materiais semeados em cada sitio, foram feitas quatro avaliações: a) Ensaio 1: Determinação da mortalidade de E. aporema e do percentual de plantas tolerantes a essa peste sob condições laboratoriais; b) Ensaio 2: Resposta dos materiais transgênicos à infestação artificial com E. aporema adulta em gaiolas no campo; c) Ensaio 3: Avaliar a resistência do idioplasma de B. thuringiensis com populações naturais de E. aporema e d) Ensaio 4: Confirmação em condições laboratoriais da expressão do gene de B. thuringiensis nas estruturas reprodutivas (vagens R4).

No Ensaio 1, foram usados abrigos de tela (14 x 6 x 2) cobertos com uma malha plástica, nos quais foram semeados 6 idioplasmas de B. thuringiensis: 707, 721, 723, 725 e 727 e um controle comercial, Asgrow 3205. Uma isolina sem B. thuringiensis (negativa ao teste ELISA) também foi colocada em cada bloco. Foi aplicado um modelo nos blocos completamente aleatórios com 4 repetições e 25 plantas por linha foram identificadas. A eficiência nas larvas de primeiro estágio e de terceiro estágio ou E. aporema foi avaliada no laboratório, em 2 estados fenológicos: V3 e R4. As folhas de mesma idade foram recolhidas das plantas marcadas. O material coletado foi colocado em tubos de poliestireno e inoculado com as larvas de uma progênie de laboratório. A cada 4 8 h, os tubos foram inspecionados para determinar consumo e sobrevivência.

No Ensaio 2, os mesmos abrigos de tela, idioplasma e modelo foram usados como no ensaio anterior. No estado fenológico V3, pares de E. aporemas adultos foram liberados em cada caso. Os materiais foram inspecionados periodicamente para reduzir o grau de infestação, idade e posição das larvas. A avaliação com a população natural (Ensaio 3) foi feita com os mesmos materiais proporcionados como no Ensaio 2, exceto que não foi feita em abrigos de tela. Os materiais foram inspecionados periodicamente para registrar o grau de infestação de E. aporema e a posição das larvas.

No Ensaio 1, a taxa de mortalidade média para as larvas de primeiro estágio foi de: 93, 84, 94, 85, 86, 94, 3 e 6% para os materiais 707, 721, 723, 725, 726, 727, Asgrow 3205 e a isolina sem B. thuringiensis, respectivamente. As larvas de terceiro estágio apresentaram, por sua vez, uma taxa de mortalidade de 91, 88, 89, 86, 89, 95, 9 e 7 para os mesmos materiais, respectivamente.

No estudo conduzido em abrigos de tela no campo em Bragado, durante o estágio reprodutivo (R4), Asgrow 3205 e as isolinas sem B. thuringiensis registraram 99 e 92% de plantas infectadas, com uma perda quase que completa de produção. As linhas 707, 721, 723, 725, 726 e 727 registraram níveis de infestação de 13, 14, 22, 11, 34 e 7%, respectivamente, com uma incidência mínima no campo.

No Ensaio 3, um forte ataque de E. aporema foi naturalmente registrado, produzindo uma infestação de 100% em Asgrow 3205 e nas isolinas sem B. thuringiensis, com uma perda total de produção. Nas linhas 707, 721, 723, 725, 726 e 727 a infestação foi de 24, 11, 28, 19, 19 e 14%, com uma diminuta incidência no campo.

Foi confirmado que as plantas, que demonstraram a expressão do gene de B. thuringiensis no estado vegetativo, registraram taxas de mortalidade acima de 95% nas vagens, mostrando a presença da toxina nas estruturas reprodutivas.

5.2.1. MATERIAIS E PROCESSOS

Os materiais transgênicos para o estudo foram proporcionados pela Monsanto S. A. Co. e foram usadas as seguintes linhas: 707, 721, 723, 725, 726, 727, um controle comercial Asgrow 3205 e as isolinas: 707, 721 e 723 negativas a B. thuringiensis (no teste ELISA.) .

Os estudos foram conduzidos em 2 localidades, Salto e Bragado (Buenos Aires) . Em cada uma das localidades mencionadas, esses materiais foram semeados em 25 de janeiro de 1997 e 28 de janeiro de 1997, respectivamente, em 3 ensaios. Dois deles foram conduzidos em abrigos de tela e o terceiro foi deixado exposto à infestação natural.

Os abrigos de tela de 12 x 6,5 x 2 m consistiam de uma armação de ferro e foram cobertos por malha plástica de 2 x 2 m. Dentro de cada gaiola, as linhas foram semeadas em lotes de sulco de 1,25 m, em blocos de 8 sulcos a 0,70 cm, separados por uma passagem de 1,25 m. 0 terceiro ensaio foi organizado da mesma maneira que aqueles realizados em abrigos de tela, mas sem cobertura.

Nos três estudos, aplicou-se um modelo de bloco estatístico complemente aleatório com 4 repetições.

5.2.3 ENSAIOS

Os estudos foram conduzidos com os mesmos materiais nos quatro ensaios: a) Ensaio 1: Condições laboratoriais. b) Ensaio 2: Abrigos de tela no campo com infestação artificial. c) Ensaio 3: No campo com uma população natural. d) Ensaio 4: Confirmação da expressão do gene B. thuringiensis nas estruturas reprodutivas.

5.2.3.1 ENSAIO 1: ESTUDO EM CONDIÇÕES LABORATORIAIS

Quando os materiais atingiram o estado fenológico V3, as folhas de 25 plantas, previamente marcadas com um marcador sobre a base do caule, foram recolhidas de uma das gaiolas em cada localidade. Foram cortados com tesouras e tomou-se cuidado para cortar as folhas de mesma idade, condicioná-las com algodão umedecido no peciolo e posteriormente foram enroladas juntamente com toalhas de papel umedecidas e colocadas em receptáculos de 1 1 com água neles (100 cm3), para evitar secagem durante transporte. 0 material assim condicionado foi colocado em caixas com gelo dentro, o que permitiu que as folhas fossem transportadas em condições laboratoriais adequadas. Uma vez que o material era recebido no laboratório, cada folha trifolheada foi dividida na folha terminal sobre um lado e nas laterais sobre o outro.

As folhas laterais foram enroladas na forma de um cartucho e mantidas com um selo plástico, com a finalidade de estimular um ambiente com estruturas adjacentes superpostas, como em um broto ou uma inflorescência de soja, cujas estruturas são, de preferência, por E. aporema. As folhas assim enroladas foram umedecidas na base (união com o pecíolo) com uma peça de algodão umedecido e colocadas dentro de garrafas de poliestireno cilíndricas de 60 cm3. Cada garrafa foi posteriormente inoculada por meio de uma escova com 3 larvas de terceiro estágio de E. aporema de uma progênie artificial e coberta com filme plástico, o que permite troca de gás com o ambiente. No terceiro dia, as garrafas foram tampadas com tampas plásticas para evitar vazamentos.

Cada folha central da mesma maneira que as folhas laterais, colocada em garrafas menores (30 cmJ) e inoculada com 5 larvas de primeiro estágio recém-nascidas. Durante um período de oito dias após a infestação, foram observadas a cada 48-72 h, e o estágio das larvas, o consumo e a sobrevivência foram registrados. A eficiência do controle foi expressa como percentual da mortalidade ± desvio padrão da média. 5.2.3.2 ENSAIO 2: ESTUDO EM ABRIGOS DE TELA NO CAMPO COM INFESTAÇÃO ARTIFICIAL Em Bragado e em Salto, em 25 de fevereiro de 1997 e 10 de março de 1997, respectivamente, E. aporemas adultas (180 fêmeas e 180 machos) foram liberadas em um dos abrigos de tela. Em ambas as localidades, uma semana após a infestação, um segundo grupo de adultos (100 fêmeas e 100 machos) foi liberado. 15 dias (V9-V11) e 25 dias (R3-4) após a primeira liberação, as mesmas 25 plantas que tinham sido marcadas para estudo no laboratório foram inspecionadas, com a finalidade de comparar a expressão do gene B. thuringiensis em ambas as situações (laboratório e infestação artificial). A planta foi inspecionada completamente, registrando: posição das larvas, estágio larval e dano. A eficiência do controle foi expresso como o percentual das plantas infectadas ± erro da média.

5.2.3.3. ENSAIO 3: ESTUDO NO CAMPO COM UMA POPULAÇÃO

NATURAL

Nesse ensaio, as linhas foram deixadas expostas à ação da peste dos Lepidópteros na forma natural. Foram inspecionadas periodicamente, registrando: estado fenológico da plantação, idade das larvas, posição delas e o dano. 5.2.3.4. ENSAIO 4: EXPRESSÃO DO GENE B. THURINGIENSIS NAS ESTRUTURAS REPRODUTIVAS Nos abrigos de tela, em cada lote experimental (linha), 10 plantas foram selecionadas, que no laboratório haviam demonstrado a expressão do gene B. thuringiensis, e as vagens no estado R4 foram cortadas. Com essas vagens colocadas em garrafas de poliestireno cilíndricas (40 cm"3), três larvas do segundo estágio de E. aporema foram inoculadas. Durante um período de 10 dias, foram observadas através das garrafas para registrar o consumo e a mortalidade. 5.2.4 Resultados 5.2.4.1. ENSAIO 1.: ESTUDO EM CONDIÇÕES LABORATORIAIS O estudo foi conduzido com material de ambas as localidades. A taxa de mortalidade média das larvas do estágio 1 nos materiais de B. thuringiensis foi de 88,8 ±2,1 e 89,9 ± 2,6 nas localidades de Bragado e Salto, respectivamente, enquanto que a taxa de mortalidade registrada em Asgrow 3205 e nas isolinas foi de 1,1 e 2,9 em Salto e 5,4 e 8,9 em Bragado, respectivamente (Figura 1). O idioplasma B. thuringiensis também provocou uma alta taxa de mortalidade nas larvas do estágio 3, com os valores médios de 87,8 ±5,4 e 91,9 ± 4,7 registrados em Bragado e Salto, respectivamente. Por sua vez, os materiais Asgrow 3205 e as isolinas suscetíveis atingiram taxas de mortalidade ligeiramente mais altas: 10,6 e 6,4 em Salto e 7,2 e 8,0 em Bragado, respectivamente (Figura 2).

Os percentuais de mortalidade são expressos em relação às larvas totais inoculadas em cada um dos materiais. Outra maneira de visualizar a expressão do gene B. thuringiensis é através do percentual de plantas que permitiam que pelo menos uma larva ou E. aporema sobrevivesse, com os interventores denominados "plantas tolerantes".

Na Figura 3, o percentual das plantas tolerantes às larvas do estágio 1 ou E. aporema, em ambas as localidades, é apresentado em detalhes. A tolerância média com as larvas do estágio 1 para os cultivos de B. thuringiensis foi de 11,7 e 9,5 para as localidades de Bragado e Salto, respectivamente. As linhas 723 e 726 apresentaram valores consideravelmente mais altos de tolerância na localidade de Bragado, enquanto que o idioplasma 725 teve o comportamento oposto. 0 restante dos plasmas do germe B. thuringiensis registraram valores similares em ambas as localidades. A tolerância média dos idioplasmas de B. thuringiensis com as larvas do estágio 3 foi de 18,5 e 13,0 para as localidades de Bragado e Salto, respectivamente. Os materiais 723, 725 e 726 apresentaram comportamento similar àquele manifestado com as larvas do estágio 1 (Figura 4).

5.2.4.2. ENSAIO 2: ESTUDO EM ABRIGOS DE TELA NO CAMPO COM INFESTAÇÃO ARTIFICIAL

Os estudos em abrigos de tela somente puderam ser conduzidos na localidade de Bragado. Em Salto, foram feitas as liberações correspondentes de E. aporema adulta, mas devido à combinação pelo tratamento com clorpirifos nas áreas circundantes, para controlar o corte de formigas, o estabelecimento dos adultos e a infestação posterior das larvas de E. aporema não foram alcançados.

Em Bragado, a infestação média dos materiais de B. thuringiensis foi de 9,7% e 16,9% nos estados vegetativo e reprodutivo, respectivamente, sendo posicionada nos brotos no primeiro caso e nas vagens no segundo. Em ambas as observações, os materiais 726 e 723 apresentaram os níveis mais altos de infestação, cujo comportamento é similar àquele registrado em condições laboratoriais; o valor mais baixo correspondia à linha 727. Asgrow 3205 e as isolinas excederam 80 e 90% em cada estágio, respectivamente; a infestação média expressa como larvas/planta nesses materiais foi de 1,35 e 0,9 larva/planta no estado vegetativo e 0,6 e 0,5 larva/planta no estado reprodutivo, respectivamente (Figura 5).

5.2.4.3. ENSAIO 3: ESTUDO NO CAMPO COM UMA POPULAÇÃO

NATURAL

Em ambas as localidades, a peste na qual tinha ocorrido uma alta incidência de infestação (80— 90% nos controles, no estágio reprodutivo) era E. aporema. A infestação média dos materiais de B. thuringiensis com E. aporema foi determinada no estágio vegetativo VI0 (12 de março de 1997) e no estágio reprodutivo R4 (24 de março de 1997).

Nos dois sítios de observação, em geral, uma maior quantidade de plantas infectadas foi registrada no estágio reprodutivo. Os materiais se comportaram de modo similar nos dois sítios experimentais, idioplasmas 723 e 725 sendo aqueles que apresentaram a maior infestação e o 707 registrou menor infestação em Salto.

Os idioplasmas suscetíveis sofrem uma perda quase que total de rendimento, enquanto que os materiais de B. thuringiensis registraram uma produção de vagens "normal". 5.2.4.4. ENSAIO 4: EXPRESSÃO DE TRANSGENE DE ENDOTOXINA NAS ESTRUTURAS REPRODUTIVAS Em ambas as localidades, observou-se que todas as linhas de B. thuringiensis atingiram taxas de mortalidade acima de 90%, quando foram usadas vagens para alimentar as larvas, enquanto que os materiais de controle atingiram valores de apenas 10,0 e 6,2 para as localidades de Bragado e Salto, respectivamente. Esses resultados mostram, claramente, que a proteína tóxica do gene B. thuringiensis também é transferida para as vagens dos materiais transgênicos (Figura 8). Esse comportamento é de vital importância para o controle das pestes que atacam as vagens e/ou as sementes, por exemplo, A. gemmatalis, E. aporema e Heliothis spp. A Figura 9 representa uma comparação dos percentuais das plantas que permitiram que as larvas sobrevivessem no laboratório, quando foram expostas à população natural de E. aporema, para a localidade de Salto. Os dois materiais suscetíveis registraram valores de mortalidade próximos a 100%, em ambas as condições de avaliação, enquanto que as linhas 707. 723, 725 e 727 apresentaram um maior percentual de plantas com dano com a população natural.

Em Bragado, os três níveis de avaliação foram realizados: laboratório, abrigos de tela no campo e população natural. Na Figura 10, os resultados obtidos nas três situações são comparados. Os resultados mostram que o comportamento dos idioplasmas 7 07, 723, 725 e 727 foi similar àquele obtido em Salto. Para esses materiais, a experiência com infestação artificial em abrigos de tela registraram valores intermediários entre aqueles do laboratório e aqueles da população natural.

Na condução de uma análise comparativa dos estudos realizados, mostra-se que os materiais transgênicos apresentaram excelente proteção contra o ataque de E. aporema em qualquer uma das condições avaliadas. Foram observadas respostas diferentes entre os idioplasmas e, em alguns casos, foram observadas diferenças marcantes entre as repetições de uma única linha. Possivelmente, isso é porque o material ainda está em segregação.

5.2.5 CONCLUSÕES

Os idioplasmas de B. thuringiensis apresentaram um controle eficiente de Epinotia aporema nas três condições avaliadas: laboratório, abrigos de tela no campo e no campo com populações naturais. Também controlou eficientemente a E. aporema no estágio vegetativo nas folhas ou brotos no estágio reprodutivo nas vagens. As linhas B. thuringiensis mostraram uma eficiência diferencial para o controle de E. aporema e o dano observado nos materiais de B. thuringiensis foi infinitesimal com ambas as infestações artificial e natural.

6.0 REFERÊNCIAS

As seguintes referências, na medida em que proporcionam detalhes de procedimento exemplificativos ou outros detalhes suplementares àqueles apresentados na presente descrição, são especificamente incorporados na presente descrição por referência.

Patente U.S. 4.554.101, emitida em 19 de nov. 19 de 1985.

Patente U.S. 4.971.908, emitida em 20 de nov. de 1990.

Patente U.S. 4.683.195, emitida em 28 de jul. de 1987.

Patente U.S. 4.683.202, emitida em 28 de jul. de 1987.

Patente U.S. 4.769.061, emitida em 6 de set. de 1988.

Patente U.S. 4 .757.011, emitida em 12 de jul. de 1988. Patente U.S. 4.940.835, emitida em 23 de fev. de 1990.

Patente U.S. 5.004.863, emitida em 2 de abr. de 1991.

Patente U.S. 5.015.580, emitida em 14 de maio de 1991.

Patente U.S. 5.349.124, emitida em 20 de set. de 1994.

Patente U.S. 5.356.623, emitida em 18 de out. de 1994.

Patente U.S. 5.380.831, emitida em 10 de jan. de 1995.

Patente U.S. 5.416.011, emitida em 16 de maio de 1995.

Patente U.S. 5.569.834, emitida em 29 de out. de 1996. Pub. Ped. de Pat. Eur. No. EP 0400246-A.

Pub. Ped. de Pat. Int. No. WO 93/07278.

Abdullah et al., Biotechnology, 4:1087, 1986.

Adang, Staver, Rocheleu, Leighton, Barker, Thompson, "Characterized full-length and truncated plasmid clones of the crystal protein of Bacilhis thuringiensis subsp. kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sesta," Gene, 36:289-300, 1985.

Benbrook et al., In: Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, MA, pp. 27-54, 1986.

Bishop, Bone, Ellar, "Cloning of novel Bacillus thuringiensis delta-endotoxin," Z46442, submissão direta ao GenBank, não-publicado.

Bosse, Masson, Brousseau, "Nucleotide sequence of a novel crystal protein gene isolated from Bacilhis thuringiensis subspecies kenyae," Nucl. Acids Res., 18 (24) : 7443, 1990.

Brizzard e Whiteley, "Nucleotide sequence of an aciditional crystal protein gene cloned from Bacillus thuringiensis subsp. thitringiensis," Nucleic Acids Res., 16(6):2723-2724, 1988.

Bytebier, Deboeck, DeGrevem, Van Montagu, Hemalsteens, "T-DNA organization in tumor cultures and transgenic plarits of the monocotyledon Asparagus officinalis," Proc. NatL Acad. Sei. USA, 84:5345-5349, 1987.

Callis et al., Genes Dev., 1{10): 1 183- 1200, 1987. Capecchi, "High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells," Cell, 22(2):479-488, 1980.

Cashinore et al., Gen. Eng. of Plants, Plenum Press, Nova York, 29-38, 1983.

Chak e Jen, "Complete nucleotide sequence and identification of a putative promoter region for the expression in Escherichia coli of the crylA(b) gene from Bacillus th uringiensis var. aizawai HDI 133," Proc. Natl. Sei.Counc.Repub. China (b), 17:7-14,1993. Chambers, Jelen, Gilbert, Jany, Johnson, Gawron-Burke, "lsolation and characterization of a novel insecticidal cyrstal protein gene from Bacillus thuringiensis subsp. aizawai," JBacteriol., 173:3966-3976, 1991.

Chau et al- Science, 244:174-181, 1989.

Clapp, "Somatic gene therapy into hematopoietic cells. Current status and future implications," Clin.

Perinatol., 20(1):155-168, 1993.

Conway e Wickens, In.- RNA Processing, p. 40, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Cristou el al., Plant Physiol, 87:671-674, 1988.

Curiel, Agarwal, Wagner, Cotten, "Aclenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery," Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88(19):8850-8854, 1991.

Curiel, Wagner, Cotten, Birnstiel, Agarwal, Li, Loechel, Hu, "High-efficiencv gene transfer mediated by adenovirus coupled to DNA-polylyslne complexes," Hum. Gen. Ther., 3(2):147-154, 1992 Dardeene, Seurinck, Lambert, Peferoen, "Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a crylA(c) gene varlant from Bacillus thiíringiensis," Nucleic Acids Res., 18(18):5546,1990.

Dean et al., Nucl. Acids Res., 14(5):2229, 1986.

Diehn et al., Genet. Engineer., 18:83-99, 1996.

Donovan, L32019, submissão direta ao GenBank, não- publicado, 1994.

Donovan, L32020, submissão direta ao GenBank, não- publicado, 1994.

Eglitis e Anderson, "Retroviral vectors for introduetion of genes into mammalian cells," Biotechniques, 6(7):608-614, 1988.

Eglitis, Kantoff, Kohn, Karson, Moen, Lothrop, Blaese, Anderson, "Retroviral-mediated gene transfer into hemopoietíc cells," Adv. Exp. Med. Biol., 241:19-27, 1988 .

Feitelson, M73248, depósito no GenBank (1991) .

Feitelson, M73249, depósito no GenBank (1991).

Feitelson, M73250, depósito no GenBank (1991) .

Feitelson, M73251, depósito no GenBank (1991) .

Feitelson, M73252, depósito no GenBank (1991). Feitelson, M73253, depósito no GenBank (1991).

Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:4803, 1983 .

Fraley et al., BíolTechnology, 3:629-635, 1985.

Fromm, Taylor, Walbot, "Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation," Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 82(17):5824-5828, 1985. Fujimura et al., Plant Tissue Cult. Lett., 2:74, 1985. Futterer e Hohn, Plant Mol. Biol., 32(1):159-189, 1996. Futterer et al., J Virol., 1(10): 7984-7989, 1997.

Fynan, Webster, Fuller, Haynes, Santoro, Robinson, "DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene gun inoculations,” Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90(24):11478-11482, 1993.

Geiscr, Schweitzer, Grimm, "The hypervariable region in the genes coding for entomopathogenic crystal proteins of Bacillis thuringiensis: Nucleotide sequence of the kurstaki gene of subsp. kurstaki HD I," Gene, 48:109-118, 1986.

Genovese e Milcarek, In.- RNA Processing, p. 621 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Gil e Proudfoot, Nature, 312:473, 1984.

Gleave, Hedges, Broadwell, Wigley, "Cloning and nucleotide sequence of an insecticidal crystal protein gene from Baciflus thuringiensis DS1R732 active against 3 species of leafroller (Lepidoptera, Tortricidae), N.Z.J. Crop Hortic. Sei., 20(1):27-36, 1992.

Gleave, Williams, Hedges, "Screeníng by polymerase chain reaction of Bacilhís thuringiensis serotypes for the presence of cryV-like insecticidal protem genes and characterization of a cryV gene cloned from B. thuringiensis subsp. kurstaki, " AppL Environ. MicrobioL, 29:1683-1687, 1993.

Graham e van der Eb, "Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5," Virology, 54(2):536-539, 1973.

Haider e Ellar, "Nucleotide sequence of a Bacillus thuringiensis aizawai ICI entomocidal crystal protein gene,"Nucleic Acids Res., 16(22):10927, 1988.

Hefford, Brousseau, Prefontaine, Hanna, Condie, Lau, "Sequence of a lepidopteran toxin gene of Baciflus thuringiensis subsp kurstaki NRD-12," J Biotechnol., 6:307-322, 1987.

Herrera, Snyman, Thomson, "Construction of a bioinsecticidal strain of Pseudomonas fluorescens active against the sugarcane borer, Eldana saccharina," Appl. Environ. Microbiol., 60:682-690, 1994.

Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367, 1987.

Hoefte, de Greve, Seurinck, Jansens, Mahillon, Ampe, Vandekerckhove, Vanderbruggen, Van Montagu, Zabeau, Vaeck, "Structural and functional analysis of a cloned delta endotoxin of Bacillus thuringiensis berfiner 1715," Eur. J. Biochem., 161(2):273-280, 1986. Hõfte e Whitely, MicrobioL Rev., 53:242-255, 1989.

Hofte, Soetaert, Jansens, Peferoen, "Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of new Lepdoptera-specific crystal protein gene from Bacillus thliringiensis," Nucl. Acids Res., 18(18):5545, 1990. Honee, van der Salm, Visser, "Nucleotide sequence of crystal protein gene isolated from B. thuringiensis subspecies entomocidus 60.5 coding for a toxin highly active against Spodoptera species," Nucleic Acids Res., 16(13):6240, 1988.

Horsch et al·., Science, 227:1229-1231, 1985.

Iannacone et al., Plant MoL Biol., 34(3):485-496, 1997. Ibarra e Barboza-Corona, "A natural variant of the cry]Eal gene of Bacillus thuringiensis," U94-323, submissão direta ao GenBank, não-publicado.

Ibarra et al. [Crop Protection 11(2): 186-190, 1992.

Laboratory and Field Studies in Chile on the Control of aporema (Lepidoptera: Olethreutidae) and Rachiplusia nu (Lepidoptera: Noctudinae) on Maseolus vulgaris beans with growth regulators, Baccilus thuringiensis, and avermectin].

Johnston e Tang, "Gene gun transféction of animal cells and genefic immunization,” Methods Cell. Biol., 43(A):353-365, 1994.

Jorgensen et al., Mol. Gen. Genet., 207:471, 1987.

Kaiser e Kezdy, Science, 223:249-255, 1984.

Kalman, "Cloning a novel crylC-type gene from a strain of Baciflus thuringiensis galleriae," Appl. Environ. Microbiol., 59:1131-1137, 1993. i Kawata et al., J Comp. Neurol., 270(4):528-536, 1988.

Keller et al., EMBO J., 8:1309-14, 1989.

Klee et al., Bio/Technology, 3:637-642, 1985.

Klein et al., Nature, 327:70, 1987.

Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:8502-8505, 1988.

Kondo, Tamura, Kurtitate, Hattori, Akashi, Ohmori, "Cloning and nucleotide sequenceing of two insecticidal delta-endotoxin genes from Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 DNA,” Agric. Biol. Chem., 51:455-463, 1987.

Koo, Choi, Shin, Park, U35780, gl022727, submissão direta ao GenBank, não-publicado, 1995.

Koo, Park, Choi, Shin, Kim, Yu, "Cloning of a novel crystal protein gene crylK from Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni," FEMS Microbiol. Lett., 134(2-3)):159-164, 1995.

Kostichka, Warren, Mullins, Mullins, Cralg, Kozicl, Estruch, "Cloning of a cryV-type insecticidal protein gene from Bacillus thuringiensis: the cryV-encoded protein is expressed early in stationary phase," J. BacterioL=l., 178(7):2141-2144, 1996.

Kyte e Doolittie, J. Mol. Biol., 157:105-132, 1982- Lambert, Z22510, submissão direta ao GenBank, não- publicado.

Lambert, Z22511, submissão direta ao GenBank, não- publicado.

Lambert, Z22512, submissão direta ao GenBank, não- publicado.

Lambert, Z22513, submissão direta ao GenBank, não- publicado.

Lee e Aronson, M65252, submissão direta ao GenBank, não-publicado, 1991.

Lindstrom et al., Developmental Genetics, 1 1: 160, 1990.

Lorz et al., Mol. Gen. Genet., 199:178, 1985.

Lu, L., Xiao, M., Clapp, D.W., Li, Z.H., e Broxmeyer, H.E., "High efficiency retroviral mediated gene transducion tinto single isolated inunature and replatable CD34(3+) hernatopoietic stem/progenitor cells from human umbilical cord blood," J. Exp. Med. 178(6):2089-2096, 1993.

Maddock et al., Third International Congress of Plant Molecular Biology, Abstract 372, 1991.

Marcotte et al., Nature, 335:454, 1988.

Masson, Marcotte, Prefontaine, Brousseau, "Nucleotide sequence of a gene cloned from Bacilhis thuringiensis subspecies entomocidus coding for an insecticidal protein toxic for Bombyx mori," Nucleic Acids Res., 17(1):446, 1989.

Masson, Mazz a, Gringorten, Baines, Aneliunas, Brousseau, "Specificity dornain localization of Bacillus thuringiensis insecticidal toxíns is highly dependent on the bioassay system," Mol. Microbiol, 14(5):851-860, 1994.

Masson, Lu, Mazza, Brousseau, Adang, "The CrylA(c) receptor purified frorn Manduca sexta displays multiple specificities," J. Biol. Chem., 270(35):20309-20315, 1995.

McBride, K.E. e Summerfelt, K.R., Plant Mol. Biol., 14(2):269-276, 1990.

McDevitt et al., Cell, 37:993-999, 1984.

Murray et al., Nucl. Acids Res., 17(2):477-493, 1989. Nayak, Basu, Das, Basu, Ghosh, Ramakrlshnan, Ghosh, Sen, "Transgenic elite indica rice plants expressing CrylAc delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis are resistant against yellow stem borer (Scirpophaga incertulas)," Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94(6):2111-2116, 1997.

Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75:30, 1987.

Odell et al., Nature, 313:810, 1985.

Oeda, Oshie, Shimizu, Nakamura, Yarnatomo, Nakayarna, Ohkawa, "Nucleotide sequence of the insecticidal protein gene of Bacillus thuringiensis strain aizawai IPL7 and its high-level expression in Escherichia coli," Gene, 53: 113-119, 1987.

Omirulleh et al., Plant Molecular Biology, 21:415-428, 1993.

Omolo, James, Osir, Thomson, "Cloning and expression of a Bacilhis thuringiensis(LI-2) gene encoding a crystal protein active against Glossina morsitans morsitans and Chilo partelllis,” Curr.Microbiol., 34:118-121, 1997. Pandey e Marzluff, In "RNA Processing," p. 133, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1987. Pena et al., Nature, 325:274, 1987.

Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199:183, 1985.

Poulsen et al., Mol. Gen. Genet., 205:193-200, 1986. Poszkowski et al., EMBO J, 3:2719, 1989.

Rogers et al., Methods Enzymol., 153:253-277, 1987. Rogers et al., In: Methods For Plant Molecular Biology, A. Weissbach e H. Weissbach, eds., Academic Press Inc., San Diego, CA 1988.

Rouwendal et al., Plant Mol. Biol, 33(6):989-999, 1997. Sadofsky e Alwine, Molec. Cell. Biol, 4(8):1460-1468, 1984.

Sanchis, Lereclus, Menou, Chaufaux, Guo, Lecadet, "Nucleotide sequence and analysis of the N-terminal coding region of the Spodoptera-active delta-endotoxin gene of Bacilhis thuringiensis aizawai, Mol. Microbiol, 3(2):229-238, 1989.

Sanger M., Daubert S., e Goodman, R.M., Plant Mol.Biol, 14 (3) :433-443, 1990.

Schnepf, Wong, Whiteley, "The arnino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiens is deduced from the DNA base sequence, " J. Biol. Cheiu., 260:6264-6212, 1985.

Selvapandiyan e Bhatnagar, "Isolation, cloning and expression of cryV gene," submissão direta ao GenBank, não-publicado.

Shaw e Kamen, In."RNA Processing", p. 220, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1987. Shevelev, Kogan, Bushueva, Voronina, Rebrikov, Novikova, Chestukhina, Kuvshinov, Pehu, Stepanov, "A novel delta-endotoxin gene crylM from Bacilhis thuringiensis ssp. wuhanensis,” FEBS Lett., 404:148-152, 1997.

Shibano, Yamagata, Nakamura, lizuka, Sugisaki, Takanami, "Nucleotide sequence coding for the insecticidal fragment of the Bacillus thuringiensis crystal protein," Gene, 34:243-251, 1985.

Shin, Park, Choi, Koo, Lee, Kim, "Distribution of cryV-type insecticidal protein genes in Bacilhis thuringiensis and cloning of cryV-Type genes from Bacilhis thuringiensis subsp. kurstaki and Bacilhis thuringiensis subsp. entomocidus," Appl. Environ. Microbiol., 61(6):2402-2407, 1995.

Simizu, Oshie, Nakamura, Takada, Oeda, "Cloning and expression in Escherichia coli of.the 135-kDa insecticidal protein gene from Bacilhis thuringiensis subsp. aizawai IPL7," Agric. Biol.Chem., 52:1565-1573, 1988 .

Simpson, Science, 233:34, 1986.

Soetaert, X95704, direct submission to Geribank, não- publicado.

Spielmann et al., Mol. Gen. Genet., 205:34, 1986.

Stewart et al., "Genetic transformation, recovery, and characterization of fertile soybean transge nic for a synthetic Bacillus thuringiensis CrylAc gene," Plant Physiology, 112:121-129, 1996.

Strizhov, X96682, submissão direta ao GenBank, não- publicado.

Strizhov, X96683, submissão direta ao GenBank, não- publicado.

Strizhov, X96684, submissão direta ao GenBank, não- publicado.

Sun, Tese, Departamento of Microbiologia, Huazhong Agricultural University, Wuhan Hubei, PROC, 1995.

Sutton, Kikuta-Oshima, Strickland, Klypina, Havstad, Kemp, "Insecticidal properties of two proteins derived from a cry3A gene modified in domain II to resemble cry3b2," Plant Genetic Engineering Laboratory, Abstract 1272.

Tallor, Tippett, Gibb, Pells, Plke, Jordan, Ely, "Identification and characterization of a novel Bacillus thuringiensis delta-endotoxin entorriocidal to coleopteran and lepidopteran larvae," Mol. Microbiol., 6(9):1211-1217, 1992 .

Thome, Gardurio, Thorripson, Decker, Zouries, Wild, Walfield, Pollock, "Structural similarity between the lepidoptera- and diptera- specific insecticial endotoxin genes of Bacilhis thuringiensis subsp. 'kurstaki* and 1israelensis'" J. Bacteriol., 166:801-811, 1986, Toriyama et al., Theor Appl. Genet., 73:16, 1986. Uchlmlya et al., MoL Gen. Genet., 204:204, 1986. Udayasuriyan, Nakarnura, Mori, Masaki, Uozumi, "Cloning of a new crylA(a) gene from Bacillus thuringiensis strain FU-2-7 and analysis of chimaeric CrylA(a) proteins for toxicity," Biosci. Biotechnol. Biochem., 58 (5) :830-835, 1994.

Van Tunen et al., EMBO. J, 5:1257-1263, 1988.

Vasil, Biotechnology, 6:397, 1988.

Visser, Musterman, Stoker, Dirkse, "A novel Bacilhis thuringiensis gene encoding a Spodoptera exigua-specific crystal protein,” J. Bacteriol., 172(12):6783-6788, 1990.

Vodkin et al., Cell, 34:1023, 1983.

Vogei et al., J. Cell Biochem., Suppl. 13D:312, 1989.

Von Tersch, Robbins, Jany, Johnson, "Insecticidal toxins from Bacillus thuringiensis subsp. kenyae: Gene cloning and characterization and comparison with B. thuringiensis subsp kurstaki CrylA(c) toxins,” Appl. Environ. Microbiol-, 57:349-358, 1991.

Wabiko, Raymond, Bulla, "Bacillus thuringiensis entomocidal protoxin gene sequence and gene product analysis," DNA, 5:305-314, 1986.

Wagner, Zatloukal, Cotten, Kirlappos, Mechtler, Curiel, Bimstiel, "Coupling of adenovirus to transferrin-polylysíne/DNA complexes greatly enhances receptor-mediated gene delivery and expression of transfected genes," Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89(13):6099-6103, 1992.

Weissbach e Weissbach, Methodsfor Plant Molecular Biology, (eds), Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1988.

Wenzler et al., Plant Mol. Biol., 12:41-50, 1989. Wickens e Stephenson, Science, 226:1045, 1984.

Wickens et al., In: RNA Processing, p. 9, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1987.

Wong e Neumann, 'Electric field mediated gene transferi’ Biochiin. Biophys. Res. Commun., 107(2):584-587, 1982.

Yamada et al., Plant Cell Rep., 4:85, 1986.

Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:4144-48, 1990.

Zhou et al., Methods Enzymol., 101:433-481, 1983.

Todos os processos descritos e reivindicados na presente descrição podem ser feitos e executados sem experimentação indevida, à luz da presente descrição. Ainda que as composições e os processos da invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, vai ser evidente para aqueles versados na técnica que podem ser aplicadas variações nos processos e nas etapas, ou na sequência de etapas do processo exposto na presente descrição, sem que se afaste do conceito, espirito e escopo da invenção. Mais especificamente, vai ser evidente que determinados agentes, que são tanto química quanto fisiologicamente relacionados, podem ser substituídos pelos agentes descritos na presente descrição, enquanto que poderíam ser obtidos os mesmos ou resultados similares. Todos esses substitutos e modificações similares, evidentes para aqueles versados na técnica, são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, como definido pelas reivindicações em anexo.

REIVINDICAÇÕES

Claims (4)

1. Método de controle de infestação de uma planta de soja por um inseto da família Tortricidae, caracterizado pelo fato de que compreende prover na dieta do referido inseto uma célula de planta de soja transformada para expressar um polipeptídeo CrylAc compreendendo a sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO:2.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido Tortricidae é um membro do gênero Epinotia.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido Epinotia é E. aporema.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo CrylAc é codificado por um polinucleotí-deo compreendendo a sequência de ácido nucleico como definida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, ou SEQ ID NO:4.