JPH11507661A

JPH11507661A - αＭＳＨと脂肪酸との複合体、その製造方法およびその薬剤としての使用

Info

Publication number: JPH11507661A
Application number: JP9502708A
Authority: JP
Inventors: デュソール・ダンテラン，ルシアン; ピネル，アン−マリー
Original assignee: Institut Europeen de Biologie Cellulaire
Current assignee: Institut Europeen de Biologie Cellulaire
Priority date: 1995-06-12
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 1999-07-06
Also published as: DE69633391T2; ATE276274T1; WO1996041815A2; DE69633391D1; FR2735131B1; FR2735131A1; EP0837881B1; WO1996041815A3; ES2227597T3; AU6309496A; EP0837881A2

Abstract

(57)【要約】天然形態でもよい４個のαＭＳＨ由来アミノ酸からなる少なくとも１つの配列を含むペプチド配列に、一般式（Ｉ）：ＨＯＯＣ−Ｒ₁−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ₁は任意に特に１もしくは２以上のアミノもしくはヒドロキシル基で置換されていてもよい、炭素数３以上、好ましくは３〜10の直鎖もしくは分岐鎖アルキレン基）で示されるジカルボン酸、または一般式（II）：Ｒ₂−ＣＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ₂はアミノ、ヒドロキシルまたはオキソ基で置換された、炭素数６以上、好ましくは６〜10の直鎖もしくは分岐鎖アルキル基）で示されるシスまたは好ましくはトランス配置のα−モノ不飽和脂肪酸のいずれかから選ばれた酸を、化学的または物理的に結合させた複合体を含有するペプチド複合体。

Description

【発明の詳細な説明】 αＭＳＨと脂肪酸との複合体、その製造方法およびその薬剤としての使用本発明の主題は、αＭＳＨ、即ち、メラノトロピンの同族体であって、化学合成により得られ、リポペプチドの形態で提供されるペプチド誘導体の製造である。 αＭＳＨとその同族体は、多くの論文やさらには臨床試験の対象となっているが、これが医薬製品を生ずることはなかった。その主な理由は、投与量や投与経路に応じてαＭＳＨが極端に偏在するためである。さらに、用量／効果の関係の欠如（これは多くのペプチドホルモンについてそうである）のためにその治療への使用はひどく複雑になる。実際には、αＭＳＨおよびその同族体の細胞受容体はＧ型のものであり、細胞内形質導入はサイクリックＡＭＰ回路に従って起こり、これらの細胞受容体の活性化は膜受容体の構造物が受け取ったペプチドホルモンの量に本質的に反比例する。本発明は、一方で抗アレルギーおよび抗炎症作用の方に、他方ではメラニン産生(melanogenesis)活性化作用の方に特異的に指向し、他の薬理作用、特に中枢神経系ならびに抹消神経系のレベルでの薬理作用をすべて排除するペプチド構造物の研究に基づいている。より具体的には、本発明は、αＭＳＨに由来する天然または非天然形態の４アミノ酸からなる少なくとも１つの配列を含有するペプチド配列に、下記一般式Ｉ：ＨＯＯＣ−Ｒ₁−ＣＯＯＨ（Ｉ）（式中、Ｒ₁は任意に特に１もしくは２以上のアミノもしくはヒドロキシル基で置換されていてもよい、炭素数３以上、好ましくは炭素数３〜10の直鎖もしくは分岐鎖アルキレン基を意味する）で示されるジカルボン酸、ならびに下記一般式 II：Ｒ₂−ＣＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ（II）（式中、Ｒ₂は任意にアミノ、ヒドロキシルまたはオキソ基で置換されていてもよい、炭素数６以上、好ましくは炭素数６〜10の直鎖もしくは分岐鎖アルキル基を意味し、この酸はシスまたはトランス配置であり、好ましくはトランス配置である）で示されるα−モノ不飽和脂肪酸から選ばれた酸、特に既知の代謝活性を持つ酸から誘導された酸を、化学的または物理的に結合させて複合体化したものを含有するペプチド複合体に関する。 αＭＳＨの配列は次の通りである。 N-アセチル-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂ 以下の説明では、αＭＳＨから得られた配列に言及する場合、そのアミノ酸はＤ、ＬもしくはＤ,Ｌ型または誘導体に相当するそのアミノ酸の非天然形態（例えば、置換誘導体、ハロゲン化物）でもよいことは理解されよう。本発明にかかる低分子量の複合体化ペプチドは、有利には、塩、エステルまたはアミドの形態で、上述した細胞性トリカルボン酸回路の活性化に必須の代謝機能を持つ酸に結合されている。一般式ＩまたはIIで示される酸は、好ましくは、Ｒ₁が置換もしくは非置換C₄ 〜C₈アルキレン基を意味するジカルボン酸、特にアジピン酸およびα−アミノアジピン酸および誘導体、セバシン酸および誘導体、Ｒ₂が直鎖もしくは分岐鎖C₇ アルキル基を意味するα−モノ不飽和脂肪酸、特にヒドロキシデセン酸およびデセノイル酸(decenoilic acid)の対応する塩、エステルまたはアミドの形態のものから選ばれる。これらは、好ましくはアジピン酸(＝ヘキサン二酸)(ADIP)、α−アミノアジピン酸(＝２−アミノヘキサン二酸)、セバシン酸（＝デカン二酸）、trans−10− ヒドロキシ−Δ²−デセン酸(＝trans−10−ヒドロキシ−２−デセン酸)(HA)、およびtrans−９−オキソ−２−デセン酸(9-DOA)である。これらの酸のうち、水溶性の相で適用する場合にはアジピン酸およびアミノアジピン酸が好ましい。これらの酸のうち、特に脂溶性ペプチド誘導体の製造により適しているのは次の脂肪酸である：セバシン酸とその誘導体、オキソデセン酸およびtrans−ヒドロキシデセン酸。これらの酸は上記したもであり、それらの生物学的作用はその抗アンドロゲン（＝抗男性ホルモン）、抗脂漏性および脂肪分解性に関連づけられている（マエダら、日本皮膚科誌，98(4)，469頁，1988）。より具体的には、本発明はメラニン産生を活性化し、抗アレルギー性で、かつ抗炎症性のペプチドに関する。本発明にかかる複合体の、αＭＳＨ由来の４アミノ酸の配列は、好ましくは下記ペプチド配列の少なくとも１つを含む。 -Glu-His-Phe- -His-Phe-Arg- -Glu-His-Phe-Arg- ここで、Pheはフェニルアラニンまたはフェニルアラニンのハロゲン化誘導体、特にＤ−homo−Pheおよびパラフルオロ−Pheを意味し、これらのアミノ酸はＤ、ＬもしくはＤ,Ｌ型をとりうる。有利には、本発明にかかる複合体は次の一般式IIIに対応する。Ａ−Ｘ−Glu−His−Phe−Ｙ（III）式中、Ａは、上記一般式ＩまたはIIで示される酸、特にアジピン酸もしくはα−アミノアジピン酸、セバシン酸、trans−９−オキソ−２−デセン酸、またはtrans− 10−ヒドロキシ−２−デセン酸であり、Ｘは、5-Me-ノルロイシン(Me.Nle)、2-N-Me-ノルロイシン(N-Me.Nle)、OHまたはNH₂基を意味し、Ｙは、Arg-ＺまたはＺ基を意味し、ここでＺはTrp-Gly-OH、Trp-OH、OH、Trp- Gly-NH₂、Trp-NH₂、またはNH₂であり、 Pheは、Ｄ−homo−Pheまたはパラ−フルオロ−Phe基を意味し、これらのアミノ酸はD、L、またはD,L型をとりうる。本発明は特に下記のペプチド誘導体に関する。１Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ２Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-NH₂ ３Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-NH₂ ４Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-NH₂ ５Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ６Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-NH₂ ７Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-NH₂ ８Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-NH₂ ９Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ 10 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-NH₂ 11 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-NH₂ 12 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-NH₂ 13 Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-Gly-OH 14 Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-OH 15 Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-OH 16 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-Gly-OH 17 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-OH 18 Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-Gly-OH 19 Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-OH 20 Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-OH 21 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-Gly-OH 22 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-OH （式中、Ａは上記と同じ意味）、ならびにこれらの分子のエステル、アミドまたは塩の形態の誘導体。上記の複合体１〜22において、酸Ａの位置はエステルまたはアミド誘導体の位置に対応し、酸のカルボン酸部分が結合を生ずる。上記のアミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列または非天然のアミノ酸配列でよい。また、場合によっては、これらのアミノ酸の一部は官能基（例、グリコシル化）を含むことも可能である。本発明はまたここに説明した記載によりカバーされるこれらの形態の全てに関するものであることは理解されよう。本発明はまた、本発明にかかる複合体の１種もしくは２種以上を含有する薬剤にも関する。本発明はさらにこれらの化合物を化粧品分野で使用することにも関する。本発明はまた上記化合物を含有する自然物系(galenical)、医薬、皮膚化粧品、または化粧品組成物にも関する。これらの組成物は化粧品分野で既知の剤形のいずれかで提供できるが、局所および腸管外剤形が好ましい。これらの組成物はヒトと獣医学領域（動物）のいずれにも使用できる。本発明の主題の１つは、上記のペプチド複合体の局所または腸管外経路による適用である。この薬剤組成物は経口または腸管外経路、特に注射経路により投与可能な形態でもよいが、好ましくは外用局所経路により投与可能な形態である。これらの組成物は、具体的には例えばクリーム、スプレーまたはローションの形態でよく、既知の賦形剤および場合により他の有効成分を含有していてもよい。有利には、組成物は、紫外線に露出せずに皮膚の日焼けを促進するために使用する溶液、ローション、乳液、またはクリームといった形態の皮膚用化粧品製剤である。本発明にかかる組成物は、アレルギー、特に皮膚アレルギー、炎症性反応およびメラニン産生障害の予防および治療に特に有用である。そのペプチド配列が４位にパラ−フルオロ−Pheアミノ酸を有する複合体（上に列挙したペプチド誘導体５〜８および18〜22）は、メラニン産生に対する作用を除いて、炎症およびアレルギーの媒介物(IL1，IL6，αTNF，PGE₂)に対する抑制効果により、特に抗アレルギー性および抗炎症性の生物学的活性の方に向けられる。４位の配列がＤ−homo-Pheアミノ酸を有する複合体（上に列挙したペプチド誘導体１〜４および９〜17）は、特にメラニン産生過程の刺激の活性の方に向けられるが、抗アレルギー性および抗炎症性作用も有する。本発明にかかるペプチド配列は、当業者に公知のいずれかの方法、特に各種の酸を結合させることができる化学合成の方法により得ることができる。いずれの場合も、その小サイズのペプチドが与えられれば、化学合成は完全に可能であり、非常に純粋な生成物を得ることができる。本発明にかかる複合体の他の特性は、下記の実施例に照らして明らかになろう。実施例は本発明にかかる複合体の化学合成による製造方法も例示している。実施例１：複合体１（Ａ＝アジピン酸）の合成アジポイル-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ 合成は、保護基としてFMOC（フルオレニルメトキシカルボニル）基を使用して MBHA樹脂を用いた固相メリフィールド法により行った。使用したアミノ酸誘導体は下記のものであり、これらを結合剤としてBOPを用いて結合させる。 FMOC-Gly-OH、 FMOC-Trp-OH、 FMOC-Arg(Tos)-OH、 FMOC-D-homo-Phe-OH、 FMOC-His(Trt)-OH、 FMOC-Glu(chex)-OH、および FMOC-Me.Nle-OH。各アミノ酸を過剰に（×２）ならびにBOPも過剰に（×２）使用して、各結合を２回繰り返す。アジピン酸も同様にして結合させ、各段階でピペリジン（ジメチルホルムアミド中20％）によりFMOC基を除去する。最終的な保護基の脱離は次の２段階で行う：ａ）トリフルオロ酢酸（５分間×２回）ｂ）無水フッ化水素酸／ｐ−クレゾール95.5（45分）。収率78％で得られた粗製化合物を水／酢酸95.5％混合液に溶解させた後、凍結乾燥させる。得られた化合物Ｐ１は純度が82％（HPLC）である。この化合物100mgを次いでＣ18カラムを用いてHPLCにより精製して、高純度の生成物65mgを得る。保持時間＝下記条件下で17.04分 −Ｃ８カラム（250mm×５mm）、ＵＶ検出波長210nm −リン酸塩緩衝トリエチルアミン−アセトニトリル10〜60％溶媒で15分間の溶離、流量1.4ml/min。アミノ酸の分析 Glu 1.02 - Gly 1.01 - His 1.00 - Arg 0.94 - D-homo-Phe 1.03-（トリプトファンは酸加水分解中に分解するため定量されなかった）。質量スペクトル（FAB⁺）1018.4／1126.5 実施例２：複合体５（Ａ＝アジピン酸）の合成 FMOC-D-homo-Phe-OHをFMOC-パラ-フルオロ-Phe-OHに変更して実施例１の操作を繰り返すことにより、下記の化合物Ｐ２を得る：アジポイル-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ 融点＝120℃（分解）。(α)_D−７(ｃ＝0.4DMF)。HPLC：Ｃ₁₈カラム、５μｍ、流量７ml/min、検出波長279nm、溶離溶媒0.1％TFA／アセトニトリル77／23v／v 、保持時間30.45分。¹ H NMR（DMSO-d₆）ppm： Me.Nle(4.76，1.62，1.24，0.82)；Glu(8.54，4.32，1.86-1.72，2.24)；His(8. 09，4.53，2.95-2.82)；パラ−フルオロ−Phe(8.09，4.53，3.00-2.78，7.3-7.0 )；Arg(8.36，4.29，1.54-1.68，1.45，3.07)；Trp(8.07，4.53，3.16-3.01，10 .80，7.19，7.56，7.30，6.96)；Gly(8.18，3.67-3.54)。実施例３：複合体１（Ａ＝trans−10−ヒドロキシ−２−デセン酸）の合成アジピン酸をtrans−10−ヒドロキシ−２−デセン酸に変更して実施例１の操作を繰り返すことにより、下記の化合物Ｐ３を得る： trans−10−ヒドロキシ−２−デセノイル-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp- Gly-NH₂ 融点＝115℃（分解）。(α)_D−16(ｃ＝0.3DMF)。HPLC：Ｃ₁₈カラム、５μｍ、流量７ml/min、検出波長279nm、溶離溶媒0.1％TFA／アセトニトリル71／29v／v 、保持時間24.20分。¹ H NMR（DMSO-d₈）ppm： Ac(1.84)；Me.Nle(8.00，4.15，1.59-1.48，1.23，0.83)；Glu(8.00，4.15，1.8 6-1.72，2.19)；His(8.00，4.54，3.00-2.88，8.89，7.26)；D-homo-Phe(7.98， 4.53，2.99-2.78，7.3-7.0)；Arg(8.27，4.29，1.67-1.53，1.46，3.08)；Trp(8 .07，4.54，3.16-3.01，10.80，7.16，7.56，7.30，7.04，6.96)；Gly(8.19，3. 68-3.54)。実施例４：複合体２（Ａ＝α−アミノアジピン酸）の合成アジピン酸をα−アミノアジピン酸に変更して実施例１の操作を繰り返すことにより、下記の化合物Ｐ４を得る： α−アミノアジポイル-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-NH₂ 融点＝130℃（分解）。(α)_D−５(ｃ＝0.5DMF)。HPLC：Ｃ₁₈カラム、５μｍ、流量７ml/min、検出波長279nm、溶離溶媒0.1％TFA／アセトニトリル77／23v／v 、保持時間28.80分。¹ H NMR（DMSO-d₆）ppm： Me.Nle(3.77，1.62，1.24，0.82)；Glu(8.53，4.32，1.82-1.71，2.25)；His(8. 11，4.53，2.98-2.83)；D-homo-Phe(8.06，4.47，2.99-2.77，7.25-7.1)；Arg(8 .32，4.30，1.69-1.55，1.45，3.07)；Trp(8.02，4.59，3.16-3.00，10.78，7.1 5，7.58，7.30，7.04，6.96)。実施例５：複合体３（Ａ＝セバシン酸）の合成 FMOC-Gly-OH試薬とFMOC-Trp-OH試薬を使用せずに、アジピン酸をセバシン酸に変更して実施例１の操作を繰り返すことにより、下記の化合物Ｐ５を得る：セバコイル-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-NH₂ 融点＝130℃（分解）。(α)_D−3.2(ｃ＝0.5DMF)。HPLC：Ｃ₁₈カラム、５μｍ、流量７ml/min、検出波長279nm、溶離溶媒0.1％TFA／アセトニトリル77／23v／ v、保持時間21.86分。¹ H NMR（DMSO-d₆）ppm： Me.Nle(4.70，1.80，2.30，1.95)；Glu(8.57，4.30，1.82-1.71，2.25)；His(8. 21，4.55，2.98-2.83)；Phe(8.09，4.55，2.99-2.77，7.25-7.1)；Arg(8.31，4. 30，1.69-1.55，1.45，3.07)；Trp(7.95，4.61，3.16-3.00，10.78，7.15，7.58 ，7.30，7.04，6.96)；Gly(8.32，3.75)。実施例６：ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)接触過敏症試験によるペプチド複合体の抗アレルギー活性の検討材料および方法５週齢の雌性C57 BL/6JICOマウスを、各バッチ10匹づつ（１ケージに５匹）の 10バッチに分ける。各動物は水と食物に自由に接近でき、24時間のうち12時間は照明による明時間にする。バッチ１〜６の動物には、試験すべき生成物（実施例１および２に従って調製した化合物Ｐ１およびＰ２で示される複合体１および５）をプロピレングリコールに溶解して50μlの一定量を５日間続けて、背部の剃毛した皮膚に局所投与することにより毎日投与する。１匹当たりの１日の投与量化合物Ｐ１−バッチ１、２及び３−それぞれ2.5、0.5及び0.1μｇ／匹／日。化合物Ｐ２−バッチ４、５及び６−それぞれ2.5、0.5及び0.1μｇ／匹／日。バッチ10の動物は対照として使用する（プロピレングリコール50μlだけの局所投与を５日間行う）。５日目の最後の投与から30分後に、DNFB（2,4-ジニトロ-1-フルオロベンゼン( FLUKA CHEMIKA PURUM、純度97％、バッチNo.33820890)）をアセトン(SDS ref．0 5510)とトリオレイン(FLUKA)との４：１混合液中に２％濃度で溶解した溶液25μ lを、剃毛した皮膚の背側領域に局所投与して、全てのマウスをDNFBで感作する。６日目にも、DNFBの投与により新たな感作を行う。 11日目、基準値を得るためにマイクロメーター（ROCH，1/100mmで０〜25mm）によりマウスの両耳の厚みを測定した後、各耳を0.8％DNFBの20μlの局所投与により刺激する。 12日目に、耳の厚みを再び測定する。試験物質を投与されたバッチのマウスならびに対照バッチのマウスについて、耳の厚み増加量の平均値(mean value)を算出する。適当であれば抑制率を次式により算出する。ここで、Ｃは対照バッチの、Ｓは試験物質が投与されたバッチの、それぞれ耳の平均厚みの増加率である。結果を次の表１にまとめて示す。Ｔは試験した各複合体の対照バッチを示す。複合体１および５は、上記の実験条件下でDNFBの投与により誘発された皮膚過敏症反応を、それぞれ69％および71％と顕著に抑制する。実施例７：複合体１および５（化合物Ｐ１およびＰ２）の抗炎症活性の検討研究の目的：アラキドン酸の代謝産物、PGE2の、IL 1により刺激された繊維芽細胞の産生に及ぼす複合体１および５（化合物Ｐ１およびＰ２）の阻害効果を実証する。方法：１ − ヒト由来の胎芽肺繊維芽細胞の培養： Cannon等(J．Immunol.，1986)により既に試験され、実験室内に連続的に維持されているATCC MRC5株を試験に選択した。継代培養後、繊維芽細胞をマイクロウェル（２cm²の24ウェルのプレート、Falcon）中で培養する。接種細胞数はウェル当たり30,000個であり、使用した栄養培地はRPMI 1640（90％）と補体を含有しないウシ胎児血清(FCS，10％)からなる。培地は細胞が融合するまで２日ごとに交換する。２ − 実験の組立てこうして得られた単細胞(monocell)層を洗浄した後、FCS １％だけを含有する新鮮培地中で24時間予備培養する。この培地に試験物質を10^-9 Mないし10^-4 Mの範囲内の各種濃度で添加する。これらの化合物の存在下で20分間培養した後、培地１ml当たり５、2.5または0.5ngの濃度のヒト組換えIL-1（Tebu、フランス）を細胞と18時間接触させる。この培養の終了後、上清を集めて、分析を行うまで− 80℃で凍結する。単細胞層をメタノールで固定する。３ − PEG2の分析 Dray等(Europ．J．Invest.，1975)に記載の方法に従ってRIA検定を行う。試験物質の各濃度および対照について３系列の実験を２回づつ行った。結果はpg／μ g-DNAにより表す。阻害効果は対照に対する％で表す。光学顕微鏡での計数に起因する誤差の可能性を回避するため、DNAはBrunk等(A nalytical Biochem.，1979)に記載の方法に従って蛍光測定法により検定した。次の表２および表３は、MRC5株での第１系列の試験結果をまとめて示す。この結果は、投与量−効果の関係を持つ複合体１の良好な阻害作用を示している。この作用はIL１の濃度には依存しない。どちらの場合も10^-7 Mから後は作用が認められなかった。複合体１および５はIL１およびPGE2の作用に対して阻害力を有する。この非常に顕著な作用は受容体の阻止（ブロッキング）に関連づけることができる。実施例８：皮膚用クリームの形態で局所投与後のマウスメラニン産生に対する複合体１および５の作用の検討（WARREN^* 法）材料および方法１）材料 −皮膚用賦形剤No.66 ラノ−石油ゼリー−Ａｃ、流動パラフィン、エトキシル蜜ロウ精製ラノリン PEG-200 −皮膚用処方複合体１および５（化合物Ｐ１およびＰ２で示される）を皮膚用賦形剤No.66 に10×10^-5 Mの量で配合する。 −動物 DBA/2マウスIFFA − CREDO５週齢２）方法（Raphael WARREN PhD等，0022-202，1987，Society of Investigate D ermatology）・各動物について脱毛後に背側剃毛領域を定める。・試験物質を、各調合物50μlを１日に２回の割合ですりこむことにより５日間投与する。・最後の投与の２日後に、動物を致死させ、処置した皮膚の約50mgの断片を集める。・各サンプルを凍結乾燥により乾燥させ、秤量する。・皮膚断片に次いで45℃で72時間のプロテアーゼＫによる酵素加水分解を受けさせる（プロテアーゼＫ，Merck - 24.568）。・得られた加水分解物に35％のH₂O₂ 20μlとNa₂CO₃ 500μlを加える。・80℃で30分間の培養を行う。・冷却後、各サンプルにクロロホルム／メタノール（体積比で２／１）200μlを添加する。・混合物を10,000ｇで遠心分離する。・水相(200μl)を"NUNC"マイクロプレートのウエルに分配する。 −メラニンの検定・メラニンの検定は、Sigma M．8631メラニンからなる較正系列と対比させて、M ultiskan Titertek MCC 340を用いて405nmで行う。 −結果結果は、対照とした賦形剤での結果と対比させてメラニンの％で表す。Ｉ−クリーム１：クリーム50μlにつき複合体１を５×10^-5 M II−クリーム５：クリーム50μlにつき複合体５を５×10^-5 M III−賦形剤66：対照Ｃ 15回の検定結果の平均値を次の表４に示す。刺激率はＱＳ値とＱＣ値の関数として次式により算出する。ここで、ＱＳは試験したサンプルの皮膚１mg当たりのメラニン量の平均値であり、ＱＣは対照の皮膚１mg当たりのメラニン量の平均値である。局所投与された皮膚用クリーム１は、皮膚でのメラニン合成を非常に顕著に誘発する（＋75％）。本発明の主題に従っているこの活性は、D-Homo-Phe基を含有する複合体１の化学構造に関連づけられる。他方、局所投与された皮膚用クリーム５は皮膚でのメラニン産生の刺激に対しては活性を持たない。この活性の欠如は、複合体５中のパラ−フルオロ−Phe基の存在に関連づけられる。これらの結果は、いわゆるクラウドマン(CLOUDMAN)法に従って、ラットのクラウドマン黒色腫（メラノーマ）細胞を用いたメラノサイト（メラニン形成細胞）のin vitro培養によるメラニン発生の検討を行って確認した。得られた全ての結果が、局所経路により活性を示し、構想した用途に応じて、抗アレルギー性および抗炎症性活性とメラニン産生の活性とを分離することができるという複合体を形成するという目的を持つ本発明の主題に従っている。実施例９：DNFB接触過敏症に対する複合体の活性とそのペプチド構造の比較検討材料および方法使用した方法は、DNFBによりマウスに誘発させた接触過敏症として実施例４において上述したものである。 −検討した生成物バッチＩ： trans−10−ヒドロキシ−２−デセノイル-Me.Nle-Glu-His-D-homo- Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂（化合物Ｐ３で示される複合体１）バッチII： Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ バッチＣ：対照＝trans−10−ヒドロキシ−２−デセン酸溶媒：先に実施例６で対照として用いたプロピレングリコール対照の活性の測定は各実験ごとに行う。 −実験および投与量対照：trans−10−ヒドロキシ−２−デセン酸を10ng／匹／日。５日目に、最後の投与から30分後に、DNFB（2,4-ジニトロ-1-フルオロベンゼン(FLUKA CHEMIKA PURUM、純度97％、バッチNo.33820890)）をアセトン(SDS ref .05510)とトリオレイン(FLUKA)との４：１混合液中に２％濃度で溶解した溶液25 μlを、剃毛した皮膚の背側領域に局所投与して、全てのマウスをDNFBで感作する。６日目にも、DNFBの投与により新たな感作を行う。11日目に、基準値を得るためにマイクロメーター(ROCH，1/100mmで０〜25mm)によりマウスの両耳の厚みを測定した後、各耳を0.8％DNFBの20μlの局所投与により刺激する。12日目に、耳の厚みを再び測定する。試験物質を投与されたバッチのマウスならびに対照バッチのマウスについて、耳の厚み増加量の平均値を算出する。適当であれば、抑制率を実施例６と同様の式により算出する。結果を次の表５に示す。 ^* μｇ／匹／日本発明にかかる複合体１（化合物Ｐ３）については、2.5μg/匹/日の投与量で皮膚過敏症の80％の抑制が認められ、0.1、0.5および2.5μg/匹/日の投与量の間で明らかな投与量／効果の関係が認められる。他方、ペプチドだけでは、0.1μg /匹/日の投与量で皮膚過敏症の47％の抑制が認められ、0.5および2.5μg/匹/日の投与量では抑制応答はそれぞれ60％および69％値度である。最後に、プロピレングリコール溶液状のtrans−10−ヒドロキシ−２−デセン酸の投与では皮膚過敏症の抑制効果は認められない。上述した実験条件下で局所投与すると、本発明にかかる複合体１は、マウスの皮膚過敏症の抑制を非常に顕著に誘発する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ // Ｃ０７Ｋ 105:00

Claims

【特許請求の範囲】１．αＭＳＨに由来する天然または非天然形態の４アミノ酸からなる少なくとも１つの配列を含有するペプチド配列に、 −下記一般式Ｉで示されるジカルボン酸ＨＯＯＣ−Ｒ₁−ＣＯＯＨ（Ｉ）（式中、Ｒ₁は任意に特に１もしくは２以上のアミノもしくはヒドロキシル基で置換されていてもよい、炭素数３以上、好ましくは炭素数３〜10の直鎖もしくは分岐鎖アルキレン基を意味する）、ならびに −下記一般式IIで示されるシスまたはトランス、好ましくはトランス配置のα− モノ不飽和脂肪酸Ｒ₂−ＣＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ（II）（式中、Ｒ₂はアミノ、ヒドロキシルまたはオキソ基で置換された、炭素数６以上、好ましくは炭素数６〜10の直鎖もしくは分岐鎖アルキル基を意味する）から選ばれた酸を、化学的または物理的に結合させた複合体を含有することを特徴とする、ペプチド複合体。２．前記アミノ酸配列が、塩、エステルまたはアミドの形態の選ばれた酸に結合されていることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の複合体。３．一般式ＩまたはIIで示される酸が、好ましくは、Ｒ₁が置換もしくは非置換C₄ 〜C₈アルキレン基を意味する一般式Ｉのジカルボン酸、特にアジピン酸および α−アミノアジピン酸および誘導体、セバシン酸および誘導体、Ｒ₂が直鎖もしくは分岐鎖C₇アルキル基を意味する一般式IIのα−モノ不飽和脂肪酸、特にヒドロキシデセン酸およびデセノイル酸の対応する塩、エステルまたはアミドの形態から選ばれることを特徴とする、請求の範囲第１項または第２項記載の複合体。４．一般式ＩまたはIIで示される酸が、好ましくはアジピン酸、α−アミノアジピン酸、セバシン酸、trans−10−ヒドロキシ−Δ²−デセン酸、およびtrans− ９−オキソ−２−デセンから選ばれることを特徴とする、請求の範囲第３項記載の複合体。５．ペプチド配列が下記配列の少なくとも１つを含有することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の複合体。 -Glu-His-Phe- -His-Phe-Arg- -Glu-His-Phe-Arg- ここで、Pheはフェニルアラニンまたはフェニルアラニンのハロゲン化誘導体、特にＤ−homo−Pheおよびパラフルオロ−Pheを意味し、これらのアミノ酸はＤ型、Ｌ型もしくはＤ,Ｌ型をとりうる。６．下記一般式IIIで示される複合体である、請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の複合体。Ａ−Ｘ−Glu−His−Phe−Ｙ（III）式中、Ａは、請求の範囲第１項、第３項または第４項に定義されたように一般式ＩまたはIIで示される酸であり、Ｘは、5-Me-ノルロイシン(Me.Nle)、2-N-Me-ノルロイシン(N-Me.Nle)、OHまたはNH₂基を意味し、Ｙは、Arg-ＺまたはＺ基を意味し、ここでＺはTrp-Gly-OH、Trp-OH、OH、Trp- Gly-NH₂、Trp-NH₂、またはNH₂であり、 Pheは、Ｄ−homo−Pheまたはパラ−フルオロ−Phe基を意味し、各アミノ酸はD、L、またはD,Ｌ型をとりうる。７．下記ペプチド誘導体から選ばれる請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の複合体、１Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ２Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-NH₂ ３Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-NH₂ ４Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-NH₂ ５Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ６Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-NH₂ ７Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-NH₂ ８Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-NH₂ ９Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ 10 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-NH₂ 11 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-NH₂ 12 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-NH₂ 13 Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-Gly-OH 14 Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-OH 15 Ａ-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-OH 16 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-Gly-OH 17 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-D-homo-Phe-Arg-Trp-OH 18 Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-Gly-OH 19 Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-OH 20 Ａ-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-OH 21 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-Gly-OH 22 Ａ-N-Me.Nle-Glu-His-パラ-フルオロ-Phe-Arg-Trp-OH （式中、Ａは請求の範囲第１項、第３項または第４項に定義されたように一般式ＩまたはIIで示される酸である）、ならびにこれらの分子のエステル、アミドまたは塩の形態の誘導体。８．請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載の複合体からなる医薬。９．ヒトおよび動物に使用できる、アレルギー、特に皮膚アレルギー、炎症性反応およびメラニン産生障害の治療に有用な請求の範囲第８項記載の医薬。 10．請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載の複合体を含むことを特徴とする自然物系組成物。 11．紫外線に露出せずに皮膚の日焼けを促進するための溶液、ローション、乳液、またはクリームの形態の皮膚用化粧品製剤であることを特徴とする、請求の範囲第10項記載の自然物系組成物。 12．溶液、ローション、クリームまたはスプレーの形態の自然物系製剤である、請求の範囲第10項または第11項記載の自然物系組成物。