【発明の詳細な説明】
潰瘍性大腸炎関連の抗好中球細胞質抗体物質および関係する方法およびキット
I.謝辞
本発明は、DK46763およびCA12800の許可番号の下、国立衛生研
究所からのサポートでなされた。従って、アメリカ合衆国政府は、本発明に所定
の権利を有する。
II.発明の背景
A.抗体レパートリー
一生の間、人は、無限の数の唯一つずつの異物(抗原)に感染する可能性に曝
される。これらの抗原のうちのどれが最終的に人に感染するかを予想することは
できないので、体が同様に無限の、抗原を認識し、結合し、抗原の破壊を引き起
こす抗体の配列を作る精密かつ簡潔なシステムを有していることは都合がよい。
抗体は、Y形の四量体分子である。重(H)鎖と呼ばれる一対の同一の比較的
長いポリペプチド鎖および軽(L)鎖と呼ばれる一対の同一の比較的短いポリペ
プチド鎖からなる。Y型構造のそれぞれのアームは、1本の軽鎖を含み、重鎖の
一端が単一のジスルフィド結合によって結合している。アームのつなぎ目で、2
つの重鎖が互いに、2つのジスルフィド結合して、Y型構造の幹を形成している
。
この抗体の構造的な描写は、視覚的にわかりやすいが、簡素化しすぎで誤解さ
れ得る。抗体の構造は、構造上の多様性の豊富さに適応している。重鎖および軽
鎖のいずれもが可変(V)および定常ドメインを有している。これらのVドメイ
ンは、抗原の結合に反応性である。
重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれBシート骨格からなり、側鎖の多
様性が加わった異なる長さの抗原結合ループ(相補性決定領域あるいはCDR)
を有する。CDRは、抗体分子の中で最も多様性のある領域である。すなわち、
その6つのすべてが、ある程度、抗体が抗原に結合する部位(抗原結合部位)の
形成に関わっている。ループの構造上の多様性により、ほぼ平坦な表面から深い
穴までの多様な形の結合部位が形成され得る。
従って、広範な抗体の特異性は、可変ドメイン構造の多様性による。この多様
性はまた、Vドメインの一次配列の多様性に由来する。抗体の構造上の多様性を
補強しているのは、組み合わせられる遺伝子の変化である。重鎖および軽鎖のポ
リペプチドはそれぞれ、免疫グロブリン(Ig)遺伝子複合体から選択される遺
伝子セグメント全体によりコードされる。B細胞(抗体を産生する細胞)の成熟
過程で、これらの遺伝子複合体のなかの不連続な遺伝子セグメントが、一連の体
細胞組換え(再配列)が起こり、最終的に抗体分子の重鎖および軽鎖をコードし
得る核酸配列が形成される。
一般的に人では、第一のIg遺伝子再配列は、Ig重鎖遺伝子複合体内で起こ
る。重鎖の可変ドメインは、3つの離れた生殖系列(ジャームライン)DNAセ
グメントから組み立てられるVHDJHエクソンから得られる。1つ以上の変化(
D)遺伝子セグメント(24個以上のD生殖系列遺伝子セグメントから選択され
た)は、単一の接合(JH)遺伝子セグメント(約6個の機能的JH生殖系列遺伝
子セグメントから選択された)で連結する。得られたDJH複合体は、次にVH遺
伝子セグメントと再配列され、抗体の重鎖の可変部をコードするVHDJHエクソ
ンが形成される。約120個の生殖系列VH遺伝子セグメント(そのうちの約8
0個のみが、潜在的に機能性)は、Ig遺伝子再配列に利用され、80%以上の
ヌクレオチドのホモロジーに基づいて、少なくとも6つのファミリーに分けられ
得る。
成功裡にVHDJH再配列を終えた後、同様の再配列が起こり、軽鎖が形成され
る。約70個のカッパー可変セグメント(VK)のうちの1つが、5つのJK遺伝
子セグメントのうちの1つと再配列し、それによって、カッパー軽鎖可変ドメイ
ンをコードし得るエクソンが生じる。この再配列により、機能的遺伝子を生ずる
ことに失敗した場合、約70個のラムダ軽鎖可変遺伝子セグメント(VA)のう
ちの1つが、4つの機能的JA-CA複合体のうちの1つと再配列し、ラムダ軽鎖可
変ドメインをコードし得るエクソンができる。このような遺伝子体操の最終産物
は、抗体分子の2つのポリペプチドをコードする体細胞で生じる遺伝子である。
2つの重鎖CDR(1および2)は、VHセグメントによってコードされる。
重鎖CDR3は、抗体分子の中で最も可変の部分であり、そして、VH遺伝子セ
グメントの3’末端、Dセグメント、およびJHセグメントの5’末端によって
コードされている。ヌクレオチドの添加(VH-DおよびD-JHジャンクションの
N領域の多様性)、Dセグメント中の異なるリーディングフレームの使用、およ
び異なる再配列重鎖および軽鎖によって、基本的な抗体ライブラリーの多様性は
膨大である。免疫反応を経て、体細胞超変異により、抗体の可変ドメインは、さ
らに多様化し、抗原により高い親和性を持つようになる。
B.自己抗体
適合する免疫システムの途方もないレパートリーにより、現存するあるいは未
知のあらゆる形の微生物分子を認識し結合することができる。しかし、そのよう
な中で、自己抗体の発生が避けられない。すなわち、その体の自身の構成体に結
合し、免疫の破壊経路を引き起こす。
自然な免疫寛容機構により、自己抗体の生産の拡大が妨げられる。抗体遺伝子
の再配列の後、自己抗体を提示するバージンB細胞(抗体を生産する細胞)が破
壊されるか、あるいは体寛容機構によって抑制される。このセーフティーネット
にもかかわらず、自己抗体は、まだ生産され、ほとんどの人では、認識しうる病
的な障害は起こらない。正常で健康な個体では、B細胞の10から30%が自己
抗体の産生に従事すると予測される。抗体の産生は、非常に多様な免疫システム
のうちの自身への免疫反応の結果のみならず、自己免疫疾患あるいは感染の後に
も起こり得る。
C.炎症性腸疾患
炎症性腸疾患(IBD)は、2つの胃腸疾患を表わすのに用いられる総称であ
る。すなわち、潰瘍性大腸炎(UC)およびクローン病(CD)である。これら
の疾患は、異なる病理学上の特徴を有するが、いくつかの臨床上および治療上の
類似性の為に、一緒に考慮されることが多い。しかし、このカテゴリーから外さ
れるのは、公知の感染性、毒性あるいは虚血性病因の疾患であり、これらは、急
性IBDに類似し得るが慢性再発および緩解シンドローム引き起こすことはない
。
IBDは、世界中で起こっており、二百万人もの人が罹患していると報告され
る。IBDの経過および予後は、非常に多様である。開始はすべての年齢で報告
されているが、IBDは特に若い成人に多く発病する。IBDの3つの最もよく
見られる症状は、下痢、腹痛、および熱である。下痢は、軽症から重症までにわ
たり得る。そして、しばしば、緊急および頻繁に起こる。UCでは、通常下痢に
出血を伴い、粘液質で化膿性の物質を含み得る。貧血と体重減少もIBDの一般
的な兆候である。IBDの患者のすべてのうちの10から15%が、10年の間
に手術を必要とする。IBD患者では、癌発生のリスクが増加し、特にUCの患
者では増加する。疾患が長引けば、癌発生のリスクも高くなる。UCの患者では
、疾患の10年後まで、内視鏡検査による定期的な癌検診を受ける。不安やうつ
を含む心理的な問題発生の増加の報告は、若い人に起こる衰弱性の疾患に対して
、おそらく驚くにあたらない二次的影響である。
D.IBDの診断方法
炎症性腸疾患は、病理学者および研究者にとって、臨床上および科学上の挑戦
的な課題を提供する。今日まで、IBDのための多くの診断の手段は、極めて主
観的なものである。高価で場所をとる研究室の装置、放射性および内視鏡的検討
検討を組み合わせてIBDの診断をし、疾患の範囲と重さを測定する。いうまで
もなく、UCとCDを区別すること、および過敏性大腸症候群、感染性下痢、直
腸の出血、発熱性大腸炎などの他の腸の炎症の症状を区別することは困難である
。なぜならば、小腸および大腸の粘膜は、異なる障害で同様に反応するからであ
る。したがって、最初の症状は、しばしば病理学者(医者)達により、IBDで
はあまり知られていない慢性でない腸疾患と、混同される。その結果、IBDは
、しばしば誤って処置され、患者が専門医に回されるまで診断されないことがあ
る。その場合でさえ、内視鏡的および放射性的な検査の不正確で主観的な特性に
よって、誤診されるか、IBDが疑われるとしても診断が下されない結果になり
得る。残念なことに、患者は、確定的な診断がされるまで病気の進行により苦し
む。しかし、多くの患者では、IBDの診断でも確定的ではない。これは、UC
とCD
の重複した特徴、特に結腸のCDの重複した特徴による。
E.IBDの原因は、不明である
IBDの病因は知られていないが、多くの研究で、人のIBDへの罹りやすさ
には、遺伝的要因が重要であること、およびこれらの疾患で組織の破壊を仲介す
るのは免疫システムであることが示唆されている。一般的に、正常な腸の自己制
御の炎症反応の調節ができないことが、IBDの特徴であるが、病気のプロセス
が何によって開始されるかは不明である。
免疫システムおよびその調節の一次の異常が、第一の開始要因となるか、あるい
は疾患のプロセスが感染性の物質により開始し、そして損傷が、免疫媒介その他
のプロセスにより残る。急性疾患の中で見られる粘膜の損傷は、例えば、Campyl
obacter jejuniのような多くの知られている感染物質による影響に類似し得る。
しかし、IBDに共通に見られる、伝染性の感染物質は同定されていない。
自己免疫性は、IBDの病因と示唆されている。この仮定の示唆の証拠は、ヒ
トおよび動物由来の両方の消化管の未知の抗原と反応する循環抗体の存在に基づ
く。例えば、ヒトの胎児および成人結腸、胆管、皮膚、管上皮細胞、ネズミ小腸
からの上皮細胞関連成分、ラットおよびヒト結腸上皮糖タンパク質、腸内細菌多
糖類、および無菌ラットの便からの抗原が、IBD患者の血清と反応したことが
報告されている。他の研究によって、IBD患者では腸粘膜中で、局所的なIg
G反応および他の腸炎症が増加していることが示されている。このIgG反応の
機構、関与している特異的な局所的抗原、およびこれらの抗体の役割は不明であ
る。これらの疾患における免疫学的異常の範囲の広さが報告されているが、UC
患者で抗好中球細胞質抗体(”ANCA”あるいはより特定的には、以下に述べ
る”pANCA”)の検出以外で、診断価値があるとして十分信頼できる方法は
ないようである。これらの抗体および対応する抗原の単離および同定は、UCお
よびCDの病因の解明のための強力な手段であり、最終的には、より効果的な処
置治療につながる。
F.抗好中球細胞質抗体
特定の慢性的な炎症性疾患のある患者は、好中球の細胞性成分に対する血清抗
体(ANCA、あるいは抗好中球細胞質抗体)を有していることが見い出されて
いる。ANCAは、アルコール固定した好中球の免疫蛍光顕微鏡法によって得ら
れる染色パターンに基づいて2つの大きなカテゴリーに分けられる。すなわち、
細胞質好中球染色(cANCA)および核周囲ハイライティング(pANCA)
である。残念ながら、これらの染色パターンは、常に正確に反応性の抗原の細胞
内の位置を反映しているわけではない。一般的に、文献では、この核周囲染色パ
ターンは、細胞性顆粒球を細胞の核の周囲に再分配するアルコール固定による要
因によると考えられている。したがって、核周囲染色が、好中球中の核の結合を
検出するように見え得るが、このような抗体は、細胞質由来の抗原に結合してい
るとみなされることが一般的である。いうまでもなく、これらの染色パターンは
、ANCAのタイプ間を確実に区別するベースとして役立つ。
最近の研究で、UC患者の血清中にpANCAが存在することが示された。Sa
xonら、J.Allergy Clin.Immunol.86:202-209(1990)。UC患者に同定さ
れたpANCAは、ウェゲナー肉芽腫症および他の脈管炎に関連するcANCA
と異なり独特である。これは、その免疫細胞化学的染色パターンおよびその抗原
標的の両面においてである。UC関連のANCAによって示される核周囲染色パ
ターンとは対象的に、ウェゲナー肉芽腫症似関連するANCAは、特徴的に、顆
粒の拡散する細胞質免疫蛍光パターンを示す。Duerr ら、Gastroenterology、10
0:1590(1991)。さらに、UC関連のpANCAは、抗原のDNアーゼ感受
性により、非UC患者で起こるpANCAと区別しうる。間接的な免疫蛍光で高
められたpANCAレベルは、UC患者の69%から80%で報告されており、
CDおよび他の腸炎ではまれにしか見られない。血清力価は、臨床の状態とは相
関せず、結腸切除後5年経過後の患者にも高いレベルが維持されている。pAN
CAは、健康な成人および子供にはごくまれにしか見られないが、UC患者の健
康な血縁者には、pANCAが多く見られる。このことから、pANCAは、免
疫遺伝学的に感受性の高いマーカーになり得ることが示唆される。ラクトフェリ
ン、カテプシンG、およびエラスターゼを含む多くの推定されている抗原が、標
的抗原であることが提案されているが、研究者は、これらの反応性は、もし、p
ANCA活性のいくらかがUCに関与しているにせよ、主要でない部分によると
提案している。
G.潰瘍性大腸炎に関連するpANCAの単離
マーカーの抗体は、HIVのようなウイルス感染から狼そう(lupus)のよう
な自己免疫疾患までの多様な疾患の診断に大きな役割を担っている。これらの抗
体は、直接病気を引き起こし得る。このような場合、潜在的な処置の様式のホス
トが示唆される。あるいは、これらの抗体は、組織の損傷を直接引き起こすこと
のない単なるこの疾患のマーカーでありうるか、あるいは多くの微生物感染に見
られるように、感染除去を援助し得る。従って、これらが疾患の状態に責任があ
るか否とに関わらず、特徴的なマーカー抗体およびその抗原が、病気の診断およ
び病気の原因に潜む免疫不調節を理解するのに非常に有用であり得る。
精励な努力にもかかわらず、UCに関連するpANCAの構造を単離し、同定
する試みは、失敗が報告されている。このような同定の困難性は、いくつかの要
因による。ハイブリドーマ産生あるいはEBVトランスフォーメーションによる
通常の方法では、時間がかかり、労力を要する。所望の抗体を産生するB細胞が
過度に突出していない限り、これらの通常の方法では、失敗する。それは、単に
本来の抗体のレパートリーのサイズと多様性が広いためである。これらの従来の
クローニング戦略の適用後、5年間の集中的な研究にもかかわらず、UC関連の
pANCAは、同定されないままである。
最近、組換え遺伝子を含むフィラメントファージの表面の抗体分子のような、
ヘテロダイマーの組換え遺伝子産物を発現するための表面組込み(surface-inte
gration)技術が開示された。この技術では、フィラメントファージのコートタ
ンパク質を組換え遺伝子産物の膜アンカーとして用い、それによって、フィラメ
ントファージ複製の組み立て段階で、遺伝子と遺伝子産物を結合させる。この技
術は、組み合わせの(結合)ライブラリーから抗体のクローニングと発現をする
場合に有用であることが証明されている。Kang ら、Proceedings of the Nation
al Academy of Science.USA,88:4363-4366(1991);Barbas ら、Proceedings o
f the National Academy of Science.USA,88;7978-7982(1991))。この技術を用
いて、B型肝炎表面抗原と免疫反応をするヒト組み合わせ抗体ライブラリーが作
られる。Zebedeeら、Proceedings of the National Academy of Science.USA,
89:3175-3179(1992)。フィラメントファージベースの組み合わせ抗体ライブラリ
ーの多様性は、重鎖および軽鎖遺伝子のシャッフリングによって(Kangら、Proc
eedings of the National Academy of Science.USA,88:11120-11123(1991)、
ライブラリーのクローン化した重鎖のCDR3領域を代えることによって(Barb
asら、Proceedings of the National Academy of Science.USA,89:4457-4461(
1992)、およびエラープローンポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)で
ライブラリーにランダム変異を導入することによって(Gramら、Proceedings of
the National Academy of Science.USA,89:3576-3580(1992)、増加する。さ
らに、Mark ら、Journal of Molecular Biology,222:581-597(1991)に記載され
ているように、シングルチェーンFvフラグメントがファージの表面に提示され
る。
これらのような最近の開発にも関わらず、これらのストラテジーを用いて、U
Cに関連するpANCAを単離するという報告はない。疑いなく、これは、従来
のハイブリドーマ技術を用いて抗体を単離する試みに不都合が生じるのとまさに
同じ要因のいずれかによる。特に、意義ある研究の為に、標的抗原の構造を知る
ことができないことおよび十分な量のpANCAを産生するB細胞の集団を単離
することができないことである。したがって、UCに関連するpANCAの構造
の同定および特徴づけは、気力の萎えるような問題を示す。
IBDの診断が、しばしば疾患が慢性になるまで不明確さを解決できないよう
な、長く、場所をとる高価なプロセスであり、IBDおよび頻繁にその処置が患
者のライフスタイルと機能的な能力に影響するという事実に鑑みて、UC関連の
pANCAを同定しそして誘起する必要性は、特に強い。pANCAの効用は、
IBDの診断および治療上の管理を助ける主要な臨床上の進歩に現われる。そし
て、より特異的な処置様式の設計の為の基礎を提供することに現われる。さらに
、予想される親についてのUCの特異的な検出は、遺伝的なカウンセリングに有
用で有り得る。従って、診断、予防、および治療の目的で、UC関連のpANC
Aの単離、同定、および産生の必要がある。
III.発明の簡単な説明
特定の慢性炎症の患者は、好中球の細胞成分に対する血清抗体(ANCAある
いは抗好中球細胞質抗体)を有していることが知られている。ANCAは、アル
コール固定した好中球の間接免疫蛍光顕微鏡法によって得られる染色パターンに
基づいて2つの大きなカテゴリーに分けられる。すなわち、細胞質好中球染色(
cANCA)および核周囲ハイライティングによる細胞質好中球染色(pANC
A)である。最近の研究で、UC患者の血清中にpANCAが存在していること
が示された。このUC関連pANCAは、抗原のDNアーゼ感受性により、非U
C患者で誘起されるpANCAと区別しうる。本発明によれば、好中球の核エン
ベロープ内に位置する抗原に、UCのpANCAが免疫反応性を有することが見
い出された。従って、好中球の核エンベロープ内に位置する抗原との免疫反応を
検出することによって、UC関連pANCAを試料中で検出する新しい方法が提
供される。
精励な努力にもかかわらず、UCに関連するpANCAの構造を単離し、同定
する試みは、失敗が報告されている。本明細書に記載のように、ファージディス
プレイ技術を用いて、初めて、潰瘍性大腸炎関連pANCA(UCpANCA)
を、組換えによって産生し、特徴づけた。従って、本発明によれば、単離した、
実質的に精製された、および/または組換えにより産生したUCpANCAおよ
びUCpANCA物質(マテリアル)、および組換えによりUCpANCAおよ
びUCpANCA物質を産生する方法が提供される。本発明による好ましい態様
によれば、本発明のUCpANCAおよびUCpANCA物質は、好中球の核エ
ンベロープ内に位置する抗原との免疫反応、アルコール固定した好中球の間接免
疫蛍光顕微鏡法によって得られる特定の染色パターン、およびDNアーゼによる
好中球の前処理により中断する免疫反応によって特徴づけられる。
本発明のUCpANCAおよびUCpANCA物質はまた、それをコードし得
る核酸配列およびアミノ酸配列によって特徴づけられる。例示的な配列の情報を
、本明細書に示す。さらに、UCpANCAVLおよびVHポリペプチド、UCp
ANCAポリペプチドVLセグメントおよびVHセグメント、ならびにこれらの
ポリペプチドをコードする核酸も提供される。これらのポリペプチドの例示的な
相補性決定領域は、本明細書の配列情報中に示してある。
本発明はさらに、免疫グロブリン遺伝子にレパートリーのある、pANCA血
清陽性の潰瘍性大腸炎の、ヘテロダイマーの抗体物質をコードするファージミド
発現ベクターのライブラリーを作る方法、ならびにライブラリー自体を提供する
。本発明はまた、このようなライブラリーを豊富化して、UCpANCA抗原と
の免疫反応性を有するヘテロダイマーの抗体物質をコードするファージミド発現
ベクターのライブラリーを作成する方法を提供する。
本発明のファージミド発現ベクターは、ファージ粒子あるいは細胞でカプセル
化され得る。コードされるライブラリーあるいはコードされるライブラリーの個
々のメンバーを、溶解性あるいはファージアンカー抗体物質として発現する方法
もまた提供される。
本発明は、イムノアッセイにおいて、本発明のUCpANCAおよびUCpA
NCA物質を用いて、サンプル中のUCpANCAを検出する方法を提供する。
UCpANCAおよびUCpANCA物質を用いて、UCpANCA抗原を単離
、特徴づけ、およびクローン化する方法もまた、提供される。従って、UCpA
NCA物質を含むキットが提供される。
潰瘍性大腸炎に関連したpANCA(UCpANCA)が、初めて、ファージ
ディスプレイ技術を用いて組換えで生産および特徴づけされた。従って、本発明
によれば、単離され、実質的に精製され、および/または組換えで作られたUC
pANCAおよびUCpANCA物質が提供される。さらに、UCpANCAVL
およびVHポリペプチド、UCpANCAポリペプチドVLセグメントおよびVH
セグメントをコードするポリペプチドが提供される。さらに、これらのポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明はさらに、免疫グロブリン遺伝子にレパートリーのある、pANCA血
清陽性の潰瘍性大腸炎の、ヘテロダイマーの抗体物質をコードするファージミド
発現ベクターのライブラリーを作る方法、ならびにライブラリー自体を提供する
。本発明はまた、このようなライブラリーを豊富化して、UCpANCA抗原と
の免疫反応性を有するヘテロダイマーの抗体物質をコードするファージミド発現
ベ
クターのライブラリーを作成する方法を提供する。
本発明のファージミド発現ベクターは、ファージ粒子あるいは細胞でカプセル
化され得る。コードされるライブラリーあるいはコードされるライブラリーの個
々のメンバーを、溶解性あるいはファージアンカー抗体物質として発現する方法
もまた提供される。
本発明は、イムノアッセイにおいて、本発明のUCpANCAおよびUCpA
NCA物質を用いて、サンプル中の好中球の核内の免疫反応性の位置決めにより
、UCpANCAを検出する方法を提供する。UCpANCAおよびUCpAN
CA物質を用いて、UCpANCA抗原を単離、特徴づけ、およびクローン化す
る方法もまた、提供される。従って、UCpANCA物質を含むキットも提供さ
れる。
IV.図面の簡単な説明
第1図は、好中球細胞の核に関して、UC+血清およびEL−pANCA血清
の免疫反応性の位置を表わす切断共焦映像の写真の再現である。核および核物質
の境界は、プロピジウムイオダイド(赤)との反応によってマークされ、一方、
抗体抗原反応は、緑でマークされる。切断映像(第1B図および第1D図)の左
がわは、抗血清(緑)およびプロピジウムイオダイド(赤)シグナルの両方が共
に示されている。真中は、抗血清反応によるシグナルのみが示してある。そして
、右側は、プロピジウムイオダイドシグナルのみが示してある。UC+血清を用
いてできたパターン(第1A図および第2B図)は、明らかに核境界内にあり、
プロパジウムイオダイド染色DNAの外側端に共に位置している。EL−pAN
CAの抗原の標的は、明らかに核の周囲である。シグナルが、核境界の外側にあ
り、そして、プロピジウムイオダイド染色DNAと共に位置していないからであ
る。
第2図は、UC+血清と好中球の核抗原との免疫反応性を表わす写真の再現で
ある。UC+血清は、凍結乾燥してパラホルムアルデヒド固定した好中球細胞と
反応した。そして、反応を、電子顕微鏡で調べた。UC+血清で処理した好中球
の核の内側周囲こ位置するヘテロクロマチンDNA上に、イムノゴールドラベリ
ングが観察された(第2A図)。比較として、同じように調製した好中球上の抗
ヒストン(第2C図)および正常ヒト血清(第2B図)の染色パターンもまた示
す。
第3図は、UCpANCAFabクローン5−3および5−4の可変重鎖ドメ
インのアミノ酸配列を、ヒト生殖系列の対応部分DP49と並列して示す。”-
”は、アミノ酸残基の一致を示す。
V.発明の詳細な説明
A.定義
文法上様々な形の、本明細書の用語「単離」、「実質的に純粋」、あるいは「
組換え」は、抗体および抗体物質を含むタンパク質、ポリベプチド、アミノ酸配
列、ポリヌクレオチド、および核酸配列、あるいは分子の修飾語であり、そのよ
うに称されるタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列、ポリヌクレオチド、お
よび核酸配列、あるいは分子が、ヒトの手で作られ、そして天然のインビボの細
胞環境から分離されていることを意昧する。このヒトの介在の結果、発明に係る
、単離され、純粋および/あるいは組換えのタンパク質、ポリベプチド、アミノ
酸配列、ポリヌクレオチド、および核酸配列、あるいは分子は、大量に産生され
うる。そして、このことは、天然のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列、
ポリヌクレオチド、および核酸配列、あるいは分子が大量に産生されない為に、
有用である。
文法上様々な形の用語「抗体」および「抗体分子」は、本明細書では、免疫グ
ロブリン分子群を表わす集含名詞である。これは、ポリクローナル抗体あるいは
より好ましくはオリジンのモノクローナル抗体であり得る。そして、いずれのイ
ソタイプでも有り得、好ましくは、ガンマおよびカッパーイソタイプであり得る
。
文法上様々な形の用語「モノクローナル抗体」あるいは「モノクローナル抗体
物質」は、抗体分子あるいは抗体物質群をいう。これは、抗原上の特定のエピト
ープと免疫反応し得る唯1つの種のイデオトープを含む。モノクローブル抗体は
、典型的には、エピトープに単一の結合親和性を示し、それと免疫反応する。し
かし、モノクローナル抗体は、複数のイデオトープを有する分子であり得る。そ
れぞれのイデオトープが、異なるエピトープに免疫特異的である。例えば、二特
異
性の(バイスペシフィックな)モノクローナル抗体がある。
文法上様々な形の用語「抗体物質」は、本明細書では、免疫グロブリン分子の
免疫学的に活性なフラグメントの群を指す集含名詞である。すなわち、抗体結合
部位を含む分子である。本発明の例示的な抗体物質は、当該分野で免疫グロブリ
ンの一部分として知られているFab,Fab’、およびF(ab’)2を含む
。抗体結合部位は、抗原と特異的に結合(免疫反応)する、重鎖および軽鎖の可
変領域および超可変領域を形成する抗体分子の構造的な部分である。
文法上様々な形の用語「免疫反応」は、例えば抗原のような抗原決定基を含む
分子と抗体分子あるいは抗体物質のような抗体結合部位を含む分子とのあいだの
特異的結合を意昧する。
用語「ANCA」は、抗好中球細胞質抗体を意昧する。
用語「pANCA」は、核周囲ハイライティングの細胞質染色パターンを有す
るANCA、および核周囲染色パターンをいう。
用語「UCpANCA」は、潰瘍性大腸炎関連の抗体をいう。これは、好中球
により発現する核抗原と免疫反応し、アルコール固定好中球11Fアッセイで、
pANCA染色パターンをつくる。
用語「UCpANCA物質」は、単離した、実質的に純粋な、あるいは組換え
で産生した、潰瘍性大腸炎関連の抗体物質を指す。これは、好中球によって発現
する核抗原と免疫反応し、そして、アルコール固定好中球11Fアツセ1イで、
pANCA染色パターンをつくる。
用語「UCpANCAポリペプチド」は、部分的にUCpANCAあるいはU
CpANCA物質を含む、単離した、実質的に純粋な、あるいは組換えで産生し
たポリペプチドをいう。
用語「pANCA血清陽性潰瘍性大腸炎」および命名「UC」は、修飾される
物が、好中球ELISAで陽性を示すか、あるいはより好ましくはアルコール固
定好中球IIFアツセイによりpANCA染色パターンを示すことを表わす修飾
語として用いられる。
記号「VH」は、可変セグメント(VHセグメント)、名様性(ダイバーシティ
ー)(D)セグメント、および接合セグメント(JH)を含む免疫グロブリン
重鎖可変ドメインを指す。
記号「VL」は、可変セグメント(VLセグメント)および接合セグメント(JH
セグメント)を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を指す。
「ダイマー」とは、2つのモノマー分子から形成されるポリマーをいう。ダイ
マーが2つの同一のモノマー分子からなるとき、本明細書ではそれを「ホモダイ
マーの」という。ダイマーが2つの異なるモノマー分子からなる時、明細書では
それを、「ヘテロダイマーの」という。
本明細書では、用語「実質的に同じアミノ酸配列」は、対照のアミノ酸配列に
対して、少なくとも約80%一致するアミノ酸配列をいう。そして、好ましくは
、対照のアミノ酸配列によって決まるポリペプチドに匹敵する特徴的な機能的生
物学的性質を保持する。好ましくは、「実質的に同じアミノ酸配列」を有するポ
リペプチドは、対照のアミノ酸配列に対して、約90%、より好ましくは95%
のアミノ酸の一致を示し、約97%以上のアミノ酸配列の一致が特に好ましい。
B.UC免疫グロブリン遺伝子レパートリーの生産のためのリンパ球の関連手段を
同定すること
免疫グロブリン遺伝子レパートリーは、免疫グロブリン遺伝子の複合体から異
なった遺伝子断片を収集することで、そして、天然源または人工的に発生させる
ものから単離され得る。免疫グロブリン遺伝子レパートリーの天然源は典型的に
は、例えばBリンパ球(B細胞)のような抗体産生細胞の異種集団である。しかし
ながら、免疫グロブリン遺伝子レパートリーに斜線を入れるために、それで免疫
グロブリン遺伝子レパートリーは特別な病気または特別な病気の部分集合に関連
した免疫グロブリン遺伝子断片を表しており、再構成されたB細胞の集団に関連
した病気は最初に発生させられ、単離されるに違いない。もし、例えばその病気
が一つまたはそれより多くの抗源に関連していれば、再構成されたB細胞を集め
る前に抗源を用いて健康な動物に繰り返し免疫性を与えることによって抗源に対
して親和性を持っている抗体を産生する遺伝子材料が豊かになったB細胞の集団
が発生され得る。もし、例えば、病気に関連した抗源が知られていなかったり、
単離されていなかったりした場合、病気になった個体から再構成されたB細胞の
集団は血液から集められ得る。
本発明の前に重要な障害が、今から述べる方法のうちいずれかを用いてpANCA
血清陽性の潰瘍になった大腸炎に関連した免疫グロブリン遺伝子断片の有用な免
疫グロブリン遺伝子レパートリー(「UC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリー
」の様な本明細書中において引用されたもの)の生産をするにあたって存在した
。一つ目に出版された文献によると、免疫化によってB細胞の豊富な集団を発生
させるために使われ得る、同定されたり、単離された抗源がなかった。加えて、
以前の当該分野の血液のリンパ球からUCpANCAを単離または生産することが失敗
したことによって示されたように、UC+の免疫グロブリン遺伝子のレパートリー
を発生させるために有用であるUCpANCAを生産している十分な量のB細胞の中で選
出されたB細胞の集団は知られていなかった。本発明は初めてUCpANCAを生産して
いるB細胞の集団を同定することによって上記の重要な障害を克服している。
UCpANCAのB細胞の起源は全身の免疫系のB細胞または特別な組織に関連したB細
胞であった。結果として抹消血液リンパ球(PBL)と腸間膜リンパ球(MNL)と基
底膜リンパ球(LPL)がpANCA血清陽性のUC患者からとにかくUCpANCAを生産した
リンパ球を決定するために単離された。
1.UC+の抹消の血液のリンパ球
抹消の血液のリンパ球(PBL)は17人のUC患者からFicoll-Hypaque フラクシ
ョンによって直接単離された。これらUC患者の17人全てが中性親和性エライザ(E
LISA)によってpANCAに対して血清陽性で、これらの患者のうちの16人がpANCAの
染色パターンを示した。他の一人は固定化中性親和性間接免疫経口アッセイ(II
Fassay)によってcANCAの染色パターンを示した。
これらのPBLによって自然に生産される免疫グロブリンは単離されたPBLを強く
洗い、そして10%のウシ胎児血清と、本明細書中で参考として援用するMacDermo
tt,R.P.,らのGastroenterology 81 : 844-852(1981)によって示された抗生物質
を添加したRPMI1640で2x106cells/mlの濃度で5%CO2:95%空気の加湿条件下、37
℃で12日間培養することによって発生した。上記の培地の上清がMacDermott,R.P
.,らのGastroenterology 81 : 844-852(1981)によって示された固相放射線免疫
検定法によって、含まれたIgGに対して解析された。
好中球エライザはブロッキングバッファーで1 : 2に希釈した12日目のPBL培地
の上清でANCAを検知するために使用された。そして希釈しなかった上清を使用し
たIIF アッセイはpANCAまたはcANCAの様なANCAの染色パターンの特徴を調べるた
めに使用された。血清テストとの比較が表1に示されている。
二つのPBL(2/17)のサンプルだけが自然にANCAを発見していることが確認され
ただけでなく、二つのうちの一つがpANCA染色パターンを示した。7つのPBLサン
プルがUCpANCA生産が刺激され得るかどうかを決定するために、IL-4(5ng/ml)
と抗CD40抗体(1μg/ml)の存在下で培養されたとき、7つのPBL血清陽性のUC患
者のPBLフラクションには見いだされ得ず、そしてPBL細胞もIgG1生産を増大させ
ることが知られている刺激の組み合わせを使ってもUCpANCAを生産するために刺
激され得なかった。
2.UC+の腸間膜リンパ節リンパ球
腸間膜リンパ節リンパ球(MNL)は、PBLサンプルが含まれる、同じ17人のUC患者
の5人から単離された。これらのUC患者の5人全部が好中球ELISAによるpANCA血清
陽性であった。IIFアッセイによって、そのうちの4人はpANCA染色パターンを示
し、一人はcANCA染色パターンを示した。
好中球ELISAはブロッキングバッファーで1:2に希釈したMNL培地の上清でANCA
を検知するために使用された。および、もしANCA陽性なら、希釈されていない上
清を使用するIIFアッセイは、pANCAまたはcANCAのようなANCA染色パターンを特
徴づけるのに使用された。培養MNL細胞は自発的にANCAを生産しなかった。しか
しながら、予備実験では、この2人のUC患者から培養されたMNLは、IL-4(5ng/ml
)と抗CD40抗体(1μg/ml)とともにインキュベートされることによってpANCA染
色パターンをもつANCA の生産が刺激され得る。この分画中で前に活性化される
のではなく開始される自己免疫B細胞の存在を示唆している。
3.UC+の基底膜リンパ球
憩室炎(diverticulitis)および正常な粘液の患者と同じようなUCおよびCD患
者由来の病気を伴う組織および病気を伴わない組織の結腸の(colonic)外科的
な試料の人の腸粘液由来の基底膜リンパ球は、MacDermott,R.P.,ら,Gastroente
rology,78:47-56(1980)およびMacDermott,R.P.,ら,Gastroenterology 81:844-
52(1981)によって改良されたBull,D.M.およびBookman,M.A.,J.clin,Invest
.59:966-974(1977)によって以前に述べられた様に単離された。全ての文献は
本明細書中で参考として援用されている。要するに、粘液は筋肉から自由に切り
裂かれ、5%の人血清および抗生物質を含むカルシウム-マグネシウムフリーのHa
nk's平均塩で緩衝されたHEPES(洗浄緩衝液)で洗われる。秤量および刻みの後
、2-5mmの粘液片はwash bufferを含む0.75mMのEDTAで37℃45分間撹拌された。こ
の処理は洗浄液中に潜在細胞が放出されなくなるまで繰り返された。粘液片はコ
ラゲナーセ(16U/ml、Worthington Biochemical,Freehold,NJ)によって10%人
血清を補足した洗浄緩衝液中で消化された。5%CO2:95%空気の加湿条件下37℃で
一定に撹拌しながら。LPLは消化した上清からFicoll-Hypaque勾配遠心によって
分けられた。本明細書中で参考として援用する詳細は、Saxon,A.F.,ら,J.All
ergy Clin,Immunol,86:202-210(1990)にある。
単離されたLPLは広く洗われ、免疫グロブリン産物を自然に生じるためにPBLと
して前述のように培養された。これらの培養由来の上清は固相放射線免疫検定法
によってIgG含有物を解析した。MacDermott,R.P.,ら,Gastroenterology 81:844
-852(1981)に述べられている。好中球エライザはブロッキング緩衝液で1:2に希
釈した12日間PBL培養液の上清でANCAを検知するために使用され、希釈していな
い上清を使用したIIFアッセイは、pANCAまたはcANCAのような染色パターンのANC
Aを特徴づけるのに使用された。
以下の表2に記載された結果は、UC患者のLPLから得られる全ての上清の68%
(15/22)はANCAを発現する粘液から得られる71%(12/17)および得られない60
%(3/5)とともにANCA陽性である。
* 非IBDに対するp<0.01およびCDに対するp<0.02
** 非IBDに対するp<0.1:UC患者由来のANCA陽性を伴わないサンプルの%は
非IBD患者の由来のものと著しくは異ならない。
† UC個体群のためにアッセイされたサンプルの数(n)は本研究に関係する患
者の事実上の数(21)よりかなり多い。二つのサンプル(伴うものおよび伴わな
いもの)は患者の一つから得られるので。
UC患者由来の伴わない粘液の小さなサンプルサイズは、ANCA発現の統計学的な意
味を排除した。対照的に、CD(1/8)および非IBD LPL(2/15)より得られた培養
上清の13%のみが ANCAを発現した(UCに対して各々p<0.02およびp<0.01)。UC
患者のANCA陽性LPLの60%(9/15)はpANCA染色パターンを示した。全ての非UC L
PL由来のANCA-発現上清はcANCA染色パターンを示した。
UC患者由来のLPLによる総IgGの自然な生産物の増加は報告されているので、期
待し得た。UC上清中の ANCAの存在はIgG中のこの増加のためであるということを
。
それ故に、総IgGはどのLPL培養上清(UC、CDおよび非IBD患者)でも計測され、
線形回帰分析を使用して好球中エライザによって結合のレベルに対してプロット
された。LPL上清中の総IgGのレベルとANCA結合のレベルの間に相関関係は見られ
なかった。UC患者のLPL中のANCA陽性の発見は、UC+LPL上清中のIgGのレベルが高
められたためだけではない。
最後に、LPLはまた、5人のUC患者から単離された。PBLおよびMNLは前述のよ
うに単離された。ANCA発現の許容直接比較および、同じ個体由来のこれらの3つ
の細胞タイプの間の染色パターン。再び、これらの5人の患者のうちの4人(4/
5)はANCA陽性血清であった。そして、全てしかし一つはpANCA染色パターンを示
した。他はcANCAだった。LPLは本明細書中に述べられたように培養された。およ
び、上清はANCAおよびANCA染色パターンのために好球中エライザおよびIIFアッ
セイによって試された。これらのアッセイの結果および同じ血清、PBL上清およ
びMNL上清で行われたアッセイ由来のデータは表3で報告される。
(+)=エライザ陽性サンプル(正常LPL上清にとってエライザの値が2つの基準の
偏りを足した平均より大きい)
(-)=エライザ陰性サンプル(正常LPL上清にとってエライザの値が2つの基準の
偏りを足した平均より少ない)
P=核周囲の免疫蛍光のパターン
C=細胞質の免疫蛍光のパターン
n/a=エライザ陰性サンプルには当てはまらない
血清陽性UC患者のpANCA由来の4つのLPL上清のうち3つ(75%)がANCAを発現し
血清ANCAに合うパターンと同一のpANCA染色パターンを示した。LPL上清のうち残
りの一つ(1/4)はANCAに陰性であり、対応する血清がpANCA反応を示した。
従って、UCpANCAを分泌するB細胞の集団が存在し、UC+-免疫グロブリン遺伝
子のレパートリーのライブラリーを生産するためにpANCA血清陽性の潰瘍性大腸
炎と診断された患者の粘膜LPL分画から単離することができる。これらANCAを分
泌するB細胞は、病気が粘膜まで含んでいる(71%)および粘膜を含んでいない
(60%)の両方に存在する。IIF分析は、これらANCA(60%)の大多数がpANCAで
あることを示している(表2)。対照的にCDおよび非IBD炎症性/非炎症性LPLのた
った13%が培養12日後にANCAを生産するに過ぎない。これらのうち、どれもpANC
Aパターンを示さなかった(表2)。
本発明に従って、UCおよびpANCAに対する血清陽性で診断された人間の患者の
基底膜リンパ球は、好ましくは基底膜型のの炎症を起こした領域、UC+の人免疫
グロブリン遺伝子レパートリーのライブラリを生じるために使われる。よりすご
いことには、免疫グロブリンの遺伝子レパートリーの遺伝子部位が得られたB細
胞型の集団の遺伝的異種は、免疫学的レパートリーの多様性が本発明の方法に従
ってスクリーニングすることによってより入手可能になるだろうことに注意すべ
きである。このように、異なった個体の基底膜由来のB細胞は、特に免疫学的に
有意に年齢が違うそれら、および異なった家族や異なった人種由来の個々の細胞
はレパートリーの不均一さを上昇させるのに合併できる。UC+の免疫グロブリン
遺伝子レパートリーはIgA、IgD、IgE、IgG、またはIgMアイソタイプのH鎖を持つ
ような免疫グロブリンを生産するLPLに由来し得、最も好ましいのはIgGまたはIg
MアイソタイプのH鎖を持つような免疫グロブリンを生産するようなLPLに由来し
得、またはさらにもっと好ましいのはIgG1アイソタイプのH鎖を持つような免疫
グロブリンを生産するようなLPLに由来し得る。UC+の免疫グロブリン遺伝子レ
パートリーはκ、λアイソタイプのL鎖を持つ免疫グロブリンを生産するようなL
PLに由来し得、好ましいのはκアイソタイプのL鎖を持つような免疫グロブリン
を生産するようなLPLに由来し得る。
C.UCpANCA抗原の局在性
UCpANCAを単離するために打ち勝たねばならない2番目の障害は、これをいか
にしてUC+免疫グロブリン遺伝子レパートリーから生じる抗体材料から分離する
かを決定することであった。UCpANCAによって特異的に認識される抗原の単離と
同定は未だに論文に報告されていない。
血清UCpANCAを検出するための慣習的な測定は細胞遠心、好中球のアルコール
固定を用いたIIFアッセイによる。上に述べたように、アルコール固定の好中球
を用いたANCAによる典型的パターンの生産はcANCAとpANCAである。残念ながらこ
れらの染色パターンは一つ以上の種のANCAによって生じることができる、たとえ
ばエラスターゼ特異的なANCA(EL-pANCA)およびミエロペルオキシダーゼ特異的な
ANCA(MPO-pANCA)。UCpANCAはエステラーゼまたはミエロペルオキシダーゼとの免
疫反応に失敗することによってこれら他のpANCAとは区別されるけれども、非UCp
ANCA材料とUCpANCA材料とを区別するような付加的測定は望まれる。
本明細書中に於いて使用されているこのような測定は「DNase感受性測定法」
として示されている。非UCpANCAのpANCAによる染色パターンではなくUCpANCAのp
ANCA染色パターンは好中球がDNaseによって前処理されるようになって、廃止さ
れまたはcANCAになった。従って、好中球エライザと慣習的なIIFアッセイに加え
て、DNase感受性測定もまたUCpANCAの同定と単離に使われるようになった。
UCpANCAを検出する方法として慣習的なIIFアッセイの欠点に打ち勝つ他の方法
は本明細書中に初めてであるUCpANCA抗原の局在化である。IIFアッセイによって
生じる染色パターンは常に正確に反応性抗原の細胞内局在を反映するものではな
い。例えば、ある細胞質抗体は好中球の細胞核をアルコール固定した後に生じる
「核周囲」の染色パターンは人工産物的な連想をさせることで知られている。UC
特異的pANCA反応性抗原かどうかを決定するために、実際には、核ドメインのい
くつかの様相が在し、または見かけの核周囲の局在性が好中球のアルコール固定
による人工産物なのかどうか、好中球内でUC患者のpANCA血清陽性の血清由来のI
gGによる結合の位置が非アルコール細胞固定の2つの方法を用いて共焦点レーザ
ー顕微鏡と免疫電子顕微鏡によって試験された。共焦点顕微鏡によって試験され
たUC+血清の大多数が核(膜)周囲の内部に局在化する反応を核反応を示した。
免疫電子顕微鏡は結合は核の周囲に向かって凝集するヘテロクロマチンを超えて
優勢に局在化されることを明らかにした。この反応は、しかしながら、これらの
血清が(二本鎖)DNA エライザで反応しなかったことから、DNAの抗体認識のた
めではなかった。
1.アルコール固定化好中球IIFアッセイ
UCによって診断され、好中球ELISAにより中程度から高度のレベルのANCAを発
現していることが予め測定されていた(好中球の結合レベルの範囲が37%-153%)
25人の患者からの血清パネルをさらにIIF検定に供し、それぞれが示す染色パタ
ーンのタイプを決定した。すべて(100%)のANCA含有血清が、pANCA染色パター
ンを示した。この血清はHELIX Diagnostics(West Sacramento,CA)の抗dsDNA
検定キットを用い、製造者の指示に従って、二本鎖DNAを認識する抗体に対して
陰性であることも確かめられた。
同様に、予めミエロパーオキシダーゼとエラスターゼ(North Carolina州 Cha
pel HillにあるNorth Carolina大学のJ.Charles Jennette博士のご厚意による
。)に対する抗体を含むことが調べられていた血清は同じIIF検定に供され、こ
れら後者の抗体に認識される抗原は細胞質顆粒の構成成分であることが知られて
いるが、典型的なpANCA染色パターンを示した。
2.パラホルムアルデヒド固定化好中球IIFアッセイ
好中球が非アルコール性試薬(例えばパラホルムアルデヒド、ホルマリンなど
)で固定化された場合、MPO-pANCA血清あるいはEL-pANCA血清を用いて得られた
核周囲染色パターンは消失し、さらに細胞質染色パターンに変化することが報告
されている。UC+の反応はMPO-およびEL-pANCA血清と同様に予めスライドの上に
おかれたパラホルムアルデヒド/アセトン固定化好中球を用いて測定された。
このスライド調製法は細胞を遠心分離したときに生じる核物質の再分配を防ぐら
しく、細胞の三次元形態を維持した。
この反応は共焦点IIF顕微鏡観察で可視化された。参考に核物質の輪郭を描く
ためにDNA特異的蛍光色素であるヨウ化プロピジウムを用いた。MPO-pANCA血清に
よって処理されたパラホルムアルデヒド固定化好中球に見られる染色パターンは
細胞質顆粒と核周囲の染色が合わさって強調されていたが、EL-pANCA血清は薄い
核周囲染色パターンのみを保持していた。核の周囲の比較的幅の広い染色のバン
ドはUC+血清で処理されたパラホルムアルデヒド固定化好中球に見られたが、正
常な提供者の血清は陰性であった。
3.共焦点顕微鏡観察によるUC+およびEL-pANCA染色パターンの比較
UC+およびEL-pANCA血清両方の「核周囲」染色反応はパラホルムアルデヒド固
定化好中球において保持されたので、切り出された共焦点イメージがこれら2つ
の抗血清によって認識される抗原部位の核の位置は同様であるのか相違があるの
か調べるために用いられた。図1に示したように、核および核物質の境界はヨウ
化プロピジウム(赤色)との反応により示されたが、抗原抗体反応は緑色で示さ
れた。切り出されたイメージの左側の図(図1Bおよび1D)は抗血清(緑色)およ
びヨウ化プロピジウム(赤色)の両方のシグナルを表しており、真ん中の図は抗
血清反応によって得られるシグナルのみを、また右側の図はヨウ化プロピジウム
のシグナルのみを表している。
UC+血清を用いることにより生成したパターン(図1AおよびB)は核の境界内に
はっきりと見られ、ヨウ化プロピジウムで染色されたDNAの外側の縁と共に位置
している。シグナルが核の境界の外側に見られ、ヨウ化プロピジウムで染色され
たDNAと共に位置しないことから、EL-pANCAの抗原目標は明らかに核周囲である
。
4.電子顕微鏡観察でのUCpANCA抗原の局在性
UC+によって認識される抗原の核における局在性およびこの局在性がEL-pANCA
特異的抗原とは異なることを確かめるために、凍結乾燥したパラホルムアルデヒ
ド固定化細胞をUC+血清と反応させ、その反応を電子顕微鏡で調べた。免疫金ラ
ベリングはUC+血清で処理された好中球の核境界の内側に存在するヘテロクロマ
チンDNA上に見られた(図2A)。UCpANCA抗原の核における局在性が細胞を調製す
る際のアーティファクトではないことを確かめるために抗ヒストンおよび健常者
の血清についての染色パターンについても検討した。期待された通り、健常者の
血清で処理された好中球においては有意な反応は認められなく(図2B)、一方抗
ヒストン血清で処理された好中球の核全域にわたって免疫金ラベリングが見られ
た(図2C)。これらの発見は共焦点顕微鏡観察で示されたUCpANCAの核の局在性
を確証するものである。
5.UCpANCA陽性血清のパネルの共焦点顕微鏡による解析
UC+患者の血清がのすべて、またはほんのいくつかが核の抗原と免疫反応する
のかを決定するために、25のUC患者のpANCA陽性血清から血清パネルをとりパラ
ホルムアルデヒドアセトンで固定した好中球を用いて共焦点顕微鏡によって解析
した。表4のように試験したUC血清の88%(22/25)が核反応を起こした。
*核表面に位置する染色で核膜の境界より中は除く
これらのうち、18/25(72%)が核表面の内部に位置していることが分かり、4/2
5(16%)が核のより中心に位置していることが分かった。血清の12%(3/25)
のみが細胞質反応を生じた。これらの結果はUCpANCAの大多数(88%)が、おそ
らくDNAと関連している好中球の核の中に位置する抗原を認識することを示して
いる。この発見はUCpANCA特異的抗原がANCA抗原と比べ独特でありUCpANCA物質と
非UCpANCA物質とを明確に区別する独特で信頼性のある基礎を提供する。
このように本発明に従って、サンプルに於いてUCpANCAを検出するのに新規で
有用性のある方法が提供され、これは(a)好中球、UCpANCAおよび検出可能な二
次試薬の免疫複合体を形成するのに好都合な条件のもとに、サンプルと検出可能
な二次試薬とを固定された好中球と接触させること、ここで二次試薬はUCpANCA
、またはUCpANCAのクラス決定部分と特異的に結合する;(b)免疫複合体から
結合していない二次試薬を分離すること;(c)結合した二次試薬の存在または
非存在を検出することによって、好中球中の細胞核の中における免疫複合体を含
むUCpANCAの存在または非存在を測定することを含む。UCpANCAは、もしUCpANCA
を含む免疫複合体が好中球細胞核の中で検出されたら、またはより好ましくは好
中球細胞核の表面内部に位置するヘテロクロマチンDNAと関連していたら、テス
トサンプルの中に存在すると考えられる。
本発明のアッセイは、本明細書中で完全に参考として援用する1983年3月8日Da
vidらに発行された米国特許第4,376,110号の中に書かれているように、順方向、
逆方向または同時であり得る。順方向アッセイでは個々の試薬は逐次、固定され
た好中球と接触する。もし望まれるなら、結合した試薬と結合しない試薬との分
離は次の試薬の添加の前に成し遂げられる。逆方向アッセイでは全ての試薬は固
定された好中球に接触する前に使用前に混合される。逆方向アッセイの修正され
た方法が1988年10月18日El Shamiらに発行された米国特許第4,778,751号に書か
れていて、本明細書中で完全に参考として援用する。同時アッセイでは全ての試
薬は分離されているが同時的に固定された好中球と接触する。
サンプルはどんな生物学的液体からも得ることができる。たとえば、全血液、
血漿、または他の体液、またはUCpANCAを有する組織から、好ましくは血清、ま
たはLPLの上清などから。
様々なアッセイフォーマットのための、本明細書中において述べた分離段階は
、免疫複合体からの結合しない二次試薬の分離法を含めて、当該分野で知られた
方法で遂行できる。適切なとき、濾過する、または吸引するあとに続く適切な緩
衝液で単純に洗いは十分である。もし好中球が微粒子の支持の上で固定化される
な
ら、微粒子を遠心し、続いて洗浄液を除くことが望ましい。もし好中球が膜やろ
過膜に固定されるときは吸引または溶液が膜やろ過膜の反対側の構成物に溶ける
、または膜やろ過膜を通って洗浄液が引かれることを応用する。
本発明の方法は通常、室温および37℃で実行される。従って本発明の方法を遂
行するのに適した温度は概して約22℃から約38℃である。
本発明の方法に従って、好中球は当該分野で良く知られた方法で本発明の方法
の中で使われた好中球が試薬の中を浸透できると示された方法で固定される。適
切な定着剤は、例えばメタノール、エタノール、ホルマリンなどを含み、および
好ましくは非アルコール定着剤のような、例えばパラホルムアルデヒドおよびア
セトンを含む。もちろん、本明細中での技術はこれら定着剤が実質上、好中球の
核あるいは細胞質の形態学を変えないと正しく認識するであろう。
好中球や本発明の実践の中で使われる二次試薬はサンプルを測定する発端に依
存するだろう。本明細書中において使われるような測定されるサンプルの起源を
示す「患者」、「対象」、あるいは「個人」といった用語はUCpANCAを産生する
可能性のある、例えば人間や、人間以外の霊長類の動物、うさぎ、ラット、マウ
ス、やそのようなものを含むどんな動物も意味する。好ましくは、好中球および
使用される二次試薬は試験されるためにサンプルを得られた種属に特異的に反応
する。例えば、人間の被験者から得られたサンプルの中のUCpANCAを測定すると
、好中球と二次試薬は好ましくは人間に特異的である。もし複数の二次試薬、例
えば二次抗体が使われると、それぞれの抗体は好ましくはその抗原にとって種特
異的である。
本発明での有用な好中球は当該分野の技術をして知られた方法を用いて様々な
源から得ることができる、例えば、人間の血液、人間以外の霊長類、ウサギ、ラ
ット、マウス、そのようなものから。
「二次試薬」として本明細書中で用いられた用語は、あらゆる試薬またはUCpA
NCAと結合できる試薬の組み合わせを示す。例えば、二次試薬は抗UCpANCA抗体ま
たはあらゆるUCpANCAのイデオタイプに特異的な断片であり得るが、好ましくは
好中球の結合に拮抗的なものまたは好中球/UCpANCA結合の立体妨害を引き起こす
ものではない。あるいは、二次試薬はUCpANCAのクラス決定部に特異性を持つ抗
アイソタイプ抗原あるいはAタンパク、あるいはGタンパクであり得る。
本発明を実践する上で有用である二次試薬は、当該分野の良く知られた技術ま
たはいくつかの商業源から得ることができる。もし抗体を使うなら、モノクロー
ナルか蓄積したモノクローナルが好ましい。
そのほか本発明の測定での検出感度を上昇するための別法は、二次試薬として
複数の抗体システムを使うことである。それゆえ、本発明の方法は抗体の組み合
わせを二次試薬として使い、行い得る。ここで少なくとも組み合わせの中で一つ
の二次抗体試薬がUCpANCAにまたはUCpANCAのクラス決定部に特異性を持ち、少な
くとも組み合わせの中で一つの二次抗体が検出できなければならない。
「測定可能な二次試薬」という用語は上に定義された二次試薬を指し、それは
様々な分析法で検出可能か、測定可能な二次試薬である。この用語は直接検出可
能な試薬を含む。シグナルを発生するラベルの付属が無くても、または検出や測
定のためにシグナルを発生させるシステムを持ってラベルされたようなものがな
くても、たとえば放射性同位元素、色素生産性または蛍光物質、化学発光マーカ
ー、金、そのようなものである。上記のどの方法もUCpANCAと二次試薬との反応
性はラベルの存在で重大に変えられることはない。
現在好ましい実施態様では、二次試薬は抗IgG抗体材料であり、蛍光化合物と
連結することによって化学的に検出できることとされている。適した蛍光化合物
は紫外線を放射するか、または光か他のエネルギー源による励起に続いて可視光
を放射する。蛍光化合物は単独で、または適切なクエンチャー分子とともに使用
できる。適切な蛍光物質の共役の方法は既に報告されていて、例えば、Methods
in Enzymology 74巻、パートC、32105、(Van Vunakis and Langone,Editors
1991)に書かれている。あるいは、本発明を試験するのに有用な蛍光物質と連結
した二次抗体は商業源から入手可能である。未だ別の好ましい実施態様では二次
試薬は金でラベルしたAタンパクとGタンパクである。
ラベルの性質によって、シグナルは、例えば複合体化したテストサンプルに光
を放射し、蛍光のパターンを観察するすることによって;電子顕微鏡によって;
または、化学蛍光、または放射性ラベルの場合はγ線計測器などの放射物計測器
またはiodine-125のようなγ線エミッターなどを使うことによって検出し得る。
D.UC+の免疫グロブリン遺伝子のレパートリーの生産
ゲノムDNAの断片(ここから免疫グロブリンの可変領域遺伝子を多様な集団と
してクローニングしうる)の調製方法は当該分野では良く知られている。例えば
Herrmannら、Methods in Enzymology 152:180-183(1987)、Frischauf、Method
s in Enzymology 152:183-190(1987)、Frischauf、Methods in Enzymology 15
2:190-199(1987)、およびDiLellaら、Methods in Enzymology 152:199-212(1
987)を参照。(ここで引用した参考文献の教示は、本明細書中で参考として援
用する。)
免疫グロブリン遺伝子のレパートリーは免疫グロブリン可変ドメインのV,D,J
遺伝子断片を発現する遺伝子を含むゲノム材料か、または可変ドメインの転写に
相当するメッセンジャーRNA(mRNA)から単離した。再配列のないBリンパ球の
他からゲノムDNAを用いることは遺伝子配列がイントロンによって分けられたも
のを、重鎖可変領域のVH、D、JH遺伝子断片をコードする遺伝子配列を並列す
ることや、または軽鎖可変領域のVk/ λおよびJk/ λ遺伝子断片をコードする遺
伝子配列を並列して用いることより難しい。適切なエキソンを含んだ遺伝子配列
は単離されなければならないし、イントロンは摘出されエキソンは適切な順序で
再接合され配置されなければならない。大部分に於いてこれは難しく、それゆえ
、再配列したB細胞に用いられる二者択一的な方法が選ばれる。これはVH、D
、JH、遺伝子断片かVk/ λおよびJk/ λ断片が近接するために転座したためで
あり、それ故遺伝子配列は完全な可変領域にとって(イントロンのない)連続的
になる。
mRNAを利用するときはB細胞はRNaseが阻害されている条件下で溶解され
るだろう。1つの実施態様中では最初の段階は全細胞RNAを単離することである
。ポリA+mRNAはオリゴ-dTセルロースカラムとのハイブリダイゼーションによ
って選別できる。重鎖および/または軽鎖のポリペプチドをコードするmRNAの存
在は適切な遺伝子の一本鎖DNAとのハイブリダイゼーションによって検出できる
。都合の良いことに、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の定常部の遺伝子配列はポリ
ヌクレオチドのプローブとして使うことができ、その配列は入手可能な源から手
に入れることができる。例えば、EarlyおよびとHood、Genetic Engineering、Se
lt
o and Hollaender,eds.,Vol.3,Plenum publishing Corporation,New York(1
981),157-188頁,およびKabatら、Sequence of Immunological Interest,Nation
al Institutes of Health,Bethesda,Maryland(1987)を参照。
現在好ましい実施態様のなかでは、UC+患者のLPL細胞から全RNAが抽出され、R
NA調製物は免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするmRNAについて富化される
。富化は代表的には、全RNA調製物を、または部分的に精製されたmRNA生産物を
、本明細書中に於いて書かれているポリヌクレオチド合成プライマーを用いるプ
ライマー伸長反応に付すことにより達成される。ポリヌクレオチド合成プライマ
ーをつかってVHおよびVL遺伝子のレパートリーを生産するための典型的な方法
はPCT Application No.PCT/US90/02836(国際公開第WO90/14430)に書かれてい
る。遺伝子レパートリーを生産するための特に好ましい方法は、本明細書中に於
いて書かれているPCR反応を行うためのポリメラーゼチェインリアクション(PCR
)の中での、プライマーとして前もって選ばれるオリゴヌクレオチドの使用に依
る。
1.UC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリーを生産するためのプライマーの調製
本発明中ではUC+のVHおよびVL免疫グロブリン遺伝子レパートリーはそれら
の利用の前に別々に調製されていることが好ましい。レパートリーの調製は代表
的にはプライマーの伸長によって果たされ、好ましくは、ポリメラーゼチェイン
リアクション(PCR)でのプライマーの伸長によって果たされる。
プライマーの伸長によってVH遺伝子をコードする相同DNAのレパートリーを生
産するためにはプライマーの遺伝子配列が免疫グロブリンの重鎖遺伝子の複数と
VH遺伝子コード領域に十分に近接した部位でハイブリダイズするように選ぶ、
それは機能的な(接着できる)ポリペプチドをコードした塩基配列を得るためで
ある。複数の異なったVH遺伝子コード塩基配列とハイブリダイズするために、
プライマーは異なる鎖間で保存された塩基配列に十分に相補でなければならない
。定常部での塩基配列を含む好ましい部位はリーダー領域とプロモーター領域で
あるけれども、VHドメインの断片は可変ドメイン基本骨格領域の中の部位、J
領域やよく似たもの、を使うことによって得ることができる。
もしVHコードDNAおよびVLコード相同DNAのレパートリーがPCR増幅によって
生産されるのなら、2つのプライマー、すなわちPCRプライマー対は増幅される
核酸のコード鎖に使われなければならない。PCRでは各プライマーは目的とする
塩基配列を増幅するための二次プライマーとして対になって働く。PCRで使うた
めのPCRプライマー対の選び方は免疫グロブリン遺伝子レパートリーを生産する
ための本明細書中に於いて書かれている考察によって適用される。これは、プラ
イマーはレパートリーの中に保存されている塩基配列に相補的な塩基配列を持つ
。VHコードDNAおよびVLコード相同DNAの増幅に有用なプライマーの配列は SEQ
ID NOs: 5から 16 に示している。
2.UC+のVHおよびVL遺伝子レパートリーの生産のためのポリメラーゼチェイン
リアクション
レパートリーに含まれるVHおよびVL遺伝子のクローニングに用いる手順は当
該分野で良く知られたように、レパートリーをつくる核酸の型、複雑さ、および
精製度に依存する。その他の要素は遺伝子がレパートリーの中の一つまたは多数
の中に含まれているかどうか、およびそれらが増幅されるか、および/または変
異がかかるかどうかである。
VHおよびVL遺伝子レパートリーはmRNAおよび/または染色体DNAのセンス鎖の
ようなポリヌクレオチドをコードする鎖から構成される。もしレパートリーが染
色体DNAの二重鎖のような形をしていたら、通常は始めに、代表的には溶融で変
性させて、一本鎖にする。レパートリーはレパートリーとPCRプライマー、ペア
ーのそれぞれは前もってその塩基配列を選ばれている、との処理によって(接触
によって)PCR反応にかけられる。PCRプライマーペアーはプライマー伸長反応を
レパートリーの中に保存されている、好ましくは少なくとも約10塩基の長さ、も
っと好ましいのは少なくとも20塩基の長さが良い、塩基配列とハイブリダイズす
ることによって開始できる。PCRプライマーの第一プライマーは時々本明細書中
に於いて「センス」プライマーと示している、これはコーディング鎖または塩基
配列のセンス鎖にハイブリダイズするからである。加えて、PCRプライマーペア
ーの第二プライマーは時々本明細書中に於いて「アンチセンス」プライマーと
示している、これは塩基配列の非コード鎖またはアンチセンス鎖、例えばコーデ
ィング鎖と相補な鎖の塩基配列に、にハイブリダイズするからである。
現在好ましい実施態様では、UC+の人間の患者のLPL由来の全RNAはVHおよびVL
をコードしている相同DNAの複数を生成するのに利用される。血清UCpANCAはIgG
1でありκアイソタイプであるから、可変重鎖およびκ鎖ファミリ特異的PCRプラ
イマーは好ましくはγlとκ定常部とそれぞれハイブリダイズするPCRプライマー
と対をなす。好ましくはUC+の免疫グロブリンレパートリー遺伝子のVHおよびVL
をコードする相同DNAを生成するPCRプライマーはSEQ ID NOs.5 から 16に供さ
れる。
PCR反応はPCRプライマー対、その量については前もって決定されているのが好
ましい、とレパートリーの核酸、その量については前もって決定されているのが
好ましい、をPCR反応混合物からなるPCR緩衝液の中で反応させる。混合物はある
時間の間PCR反応生成物を十分に形成できるポリヌクレオチドの合成の概して前
もって決められている状況を維持され、その結果多数の異なったVHをコードす
るおよび/またはVLをコードする相同DNAを生産する。
複数の第一プライマーおよび/または第二プライマーは各々増幅に用いること
ができる、たとえば第一プライマーのある種はいくつかの異なったプライマーと
ペアーを形成することによって幾らかの異なった二次プライマーとペアーをつく
ることができる。または、第一と第二プライマーの個々のペアーを使うことがで
きる。どの場合でも、増幅に用いた一次プライマーと二次プライマーの組み合わ
せが同じかまたはことなっている組み合わせを用いて増幅した増幅生成物は、遺
伝子ライブラリーの多様性の増加に結びつけることができる。
現在好ましい実施態様にはVHコード相同DNAが重鎖可変領域断片ファミリ特異
的プライマー(SEQ ID NOs:6 から 12)とγl定常部特異的プライマーとのペアか
ら成る7つの分離された反応からつくられた。7つの反応のそれぞれからつくられ
た等しい量のホモログはそれからUC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリー(「U
C+のVHライブラリ」)のVHコード相同DNAライブラリをつくるために統合され
た。同様にVLコード相同DNAはκL鎖可変部医ファミリ特異的プライマー(SEQ ID
NOs: 14から16)とκ定常部特異的プライマーの組み合わせから成る3つ
の分離された反応からつくられることが現在好ましい。3つの反応からつくられ
るそれぞれ等しい量のホモログがその時、UC+の免疫グロブリン遺伝子レパート
リーのVLをコードする相同DNAを創造するために結合される(「UC+のVLライブ
ラリ」)。
PCR増幅方法は詳細に述べられている。米国特許第4,683,195および4,683,202
および4,800,159および4,965,188に。および少なくとも2、3のテキストに、例え
ば「PCR Technology : Principles and Applications for DNA Amplification」
H.Erlich,ed.,Stockton Press,New York(1989); および「PCR Protocols : A
Guide to Methods and Applications,」Innis ら.,eds.,Academic Press,Sa
n Diego,California(1990)。
E.UC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリーのVHおよびVLをコードする相同DNA
由来のヘテロ二量体抗体材料をコードするライブラリの製造
1.一般的原理
ファージディスプレイ技術を使う本発明のUCpANCA材料を生むための方法は、
好ましくは初めにUC+の免疫グロブリン遺伝子ライブラリ由来のヘテロ二量体抗
体材料をコードする「UC+のヘテロ二量体ライブラリ」を形成するためにUC+のVH
およびVLライブラリを結合することを含む。UC+のヘテロ二量体ライブラリの構
成要素は次に、例えばE.coliのような試験管内発現宿主で発現させ得る。それで
、試験管内のVHおよびVLポリペプチドの共に発現したものは組み立てられて機能
ヘテロ二量体抗体材料にされる。次に、UC+のヘテロ二量体ライブラリの構成要
素は、UCpANCA抗体に結合するためのヘテロ二量体抗体材料を発現させるそれら
の能力をスクリーニングされる。このスクリーニングプロセスは、それをコード
するVHおよびVLの相同DNAを伴う発現産物(すなわちヘテロ二量体抗体材料)に
つなぐ方法が要求される。これは、ヘテロ二量体抗体材料をファージ外被に固定
することによって完成される。ファージ外被に固定するのに、ヘテロ二量体抗体
材料をコードするVHおよびVLの相同DNAを順番に包膜する。最後に、抗体結合能
力を持つヘテロ二量体抗体材料をコードするUC+のヘテロ二量体ライブラリの構
成要素は、付加的な特性評価および/または使用のためにライブラリの残りから
分離される。
2.ファージ表面上のヘテロ二量体抗体材料の発現のためのベクター
目的は、VHおよびVLの相同DNAを伴う発現産物をつなぐUC+の結合VHおよびVLラ
イブラリを達成することであるので、適当なファージミド発現ベクターで本発明
のヘテロ二量体ライブラリを創造し保存するのは迅速である。本発明の実行に有
用なファージミド発現ベクターは、モノシストロン性ベクターを含み、より好ま
しくはジシストロン性ベクターを含む。
繊維状ファージ粒子表面上でのヘテロ二量体抗体材料発現のためのファージミ
ドベクターは、VHおよびVLをコードする相同DNAの受容、および融合タンパクと
してのそれらの相同DNAの発現のためにふさわしい組換えDNA分子である。融合タ
ンパクでこれらの相同体の一つが繊維状ファージ外被タンパク膜のアンカードメ
インおよび、原核生物の分泌シグナルドメインに融合される。および、その他の
これらの相同体は、原核生物の分泌シグナルドメインに融合される。それは、VH
およびVLポリペプチドのどちらか一方のうち繊維状ファージ外被タンパク膜の固
定および、原核分泌シグナルを含む融合タンパクとして発現し、他のポリペプチ
ドは原核分泌シグナルを含む融合タンパクとして発現する、ということである。
原核生物の分泌シグナルは相対的にポリペプチドのアミノ末端が短いアミノ酸配
列であり、それは細菌の原形質膜を通してポリペプチドに運ぶ、または誘導する
。および、その結果として起こる周辺腔とあるいはたぶんその向こうへの分泌を
確実にする。リーダーペプチド配列は一般的にポリペプチドが活性化する以前に
取り除かれる。
一つの発現ベクターは、例えばpComb 3などの、二つのシストロンとともに使
用し得る。または、二つの発現ベクターは、一つのシストロン毎に使用し得る。
あるいは、本発明で使用するのに適当な発現ベクター(例えば、Statagene,La
Jolla,Californiaによってキットで提供されたSurfZapTMベクター)は、VHおよ
びVLの両方の相同DNAをコードする一つのポリペプチドを受容するためにふさわ
しく(それは、ある他のもの、好ましくはリンカーに一方向に結合される)、お
よび、このポリヌクレオチドを、繊維状ファージ外被タンパク膜の固定および、
原核生物の分泌シグナルを含む単一融合タンパクとして発現するためにふさわし
い。繊維状ファージ粒子表面上でのヘテロ二量体抗体材料発現のためのベクター
は、この予定された結果に到達するための多くの異なる方法において構築され得
ることを熟練者は認識する。その結果、熟練者はモノシストロン性発現ベクター
の組合せ、またはひとつあるいはそれ以上のシストロンを伴う単一発現ベクター
を使用するのを選び得る。
好ましくは、ヘテロ二量体抗体材料発現のためのファージミド発現ベクターは
、VHおよびVLをコードする相同DNAを独立して、ベクターにおいて存在する二つ
の分離した発現カセットにクローニング(導入)するためのシステムを提供し、
これはヘテロ二量体抗体材料のコードされたVHおよびVLポリペプチドの発現のた
め
の二つの分離したシストロンを形成する。二つの発現カセットを構成するファー
ジミド発現ベクターはジシストロン性ファージミド発現ベクターとして参照され
る。現在、好ましいジシストロン性ファージミド発現ベクターは、pComb 3およ
びC3AP313H6であり、その両方はCarlos Barbas III of the Scripps Research I
nstitute,La Jolla Californiaによって提供された。pComb 3ファージミドは
ジシストロン性ファージミド発現ベクターの好ましい特性の例を提供するために
、詳細は以下に述べられる。
pComb 3ファージミドは第1の発現カセット(また、本明細書中において「Hc
2発現カセット」として参照される)を構成し、相同DNAに一方向に結合するのに
ふさわしいヌクレオチド配列によって作動可能につながれた、上流および下流の
翻訳可能DNA配列を含む。上流の翻訳可能配列は、原核生物の周辺腔分泌シグナ
ル(「pelB leader」)をコードする。pelB leaderの発明は、細菌の細胞質から
周辺腔にそのうえに(例えばVHおよびVLポリペプチド)融合するポリペプチドの
分泌を容易にする。pelB leaderに適当なアミノ酸配列の例は、国際公開第PCT/U
S93/08364の表1で提供される。pComb 3ファージミドの第1の発現カセットの下
流の翻訳可能配列は、繊維状ファージ外被タンパクIIIの繊維状ファージ外被タ
ンパク膜のアンカードメインをコードする。膜アンカードメインは、外被タンパ
クIII(「cp III])のC末端領域のポーションであり、脂質二分子膜を補うため
の親水アミノ酸残基の領域を含む。および、荷電アミノ酸残基の領域は、膜の細
胞質腔および膜から離れて伸びる。このファージ外被タンパク膜の固定は、繊維
状ファージ粒子のマトリックスに結合することが可能であり、それによってファ
ージ表面に、それに融合したポリペプチドを組み入れる。適当な繊維状ファージ
外被タンパク膜のアンカードメイン、cpIIIおよびcpVIIIのアミノ酸配列の例は
また、国際公開第PCT/US93/08364の表1で提供され、本明細書中で参考文献とし
て援用する。
本明細書中において使用されている「融合タンパク」という用語は、少なくと
も二つのポリペプチドおよび、二つのポリペプチドを一つの連続的なポリペプチ
ドに作動可能につなぐための結合配列で構成されるアミノ酸ポリマーを示してい
る。融合タンパクに結合されている二つのポリペプチドは、代表的には二つの独
立した源から得られ、それ故、融合タンパクは、自然界では通常結合したものが
見つからない二つの結合したポリペプチドを構成する。
このpComb 3ファージミドの第1の発現カセットは、翻訳可能DNA配列を発現
するために、DNA発現調節配列を含む。DNA発現調節配列は、構造遺伝子を発現す
るためのDNA発現シグナルのセットを構成し、5’および3’の両方のプロモータ
ーおよびターミネーター要素を含む。これらは、よく知られているように、発現
カセットが構造遺伝子産物を発現し得るように、発現カセットの残りに作動可能
に結合する。DNA発現調節配列を定義するヌクレオチドのセット、上流および下
流の翻訳可能DNA配列、および相同DNAに指向性連結反応するのにふさわしいヌク
レオチド配列は、総称的に発現カセットとして示される。5’調節配列は、転写
を開始するためのプロモーター(転写プロモーター)として、および、上流の翻
訳可能DNA配列の5’末端に作動可能につながれたリボゾームの結合部位として定
義する。3’調節配列は少なくとも、枠内での終結(停止)コドン、および、膜
アンカーポリペプチドをコードする配列に作動可能につなぐことを定義する。
pComb 3ファージミドはまた、第二のポリペプチド(例えば、VHおよびVLポリ
ペプチドはいつも第1の発現カセットによって発現されるわけではない)を発現
するための第2の発現カセット(また、本明細書中において「Lc2発現カセット
」として示されている)を含む。第2の発現カセットは、pelB leaderをコード
する翻訳されうる第2のDNA配列を含み、ベクターの下流DNA配列に指向性連結反
応するのにふさわしいヌクレオチド配列によってその3’末端で作動可能につな
ぐ。そのベクターは代表的には、カセットの読み枠中に少なくとも一つの停止コ
ドンが定義する。翻訳可能な第二のDNA配列は5’末端において、5’要素を形成
するDNA発現調節配列に作動可能につながれる。第二の発現カセットは、DNA配列
の挿入変異(例えば、VHおよびVLをコードする相同DNA)において、それに関し
て挿入DNAによってコードされるポリペプチドとともにつながれるpelB leaderを
含む融合タンパクとして、コードされる第二のポリヌクレオチドを発現すること
が可能である。
本発明の実行に有用なファージミド発現ベクター中のシストロンは、ベクター
の領域である。それは、VHおよびVLをコードする相同DNAの挿入において、適切
な宿主において、UC+の抗体材料の発現が可能なヌクレオチド配列の形態を取る
。従って、ヌクレオチドの発現-コンピテント配列はシストロンとして示される
。シストロンは、VHおよびVLをコードする相同DNAが、その目的にふさわしいヌ
クレオチド配列によって、上流および下流の間で一方向に挿入される(「direct
ionally ligated」)ときに形成される。三つの翻訳されうるDNA配列、すなわち
上流、挿入されたものおよび下流配列は全て、同じ読み枠において作動可能につ
ながれている。その結果、UC+のヘテロ二量体抗体材料を発現するためのジシス
トロン性ファージミド発現ベクターは、VHおよびVLライブラリの両方の構成要素
を、UC+のヘテロ二量体抗体材料のVHおよびVLポリペプチドを共に発現するする
ことが可能なシストロンを生産するための、ベクターのカセットポーションにク
ローニングするためのシステムを提供する。
pComb 3ファージミド発現ベクターはまた、第1のおよび第二の発現カセット
に加えて、アンピシリンによる選択が出来る耐性マーカー伝子を保持する。flフ
ァージ複製起点は、一本鎖ファージミドの形成を容易にする。イソプロピルチオ
ガラクトピラノシド(IPTG)は、一次シストロンの融合タンパクおよび二次シス
トロンの融合タンパクをコードするジシストロン情報の発現を誘導する。
本明細書中において使用される「ベクター」という用語は、異なる遺伝子環境
へと、作動可能につながれた他のDNA分子の間を輸送することが可能な組換えDNA
分子を示している。ベクターは細胞中で自律複製が可能であり、DNAセグメント
、例えば遺伝子またはポリヌクレオチド、は付着セグメントの複製について運ぶ
ように作動可能につながれ得る。翻訳可能DNAの発現が一方向に可能であり、ひ
とつまたはそれ以上のポリペプチドそコードすることが可能なベクターは本明細
書中において「発現ベクター」と示されている。
本明細書中においてDNA配列またはセグメントに関して使用されている「作動
可能につながれる」というフレーズは、配列またはセグメントが、一つのDNA鎖
に、一本鎖または二本鎖形態かどうかを問わず、共有結合されているという意味
であり、慣用的なフォスホジエステル結合によってが好ましい。
この発明での転写ユニットまたはカセットが作動可能につながれるベクターの
選択は、当該分野ではよく知られているように、機能特性上で要求される、例え
ばベクター複製およびタンパク発現、および、形質転換されるための宿主細胞に
直接的に依存し、これらは組換えDNA分子構築の分野固有の制限である。
指向性連結反応、例えばポリリンカー、にふさわしいヌクレオチド配列は、フ
ァージミド発現ベクター領域である。これは(1)上流および下流の翻訳可能DNA配
列を複製および輸送するために好ましくつなぎ、(2)ベクターにへの相同DNAの指
向性連結反応の部位または方法を提供する。代表的には、指向性ポリリンカーは
ヌクレオチド配列である。それは二つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ
認識配列、または認識部位を定義する。制限切断のもとで、二つの側は付着末端
を生産する。VHおよびVLをコードする相同DNAはファージミド発現ベクターに連
結反応され得るために。好ましくは、二つの制限部位は制限切断を提供し、付着
末端は非相補的でなくて、それにより発現カセットに相同DNAの指向性挿入を認
める。たとえば、pComb 3ファージミドの第1の発現カセット(「Hc2」)で指
向性連結反応にふさわしいヌクレオチド配列は、5’から3’へのXho1制限部位
およびSpeI制限部位をコードする。pComb 3ファージミドの第1の発現カセッ
ト(「Lc2」)で指向性連結反応にふさわしいヌクレオチド配列は、5’から3’
へのSacI制限部位およびXbaI制限部位をコードする。
好ましい実施態様において、ファージミド発現ベクターは便利な操作のために
、本発明の教えにより、ゲノムをカプセルに包んだ繊維状ファージ粒子の形態で
デザインされる。この実施態様において、ファージミド発現ベクターはさらに、
繊維状ファージの複製起点を定義するヌクレオチド配列を含み、これによりベク
ターが、適切な遺伝相補性において、一本鎖複製フォーム中で繊維状ファージの
ように複製でき、繊維状ファージ粒子にパッケージされる。この特徴は、ファー
ジミドベクターの粒子の部分配列分離のために、ファージ粒子にパッケージされ
る可能性を提供する。および、ファージ粒子の集団を構成する他の粒子から離れ
て含まれているベクター。
繊維状ファージの複製起点は、ファージゲノムの領域である。これは、よく知
られているように、複製によって生産される複製開始点および複製終結点および
複製フォームのパッケージングのためのサイトを定義する。例として、Rasched
ら、Microbiology Review,50:401-427(1986);およびHoriuchi,Journal of M
olecular Biology,188:215-223(1986)を参照。
本発明において使用されるのに好まれる繊維状ファージの複製起点は、M13ま
たはflまたはfdファージの複製起点である。pComb 3ファージミドはflファージ
複製起点を用いる。好ましいファージミド発現ベクターは、ジシストロン性ファ
ージミド発現ベクターである。
3.ジシストロン性ファージミド発現ベクターでのVHおよびVLをコードする相同
DNAのランダムな結合
UC+のVHまたはVLライブラリのVHおよびVLポリペプチドの発現が可能なジシス
トロン性ファージミド発現ベクターのライブラリの構築は二つの一般的なステッ
プで完成された。第一ステップでは、UC+のVHまたはVLどちらか一方のライブラ
リの構成要素はジシストロン性ベクターの発現カセットの一つに指向性連結反応
される。次のステップは他の遺伝子ライブラリの構成要素は他の発現カセットの
一つに指向性連結反応される。シストロン性ベクター二つの相同DNAのランダム
結合を含む。あるものはVHポリペプチドををコードするし、他のものはVLポリペ
プチドをコードする。これはUC+のH鎖およびL鎖を潜在的にともに発現するどち
らか一方のクローンのライブラリでの結果である。事実上の結合はランダムであ
り、UC親株のLPLでのB細胞集団の本組み合わせを反映する必要はない。
本発明の実施態様において、ファージ粒子状でUC+のヘテロ二量体抗体材料の
発現を可能にするジシストロン性ファージミド発現ベクターライブラリが調製さ
れた。ジシストロン性ファージミド発現ベクターライブラリの各構成要素は一次
および二次シストロン由来のVHポリペプチドおよびVLポリペプチドの発現をそれ
ぞれ可能にし、適当な宿主で繊維状ファージ粒子表面上でUC+のヘテロ二量体抗
体材料を形成することが出来る。
本発明の他の実施態様に従って、UC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリーの
ヘテロ二量体抗体材料をコードするジシストロン性ファージミド発現ベクターラ
イブラリを生産する方法が提供される。これは以下を含む(a)連結反応緩衝液中
で以下を結合することによる第一連結混合物の形成(I)UC+の免疫グロブリン
遺伝子レパートリーの第一ライブラリ、dsDNAの形態中で複数の相同DNAを構成す
る第一ライブラリといわれる、指向性連結反応にふさわしい付着末端を持つライ
ブラリの各相同DNA、ライブラリはUC+のVHライブラリおよびUC+のVLライブラリ
からなるグループの形態が選択されている、および、(ii)直線上の直線上の複
数のファージミド発現ベクターの、上流および下流の第一付着末端を持つ各々、
は一般的な読み枠中でUC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリーの第一ライブラ
リの相同DNAを一方向に受け取るのにふさわしい。その点で言われる第一付着末
端はそれぞれの上流および下流の翻訳可能DNA配列に作動可能につながれる。次
々にそれぞれの上流および下流の翻訳可能DNA発現制御配列に作動可能につなが
れる。第一付着末端の上流の翻訳可能DNAは原核生物の分泌シグナルをコードす
るし、第一付着末端の下流の翻訳可能DNA配列繊維状ファージ外被タンパク膜ア
ンカーをコードする。
(b)十分なタイムピリオドのための連結反応条件に混合物を従属させること
、ベクターにUC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリーの第一ライブラリの相同D
NAを作動可能につなぐために、および複数の環状ファージミド発現ベクター、UC+
の免疫グロブリン遺伝子レパートリーの第一ライブラリを発現するための第一
シストロンを持つ各々、を生産する;
(c)DNA切断条件下の複数の環状ファージミド発現ベクター、複数の直線状の
ファージミド発現ベクターを生産するための、上流および下流の第二付着末端を
持つ各々、(I)は一般的な読み枠中でUC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリ
ーの第二ライブラリの相同DNAを一方向に受け取るのにふさわしい、および(ii
)はそれぞれの上流および下流の翻訳可能DNA配列に作動可能につながれる、そ
れは次々にDNA発現制御配列に作動可能につながれる。第二付着末端の上流DNA配
列は原核生物の分泌シグナルをコードする翻訳可能な配列である。および、第二
付着末端の下流DNA配列は読み枠中に少なくとも一つの停止コドンを持つ。
(d)連結反応緩衝液中の結合による第二連結反応の混合物を形成すること(I
)(c)において複数のファージミド発現ベクター形成した、および(ii)UC+の
免疫グロブリン遺伝子レパートリーの第二ライブラリ、dsDNA形態中で複数の相
同DNAのを構成する第二ライブラリと呼ばれる、ファージミド発現ベクターの第
二付着末端に指向性連結反応するのにふさわしい付着末端を持つ各々の相同DN
A、ライブラリはUC+のVHライブラリおよびUC+のVLライブラリを含むグループか
ら選択されたといわれる点で;および
(e)十分なタイムピリオドのための連結反応条件に第二混合物を従属させる
こと、UC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリーの第二ライブラリの相同DNAを作
動可能につなぐ、および複数の環状ファージミド発現ベクター、UC+の免疫グロ
ブリン遺伝子レパートリーの第二ライブラリを発現するための第一シストロンを
持つ各々、ジシストロン性ファージミド発現ベクターのライブラリを形成するの
に関して、を生産する。
好ましい実施態様で、第一付着末端の上流翻訳可能DNA配列によってコードさ
れる原核生物の分泌シグナルおよび第二付着末端の上流翻訳可能DNA配列によっ
てコードされる原核生物の分泌シグナルはpelB分泌シグナルである。また好まし
いのは、第一付着末端の下流翻訳可能DNA配列によってコードされる繊維状ファ
ージ外被タンパク膜アンカーである。本明細書中において述べられているように
cpIIIおよびcpVIIIが得られる。
前述の方法を実行するのに役立つジシストロン性ファージミド発現ベクターは
ジシストロン性ファージミド発現ベクターpComb 3およびC3AP313H6である。
UC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリーのヘテロ2量体材料をコードするジ
シストロン性ファージミド発現ベクターのライブラリの生産のための方法を実行
では、上流および下流の第一付着末端は上流および下流の第二付着末端の様に同
じヌクレオチド配列を持たないということが好ましい。この実施態様では、直鎖
状の複数のファージミド発現ベクター処理は第二付着末端と呼ばれる、生産する
ために特異的である制限エンドヌクレアーゼの使用を典型的に伴う、しかし、第
一付着末端を形成する部位において環状ファージミド発現ベクターを切断しない
。例として好ましい第一および第二末端は、上流および下流の第一付着末端を形
成するのにXhoIおよびSpeIとともにpComb 3の切断によって得られる末端、お
よび上流および下流の第二付着末端を形成するのにSacIおよびXbaIとともにpC
omb 3の切断によって得られる末端である。この実施態様では、付着末端の他の
ペアは第一および第二付着末端の好ましいペアを利用できる。四つの末端が各々
他と全く別な賞賛されない末端である限り。例としてはpCBAK8およびpComb2-3
お
よびpComb2-3'およびpComb8およびpComb2-8ベクターで見つけられる末端であり
、国際公開第PCT/US93/08364に述べられている。これは本明細書中で参考として
援用する。
直線状ファージミド発現ベクターを形成するためのDNA切断条件下における複
数の環状ファージミド発現ベクターの処理法は、一般的によく知られており、切
断されるヌクレオチド配列および切断メカニズムに依存している。好ましい処理
は、混合を伴う。要求される切断位置において、エンドヌクレアーゼ認識部位に
特異的な制限エンドヌクレアーゼとともにファージミド発現ベクターおよびファ
ージミド発現ベクターを切断するための制限エンドヌクレアーゼの十分な量の。
制限エンドヌクレアーゼ切断の、緩衝液および切断条件および基質条件はよく知
られていて、特に酵素の利用に依存している。例示的な制限酵素切断条件は以下
の実施例に述べられている。
本発明の他の実施態様では、UC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリー由来の
ヘテロ二量体抗体材料をコードするジシストロン性ファージミド発現ベクターの
ライブラリを生産するための方法が提供され、これは以下を含む:
(a)連結反応緩衝液中で結合することによって第一連結反応混合物を形成す
ること。(I)dsDNA形態中でUC+のVLをコードする相同DNAライブラリ、ライブ
ラリの各々のVLをコードする相同DNAは5’末端SacI付着末端および3’末端Xba
I付着末端を持つという点で、および(ii)直線状の複数のpComb 3ファージミ
ド発現ベクターは、一般的な読み枠中のUC+のVLをコードする相同DNAライブラリ
VLをコードする相同DNAを一方向にうけ取るのにふさわしい5’および3’付着末
端を各々持つ、5’付着末端は上流pelBリーダー配列に作動可能につながれるXba
I付着末端があるといわれている点で、および、3’付着末端は読み枠中に、少
なくとも一つの停止コドンを持つ下流翻訳可能配列に作動可能につながれるSac
I付着末端があるといわれている点で、および、上流pelBリーダー配列および下
流翻訳可能配列と呼ばれているものは、好ましい上流および下流DNA発現制御配
列に作動可能につながれるという点で;
(b)第一連結反応混合物、タイムピリオドのための連結反応条件、pComb 3
ベクターと呼ばれるためのVLをコードする相同DNAと呼ばれる好ましい結合、お
よびUC+のVLをコードする相同DNAライブラリのVLをコードする相同DNAを発現す
るための第一シストロンを各々持つ複数の環状pComb 3ベクター;
(c)DNA切断条件下で複数の環状pComb 3ベクターを処理すること。直線状の
複数のpCom 3ベクターを生産するための一般的な読み枠中でUC+のVHをコードす
る相同DNAライブラリのVHをコードする相同DNAを一方向に受け取るための。およ
び、各々持っている、(I)その3’末端におけるXhoI付着末端、pelBリーダー
をコードする上流翻訳可能DNA配列のつながれるのに好ましいXhoI付着末端と呼
ばれる、上流DNA発現制御配列につながれるのに好ましい上流翻訳可能DNA配列と
呼ばれる、および(ii)その5’末端におけるSpeI付着末端、繊維状ファージ外
被タンパク膜アンカーをコードする重流DNA配列につながれるのに好ましいSpeI
付着末端と呼ばれる、下流DNA発現制御配列につながれるのに好ましい下流DNA配
列と呼ばれる;
(d)連結反応緩衝液中の結合による第二連結反応混合物の形成(I)直線状
の複数のpComb 3ベクター、および複数のpComb 3ベクターへの指向性連結反
応にふさわしいdsDNA形態中のUC+のVHをコードする相同DNAライブラリ、各々のVH
をコードする相同DNAは5’末端においてXhoI付着末端および3’末端においてS
peI付着末端を持つという点で;および
(e)タイムピリオドのための連結反応条件の第二連結反応混合物は、pComb
3ベクターと呼ばれるものに、VHをコードする相同DNAライブラリ十分に好まし
く結合する、および、UC+のVHをコードする相同DNAライブラリのVHをコードす
る相同DNAを発現するための第二シストロンを各々持つ、複数の環状pComb 3ベ
クターを生産する。
本発明におけるさらに他の実施態様では、UC+の免疫グロブリン遺伝子のレパ
ートリー由来のVLまたはVHをコードするcDNAを含むファージミド発現ベクターの
ライブラリーが提供される。ここで当該UC+の免疫グロブリン遺伝子のレパート
リーはUCによって診断されたpANCAについて血清陽性である1人またはそれ以上
の人のLPL由来のものである。このファージミド発現ベクターのライブラリーはVL
ポリペプチドのκイソタイプまたはVHポリペプチドのγイソタイプをコードす
るcDNAを含んでいることが好ましい。このファージミド発現ベクターのライブラ
リーは免疫グロブリンのκL鎖可変部位のそれぞれのファミリ由来のVLポリペプ
チドまたは免疫グロブリンのH鎖可変部位のそれぞれのファミリ由来のVHポリペ
プチドを含んでいることがより好ましい。追加的に当該VLまたはVHポリペプチド
をコードするcDNAは機能的に上流と結合しており、下流翻訳可能DNA配列とも機
能的に結合している、つまり上流下流の発現制御DNA配列のとそれぞれ機能的に
結合していることが好ましい。ここで言う上流翻訳可能DNA配列は原核生物分泌
シグナル、好ましくはpelBリーダー、および下流翻訳可能DNA配列は繊維状ファ
ージ外被タンパクの膜アンカー、好ましくはcpIII膜アンカーをコードしている
。
本発明におけるさらに他の実施態様では、本発明におけるUC+の免疫グロブリ
ン遺伝子レパートリー由来のVLまたはVHポリペプチドをコードするcDNAを含むフ
ァージミド発現ベクターのライブラリーを含む複数の原核細胞、好ましくはE.c
oliが提供される。関連する実施態様では、複数の原核細胞はUC+の免疫グロブリ
ン遺伝子レパートリー由来のVLポリペプチドをコードするcDNAを含むファージミ
ド発現ベクターのライブラリーおよびUC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリー
由来のVHポリペプチドをコードするcDNAを含むファージミド発現ベクターのライ
ブラリーを含んでいる。
他の実施態様は本発明におけるUC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリー由来
のVHまたはVLポリペプチドをコードするcDNAを含むファージミド発現ベクターの
ライブラリーを包膜する繊維状ファージの集団を提供している。関連する実施態
様では、複数の原核細胞はUC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリー由来のVLポ
リペプチドをコードするcDNAを含むファージミド発現ベクターのライブラリーお
よびUC+の免疫グロブリン遺伝子レパートリー由来のVHポリペプチドをコードす
るcDNAを含むファージミド発現ベクターのライブラリーを含んでいる。ファージ
ミド発現ベクターに含まれるcDNAによってコードされるVLまたはVHポリペプチド
はファージ粒子の表面で発現されることが好ましい。そのファージ粒子はVLまた
はVHポリペプチドと繊維状ファージの外被タンパク膜アンカーからなる融合タン
パクとしてそれを包膜する。
本発明における他の具体化されたライブラリーはUC+の免疫グロブリン遺伝子
レパートリー由来のヘテロ二量体の抗体材料を発現させることが可能なヘテロ二
量体ファージミド発現ベクターのライブラリーである。ここで当該UC+の免疫グ
ロブリン遺伝子のレパートリーはUCによって診断されたpANCAについて血清陽性
である1人かそれ以上の人のLPL由来のものである。ジシストロンファージミド
発現ベクターの1つのシストロンはVLポリペプチドをコードするcDNAを含み、他
方のシストロンはVHポリペプチドをコードするcDNAを含む。VLをコードするポリ
ペプチドはκイソタイプが好ましく、免疫グロブリンκL鎖可変領域のそれぞれ
のファミリがVLをコードするポリペプチドに相当すればより好ましい。免疫グロ
ブリンκH鎖可変領域のファミリそれぞれがVHをコードするポリペプチドに相当
すること、またVHをコードするポリペプチドがγイソタイプであることも好まし
い。当該VLポリペプチドをコードするcDNAおよび当該VHポリペプチドをコードす
るcDNAはいずれも原核生物の分泌シグナル、好ましくはpelBリーダーをコードす
る上流翻訳可能DNA配列と機能的に結合している、つまり上流の発現制御DNA配列
とそれぞれ機能的に結合している。VLポリペプチドまたはVHポリペプチドをコー
ドするcDNAは繊維状ファージ外被タンパクの膜アンカー、好ましくはcpIII膜ア
ンカーをコードしている下流翻訳可能DNA配列と機能的に結合している、つまり
下流の発現制御DNA配列と機能的に結合している。ジシストロンファージミド発
現ベクターはpComb 3またはC3AP313H6が好ましい。
ある実施態様では本発明におけるヘテロ二量体ファージミド発現ベタターは原
核細胞、例えば、E.coliの集団に含まれ得る。UC+の免疫グロブリン遺伝子レパ
ートリー由来のヘテロ二量体抗体の材料をコードし発現させることができ、本発
明における方法に従って作製すること可能で、E.coliの集団に含まれるような
ヘテロ二量体ファージミド発現ベクターのライブラリーの実施態様は、特許手続
きのための微生物寄託に関する国際承認におけるブダペスト条約の協約に従って
、1995年3月31日にアメリカンタイプカルチャーコレクション("ATCC")(12301 P
arklawn Drive,Rockville,Maryland,U.S.A.20852)に寄託され、ATCC受け
入れ番号69827が割り当てられた。法規はこの条約で公布された。寄託された材
料のサンプルは条約および法規の協約に従って、およびそうでなければ、アメリ
カ合衆国およびその他の国々、またはこの応用またはこの応用の優先権を要求す
る応用が提出された、またはそのような応用を認可されたいかなる特許が認可さ
れ
た国際組織の特許法律および法規の協約に従って、法律的にそれらを受け取る権
利を与えられた産業に関する会社及びその他の者には利用可能または可能になる
であろう。特に、この応用およびこの応用の優先権を要求するいかなる応用に基
づいた、またはこの応用を参考として引用したアメリカ合衆国特許の発行に基づ
いて、寄託された材料の使用に関する全ての制限は挽回しがたく取り除かれるで
あろう。
F.発現ベクターを包膜した繊維状ファージによるUC+の抗体材料の表面発現
1.繊維状ファージ
繊維状ファージは細菌に感染するウイルスの一種である。それらはファージDN
Aを包むタンパク性の殻または外被からなる長く、薄い粒子であるため繊維状フ
ァージと称される。F線毛繊維状ファージ(「Ffファージ」)は細菌のF線毛の
先端に特異的に吸着することによりグラム陰性の細菌のみに感染し、Fd、Fl,Ml
3なども含む。Ffファージは宿主細胞を殺したり溶菌させたりはしない。
成熟したFfファージの外膜はファージDNAによってコードされる5つのタンパ
クからなる。ファージ外被の長さは外被タンパクVIII(「cpVIII」)の2500から
3000コピーが規則正しいらせん配置をとるように形成され、それゆえ独特の繊維
構造を形成する。それ以外の4つのタンパクのおよそ5コピーずつが細くのびた
外膜の末端に存在する:cpIIIおよびcpIVは外膜の末端にあり、cpVIIおよびcpIX
はその他に存在する。ファージDNAの遺伝子IIIにコードされるcpIIIは感染の初
期段階にその細菌宿主にファージが結合する受容体として働く。Ffファージの構
造についての詳細な総説についてはRaschedらのMicrobiology Review,50: 401-
427(1986)およびModelらの"The bacteriophages,Volume 2,"Our Calendar,
et.Plenum press,pp.375-456(1988)を参照せよ。なおこれらすべてについて
は本明細書中で参考として援用している。
Ffファージ粒子の集合はとても複雑な機構による。しかしながら、一般的にフ
ァージ粒子は宿主細胞の膜を通してウイルス染色体が追い出される間に集合する
。追い出しに先だって、cpVIIIおよびcpIIIが合成され、宿主細胞の膜に輸送さ
れる。cpVIIIおよびcpIIIは両方とも成熟した粒子に取り込まれる前に宿主細胞
の
膜につながれる。
cpVIIIおよびcpIIIタンパクは両方とも成熟したファージ粒子の集合のシグナ
ルとなる2つの領域を含んでいる。第一の領域は新しく合成されたタンパクを宿
主細胞の膜に導く分泌シグナルである。この分泌シグナルはポリペプチドのアミ
ノ末端に存在し、少なくともこのポリペプチドが細胞膜を標的とする。第二の領
域は膜アンカー領域で宿主細胞膜およびファージ粒子と結合するためのシグナル
となる。cpVIIIおよびcpIIIのこの第二のシグナルは膜を貫通するため少なくと
も1つの疎水領域を含んでいる。
cpIIIの配列を操作することにより、膜と結合する能力は保ったまま、疎水ア
ミノ酸で構成され、通常膜につなぎとめる役目をするC末端の23アミノ酸の残基
を様々に換えることができることが示された。cpIIIのアミノ酸残基の配列に単
鎖抗体領域ことが分かっている1つの短いポリペプチドまたは1つのアミノ酸残
基が挿入されたFfファージベースの発現ベクターについて述べられている。Parm
leyら,Gene,73: 305-318(1998); Cwirlaら,Proceedings of the National Ac
ademy of Science,USA,87: 6378-6382(1990)およびMcCaffertyら,Science,3
48: 552-554(1990)を本明細書中で参考として援用している。これらのハイブリ
ッドタンパクは合成されてファージ粒子の中に普通のcpIIIの通常の密度である
5コピー/ファージ粒子、集合する。これは普通のcpIIIの通常の密度である。
加えて、酵素機能を有したアルカリフォスファターゼがcpIIIとの融合タンパク
として繊維状ファージ粒子の表面に発現している。McCaffertyら,Protein Engi
neering,4: 955-961(1991)。
2.繊維状ファージ生産の方法
本発明における繊維状ファージ粒子は、標準的繊維状ファージ粒子調製方法に
よって生産され、そして本発明におけるファージミド発現ベクターの存在に依存
する。このベクターは、本明細書中において記述された、繊維状ファージの複製
開始点を含み、以下のことに必要な信号を提供する(1)一本鎖繊維状ファージ
複製型の生産および(2)繊維状ファージ粒子中への複製型のパッケージング。
そのようなファージミド発現ベクターは、遺伝相補性の導入上の細菌細胞宿主に
存在するときにパッケージングされ得、感染性ファージ粒子の生産のために要求
される繊維状ファージタンパク質を提供する。
一般にUC+の粒子表面ヘテロ二量体抗体材料を有する繊維状ファージ粒子生産
の方法は以下を含む:(a)原核生物宿主細胞の中に導入する、繊維状ファージ複
製を許された、ジシストロニックファージミド発現ベクター含む、およびVHをコ
ードするおよびVLをコードするUC+の相同DNAを発現することができる、その中で
一つのコードされたポリペプチドは融合される、繊維状ファージ外被タンパク質
膜固定に、および(b)そのベクターを含む原核生物宿主細胞の維持、繊維状ファ
ージ粒子の生産のために十分な条件下での、およびUC+のヘテロ二量体抗体材料
の発現のために十分な条件下で、それによってファージ粒子の形成。
ジシストロニックファージミド発現ベクターの、複製を許容する原核生物宿主
への導入はベクターによる、たとえばE.coliの形質転換によって達成される。
原核生物宿主細胞の形質転換は周知であり、カルシウム媒介の形質転換、エレク
トロポレーションおよびそのようなものを含む。他の導入の手段は繊維状ファー
ジ粒子による感染を含む。
本発明における繊維状ファージ生産のための原核生物宿主細胞は、繊維感染と
形態形成を許容し、そして繊維状ファージ分野でよく特性を表されている。好ま
れる宿主はE.coli細胞である、しかしながら、他の原核生物細胞も使われ得る
。
(b)上記に従って維持することは、ファージ粒子形成のための導入されたベク
ターの発現の促進および、相同DNA染色体の生産物を導く。典型的に、本発明の
ファージミド発現ベクターは組換えDNA分子調製および操作のための最小遺伝情
報をなどを含み、繊維状ファージ粒子生産のめに要求される遺伝子の完全な領域
は含まない。典型的なおよび好まれる遺伝相補性のための方法は本発明のファー
ジミド発現ベクターを含む細菌宿主細胞をヘルパー繊維状ファージに感染させる
ことである、それによってファージ粒子生産物に要求される遺伝成分が供給され
る。例示的なヘルパーレスキュー方法は記述本明細書中、実施例において記述さ
れ、および本明細書中、参照に組み込まれているShortら Nucleic Acid Researc
h,16: 7583-7600(1988)に記述されている。
したがって維持の段階は典型的にヘルパーファージによる重感染とヘルパー遺
伝子に相補遺伝子を発現および、ファージ粒子の発現と生産物を援助すること許
す条件下での培養期間との組み合わせを含む。
繊維状ファージ粒子の表面上で宿主細胞からのファージ粒子放出のステップの
間に捕獲されるUC+のヘテロ二量体抗体材料の量は様々な意味で調節され得る。
一つの実施態様の中で、ファージ粒子の表面上のUC+のヘテロ二量体抗体材料の
量はVHおよびVL融合タンパク質の発現とヘルパーファージによる重感染との間の
タイミングを調節することにより調節され得る。発現ベクターの宿主細胞への導
入後、ヘルパーファージの追加以前の長い延期時間は宿主細胞内の融合タンパク
質の蓄積の増加を許す、それによって噴出したファージ粒子によって獲得される
融合タンパク質の量が増加する。
したがって、現在の発明の好まれる実施態様にしたがって、UC+の免疫グロブ
リン遺伝子のレパートリーからのヘテロ二量体抗体材料をコードするpComb 3発
現ベクターのライブラリが形質転換によりE.coliに導入される。それぞれのpCo
mb 3発現ベクターの一つのシストロンはVLポリペプチドをコードするcDNAを含み
、そしてそれぞれのベクターのもう一方のシストロンはVLポリペプチドをコード
するcDNAを含む。VLポリペプチドをコードするcDNA およびVHポリペプチドをコ
ードするcDNAの両方は作動的に原核生物の分泌シグナルをコードしている上流の
翻訳可能なDNA配列、好ましくは、pelBに連結されて、次にまたDNA発現調節配列
に作動的につながれている。VLポリペプチドあるいはVHポリペプチドをコードす
るcDNAは下流の翻訳可能な繊維状ファージ被膜タンパク質膜固定装置、好ましく
はcpIII膜固定装置、次にまた下流のDNA発現調節配列に作動的につながれている
DNA配列に作動的につながれている。pComb 3のflファージ複製開始点は
一本鎖ファージミドの発生を促進する。イソプロピルチオガラクトピラノシド(I
PTG)はジシストロニックメッセージの発現を誘発する。原核生物分泌シグナル、
例えばpelBリーダー、続いて切りはなされる、細菌のサイトプラズマから周辺腔
へのVLポリペプチドおよびVHポリペプチドの統合されるが、わかれた分泌を促進
する。例えば、もしVHポリペプチドがcpIIIに融合されると、VLポリペプチドが
ペリプラズマに分泌される間に、それはcpIII膜固定装置を介して膜に固定され
る。VHポリペプチドはVLポリペプチドの存在下でUC+のヘテロ二量体抗体材料、
好ましくはFab分子を形成するために組み立てられる。同じ結果が達せられるも
し、他にVLポリペプチドがVLポリペプチドを介して膜に固定されると/膜固定化
融合タンパク質、水溶性VHポリペプチドはpelBリーダーを介してペリプラズマに
分泌される。その後のヘルパーファージとE.coliとの感染で繊維状バクテリオ
ファージの生産物が進行している時、バクテリオファージの表面にUC+の抗体材
料を固定しながらcpIIIはバクテリオファージの尾に取り込まれる。
したがって、本発明は本発明の方法に従って生産され得るUC+の免疫グロブリ
ン遺伝子のレパートリーからのヘテロ二量体抗体材料をコードしたジシストロニ
ックファージミド発現ベクターを包んだ繊維状ファージ粒子の個体群を提供する
。関連した実施態様において、繊維状ファージの個体群のメンバーはまた包み込
んだ発現ベクターによってコードされたヘテロ二量体抗体材料を繊維状ファージ
表面に発現した。
G.ファージライブラリからのUCpANCA発現ファージ粒子の分離
本発明のライブラリは、最初にUC+LPLのVHおよびVL遺伝子レパートリーの個々
のクローニングにより(これはUC+のヘテロ二量体抗体材料の重鎖および軽鎖ポ
リペプチドに相当する)生産される場合、その結果のライブラリの大きさは(二
つのレパートリーをジシストロニックベクターの型ででたらめに結合した後)、
は大きく増加する。例えば、軽鎖と重鎖可変抗体遺伝子、それぞれ106の異なっ
たメンバーをもっていることを考えよ。2つのレパートリーの組み合わせると理
論上ファージライブラリは1012の可能性の異なったヘテロ二量体抗体材料の種を
生じる。
UCpANCA材料のVHおよび/またはVLポリペプチドをコードしているDNA発現ベク
ターを含むファージ粒子の単離(分離)は典型的にライブラリから成る他のファ
ージ粒子の個体群から興味のあるDNA相同性を含む繊維状ファージ粒子を分離し
離すことから導かれる。ファージ粒子の分離はライブラリの他の粒子から個々の
ファージ粒子を物理的分離および増殖により離すことを必要とする。個々の粒子
を形成するための繊維状ファージ粒子の物理的分離および個々の粒子から得られ
る後代のファージの個体群の形成のための、個々の粒子の増殖の方法は一般的に
繊維状ファージ粒子分野で周知である。
好まれる分離方法はファージ粒子とUCpANCA抗原との間のUCpANCA抗原特異的結
合を使った、ファージ粒子の表面の発現したヘテロ二量体UCpANCA材料の同定を
必要とする。例示的および好まれることは「パンニング(panning)」方法の使
用である、それによってファージ粒子の懸濁液が個体相抗原に接触させられる、
たとえば、メタノールが好中球を固定し、免疫反応を許す。結合後、非結合粒子
は個体相を洗い落とされ、結合ファージ粒子は表面にUCpANCA抗原特異免疫グロ
ブリンポリペプチドを含む。結合粒子はそれから、個体相から結合粒子の溶出に
よって回収され得、こらは典型的に抗原抗体材料相互作用を妨げる水溶溶媒によ
る。典型的な溶媒は、高いイオン強度あるいは低いpHの緩衝液を含む。
粒子の個体集団からの表面で発現したUC+のヘテロ二量体抗体材料の特異性に
もとづいてファージ粒子を分離するもう一つの方法は、UCpANCA抗原との架橋に
よって、ファージ粒子を水相から沈殿させることである、例えば、メタノールが
好中球を固定する。
上記の粒子分離方法の使用は本発明のファージライブラリ中に存在する繊維状
ファージ粒子の個体群のスクリーニングのための手段を提供する。ファージライ
ブラリに利用すると、スクリーニングは一つまたはそれ以上のUCpANCA抗原の特
異性をもつUCpANCA材料を発現する粒子の濃縮に役立て得る。ライブラリが、全
てが検出可能なUCpANCA抗原結合活性をもつ多重種のUCpANCA材料を含むように設
計されている、しかしながらタンパク質構造、抗原性、抗原親和性または結合力
、およびそのようなものが異なるとき、そのスクリーニング方法は役立ち得る。
連続して最初に結合特異性を前もって選択するための濃縮のライブラリを形成し
、
そしてそれから二つめの、さらにスクリーニングによりさらに濃縮された一つま
たはそれ以上の単離されたファージ粒子から成るライブラリを形成する。抗原結
合活性、抗原性およびそのような抗原と抗体材料間の相互作用の測定の方法は一
般的に周知であるし、それらが将来の本発明に必須でないのでさらに論議はしな
い。
したがって本発明はUC+のヘテロ二量体抗体材料をコードするジシストロニッ
クファージミド発現ベクターを含む繊維状ファージ粒子の個体群を提供する、こ
こで、メタノールが好中球を固定ために結合することによって証明されたように
、ヘテロ二量体抗体材料がUCpANCA抗原と免疫反応する。それゆえにヘテロ二量
体抗体材料は本明細書においてUCpANCA抗原材料と呼ぶ。他の実施態様において
、本発明は、単一粒子の後代であり、したがって、すべては同じUCpANCA材料を
粒子表面上に発現する繊維状ファージの個体群を提供する。そのようなファージ
の個体群は相同性がある、そしてコロニーとして得られ、したがって多量のUCpA
NCA材料を発現するための源を提供する。
H.抗体材料をコードするファージミドからの水溶性抗体材料の生産
ファージ粒子の外被に固定されてるUC+のヘテロ二量体抗体材料は、本発明に
従うと、ヘテロ二量体抗体材料をコードするジシストロニックファージミド発現
ベクターからファージ外被タンパク質膜固定部位をコードするポリヌクレオチド
を摘出することのみにより、水溶性の型で発現させられえる。したがって、VH-
およびVL- をコードする相同DNAは、それぞれpelB/VH融合タンパク質およびpelB
/VL融合タンパク質のように表される。それぞれは周辺腔に分泌され、そしてUC+
のヘテロ二量体抗体材料に再構成するが、固定はされない。そのような水溶性抗
体材料はその後の使用またはさらなる評価のために宿主細胞抽出液から回収され
得る。
例えば、VH- およびVL- ポリペプチドをコードするcDNAを含むpComb 3発現ベ
クターはcpIIIをコードするポリヌクレオチドを摘出するためにSpe IおよびNhe
I制限エンドヌクレアーゼで分離および消化され得る。なぜならSpe IおよびNhe
Iは互換性のある粘着末端を生産するため、そのベクターはゲル精製および自
己結合され得る、例えば、形質転換された宿主中で水溶性抗体材料発現すること
を促進され得るファージミドを生ずる。
I.UCpANCA材料
上記に記述されたように生成した水溶性ヘテロ二量体UCpANCA材料は、一つま
たはそれ以上の本明細書中においてもまた記述された免疫性定量に従ってさらに
評価され得る。したがって、本発明によれば、好中球中の核抗原と免疫反応する
ヘテロ二量体UCpANCA材料が供給され、その中で、免疫反応は、下述の実施例に
記述されたようにアルコール固定好中球IIFアッセイで形成された核周囲染色パ
ターンによって特徴付けられる。好ましくは、UCpANCA材料の免疫反応ほさらに
、DNaseとアルコール固定された好中球の前処理によって崩壊させられて、例え
ば、実施例の中で記述されたようにDNase感度アッセイによって評価される。UCp
ANCAの免疫反応の崩壊は、IIFアッセイでのpANCA染色パターンの喪失によって、
またはpANCA染色パターンからANCA染色パターンへの染色パターンの変化によっ
てそれ自身を表示できる。さらにもっと好ましくは、UCpANCA材料の免疫反応は
さらに、例えば本明細書中において記述されたように共焦顕微鏡または免疫電子
顕微鏡によって証明され得る好中球の核包膜に位置することにより評価される。
さらにもっと好ましくは、UCpANCA材料は、12%のSDS-PAGE上で分子量約60,000
ダルトンのFabである。
本発明は本発明のヘテロ二量体UCpANCA材料をコードするジシストロニックフ
ァージミド発現ベクターを提供する。
そのUCpANCAのVH- およびVL-ポリペプチドをコードする相同DNAは多量に生産
され得るので、ジシストロニックファージミド発現ベクターから摘出した、そし
て当該分野の周知な方法により配列決定する、本発明に従って生産されたUCpANC
A材料は核酸配列と構成ポリペプチドをコードする導きだされたアミノ酸配列に
よって定義され得る。実施例のなかでより詳細に記述されるように、10個の分離
したUCpANCA材料のクローンをコードしたファージミドがBstN1により消化されそ
してアガロースゲル電気泳動によって解析された時、2個の一貫した制限パター
ンが検出された。
これらの2パターン(5-3および5-4)に表されたクローンは直接DNAシーケンシ
ングにより解析された。クローン5-3および5-4のVHポリペプチドの核酸配列は、
それぞれSEQ ID NO:1および3に供給される。クローン5-3および5-4のVLポリペプ
チドの核酸配列は、それぞれSEQ ID NO:5および7に供給される。V、D、および
Jセグメントの配列は分離して、標準コンピューター方法論を使い、以前に報告
されたgermlineおよび再分類されたIg遺伝子と相同性が解析された。図3はクロ
ーン5-3、5-4とそれらのもっとも近いgermline対間とのアミノ酸配列の比較を提
供する。クローン5-3はJH3の3個のヌクレオチドと2個のアミノ酸を置換、Jκ1の
2個のヌクレオチドを置換して使う。クローン5-4はJH6を1個のサイレントヌクレ
オチドを置換、Jκ3の2個のヌクレオチドを置換、結果的に1個のアミノ酸を代え
て使う。クローン5-3および5-4により利用される多様性セグメントは指定されな
かった。接合セグメントの使用のこれらの違いにもかかわらず、クローンは重鎖
と軽鎖可変セグメントで高い程度の相同性を表す。クローン5-3および5-4の両方
ともVA27と称するVκセグメントを使い、これはそれぞれ14および9個のアミノ酸
置換を伴う。クローン5-3および5-4はまたDP49(1.9III遺伝子同族体)と称する
VHセグメントを使い、これはそれぞれ12個のアミノ酸置換して。VH CDR2の新し
い共有配列、特にその中に含む高電荷RKKK、そしてこのセグメントの高い置換と
サイレントの比(表5参照)は、これが抗原認識に重要と示す。
よって、熟練者は本明細書中において供給されたUCpANCA材料およびUCpANCAポリ
ペプチドの例示的な配列情報を評価するだろう、特にSEQ ID NOs.1から8までに
発表されたような、熟練者に周知な方法によって再工作され得る、例えばCDR移
植、ポイント変異などのような技術により、本明細書中において記述された発明
の基本的および新しい将来から離れることなく、多のUCpANCA材料およびUCpANCA
ポリペプチドを作成するように。したがって、新しいUCpANCA材料およびUCpANCA
ポリペプチドは異なった配列をもって作成され得る、配列ID一覧に与えられた配
列特異性を破壊することはないというより、そしてたぶんより進歩させる、UCpA
NCA材料およびUCpANCAポリペプチドの免疫反応の特徴を。
例えば、本発明は、以下にSEQ ID NOs.1から8を参照して定義される、UCpANCA
材料およびUCpANCA材料のポリペプチドを提供する。当業者は評価するだろう、
本発明のUCpANCA抗体材料、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドの配列の供
給したことを、そのような組成の追加の実施態様は形成され得る、本明細書中に
おいて特に表された配列に大体同等のアミノ酸残基配列をもつ、機能的に似てい
る残基と一かそれ以上の残基の単に保守的な置換をつくることによって、および
本明細書中において記述したように組成を真似る能力を示す。保守的な置換の例
は含む、一個の非極性分子(疎水)残基、イソロイシン、バリン、ロイシン、ま
たはメチオニンを他に置換、一個の極性分子(親水)残基を他に、アルギニン、
リジン間、グルタミン、アスパラギン間、グリシン、セリン間などの置換、また
は一個のアルカリ性残基、リジン、アルギニンまたはヒスチジンを他に、または
一個の酸性残基、アスパラギン酸、グルタミン酸を他に置換。
「保守的な置換」という句は化学的に誘導された残基の使用も含む、非誘導残
基の代わりに供給した、そのようなポリペプチドが必須の結合活性を表示する。
「化学的誘導」は言及する、主体のポリペプチドが一個かそれ以上の機能的な
サイドグループの反応によって化学的に得られた残基をもっている。そのような
得られた分子は含む、例えば、形成するために自由なアミノグループが得られた
それらの分子、塩化アミン、p-トルエンスルホニルグループ、カルボベンゾキシ
グループ、t-ブチルオキシカルボニルグループ、クロロアセチルグループ、また
はホルミルグループ。自由なカルボキシグループは塩、メチルおよびエチルエス
テルまたは他のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成するために得られるだ
ろう。自由なヒドロキシルグループはO-アシルまたはO-アルキル誘導体を形成の
ため得られるだろう。ヒスチジンのイミダゾール窒素はN-im-ベンジルヒスチジ
ン形成のため得られるだろう。また化学的誘導に含まれるものは、自然に発生す
る20の標準アミノ酸のアミノ酸誘導体を含むそれらのペプチドである。例えば:
4-ヒドロキシプロリンはプロリンのために置換されるだろう;5-ヒドロキシリジ
ンはリジンのために置換されるだろう;3-メチルヒスチジンはヒスチジンのため
に置換されるだろう;ホモセリンはセリンのために置換されるだろう;そしてオ
ルニチンはリジンのために置換されるだろう。本発明のポリペプチドもまた一個
かそれ以上の配列が本明細書中においてに表さているポリペプチドの配列に関連
する残基の付加および/または欠失をもっているポリペプチドを含む、必須の活
性を維持するかぎり。
そこには供給された単離されたおよび/または組換え型UCpANCAポリペプチドが
ある、少なくとも一つの免疫グロブリン重鎖(“VHセグメント”)の可変セグメ
ントを含む、その中に骨格部位を含むVHセグメント、相補性決定部位I(“CDRH
I”)および相補性決定部位II(“CDRHII”)そしてその中にCDRHIは大体同じ
アミノ酸配列をもつ、とSEQ ID No:2の33残基から37またはSEQ ID No:4の32残基
から36、および/またはその中にCDRHIIはもつ、SEQ ID No:2の52残基から68また
はSEQ ID No:4の51残基から67と大体同じアミノ酸配列を、および/またはその中
にVHセグメントはもつ、SEQ ID No:2の6残基から100またはSEQ ID No:4の6残基
から99と大体同じアミノ酸配列を。もっと好ましくは、CDRHIはSEQ ID No:2の3
3残基から37またはSEQ ID No:4の32残基から36と同じアミノ酸配列をもつ、およ
び/またはCDRHIIはSEQ ID No:2の33残基から37またはSEQ ID No:4の51残基から6
7と同じアミノ酸配列をもつ、および/またはVH SEQ ID No:2の1残基から95また
はSEQ ID No:4の6残基から99と同じアミノ酸配列をもつ。
UCpANCA材料のこれらのポリペプチドの他の実施態様の中にポリペプチドが供
給される、免疫グロブリン重鎖接合セグメント(“JHセグメンド”)および多様
性セグメントをさらに含む、その中で少なくとも、JHセグメントの一部および多
様性セグメントの一部が相補性決定部位III(“CDRHIII”)を定義する、そして
その中にCDRHIIIのアミノ酸配列は大体同じ、またはもっと好ましくは、SEQ ID
No:2の101残基から109またはSEQ ID No:4の100残基から120のアミノ酸配列と同
じ。
本発明の他の実施態様の中に、そこに供給される、単離される、大体純粋、お
よび/または組換え型免疫グロブリン重鎖ポリペプチドはSEQ ID No:2またはSEQ
ID No:4と大体同じアミノ酸配列をもっている、またはもっと好めばSEQ ID No:2
またはSEQ ID No:4と同じアミノ酸配列。
免疫グロブリン重鎖セグメントの部位を含むこれらのポリペプチドのどれでも
一部になり得る、例えば、Fdポリペプチド、Fab、Fab'、F(ab')2の免疫グロブリ
ン重鎖、抗体およびそのようなもの。
そこに供給される、単離される、大体純粋、および/または組換え型ポリペプ
チド、少なくとも一つの免疫グロブリンκ軽鎖(“Vκセグメンド”)の可変セ
グメントを含む、その中に骨格部位を含むVκセグメント、相補性決定部位I
(“CDRκI”)および相補性決定部位II(“CDRκI”)そしてその中にCDRκII
は大体同じアミノ酸配列をもつ、SEQ ID No:6またはSEQ ID No:8の23残基から34
と、および/またはその中にCDRκIIはもつ、SEQ ID No:6またはSEQ ID No:8の50
残基から56と大体同じアミノ酸配列を、もっと好ましくは、CDRκIはSEQ ID No:
6またはSEQ ID No:8の23残基から34と同じアミノ酸配列をもつ、および/または
その中にCDRκIIはSEQ ID No:6またはSEQ ID No:8の50残基から56と同じアミノ
酸配列をもつ。
しかし、単離された、大体純粋な他の実施態様の中、および/またはUCpANCA材
料の組換え型ポリペプチド、供給されたポリペプチドがある、さらに免疫グロブ
リンκ軽鎖接合セグメント(“Jκセグメンド”)を含む,その中で少なくとも
、JHセグメントの一部および多様性セグメントの一部が相補性決定部位III(“C
DRκIII”)を定義する、そしてその中にCDRκIIIのアミノ酸配列はSEQ ID No:6
の89残基から97またはSEQ ID No:8の89残基から98と大体同じ、またはもっと好
ましくは、SEQ ID No:6の89残基から97またはSEQ ID No:8の89残基から98のアミ
ノ酸配列と同じ。
本発明の他の実施態様の中に、そこに供給される、単離される、大体純粋、お
よび/または組換え型免疫グロブリンκ軽鎖ポリペプチドはSEQ ID No:6またはSE
Q ID No:8と大体同じアミノ酸配列をもっている、またはもっと好めばSEQ ID No
:6またはSEQ ID No8と同じアミノ酸配列。
免疫グロブリン軽鎖セグメントの部位を含むこれらのポリペプチドのどれでも
一部になり得る、例えば、免疫グロブリン軽鎖、Fab、Fab'、F(ab')2の免疫グロ
ブリン軽鎖、抗体およびそのようなもの。好ましくは、免疫グロブリン軽鎖セグ
メントを含むこれらのポリペプチドは二量体抗体材料に結合される、好ましくは
、免疫グロブリン重鎖セグメントの部位を含む本発明のポリペプチドといっしょ
に。よりもっと好まれるのは、UCpANCAポリペプチド一つ、または他のポリペプ
チドとの結合、いくらかの本発明のUCpANCA材料の免疫反応のいくらかの部分を
少なくとも保持する。よって、本発明は提供する、好中球の核抗原と免疫反応と
して評価されたUCpANCAポリペプチド、その中に免疫反応は評価される、アルコ
ール固定化好中球IIFアッセイの中で形成された核周囲染色パターンによって、
その
中で免疫反応は評価される、DNaseとアルコール固定された好中球の前処理によ
って崩壊させられて、および/またはその中で免疫反応は評価される、好中球の
核包膜に位置することにより。
本発明によりまた供給されるのは、一本鎖および二本鎖cDNAまたはRNAの型の
核酸である、現研究のポリペプチドおよび抗体材料をコードする。これらの核酸
はベクターに取り込まれ得る。現在、現研究で好まれるベクターは、ジシストロ
ニックファージミド発現ベクターである、そのような例えば、pComb3。付加した
ベクター、本明細書中において有用な、はウイルスである、そのような、バキュ
ロウイルスおよびレトロウイルス、コスミド、プラスミドおよびそのようなもの
。核酸はゲノムベクターの中に挿入される、当該分野において周知な方法により
。例えば、インサートおよびベクターDNAは両方制限酵素にさらされ得る、両方
の分子に相補末端を造るために、お互いの塩基対およびそれから連結反応で一緒
に結合される。他に、ベクターDNAで制限部位に相当する合成核酸リンカーがイ
ンサートDNAに結合され得る、それから独特なヌクレオチド配列を認める制限酵
素によって消化される。つけ加えて、終結コドンを含むオリゴヌクレオチドおよ
び妥当な制限部位がインサートのために結合され得る、次に続くいくらかまたは
全てを含むベクターの中に、例えば、選択マーカー遺伝子、ネオマイシン遺伝子
のような、哺乳類細胞の中の安定したまたは過度のトランスフェクタントの選択
のための; ヒトCMVの即時初期遺伝子からのエンハンサー/プロモーター配列、
転写の高レベルのための;SV40からの転写終了およびRNAプロセッシング信号、m
RNA安定性のため;複製のSV40ポリオーマ複製開始点および正しいエピソームの
複製のためのColE1;多方面に向くマルチプルクローニング部位;およびセンス
およびアンチセンスRNAのin vtro転写のためのT7およびSP6プロモーター。他の
手段も有効そして容易に近づくかれ得る、それらの当該分野の技術により。
また供給されるのは、発現ベクター、UCpANCAポリペプチドまたは抗体材料を
コードするcDNA分子を含む、発現のために適合した、細菌細胞、酵母細胞、哺乳
類細胞および他の動物細胞の中で。そのベクターはつけ加えて含む、細菌細胞、
酵母細胞、哺乳類または動物細胞の中でDNAの発現のために必要な調節因子を、
それで位置された、UCpANCAポリペプチドコードするDNAに関係のある、そこで発
現を許可するように。発現に要求される調節因子は含む、RNAポリメラーゼに結
合するためのプロモーター配列およびリボゾーム結合のための開始配列。例えば
、細菌の発現ベクターは含む、lacプロモーターのようなプロモーターおよび転
写開始のための、シャイン−ダルガルノ配列および開始コドンAUG(Ausubelら、
supra 1993)。同じように、真核生物発現ベクターは含む、RNAポリメラーゼII
のための非相同または相同プロモーター下流ポリアデニル化信号、開始コドンAU
G、およびリボゾーム脱離のための終始コドン。そのようなベクターは手に入れ
得る、市販または配列の生産物、当該分野の周知な方法で記述された、例えば、
上記に記述された方法、一般にベクター生産物のための。発現ベクターはポリペ
プチドを発現する細胞を生産するのに有用である。
本発明は提供する、UCpANCA VLまたはVHポリペプチドをコードするcDNAを含む
ファージミド発現ベクターも、好ましくは両方、例えば、UCpANCA材料。任意で
、VLまたはVHポリペプチドをコードするcDNAは作用的に上流に結合されるそして
好ましくは下流の翻訳可能なDNA配列にも、交互に作用的に結合される、個々の
上流および下流DNA発現調節配列に、その中に原核生物分泌信号をコードする上
流の翻訳可能DNA、好ましくはpelB、および繊維状ファージ外被タンパク質膜固
定をコードする下流の翻訳可能DNA、好ましくは、cpIII膜固定。さらにもっと好
ましくは、ファージミド発現ベクターはpComb3。
本発明の他の実施態様の中、供給される、原核生物細胞、好ましくはE.coli
、UCpANCA VLまたはVHポリペプチドをコードするcDNA含むファージミド発現ベク
ターを含む、好ましくは両方、例えば、UCpANCA材料。
本発明は提供する、UCpANCAポリペプチドまたは抗体材料をコードするcDNA含
む哺乳類細胞も。一つの実施例は哺乳類細胞の中で発現するために適合したプラ
スミドを含む哺乳類細胞である。そのプラスミドは含む、UCpANCAポリペプチド
およびポリペプチド発現に必要な調節因子をコードするcDNA。さまざまな哺乳類
細胞は宿主を利用するだろう、例えば含む、マウス繊維芽細胞NIH3T3、CHO細胞
、HeLa細胞、Ltk-細胞、など。上述されたような発現プラスミドは哺乳類細胞に
トランスフェクトするために使用され得る、当該分野で周知な方法により、例え
ば、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキスロラン、エレククトロポレーション、
マイ
クロインジェクション、リポフェクション、およびそのようなもの。
本発明はさらに提供する、繊維状ファージ粒子UCpANCA材料を含むタンパク質
性繊維状ファージ外被を含む繊維状ファージ粒子、UCpANCA材料は含まされる、
少なくとも一つのUCpANCA VLまたはVHポリペプチド、ファージ外被の表面の中に
組み換えられる、繊維状ファージ外被タンパク質膜固定領域を介して、少なくと
も一つのUCpANCA材料のポリペプチドに融合される。好ましくは、そのファージ
外被はカプセルに入れている、UCpANCA材料を作成するポリペプチドをコードす
るゲノムを。
本発明の好まれる繊維状ファージはヘテロ二量体UCpANCA VLポリペプチドを含
むヘテロ二量体UCpANCA材料を含む、および繊維状ファージ外被タンパク質膜固
定に融合されたUCpANCA VHポリペプチド、UCpANCA VH融合タンパク質を形成して
、その中にUCpANCA VH融合タンパク質の膜固定部分はファージ外被の中に組み換
えられた、そしてUCpANCA VH融合タンパク質のVHポリペプチド部分はUCpANCA VL
ポリペプチドと結合する、もしそうでなければ自由である、水溶性一量体。異な
って表すと、UCpANCA VH融合タンパク質のVHポリペプチド部分はおよびUCpANCA
VLは自然組立てをできる、機能的、ヘテロ二量体UCpANCA材料の中に、ファージ
の外表面上に発現される、ある意味でUCpANCA抗原に近づきやすい、例えば、そ
れらはファージの中に表面組み換えされる。
水溶性による、その意味は未固定である、結合していない、自由、融合タンパ
ク質でない、融合ポリペプチドでない、結ばれていない、インターサブユニット
結合をもっている二量体の処理により固定状態から解放できる、二つのシステイ
ン間のジスルフィド結合のような、およびそのようなもの。したがって、水溶性
という言葉は非相同ポリペプチドを定義する、本発明で膜固定なしで発現された
、他の水溶性一量体または固定された一量体に結合するのは自由である。つけ加
えて、水溶性という言葉はまた非相同ポリペプチドを定義する、二量体から解放
された、二量体の還元剤への露出により、ベーターメルカプトエタノールのよう
な、一量体サブユニットの分離になる。
ヘテロ二量体UCpANCA材料の表面組み換えは供給される、そこに融合された繊
維状ファージ外被タンパク質固定領域の存在により。好ましくは、外被タンパク
質はcpIIIおよびcpVIIIから成るグループから選択される。本明細書中において
記述された好まれる実施態様の中で、繊維状ファージ外被タンパク質固定はcpII
Iである。しかしながら、cpIIIが使用される場合、ファージ外被の大部分はヘテ
ロ二量体UCpANCA材料に覆われる。cpIIIが膜固定として使用される場合、ヘテロ
二量体UCpANCA材料はファージ粒子の一つの末端に位置される。
J.UCpANCA材料を使用するための方法
1.診断のシステム
本発明は診断のシステムも記述する、好ましくはキットの形で、ヒトのUCpANC
A血清の存在の定量の、それによって医師のUC診断を助ける。多量のモノクロー
ナルUCpANCA材料は生産される、上記に記述された方法にしたがって、それらの
まさしく性質は特によく適合する、標準試薬として使用される、免疫診断定量お
よびUC診断のキットの中で。例えば、アルコール固定化好中球IIFアッセイはpAN
CAの存在を検出するための型式的な定量である、UCをもっていると憶測される患
者の血清の中の。本発明のUCpANCA材料の標準試薬としての使用は提供するであ
ろう、UCに関連したpANCA染色パターンのための信頼できるポジティブコントロ
ールを。その上、共焦点顕微鏡はpANCA血清の存在を検出する方法を提供する、
それによりUCを示唆する。UCpANCA材料は標準試薬としての使用され得る、信頼
できるポジティブコントロールを提供するために、好中球の核内部の免疫複合体
の位置を確認するために。
本発明の適切なキットは含む、例えば、少なくとも一つの定量に必要な量、UC
pANCA材料、好ましくは、分けてパッケージされた試薬としてIgGアイソタイプの
モノクローナルUCpANCA。好ましくは、そのキットは次のどれか一つまたはそれ
以上もまた含む、少なくとも一つの定量に必要な量で;好中球、DNase、Dnase処
理された好中球、検出可能なマーカー、酵素基質、抗IgG、およびそのようなも
の。つけ加えて、補助的な試薬のような他の成分を含むだろう、例えば、安定剤
、緩衝液、固定液、およびそのようなもの。
「使用の指示書」は典型的に含む、試薬濃度を記述した明白な表示、または少
なくとも一つの定量方法パラメーター、試薬の相当する量のような、および混合
されるためのサンプル、試薬の維持期間/サンプル混合液、温度、緩衝液条件お
よびそのようなもの。
その好中球は、例えば、頑丈な土台を形成するために頑丈なマトリックスには
りつけられ得る、従属の診断システムの中のパッケージを含む。試薬は典型的に
液体培地からの吸収により頑丈なマトリックにはりつけられる。有用な頑丈なマ
トリックは当該分野においても周知である。
UCpANCA材料、好中球、ラベルされた特異結合物質、Dnaseおよびそのようなも
の、本明細書中において記述されたどのキットの、は液体で供給され得る、液体
分散またはしっかりとした乾燥粉として、例えば、凍結乾燥された型で。示唆さ
れた手段が酵素の場合、その酵素の基質も供給され得る、システムの分かれたパ
ッケージの中に。
そのキットに関して本明細書中において議論されたパッケージ材料はキットで
習慣的に利用さえる、および市販で入手できる。「パッケージ」という語句は頑
丈なマトリックまたは材料に相当する、ガラス、プラスチックのような(例えば
、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリカーボネート)、紙、ホイルおよ
びそのような固定された区域の中に診断試薬を保つことができる、タンパク質、
ポリペプチド断片、抗体またはモノクローナル抗体のような、本発明の。したが
って、例えば、パッケージはなり得る、瓶、バイアル、プラスチックおよびプラ
スチック箔にラミネートされた包膜に、またはそのような容器、予期される試薬
を含むのに慣れている、またはマイクログラム量の予期される試薬が効力的には
りつけられたマイクロタイタープレートウェルにもなり得る、例えば、検出され
る抗体またはポリペプチドにより免疫的に結合させられることのできるように結
合した。
2.UCpANCA抗原の単離および評価
本発明のUCpANCA材料はUCpANCA抗原の単離、評価およびクローニングにもまた
適している。よって、本発明は単離の方法を提供する、好中球細胞溶菌液に接触
している、UCpANCA材料を含む抗原のような、UCpANCA材料を含む免疫複合体を形
成するために適する時間、温度およびpH、それから、非複合体細胞溶菌液から免
疫複合体を単離する、および抗原からUCpANCA材料を単離する。
現在好まれる実施態様の中で、その5-3組み換えUCpANCAFabクローンは利用さ
れる、UCpANCA反応抗原を評価、単離およびクローンするために、免疫親和性精
製により。この技術はタンパク質の単離のための最も強力な方法の一つである、
そして一段階で1,000-10,000倍の精製を認める。この技術はよく記録されている
、抗体:実験マニュアル(Antibodies: A laboratory manual)の13章に、Harlo
wおよびLaneによる、Cold Spring Harbor Laboratories、(1989)、参照として本
明細書中において援用される。そのステップはかかわる、抗体または抗体材料利
用をするのに、頑丈な基質に反応抗原を結合するために、汚染しているタンパク
質を洗い流す、そしてそれから選択的に抗原を取り除く。たくさんの型の変化は
これを完成させるために利用され得る;一つのそのような例は次につづく。
好中球は本明細書中において記述されたように単離した、それから氷上で可溶
化された、リン酸緩衝液食塩水の中で1%NP-40と。その溶菌液は300 X gで遠心分
離される、そしてその核分画ペレットは集められる。(UCpANCA抗原を含んでい
る)その5-3組み換えUCpANCAFabクローンはその核分画と一緒に氷上でインキュ
ベートされる、5-3 UCpANCAFab免疫複合体と抗原の形成を許すために。その抗原
-抗体複合体はDNaseI消化により可溶化される、そしてその可溶化された複合体
はNi-NTAとアフィニティークロマトグラフィーにより単離される。(Hochuli,E
.,Piesecki,S.(1992):ヘキサヒスチジン融合タンパク質とニトロロトリ酢酸
キレート化Ni2+イオンの相互作用。方法4:68-72,参照として本明細書中におい
て援用される)単離された抗原の分子量はSDS-PAGEにより査定される。この情報
により、そのプロトコールは予備の抗原液のためにスケールアップされる。
単離されたタンパク質のマイクロシーケンシングは縮退オリゴヌクレオチドプ
ライマー設計のために使用される、そしてこれらは骨髄または好中球細胞線cDNA
ライブラリからの遺伝子のPCRクローニングに使用される。(Goldsborough,A.
,Ashworth,A.,Willison,K.,Nucleic Acids Res 18:1634(1990),参照とし
て本明細書中において援用される。他に、UCpANCA抗原のクローニングは行われ
た、骨髄または好中球細胞線cDNAライブラリから得られた発現cDNAライブラリの
直接スクリーニングにより。Aruffo,A.,Seed,B.,Proc Natl Acad Sci US
A 84:8573-8577(1987)を参照、参照として本明細書中において援用される。これ
らの発現クローンは適切な量のUCpANCA抗原の源を提供する、UCpANCA抗原の市販
に利用できる量の生産のための、診断のおよび他の市販目的のための。
本発明はより詳細に記述されるだろう、次につづく制限されない実施例に言及
されることにより。実施例
実施例1-PBLの単離
抹消血液リンパ球(PBL)は17人UC患者からのFicoll-Hypaqueフラクションに
より直接単離された、pANCA生産の解析のために。17人すべてのこれらのUC患者
は好中球ELISAによりpANCAのセロポジティブだった、16人はpANCA染色パターン
を説明した、およびその他はcANCA染色パターンを見せた、固定化間接免疫蛍光
アッセイ(IIFassay)により。
より具体的に、31.8 gFicoll400(Pharmacia,Sweden)は400 mlの脱イオン水と
結合された、溶けるまでゆるやかに振とうされた、および100 mlの50% sodium d
iatrizoate hypaque(UCLA Pharmacy,Los Angeles,California)が加えられ混ぜ
られた。比重は比重計により確認された。それは1.077-1.080であるはずである
、好ましくは1.080。そのFicoll-Hypaque水溶液はそれから0.22または0.45μmの
bottle topフィルターに通してフィルター滅菌する。Ficoll-Hypaque水溶液は光
からまもられて4℃で保存され得る。
Ficoll-Hypaque水溶液(15ml)は50 mlのコニカル遠心管に注がれる、注意深く3
0 mlのヘパリン添加血液をかぶせる、および1000 X g(2000 RPM)で20分間遠心
分離する。セロロジックピペットまたはパスツールピペットを使い界面が取り除
かれる、50 mlのコニカル遠心管に置かれる、および少なくとも等量のHanks' Ba
lanced Salt Solution(HBBS)により希釈される(Irvine Scientific,Santa Ana
,California)。その希釈された界面は400 X g(1200 RPM)で5分間遠心分離され
、および上清がデカントされる。そのペレットは50 ml HBSSに再懸濁される。遠
心分離および再懸濁は二回繰り返される、およびそのPBLはRPMI 1640(Irvine Sc
ientific,Santa Ana,California)+5% ウシ胎児血清(GIBCO,Gahtersberg,
Maryland)に再懸濁される。
実施例2-LPLの単離
リンパ球は単離された、propriaの薄膜の炎症領域の生検組織から、高タイタ
ー血清pANCAをもつ患者から。生検組織は切り刻まれる、およびそれから37 ℃で
30分間滅菌培養培地の中で(RPMI 1640,10% FCS,および抗生物質)培養される、2
0 μg/mlのコラゲナーゼ、20 μg/ml のヒアルロニダーゼおよび0.1%のDNaseと
いっしょに。組織はそれから曇った懸濁液が得られるまで18ゲージ針を通して滴
定される。洗浄の後、その結果できた単一の細胞懸濁液は単核細胞を得るために
Ficoll-Hypaque勾配上で遠心分離される。
外科的切除のため、組織は付着破片を取り除くために食塩水中で洗われ、およ
び粘膜は下にある層から切開される。上被層を取り除くために、小さい粘膜の切
片(1 X 3cm)は振とう恒温漕で培養される、Ca2+/Mg2+フリーのHanks’Balanced
Salt Solution(“HBBS”)と1 mMEDTAと抗生物質との中で、連続して培地を換
えながら。その残りの組織は切り刻まれるおよび消化される、HBSSと0.5 mg/ml
のコラゲナーゼ、1 mg/mlのヒアルロニダーゼの中で、それから生検試料として
加工される。
単離されたリンパ球は37 ℃で12日間培養される、5%CO2:95%空気の湿らせ
た大気中で、2 X 106cells/mlの濃度で、RPMI 1640中で(Irvine Scientific,Sa
nta Ana,California)、10%ウシ胎児血清に補足されて。
実施例3-好中球の単離
好中球は普通の個体の抹消血液から単離された、Ficoll-Hypaque勾配遠心分離
により(比重 1.080)、デキストラン沈降につづかれて。
よって、実施例1に記述されたように用意されたFicoll-Hypaque水溶液(15ml
)は、50 mlのコニカル遠心管に注がれる、注意深く30 mlヘパリン添加血液でか
ぶせる、および1000 X g(2000 RPM)で20分間遠心分離する。その上清は注意深く
赤血球細胞のペレットから取り除かれる、10 mlの6%デキストランが15 mlのペレ
ットに加えられる、および1X HBSSで50 mlに仕上げられる。そのペレットは
再懸濁される、およびそれから赤血球細胞は置かれることを許される、約45分か
ら1時間。上清は分離される、1X HBSSで50 mlに仕上げられる、および5分間1800
rpmで遠心分離される。その上清はデカントされるおよびペレットはたたかれる
。残りの赤血球細胞は9 mlの脱イオン水を加えることにより低張的に溶かされる
、渦巻く、それから10X HBSSを1 ml加え、およびただちに1X HBSSで50 mlに希釈
する。その溶けた細胞は5分間1000 rpmで遠心分離される。その上清は捨てられ
る、および好中球ペレットは15 mlの1X HBSS に再懸濁される。
実施例4-好中球のマイクロタイタープレート上の固定化とアルコール固定
単離された好中球は2.5 X 106cells per mlを得るために適当な量の1X HBSSに
再懸濁される。0.1 mlの細胞懸濁液は96-well microtiter Immulon 1TMまたはIT
nmulonTMplate(Dynatech Laboratories of Chantilly,Virginia)のそれぞれ
のウェルに加えられる、およびその細胞は30-60分間置くことを許される。その
上清は真空につながれた8チャンネル多岐管で取り除かれた、およびプレートは
空気乾燥された(約2時間)または乾燥するために層流フードの格子の上にさか
さまにさる(約10分間)。
好中球はアルコールに固定される、ウェルにつき0.1 mlの100%メタノールの
中で10分間細胞を培養することにより。そのメタノールはそれから捨てられる、
およびそのプレートは空気乾燥される。-20 ℃で保存する。すべての好中球プレ
ートは用意の2週間以内に使用された。
実施例5-好中球ELISA
以下の「好中球ELISA」は本明細書中において記述されたいくらかのサンプル
上で行われた、好中球に特異性をもつANCAまたは抗体材料の存在を検出または確
認するために。
ウェルは1時間リン酸緩衝液食塩水(“PBS”)中で0.25%BSAでブロックされ
た。リンパ球、形質転換細胞、血清または他のテストサンプルからの上清は、本
明細書中において記述されたように、PBS+0.5% Tween 20で希釈された、および
実施例4にしたがって用意されたウェルに加えられた、1時間培養された、およ
びそれから5回0.5%Tween-PBSで洗浄された。プレートはそれから展開された、P
BS-0.5%Tweenで1/1000希釈されたアルカリーホスフォターゼ接合ヤギF(ab')2抗
ヒトIgG特異抗体(Pierce)をそれぞれのウェルに加えることにより、および1時間
培養することを許した。ウェルは0.5%PBS-Tweenで5回、およびそれからTris-Na
Cl(50 mM Tris,/50 mM NaCl,pH7.5)で3回洗浄された。免疫複合体はp-ニトロ
フェニルリン酸(一錠、Sigma 104 pnPP per 5 ml 10% ジエタノールアミン,1m
M MgCl2,pH9.8)で検出された。吸光度はBioradまたは Particle Data ELISA re
aderを使って405nmで測定された。
実施例6-好中球抗原ELISA
ELISA型は、好中球を固定するための抗体および抗体材料の結合のための抗原
源は、次につづく好中球の細胞質構成要の素存在の結果であるかどうか決定する
ためにもまた使用される:エラスターゼ、カテプシンG、ミエロペルオキシダー
ゼ、およびラクトフェリン。これらの定量は「好中球抗原ELISA」として蓄積さ
れることを調べる。
これらの定量は上記の実施例5で記述された同じプロトコールにしたがって行
われる、マイクロタイタープレートのウェルは4℃で一晩、エラスターゼ、カテ
プシンG、ミエロペルオキシダーゼ、またはラクトフェリンに覆われる、ことを
を除く。ウサギ抗抗原抗体がポジティブコントロールとしてそれぞれの抗原と注
がれる。
実施例7-カッパー捕獲ELISA
UC+の水溶性二量体抗体材料の存在、およびκイソタイプのUCpANCA材料は上清
中でELISAを使い検出および定量された、捕獲κELISAとして本明細書中において
調べられた。
このELISAはマイクロタイタープレートのウェルを標識されていないヤギ抗ヒ
トκIgG(Southern Biotechnology Associates)の1/1000希釈で覆うことにより
行われた、4℃で一晩抗体を含むプレートを培養することにより。残りの段階は
室温で行われた。
ウェルは1時間リン酸緩衝食塩水中の0.25%BSAでブロックされた。PBS+0.5%Tw
een 20で希釈された上清はウェルに加えられた、1時間培養された、およびそれ
から5回0.5%Tween -PBSで洗浄された。プレートはそれから展開された、PBS-0.5
%Tweenで1/1000希釈されたアルカリ−ホスフォターゼ接合ヤギF(ab')2抗ヒトIgG
特異抗体(Pierce)をそれぞれのウェルに加えることにより、および1時間培養す
ることを許した。ウェルは0.5%PBS-Tweenで5回、およびそれからTris-NaCl(50m
M Tris,/50 mM NaCl,pH7.5)で3回洗浄された。免疫複合体はp-ニトロフェニル
リン酸(一錠、Sigma 104 pnPP per 5 ml 10% ジエタノールアミン,1 mM MgCl2
,pH 9.8)で検出された。吸光度はBioradまたは Particle Data ELISA readerを
使って405nmで測定された。
実施例8-好中球のガラススライド上の固定化とアルコール固定
単離された好中球は2.5 X 106cells per mlを得るために適当な量の1X HBSSに
再懸濁される。懸濁液(0.1 ml)中の好中球はガラススライドの上に置かれる、
およびその細胞はサイトスピンを使ってスライドに注がれる、500 rpmで5分間。
その固定化好中球はサンプルを覆うために適切な量の100%メタノール中で10
分間培養することにより固定される。そのスライドは空気乾燥することを許され
る、および-20 ℃で保存され得る。
実施例9-アルコール固定間接免疫蛍光アッセイ
上の実施例8にしたがって用意されたスライドに、0.05 mlのリン酸緩衝食塩
水で1/40希釈された血清、リン酸緩衝食塩水で1/500希釈されたUCpANCA材料また
はUC+のヘテロ二量体抗体材料、または培養されたPBL、MNLまたはLPLの希釈され
てない上清、を加える、および室温で1時間培養することを許される。ブランク
として0.05 mlのリン酸緩衝食塩水が清潔なスライドに加えられる。
三回のPBS-Tweenでの洗浄の後、スライドは、1:1000抗体:リン酸緩衝食塩水
希釈で0.05 mlのヤギF(ab')2抗ヒトIgG抗体材料(Jackson Immuno-Research,We
stgrove,PA)を加えることにより染色された、および室温で1時間培養すること
を許された。非結合抗IgG抗体を取り除くため、スライドにつき約100-250 mlの
リン酸緩衝食塩で洗浄した後、そのスライドは空気乾燥されることを許された、
およびepi蛍光光が備えられた蛍光顕微鏡上で観察された。pANCA染色パターンは
UCpANCAの存在を示唆する。
実施例10-DNase感度アッセイ
DNase感度アッセイはIIFの定量型で行われた。よって、上記の、実施例9で記
述された同じプロトコールに従われた。それからそのプロトコールは同じ源から
得られた二つ目のサンプルのために繰り返された、スライドにサンプルを加える
前を除いて、その好中球はスライドにつきlunitのDNaseIと一緒に培養された、
例えば、DNASCITM(Sigma)、1 ml緩衝液(40 mM Tris-HCI,10 mM NaCl,6 mM Mg
Cl2,10 mM CaCl2,pH7.9)につき37℃で30分間。そのスライドはそれからPBSで
3回洗浄された、そのサンプルは加えられた、およびIIFassayプロトコールの残
りが続けられた。一つ目の好中球の染色パターンと二つ目のDNase処理された好
中球の染色パターンは較べられた、ANCA抗原結合の欠損を検出するために。一つ
目のサンプルのpANCA染色パターンの存在および、二つ目のサンプルのpANCA染色
パターンの欠乏またはcANCA染色パターンの存在は示唆する、サンプル中のUCpAN
CA材料の存在を。
実施例11-共焦点顕微鏡検査
好中球(100,000/スライド)はガラススライド上に室温で30分間置かれた、室
温で10分間1 mlPBSにつき10 mgのパラホルムアルデヒドで固定された、および1
分間-20 ℃で純粋なアセトンと培養された。スライドはそれから空気乾燥された
および-20 ℃で保存された。つけ加えて、その好中球は細胞核は可視化された、
プロピジウムヨウ化物、DNA特異染料との対比染色により。UC患者からの血清、
そのUC患者の細胞は抗体ファージライブラリを用意しるために使用された、およ
びUCpANCA Fab(血清は1/20希釈でおよびFabは1/100希釈で)は室温で1時間、固
定された好中球と培養された。PBS-Tweenとの3回の洗浄の後、免疫複合体は標識
された、好中球と1/1000FITC標識されたヤギF(ab')2抗ヒトIgG特異抗体材料を
室温で1時間、培養することにより。洗浄の後、焦点イメージは取られた、ePi蛍
光光を備えたNikon 200 Diaphot 顕微鏡につなげられた60x対物レンズ(N.A 1.4
.)のついたBio-Rad UV MRC-1000焦点レーザースキャニングシステム上で。その
焦点マイクログラフィックはMitsubishi S3600染料昇華デジタルカラープリンタ
ーでつくらられた。
実施例12-免疫電子顕微鏡検査
好中球は急速冷凍により用意された、分子蒸留により凍結乾燥された、パラホ
ルムアルデヒドにより安定化された、およびLR Goldと浸透された。超薄切片はU
C+血清(1:5および1:10希釈)または普通のコントロール血清と反応させられ
た、および抗原抗体反応は1:100希釈のprotein G-Goldまたはprotein A-Gold(5
nm コロイド金)接合との結合により検出された。protein G-Gold、protein A-
Goldおよび緩衝液コントロールは含まれた。ヒストンへの抗体は核染色のポジテ
ィブコントロールとして使用された。すべての切片は最後にTrump液(1% グルタ
ルアルデヒド/4% パラホルムアルデヒド、pH 7.2)中で固定された、洗浄された
および空気乾燥された。切片は炭素コートされた、および22,000-35,000Xで観察
された、Philip CM 12 電子顕微鏡を使用して、加速電圧40 KVで操作して。
実施例13-ANCAイソタイプの決定
培養されたLPLの上清は総合血清IgGの濃度のために解析された、標準ELISA方
法により。簡単に、マイクロタイタープレート(Costar,Pleasanton, CA)のウ
ェルは一晩(4 ℃)被せられた、カーボネート-バイカーボネート緩衝液、pH 9.
6(Sigma,St.Louis,MO)で希釈されたヤギ抗ヒトIgG(Southern Biotechnolo
gy Associates,Birmingham,AL)と。そのプレートはPBS+0.5% Tween-20で15分
間、3回、リンスされた、および4 ℃で1時間、それぞれの血清サンプルのために
連続した希釈で培養された、3重に定量された、それから4 ℃で1時間、ヤギ抗ヒ
トIgGワサビペルオキシダーゼ(Southern Biotechnology Associates)で染色さ
れた。サンプルは37 ℃で30分間、o-フェニレンジアミン(OPD)ジヒドロクロラ
イド基質(Sigma)と培養された、3-N H2SO4で停止された、およびその吸光度
は492 nmで決定された。IgG標準結合曲線はプールされたヒト血清(Sigma)から
標準精製されたヒトIgGを使用して得られた。そのサンプル値はMacintosh ELISA
program(Biorad,Richmond,CA)を使用し標準曲線に内挿された。
実施例14-ライブラリ構築
UCと診断されたヒトからのLPL細胞の重鎖および軽鎖遺伝子レパートリーのVH-
VL-をコードするする相同DNAライブラリ、およびpANCAのためのセロポジティブ
はランダムに結合された、発現されたおよび、その結果できた抗体材料はファー
ジディスプレイ技術により好中球結合能力のためにふるい分けられた。これらの
可変重鎖および軽鎖ライブラリは、これらのLPLからの可変重鎖および軽鎖のPCR
クローニングにより構築された。これらのライブラリからのその同族体は、本明
細書中に記述されたように、ランダムにジシストロニックファージミド発現ベク
ターpCom3中に二つ一組にされた、その結果、そのVHポリペプチドおよび繊維状
ファージ外被タンパク質IIIの断片を含む可変重鎖融合タンパク質。E.coliはあ
とで、ヘテロ二量体抗体材料をコードするDNAを含むこれらのベクターと形質転
換された。そのベクターの発現は誘発されたおよびその細胞はヘルパーファージ
と形質転換された。その形質転換されたE.coliから押し出されたファージはヌ
クレオチド配列をコードするベクターDNAを包み込んだ、およびコードされた重
鎖および軽鎖を見せる、遺伝子III固定タンパク質を介してファージ外被に固定
されたFab抗体材料として。このファージミド発現システムは、したがって、一
つのファージ粒子の中で認識と複製の両方の過程をつなぐ。
Parmleyらにより記述されたパンニングと呼ばれる過程の中で、Gene,74: 305
-318(1988)、抗好中球免疫反応をもつヘテロ二量体抗体材料を発現するそのフ
ァージは濃縮および単離される。そのヘテロ二量体抗体材料はそれからさらなる
UCpANCA評価のために定量される、および代表的なUCpANCA Fabをコードする核酸
はシーケンスされる。
VHおよびVLライブラリ生産
免疫グロブリンタンパク質CDRsをコードするヌクレオチド配列は高度に可変で
ある。しかしながら、十分に保存されたヌクレオチド配列を含む軽および重鎖の
V領域に隣接するいくらかの保存された配列領域がある、例えば、同じプライマ
ー配列に対合させるであろう配列。
ポリヌクレオチド合成(“増幅”)プライマー、これらの保存された配列に対
合させる、および生産されたする相同DNA中に制限部位を取り込む、そのする相
同DNAをベクターに結合するのに適する制限部位、が構築された。より具体的に
、結果として生産されたする相同DNAが読み枠中に発現ベクター中に挿入され得
るためにそのプライマーは設計された、指向性連結反応手段を含むベクターの領
域の上流の翻訳可能DNA配列と。本明細書中において記述されたプライマーによ
る増幅が行われた、UCと診断されたヒトおよびpANCAのために血清陽性のLPLから
単離されたトータルRNAから生産されたcDNAテンプレート上で。
VHプライマー
VH領域の増幅のために、プライマーが設計された、方向性ライゲーションに適
合する付着末端をpComb3ファージミド発現ベクターのHc2発現カセットの独特なX
ho IおよびSpe I部位に導入するために。すべての場合、SEQ ID Nosに記入さ
れた5'プライマー:10から16は保存されたN末端領域の一番目の鎖cDNAに相補的
になるよう選ばれる(アンチセンス鎖)。
追加のVH増幅プライマー、独特な3'プライマーを含む、γl重鎖mRNAの一番目
の定常部領域の一部に相補的になるよう設計される(SEQ ID NO: 9)。これらのプ
ライマーは、IgGイソタイプの免疫グロブリン重鎖のVH領域および一番目の定常
部領域からのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むする相同DNAを生産
するであろう。これらの同族体は、したがって、FvよりもFab断片を生産するた
めに使用されるであろう。
追加の独特な3'プライマーは意図する、多のクラスの免疫グロブリン重鎖、Ig
M、IgEおよびIgAのような、の同じような領域に対合するために設計された。他
の3'プライマーは、CHl定常部の特異的なクラスの特異な領域に対合する、およ
びこのプライマーを使って増幅されたVH領域をそれらのVH領域を発現することの
できる発現ベクターに移転するのに適合する、重鎖または軽鎖定常部の異なっ
たクラスと、もまた意図する。
増幅は7の分かれた反応中で行われる、それぞれはSEQ IDs:10から16に示され
た5'プライマーの一つを含む、およびSEQ IDs:9に示された3'プライマーを。そ
の5'プライマーはXho I部位を取り込むおよびその3'プライマーはSpe I制限部位
を取り込む、VHをコードするする相同DNAのpComb3ファージミドHc2発現カセット
への挿入のため。
VLプライマー
VL領域の増幅のために、免疫グロブリン軽鎖の保存された配列に対合する増幅
プライマーが構築される、およびSac Iおよび Xba Iで切断されたpComb 3ファー
ジミド Lc2発現カセットにVLをコードするする相同DNAクローニングするの許す
制限部位が取り込まれる。5'プライマー(SEQ IDs:18から20)は保存されたN末
端領域中のcDNAの一番目の鎖に対合するように設計される。これらのプライマー
はpComb 3ファージミド Lc2発現カセットにVLをコードするする相同DNAがクロー
ンされるのを許すためにSac I制限酵素部位を挿入する。その3'VL増幅プライマ
ー(SEQ IDs:17)はκcDNAの定常部に対合するために設計される、およびpComb
3ファージミド Lc2発現カセットにVLをコードするする相同DNAを挿入するため
に要求されるXba I制限酵素部位を導入するために。これらのプライマーはκイ
ソタイプの免疫グロブリン軽鎖をコードするする相同DNAが生産されることを許
す。これらのプライマーはFvよりもFab断片を生産することを可能にする。
免疫グロブリン軽鎖遺伝子レパートリーの増幅は3の分かれた反応中で行われ
る、それぞれは5'プライマーの一つを含む(SEQ IDs:18から20)および3'プラ
イマーの一つ(SEQ IDs:17)。5'プライマーはSac I制限部位および3'プライマ
ーはXba I制限部位を含む。
ラムダイソタイプのヒト軽鎖可変領域を増幅するため設計された増幅プライマ
ーもまた意図される。
本明細書中に於いて述べた全てのプライマーと合成したポリヌクレオチドはOl
igos等から購入した。(Wilsonville,OR)
VHおよびVLライブラリの構築
全RNAは標準的なグアニジウムイソチオシアナート抽出プロトコルを用いて1.1
5x107リンパ球からから抽出された。例えば、本明細書中で参考として援用する
、Chocynski,P.およびSaochi,N.,Anal.Biochem.162:156-159(1987)をみよ
。PCR増幅のための調製では、上記によって調製されたRNAはプライマー伸長反応
によってcDNAの合成のためのテンプレートとして用いられた。このように、10μ
gRNAは1μgオリゴdTプライマーと10mM dithiothreitol、RNasinTM(RNaseタンパ
ク阻害剤、Promega Corrporation,Madison,WI)、25mM dATP,dCTP,dGTP,dT
TP,1x逆転写緩衝液(Bethesda Research Laboratories,Bethesda,MD)および
2μl(200units)逆転写酵素(Superscript,Bethesda Research Laboratories
)を用いて50μl容で50分42℃に続いて10分室温で一本鎖DNAに逆転写された。5
分90℃の熱処理と氷上10分に続いて1μlのRNaseH(Bethesda Research Laborator
ies)で37℃20分の処理を行った。
上記によって生成した一本鎖DNAはポリメラーゼチェインリアクション(PCR)
法を用いて増幅した。下に示すようなファミリー特異的可変領域とイソタイプ特
異的定常領域プライマーはIgG1 VH1-VH6の重鎖およびκ軽鎖 VL1-VL3 特異的ラ
イブラリをつくるために使われた。
IgG1重鎖定常領域ライブラリ作成のためのプライマー
重鎖可変領域ライブラリ作成のためのプライマー
κ軽鎖定常領域ライブラリ作成のためのプライマー
κ軽鎖可変領域ライブラリ作成のためのプライマー
PCR増幅は逆転写反応生成物(一本鎖cDNAの450μl中、約1μl)、60pmの3’VH
プライマー(SEQ ID NO:9)、60pmの5’プライマー(SEQ ID NO:10から16)、8μl
の25mMのdNTP混合液、10μlの10xPCR緩衝液(Perkin-Elmer),および5unitsのTaq
DNA polymerase(Perkin-Elmer,Norwalk,CT)で100μl反応で行われる。反応混
合物はPerkin-Elmer 9600 thrmocyclerを用いて30サイクルの増幅にかけた。各
増幅はcDNAの94℃15秒の変性、続いて52℃50秒でプライマーのアニーリング、お
よび72℃90秒の増幅を含む。続いて72℃で10分伸長した。効率的で再現性のある
相同DNAの合成は本明細書中に於いて定義されたプライマーで行われた、約680bp
のメジャーなバンドをもつ増幅したVHコードホモログcDNAおよび約660bpのメジ
ャーなバンドをもつ増幅したVκコードホモログcDNAを生成する。
アガロースゲル電気泳動ですべての増幅が成功し同様の産物が得られているの
を照合した後に、VHコードおよびVκコードする相同DNAは別々に蓄えられ0.8
% Seaplaque GTG Agarose(FMC,Rockland,ME)で製品説明書に従ってゲル精製
を行った。
VLをコードする相同DNAのベクターへの連結反応
それぞれ軽鎖プライマー伸長反応からの生成物の等しい一部分はUC+のVLライ
ブラリの蓄積を生成するために混合された。蓄積されたVLライブラリは蓄積さ
れたVLライブラリマイクログラムあたり70unitsのと蓄積されたVLライブ
ラリマイクログラムあたり35unitsのSacIで二重消化された。(全ての制限酵素
はBoeringer-Mannheim,Indianapolis,IN.から入手可能である)消化生成物は
再び上記のようにしてゲル精製され、約660bpが存在するDNA断片を含むゲルの領
域をアガロースから抽出しエタノールで沈殿した。結果、付着末端をもつκ軽鎖
ポリペプチド遺伝子のレパートリーに相当するVL相同DNAはpComb 3 ファージミ
ドLc2発現カセットとの指向性連結反応に適合した。
pComb 3 ファージミドLc2発現カセットに軽鎖相同DNAを挿入する準備を30μg
のファージミドと280unitsのXbaIを160unitsのSacI制限酵素と製品に推奨されて
いる緩衝液の混合によってする。この溶液は37℃に3時間保たれた。溶液は2ml g
lycogen,1/10容3M NaAc,2.5容ethanolで-20℃1時間で沈殿した。それからペレ
ットにして70%エタノールで洗浄した。ペレットは水に再溶解され0.8% 1xTAE
Seplaque 676でゲル精製された。4Kbのバンドが存在し、フェノール抽出、LiCl3
処理およびエタノール沈殿を同様にPCR生成物に行った。
Lc2発現カセットはそれから上記VLコードする相同DNAとの連結反応の準備が
なされた。これらVLコードする相同DNAは直接XbaIとSacIのによって消化された
Lc2発現カセットに挿入された。0.45μg VL相同DNAを1.4μgの消化済みpComb 3
(Scripps Research Institute,La Jolla,California のDr.Carlos BarbasII
Iに提供された。Barbasら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982(1991)は
本明細書中で参考として援用する。)に10units リガーゼを用いて200μl容のな
かで25℃で一昼夜、反応させた。それから65℃15分間保つことによって熱処理し
た(Boehringer-Mannheim)。DNAは沈殿され70%エタノールで洗浄され、15μl 10
mM MgCl2に再懸濁された。
VLライブラリを含んだベクターを用いた宿主の形質転換
Escherichia coli XLI-Blue(Stratagene,La Jolla,CA)は再懸濁されたDNA
でエレクトロポレーションによって形質転換された。1リットルのE.coli OD600=
0.8を4mlまで濃縮してつくったストックの300μlを15μlDNA(=2μg)(連結反
応混合液の全て)でエレクトロポレーションした。形質転換した細胞は100μg/m
l carbenicillinを含んだsuper brothで培養することによってプラスミドの抗生
物質耐性によって選ばれた。ライブラリのサイズは6%バックグラウンド再連結
反応で8.6x107形質転換体だった。
抗生物質耐性コロニーは37℃で液体培養、super broth培地(SB)で増幅された
。(1リットル水中に30g tryptone,20g yeast extract,10g 3[N-Morpoholino]p
ropane-sulfonic acid(Mops)、pH7に合わせた)10μg/ml テトラサイクリン,20
μg/ml カルベニシリン,40mM glucose,10mM MgCl2を追加した)。κVLポリ
ペプチドをコードしたpComb 3 ファージミド("κ-pComb 3 ファージミド")はQ
iagen-tips,Qiagen,Chatsworth,CAのアニオン交換樹脂、を用いて製品説明書
に従って単離された。単離されたκ-pComb 3 ファージミドは1μgκ-pComb 3 フ
ァージミドあたり10unitsのXhoIと3unitsのSpeIで二重消化された反応混合液は
エタノール沈殿され4.7Kbの二重消化ファージミドは前と同じように0.8%Seapla
que TAE ゲルでゲル精製された。κ-pComb 3 ファージミドはこれで重鎖ライブ
ラリとの連結反応をする用意ができた。
VHをコードする相同DNAのベクターへの連結反応および宿主の形質転換
それぞれ重鎖プライマー伸長反応からの生成物の等しい一部分はVHをコード
する相同DNAライブラリの蓄積を生成するために混合された。蓄積されたVHライ
ブラリは蓄積されたVHライブラリはXhoIとSpeIで二重消化され、κpComb 3 フ
ァージミドのHc発現カセットへの連結反応の準備がなされた。しかるべく、蓄積
されたVHライブラリは蓄積されたVHライブラリ1μgあたり70unitsのXhoIと17u
nitsのSpeIによって二重消化された。それから0.40μgの消化された重鎖ライブ
ラリは1.4μgの消化されたκ-pComb 3 ファージミド、上に述べた、に10unitsの
リガーゼを用いて200μlのリガーゼ緩衝液の中で連結された。反応は65℃15分の
熱処理で止められた。DNAは沈殿され、ペレットは15μlの10mM MgCl2に再懸濁さ
れ、E.coli XLI-Blueをエレクトロポレートするのに使われた。エレクトロポレ
ートされた細胞はグルコースを含まなかったのを除いては、上に書いているよう
に補ったSB内で生育した。ライブラリのサイズは重鎖連結反応後に14%バックグ
ラウンド再連結反応で4.9x107形質転換体だった。ベクター内にVHとVLコード
する相同DNAの両方が存在を制限解析で照合すると、7クローン中7個が両方のホ
モログを含んでいた。
エレクトロポレートされたE.coli XLI-Blueの10ml培養はそれから50μg/mlカ
ルベニシリン,10μg/ml テトラサイクリン,10mM MgCl2を補ったSBに移し、その
他の時間でインキュベートされた。培養された細胞は10x12VCS-M13ヘルパーファ
ージ(Stratagene,La Jolla,CA)でファージミドDNAのセンス鎖のコピーの生成
をはじめるために感染させられた。ヘルパーファージの添加後、混合液には50μ
g/ml カルベニシリン,10μg/ml テトラサイクリン,10mM MgCl2を補った100mlの
SBを加えた。ヘルパーファージを含んだ混合液は線状バクテリオファージにそれ
から加えて2時間37℃に、発現したUC+のヘテロ二量体抗体材料がcpIII バクテリ
オファージアンカードメインに溶解し、バクテリオファージのバクテリオファー
ジ粒子の表面に組み込まれるようさせるために、保たれた。2時間後に混合液は
e.coliに感染したヘルパーファージを選ぶため70μg/mlカナマイシンで封じ込め
られ、37℃、300rpmで一晩培養された。ファージはバクテリアの細胞ペレットの
結果として遠心で沈殿され、ファージを含んだ上清は、100μg/mlカルベニシリ
ン LBプレートに塗布されコロニー形成力価単位(CFU)を決定する、。
実施例15-パンニング
24ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルは10x6個の好中球を加えること
によって、メタノールで固定された好中球で覆われた、それらを置いて空気乾燥
しそれから100%メタノールで固定した。各ウェルは37℃で一時間 Tris緩衝塩水
("TBS")内の3%ウシ血清アルブミン("BSN")で固定された。ブロッキング溶液
は取り除かれ、250μl TBS中の5x10x11ファージが加えられ、2時間37℃でイン
キュベートされた。洗浄後、酸溶出し、中和して、溶出されたファージの数がCF
Uによってモニターされた。
溶出させたファージはE.coli XLI-blueに再感染させて増幅した。パンニング/
増幅のサイクルは少なくとも100倍になるまで5回繰り返した。この方法はUCpANC
A材料を生成するためのファージライブラリを豊富にした。豊富な量を量るため
に、もとのライブラリの一部分をファージの回収に於いて普段の変動を制御する
ための富化の各サイクルと平行して再度パンニングした(re-panned)。富化はフ
ァージのon/offの割合で計算し、同じ日に動かした豊富でないライブラリと比較
した。パンニングはまた形式と比べるために96ウェル形式でウェルにつき1011フ
ァージで行われた。
実施例16-UCの可溶性組換え抗好中球抗体材料の調製とライブラリのスクリーニ
ング
可溶性ヘテロ二量体抗体材料の調製は、本質的にFabであり、Qiagen-Tipsを用
いて製品説明書に従ってファージミドの単離は行った。(Qiagen,Chatsworth,C
A)単離されたファージミドはcpIII遺伝子を単離するためにファージミドμgあた
り17unitsのSpeIと50unitsのNheIで消化された。ファージミドDNAはゲル精製お
よび1μgあたり10unitsのリガーゼを用い、反応液を25℃で一晩おくことによっ
て自己連結がなされた。反応は65℃に15分置くことで止められた。200ngゲル精
製断片は20μl容で1μl連結反応混合液とで自己連結し、断片は0℃に於いて2cm
溝カセットの中で2.5kV,25μF,200RでE.coliストックの40μlを用いてエレクト
ロポレーションによってE.coli XLI-Blueを形質転換した。シングルコロニーは1
00μl/ml カルベニシリン,を含むLB寒天培地から拾い上げられ、100μg/ml カ
ルベニシリン,10μg/ml テトラサイクリン,50mM MgCl2を補った10mlのSBで培養
された。培養液は1mM イソプロピル 6-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)(United
States Biochemicals,Cleveland,OH)の添加によって誘導され一晩培養された
。ファージはバクテリアの細胞ペレットの結果として遠心でファージを含んだ上
清と単離された。上清は取り除かれ、上に示した方法でカッパ捕獲 ELISAによっ
て生産されるFabが解析された、検出にはヤギ抗ヒト Fab-アルカリ性フォスファ
ターゼ(Pierce,Rockland,IL)が使われた。豊富な、および非豊富なライブラリ
からそれぞれコロニーが比較のために選ばれた。非豊富なライブラリからの10こ
のコロニーのうち6個がかなりな量のカッパ捕獲 ELISAによって測定されるFabを
生産していた。対照的に豊富なライブラリからの10個のコロニーのうち10個がFa
bを生産していた。この事から豊富なライブラリはFab発現で肯定的に選ばれた事
を示している。
これらのクローンはまた好中球ELISAによって好中球の結合を解析された。非
豊富なライブラリの10のクローンのうち好中球に結合するものは一つもなかった
。それに対して豊富なライブラリからの全てのサンプルは好中球への強い結合を
示した。
豊富なおよび非豊富なライブラリ由来のFabで使われる重鎖および軽鎖の多様
性は単一のFabをコードする4μgのファージミドを20unitsのBSTN1(New England
Biolabs,Beverly,MA)によって消化し3%アガロースゲルで断片を解析する事
によって示される。非豊富なライブラリからの30クローンのそれぞれは独特の制
限パターを示すのに対して、豊富なライブラリからのクローンはたった2つのそ
っくりなパターンを示す。これら2つのパターンの代表的なクローン(5ー3お
よび5ー4)はそれゆえ、直接DNAシークエンスによって解析された。
実施例17-Fabの精製
豊富なライブラリ、非豊富なライブラリの両方はpComb 3からC3AP313H6に転写
され、cpIIIアンカードメインを分離するためにSpeIおよびNheIによって消化し
た後、pComb 3誘導体はカルボキシル末端の6ヒスチジンが溶解した。(C3AP313H
6はScripps Research Institute,La Jolla,CaliforniaのCarlos Barbas IIIに
譲渡していただいた。)ライブラリはpComb 3のHc2およびLc2発現カセットから
VH-およびVL-コードポリヌクレオチドを分離することによって動かされた、続
いてこれらはC3AP313H6に連結された。E.coli XLI-Blueはエレクトロポレーショ
ンによって新しいファージミドで形質転換された。個々のコロニーは100μl/ml
カルベニシリンを含む選択LBプレートで単離された。
豊富なライブラリからの5-3クローンは大規模精製に選ばれた。単一のコロ
ニーが拾われ、10μg/ml テトラサイクリン,50μg/ml カルベニシリン,10mM M
gCl2,40mM glucoseを補った10mlのSBで培養された。菌体はグルコースと分離す
るために遠心でペレットにされ、菌体は50μg/ml カルベニシリン,20mM MgCl2
を含む1リットルのSBに移された。XLI-Blueは37℃300rpmで吸収(OD600)が0.6-
0.8になるまで培養された。菌体はそれから4mM IPTGによってヘテロ二量体抗体
材料を生産するために誘導がかけられ、30℃で一晩培養された。培養された菌体
は遠心でペレットにされ、XLI-Blueは30ml超音波破砕緩衝液(50mM NaPO4,300m
M NaCl2,0.01% NaN3,pH7.9)に懸濁された。再懸濁された細胞は15秒、50%の
破砕力で8回破砕された。(40 watts micro sonic disrupter,Tekmar,Cincinna
ti,OH)
破砕物はBeckman JA-20で15,000rpmで40min、4℃で遠心され、上清は0.45およ
び0.22ミクロン Nytex filter(Amicon,Beverly,MA)で連続的に濾過された。破
砕物はすぐさま20ml/hrで1ml NTA-Ni column(Quagen)に流され、破砕緩衝液で、
代表的には40-50mlで、吸収(OD280)が0.01以下になるまで洗われた。カラムはそ
れから汚染物を分離するために10mlの10mM イミダゾール入り破砕緩衝液で洗わ
れ、続いて100mM,250mM,500mMの各10ml イミダゾールでOD280を見ながら1mlのフ
ラクションが集められた。Fabが抽出される画分を決定するため一部分で12%SDS
-PAGE変性還元ゲルによる解析が行われた。イミダゾール存在のためローディン
グ染料とサンプルは煮沸できないが、代わりにローディングの前に37℃で10min
で変性させた。代表的には、Fab画分は100mM イミダゾール洗浄の最初の3画分に
あった。
Fabを含む1ml画分はそれから、蓄積されPBSに対するAmicon透析膜でイミダゾ
ールを分離するために透析された(6-8kD切り捨て膜)。サンプルは濃縮され遊
離した重鎖と軽鎖がCentricon 50TM(遠心透析膜、Amicon Corporation,Beverl
y,MA)をつかって分離された。
奇妙にも精製画分内の算出された抗体のレベルは全タンパク(Bio-radProtein
Assay,Richmond,CA)対ELISA(抗κ)決定と異なっていた。菌体の培地1リット
ルあたりFab産出は免疫アッセイで約0.1mgであったのに対してプロテインアッセ
イで約1mgであった。ELISA免疫反応を用いたこの研究でのタンパクの用途から、
Fab濃度はELISA法を用いて報告した。
5-3Fabは本明細書中に於いて述べた分析で特徴を決定した。好中球にはELISA
法では強固に結合する(およそ0.1μg/ml)また注目すべきは5-3 UCpANCA Fabは
UC血清に比べ強烈である、最適な結合は1%血清の時に起こる。(またはおよそ0.
1mg/ml全IgG)。およそ1%と見積もられた高度免疫血清が抗原特異的で、陰性pAN
CA IgGはおよそ1μg/mlのレベルで、または一価のFabによる結合の範囲に類似し
ている。
炎症性疾患では、ANCA型マーカー抗体は正確に限定された好中球タンパクに特
異的である。5-3UCpANCA Fabは好中球抗体ELISAでカテスピンG,エラスターゼ,
ミエロペルオキシダーゼおよびラクトフェリンとの反応性を試験された。500ng/
mlまで5-3UCpANCA Fabを上げたが結合は検出されなかった。
5-3UCpANCA FabはまたpANCAの染色パターンからアルコール固定好中球IIFアッ
セイを試験された。5-3UCpANCA Fabによる好中球の免疫蛍光検出は慣習的なUC血
清によって生産されるpANCAの染色パターンと同一であった。5-3UCpANCA Fabの
免疫反応性をDNase感受性で試験するときには、慣習的なpANCA血清陽性UC血清と
のように、好中球のDNase I処理によって、検出可能なpANCAの染色パターンの完
全な欠如が引き起こされる。加えて共焦点顕微鏡は5-3UCpANCA Fabが核膜の内側
に位置する5-3UCpANCA Fab抗体に結合していることを示し、特性はpANCA血清陽
性UC血清に見いだされた。
実施例18-核酸シークエンス
核酸シークエンスは、重鎖、軽鎖の5’、3’プライマー(SEQ ID NOs:21 and
22,SEQ ID NOs: 23 and 24)を用いて5-3、5-4クローンの二重鎖DNAで、Sequen
ase 1.0(United States Biochemicals)で行われた。ホモロジー検索と整列はG
enebankを用いて行われた。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
G01N 33/53 G01N 33/53 D
//(C12P 21/08
C12R 1:91)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CZ,
DE,DK,EE,ES,FI,GB,GE,HU,I
L,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LK
,LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,
MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,R
U,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TR
,TT,UA,UG,UZ,VN
(72)発明者 ブラウン,ジョナサン
アメリカ合衆国 カリフォルニア 91356,
ターザナ,ヒルトン ヘッド ウェイ
3924
(72)発明者 エジェナ,マーク ピー.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 91202,
グレンデール,クリーブランド ロード
1724
(72)発明者 ターガン,ステファン アール.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 90049,
ロサンジェルス,ホームウッド ロード
4281