JPH11506435A

JPH11506435A - 腫瘍特異的抗体を利用する大腸ガンの治療方法

Info

Publication number: JPH11506435A
Application number: JP8535805A
Authority: JP
Inventors: ウェルト，シドニー; オールド，ロイド，ジェイ; バレンズワード，エルスィエ; モンタルト，ニコラス，ジェイ; グア，アリ，オスメイ
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1995-05-25
Filing date: 1996-05-21
Publication date: 1999-06-08
Also published as: US5851526A; EP0831905A1; US5958412A; AU709694B2; EP0831905A4; AU5867996A; WO1996037224A1; CA2221935A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＨＬＡ−Ａ１等のＨＬＡ分子に依るノナペプチドに関する。得られる複合体は、細胞溶解性Ｔ細胞によって同定される。このような認識は、診断又は治療的に利用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍特異的抗体を利用する大腸ガンの治療方法関連出願のクロスリファレンス本出願は、放棄された１９８５年４月１９日出願の米国特許出願第０６／７２４，９９１号の継続出願である、放棄された１９８７年１１月６日出願の米国特許出願第０７／１１８，４１１号の一部継続出願である、放棄された１９８９年３月２３日出願の米国特許出願第０７／３２７，７６５号の継続出願である、放棄された１９９１年３月１８日出願の米国特許出願第０７／６７３，１５３号の継続出願である、継続中の１９９３年２月１６日出願の米国特許出願第０８／０２０，２２３号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、少なくとも一種のモノクローナル抗体を利用して、大腸ガン腫瘍の影響を弱める方法に関する。具体的には結腸直腸ガン（大腸ガン）の治療において、少なくとも一種のモノクローナル抗体が、抗腫瘍剤、ＤＮＡ腫瘍活性を阻害するペプチド、又は、放射性同位元素（ラジオアイソトープ）と結合した形で利用される。本発明はさらに、腫瘍細胞のＤＮＡに遺伝物質を運ぶ（伝える）方法、及び、大腸腫瘍細胞の核に抗ガン剤を運ぶ（伝える）方法、そして、大腸ガン細胞上にみられる抗原であるＡ３３抗原に特異的なモノクローナル抗体に関する。発明の背景結腸直腸ガン（大腸ガン）は悪性腫瘍性の疾患である。西洋、特に米国における結腸直腸ガンの発病率は高い。このタイプの腫瘍はしばしばリンパ管及び血管を介して転移する。結腸直腸ガンをわずらう多くの患者が結局この疾患によって死亡する。事実、米国だけで、毎年６２０００人が結腸直腸ガンによって死亡していると見積もられている。今日まで、結腸直腸ガンの治療のための、全身療法及び化学療法が開発されてきた。しかしながら、転移疾患を伴う結腸直腸ガン患者の生存を、いくらかの確実性をもって延長させるのに十分な抗腫瘍活性を示す療法は存在していない。結果として、結腸直腸ガンの有効な治療方法の開発がいまだ必要とされている。従って、本発明の目的は大腸ガンの影響を弱める方法を提供することである。本発明のもう一つの目的は、遺伝物質を、大腸ガン細胞のＤＮＡに運ぶ（伝える）方法を提供することである。本発明のさらなる他の目的は、抗ガン剤を大腸ガン細胞の核に運ぶ（伝える）方法を提供することである。本発明のさらなる他の目的は、大腸ガンの治療において有用な、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー(trimeric)抗体、ヘテロマー(heter omeric)抗体、及び一本鎖化（single chain）抗体を含む抗体を提供することである。発明の概要本発明は、腫瘍に結合する、抗体結合体（抗体複合体：antibody conjugates ）の投与からなる、大腸ガンの影響を弱める方法に関する。具体的には、大腸ガン細胞と結合する抗体と、抗ガン剤との、少なくとも一種の結合体（conjugate ）が投与される。又は、大腸ガン細胞に対して特異的な抗体と、大腸ガン細胞のＤＮＡ活性を阻害するペプチドとの、少なくとも一種の結合体が、大腸ガンの影響を弱めるために薬学的に効果的な量で投与される。大腸ガンの影響を弱めるもう一つの方法は、大腸ガンの腫瘍に対して特異的な抗体と、放射性同位元素（ラジオアイソトープ）との少なくとも一種の結合体を薬学的に効果的な量で投与することからなる。本発明はさらに大腸ガン細胞に遺伝物質を運ぶ（伝える）方法に関し、これは、腫瘍細胞内に取り込まれる抗体に結合された遺伝物質を、腫瘍細胞と接触させ、それによって、ＤＮＡへの遺伝物質の組み込みを媒介させることからなる。それに加えて、大腸ガン細胞に取り込まれる抗体と結合した抗ガン剤を、その細胞と接触させることによって大腸ガン細胞の核（ＤＮＡ）に抗ガン剤を運ぶ（伝える）ことができる。本発明はさらに、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー抗体、ヘテロマー抗体、及び一本鎖化抗体を含む抗体に関し、これらは大腸ガンの影響を弱めるために利用することができる。図面の簡単な説明上記の簡単な説明、そして本発明のさらなる目的と特徴は、後述の、例示的ではあるが現在好適とされる、本発明の実施例の詳細な説明と、添付の図面を結び付けて参照することで、より完全に理解されるであろう。添付の図面において、図１は、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３が肝臓の病変部に蓄積し、周囲の正常な肝臓組織には蓄積しないことを示す、オートラジオグラフである。図２はｍＡｂＡ３３に結合した放射性同位元素¹³¹Ｉが腫瘍細胞内に取り込まれ、周囲の組織には見られないことを示すオートラジオグラフである。図３はガンの病巣に対する¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の効果を表している。図４はｈＡ３３ＩｇＧ１とｈＡ３３Ｆａｂ’△ｃｙｓの発現ベクターを表している。図５はヒト化Ａ３３抗体の重鎮と軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を表している。図６は還元条件下と非還元条件下のヒト化Ａ３３ＩｇＧ及びＴＦＭ^TMのＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表している。図７はｈＡ３３Ｆａｂ’、ＴＦＭ^TMとのクロスリンク後のｈＡ３３Ｆａｂ’、及び精製ｈＡ３３ＴＦＭ^TMのＨＰＬＣプロフィールを表している。図８はヒト化及びマウスＡ３３のＳＷ１２２２細胞に対する結合のスキャッチャードプロットを表している。図９はｈＡ３３Ｆａｂ’△ｃｙs、ＩｇＧ、及びＴＦＭ^TMのＣＯＬＯ２０５細胞に対する結合の競合結合アッセイを表している。図１０はＳＷ１２２２腫瘍の異種移植をうけたヌードマウスにおける⁹⁰Ｙ−標識化ヒト化Ａ３３の体内分布を示している。そして、図１１はカニクイザルにおける¹¹¹ＩｎｈＡ３３ＩｇＧ、ＴＦＭ^TM、及びＤＦＭ^TMの薬物動力学プロフィールを示している。発明の詳細な説明マウスモノクローナル抗体Ａ３３（ここにおいてｍＡｂＡ３３と称される）は、抗原Ａ３３と呼ばれる細胞表面抗原を規定するＩｇＧ２ａアイソタイプのモノクローナル抗体であり、抗原Ａ３３は結腸直腸ガンの９５％以上において、また正常な腸粘膜において存在する（表１を参照のこと）。結腸直腸ガンではＡ３３抗原は、抗原−陽性病変の９５％以上において、細胞表面に均一に分布して発現している。さらに、Ａ３３抗原は大腸ガンにおいてその組織の分化の程度にかかわらず、また初発病変にも、肝臓転移を含む転移病変にも見られる。抗原Ａ３３は、抗原Ａ３３−陽性大腸ガン患者の血清中にも、粘液性大腸ガンの腫瘍分泌物中にも、また抗原Ａ３３−陽性大腸ガン細胞系の上清中にも検出されていない。これは抗原Ａ３３が分泌される分子ではないことを示唆している。正常な消化管において抗原Ａ３３は、正常な小腸粘膜及び大腸粘膜に見られ、それらの陰窩を通じて均一な細胞表面分布を示している。３００以上の異なる組織タイプの腫瘍における、また正常なヒトの成人及び胎児組織における抗原Ａ３３発現の詳細な調査により、この抗原の制限された分布パターンが示された。後述するように、本発明者らは、腫瘍形成組織のなかで、抗原Ａ３３は、大腸ガン及び腸上皮化生を示す胃ガンの一部において存在するが、テストされた他の上皮ガンのいずれにおいても存在しないことを見出した。抗原Ａ３３は、肉腫、神経外胚葉腫瘍、そしてリンパ性腫瘍には存在しないことが判った。これらの組織はすべて抗原Ａ３３−陰性であることが判った。参考文献として本出願にその全内容が合体される米国特許第５，１６０，７２３号に開示されているように、モノクローナル抗体Ａ３３は大腸ガン細胞表面に見られる抗原Ａ３３に特異的であり、それゆえ大腸ガンに対して特異的である。その結果、モノクローナル抗体Ａ３３、及び抗原Ａ３３−特異的である他の抗体は、大腸ガンの診断に利用できる。それらの抗体は、抗ガン剤、ペプチド、又は、放射性同位元素と結合させて大腸腫瘍の治療に利用することができる。例１ −マウスに異種移植したヒト大腸腫瘍における¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３のインターナリゼーション抗原Ａ33は、免疫療法研究に有用となるようないくつかの特徴を有している。それは、初発病変と転移病変とを含む、結腸直腸ガンの９５％以上において存在している。それは腫瘍小節（tumor nodules）に均一に発現しており、血流中へは分泌されない。さらに¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３及び¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３の臨床的評価によって、非常に良好に転移大腸ガン部位にターゲッティングされること、及び、わずかに限られた毒性を伴う臨床応答の証拠が示された。ｍＡｂＡ３３に対する生体組織検査に基づく定量的線量測定データは、ｍＡｂＡ３３が効果的かつ安全な放射線免疫療法に使用可能であることを示している。モノクローナル抗体Ａ３３が米国特許第５，１６０，７２３号（'７７２３特許）に開示されている手順によって¹²⁵Ｉ放射性同位元素標識された。この¹²⁵Ｉ −標識化Ａ３３モノクローナル抗体をここで¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３と呼称する。¹ ²⁵ Ｉ−ｍＡｂＡ３３は、ヒト大腸腫瘍を異種移植されたｎｕ／ｎｕマウスに投与された。このマウスは、その後、¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３局在について研究された。放射性同位元素標識したモノクローナル抗体Ａ３３の局在場所のパラメーターは、Ａ３３−陽性大腸ガン細胞系ＳＷ１２２２を用いてｎｕ／ｎｕマウスにおいて評価された。イン・ヴィトロでの培養ＳＷ１２２２細胞におけるｍＡｂＡ３３の動力学及び輸送について多くのことが分かっているので、このモデルは特に興味深いものである。具体的には、ｍＡｂＡ３３はＳＷ１２２２細胞内にすばやく取り込まれること（１時間以内に約３３％）；ｍＡｂＡ３３のインターナリゼーションの経路は、細胞膜ラッフリングによって生じるマクロピノソームを介していること；ＳＷ１２２２細胞は、平均すると細胞あたり８００，０００分子のｍＡｂＡ３３に結合すること；これらの細胞による¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３保持のｔ1/2〜１４時間であること；そして細胞内に取り込まれたｍＡｂＡ33のほとんどはインタクトな免疫反応性を有する形態で放出されること、が知られている。放出されたｍＡｂＡ33は腫瘍細胞に再び結合することができ、その結果、このモノクローナル抗体の取り込み／保持（uptake/retention）はより高くなる。これはマウスとヒトとの両方で起ることである（ヒトのデータは後述する）。注入後２４〜４８時間での¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３の腫瘍への取り込みピークは３５〜４０％グラム当たり注入線量（injected dose/g）であった。腫瘍：肝臓の比は３０：１から４０：１の範囲であり、腫瘍：血液の比は１０：１から１５：１の範囲であった。これらの値は、投与したモノクローナル抗体の線量（the dose）に依存していくらかの小さい変動を示した。そして、腫瘍への取り込みは、過剰量の非標識化ｍＡｂＡ３３の静脈内への投与によって阻害されうるのに対し、関連のないネガティブコントロールｍＡｂによっては阻害されないことから、局在パラメーターは抗原特異的であるということが判った。125Ｉ−ｍＡｂＡ３３は腫瘍異種移植から、ｔ1/2＝６０時間で除去される。これに対して¹¹¹Ｉｎで放射性同位元素標識されたｍＡｂＡ３３は、４５％グラム腫瘍当たり注入線量（injected dose/g tumor）の局在を示し、この放射性同位元素（アイソトープ）の保持は有意に長い（７日以上）。これは、おそらく¹¹¹Ｉｎの細胞質トラッピングによると考えられる。この、ｍＡｂＡ３３の腫瘍への局在のイン・ヴィヴォモデルは、様々な抗体結合体の相対的な有効性を評価することにおいて、また、様々な放射性同位元素（アイソトープ）に関する線量測定計算のために、非常に価値の高いものである。例２大腸ガンをわずらう人における¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３のインターナリゼーションＡ３３抗原システムは免疫療法に使用することができる。それは特にこの用法（免疫療法）に好適である。というのは、抗原Ａ３３−ｍＡｂＡ３３複合体は大腸ガン細胞に、迅速にインターナリゼーション（細胞内への取り込み）されるからである。さらに細胞内に作用部位を有するｍＡｂＡ３３結合体は、イン・ヴィトロ及びイン・ヴィヴォで大腸ガン細胞を殺す能力を有する。本発明者らは、ヒトにおける¹²⁵Ｉ−標識化ｍＡｂＡ３３の局在場所と細胞障害性効果について研究した。¹²⁵Ｉ放射性核種は、主に近距離（short-range）オージェ電子によってその細胞障害性効果を発揮する。この近距離オージェ電子は細胞核にきわめて近接して（＜１〜４μｍ）生じた場合に最も効果的である。それゆえに¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３と比較した際の¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３の、予期される利点の１つは骨髄に対する毒性が少ないことである。５０ｍＣｉ／ｍ²の初期線量（initial dose）の¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３によって治療された患者においては毒性はみられなかった。コリメーターを用いた外部からの¹²⁵Ｉ放射能探査（¹ ²⁵ Ｉscanning）による、腫瘍の画像診断をすべての患者について行ったところ、抗体注入後３５日までに明確な（陽性の；positive）の腫瘍の画像が生じた。これまでは¹²⁵Ｉ放射の小部分（smallfraction）のみがスキャニングに適していると考えられていたので、この結果は驚くべきものであった。 ¹²⁵Ｉ放射の大部分は非常に近距離で作用しており、明確な画像（positive im ages）はかなりの腫瘍での線量（tumor doses）の存在を示唆している。最初の９人の患者の中で、１人は治療後４週間目において。３５％のガン胎児性抗原（ＣＥＡ）レベルの現象を伴う応答を示した。１人の患者については、この患者が肺病変の切除をうけるため評価することができなかった。¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３投与の結果、腫瘍退縮がおこった。また、¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３を投与される前には化学療法に対して応答しなかった患者が¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３投与後には化学療法に応答するようになった（即ち、腫瘍退縮がおこった）。従って、本発明の抗体−放射性同位元素結合体は、患者を化学療法に対して敏感にさせるために使用可能である。例３大腸ガンをわずらうヒトにおける、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の体内分布結腸直腸ガンが肝臓に転移していると推測される、手術前の患者における、¹³ ¹ Ｉ−標識化ｍＡｂＡ３３の体内分布について研究した。これは、外部スキャニング技術（external scanning techniques）及び生体組織検査に基づく線量測定（biopsy-based dosimetry）によって判定される、ｍＡｂＡ３３のターゲティング能力を立証するため、そして、ｍＡｂＡ３３ターゲティングが、関連性はないがアイソタイプは一致するネガティブコントロールｍＡｂであるｍＡｂＴＡ９９と比較した場合に、抗原特異的であるということを示すために行われた。最適レベルの免疫反応性を保持させつつ、効率的で一定した、ｍＡｂの放射性同位元素標識をすることが放射性免疫療法には欠くことができない。臨床前の評価により、ｍｇタンパク質当たり５０ｍＣｉの¹³¹Ｉ（５０ｍＣｉ¹³¹Ｉ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ）までで標識したｍＡｂＡ３３は、連続的吸収分析（sequential absorptionanalysis）で測定したところ、もとの免疫反応性の４０〜７０％を保持していることが示された。約１５ｍＣｉ／ｍｇ（実際の範囲１２．５〜２２ｍＣｉ／ｍｇ）の特異的活性を達成するように計画されたプロトコールを用いて、５１の線量のｍＡｂＡ３３が４２のヨウ素化手法で標識化された。１７人の患者が４０〜７０％の免疫反応性を有するサンプルを与えられた。６人の患者は４０〜７０％の免疫反応性をもつ¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３と、２０〜３５％の免疫反応性をもつもののいくらかの調製物を与えられたが、これは最適状態に及ばないと考えられる。１７人の患者が５段階の線量（dose）レベル（０．２〜５０ｍｇ）で、¹³¹Ｉ −ｍＡｂＡ３３を投与され、３人の患者が¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３（２ｍｇ）とともに、関連性はないが、アイソタイプは一致するネガティブコントロールである¹³¹ Ｉ−ｍＡｂＴＡ９９（２ｍｇ）を与えられた。注入の１時間以上後、¹³¹Ｉ− ｍＡｂＡ３３及びコントロール¹³¹Ｉ−ｍＡｂＴＡ９９のピーク血清レベルは、試験したすべての線量レベルについて、２８％ＩＤ／リットルに達した。これは同じ患者での^99mＴｃ−ＨＳＡ血清研究から判定されるように、血管内の血しょう容量（メジアン：median２．５７リットル）中に自由に分布しているということと一致する。血中からの¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の除去（クリアランス）は、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の半減期が、ネガティブコントロールの¹³¹Ｉ−ｍＡｂＴＡ９９のレベルよりも迅速に減少すると、判明したことを示していた。これは、ほぼおそらく、抗原−陽性腫瘍組織によるイン・ヴィヴォでの¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の吸収に起因すると考えられる。 ¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３で処置された１７人の患者において、合計４６の肝臓への転移が手術によって証明され、これらのうち４５は全身の平面の、又はスポット・ビューの腹部の画像で確認された。２つの初発大腸ガンも外部からのスキャンによって見ることができたが、局所のリンパ節への転移は、生体組織検査に基づく線量測定によると類似の腫瘍：正常組織比を示したのにもかかわらず、腹部における近接した取り込み部位と区別することができなかった。肝臓転移の血管分布が^99mＴｃ−ＨＳＡスキャン及び生体組織検査に基づく線量測定によって、評価された。^99mＴｃ−ＨＳＡスキャンによって、これらの病変の特徴である血管像過小が確認された。これは、周囲の、関係のない肝臓と比較して光の少ない（photopenic）部分として現われた。同様に、生体組織検査により^99mＴｃの腫瘍：肝臓比は０．１４：１から１．１９：１の範囲であり、ほとんどの病変は０．６０以下の値を有することが示された。ネガティブコントロールｍＡｂである¹³¹Ｉ−ｍＡｂＴＡ９９に関する試験では、ただ１人の患者においてかすかな陽性の画像がみられたが、腫瘍への取り込みはごく少ないことが示され、腫瘍：肝臓比は１．１：１から５．４：１であった。これに対して¹³¹ Ｉ−ｍＡｂＡ３３は生体組織検査から判定して、１００：１までもの腫瘍：肝臓比を生じさせた。¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３が肝臓病変部に特異的に蓄積し、周囲の正常な肝臓には蓄積しないということは、併用したオートラジオグラフィーと、（図１及び図２を参照）凍結組織切片を用いた免疫組織化学によっても見ることができた。 ¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の可変性を伴う、正常な腸への局在が見られた。何人かの患者におけるスキャンは腸のいくらかの部分の標識化を示しており、ある場合には正常な大腸のはっきりとした輪郭がみられた。しかし、他の場合では最低限の正常な大腸の画像のみがみられた。手術中に切除された正常大腸の切片を用いた試験では、試験片をリン酸緩衝食塩水で簡単に洗浄することにより、かなりの量の放射性同位元素標識が回収できることが示された。従って、少なくとも、いくらかの¹³¹Ｉ −ｍＡｂＡ３３の正常な腸による見かけの取り込みは、胃によって分泌された遊離の¹³¹Ｉの存在、又は、結合アフィニティーが低い場合のモノクローナル抗体の存在を示している可能性がある。Ａ３３−陽性の、正常な小腸と大腸の腸粘膜に¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３がより強固に蓄積しないという所見は、正常粘膜中の抗原が近づくことが容易でないということに関係しているのかもしれない。例４大腸ガンをわずらうヒトにおける¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の治療効果進行した大腸ガンをわずらう患者において、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の治療試験が行われた。２３人の患者が研究に参加し、１回の注入として３０ｍＣｉ／ｍ² の¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３を、又は３日つづけての注入によって、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３を与えられた。２人の患者（Ｎｏ．１４及びＮｏ．１８）は追跡調査することができず、（最も悪い状態の時期（nadir time）における血液サンプル数が不十分であった）治療後、１ヶ月以内に進行性の疾患によって死亡した２人の患者（Ｎｏ．２及び２２）については不完全な毒性評価した行われなかった。組織のスライドを観察したところ、１人の患者（Ｎｏ．１０）は、大腸ガンではなく小腸ガンを有することが判明した。この研究に含まれた患者についてＡ３３免疫組織化学のための凍結組織が得られなかったため、この研究における封入体（incl usion）の診断基準としての抗原型検査をすることができなかった。Ａ３３に対する利用可能なｍＡｂは、型通りに固定された、パラフィン−固定化材料における抗原の検出に用いることができない。治療の１から３週間後、治療された２３人の患者のうち２０人については、ＣＴスキャン又は胸部Ｘ線によって独立して同定された腫瘍部位について陽性の¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３スキャンが示された。腹部内の疾患が外科的に証明され、ＣＥＡレベルが上昇している２人の患者については、ＣＴスキャンによっても¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３スキャンによっても可視化されず、小腸ガンである、１人の患者（Ｎｏ．１０）については、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３スキャン陰性であった。この研究に含まれた全ての患者で、１回の治療サイクル後にヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が現われ、治療後４週間までのＩｇＭ及びＩｇＧ両方に対するタイターは、１：１０，０００から１：１００，０００であった。観察された主な毒性は、血しょう板減少症と好中球減少症であり、それらの重症度は概して線量依存的であった。しかし、テストした各線量レベル（＞＝４５ｍＣｉ／ｍ²）において、以前に大量の化学療法をうけた患者は、たとえ¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３治療時に血しょう板数が正常範囲にまで回復していても、とても顕著な、及び／又は長期にわたる骨髄の（免疫の）抑制の徴兆を示した。このような血液毒性の患者による相違は、全身のアイソトープクリアランス速度によって測定される、¹³¹ Ｉの保持の差違に起因するものではなかった。そうではなく、それ（血液毒性の患者による相違）は放射線ダメージに対する、内因性の感受性と反映しているようであった。７５〜８４ｍＣｉ／ｍ²で治療された５人の患者のうち１人の患者は（Ｎｏ．１１）は、グレード３の血しょう板減少症（最も悪い状態（nadia）で２日間、３３，０００／マイクロリットル）が現われ、３人の患者（Ｎｏ．１３、１４、及び１５）は毒性効果を示さなかった。患者Ｎｏｓ．１１と１２は以前に、ＢＣＮＵ、ストレプトゾチシン（streptozoticin）、ビンクリスチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びロイコボリンによる治療をうけており、一方、患者Ｎｏ．１３、１４と１５は５−ＦＵとロイコボリンのみを与えられていた。８６〜９４ｍＣｉ／ｍ²の¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３を与えられた６人の完全に評価な患者（Ｎｏ．１６、１７、１９、２０、２１及び２３）の中で、２人（Ｎｏ．２１と２３）はグレード４の毒性を示し、１人はグレート１の毒性を示し、３人は毒性を示さなかった。グレート４の毒性を示した２人の患者のうち、患者Ｎｏ．２１は、以前に大量の化学療法（５−ＦＵ、インターフェロンα、ＢＣＮＵ、ストレプゾトチシン、及びビンクリスチンを３０ヶ月間以上別々のプロトコールで）を受けており、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３治療後、迅速に、かつ長期にわたる血しょう板数及び好中球数の抑制を示した。血しょう板減少症が現われた２人の患者（Ｎｏ．２１と２３）では好中球減少症がみられた。他の２人の患者（Ｎｏ．１８と２２）は、彼らの最も悪い状態の期間（nadir period）中に一度の血液試験しか受けなかったため、完全な評価はできなかったが、少なくともグレード２及びグレード３の好中球毒性を有していた。一般に、全白血球数の減少には、リンパ球減少症が伴ったが、個々のリンパ球サブセットに関しては分析は行われなかった。治療反応性に関しては、胸部Ｘ線又はＣＴスキャンによって判定された疾患をわずらう１８人の患者、及び血清ＣＥＡレベルによっては、判定可能な疾患を示したが、Ｘ線撮影研究によっては判定可能な疾患を示すことができなかった３人の患者について、評価が行われた。２人の患者については追跡調査ができない、又は腫瘍を手術で切除したという理由で評価することができなかった。混合応答（ mixed responses）の証拠が５人の患者（Ｎｏ．３、５、７、９、及び２３）において得られた。患者Ｎｏ．３は肝臓への転移と細胞学で判明した悪性の腹水症を示しており、治療前は利尿剤（ラシックス、アルダクトン）によって安定化させられていた。¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３注入後、腹水液中に大量の放射性同位元素の蓄積が検出された。治療の１ヶ月後、この患者の体重は８ｋｇ減少し、腹水症は消失し、そして血清ＣＥＡレベルは３７５０〜４２００ｎｇ／ミリリットル（治療前）から２０００ｎｇ／ミリリットルに減少した。その後、利尿剤を続けることをやめ、血清ＣＥＡレベルはほぼ４ヶ月間１７５０ｎｇ／ミリリットルに安定した。肝臓への転移はＸ線撮影法基準によると変化しないままであった。１０週間後に¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３による再治療を試みた；しかしながら、ＨＡＭＡ応答のためアイソトープの蓄積は肝臓及び脾臓にのみみられ、腫瘍部位においてはみられなかった。患者Ｎｏ．５は、右胸部に広範囲な胸膜の疾患と、左胸部に測定可能な病変と、肝臓への転移をわずらっていた。¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３治療の３週間後、左胸部の病変ははっきりとはみえなくなり、２ヶ月後には、消失した（図３を参照のこと）。他の測定可能な疾患部位は５ヶ月間安定に残っていた。患者Ｎｏ．９は肝臓への転移、骨盤における大きな凝集性物質の塊（large pelvic mass）、及び左鎖骨上と頚部における大きなリンパ節を含む広範囲な腹部の疾患を有していた。¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３治療の４週間後リンパ節は触診できないようになったが、１ヶ月後彼女の骨盤における凝集性物質の塊は、大きさを増していた。患者Ｎｏ．７と２３では、血清ＣＥＡレベルが、１６週間以上にわたり、それぞれ２２％及び３０％減少した；しかし、疾患の進行のより詳細な評価は、どちらの患者も放射線医学検査によって測定可能な疾患を有していなかったため、不可能であった。混合反応の証拠を示す患者と示さない患者との比較によっては、一貫した相違は明らかにならなかった。具体的には、腫瘍部位への放射性同位元素の取り込みレベル（スキャンから判定したもの）と測定可能な応答との間の明らかな相関関係は現われなかった。抗体結合体の調製モノクローナル抗体Ａ３３は抗ガン剤と結合させて、ガンの治療のために投与することができる。例えば、ｍＡｂＡ３３は、抗葉酸剤であるＱＦＡと、又は腫瘍細胞の二本鎖ＤＮＡを切断する抗腫瘍抗生物質である、カリケアミシン（cali cheamicin）と結合させることができる。ＱＦＡとカリケアミシンは両者とも細胞内に作用部位を有しており、容易に細胞膜を通り抜けることができない。従って、それらは細胞培養物に添加した場合、弱い細胞障害性効果を示す。ｍＡｂＡ３３−仲介インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞内への取り込みは、これらの細胞障害性効果をイン・ヴィトロで大幅に増強させる。イン・ヴィヴォの異種移植研究では、ｍＡｂＡ３３−ＱＦＡ及びｍＡｂＡ３３−カリケアミシン結合体の両方によって正常組織の損傷を制限させつつ、腫瘍を阻害することができることが示されている。他の抗ガン剤も、本発明の抗体と結合させることができ、ガンの治療のために使用することができる。他の抗ガン剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシルが含まれる。モノクローナル抗体Ａ３３は、大腸ガン細胞及び正常大腸細胞（normalcolono cytes）の両方に遺伝物質をターゲティングするためにも使用可能である。というのは、それは迅速に標的細胞中に取り込まれるからである。Ａ３３抗原は抗体を細胞内区画であるマクロピノソームに伝える。トランスフェクションされたＤＮＡもマクロピノソーム区画上を移動し、加水分解を免れて最後に染色体ＤＮＡに組み込まれる。ｍＡｂＡ３３−薬剤結合体に関しては、Ａ３３抗体が薬剤を核のＤＮＡへと伝える。同様に、ｍＡｂＡ３３を利用して、遺伝物質を細胞内に運ぶことができる。例５Ａ３３−オリゴヌクレオチド結合体異種の二官能基をもつ試薬（heterobifunctional reagent）ＳＰＯＰを用いて、３’末端に遊離の反応性のチオール基を有する２６マーのオリゴヌクレオチドがｍＡｂＡ３３の遊離のアミンに結合された。このオリゴヌクレオチドの５’末端はＤＮＡのトレーサーとして³²Ｐで酵素によって標識化された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと還元したゲルは、オリゴヌクレオチド／ｍＡｂ比の範囲を含む生成物と一致するパターンを示した。プロテインＡクロマトグラフィーによって精製がなされた。最終生成物は滅菌ろ過（除菌）され、細胞結合活性及び、タンパク質と結合したオリゴヌクレオチドの濃度についてテストされた。最終精製生成物は、Ａ３３抗原を発現している大腸ガン細胞系ＳＷ１２２２を用いてテストされた。低ｐＨが、ｍＡｂＡ３３の、その抗原への結合を逆転させるという能力に基づいて、インターナリゼーションの割合を定量するためのプロトコールを開発した。これは、ｍＡｂＡ３３−³²Ｐ−ＤＮＡの結合とインターナリゼーションを¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３の結合とインターナリゼーションと比較し、分析するために用いられた。放射性同位元素標識したｍＡｂＡ３３結合体の細胞への特異的な結合を阻害するために、過剰量の、非標識化・非修飾・ｍＡｂＡ３３が用いられた。これにより、すべての細胞結合は、特異的であり、ｍＡｂＡ３３とその抗原との相互作用によって媒介されているということが明らかになった。アッセイは９６穴プレートにおいて行われ、対数増殖期の細胞をウェル当たり１００，０００細胞用いた。２４時間後ウェルに添加された³²Ｐのうち７．２％が細胞に結合した。４８時間後には、６０％以上の³²Ｐが細胞内に取り込まれた。抗−アクチンＤＮＡを用いた場合の抗腫瘍効果は、移植されたＳＷ１２２２細胞を有するヌードマウスにおいて、観察された。これらの結合体は、トレーサーとして、³²Ｐも含んでおり、³²Ｐが抗腫瘍効果にいくらか寄与していたという可能性がある。しかし、放射能量が低かったので（１０μＣｉ／マウス）アイソトープ（isotype）単独から予測される効果は極めて小さいであろうと考えられる。本発明の抗体結合体は、この分野に習熟したものにとって周知の、様々な経路によって投与することができる。経路の例を挙げると、これらは静脈内に、腹膜内に、筋肉内に、皮下に、又は経口的に（例えばウイルスと結合させて）投与することができる。本発明の抗体結合体は、製薬学的に許容しうる担体を組み合わせた組成物形態においても投与することができる。本発明の抗体結合体は、約０．１ｍｇから２０００ｍｇの投与量の範囲で投与することができる。しかし、投与量範囲は、治療すべき患者の状態、患者の治療歴（medical histoy）、投与方法、及びその他のいくつかの因子に依存して、治療すべき患者に応じて変化するであろう。例６Ａ３３システムのキャラクタライゼーションＡ３３システムの特性を明らかにするためにいくつかのＡ３３−陽性大腸ガン細胞系が、細胞当たりのｍＡｂＡ３３結合部位の数を測定するのに用いられた。細胞当たり８００，０００以上の部位が存在することが判った。ｍＡｂＡ３３結合の親和力は高いということが判った。同じ細胞系を用いて、Ａ３３抗原は迅速に細胞内に取り込まれる抗原であることが示され、ヒト内部で２４時間以上にわたり９０％までものインターナリゼーションがおこることが示された。培養大腸ガン細胞への¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３の結合動力学の研究、酸での洗浄実験、及び細胞抽出物と培養上清とのＳＤＳ−ゲル分析により細胞内に取り込まれたｍＡｂＡ３３の８０〜８５％が細胞内区画を循環し、約１〜２日の間に、細胞からインタクトな免疫反応性を示す形態で放出されることが示された。細胞内に取り込まれた¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３のうち、ほんのわずかな量のみがインターナリゼーションの後、分解される（degraded）ようであり、そしてこの分解（degradation ）は、リソソーム酵素のインヒビターによって部分的に阻害された。ｍＡｂＡ３３インターナリゼーションのメカニズムは、マクロピノソームと関係している。¹²⁵Ｉカリケアミシン（calicheamicin）、及びＱＦＡと結合されたｍＡｂＡ３３に関するイン・ヴィトロの研究は、Ａ３３−陽性大腸ガン細胞に対する強力な細胞障害活性を示したが、Ａ３３−陰性腫瘍細胞系に対しては、（細胞障害）活性を示さなかった。３種の結合体はすべて、細胞内への取り込み後に作用するので、Ａ３３の有する細胞内取り込み能力が、観察される細胞障害効果において非常に重要な役割を果たしていると判断された。例７他のマウス抗体の生成本発明者らは、ＩｇＧ２ｂアイソタイプであるｍＡｂ１００−２１０と称されるものと、ＩｇＧ２ｂアイソタイプであるｍＡｂ１００−３１０と称されるものとの、２つの追加のマウスｍＡｂを生成させた。ｍＡｂ１００−３１０は、参考文献として本出願にその開示内容全体が合体される米国特許出願第０８／２７３，２７７に記載されている。モノクローナル抗体１００−２１０及び１００−３１０を分泌するハイブリドーマはブタペスト条約に基づいてそれぞれ１９９４年１１月３０日と１９９２年４月２８日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託されており、それぞれＡＴＴＣＮｏ．ＨＢ１１７６４及びＨＢ１１０２８としてカタログされている。それらのモノクローナル抗体はｍＡｂＡ３３と同じ反応性パターンを示す。競合ラジオバインディングアッセイにおいて、モノクローナル抗体１００ −２１０はｍＡｂＡ３３の結合を阻害する。これは、それ（モノクローナル抗体１００−２１０）がｍＡｂＡ３３と同一の、又は空間的に連関した、Ａ３３抗原上のエピトープ（抗原決定基）に結合することを示唆している。一方、ｍＡｂ１００−３１０とｍＡｂＡ３３は互いに交差阻害（cross-blck）せず、これは、これらが、Ａ３３抗原上の同じ細胞表面タンパク質における、２つの異なるエピトープと反応していることを示唆している。例８ヒト化Ａ３３抗体の生成高い、又は低い親和性のｍＡｂ、もしくはより速い、又はより遅い血清クリアランスを有するｍＡｂの、ガン患者における免疫両方のための使用は、抗原性の標的、腫瘍タイプ、ｍＡｂに固有の薬物動力学的特性、目的とするエフェクターメカニズム、そして他の非免疫学的パラメーターの違いによって異なるものとなるであろう。ｍＡｂＡ３３は、イン・ヴィヴォで非常に良好なターゲティング（標的化）特性を示すので、こういったパラメーターを評価するための有効なテストシステムを提供する。ヒト化及び修飾されたモノクローナル抗体がｍＡｂＡ３３から作成された。Ａ３３に対するｍＡｂの遺伝子をクローニングし発現させるために、１０％胎児ウシ血清と１ｍＭグルタミンを追加したＲＰＭＩ１６４０培地中でｍＡｂＡ３３ハイブリトーマ細胞を培養した。トータルＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート（guanadinium isothiocyanate）を用いて１０⁹のハイブリドーマから調製し、オリゴ（ｄＴ）アフィニティークロマトグラフィーによってポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡを単離した。ファーストストランドｃＤＮＡを１０ｍｇのｍＲＮＡから合成した。分泌のためのシグナル配列を含む、Ａ３３可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８８−８９（１９９１）に記載されているＰＣＲ手順を用いて、ｃＤＮＡから増幅させた。ただし、哺乳類細胞における発現用のベクターに、ＰＣＲ産物を容易にクローニングできるように設計されたプライマーを用いた。これらのベクターは、元はｐＥＥ６（スティーヴンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ）他，Ｎｕｃｌ．ＡｃｌｄｓＲｅｓ．，１７：７１１０（１９８９））から誘導されたものである。図４は最終的なＮＳＯ発現ベクターを示す。ＰＣＲで増幅された軽鎖可変ドメインのフラグメントはｐＭＲＲ０１０のＢｓｔ１サイトとＡｐｌ１サイトの間にクローニングされた。ｐＭＲＲ０１０は、カッパキメラ軽鎖のような配列が発現するように構築されたｐＥＥ６の誘導体である。ＰＣＲで増幅された、Ａ３３重鎖可変ドメインのフラグメントはｐＭＲＲ０１１のＨｉｎｄIIIサイトとＡｐａＩサイトの間にクローニングされた。ｐＭＲＲ０１１はガンマ１キメラ重鎖のような配列が発現するように構築されたｐＥＥ６の誘導体であるクローニングされた可変領域遺伝子は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーセを用いた二本鎖ジデオキシチェインターミネーター法によって配列決定された。ヒト化可変ドメインは、ドーハーティ（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ）他，Ｎｕｃｌ．ＡｃｃｉｄｓＲｅｓ．，１９：２４７１〜２４７６（１９９１）に開示されている手順によって組み立てられた。ここで、それぞれ軽鎖と重鎖に対応する、ｐＭＲＲ０１０とｐＭＲＲ０１１へのクローニングが容易になされているようなプライマーを用いた。これらヒト化可変領域遺伝子はマウス可変領域遺伝子に用いられたものと同じ手順によって配列決定された。ヒンジ領域に１つのチオールを有するｈＡ３３Ｆａｂ’△ｃｙｓ重鎖のための発現ベクターは、ガンマ１定常ドメインを、キング（Ｋｉｎｇ）他，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４：６１７６〜６１８５（１９９４）に記載されているｃＢ７２．３Ｆａｂ’△ｃｙｓ遺伝子からの適切なヤグメントと置換することによって構築した。マウスＩｇＧの重鎖と軽鎖、又はヒト化ＩｇＧ及びＦａｂ’の重鎖と軽鎖の一過性共発現が、コッケット（ｃｏｃｋｅｔｔ）他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，８：６６２〜６６７（１９９０）に記載されているように個々の発現ベクターをＣＨＯ−Ｌ７６１ｈｏｕｒ細胞に共トランスフェクションすることによって達成された。重鎖と軽鎖の発現が安定である細胞系を開発するため、（複数の）ユニットを１つのプラスミドに組み合わせた。これは、軽鎖発現プラスミド中のＮｏｔ１−ＢａｍＨ１スタッファーフラグメント（stuffer fragment）を、重鎖発現プラスミド由来のｈＣＮＶプロモーター／エンハンサー及び重鎖遺伝子を有するＮｏｔ１−ＢａｍＨ１フラグメントと置換することによって完成した。最終的な発現プラスミドはｈＡ３３ＩｇＧとＦａｂ’△ｃｙｓのそれぞれに対して、ｐＡＬ７１とｐＡＬ７２と命名された（図４）。次に、ｈＩｇＧ１及びｈＦａｂ’の産生のための安定なＮＳＯ細胞系が、ベッビントン（Bｅｂｂｉｎｇｔｏn）他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６９〜１７５（１９９２）に教示されている手順に従って、プラスミドをトランスフェクションさせることによって確立された。トランスフェクションの後、細胞を１０％の透析された胎児ウシ血清と、２ｍＭグルタミンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｓＭｅｄｉｕｍ中に、９６穴プレート当たり２ｘ１０⁵細胞となるようにプレーティングした。２４時間後、メチオニンスルフォキシミン（methionine sulphoximine）を終濃度７μＭになるように培地に添加することによって細胞を選抜した。２１日間の培養後、生産性の分析をするために、耐性コロニーを選び取り、拡張させた。最も高生産性を示すものを選択し、ローラーボルト培養で、組み換え抗体（recombinant antibody）を産生させた。これらの結合アッセイの結果、キメラ抗体はマウスＡ３３と同様に、抗原を発現する細胞に結合することが示され、クローニングされた遺伝子はＡ３３のもの（抗体）に対応することが確認された。図５は、クローニングされた可変ドメイン遺伝子のＤＮＡ配列から推定される重鎖と軽鎖のアミノ酸配列を示している。最初の１１アミノ酸のＮ末端タンパク質配列決定は、重鎖と軽鎖との両方のこれらの推定アミノ酸配列と完全に一致する結果を示したので、適切な遺伝子がクローニングされていたことが確認された。図５は、マウス及びヒト化Ａ３３抗体の軽鎖［Ａ］と重鎖［Ｂ］の可変ドメインのアミノ酸配列を示している。ｃＤＮＡから推定されるマウス抗体の配列（ｍＡ３３）と、ヒト化抗体の配列（ｈＡ３３）とが並べて示されている。ヒト化フレームワーク配列は、ヒト抗体ＬＡＹ（カバット（Ｋａｂａｔ）他，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈＥｄ．（１９８７））由来のものである。各鎖における３つの相補性決定部には下線が引かれている。ＬＡＹフレームワーク中で、マウスＡ３３配列と置換されている残基には二重下線が引かれている。Ａ３３のＶ_Hは、ヒトサブグループＶ_HIIIのコンセンサス配列に最も近いホモロジー（７０％）を示し、一方Ｖ_Lは、ヒトサブグループＶ_LＩ及びＶ_LＩのコンセンサス配列と最大のホモロジー（６２％）を示している。これらのサブグループからＬＡＹがヒトフレームワークとして選ばれたのであり、ＬＡＹはＶ_HIII重鎖及びＶ_LＩ軽鎖を有している。図５において、軽鎖の残基１〜２３、３５〜４５、４７〜４９、５７〜８６、８８、及び９８〜１０８は全てＬＡＹ配列に由来しており残基２４〜３４、４６、５０〜５６、８７及び８９〜９７は相補性決定部（ＣＤＲ）に対応する。残基４６と８７は、軽鎖と重鎖の可変領域の接点にあると予想される。残基４６は通常ヒト抗体配列においてはロイシンであり、残基８７は通常フェニルアラニン又はチロシンである。重鎖については、残基２〜２６、３６〜４９、６６〜７１、７４〜８２ａ、８２ｃ〜８５、８７〜９３、及び１０３〜１１３はすべてＬＡＹ配列由来であり、一方残基１、２７〜３５、５０〜６５、７２、７３、８２ｂ、８６及び９４〜１０２は、全てマウス由来であった。重鎖における残基３１〜３５、５０〜６５及び９５〜１０２はＣＤＲに対応する。フレームワーク部の中にマウス由来アミノ酸がいくつかの理由によって含まれた：残基１は通常、触媒に近づきやすく、ＣＤＲ領域（残基２７〜２０）の付近に位置する；ＬＡＹは普通、ヒト又はマウスＶ_H配列中のこの位置にはみられない、アラニン残基を有しているので、マウス残基が用いられた。位置７２及び７３においても、ＣＤＲ２に近接することが予想されるので、マウス残基が用いられた。そして、残基７２の場合には、ＬＡＹフレームワークを用いることによって可変ドメイン内にＮ−結合グリコシル化部位が導入される可能性を排除するために、マウス残基が用いられた。マウス配列は、ドメイン中の残基９４においても用いられ、ここではＡ３３は、通常はこの位置にはみられない、プロリンを有している。マウス残基は、位置８２及び８６において用いられた。これは、ＬＡＹフレームワークを有するヒト化抗体の、これらの位置において、ヒトアミノ酸を用いることは、重鎖の発現にとって、有害であることが以前に見出されていたためである。ｈＩｇＧは、ＮＳＯ細胞の組織培養上清からプロテインＡ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され、キング（Ｋｉｎｇ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８１：３１７〜３２３（１９９２）に記載されているようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによってキャラクタライズされた。ｈＡ３３Ｆａｂ’△ ｃｙｓは、細胞培養上清からＦａｂ'上の低親和性プロテインＡ結合部位を精製のための基本原理として利用して、プロテインＡ−セファロースのクロマトグラフィーによって精製した。プロテインＡ−セファロースのカラムを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭのホウ酸バッファーｐＨ８．０で平衡化した。ｈＡ３３Ｆａｂ'△ｃｙｓを発現するＮＳＯ細胞からの組織培養上清を１Ｍのトリスを添加することによってｐＨ８．０に調製し、カラムにアプライした。平衡化バッファーによる洗浄後、Ｆａｂ’は０．１Ｍのクエン酸で溶出され、フラクションを直接十分な量の１Ｍトリス中に収集し、直ちにフラクションのｐＨが６と７の間に調整されるようにした。透析と限外ろ過の後、ｈＡ３３Ｆａｂ'△ｃｙｓはマレイミド−ベース（malei mide-based）の同種二機能体（homobifunctional）及び同種三機能性（homotrif unctional）リンカーＣＴ５２及びＣＴ９９８をそれぞれ使用して、ＣＢ７２．３Ｆａｂ’△ｃｙｓに関して、前述のキング（Ｋｉｎｇ）他，（１９９４）に記載されているようにＤＦＭ^TM及びＴＦＭ^TMとクロスリンクされた。これらのクロスリンカーは⁹⁰Ｙの結合のための１２Ｎ４マクロサイクル（the 12Ｎ₄macrocycl e）を含んでいる。生成したＤＦＭ^TM及びＴＦＭ^TMは、セファクリル（Sephacryl ）Ｓ−２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過によって精製された。⁹⁰Ｙでの放射性同位元素標識は、前述のキング（Ｋｉｎｇ）他，（１９９４）に記載されているように行った。少量のヒト化抗体が、ＣＨＯ細胞における一過性発現システムで生成され、それが抗原を発現しているＳＷ１２２２細胞に結合することが立証された。次に、より大量の精製物質を生成させるためにｈＡ３３ＩｇＧとＦａｂ'△ｃｙｓ両方に対応する安定なＮＳＯ細胞系が単離された。最良の細胞系は、懸濁培養で、およそ７００ｍｇ／ミリリットルのｈＡ３３ＩｇＧ１及び５００ｍｇ／ミリリットルのＦａｂ'△ｃｙｓを産生した。図６は、（Ａ）非還元、及び（Ｂ）還元条件下でのヒト化Ａ３３ＩｇＧとＴＦＭ^TMのＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示している。レーン１はｈＡ３３ＩｇＧ；レーン２はｈＡ３３Ｆａｂ'△ｃｙｓ；レーン３はｈＡ３３Ｆａｂ'△ｃｙｓクロスリンク混合物；レーン４は精製ｈＡ３３ＴＦＭ^TMである。図６は、精製ｈＩｇＧは均一であり、完全に組み立てられていた（assembld）ことを証明している。ＨＰＬＣ分析ではｈＩｇＧが凝集していないことが証明された。予測していたように、ｈＦａｂ'△ｃｙｓは大部分が一価のＦａｂ'の形態で、少量がＦ（ａｂ'）₂の形態で回収されたが、これは他の組み替えＦａｂ'フラグメントでの結果と一致する。精製ＴＦＭ^TMのSＤＳ−ＰＡＧＥ分析は非還元条件下においてはおよそ１５０ｋＤの単一種を示した。還元条件下では、およそ７５ｋＤと２５ｋＤの二種が観察され、これはそれぞれ、３つクロスリンクしたＦｄ'鎖と軽鎖から予測されるサイズに対応する。Ｆab'△cysのＴＦＭ^TMへのクロスリンクは、６０〜６５％の収率で達成された。図７は、（ａ）ｈＡ３３Ｆａｂ'；（ｂ）ＴＦＭ^TMへのクロスリンク後のｈＡ３３Ｆａｂ'及び（ｃ）精製ｈＡ３３の、２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣプロフィールを示している。ＨＰＬＣゲルろ過はデュポン社のＺoｒｂａｘＧＦ−２５０カラム流出で、（流速）１ミリリットル／ｍｉｎで、０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０中にて行われた。（ａ）に示されるようにｈＡ３３Ｆａｂ'のピークは１０．５分の保持時間を示し、Ｆ（ａｂ'）²のマイナーピークは９．７分であり、バッファーピークは１２．２分であった。（ｂ）に示されるようにクロスリンク後、９．０分におけるメジャーピークはＴＦＭ^TMを表している。マイナーピークは９．６分におけるものはジ−Ｆａｂを、１０．５分におけるものは残留しているモノマーＦａｂ'を、８．２分におけるものは少量の凝集塊を、そして１２．２分におけるものは同じバッファーピークを表している。（ｃ）に示されるように精製後、ＴＦＭ^TMピークはなお９．０分においてみられ、唯一の他の見ることのできるピークは、１２．２分におけるバッファーピークであった。次に、抗原結合アッセイは、Ａ３３抗原を発現する２つのヒト結腸直腸腫瘍細胞系、ＣＯＬＯ２０５とＳＷ１２２２の細胞を用いて行われた。これらの細胞は２ｍＭグルタミンと１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地中で培養された。培養上清中の、及び精製調製物中の組み立てられた抗体（assembled antibody）はＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）によって定量された。ＳＷ１２２２細胞へのマウス及びヒト化抗体の直接の結合はＦＡＣＳｃａｎアッセイによって測定された。ＳＷ１２２２細胞は培養フラスコから取り出すためにトリプシン処理され、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、１０％ウシ血清と０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中に再懸濁された。ヒト化Ａ３３抗体は、続いて１０％ＦＣＳと０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中に希釈され、２ｘ１０⁵ の細胞に添加された。氷上での１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次に氷上でさらに１時間、ローダミン抗−（ヒトＦｃ）結合体（rh odamine anti-(humanFc)conjugate）（ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウム中で１:１０００）とともにインキュベートした。ＰＢＳ中での洗浄後、細胞に結合したローダミン標識化Ａ３３抗体結合体の量をＦＡＣＳｃａｎアナライザーで測定した。マウスＡ３３の直接の結合はＳＷ１２２２細胞をＦＩＴＣ標識化抗体とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳｃａｎ分析によって測定した。Ａ３３が、Ｆｃの相互作用を介した非特異的結合ではなく、抗体−抗原相互作用を介して特異的に結合していることを明らかにするために、適当な非特異的抗体コントロール（実験）を行った。マウス及びヒト化抗体のアフィニティーの測定は、クラウゼ（Ｋｒａｕｓe）他，ＢｅｈｒｉｎｇＩｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．，８７：５６〜６７（１９９０）に記載されている手順に基づいて行った。簡単にいえば、抗体を、１．３ｍｇ／ミリリツトルからタイター測定されたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いてフルオレセインで標識化し、次に５％ＦＣＳと０．１％アジ化ナトリウムを含有する３５０ミリリットルのＰＢＳ中で氷上で２時間、２．８ｘ１０⁵のＳＷ１２２２細胞とともにインキュベートした。細胞当たりに結合した蛍光の量をＦＡＣＳｃａｎで測定し、標準ビード（standard beads）を用いて較正した。各抗体濃度における、細胞当たりの、結合した抗体の分子数はそのように確立され、スキャッチャードプロットを得るために用いられた。標準量のマウス抗体を連続的に希釈した（一連の）ヒト化ヴァリアントともに、ＳＷ１２２２細胞をインキュベートした後、結合したＦＩＴＣ標識化マウスＡ３３をＦＡＣＳｃａｎで定量することにより、競合アッセイが行われた。図８は、ＳＷ１２２２細胞へのマウス抗体とｈＩｇＧ１との結合に関するスキャッチャード分析を示している。これらのデータは、両方の抗体の形態が、１．３ｎＭの平衡解離定数（Ｋ^D's）を有しており、細胞当たりおよそ３００，０００の部位を有しているということを示唆している。ｈＴＦＭ^TMの抗原結合活性を一価のｈＦａｂ'△ｃｙｓ及びｈＩｇＧの抗原結合活性と、競合結合アッセイにおいて比較した。このアッセイにおいて、これらの種は、抗原を発現しているＣＯＬＯ２０５細胞への結合に対してマウスＩｇＧと競合させられた。結果（図９）は予想されるように一価のＦａｂ'フラグメントの結合は二価のＩｇＧと比べて、よくないということを明らかにしている。一方、三価のｈＴＦＭ^TMはｈＩｇＧよりもおよそ２倍の良好な結合を示しており、これはおそらくアビディティーの増加の結果であると考えられる。この知見は、キメラＢ７２．３で得られた結果と一致しており、キメラＢ７２．３でもＴＦＭ^TMはＩｇＧよりも２から３倍の良好な結合を示していた。図８は、ＳＷ１２２２細胞へのヒト化及びマウスＡ３３結合のスキャッチャードプロットを示している。実験の詳細は、材料と方法（materials and methods ）の通りである。マウスＡ３３ＩｇＧのＫｄ値１．２８ｎＭと、ヒト化Ａ３３ＩｇＧのＫｄ値１．２７ｎＭはデータポイントの線形回帰分析から計算された。図９は、ＣＯＬＯ２０５細胞へのｈＡ３３Ｆａｂ‘△ｃｙｓ、ＩｇＧ及びＴＦＭ^TM の結合に関する競合結合アッセイを表している。ｈＡ３３ＩｇＧ（◇）、ＴＦＭ^TM （｜）、ＴＦＭ^TM（□）、及びＦａｂ’△ｃｙｓ（△）はＦＩＴＣ標識化マウスＡ３３ＩｇＧによって競合され、結果は蛍光ユニット対ｎＭ結合部位としてプロットされた。次に、抗体を大環状のリガンドであるテトラアゾシクロドデカンエトラ酸（te traazocyclo dodecane etra-adid）（１２Ｎ４又はＤＯＴＡと呼ばれる）を介して⁹⁰Ｙで標識化した。このリガンド（１２Ｎ４）は、アントニウ（Ａｎｔｏｎｉｗ）他，“Ｐｒａｃｔｉｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｙｔｔｒｉｕｍ− ９０ＩａｂｅｌｌｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙＡ３３ａｎｄＡ３３ｔｒｉ−ｆａｂ（ＴＦＭ）ｆｏｒｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ”，ＩｎＰｒｅｓｓに記載されているように、１２Ｎ４−マイミドリンカーを介して免疫グロブリンに結合させた。ｈＡ３３−１２Ｎ４結合体の⁹⁰Ｙ及び¹²⁵Ｉによる放射線同位元素標識、及び、皮下にＳＷ１２２２腫瘍異種移植を有するヌードマウスにおける体内分布研究を、前述のアントニウ（Ａｎｔｏｎｉｗ）他，に記載されているように行った。抗体を、第２の大環状のリガンドである１，４，７−トリアザシクロノナントリ酢酸（1,4,7-triazacyclononanetriacetic acid）即ち９Ｎ３を介して、ターナー（Tｕｒｎｅｒ）他，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：３５〜４１（１９９４）に記載されているように９Ｎ３−マレイミドリンカーを用いて¹¹¹Ｉｎで標識化した。放射性同位元素標識の前と後の両方において、免疫結合体が完全な免疫反応性を示すことが、競合を基礎とするＦＡＣｓアッセイを用いて示された。体内分布実験に関して、放射性同位元素標識は＞９５％の⁹⁰Ｙが結合し、２μＣｉ／ μｇの特異的活性（放射能；activity）をもつように達成された。モルモットにおける体内分布研究が、オスの異系交配されたおよそ２５０〜３００グラムのＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモットへの静脈内投与後に行われた。４つのモルモットのグループがそれぞれ⁹⁰Ｙ−標識化成分を耳の静脈へ注射され、図１０に示されるように投与後、時間間隔をおいて犠牲にされた（殺された）。血液サンプルが採取され、そして前述のアントニウ（Ａｎｔｏｎｉｗ）他，によってマウスに関して記載されているように組織が分析された。５〜７ｋｇのカニクイザル（グループにつき２頭）における薬物動力学研究も、放射性同位元素標識された成分の静脈注射後に行われた。カウント（計数）のために血液サンプルを０．５、１、２、４、６、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間において採取した。図１０は、ＳＷ１２２２腫瘍異種移植を有するヌードマウスにおける⁹⁰Ｙ標識化ヒト化Ａ３３の体内分布に関するタイムコース研究を示している。マウスにそれぞれ１９μＣｉ（１０μｇ）の90Ｙ−標識化ｈＡ３３を静脈注射した。４つのマウス後に殺され、活性（放射能；activity）量が、腫瘍及び正常組織において測定された。各コラムは、４匹のマウスから得られた平均値を表している。エラーバーは平均値の標準偏差を表している。組織への取り込みは、グラム組織当たりの％注入線量（％injected dose）としてプロットされている。良好な体内分布が達成されており、高レベルの活性（放射能）が主要に局在し、どの正常組織においても蓄積はわずかであるか、又はなかった。ヒト化Ａ３３免疫結合体の体内分布は、同じ異種移植システムにおけるこれらの時点でのマウス抗体の体内分布と有意な差異はなかった。マウス及びヒト化抗体の両方について腫瘍に局在する活性（放射能）レベルは、他のすべての組織におけるレベルが減少しているにもかかわらず、時間とともに増加しており、その結果、時間中にわたって腫瘍対正常組織の比は増加することとなった（表２）。これが、抗体自身の特徴なのか、使用した放射性同位元素の特徴なのかを評価するため、¹²⁵Ｉで標識化したヒト化Ａ３３を用いた、体内分布実験も行った。この実験では、腫瘍によって保持されるアイソトープの絶対レベルはわずかに低かったが、腫瘍対血液比は非常に類似しており、これは、局在化の増加はアイソトープ／キレーターシステムの性質ではなくＡ３３抗体の特性であることを示唆している。腫瘍に局在化する¹²⁵Ｉ−ｈＡ３３の絶対レベルが低いのはおそらく、放射性ヨウ素化抗体の脱ハロゲン化の結果であろう。ヒト化ＴＦＭ^TMと、試験を行った他の全てのヒト化フラグメントは一貫してマウスの循環から以上に速く、同等のマウスフラグメントと比べてはるかに速く除去されるということが観察された。この現象はマウスに特異的であることが示され、ラット、モルモット、又はサルでは起らなかった。表３は、ｈＡ３３ＩｇＧ、ＤＦＭ^TM及びＴＦＭ^TMのモルモット中での体内分布の比較を示している。これは、ＤＦＭ^TMとＴＦＭ^TMのより速い血液クリアランスを表しており、１４４時間目において、これらの血液活性（放射能）はそれぞれ０．０１及び０．０２％注入線量／グラム（i.d./g）まで減少している。ｈＩｇＧの血液活性（放射能）はそれらよりかなり高く、その時点において０．４％注入線量／グラム（i.d./g）であった。表３は、ＤＦＭ^TMについては、ＩｇＧ及びＴＦＭ^TMと比べてかなり高レベルの放射能が腎臓によって取り込まれることを非常に明らかに表している。このＤＦＭ^TMについての高い活性（放射能）は血液からと比べて腎臓からの方がかなりゆっくりと消えていく。早い時点では、腎臓のレベルはＴＦＭ^TMとＩｇＧについては、わずかに高いが、これらはＤＦＭ^TMについてのレベルと比べるとかなり低く、活性（放射能）は、ＴＦＭ^TMの方がＤＦＭ^TMと比べてかなり速く腎臓から消える。Ａ３３に関するこれらの結果は、ｃＢ７２．３のＤＦＭ^TM及びＴＦＭ^TMに関する結果と一致しており、また、腎臓がＴＦＭ^TMを除去する器官であるという見解と一致する。それぞれのサルについて血液クリアランスパラメーターを測定するため、指数関数的な、非線形最小二乗法を適合させた手法が用いられた。投与後の時間の関数として、吸収線量のパーセントを算出するためにＩｇＧ、ＴＦＭ^TM及びＤＦＭ^TM についての血液クリアランスパラメーターの平均値を用いて適切な積分（inte grals）を行った。ヒトにおいては⁹⁰Ｙで標識化された場合、各形態の抗体（ＩｇＧ、ＴＦＭ^TM及びＤＦＭ^TM）によって運ばれたと考えられる、赤色骨髄についての吸収線量に関して評価が行われた。サルのデータは、早い時点では、投与された活性（放射能）の全てが血液循環中にあることを示しており、そしてこれはヒトについてもそうであるとみなされた。計算は、¹¹¹Ｉｎ及び⁹⁰Ｙで標識化された抗体の薬物動力学は互いに同じであり、サルとヒトにおいても同じであるという仮定に基づいて行われた。また、骨髄における放射性同位元素標識化抗体の特異的な取り込みはないと仮定され、数時間（＜５時間）後では、血液と骨髄における放射能は同じであるとされた。ヒトを代表する数値を作るために、以下の標準的な人間に関するデータ：５０００ミリリットルの総血液溶量；骨髄スペース；⁹⁰ Ｙベータ粒子についての吸収フラクション；そして骨内層の厚さ、が用いられた。⁹⁰Ｙベータ粒子は高エネルギーであるため、骨髄と骨内層における放射線吸収線量は全ての実際的な目的に関して同じである。図１１は、カニクイザルにおける、¹¹¹ＩｎｈＡ３３ＩｇＧ（■）、ＴＦＭ^TM （○）及びＤＦＭ^TM（▲）の薬物動力学プロフィールを表している。データは崩壊について補正されており、各時点において残存している注入線量の平均パーセンテージとしてプロットした。安全性を考慮したため、これらの成分は⁹⁰Ｙではなく¹¹¹Ｉｎで標識化した。というのは、以前の研究によって、⁹⁰Ｙ−標識化ＩｇＧ及びフラグメントは、¹¹¹ Ｉｎで標識化したものと非常によく似た薬物動力学と体内分布を示すことが、示唆されていたからである。血しょうクリアランスプロフィールは図１１に示されておりアルファ及びベータ相の半減期の値は表４に示されている。マウス及びモルモットでの薬物動力学データから予測されるように、ＴＦＭ^TM とＤＦＭ^TMはともに、ＩｇＧと比べて、（血液）循環から、速く除去される。それに加えて、ＤＦＭ^TMはＴＦＭ^TMと比べてより迅速に除去される。血しょうクリアランスをアイソトープに関する崩壊の補正を行わずに調べた場合（表５）、このデータは、ＩｇＧとＴＦＭ^TMについての一相性（monophasic）動力学及びＤＦＭ^TMについての二相性（biphasic）動力学と非常によく一致した。これらのデータに基づく線量測定計算の結果は、⁹⁰Ｙで標識化し、当量の放射能を注入した場合ＤＦＭ^TMはＩｇＧのおよそ５分の１の低さの骨髄への吸収線量を示す（表５）、ということを示唆している。一本鎖化抗体（single chain antibody：ＳＣＡ）も、ｍＡｂＡ３３から作成することができる。一本鎖化抗体はサイズが小さいため、腫瘍組織へ、より良好に拡散する。それらはまた短い血清半減期を有しており、そのため、例えば骨髄への毒性が弱くなる。血液からの迅速なＳＣＡの除去の結果、腫瘍による取り込みがより低くなる可能性がある。一本鎖化抗体ＳＣＡ−Ａ３３が作成された。この抗体はｍＡｂＡ３３の結合特異性を維持しており、インタクトなｍＡｂと比べて約３分の１の低さの結合親和力（binding affinity）を示す。ＳＣＡ−Ａ３３は、他の一本鎖化抗体と同様に、局所（local/rregional）灌流について、肝動脈を介して肝臓への転移のために、そして、上腸間膜動脈灌流を介して、一次病変のために治療上に使用することができる。本発明はここにおいて、特定の具体例に言及して記載されているが、これらの具体例は単に本発明の様々な側面を例示しているにすぎないということが理解されるべきである。従って、様々な改良が、これらの例示的な具体例の枠内でなされることが可能であり、他の組み合わせ（アレンジ）が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、考案され得るということが理解されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年６月２５日【補正内容】請求の範囲１．大腸ガンをわずらう患者に、薬学的に効果的な量の、マウス、ヒト化、キメラ、トリマー（trimeric）、ヘテロマー（heteromeric）、又は一本鎖化（sin gle chain）形態の抗体と抗ガン剤との結合体を投与することからなる、患者における腫瘍退縮を促進させる、又は、血清ＣＥＡレベルを減少させるための方法。２．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１の方法。３．前記モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項２の方法。４．前記抗ガン剤が、カリケアミシン（calihcheamicin）、ＱＦＡ、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシルからなるグループから選択される請求項１の方法。５．患者に、薬学的に効果的な量の、大腸ガンに特異的な抗体とペプチドとの結合体を投与することからなり、前記ペプチドは、大腸ガンのＤＮＡ活性を特異的に阻害するものである、大腸ガンをわずらう患者における腫瘍退縮を促進させる、又は、血清ＣＥＡレベルを減少させるための方法。６．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項５の方法。７．前記モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項６の方法。８．前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー（trimeric）抗体、ヘテロマー（heteromeric）抗体、及び一本鎖化（single chain）抗体からなるグループから選択される、請求項５の方法。９．患者に、薬学的に効果的な量の、マウス、ヒト化、キメラ、トリマー（tr imeric）、ヘテロマー（heteromeric）、又は一本鎖化（single chain）形態の抗体と、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、⁹⁹Ｔｃ、¹²⁵Ｔｃ、⁹⁰Ｙ、及び¹¹¹Ｉｎからなるグループから選択される放射性同位元素との結合体を投与することからなる、大腸ガンをわずらう患者における腫瘍退縮を促進させる、又は、血清ＣＥＡレベルを減少させるための方法。１０．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項９の方法。１１．前記モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項１０の方法。１２．前記モノクローナル抗体Ａ３３が、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ８７７９によって産生されたものである請求項１１の方法。１３．前記モノクローナル抗体１００−２１０が、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１１７６４によって産生されたものである請求項１１の方法。１４．前記モノクローナル抗体１００−３１０が、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１１０２８によって産生されたものである請求項１１の方法。１５．前記放射性同位元素が、¹²⁵Ｉである請求項９の方法。１６．遺伝物質を大腸ガン細胞のＤＮＡに伝える方法であって、前記細胞を、前記細胞内へ取り込まれる抗体と結合した遺伝物質と接触させることからなる方法。１７．前記抗体が、モノクローナル抗体Ａ３３、モノクローナル抗体１００−２１０及びモノクローナル抗体１００−３１０からなるグループから選択される請求項１６の方法。１８．抗ガン剤を大腸ガン細胞のＤＮＡに伝える方法であって、前記細胞を、前記細胞内へ取り込まれる抗体と結合した抗ガン剤と接触させることからなり、前記抗ガン剤は、カリケアミシン（calicheamicin）、ＱＦＡ、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシルからなるグループから選択される方法。１９．前記抗体が、モノクローナル抗体Ａ３３、モノクローナル抗体１００−２１０及びモノクローナル抗体１００−３１０からなるグループから選択される請求項１８の方法。２０．大腸ガン細胞と接触させた時に、大腸ガン細胞内へ取り込まれるペプチド −抗体結合体であって、前記ペプチドは大腸ガン細胞のＤＮＡ活性を特異的に阻害するものであるペプチド−抗体結合体。２１．大腸ガン細胞と接触させた時に、大腸ガン細胞内へ組み込まれる抗ガン剤 −抗体結合体であって、前記抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー（trim eric）抗体、ヘテロマー（heteromeric）抗体、及び一本鎖化（single chain）抗体からなるグループから選択される抗ガン剤−抗体結合体。２２．前記抗ガン剤が、カリケアミシン（calicheamicin）、ＱＦＡ、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシルからなるグループから選択される請求項２１の方法。２３．１９９４年１１月３０日に、ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託され、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７６４としてカタログされた、モノクローナル抗体１００−２１０を分泌するハイブリドーマ。２４．ハイブリドーマＨＢ１１７６４によって分泌されるモノクローナル抗体。２５．１９９４年１１月３０日に、ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｄに寄託され、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７６４としてカタログされている、モノクローナル抗体１００−３１０を分泌するハイブリドーマ。２６．ハイブリドーマＨＢ１１７６４によって分泌されるモノクローナル抗体。２７．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られたヒト化抗体。２８．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られたキメラ抗体。２９．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られたトリマー（trimeric）抗体。３０．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られた一本鎖化（sinngle chain）抗体。３１．大腸ガンをわずらう患者に、薬学的に効果的な量の、抗体及び抗体に結合したペプチドからなるグループから選択される物質を投与することからなり、前記ペプチドは大腸ガン細胞のＤＮＡ活性を特異的に阻害するものであり、そして前記抗体は大腸ガンに特異的である、患者における腫瘍退縮を促進させる、又は、血清ＣＥＡレベルを減少させるための方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 51/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 43/00 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者オールド，ロイド，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (72)発明者バレンズワード，エルスィエアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (72)発明者モンタルト，ニコラス，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (72)発明者グア，アリ，オスメイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345

Claims

【特許請求の範囲】１．患者に、薬学的に効果的な量の、抗体に結合した抗ガン剤を投与することからなり、前記抗体は大腸ガンに特異的である、患者における大腸ガンの影響を弱める方法。２．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１の方法。３．前記モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項２の方法。４．前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー（trimeric）抗体、ヘテロマー（heteromeric）抗体、及び一本鎖化（single chain）抗体からなるグループから選択される、請求項１の方法。５．前記抗ガン剤が、カリケアミシン（calicheamicin）、ＱＦＡ、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシルからなるグループから選択される請求項１の方法。６．患者に、薬学的に効果的な量の、大腸ガンに特異的な抗体とペプチドとの結合体を投与することからなり、前記ペプチドは、大腸ガンのＤＮＡ活性を特異的に阻害するものである、患者における大腸ガンの影響を弱める方法。７．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項６の方法。８．前記ノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項７の方法。９．前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー（trimeric）抗体、ヘテロマー（heteromeric）抗体、及び一本鎖化（single chain）抗体からなるグループから選択される、請求項６の方法。１０．患者に、薬学的に効果的な量の、大腸ガンに特異的な抗体と放射性同位元素との結合体を投与することからなる、患者における大腸ガンの影響を弱める方法。１１．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１０の方法。１２．前記ノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項１１の方法。１３．前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー（trimeric）抗体、ヘテロマー（heteromeric）抗体、及び一本鎖化（single chain）抗体からなるグループから選択される、請求項１０の方法。１４．前記放射性同位元素が、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、⁹⁹Ｉ、¹²⁵Ｔｃ、⁹⁰Ｙ、及び¹¹¹Ｉ nからなるグループから選択される請求項１０の方法。１５．遺伝物質を、大腸ガン細胞のＤＮＡに伝える方法であって、前記細胞を、前記細胞内へ取り込まれる抗体と結合した遺伝物質と接触させることからなる方法。１６．前記抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項１５の方法。１７．抗ガン剤を大腸ガン細胞のＤＮＡに伝える方法であって、前記細胞を、前記細胞内へ取り込まれる抗体と結合した抗ガン剤と接触させることからなる方法。１８．前記抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項１７の方法。１９．前記抗ガン剤が、カリケアミシン（calicheamicin）、ＱＦＡ、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシルからなるグループから選択される請求項１７の方法。２０．大腸ガン細胞と接触させた際、大腸ガン細胞内へ取り込まれるペプチド− 抗体結合体。２１．大腸ガン細胞と接触させた際、大腸ガン細胞内へ組み込まれる抗ガン剤− 抗体結合体。２２．ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに、１９９４年１１月３０日に寄託され、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７６４としてカタログされている、モノクローナル抗体１００−２１０を分泌するハイブリドーマ。２３．ハイブリドーマＨＢ１１７６４によって分泌されるモノクローナル抗体。２４．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られたヒト化抗体。２５．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られたキメラ抗体。２６．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られたトリマー（trimeric）抗体。２７．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られた一本鎖化（sinngle chain）抗体。