JPH11506435A

JPH11506435A - Method for treating colorectal cancer using tumor-specific antibodies

Info

Publication number: JPH11506435A
Application number: JP8535805A
Authority: JP
Inventors: ウェルト，シドニー; オールド，ロイド，ジェイ; バレンズワード，エルスィエ; モンタルト，ニコラス，ジェイ; グア，アリ，オスメイ
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1995-05-25
Filing date: 1996-05-21
Publication date: 1999-06-08
Also published as: EP0831905A4; US5851526A; AU5867996A; CA2221935A1; US5958412A; AU709694B2; EP0831905A1; WO1996037224A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＨＬＡ−Ａ１等のＨＬＡ分子に依るノナペプチドに関する。得られる複合体は、細胞溶解性Ｔ細胞によって同定される。このような認識は、診断又は治療的に利用可能である。 (57) [Summary] The present invention relates to nonapeptides based on HLA molecules such as HLA-A1. The resulting complex is identified by cytolytic T cells. Such recognition can be used diagnostically or therapeutically.

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍特異的抗体を利用する大腸ガンの治療方法関連出願のクロスリファレンス本出願は、放棄された１９８５年４月１９日出願の米国特許出願第０６／７２４，９９１号の継続出願である、放棄された１９８７年１１月６日出願の米国特許出願第０７／１１８，４１１号の一部継続出願である、放棄された１９８９年３月２３日出願の米国特許出願第０７／３２７，７６５号の継続出願である、放棄された１９９１年３月１８日出願の米国特許出願第０７／６７３，１５３号の継続出願である、継続中の１９９３年２月１６日出願の米国特許出願第０８／０２０，２２３号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、少なくとも一種のモノクローナル抗体を利用して、大腸ガン腫瘍の影響を弱める方法に関する。具体的には結腸直腸ガン（大腸ガン）の治療において、少なくとも一種のモノクローナル抗体が、抗腫瘍剤、ＤＮＡ腫瘍活性を阻害するペプチド、又は、放射性同位元素（ラジオアイソトープ）と結合した形で利用される。本発明はさらに、腫瘍細胞のＤＮＡに遺伝物質を運ぶ（伝える）方法、及び、大腸腫瘍細胞の核に抗ガン剤を運ぶ（伝える）方法、そして、大腸ガン細胞上にみられる抗原であるＡ３３抗原に特異的なモノクローナル抗体に関する。発明の背景結腸直腸ガン（大腸ガン）は悪性腫瘍性の疾患である。西洋、特に米国における結腸直腸ガンの発病率は高い。このタイプの腫瘍はしばしばリンパ管及び血管を介して転移する。結腸直腸ガンをわずらう多くの患者が結局この疾患によって死亡する。事実、米国だけで、毎年６２０００人が結腸直腸ガンによって死亡していると見積もられている。今日まで、結腸直腸ガンの治療のための、全身療法及び化学療法が開発されてきた。しかしながら、転移疾患を伴う結腸直腸ガン患者の生存を、いくらかの確実性をもって延長させるのに十分な抗腫瘍活性を示す療法は存在していない。結果として、結腸直腸ガンの有効な治療方法の開発がいまだ必要とされている。従って、本発明の目的は大腸ガンの影響を弱める方法を提供することである。本発明のもう一つの目的は、遺伝物質を、大腸ガン細胞のＤＮＡに運ぶ（伝える）方法を提供することである。本発明のさらなる他の目的は、抗ガン剤を大腸ガン細胞の核に運ぶ（伝える）方法を提供することである。本発明のさらなる他の目的は、大腸ガンの治療において有用な、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー(trimeric)抗体、ヘテロマー(heter omeric)抗体、及び一本鎖化（single chain）抗体を含む抗体を提供することである。発明の概要本発明は、腫瘍に結合する、抗体結合体（抗体複合体：antibody conjugates ）の投与からなる、大腸ガンの影響を弱める方法に関する。具体的には、大腸ガン細胞と結合する抗体と、抗ガン剤との、少なくとも一種の結合体（conjugate ）が投与される。又は、大腸ガン細胞に対して特異的な抗体と、大腸ガン細胞のＤＮＡ活性を阻害するペプチドとの、少なくとも一種の結合体が、大腸ガンの影響を弱めるために薬学的に効果的な量で投与される。大腸ガンの影響を弱めるもう一つの方法は、大腸ガンの腫瘍に対して特異的な抗体と、放射性同位元素（ラジオアイソトープ）との少なくとも一種の結合体を薬学的に効果的な量で投与することからなる。本発明はさらに大腸ガン細胞に遺伝物質を運ぶ（伝える）方法に関し、これは、腫瘍細胞内に取り込まれる抗体に結合された遺伝物質を、腫瘍細胞と接触させ、それによって、ＤＮＡへの遺伝物質の組み込みを媒介させることからなる。それに加えて、大腸ガン細胞に取り込まれる抗体と結合した抗ガン剤を、その細胞と接触させることによって大腸ガン細胞の核（ＤＮＡ）に抗ガン剤を運ぶ（伝える）ことができる。本発明はさらに、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー抗体、ヘテロマー抗体、及び一本鎖化抗体を含む抗体に関し、これらは大腸ガンの影響を弱めるために利用することができる。図面の簡単な説明上記の簡単な説明、そして本発明のさらなる目的と特徴は、後述の、例示的ではあるが現在好適とされる、本発明の実施例の詳細な説明と、添付の図面を結び付けて参照することで、より完全に理解されるであろう。添付の図面において、図１は、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３が肝臓の病変部に蓄積し、周囲の正常な肝臓組織には蓄積しないことを示す、オートラジオグラフである。図２はｍＡｂＡ３３に結合した放射性同位元素¹³¹Ｉが腫瘍細胞内に取り込まれ、周囲の組織には見られないことを示すオートラジオグラフである。図３はガンの病巣に対する¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の効果を表している。図４はｈＡ３３ＩｇＧ１とｈＡ３３Ｆａｂ’△ｃｙｓの発現ベクターを表している。図５はヒト化Ａ３３抗体の重鎮と軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を表している。図６は還元条件下と非還元条件下のヒト化Ａ３３ＩｇＧ及びＴＦＭ^TMのＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表している。図７はｈＡ３３Ｆａｂ’、ＴＦＭ^TMとのクロスリンク後のｈＡ３３Ｆａｂ’、及び精製ｈＡ３３ＴＦＭ^TMのＨＰＬＣプロフィールを表している。図８はヒト化及びマウスＡ３３のＳＷ１２２２細胞に対する結合のスキャッチャードプロットを表している。図９はｈＡ３３Ｆａｂ’△ｃｙs、ＩｇＧ、及びＴＦＭ^TMのＣＯＬＯ２０５細胞に対する結合の競合結合アッセイを表している。図１０はＳＷ１２２２腫瘍の異種移植をうけたヌードマウスにおける⁹⁰Ｙ−標識化ヒト化Ａ３３の体内分布を示している。そして、図１１はカニクイザルにおける¹¹¹ＩｎｈＡ３３ＩｇＧ、ＴＦＭ^TM、及びＤＦＭ^TMの薬物動力学プロフィールを示している。発明の詳細な説明マウスモノクローナル抗体Ａ３３（ここにおいてｍＡｂＡ３３と称される）は、抗原Ａ３３と呼ばれる細胞表面抗原を規定するＩｇＧ２ａアイソタイプのモノクローナル抗体であり、抗原Ａ３３は結腸直腸ガンの９５％以上において、また正常な腸粘膜において存在する（表１を参照のこと）。結腸直腸ガンではＡ３３抗原は、抗原−陽性病変の９５％以上において、細胞表面に均一に分布して発現している。さらに、Ａ３３抗原は大腸ガンにおいてその組織の分化の程度にかかわらず、また初発病変にも、肝臓転移を含む転移病変にも見られる。抗原Ａ３３は、抗原Ａ３３−陽性大腸ガン患者の血清中にも、粘液性大腸ガンの腫瘍分泌物中にも、また抗原Ａ３３−陽性大腸ガン細胞系の上清中にも検出されていない。これは抗原Ａ３３が分泌される分子ではないことを示唆している。正常な消化管において抗原Ａ３３は、正常な小腸粘膜及び大腸粘膜に見られ、それらの陰窩を通じて均一な細胞表面分布を示している。３００以上の異なる組織タイプの腫瘍における、また正常なヒトの成人及び胎児組織における抗原Ａ３３発現の詳細な調査により、この抗原の制限された分布パターンが示された。後述するように、本発明者らは、腫瘍形成組織のなかで、抗原Ａ３３は、大腸ガン及び腸上皮化生を示す胃ガンの一部において存在するが、テストされた他の上皮ガンのいずれにおいても存在しないことを見出した。抗原Ａ３３は、肉腫、神経外胚葉腫瘍、そしてリンパ性腫瘍には存在しないことが判った。これらの組織はすべて抗原Ａ３３−陰性であることが判った。参考文献として本出願にその全内容が合体される米国特許第５，１６０，７２３号に開示されているように、モノクローナル抗体Ａ３３は大腸ガン細胞表面に見られる抗原Ａ３３に特異的であり、それゆえ大腸ガンに対して特異的である。その結果、モノクローナル抗体Ａ３３、及び抗原Ａ３３−特異的である他の抗体は、大腸ガンの診断に利用できる。それらの抗体は、抗ガン剤、ペプチド、又は、放射性同位元素と結合させて大腸腫瘍の治療に利用することができる。例１ −マウスに異種移植したヒト大腸腫瘍における¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３のインターナリゼーション抗原Ａ33は、免疫療法研究に有用となるようないくつかの特徴を有している。それは、初発病変と転移病変とを含む、結腸直腸ガンの９５％以上において存在している。それは腫瘍小節（tumor nodules）に均一に発現しており、血流中へは分泌されない。さらに¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３及び¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３の臨床的評価によって、非常に良好に転移大腸ガン部位にターゲッティングされること、及び、わずかに限られた毒性を伴う臨床応答の証拠が示された。ｍＡｂＡ３３に対する生体組織検査に基づく定量的線量測定データは、ｍＡｂＡ３３が効果的かつ安全な放射線免疫療法に使用可能であることを示している。モノクローナル抗体Ａ３３が米国特許第５，１６０，７２３号（'７７２３特許）に開示されている手順によって¹²⁵Ｉ放射性同位元素標識された。この¹²⁵Ｉ −標識化Ａ３３モノクローナル抗体をここで¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３と呼称する。¹ ²⁵ Ｉ−ｍＡｂＡ３３は、ヒト大腸腫瘍を異種移植されたｎｕ／ｎｕマウスに投与された。このマウスは、その後、¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３局在について研究された。放射性同位元素標識したモノクローナル抗体Ａ３３の局在場所のパラメーターは、Ａ３３−陽性大腸ガン細胞系ＳＷ１２２２を用いてｎｕ／ｎｕマウスにおいて評価された。イン・ヴィトロでの培養ＳＷ１２２２細胞におけるｍＡｂＡ３３の動力学及び輸送について多くのことが分かっているので、このモデルは特に興味深いものである。具体的には、ｍＡｂＡ３３はＳＷ１２２２細胞内にすばやく取り込まれること（１時間以内に約３３％）；ｍＡｂＡ３３のインターナリゼーションの経路は、細胞膜ラッフリングによって生じるマクロピノソームを介していること；ＳＷ１２２２細胞は、平均すると細胞あたり８００，０００分子のｍＡｂＡ３３に結合すること；これらの細胞による¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３保持のｔ1/2〜１４時間であること；そして細胞内に取り込まれたｍＡｂＡ33のほとんどはインタクトな免疫反応性を有する形態で放出されること、が知られている。放出されたｍＡｂＡ33は腫瘍細胞に再び結合することができ、その結果、このモノクローナル抗体の取り込み／保持（uptake/retention）はより高くなる。これはマウスとヒトとの両方で起ることである（ヒトのデータは後述する）。注入後２４〜４８時間での¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３の腫瘍への取り込みピークは３５〜４０％グラム当たり注入線量（injected dose/g）であった。腫瘍：肝臓の比は３０：１から４０：１の範囲であり、腫瘍：血液の比は１０：１から１５：１の範囲であった。これらの値は、投与したモノクローナル抗体の線量（the dose）に依存していくらかの小さい変動を示した。そして、腫瘍への取り込みは、過剰量の非標識化ｍＡｂＡ３３の静脈内への投与によって阻害されうるのに対し、関連のないネガティブコントロールｍＡｂによっては阻害されないことから、局在パラメーターは抗原特異的であるということが判った。125Ｉ−ｍＡｂＡ３３は腫瘍異種移植から、ｔ1/2＝６０時間で除去される。これに対して¹¹¹Ｉｎで放射性同位元素標識されたｍＡｂＡ３３は、４５％グラム腫瘍当たり注入線量（injected dose/g tumor）の局在を示し、この放射性同位元素（アイソトープ）の保持は有意に長い（７日以上）。これは、おそらく¹¹¹Ｉｎの細胞質トラッピングによると考えられる。この、ｍＡｂＡ３３の腫瘍への局在のイン・ヴィヴォモデルは、様々な抗体結合体の相対的な有効性を評価することにおいて、また、様々な放射性同位元素（アイソトープ）に関する線量測定計算のために、非常に価値の高いものである。例２大腸ガンをわずらう人における¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３のインターナリゼーションＡ３３抗原システムは免疫療法に使用することができる。それは特にこの用法（免疫療法）に好適である。というのは、抗原Ａ３３−ｍＡｂＡ３３複合体は大腸ガン細胞に、迅速にインターナリゼーション（細胞内への取り込み）されるからである。さらに細胞内に作用部位を有するｍＡｂＡ３３結合体は、イン・ヴィトロ及びイン・ヴィヴォで大腸ガン細胞を殺す能力を有する。本発明者らは、ヒトにおける¹²⁵Ｉ−標識化ｍＡｂＡ３３の局在場所と細胞障害性効果について研究した。¹²⁵Ｉ放射性核種は、主に近距離（short-range）オージェ電子によってその細胞障害性効果を発揮する。この近距離オージェ電子は細胞核にきわめて近接して（＜１〜４μｍ）生じた場合に最も効果的である。それゆえに¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３と比較した際の¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３の、予期される利点の１つは骨髄に対する毒性が少ないことである。５０ｍＣｉ／ｍ²の初期線量（initial dose）の¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３によって治療された患者においては毒性はみられなかった。コリメーターを用いた外部からの¹²⁵Ｉ放射能探査（¹ ²⁵ Ｉscanning）による、腫瘍の画像診断をすべての患者について行ったところ、抗体注入後３５日までに明確な（陽性の；positive）の腫瘍の画像が生じた。これまでは¹²⁵Ｉ放射の小部分（smallfraction）のみがスキャニングに適していると考えられていたので、この結果は驚くべきものであった。 ¹²⁵Ｉ放射の大部分は非常に近距離で作用しており、明確な画像（positive im ages）はかなりの腫瘍での線量（tumor doses）の存在を示唆している。最初の９人の患者の中で、１人は治療後４週間目において。３５％のガン胎児性抗原（ＣＥＡ）レベルの現象を伴う応答を示した。１人の患者については、この患者が肺病変の切除をうけるため評価することができなかった。¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３投与の結果、腫瘍退縮がおこった。また、¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３を投与される前には化学療法に対して応答しなかった患者が¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３投与後には化学療法に応答するようになった（即ち、腫瘍退縮がおこった）。従って、本発明の抗体−放射性同位元素結合体は、患者を化学療法に対して敏感にさせるために使用可能である。例３大腸ガンをわずらうヒトにおける、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の体内分布結腸直腸ガンが肝臓に転移していると推測される、手術前の患者における、¹³ ¹ Ｉ−標識化ｍＡｂＡ３３の体内分布について研究した。これは、外部スキャニング技術（external scanning techniques）及び生体組織検査に基づく線量測定（biopsy-based dosimetry）によって判定される、ｍＡｂＡ３３のターゲティング能力を立証するため、そして、ｍＡｂＡ３３ターゲティングが、関連性はないがアイソタイプは一致するネガティブコントロールｍＡｂであるｍＡｂＴＡ９９と比較した場合に、抗原特異的であるということを示すために行われた。最適レベルの免疫反応性を保持させつつ、効率的で一定した、ｍＡｂの放射性同位元素標識をすることが放射性免疫療法には欠くことができない。臨床前の評価により、ｍｇタンパク質当たり５０ｍＣｉの¹³¹Ｉ（５０ｍＣｉ¹³¹Ｉ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ）までで標識したｍＡｂＡ３３は、連続的吸収分析（sequential absorptionanalysis）で測定したところ、もとの免疫反応性の４０〜７０％を保持していることが示された。約１５ｍＣｉ／ｍｇ（実際の範囲１２．５〜２２ｍＣｉ／ｍｇ）の特異的活性を達成するように計画されたプロトコールを用いて、５１の線量のｍＡｂＡ３３が４２のヨウ素化手法で標識化された。１７人の患者が４０〜７０％の免疫反応性を有するサンプルを与えられた。６人の患者は４０〜７０％の免疫反応性をもつ¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３と、２０〜３５％の免疫反応性をもつもののいくらかの調製物を与えられたが、これは最適状態に及ばないと考えられる。１７人の患者が５段階の線量（dose）レベル（０．２〜５０ｍｇ）で、¹³¹Ｉ −ｍＡｂＡ３３を投与され、３人の患者が¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３（２ｍｇ）とともに、関連性はないが、アイソタイプは一致するネガティブコントロールである¹³¹ Ｉ−ｍＡｂＴＡ９９（２ｍｇ）を与えられた。注入の１時間以上後、¹³¹Ｉ− ｍＡｂＡ３３及びコントロール¹³¹Ｉ−ｍＡｂＴＡ９９のピーク血清レベルは、試験したすべての線量レベルについて、２８％ＩＤ／リットルに達した。これは同じ患者での^99mＴｃ−ＨＳＡ血清研究から判定されるように、血管内の血しょう容量（メジアン：median２．５７リットル）中に自由に分布しているということと一致する。血中からの¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の除去（クリアランス）は、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の半減期が、ネガティブコントロールの¹³¹Ｉ−ｍＡｂＴＡ９９のレベルよりも迅速に減少すると、判明したことを示していた。これは、ほぼおそらく、抗原−陽性腫瘍組織によるイン・ヴィヴォでの¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の吸収に起因すると考えられる。 ¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３で処置された１７人の患者において、合計４６の肝臓への転移が手術によって証明され、これらのうち４５は全身の平面の、又はスポット・ビューの腹部の画像で確認された。２つの初発大腸ガンも外部からのスキャンによって見ることができたが、局所のリンパ節への転移は、生体組織検査に基づく線量測定によると類似の腫瘍：正常組織比を示したのにもかかわらず、腹部における近接した取り込み部位と区別することができなかった。肝臓転移の血管分布が^99mＴｃ−ＨＳＡスキャン及び生体組織検査に基づく線量測定によって、評価された。^99mＴｃ−ＨＳＡスキャンによって、これらの病変の特徴である血管像過小が確認された。これは、周囲の、関係のない肝臓と比較して光の少ない（photopenic）部分として現われた。同様に、生体組織検査により^99mＴｃの腫瘍：肝臓比は０．１４：１から１．１９：１の範囲であり、ほとんどの病変は０．６０以下の値を有することが示された。ネガティブコントロールｍＡｂである¹³¹Ｉ−ｍＡｂＴＡ９９に関する試験では、ただ１人の患者においてかすかな陽性の画像がみられたが、腫瘍への取り込みはごく少ないことが示され、腫瘍：肝臓比は１．１：１から５．４：１であった。これに対して¹³¹ Ｉ−ｍＡｂＡ３３は生体組織検査から判定して、１００：１までもの腫瘍：肝臓比を生じさせた。¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３が肝臓病変部に特異的に蓄積し、周囲の正常な肝臓には蓄積しないということは、併用したオートラジオグラフィーと、（図１及び図２を参照）凍結組織切片を用いた免疫組織化学によっても見ることができた。 ¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の可変性を伴う、正常な腸への局在が見られた。何人かの患者におけるスキャンは腸のいくらかの部分の標識化を示しており、ある場合には正常な大腸のはっきりとした輪郭がみられた。しかし、他の場合では最低限の正常な大腸の画像のみがみられた。手術中に切除された正常大腸の切片を用いた試験では、試験片をリン酸緩衝食塩水で簡単に洗浄することにより、かなりの量の放射性同位元素標識が回収できることが示された。従って、少なくとも、いくらかの¹³¹Ｉ −ｍＡｂＡ３３の正常な腸による見かけの取り込みは、胃によって分泌された遊離の¹³¹Ｉの存在、又は、結合アフィニティーが低い場合のモノクローナル抗体の存在を示している可能性がある。Ａ３３−陽性の、正常な小腸と大腸の腸粘膜に¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３がより強固に蓄積しないという所見は、正常粘膜中の抗原が近づくことが容易でないということに関係しているのかもしれない。例４大腸ガンをわずらうヒトにおける¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の治療効果進行した大腸ガンをわずらう患者において、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３の治療試験が行われた。２３人の患者が研究に参加し、１回の注入として３０ｍＣｉ／ｍ² の¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３を、又は３日つづけての注入によって、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３を与えられた。２人の患者（Ｎｏ．１４及びＮｏ．１８）は追跡調査することができず、（最も悪い状態の時期（nadir time）における血液サンプル数が不十分であった）治療後、１ヶ月以内に進行性の疾患によって死亡した２人の患者（Ｎｏ．２及び２２）については不完全な毒性評価した行われなかった。組織のスライドを観察したところ、１人の患者（Ｎｏ．１０）は、大腸ガンではなく小腸ガンを有することが判明した。この研究に含まれた患者についてＡ３３免疫組織化学のための凍結組織が得られなかったため、この研究における封入体（incl usion）の診断基準としての抗原型検査をすることができなかった。Ａ３３に対する利用可能なｍＡｂは、型通りに固定された、パラフィン−固定化材料における抗原の検出に用いることができない。治療の１から３週間後、治療された２３人の患者のうち２０人については、ＣＴスキャン又は胸部Ｘ線によって独立して同定された腫瘍部位について陽性の¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３スキャンが示された。腹部内の疾患が外科的に証明され、ＣＥＡレベルが上昇している２人の患者については、ＣＴスキャンによっても¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３スキャンによっても可視化されず、小腸ガンである、１人の患者（Ｎｏ．１０）については、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３スキャン陰性であった。この研究に含まれた全ての患者で、１回の治療サイクル後にヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が現われ、治療後４週間までのＩｇＭ及びＩｇＧ両方に対するタイターは、１：１０，０００から１：１００，０００であった。観察された主な毒性は、血しょう板減少症と好中球減少症であり、それらの重症度は概して線量依存的であった。しかし、テストした各線量レベル（＞＝４５ｍＣｉ／ｍ²）において、以前に大量の化学療法をうけた患者は、たとえ¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３治療時に血しょう板数が正常範囲にまで回復していても、とても顕著な、及び／又は長期にわたる骨髄の（免疫の）抑制の徴兆を示した。このような血液毒性の患者による相違は、全身のアイソトープクリアランス速度によって測定される、¹³¹ Ｉの保持の差違に起因するものではなかった。そうではなく、それ（血液毒性の患者による相違）は放射線ダメージに対する、内因性の感受性と反映しているようであった。７５〜８４ｍＣｉ／ｍ²で治療された５人の患者のうち１人の患者は（Ｎｏ．１１）は、グレード３の血しょう板減少症（最も悪い状態（nadia）で２日間、３３，０００／マイクロリットル）が現われ、３人の患者（Ｎｏ．１３、１４、及び１５）は毒性効果を示さなかった。患者Ｎｏｓ．１１と１２は以前に、ＢＣＮＵ、ストレプトゾチシン（streptozoticin）、ビンクリスチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びロイコボリンによる治療をうけており、一方、患者Ｎｏ．１３、１４と１５は５−ＦＵとロイコボリンのみを与えられていた。８６〜９４ｍＣｉ／ｍ²の¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３を与えられた６人の完全に評価な患者（Ｎｏ．１６、１７、１９、２０、２１及び２３）の中で、２人（Ｎｏ．２１と２３）はグレード４の毒性を示し、１人はグレート１の毒性を示し、３人は毒性を示さなかった。グレート４の毒性を示した２人の患者のうち、患者Ｎｏ．２１は、以前に大量の化学療法（５−ＦＵ、インターフェロンα、ＢＣＮＵ、ストレプゾトチシン、及びビンクリスチンを３０ヶ月間以上別々のプロトコールで）を受けており、¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３治療後、迅速に、かつ長期にわたる血しょう板数及び好中球数の抑制を示した。血しょう板減少症が現われた２人の患者（Ｎｏ．２１と２３）では好中球減少症がみられた。他の２人の患者（Ｎｏ．１８と２２）は、彼らの最も悪い状態の期間（nadir period）中に一度の血液試験しか受けなかったため、完全な評価はできなかったが、少なくともグレード２及びグレード３の好中球毒性を有していた。一般に、全白血球数の減少には、リンパ球減少症が伴ったが、個々のリンパ球サブセットに関しては分析は行われなかった。治療反応性に関しては、胸部Ｘ線又はＣＴスキャンによって判定された疾患をわずらう１８人の患者、及び血清ＣＥＡレベルによっては、判定可能な疾患を示したが、Ｘ線撮影研究によっては判定可能な疾患を示すことができなかった３人の患者について、評価が行われた。２人の患者については追跡調査ができない、又は腫瘍を手術で切除したという理由で評価することができなかった。混合応答（ mixed responses）の証拠が５人の患者（Ｎｏ．３、５、７、９、及び２３）において得られた。患者Ｎｏ．３は肝臓への転移と細胞学で判明した悪性の腹水症を示しており、治療前は利尿剤（ラシックス、アルダクトン）によって安定化させられていた。¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３注入後、腹水液中に大量の放射性同位元素の蓄積が検出された。治療の１ヶ月後、この患者の体重は８ｋｇ減少し、腹水症は消失し、そして血清ＣＥＡレベルは３７５０〜４２００ｎｇ／ミリリットル（治療前）から２０００ｎｇ／ミリリットルに減少した。その後、利尿剤を続けることをやめ、血清ＣＥＡレベルはほぼ４ヶ月間１７５０ｎｇ／ミリリットルに安定した。肝臓への転移はＸ線撮影法基準によると変化しないままであった。１０週間後に¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３による再治療を試みた；しかしながら、ＨＡＭＡ応答のためアイソトープの蓄積は肝臓及び脾臓にのみみられ、腫瘍部位においてはみられなかった。患者Ｎｏ．５は、右胸部に広範囲な胸膜の疾患と、左胸部に測定可能な病変と、肝臓への転移をわずらっていた。¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３治療の３週間後、左胸部の病変ははっきりとはみえなくなり、２ヶ月後には、消失した（図３を参照のこと）。他の測定可能な疾患部位は５ヶ月間安定に残っていた。患者Ｎｏ．９は肝臓への転移、骨盤における大きな凝集性物質の塊（large pelvic mass）、及び左鎖骨上と頚部における大きなリンパ節を含む広範囲な腹部の疾患を有していた。¹³¹Ｉ−ｍＡｂＡ３３治療の４週間後リンパ節は触診できないようになったが、１ヶ月後彼女の骨盤における凝集性物質の塊は、大きさを増していた。患者Ｎｏ．７と２３では、血清ＣＥＡレベルが、１６週間以上にわたり、それぞれ２２％及び３０％減少した；しかし、疾患の進行のより詳細な評価は、どちらの患者も放射線医学検査によって測定可能な疾患を有していなかったため、不可能であった。混合反応の証拠を示す患者と示さない患者との比較によっては、一貫した相違は明らかにならなかった。具体的には、腫瘍部位への放射性同位元素の取り込みレベル（スキャンから判定したもの）と測定可能な応答との間の明らかな相関関係は現われなかった。抗体結合体の調製モノクローナル抗体Ａ３３は抗ガン剤と結合させて、ガンの治療のために投与することができる。例えば、ｍＡｂＡ３３は、抗葉酸剤であるＱＦＡと、又は腫瘍細胞の二本鎖ＤＮＡを切断する抗腫瘍抗生物質である、カリケアミシン（cali cheamicin）と結合させることができる。ＱＦＡとカリケアミシンは両者とも細胞内に作用部位を有しており、容易に細胞膜を通り抜けることができない。従って、それらは細胞培養物に添加した場合、弱い細胞障害性効果を示す。ｍＡｂＡ３３−仲介インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞内への取り込みは、これらの細胞障害性効果をイン・ヴィトロで大幅に増強させる。イン・ヴィヴォの異種移植研究では、ｍＡｂＡ３３−ＱＦＡ及びｍＡｂＡ３３−カリケアミシン結合体の両方によって正常組織の損傷を制限させつつ、腫瘍を阻害することができることが示されている。他の抗ガン剤も、本発明の抗体と結合させることができ、ガンの治療のために使用することができる。他の抗ガン剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシルが含まれる。モノクローナル抗体Ａ３３は、大腸ガン細胞及び正常大腸細胞（normalcolono cytes）の両方に遺伝物質をターゲティングするためにも使用可能である。というのは、それは迅速に標的細胞中に取り込まれるからである。Ａ３３抗原は抗体を細胞内区画であるマクロピノソームに伝える。トランスフェクションされたＤＮＡもマクロピノソーム区画上を移動し、加水分解を免れて最後に染色体ＤＮＡに組み込まれる。ｍＡｂＡ３３−薬剤結合体に関しては、Ａ３３抗体が薬剤を核のＤＮＡへと伝える。同様に、ｍＡｂＡ３３を利用して、遺伝物質を細胞内に運ぶことができる。例５Ａ３３−オリゴヌクレオチド結合体異種の二官能基をもつ試薬（heterobifunctional reagent）ＳＰＯＰを用いて、３’末端に遊離の反応性のチオール基を有する２６マーのオリゴヌクレオチドがｍＡｂＡ３３の遊離のアミンに結合された。このオリゴヌクレオチドの５’末端はＤＮＡのトレーサーとして³²Ｐで酵素によって標識化された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと還元したゲルは、オリゴヌクレオチド／ｍＡｂ比の範囲を含む生成物と一致するパターンを示した。プロテインＡクロマトグラフィーによって精製がなされた。最終生成物は滅菌ろ過（除菌）され、細胞結合活性及び、タンパク質と結合したオリゴヌクレオチドの濃度についてテストされた。最終精製生成物は、Ａ３３抗原を発現している大腸ガン細胞系ＳＷ１２２２を用いてテストされた。低ｐＨが、ｍＡｂＡ３３の、その抗原への結合を逆転させるという能力に基づいて、インターナリゼーションの割合を定量するためのプロトコールを開発した。これは、ｍＡｂＡ３３−³²Ｐ−ＤＮＡの結合とインターナリゼーションを¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３の結合とインターナリゼーションと比較し、分析するために用いられた。放射性同位元素標識したｍＡｂＡ３３結合体の細胞への特異的な結合を阻害するために、過剰量の、非標識化・非修飾・ｍＡｂＡ３３が用いられた。これにより、すべての細胞結合は、特異的であり、ｍＡｂＡ３３とその抗原との相互作用によって媒介されているということが明らかになった。アッセイは９６穴プレートにおいて行われ、対数増殖期の細胞をウェル当たり１００，０００細胞用いた。２４時間後ウェルに添加された³²Ｐのうち７．２％が細胞に結合した。４８時間後には、６０％以上の³²Ｐが細胞内に取り込まれた。抗−アクチンＤＮＡを用いた場合の抗腫瘍効果は、移植されたＳＷ１２２２細胞を有するヌードマウスにおいて、観察された。これらの結合体は、トレーサーとして、³²Ｐも含んでおり、³²Ｐが抗腫瘍効果にいくらか寄与していたという可能性がある。しかし、放射能量が低かったので（１０μＣｉ／マウス）アイソトープ（isotype）単独から予測される効果は極めて小さいであろうと考えられる。本発明の抗体結合体は、この分野に習熟したものにとって周知の、様々な経路によって投与することができる。経路の例を挙げると、これらは静脈内に、腹膜内に、筋肉内に、皮下に、又は経口的に（例えばウイルスと結合させて）投与することができる。本発明の抗体結合体は、製薬学的に許容しうる担体を組み合わせた組成物形態においても投与することができる。本発明の抗体結合体は、約０．１ｍｇから２０００ｍｇの投与量の範囲で投与することができる。しかし、投与量範囲は、治療すべき患者の状態、患者の治療歴（medical histoy）、投与方法、及びその他のいくつかの因子に依存して、治療すべき患者に応じて変化するであろう。例６Ａ３３システムのキャラクタライゼーションＡ３３システムの特性を明らかにするためにいくつかのＡ３３−陽性大腸ガン細胞系が、細胞当たりのｍＡｂＡ３３結合部位の数を測定するのに用いられた。細胞当たり８００，０００以上の部位が存在することが判った。ｍＡｂＡ３３結合の親和力は高いということが判った。同じ細胞系を用いて、Ａ３３抗原は迅速に細胞内に取り込まれる抗原であることが示され、ヒト内部で２４時間以上にわたり９０％までものインターナリゼーションがおこることが示された。培養大腸ガン細胞への¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３の結合動力学の研究、酸での洗浄実験、及び細胞抽出物と培養上清とのＳＤＳ−ゲル分析により細胞内に取り込まれたｍＡｂＡ３３の８０〜８５％が細胞内区画を循環し、約１〜２日の間に、細胞からインタクトな免疫反応性を示す形態で放出されることが示された。細胞内に取り込まれた¹²⁵Ｉ−ｍＡｂＡ３３のうち、ほんのわずかな量のみがインターナリゼーションの後、分解される（degraded）ようであり、そしてこの分解（degradation ）は、リソソーム酵素のインヒビターによって部分的に阻害された。ｍＡｂＡ３３インターナリゼーションのメカニズムは、マクロピノソームと関係している。¹²⁵Ｉカリケアミシン（calicheamicin）、及びＱＦＡと結合されたｍＡｂＡ３３に関するイン・ヴィトロの研究は、Ａ３３−陽性大腸ガン細胞に対する強力な細胞障害活性を示したが、Ａ３３−陰性腫瘍細胞系に対しては、（細胞障害）活性を示さなかった。３種の結合体はすべて、細胞内への取り込み後に作用するので、Ａ３３の有する細胞内取り込み能力が、観察される細胞障害効果において非常に重要な役割を果たしていると判断された。例７他のマウス抗体の生成本発明者らは、ＩｇＧ２ｂアイソタイプであるｍＡｂ１００−２１０と称されるものと、ＩｇＧ２ｂアイソタイプであるｍＡｂ１００−３１０と称されるものとの、２つの追加のマウスｍＡｂを生成させた。ｍＡｂ１００−３１０は、参考文献として本出願にその開示内容全体が合体される米国特許出願第０８／２７３，２７７に記載されている。モノクローナル抗体１００−２１０及び１００−３１０を分泌するハイブリドーマはブタペスト条約に基づいてそれぞれ１９９４年１１月３０日と１９９２年４月２８日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託されており、それぞれＡＴＴＣＮｏ．ＨＢ１１７６４及びＨＢ１１０２８としてカタログされている。それらのモノクローナル抗体はｍＡｂＡ３３と同じ反応性パターンを示す。競合ラジオバインディングアッセイにおいて、モノクローナル抗体１００ −２１０はｍＡｂＡ３３の結合を阻害する。これは、それ（モノクローナル抗体１００−２１０）がｍＡｂＡ３３と同一の、又は空間的に連関した、Ａ３３抗原上のエピトープ（抗原決定基）に結合することを示唆している。一方、ｍＡｂ１００−３１０とｍＡｂＡ３３は互いに交差阻害（cross-blck）せず、これは、これらが、Ａ３３抗原上の同じ細胞表面タンパク質における、２つの異なるエピトープと反応していることを示唆している。例８ヒト化Ａ３３抗体の生成高い、又は低い親和性のｍＡｂ、もしくはより速い、又はより遅い血清クリアランスを有するｍＡｂの、ガン患者における免疫両方のための使用は、抗原性の標的、腫瘍タイプ、ｍＡｂに固有の薬物動力学的特性、目的とするエフェクターメカニズム、そして他の非免疫学的パラメーターの違いによって異なるものとなるであろう。ｍＡｂＡ３３は、イン・ヴィヴォで非常に良好なターゲティング（標的化）特性を示すので、こういったパラメーターを評価するための有効なテストシステムを提供する。ヒト化及び修飾されたモノクローナル抗体がｍＡｂＡ３３から作成された。Ａ３３に対するｍＡｂの遺伝子をクローニングし発現させるために、１０％胎児ウシ血清と１ｍＭグルタミンを追加したＲＰＭＩ１６４０培地中でｍＡｂＡ３３ハイブリトーマ細胞を培養した。トータルＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート（guanadinium isothiocyanate）を用いて１０⁹のハイブリドーマから調製し、オリゴ（ｄＴ）アフィニティークロマトグラフィーによってポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡを単離した。ファーストストランドｃＤＮＡを１０ｍｇのｍＲＮＡから合成した。分泌のためのシグナル配列を含む、Ａ３３可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８８−８９（１９９１）に記載されているＰＣＲ手順を用いて、ｃＤＮＡから増幅させた。ただし、哺乳類細胞における発現用のベクターに、ＰＣＲ産物を容易にクローニングできるように設計されたプライマーを用いた。これらのベクターは、元はｐＥＥ６（スティーヴンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ）他，Ｎｕｃｌ．ＡｃｌｄｓＲｅｓ．，１７：７１１０（１９８９））から誘導されたものである。図４は最終的なＮＳＯ発現ベクターを示す。ＰＣＲで増幅された軽鎖可変ドメインのフラグメントはｐＭＲＲ０１０のＢｓｔ１サイトとＡｐｌ１サイトの間にクローニングされた。ｐＭＲＲ０１０は、カッパキメラ軽鎖のような配列が発現するように構築されたｐＥＥ６の誘導体である。ＰＣＲで増幅された、Ａ３３重鎖可変ドメインのフラグメントはｐＭＲＲ０１１のＨｉｎｄIIIサイトとＡｐａＩサイトの間にクローニングされた。ｐＭＲＲ０１１はガンマ１キメラ重鎖のような配列が発現するように構築されたｐＥＥ６の誘導体であるクローニングされた可変領域遺伝子は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーセを用いた二本鎖ジデオキシチェインターミネーター法によって配列決定された。ヒト化可変ドメインは、ドーハーティ（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ）他，Ｎｕｃｌ．ＡｃｃｉｄｓＲｅｓ．，１９：２４７１〜２４７６（１９９１）に開示されている手順によって組み立てられた。ここで、それぞれ軽鎖と重鎖に対応する、ｐＭＲＲ０１０とｐＭＲＲ０１１へのクローニングが容易になされているようなプライマーを用いた。これらヒト化可変領域遺伝子はマウス可変領域遺伝子に用いられたものと同じ手順によって配列決定された。ヒンジ領域に１つのチオールを有するｈＡ３３Ｆａｂ’△ｃｙｓ重鎖のための発現ベクターは、ガンマ１定常ドメインを、キング（Ｋｉｎｇ）他，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４：６１７６〜６１８５（１９９４）に記載されているｃＢ７２．３Ｆａｂ’△ｃｙｓ遺伝子からの適切なヤグメントと置換することによって構築した。マウスＩｇＧの重鎖と軽鎖、又はヒト化ＩｇＧ及びＦａｂ’の重鎖と軽鎖の一過性共発現が、コッケット（ｃｏｃｋｅｔｔ）他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，８：６６２〜６６７（１９９０）に記載されているように個々の発現ベクターをＣＨＯ−Ｌ７６１ｈｏｕｒ細胞に共トランスフェクションすることによって達成された。重鎖と軽鎖の発現が安定である細胞系を開発するため、（複数の）ユニットを１つのプラスミドに組み合わせた。これは、軽鎖発現プラスミド中のＮｏｔ１−ＢａｍＨ１スタッファーフラグメント（stuffer fragment）を、重鎖発現プラスミド由来のｈＣＮＶプロモーター／エンハンサー及び重鎖遺伝子を有するＮｏｔ１−ＢａｍＨ１フラグメントと置換することによって完成した。最終的な発現プラスミドはｈＡ３３ＩｇＧとＦａｂ’△ｃｙｓのそれぞれに対して、ｐＡＬ７１とｐＡＬ７２と命名された（図４）。次に、ｈＩｇＧ１及びｈＦａｂ’の産生のための安定なＮＳＯ細胞系が、ベッビントン（Bｅｂｂｉｎｇｔｏn）他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６９〜１７５（１９９２）に教示されている手順に従って、プラスミドをトランスフェクションさせることによって確立された。トランスフェクションの後、細胞を１０％の透析された胎児ウシ血清と、２ｍＭグルタミンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｓＭｅｄｉｕｍ中に、９６穴プレート当たり２ｘ１０⁵細胞となるようにプレーティングした。２４時間後、メチオニンスルフォキシミン（methionine sulphoximine）を終濃度７μＭになるように培地に添加することによって細胞を選抜した。２１日間の培養後、生産性の分析をするために、耐性コロニーを選び取り、拡張させた。最も高生産性を示すものを選択し、ローラーボルト培養で、組み換え抗体（recombinant antibody）を産生させた。これらの結合アッセイの結果、キメラ抗体はマウスＡ３３と同様に、抗原を発現する細胞に結合することが示され、クローニングされた遺伝子はＡ３３のもの（抗体）に対応することが確認された。図５は、クローニングされた可変ドメイン遺伝子のＤＮＡ配列から推定される重鎖と軽鎖のアミノ酸配列を示している。最初の１１アミノ酸のＮ末端タンパク質配列決定は、重鎖と軽鎖との両方のこれらの推定アミノ酸配列と完全に一致する結果を示したので、適切な遺伝子がクローニングされていたことが確認された。図５は、マウス及びヒト化Ａ３３抗体の軽鎖［Ａ］と重鎖［Ｂ］の可変ドメインのアミノ酸配列を示している。ｃＤＮＡから推定されるマウス抗体の配列（ｍＡ３３）と、ヒト化抗体の配列（ｈＡ３３）とが並べて示されている。ヒト化フレームワーク配列は、ヒト抗体ＬＡＹ（カバット（Ｋａｂａｔ）他，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈＥｄ．（１９８７））由来のものである。各鎖における３つの相補性決定部には下線が引かれている。ＬＡＹフレームワーク中で、マウスＡ３３配列と置換されている残基には二重下線が引かれている。Ａ３３のＶ_Hは、ヒトサブグループＶ_HIIIのコンセンサス配列に最も近いホモロジー（７０％）を示し、一方Ｖ_Lは、ヒトサブグループＶ_LＩ及びＶ_LＩのコンセンサス配列と最大のホモロジー（６２％）を示している。これらのサブグループからＬＡＹがヒトフレームワークとして選ばれたのであり、ＬＡＹはＶ_HIII重鎖及びＶ_LＩ軽鎖を有している。図５において、軽鎖の残基１〜２３、３５〜４５、４７〜４９、５７〜８６、８８、及び９８〜１０８は全てＬＡＹ配列に由来しており残基２４〜３４、４６、５０〜５６、８７及び８９〜９７は相補性決定部（ＣＤＲ）に対応する。残基４６と８７は、軽鎖と重鎖の可変領域の接点にあると予想される。残基４６は通常ヒト抗体配列においてはロイシンであり、残基８７は通常フェニルアラニン又はチロシンである。重鎖については、残基２〜２６、３６〜４９、６６〜７１、７４〜８２ａ、８２ｃ〜８５、８７〜９３、及び１０３〜１１３はすべてＬＡＹ配列由来であり、一方残基１、２７〜３５、５０〜６５、７２、７３、８２ｂ、８６及び９４〜１０２は、全てマウス由来であった。重鎖における残基３１〜３５、５０〜６５及び９５〜１０２はＣＤＲに対応する。フレームワーク部の中にマウス由来アミノ酸がいくつかの理由によって含まれた：残基１は通常、触媒に近づきやすく、ＣＤＲ領域（残基２７〜２０）の付近に位置する；ＬＡＹは普通、ヒト又はマウスＶ_H配列中のこの位置にはみられない、アラニン残基を有しているので、マウス残基が用いられた。位置７２及び７３においても、ＣＤＲ２に近接することが予想されるので、マウス残基が用いられた。そして、残基７２の場合には、ＬＡＹフレームワークを用いることによって可変ドメイン内にＮ−結合グリコシル化部位が導入される可能性を排除するために、マウス残基が用いられた。マウス配列は、ドメイン中の残基９４においても用いられ、ここではＡ３３は、通常はこの位置にはみられない、プロリンを有している。マウス残基は、位置８２及び８６において用いられた。これは、ＬＡＹフレームワークを有するヒト化抗体の、これらの位置において、ヒトアミノ酸を用いることは、重鎖の発現にとって、有害であることが以前に見出されていたためである。ｈＩｇＧは、ＮＳＯ細胞の組織培養上清からプロテインＡ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され、キング（Ｋｉｎｇ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８１：３１７〜３２３（１９９２）に記載されているようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによってキャラクタライズされた。ｈＡ３３Ｆａｂ’△ ｃｙｓは、細胞培養上清からＦａｂ'上の低親和性プロテインＡ結合部位を精製のための基本原理として利用して、プロテインＡ−セファロースのクロマトグラフィーによって精製した。プロテインＡ−セファロースのカラムを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭのホウ酸バッファーｐＨ８．０で平衡化した。ｈＡ３３Ｆａｂ'△ｃｙｓを発現するＮＳＯ細胞からの組織培養上清を１Ｍのトリスを添加することによってｐＨ８．０に調製し、カラムにアプライした。平衡化バッファーによる洗浄後、Ｆａｂ’は０．１Ｍのクエン酸で溶出され、フラクションを直接十分な量の１Ｍトリス中に収集し、直ちにフラクションのｐＨが６と７の間に調整されるようにした。透析と限外ろ過の後、ｈＡ３３Ｆａｂ'△ｃｙｓはマレイミド−ベース（malei mide-based）の同種二機能体（homobifunctional）及び同種三機能性（homotrif unctional）リンカーＣＴ５２及びＣＴ９９８をそれぞれ使用して、ＣＢ７２．３Ｆａｂ’△ｃｙｓに関して、前述のキング（Ｋｉｎｇ）他，（１９９４）に記載されているようにＤＦＭ^TM及びＴＦＭ^TMとクロスリンクされた。これらのクロスリンカーは⁹⁰Ｙの結合のための１２Ｎ４マクロサイクル（the 12Ｎ₄macrocycl e）を含んでいる。生成したＤＦＭ^TM及びＴＦＭ^TMは、セファクリル（Sephacryl ）Ｓ−２００ＨＲカラムを用いたゲルろ過によって精製された。⁹⁰Ｙでの放射性同位元素標識は、前述のキング（Ｋｉｎｇ）他，（１９９４）に記載されているように行った。少量のヒト化抗体が、ＣＨＯ細胞における一過性発現システムで生成され、それが抗原を発現しているＳＷ１２２２細胞に結合することが立証された。次に、より大量の精製物質を生成させるためにｈＡ３３ＩｇＧとＦａｂ'△ｃｙｓ両方に対応する安定なＮＳＯ細胞系が単離された。最良の細胞系は、懸濁培養で、およそ７００ｍｇ／ミリリットルのｈＡ３３ＩｇＧ１及び５００ｍｇ／ミリリットルのＦａｂ'△ｃｙｓを産生した。図６は、（Ａ）非還元、及び（Ｂ）還元条件下でのヒト化Ａ３３ＩｇＧとＴＦＭ^TMのＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示している。レーン１はｈＡ３３ＩｇＧ；レーン２はｈＡ３３Ｆａｂ'△ｃｙｓ；レーン３はｈＡ３３Ｆａｂ'△ｃｙｓクロスリンク混合物；レーン４は精製ｈＡ３３ＴＦＭ^TMである。図６は、精製ｈＩｇＧは均一であり、完全に組み立てられていた（assembld）ことを証明している。ＨＰＬＣ分析ではｈＩｇＧが凝集していないことが証明された。予測していたように、ｈＦａｂ'△ｃｙｓは大部分が一価のＦａｂ'の形態で、少量がＦ（ａｂ'）₂の形態で回収されたが、これは他の組み替えＦａｂ'フラグメントでの結果と一致する。精製ＴＦＭ^TMのSＤＳ−ＰＡＧＥ分析は非還元条件下においてはおよそ１５０ｋＤの単一種を示した。還元条件下では、およそ７５ｋＤと２５ｋＤの二種が観察され、これはそれぞれ、３つクロスリンクしたＦｄ'鎖と軽鎖から予測されるサイズに対応する。Ｆab'△cysのＴＦＭ^TMへのクロスリンクは、６０〜６５％の収率で達成された。図７は、（ａ）ｈＡ３３Ｆａｂ'；（ｂ）ＴＦＭ^TMへのクロスリンク後のｈＡ３３Ｆａｂ'及び（ｃ）精製ｈＡ３３の、２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣプロフィールを示している。ＨＰＬＣゲルろ過はデュポン社のＺoｒｂａｘＧＦ−２５０カラム流出で、（流速）１ミリリットル／ｍｉｎで、０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０中にて行われた。（ａ）に示されるようにｈＡ３３Ｆａｂ'のピークは１０．５分の保持時間を示し、Ｆ（ａｂ'）²のマイナーピークは９．７分であり、バッファーピークは１２．２分であった。（ｂ）に示されるようにクロスリンク後、９．０分におけるメジャーピークはＴＦＭ^TMを表している。マイナーピークは９．６分におけるものはジ−Ｆａｂを、１０．５分におけるものは残留しているモノマーＦａｂ'を、８．２分におけるものは少量の凝集塊を、そして１２．２分におけるものは同じバッファーピークを表している。（ｃ）に示されるように精製後、ＴＦＭ^TMピークはなお９．０分においてみられ、唯一の他の見ることのできるピークは、１２．２分におけるバッファーピークであった。次に、抗原結合アッセイは、Ａ３３抗原を発現する２つのヒト結腸直腸腫瘍細胞系、ＣＯＬＯ２０５とＳＷ１２２２の細胞を用いて行われた。これらの細胞は２ｍＭグルタミンと１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地中で培養された。培養上清中の、及び精製調製物中の組み立てられた抗体（assembled antibody）はＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）によって定量された。ＳＷ１２２２細胞へのマウス及びヒト化抗体の直接の結合はＦＡＣＳｃａｎアッセイによって測定された。ＳＷ１２２２細胞は培養フラスコから取り出すためにトリプシン処理され、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、１０％ウシ血清と０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中に再懸濁された。ヒト化Ａ３３抗体は、続いて１０％ＦＣＳと０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中に希釈され、２ｘ１０⁵ の細胞に添加された。氷上での１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次に氷上でさらに１時間、ローダミン抗−（ヒトＦｃ）結合体（rh odamine anti-(humanFc)conjugate）（ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウム中で１:１０００）とともにインキュベートした。ＰＢＳ中での洗浄後、細胞に結合したローダミン標識化Ａ３３抗体結合体の量をＦＡＣＳｃａｎアナライザーで測定した。マウスＡ３３の直接の結合はＳＷ１２２２細胞をＦＩＴＣ標識化抗体とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳｃａｎ分析によって測定した。Ａ３３が、Ｆｃの相互作用を介した非特異的結合ではなく、抗体−抗原相互作用を介して特異的に結合していることを明らかにするために、適当な非特異的抗体コントロール（実験）を行った。マウス及びヒト化抗体のアフィニティーの測定は、クラウゼ（Ｋｒａｕｓe）他，ＢｅｈｒｉｎｇＩｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．，８７：５６〜６７（１９９０）に記載されている手順に基づいて行った。簡単にいえば、抗体を、１．３ｍｇ／ミリリツトルからタイター測定されたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いてフルオレセインで標識化し、次に５％ＦＣＳと０．１％アジ化ナトリウムを含有する３５０ミリリットルのＰＢＳ中で氷上で２時間、２．８ｘ１０⁵のＳＷ１２２２細胞とともにインキュベートした。細胞当たりに結合した蛍光の量をＦＡＣＳｃａｎで測定し、標準ビード（standard beads）を用いて較正した。各抗体濃度における、細胞当たりの、結合した抗体の分子数はそのように確立され、スキャッチャードプロットを得るために用いられた。標準量のマウス抗体を連続的に希釈した（一連の）ヒト化ヴァリアントともに、ＳＷ１２２２細胞をインキュベートした後、結合したＦＩＴＣ標識化マウスＡ３３をＦＡＣＳｃａｎで定量することにより、競合アッセイが行われた。図８は、ＳＷ１２２２細胞へのマウス抗体とｈＩｇＧ１との結合に関するスキャッチャード分析を示している。これらのデータは、両方の抗体の形態が、１．３ｎＭの平衡解離定数（Ｋ^D's）を有しており、細胞当たりおよそ３００，０００の部位を有しているということを示唆している。ｈＴＦＭ^TMの抗原結合活性を一価のｈＦａｂ'△ｃｙｓ及びｈＩｇＧの抗原結合活性と、競合結合アッセイにおいて比較した。このアッセイにおいて、これらの種は、抗原を発現しているＣＯＬＯ２０５細胞への結合に対してマウスＩｇＧと競合させられた。結果（図９）は予想されるように一価のＦａｂ'フラグメントの結合は二価のＩｇＧと比べて、よくないということを明らかにしている。一方、三価のｈＴＦＭ^TMはｈＩｇＧよりもおよそ２倍の良好な結合を示しており、これはおそらくアビディティーの増加の結果であると考えられる。この知見は、キメラＢ７２．３で得られた結果と一致しており、キメラＢ７２．３でもＴＦＭ^TMはＩｇＧよりも２から３倍の良好な結合を示していた。図８は、ＳＷ１２２２細胞へのヒト化及びマウスＡ３３結合のスキャッチャードプロットを示している。実験の詳細は、材料と方法（materials and methods ）の通りである。マウスＡ３３ＩｇＧのＫｄ値１．２８ｎＭと、ヒト化Ａ３３ＩｇＧのＫｄ値１．２７ｎＭはデータポイントの線形回帰分析から計算された。図９は、ＣＯＬＯ２０５細胞へのｈＡ３３Ｆａｂ‘△ｃｙｓ、ＩｇＧ及びＴＦＭ^TM の結合に関する競合結合アッセイを表している。ｈＡ３３ＩｇＧ（◇）、ＴＦＭ^TM （｜）、ＴＦＭ^TM（□）、及びＦａｂ’△ｃｙｓ（△）はＦＩＴＣ標識化マウスＡ３３ＩｇＧによって競合され、結果は蛍光ユニット対ｎＭ結合部位としてプロットされた。次に、抗体を大環状のリガンドであるテトラアゾシクロドデカンエトラ酸（te traazocyclo dodecane etra-adid）（１２Ｎ４又はＤＯＴＡと呼ばれる）を介して⁹⁰Ｙで標識化した。このリガンド（１２Ｎ４）は、アントニウ（Ａｎｔｏｎｉｗ）他，“Ｐｒａｃｔｉｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｙｔｔｒｉｕｍ− ９０ＩａｂｅｌｌｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙＡ３３ａｎｄＡ３３ｔｒｉ−ｆａｂ（ＴＦＭ）ｆｏｒｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ”，ＩｎＰｒｅｓｓに記載されているように、１２Ｎ４−マイミドリンカーを介して免疫グロブリンに結合させた。ｈＡ３３−１２Ｎ４結合体の⁹⁰Ｙ及び¹²⁵Ｉによる放射線同位元素標識、及び、皮下にＳＷ１２２２腫瘍異種移植を有するヌードマウスにおける体内分布研究を、前述のアントニウ（Ａｎｔｏｎｉｗ）他，に記載されているように行った。抗体を、第２の大環状のリガンドである１，４，７−トリアザシクロノナントリ酢酸（1,4,7-triazacyclononanetriacetic acid）即ち９Ｎ３を介して、ターナー（Tｕｒｎｅｒ）他，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：３５〜４１（１９９４）に記載されているように９Ｎ３−マレイミドリンカーを用いて¹¹¹Ｉｎで標識化した。放射性同位元素標識の前と後の両方において、免疫結合体が完全な免疫反応性を示すことが、競合を基礎とするＦＡＣｓアッセイを用いて示された。体内分布実験に関して、放射性同位元素標識は＞９５％の⁹⁰Ｙが結合し、２μＣｉ／ μｇの特異的活性（放射能；activity）をもつように達成された。モルモットにおける体内分布研究が、オスの異系交配されたおよそ２５０〜３００グラムのＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモットへの静脈内投与後に行われた。４つのモルモットのグループがそれぞれ⁹⁰Ｙ−標識化成分を耳の静脈へ注射され、図１０に示されるように投与後、時間間隔をおいて犠牲にされた（殺された）。血液サンプルが採取され、そして前述のアントニウ（Ａｎｔｏｎｉｗ）他，によってマウスに関して記載されているように組織が分析された。５〜７ｋｇのカニクイザル（グループにつき２頭）における薬物動力学研究も、放射性同位元素標識された成分の静脈注射後に行われた。カウント（計数）のために血液サンプルを０．５、１、２、４、６、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間において採取した。図１０は、ＳＷ１２２２腫瘍異種移植を有するヌードマウスにおける⁹⁰Ｙ標識化ヒト化Ａ３３の体内分布に関するタイムコース研究を示している。マウスにそれぞれ１９μＣｉ（１０μｇ）の90Ｙ−標識化ｈＡ３３を静脈注射した。４つのマウス後に殺され、活性（放射能；activity）量が、腫瘍及び正常組織において測定された。各コラムは、４匹のマウスから得られた平均値を表している。エラーバーは平均値の標準偏差を表している。組織への取り込みは、グラム組織当たりの％注入線量（％injected dose）としてプロットされている。良好な体内分布が達成されており、高レベルの活性（放射能）が主要に局在し、どの正常組織においても蓄積はわずかであるか、又はなかった。ヒト化Ａ３３免疫結合体の体内分布は、同じ異種移植システムにおけるこれらの時点でのマウス抗体の体内分布と有意な差異はなかった。マウス及びヒト化抗体の両方について腫瘍に局在する活性（放射能）レベルは、他のすべての組織におけるレベルが減少しているにもかかわらず、時間とともに増加しており、その結果、時間中にわたって腫瘍対正常組織の比は増加することとなった（表２）。これが、抗体自身の特徴なのか、使用した放射性同位元素の特徴なのかを評価するため、¹²⁵Ｉで標識化したヒト化Ａ３３を用いた、体内分布実験も行った。この実験では、腫瘍によって保持されるアイソトープの絶対レベルはわずかに低かったが、腫瘍対血液比は非常に類似しており、これは、局在化の増加はアイソトープ／キレーターシステムの性質ではなくＡ３３抗体の特性であることを示唆している。腫瘍に局在化する¹²⁵Ｉ−ｈＡ３３の絶対レベルが低いのはおそらく、放射性ヨウ素化抗体の脱ハロゲン化の結果であろう。ヒト化ＴＦＭ^TMと、試験を行った他の全てのヒト化フラグメントは一貫してマウスの循環から以上に速く、同等のマウスフラグメントと比べてはるかに速く除去されるということが観察された。この現象はマウスに特異的であることが示され、ラット、モルモット、又はサルでは起らなかった。表３は、ｈＡ３３ＩｇＧ、ＤＦＭ^TM及びＴＦＭ^TMのモルモット中での体内分布の比較を示している。これは、ＤＦＭ^TMとＴＦＭ^TMのより速い血液クリアランスを表しており、１４４時間目において、これらの血液活性（放射能）はそれぞれ０．０１及び０．０２％注入線量／グラム（i.d./g）まで減少している。ｈＩｇＧの血液活性（放射能）はそれらよりかなり高く、その時点において０．４％注入線量／グラム（i.d./g）であった。表３は、ＤＦＭ^TMについては、ＩｇＧ及びＴＦＭ^TMと比べてかなり高レベルの放射能が腎臓によって取り込まれることを非常に明らかに表している。このＤＦＭ^TMについての高い活性（放射能）は血液からと比べて腎臓からの方がかなりゆっくりと消えていく。早い時点では、腎臓のレベルはＴＦＭ^TMとＩｇＧについては、わずかに高いが、これらはＤＦＭ^TMについてのレベルと比べるとかなり低く、活性（放射能）は、ＴＦＭ^TMの方がＤＦＭ^TMと比べてかなり速く腎臓から消える。Ａ３３に関するこれらの結果は、ｃＢ７２．３のＤＦＭ^TM及びＴＦＭ^TMに関する結果と一致しており、また、腎臓がＴＦＭ^TMを除去する器官であるという見解と一致する。それぞれのサルについて血液クリアランスパラメーターを測定するため、指数関数的な、非線形最小二乗法を適合させた手法が用いられた。投与後の時間の関数として、吸収線量のパーセントを算出するためにＩｇＧ、ＴＦＭ^TM及びＤＦＭ^TM についての血液クリアランスパラメーターの平均値を用いて適切な積分（inte grals）を行った。ヒトにおいては⁹⁰Ｙで標識化された場合、各形態の抗体（ＩｇＧ、ＴＦＭ^TM及びＤＦＭ^TM）によって運ばれたと考えられる、赤色骨髄についての吸収線量に関して評価が行われた。サルのデータは、早い時点では、投与された活性（放射能）の全てが血液循環中にあることを示しており、そしてこれはヒトについてもそうであるとみなされた。計算は、¹¹¹Ｉｎ及び⁹⁰Ｙで標識化された抗体の薬物動力学は互いに同じであり、サルとヒトにおいても同じであるという仮定に基づいて行われた。また、骨髄における放射性同位元素標識化抗体の特異的な取り込みはないと仮定され、数時間（＜５時間）後では、血液と骨髄における放射能は同じであるとされた。ヒトを代表する数値を作るために、以下の標準的な人間に関するデータ：５０００ミリリットルの総血液溶量；骨髄スペース；⁹⁰ Ｙベータ粒子についての吸収フラクション；そして骨内層の厚さ、が用いられた。⁹⁰Ｙベータ粒子は高エネルギーであるため、骨髄と骨内層における放射線吸収線量は全ての実際的な目的に関して同じである。図１１は、カニクイザルにおける、¹¹¹ＩｎｈＡ３３ＩｇＧ（■）、ＴＦＭ^TM （○）及びＤＦＭ^TM（▲）の薬物動力学プロフィールを表している。データは崩壊について補正されており、各時点において残存している注入線量の平均パーセンテージとしてプロットした。安全性を考慮したため、これらの成分は⁹⁰Ｙではなく¹¹¹Ｉｎで標識化した。というのは、以前の研究によって、⁹⁰Ｙ−標識化ＩｇＧ及びフラグメントは、¹¹¹ Ｉｎで標識化したものと非常によく似た薬物動力学と体内分布を示すことが、示唆されていたからである。血しょうクリアランスプロフィールは図１１に示されておりアルファ及びベータ相の半減期の値は表４に示されている。マウス及びモルモットでの薬物動力学データから予測されるように、ＴＦＭ^TM とＤＦＭ^TMはともに、ＩｇＧと比べて、（血液）循環から、速く除去される。それに加えて、ＤＦＭ^TMはＴＦＭ^TMと比べてより迅速に除去される。血しょうクリアランスをアイソトープに関する崩壊の補正を行わずに調べた場合（表５）、このデータは、ＩｇＧとＴＦＭ^TMについての一相性（monophasic）動力学及びＤＦＭ^TMについての二相性（biphasic）動力学と非常によく一致した。これらのデータに基づく線量測定計算の結果は、⁹⁰Ｙで標識化し、当量の放射能を注入した場合ＤＦＭ^TMはＩｇＧのおよそ５分の１の低さの骨髄への吸収線量を示す（表５）、ということを示唆している。一本鎖化抗体（single chain antibody：ＳＣＡ）も、ｍＡｂＡ３３から作成することができる。一本鎖化抗体はサイズが小さいため、腫瘍組織へ、より良好に拡散する。それらはまた短い血清半減期を有しており、そのため、例えば骨髄への毒性が弱くなる。血液からの迅速なＳＣＡの除去の結果、腫瘍による取り込みがより低くなる可能性がある。一本鎖化抗体ＳＣＡ−Ａ３３が作成された。この抗体はｍＡｂＡ３３の結合特異性を維持しており、インタクトなｍＡｂと比べて約３分の１の低さの結合親和力（binding affinity）を示す。ＳＣＡ−Ａ３３は、他の一本鎖化抗体と同様に、局所（local/rregional）灌流について、肝動脈を介して肝臓への転移のために、そして、上腸間膜動脈灌流を介して、一次病変のために治療上に使用することができる。本発明はここにおいて、特定の具体例に言及して記載されているが、これらの具体例は単に本発明の様々な側面を例示しているにすぎないということが理解されるべきである。従って、様々な改良が、これらの例示的な具体例の枠内でなされることが可能であり、他の組み合わせ（アレンジ）が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、考案され得るということが理解されるべきである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Method for treating colorectal cancer using tumor-specific antibodies Cross Reference of Related Applications This application is related to U.S. Patent Application No. 06/72, filed April 19, 1985, which was abandoned. US Patent No. 4,991, filed on November 6, 1987, abandoned Abandoned 1989, a continuation-in-part of copending application Ser. No. 07 / 118,411. Japanese Patent Application No. 07 / 327,765, filed March 23, No. 07 / 673,153, filed Mar. 18, 1991, which was abandoned. Continuing application, pending US Patent Application Serial No. 08/0, filed February 16, 1993 No. 20,223 is a continuation-in-part application. Field of the invention The present invention utilizes at least one monoclonal antibody to treat colorectal cancer tumors. How to reduce the impact. Specifically, in the treatment of colorectal cancer (colorectal cancer) At least one monoclonal antibody inhibits antineoplastic, DNA tumor activity Peptide or a radioisotope (radioisotope) Used. The present invention further provides a method of delivering genetic material to tumor cell DNA. And delivery of anticancer drug to colon tumor cell nucleus and colon cancer Monoclonal antibodies specific for A33 antigen, an antigen found on cells . Background of the Invention Colorectal cancer (colorectal cancer) is a malignant tumorous disease. In the West, especially in the United States The incidence of colorectal cancer is high. This type of tumor is often lymphatic and vascular Metastasis through. Many patients suffering from colorectal cancer eventually end up with this disease Dies. In fact, in the United States alone, 62,000 people die each year from colorectal cancer. It is estimated that. To date, systemic and chemotherapy for the treatment of colorectal cancer has been developed. Came. However, the survival of colorectal cancer patients with metastatic disease Reality No therapy has shown sufficient antitumor activity to prolong it. Results and Thus, there is still a need for the development of effective treatments for colorectal cancer. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for reducing the effects of colon cancer. Another object of the present invention is to transfer genetic material to the colorectal cancer cell DNA. ) To provide a method. Still another object of the present invention is to carry (transmit) an anticancer drug to the nucleus of colon cancer cells. Is to provide a way. Yet another object of the present invention is to provide a monoclonal antibody useful in the treatment of colon cancer. Antibody, humanized antibody, chimeric antibody, trimeric antibody, heteromer (heter omeric) antibodies, and antibodies, including single chain antibodies is there. Summary of the Invention The present invention relates to an antibody conjugate that binds to a tumor. )), The method comprising reducing the effects of colorectal cancer. Specifically, large intestine At least one conjugate of an antibody that binds to cancer cells and an anticancer drug ) Is administered. Alternatively, an antibody specific for colon cancer cells and a colon cancer cell At least one conjugate with a peptide that inhibits DNA activity is a shadow of colon cancer It is administered in a pharmaceutically effective amount to reduce the effects. To reduce the effects of colorectal cancer Another approach is to use antibodies specific for colorectal cancer tumors and radioisotopes (La At least one conjugate with a geoisotope) in a pharmaceutically effective amount. Consisting of The invention further relates to a method of delivering (transmitting) genetic material to colon cancer cells, comprising: Contacting the genetic material bound to the antibody taken up into the tumor cells with the tumor cells , Thereby mediating the integration of genetic material into DNA. In addition, anticancer drugs combined with antibodies taken up by colon cancer cells The anticancer agent is delivered to the nucleus (DNA) of colon cancer cells by contact with the cells ( Can tell). The present invention further provides monoclonal, humanized, chimeric, and trimeric antibodies. Antibodies, including human, heteromeric, and single-chain antibodies, Can be used to mitigate the impact. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES The foregoing brief description, as well as further objects and features of the present invention, will be set forth in the following, illustrative examples. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. It will be more fully understood by reference to the following. In the attached drawings, FIG.¹³¹I-mAbA33 accumulates in the affected part of the liver, and the surrounding normal liver group It is an autoradiograph showing that it does not accumulate in the weave. Figure 2 shows the radioisotope bound to mAbA33¹³¹I is taken into tumor cells It is an autoradiograph showing that it is not found in surrounding tissues. Figure 3 shows cancer lesions¹³¹This shows the effect of I-mAbA33. FIG. 4 shows expression vectors of hA33IgG1 and hA33Fab '@ cys. I have. FIG. 5 shows the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of the humanized A33 antibody. I have. FIG. 6 shows humanized A33 IgG and TFM under reducing and non-reducing conditions.^TMSDS 1 shows a polyacrylamide gel (SDS-PAGE). FIG. 7 shows hA33 Fab ′, TFM^TMHA33Fab 'after cross-linking with And purified hA33TFM^TM2 shows the HPLC profile of Figure 8 Scatch of humanization and binding of mouse A33 to SW1222 cells. FIG. FIG. 9 shows hA33 Fab ′ △ cys, IgG, and TFM.^TMCOLO205 Fine 1 depicts a competitive binding assay for binding to cells. FIG. 10 shows the results of nude mice receiving xenograft of SW1222 tumor.⁹⁰Y-mark 1 shows the biodistribution of intellectualized humanized A33. And Figure 11 shows a cynomolgus monkey¹¹¹InhA33 IgG, TFM^TM, And DF M^TM2 shows the pharmacokinetic profile of Detailed description of the invention Mouse monoclonal antibody A33 (referred to herein as mAb A33) Of the IgG2a isotype defining a cell surface antigen called antigen A33 Black Antigen A33 is normal in more than 95% of colorectal cancer In the intestinal mucosa (see Table 1). A33 antigen in colorectal cancer Is uniformly distributed and expressed on the cell surface in more than 95% of antigen-positive lesions I have. In addition, the A33 antigen is dependent on the degree of tissue differentiation in colorectal cancer. And it is also present in primary lesions and metastatic lesions, including liver metastases. Antigen A33 is also present in the serum of patients with antigen A33-positive colorectal cancer, In the tumor secretions and in the supernatant of the antigen A33-positive colon cancer cell line. Not. This suggests that antigen A33 is not a secreted molecule. In the normal gastrointestinal tract, antigen A33 is found on normal small and large intestinal mucosa. Those shades It shows a uniform cell surface distribution through the fovea. Of over 300 different organization types Details of antigen A33 expression in tumors and in normal human adult and fetal tissues Further investigation showed a restricted distribution pattern of this antigen. As described below In addition, the present inventors have found that among tumorigenic tissues, antigen A33 can be used for colon cancer and intestinal epithelium. Exists in some metastatic stomach cancers, but none of the other epithelial cancers tested It was found that none of them existed. Antigen A33 is sarcoma, neuroectodermal tumor And found not to be present in lymphoid tumors. These tissues are all antigens A33-was found to be negative. US Pat. No. 5,160,72, the entire contents of which are incorporated herein by reference. As disclosed in No. 3, the monoclonal antibody A33 is applied to the surface of colon cancer cells. Specific for the antigen A33 found and therefore specific for colon cancer. As a result, monoclonal antibody A33 and other antibodies that are antigen A33-specific Can be used to diagnose colorectal cancer. These antibodies may be anticancer drugs, peptides, or Can be combined with radioisotopes and used for treatment of colorectal tumors.Example 1 - ¹²⁵ I-mAbA33 Lee in human colon tumors xenografted into mice Internationalization Antigen A33 has several features that make it useful for immunotherapy research. It is present in over 95% of colorectal cancers, including primary and metastatic lesions are doing. It is uniformly expressed in tumor nodules and enters the bloodstream. Is not secreted. further¹³¹I-mAbA33 and¹²⁵Clinical of I-mAbA33 By the evaluation, it is very well targeted to the metastatic colorectal cancer site, And evidence of a clinical response with slightly limited toxicity. mAb A33 Is the quantitative dosimetry data based on the biopsy for the mAb A33 effective? It can be used for safe radioimmunotherapy. Monoclonal antibody A33 is disclosed in US Pat. No. 5,160,723 ( According to the procedures disclosed in¹²⁵I radioisotope labeled. this¹²⁵I -Labeled A33 monoclonal antibody here¹²⁵It is called I-mAbA33.¹ ^{twenty five} I-mAbA33 is administered to nu / nu mice xenografted with human colon tumor Was done. This mouse then¹²⁵The I-mAbA33 localization was studied. Radioactive The localization parameter of the isotope-labeled monoclonal antibody A33 was A3 Evaluated in nu / nu mice using the 3-positive colon cancer cell line SW1222 Was. Dynamics of mAbA33 in cultured SW1222 cells in vitro This model is of particular interest because we know a lot about It is. Specifically, mAbA33 is rapidly taken up into SW1222 cells (Approximately 33% within 1 hour); of mAb A33 internalization The pathway is through macropinosomes caused by cell membrane ruffling SW1222 cells average 800,000 mAb A3 cells per cell; Binding to 3; by these cells¹²⁵T1 / 2 to 14 of I-mAbA33 retention Time; and most of the mAb A33 incorporated into the cells It is known that it is released in a form that is highly immunoreactive. M released AbA33 can bind again to tumor cells, and as a result, The uptake / retention of the antibody is higher. This is mouse and chick (Human data are described below). 24 to 48 hours after injection¹²⁵The peak incorporation of I-mAbA33 into tumor was Injected dose / g was 35-40% gram. Tumor: liver Ratio ranges from 30: 1 to 40: 1, and the tumor: blood ratio ranges from 10: 1 to 15: 1. : 1 range. These values are based on the dose of monoclonal antibody administered (the dose) and showed some small variations. And the uptake into the tumor Can be inhibited by the intravenous administration of an excess amount of unlabeled mAb A33. But not inhibited by an unrelated negative control mAb The localization parameters were found to be antigen specific. 125I-mAbA 33 is removed from the tumor xenograft at t1 / 2 = 60 hours. On the contrary¹¹¹In MAb A33 radiolabeled with, injected dose per 45% gram tumor (Injected dose / g tumor), indicating the radioisotope (isotope) ) Is significantly longer (> 7 days). This is probably¹¹¹In cytoplasmic trap It is thought to be due to ping. This in-vivo localization of mAbA33 to tumors Models are useful in assessing the relative efficacy of various antibody conjugates. , Various radioisotopes (isotopes) Very valuable for dosimetry calculations forExample 2 Internalization of ¹²⁵ I-mAbA33 in people suffering from colorectal cancer Yo N The A33 antigen system can be used for immunotherapy. It is especially for this usage (Immunotherapy). This is because the antigen A33-mAbA33 complex is large. Will it be rapidly internalized (uptake into cells) by intestinal cancer cells? It is. In addition, mAbA33 conjugates having an intracellular site of action are It has the ability to kill colon cancer cells in toro and in vivo. We have found that in humans¹²⁵Location of I-labeled mAbA33 and cytotoxicity The harmful effects were studied.¹²⁵I radionuclides are mainly short-range Exerts its cytotoxic effect by the electron. This short-range Auger electron It is most effective when generated very close to the cell nucleus (<1-4 μm). So Therefore¹³¹When compared to I-mAbA33¹²⁵Expected for I-mAbA33 One advantage is that it is less toxic to bone marrow. 50mCi / m^TwoEarly Of the initial dose¹²⁵In patients treated with I-mAbA33 Was not toxic. Externally using a collimator¹²⁵I radioactivity survey (¹ ^{twenty five} Iscanning) performed tumor imaging on all patients. By day 35 after antibody injection, a clear (positive) tumor image was produced. This Until now¹²⁵Only a small fraction of I radiation is suitable for scanning This result was surprising, as it was thought to be. ¹²⁵Most of the I radiation is acting at very short distances, and the clear image (positive im ages) indicate the presence of considerable tumor doses. the first Of the nine patients, one was four weeks after treatment. 35% of carcinoembryonic antigen ( CEA) level response. For one patient, this patient The lung lesion was resected and could not be evaluated.¹²⁵I-mAbA33 As a result of the administration, tumor regression occurred. Also,¹²⁵Before administration of I-mAbA33 Patients who did not respond to chemotherapy¹²⁵After administration of I-mAbA33 Became responsive to chemotherapy (ie, tumor regression occurred). Therefore, the present invention Antibody-radioisotope conjugate Can be used to sensitize patients to chemotherapy.Example 3 Biodistribution of ¹³¹ I-mAbA33 in humans with colorectal cancer In pre-operative patients, where colorectal cancer is presumed to have spread to the liver,¹³ ¹ The biodistribution of I-labeled mAbA33 was studied. This is an external scan Dosimetry based on external scanning techniques and biopsy (Targeting mAbA33 determined by biopsy-based dosimetry) Targeting is not relevant, and mAb A33 targeting is not relevant Is the negative control mAb mAb TA99 whose isotype is identical Performed to show that it is antigen specific when compared to Efficient and constant mAb radioactivity while retaining optimal levels of immunoreactivity Isotopic labeling is an integral part of radioimmunotherapy. Preclinical review Depending on the titer, 50 mCi per mg protein¹³¹I (50mCi¹³¹I / mg mAb A33 labeled up to the protein) was analyzed by sequential absorption analysis (sequential absorption analysis), the original immunoreactivity was found to be 40-70%. It was shown to be retained. About 15 mCi / mg (actual range 12.5-22 mCi / mg) using a protocol designed to achieve a specific activity. , 51 doses of mAbA33 were labeled with 42 iodination procedures. 17 patients Subjects received samples with 40-70% immunoreactivity. 6 patients are 4 0-70% immunoreactivity¹³¹I-mAbA33 and 20-35% immune response Given some preparations that are responsive but this is suboptimal it is conceivable that. Seventeen patients have five dose levels (0.2-50 mg)¹³¹I -MAb A33 was administered and three patients¹²⁵With I-mAbA33 (2 mg) Irrelevant, but isotype-matched negative controls¹³¹ I-mAb TA99 (2 mg) was given. More than 1 hour after injection¹³¹I- mAb A33 and control¹³¹The peak serum level of I-mAbTA99 was 28% ID / liter was reached for all dose levels tested. This is the same In the patient^99mIntravascular plasma volume as determined from a Tc-HSA serum study Amount (Mezier (Median: 2.57 liters). In the blood from¹³¹Removal (clearance) of I-mAbA33¹³¹Of I-mAbA33 Half-life is negative control¹³¹Faster than I-mAbTA99 level Decreasing quickly indicated that it had been found. This is most likely an antigen-positive In vivo due to metastatic tumor tissue¹³¹Due to the absorption of I-mAbA33 Conceivable. ¹³¹In a total of 46 livers in 17 patients treated with I-mAbA33 Metastases have been demonstrated by surgery, of which 45 are planar or spotted This was confirmed in the image of the abdomen in the view. Two first colorectal cancer scans from outside Metastases to local lymph nodes, as determined by biopsy. Abdominal despite showing similar tumor: normal tissue ratio Could not be distinguished from the close uptake site in. The vascular distribution of liver metastases^99mLine based on Tc-HSA scan and biopsy It was evaluated by quantitative measurement.^99mBy Tc-HSA scan, these diseases Underestimation of the blood vessel image, which is a feature of the abnormalities, was confirmed. This is comparable to the surrounding, unrelated liver. It appeared as a photopenic part in comparison. Similarly, for biopsy Than^99mThe tumor: liver ratio of Tc ranges from 0.14: 1 to 1.19: 1, Most lesions were shown to have values below 0.60. Negative control MAb¹³¹In a study on I-mAbTA99, only one patient Slightly faint positive images, but very little uptake into tumors As shown, the tumor: liver ratio was 1.1: 1 to 5.4: 1. On the contrary¹³¹ I-mAbA33 is up to 100: 1 tumor: liver, as determined by biopsy A ratio was generated.¹³¹I-mAbA33 specifically accumulates in liver lesions, The fact that it does not accumulate in the normal liver means that (See FIGS. 1 and 2) See also by immunohistochemistry using frozen tissue sections Was completed. ¹³¹Normal intestinal localization was seen, with variability of I-mAbA33. How many people Scans in some patients show labeling of some part of the intestine, and in some cases Had a clear outline of a normal colon. But in other cases at least Only a normal colon image was seen. Using a section of normal colon resected during surgery In some tests, simple washing of the specimens with phosphate buffered saline Quantity of radioisotope It was shown that the element labels could be recovered. Therefore, at least some¹³¹I -Apparent uptake of mAb A33 by normal intestine is due to free secretion by the stomach. Detached¹³¹Monoclonal antibodies in the presence of I or low binding affinity Could indicate the presence of A33-positive intestinal mucosa of normal small and large intestine To¹³¹The finding that I-mAbA33 does not accumulate more strongly suggests that anti- It may be related to the fact that Hara is not easy to approach.Example 4 Therapeutic effect of ¹³¹ I-mAbA33 in humans suffering from colorectal cancer In patients suffering from advanced colorectal cancer,¹³¹Treatment test of I-mAbA33 Was made. Twenty-three patients participated in the study and received 30 mCi / m as one infusion^Two of¹³¹By injecting I-mAbA33 or for 3 consecutive days,¹³¹I-mAbA 33 were given. Two patients (No. 14 and No. 18) should be followed up. (The number of blood samples during the nadir time is 2 patients who died of progressive disease within 1 month after treatment (Nos. 2 and 22) were not evaluated for incomplete toxicity. Organizational Observation of the slide revealed that one patient (No. 10) showed small It was found to have bowel cancer. A33 immune group for patients included in this study Because frozen tissue was not obtained for weaving chemistry, inclusion bodies (incl serotype test could not be performed as a diagnostic criterion for usion). For A33 Available mAbs are routinely immobilized on paraffin-immobilized material. Cannot be used for the detection of antigens. 1 to 3 weeks after treatment, 23 treated Of 20 patients independently by CT scan or chest x-ray Positive for identified tumor site¹³¹An I-mAbA33 scan was shown. In two patients with surgically proven intra-abdominal disease and elevated CEA levels, And also by CT scan¹³¹Visible by I-mAbA33 scan For one patient (No. 10) who was not transformed and had small bowel cancer,¹³¹Im AbA33 scan negative. In all patients included in this study, human anti-mouse anti-mouse A body (HAMA) response emerges, against both IgM and IgG up to 4 weeks after treatment Titers ranged from 1: 10,000 to 1: 100,000. Observed Main poison The sexes are plasmacytopenia and neutropenia, and their severity is generally dose-dependent. Was surprising. However, each dose level tested (> = 45 mCi / m^Two) Patients who have previously received large doses of chemotherapy¹³¹I-mAbA33 treatment Occasionally, even if the plasma plate number has returned to the normal range, it is very noticeable and / or It showed signs of prolonged bone marrow (immune) suppression. Such hematological patients Is measured by the rate of whole body isotope clearance,¹³¹ It was not due to the difference in retention of I. Rather, it (hematotoxic Patient-to-patient) reflects the intrinsic sensitivity to radiation damage It was. 75 to 84 mCi / m^Two1 out of 5 patients treated at (No. 11) is grade 3 plasmacytopenia (worst condition (nadia) At 33,000 / microliter for 2 days, and 3 patients (No. 13, 14) , And 15) showed no toxic effects. Patient Nos. 11 and 12 were previously B CNU, streptozoticin, vincristine, 5-fluo Being treated with Louracil (5-FU) and leucovorin while patients No. 13, 14 and 15 received only 5-FU and leucovorin. 86-94mCi / m^Twoof¹³¹Complete evaluation of 6 people given I-mAbA33 Of the healthy patients (Nos. 16, 17, 19, 20, 21 and 23), two (No. 21 and 23) show grade 4 toxicity, one shows Great 1 toxicity and 3 Showed no toxicity. Of the two patients showing Great 4 toxicity, patient No. . 21 had previously received high dose chemotherapy (5-FU, interferon alpha, BCNU, Separate protocol for streptozotocin and vincristine for more than 30 months At)¹³¹Rapid and prolonged blood after I-mAbA33 treatment It showed suppression of the number of sac and neutrophils. Two patients with plasmacytopenia (Nos. 21 and 23) had neutropenia. The other two patients (No. 18 and 22) include one blood test during their nadir period. Was not fully evaluated because it was only tested And grade 3 neutrophil toxicity. In general, a reduction in total leukocyte count However, no analysis was performed on individual lymphocyte subsets. won. Regarding treatment responsiveness, diseases determined by chest X-ray or CT scan I Eighteen patients displaced and, depending on serum CEA levels, show measurable disease However, three radiographs failed to show a measurable disease. The patient was evaluated. Follow-up is not possible for two patients, Could not be evaluated because the tumor was surgically removed. Mixed response ( evidence of mixed responses) in 5 patients (Nos. 3, 5, 7, 9, and 23) Was obtained. Patient No. 3 is metastasis to the liver and malignant ascites revealed by cytology Before treatment, stabilized by diuretics (Lasix, Aldactone) Had been¹³¹After injection of I-mAbA33, a large amount of radioisotope in ascites fluid Accumulation was detected. One month after treatment, the patient lost 8 kg and ascites Disappeared and serum CEA levels were 3750-4200 ng / ml (pre-treatment ) To 2000 ng / ml. Then stop continuing diuretics, Serum CEA levels stabilized at 1750 ng / ml for almost 4 months. Turn to the liver The transfer remained unchanged according to radiographic criteria. 10 weeks later¹³¹Im Re-treatment with AbA33 was attempted; however, The accumulation of soup was found only in the liver and spleen, but not in the tumor site. Patient No. 5: Extensive pleural disease in the right chest and measurable lesions in the left chest Had trouble with metastasis to the liver.¹³¹Three weeks after I-mAbA33 treatment, the left chest The part of the lesion became invisible and disappeared after 2 months (see FIG. 3). thing). Other measurable disease sites remained stable for 5 months. Patient No. 9 is Metastasis to the liver, large pelvic mass in the pelvis, and With extensive abdominal disease, including large lymph nodes in the supraclavicular and left neck Was.¹³¹Four weeks after I-mAbA33 treatment, lymph nodes became non-palpable However, after one month, the clumps of cohesive material in her pelvis had increased in size. patient No. At 7 and 23, serum CEA levels increased by 2 2% and 30%, respectively; however, a more detailed assessment of disease progression Also had no disease measurable by radiological examination, there were. Comparisons between patients showing evidence of mixed response and those not showing No differences were apparent. Specifically, the collection of radioisotopes at the tumor site There is a clear difference between the penetration level (determined from the scan) and the measurable response. No correlation appeared.Preparation of antibody conjugate Monoclonal antibody A33 is combined with an anticancer drug and administered for cancer treatment can do. For example, mAb A33 is associated with QFA, an antifolate, or tumor. Calicheamicin (cali), an antitumor antibiotic that cuts double-stranded DNA in tumor cells cheamicin). QFA and calichea sewing machine are both It has a site of action in the cell and cannot easily pass through the cell membrane. Follow Thus, they show weak cytotoxic effects when added to cell culture. Uptake of these drugs into cells by mAbA33-mediated internalization Entrapment greatly enhances these cytotoxic effects in vitro. Inn Vivo xenograft studies included mAbA33-QFA and mAbA33- Inhibits tumors while limiting normal tissue damage by both caremicin conjugates It is shown that it can be. Other anti-cancer drugs are also conjugated with the antibodies of the present invention. And can be used for the treatment of cancer. Other anticancer drugs include: BCNU, streptozoicin, vincristine and 5-fu Contains Luouracil. Monoclonal antibody A33 is used for colon cancer cells and normal colon cells (normalcolono). cytes) can also be used to target genetic material to both. To Since it is rapidly taken up into target cells. A33 antigen is an antibody To the macropinosome, an intracellular compartment. Transfected D NA also moves on the macropinosomal compartment, escapes hydrolysis, and ends with chromosomal DNA. Incorporated in For the mAb A33-drug conjugate, the A33 antibody nucleates the drug. To the DNA. Similarly, using mAbA33 to transfer genetic material into cells. I can do it.Example 5 A33-oligonucleotide conjugate Using heterobifunctional reagent SPOP 26-mer oligonucleotide having a free reactive thiol group at the 3 'end Was bound to the free amine of mAb A33. 5 'end of this oligonucleotide End As a DNA tracer³²Labeled with enzyme by P. SDS-PAGE And reduced gels are consistent with products containing a range of oligonucleotide / mAb ratios. Pattern. Purified by protein A chromatography . The final product is sterile filtered (disinfected) and binds to cell binding activity and proteins. Oligonucleotides tested. The final purified product is a colon cancer cell line SW1222 expressing the A33 antigen. Tested with Low pH reverses mAb A33 binding to its antigen To determine the rate of internalization based on the ability to Tokor developed. This is mAbA33-³²P-DNA binding and internal The resizing¹²⁵Comparison of I-mAbA33 binding and internalization Was used to analyze. Radioisotope labeled mAb A33 conjugate details To prevent specific binding to vesicles, an excess of unlabeled, unmodified, mAbA 33 were used. This ensures that all cell binding is specific and mAbA 33 is mediated by the interaction of its antigen with Was. Assays were performed in 96-well plates and cells in exponential growth phase were applied to wells. 100,000 cells were used. Added to wells after 24 hours³²7.2 out of P % Bound to the cells. After 48 hours, more than 60%³²P is taken into cells Was. The anti-tumor effect when using anti-actin DNA was confirmed by the transplanted SW1222. Observed in nude mice with cells. These conjugates are -³²Also contains P,³²P contributed somewhat to antitumor effect there is a possibility. However, due to the low radioactivity (10 μCi / mouse) The effect expected from tope (isotype) alone would be very small You. The antibody conjugates of the invention can be obtained by various routes well known to those skilled in the art. Can be administered. Examples of routes include intravenous, peritoneal Intramuscular, intramuscular, subcutaneous, or oral (eg, associated with a virus) Can be The antibody conjugate of the present invention is combined with a pharmaceutically acceptable carrier. It can also be administered in the form of a composition that has been prepared. The antibody conjugate of the present invention has a capacity of about 0 . The dosage can range from 1 mg to 2000 mg. However, The dosage range depends on the condition of the patient to be treated, the patient's medical history, Law and other Depending on a number of factors, it will vary depending on the patient to be treated.Example 6 Characterization of A33 system Some A33-positive colorectal cancers to characterize the A33 system Cell lines were used to determine the number of mAbA33 binding sites per cell. It was found that there were more than 800,000 sites per cell. mAb A33 It turned out that the affinity in the case was high. A33 antigen is rapid using the same cell line It is shown that it is an antigen that is taken up into cells within 24 hours. It has been shown that up to 90% internalization occurs. Cultured large intestine To cancer cells¹²⁵Studies of binding kinetics of I-mAbA33, washing experiments with acid, and MAb incorporated into cells by SDS-gel analysis of cell extract and culture supernatant 80-85% of A33 circulates in the intracellular compartment and in about 1-2 days It was shown to be released in a form that exhibited takt immunoreactivity. Uptake in cells Was¹²⁵Of the I-mAbA33, only a very small amount was internalized. After the installation, it appears to be degraded, and this degradation ) Was partially inhibited by inhibitors of lysosomal enzymes. The mechanism of mAbA33 internalization is related to macropinosomes. Is engaged.¹²⁵Combined with I calicheamicin and QFA In vitro studies on mAb A33 have shown that A33-positive colon cancer cells Although it showed potent cytotoxic activity, A33-negative tumor cell lines Vesicle injury) activity. All three conjugates, after uptake into cells A33 has the ability to take up A33 cells, Was determined to play a very important role inExample 7 Generation of other mouse antibodies We have designated the IgG2b isotype mAbs 100-210. And mAb 100-310, which is an IgG2b isotype And two additional mouse mAbs were generated. mAbs 100-310 are for reference only U.S. patent application Ser. No. 08/273, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. , 277 Has been described. Secretes monoclonal antibodies 100-210 and 100-310 Hybridomas are based on the Budapest Treaty on November 30, 1994, respectively. On April 28, 1992, American Type Culture C collection, Rockville, Maryland , Each ATTC No. Cataloged as HB11764 and HB11028 Have been. These monoclonal antibodies show the same reactivity pattern as mAbA33. Show. In a competitive radiobinding assay, monoclonal antibody 100 -210 inhibits mAb A33 binding. This is it (monoclonal antibody 100-210) identical to or spatially linked to mAb A33, A33 antigen Suggests binding to the above epitope (antigenic determinant). On the other hand, mAb1 00-310 and mAbA33 did not cross-blck with each other, indicating that These are two different epitopes on the same cell surface protein on the A33 antigen. Suggests that it is reacting withExample 8 Generation of humanized A33 antibody High or low affinity mAbs or faster or slower serum clearing The use of mAbs with lances for both immunization in cancer patients is Targets, tumor types, mAb-specific pharmacokinetic properties, desired effectors Mechanisms and other non-immunological parameters. Will be. mAb A33 has very good targeting in vivo Targeting) properties, which are useful tests to evaluate these parameters. Provide a security system. The humanized and modified monoclonal antibody is mAbA3 3 To clone and express the gene for the mAb to A33, MAb A3 in RPMI 1640 medium supplemented with calf serum and 1 mM glutamine Three hybridoma cells were cultured. Total RNA is guanidine isothiocyane Using guanadinium isothiocyanate⁹Prepared from hybridoma And poly (A +) m by oligo (dT) affinity chromatography. RNA was isolated. First-strand cDNA was synthesized from 10 mg of mRNA. Done. D encoding A33 variable domain, including signal sequence for secretion NA sequence Jones et al.,Bio / Technology, 9: 88-89 ( 1991) using the PCR procedure. Was However, the PCR product can be easily cloned into a vector for expression in mammalian cells. A primer designed to be able to be used was used. These vectors were originally pE E6 (Stevens, et al.,Nucl. Acls Res. , 17: 7110 (1989)). FIG. 4 shows the final NSO expression vector. Light chain variable domain amplified by PCR Fragment between the Bst1 and Ap11 sites of pMRR010 Cloned. pMRR010 expresses a sequence such as a kappa chimeric light chain. This is a derivative of pEE6 constructed to A33 heavy amplified by PCR The fragment of the chain variable domain contains the HindIII site of pMRR011 and Apa It was cloned between the I sites. pMRR011 is a gamma 1 chimeric heavy chain Cloned is a derivative of pEE6 constructed to express such a sequence The variable region gene is a double-stranded dideoxy chain using T7 DNA polymerase. Sequenced by the terminator method. Humanized variable domains have been described by Daugherty et al.Nucl. Accids Res., 19: 2471-2476 (1991). Assembled by the steps you have. Where the light and heavy chains respectively correspond to It seems that cloning into pMRR010 and pMRR011 is easy. Primers were used. These humanized variable region genes are used for mouse variable region genes. Sequenced according to the same procedure as given. One thiol in hinge region The expression vector for the hA33 Fab '△ cys heavy chain with Domains, such as King,CancerRes., 54: 6176- 6B (1994), the cB72.3 Fab '@ cys gene Constructed by substituting the appropriate yagments for them. One of the heavy chain and light chain of mouse IgG, or one of the heavy chain and light chain of humanized IgG and Fab '. Transient co-expression has been reported by Cockett et al.Bio / Technology , 8: 662-667 (1990). By co-transfection into CHO-L761 hour cells Achieved Was. To develop cell lines with stable heavy and light chain expression, Were combined into one plasmid. This is because Not in the light chain expression plasmid The 1-BamH1 stuffer fragment was inserted into the heavy chain expression N with the hCNV promoter / enhancer and heavy chain gene from lathmid It was completed by substituting the ot1-BamH1 fragment. Final departure The current plasmid contains pAL for hA33 IgG and Fab'Ｆcys, respectively. 71 and pAL72 (FIG. 4). Next, stable NS0 cell lines for the production of hIgGl and hFab ' Bebbington and othersBio / Technology, 10: 1 69-175 (1992). Established by sfection. After transfection, The vesicles were treated with 10% dialyzed fetal bovine serum and Dulb containing 2 mM glutamine. 96 holes in ecco's Modified Eagles Medium 2x10 per port^FivePlated to be cells. 24 hours later, Onion sulfoximine (methionine sulphoximine) to a final concentration of 7μM Cells were selected by adding to the medium as described above. Productivity after 21 days of culture Resistant colonies were picked and expanded for analysis. Highest productivity Select one, and incubate with a roller bolt, use a recombinant antibody. Was produced. As a result of these binding assays, the chimeric antibody developed an antigen, similar to mouse A33. The cloned gene is that of A33, which has been shown to bind to (Antibody). FIG. 5 shows the cloned variable domain. 2 shows the amino acid sequences of the heavy and light chains deduced from the DNA sequence of the gene. The N-terminal protein sequencing of the first 11 amino acids shows this for both heavy and light chains. Since the result showed a perfect match with the deduced amino acid sequence, the appropriate gene was It was confirmed that the FIG. 5 shows the variable domain of the light chain [A] and heavy chain [B] of mouse and humanized A33 antibodies. 2 shows the amino acid sequence of the amino acid sequence. Mouse antibody sequence deduced from cDNA (m A33) and the sequence of the humanized antibody (hA33) are shown side by side. Humanized The framework sequence is based on the human antibody LAY (Kabat et al.),Seque nces of Proteins of ImmunologicalInter est , 4th Ed. (1987)). Three in each chain The complementarity determinator is underlined. Mouse A3 in the LAY framework Residues that have been replaced with three sequences are double underlined. A33 V_HIs human subgroup V_HHomolog closest to the consensus sequence of III (70%) while V_LIs human subgroup V_LI and V_LI's Con The maximum homology (62%) with the census sequence is shown. These sub-glue LAY was selected as a human framework from the_HIII heavy Chain and V_LIt has an I light chain. In FIG. 5, residues 1-23, 35-4 of the light chain 5, 47-49, 57-86, 88, and 98-108 are all derived from the LAY sequence And residues 24-34, 46, 50-56, 87 and 89-97 are complementarity determined. (CDR). Residues 46 and 87 are at the junction of the light and heavy chain variable regions. Is expected. Residue 46 is usually leucine in the human antibody sequence, 87 is usually phenylalanine or tyrosine. For the heavy chain, residues 2-26, 36-49, 66-71, 74-82a, 8 2c-85, 87-93, and 103-113 are all derived from the LAY sequence, On the other hand, residues 1, 27-35, 50-65, 72, 73, 82b, 86 and 94-1 02 were all mouse-derived. Residues 31-35, 50-65 and in the heavy chain And 95 to 102 correspond to the CDRs. Mouse-derived amino in the framework The acid was included for several reasons: residue 1 is usually accessible to the catalyst, Located near the DR region (residues 27-20); LAY is usually human or mouse V_HMouse with an alanine residue not found at this position in the sequence Residues were used. At positions 72 and 73, it is expected that the position is close to CDR2. As expected, mouse residues were used. In the case of residue 72, LAY N-linked glycosylation sites in variable domains by using a framework To eliminate the possibility of introducing a position, mouse residues were used. Mouse array Is also used at residue 94 in the domain, where A33 is usually Has proline, not found in position. Mouse residues are at positions 82 and 86 Used in This is LAY At these positions in the humanized antibody with the framework, human amino acids are Use was previously found to be detrimental to heavy chain expression It is. hIgG is obtained from the tissue culture supernatant of NSO cells by protein A-cephalo Purified using sorbent affinity chromatography, King other,Biochem., 281: 317-323 (1992). As characterized by SDS-PAGE. hA33Fab '△ cys purifies low-affinity protein A binding site on Fab 'from cell culture supernatant Chromatography of protein A-Sepharose Purified by fee. A column of Protein A-Sepharose was loaded at 150 mM. Equilibrate with 100 mM borate buffer pH 8.0 containing sodium chloride Was. The tissue culture supernatant from NSO cells expressing hA33 Fab '@ cys was The pH was adjusted to 8.0 by adding squirrel and applied to the column. equilibrium After washing with an activating buffer, Fab 'was eluted with 0.1 M citric acid, The fractions were collected directly in a sufficient volume of 1 M Tris and the pH of the And between 7. After dialysis and ultrafiltration, hA33 Fab '@ cys is a maleimide-based (malei mide-based and homobifunctional and homomotrif unctional) using the linkers CT52 and CT998, respectively. Regarding 3Fab '△ cys,The aforementionedKing, et al., (1994) DFM as listed^TMAnd TFM^TMAnd was cross-linked. These black Slinker is⁹⁰12N4 macrocycles for combining Y (the 12N_Fourmacrocycl e) is included. Generated DFM^TMAnd TFM^TMIs Sephacryl ) Purified by gel filtration using an S-200HR column.⁹⁰Radioactivity at Y Isotope labels areThe aforementionedDescribed in King et al. (1994). Went like so. A small amount of the humanized antibody was generated with the transient expression system in CHO cells, It was demonstrated that it binds to SW1222 cells expressing the antigen. next, Both hA33 IgG and Fab '@ cys were used to produce larger quantities of purified material. A stable NSO cell line corresponding to was isolated. The best cell line is suspension culture, Outside 700 mg / ml hA33 IgG1 and 500 mg / ml Fab'Δc ys was produced. FIG. 6 shows (A) non-reducing and (B) humanized A33 IgG and TF under reducing conditions. M^TM1 shows an SDS polyacrylamide gel of the present invention. Lane 1 is hA33 IgG Lane 2 is hA33 Fab '@ cys; lane 3 is hA33 Fab' @ cys Roslink mixture; lane 4 is purified hA33TFM^TMIt is. FIG. 6 shows that the purified hIgG was homogeneous and fully assembled. Prove that. HPLC analysis shows no hIgG aggregation Was. As expected, hFab '@ cys is largely a monovalent form of Fab' And a small amount is F (ab ')_TwoRecovered in the form of other recombinant Fab ' Consistent with the results at the fragment. Purified TFM^TMSDS-PAGE analysis of non-reduced Under the conditions, it showed a single species of about 150 kD. Under reducing conditions, approximately Two species of 75 kD and 25 kD were observed, each of which cross-linked three times It corresponds to the size predicted from the Fd 'chain and the light chain. Fab '△ cys TFM^TMCross-linking was achieved in 60-65% yield . FIG. 7 shows (a) hA33 Fab ′; (b) TFM^TMHA after crosslink to HPLC profile of 33 Fab 'and (c) purified hA33 at 280 nm. Is shown. HPLC gel filtration was performed by DuPont's Zorbax GF-250. At the column outlet, (flow rate) 1 ml / min, 0.2 M sodium phosphate buffer Performed in pH 7.0. As shown in (a), the hA33 Fab ' Indicates a retention time of 10.5 minutes, and F (ab ')^TwoHas a minor peak of 9.7 minutes And the buffer peak was 12.2 minutes. As shown in (b) After the slink, the major peak at 9.0 minutes is TFM^TMIs represented. Minor -The peak at 9.6 minutes is di-Fab, and the one at 10.5 minutes remains. The remaining monomer Fab 'at 8.2 minutes showed a small amount of aggregates and At 12.2 minutes represents the same buffer peak. Shown in (c) After purification to^TMThe peak is still seen at 9.0 minutes, the only other The visible peak was the buffer peak at 12.2 minutes. Next, the antigen binding assay was performed using two human colorectal tumor cells expressing the A33 antigen. Vesicle The system was performed using cells from COLO205 and SW1222. These cells are 2 Cultured in DMEM medium containing mM glutamine and 10% fetal bovine serum. Assembled antibodies in culture supernatants and in purified preparations Was quantified by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). To SW1222 cells Direct binding of various mouse and humanized antibodies was determined by the FACScan assay. Was. SW1222 cells are trypsinized to remove from culture flasks Washed with phosphate buffered saline (PBS), 10% bovine serum and 0.1% sodium azide Resuspended in PBS containing thorium. The humanized A33 antibody is subsequently % FCS and 0.1% sodium azide diluted in PBS^Five Of cells. After 1 hour incubation on ice, cells were washed with PBS. In rhodamine, and then on ice for an additional hour, rhodamine anti- (human Fc) conjugate (rh odamine anti- (humanFc) conjugate) (PBS, 10% FCS and 0.1% 1: 1000 in sodium chloride). Wash in PBS After purification, the amount of rhodamine-labeled A33 antibody conjugate bound to the cells was determined by FACScan. It was measured with an analyzer. Direct binding of mouse A33 to SW1222 cells After incubation with TC-labeled antibody, measured by FACScan analysis Specified. A33 is an antibody-antigen rather than a non-specific binding via Fc interaction Appropriate non-characteristics are used to demonstrate specific binding through interactions. Different antibody controls (experiments) were performed. Measuring the affinity of mouse and humanized antibodies was performed by Krause. other,Behring Inst. Mitt., 87: 56-67 (1990). Performed according to the procedure described. Briefly, 1.3 mg / milliliter of antibody Fluorescein isothiocyanate (FITC) titered from With fluorescein, then 5% FCS and 0.1% sodium azide 2.8 x 10 for 2 hours on ice in 350 ml PBS containing^FiveSW12 Incubated with 22 cells. The amount of fluorescence bound per cell was determined by FAC Measured with Scan and calibrated using standard beads. Each antibody concentration The number of bound antibody molecules per cell at Used to obtain a Jatchard plot. Continuous amount of standard mouse antibody Diluted (series) humanization After incubating SW1222 cells together with Variant, the bound FI Competition assay by quantifying TC-labeled mouse A33 with FACScan Was made. FIG. 8 shows a scheme for binding of mouse antibody and hIgG1 to SW1222 cells. 3 shows a Jatchard analysis. These data indicate that both antibody forms are: 3 nM equilibrium dissociation constant (K^D's) and is approximately 300,00 per cell It suggests that it has 0 sites. hTFM^TMAntigen binding activity Monovalent hFab '△ cys and hIgG antigen binding activity and competitive binding assays And compared. In this assay, these species will have antigen-expressing C Competed with mouse IgG for binding to OLO205 cells. Results (FIG. 9) ) Indicates that the binding of the monovalent Fab ′ fragment is greater than that of the divalent IgG as expected. Clarify that it is not good. On the other hand, trivalent hTFM^TMIs hIg G shows approximately 2 times better binding than G, probably due to avidity It is thought to be the result of the increase. This finding is based on the conclusions obtained with chimera B72.3. And TFM was also found in chimera B72.3.^TMIs 2-3 times more than IgG It showed good binding. Figure 8. Scatcher of humanization and mouse A33 binding to SW1222 cells. FIG. For details of the experiment, see Materials and methods A). The Kd value of mouse A33 IgG was 1.28 nM, and humanized A33I A gG Kd value of 1.27 nM was calculated from linear regression analysis of the data points. Figure 9 shows hA33 Fab @ cys, IgG and TFM on COLO205 cells^TM Figure 3 depicts a competition binding assay for binding of. hA33 IgG (◇), TFM^TM (|), TFM^TM(□) and Fab ′ △ cys (△) are FITC-labeled mice. Competition with A33 IgG, and the result is expressed as a fluorescent unit versus an nM binding site. Lot. Next, the antibody was conjugated to the macrocyclic ligand tetraazocyclododecaneetraic acid (te via traazocyclo dodecane etra-adid (called 12N4 or DOTA) hand⁹⁰Labeled with Y. This ligand (12N4) is available from Antoni (Antoni). w) et al., “Practical evaluation of yttrium- 90 Iabellmonoclonal antibody A33 and A 33 tri-fab (TFM) for radioimmunotherapy of color carcinoma ",InPressListed in As described above, to an immunoglobulin via a 12N4-mimide linker. hA33-12N4 conjugate⁹⁰Y and¹²⁵Radioisotope labeling with I, and Biodistribution studies in nude mice with subcutaneous SW1222 tumor xenografts ,The aforementionedPerformed as described in Antoniw et al. Anti The body is converted to a second macrocyclic ligand, 1,4,7-triazacyclononanetrivine Via an acid (1,4,7-triazacyclononanetriacetic acid) or 9N3, (Turner) et al.Br. J. Cancer, 70: 35-41 (1994). Using a 9N3-maleimide linker as described in¹¹¹Labeled with In did. Both before and after radioisotope labeling, the immunoconjugate Responsiveness was demonstrated using a competition-based FACs assay. Inside the body For distribution experiments, radioisotope labeling was> 95%⁹⁰Y binds and 2 μCi / Achieved with a specific activity of μg. Biodistribution studies in guinea pigs indicate that approximately 250 to 3 outbred males were outbred. Done after intravenous administration to 00 gram Dunkin-Hartley guinea pig Was. Four groups of guinea pigs each⁹⁰Inject Y-labeled component into ear vein Shot and sacrificed at time intervals after administration (killed) as shown in FIG. Was). A blood sample is taken, andThe aforementionedAntoniw Tissues were analyzed as described by M. et al. For mice. 5-7k g in cynomolgus monkeys (2 per group) This was done after intravenous injection of the element labeled components. Blood for counting 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 1 Collected at 44 and 168 hours. FIG. 10 shows in nude mice with SW1222 tumor xenograft.⁹⁰Y sign 1 shows a time course study on the biodistribution of humanized A33. Mouse In each case, 19 μCi (10 μg) of 90Y-labeled hA33 was injected intravenously. Four mouse Later killed and the amount of activity measured in tumor and normal tissue. Was. Each column represents the average value obtained from four mice. Error bars are average Represents the standard deviation of the values. Tissue uptake is% injection line per gram tissue Plotted as amount (% injected dose). Good biodistribution is achieved High levels of activity (radioactivity) are predominantly localized and are stored in any normal tissue. The product was small or not. The biodistribution of the humanized A33 immunoconjugate was Distribution and significant differences of mouse antibodies at these time points in the same xenograft system There was no difference. Tumor-localized activity (radioactive) for both mouse and humanized antibodies Noh) levels are lower despite lower levels in all other organizations , Increasing over time, resulting in a tumor to normal tissue ratio over time. Increased (Table 2). Assess whether this is a characteristic of the antibody itself or of the radioisotope used To do¹²⁵A biodistribution experiment using humanized A33 labeled with I was also performed. In this experiment, the absolute level of isotope retained by the tumor was slightly lower. However, the tumor to blood ratios were very similar, indicating that the increased localization was Suggests that it is an A33 antibody characteristic, not a tope / chelator system characteristic are doing. Localized to tumor¹²⁵The low absolute levels of I-hA33 probably May be the result of dehalogenation of the radioiodinated antibody. Humanized TFM^TMAnd all other humanized fragments tested were consistently masked. Faster than in mouse circulation, much faster than the equivalent mouse fragment Was observed to be left. This phenomenon has been shown to be mouse specific And did not occur in rats, guinea pigs, or monkeys. Table 3 shows hA33 IgG. , DFM^TMAnd TFM^TM3 shows a comparison of the biodistribution in guinea pigs. this Is DFM^TMAnd TFM^TMRepresents 144 hours of faster blood clearance In the eyes, these blood activities (radioactivity) are 0.01% and 0.02%, respectively. Dose / gram (i.d./g). The blood activity (radioactivity) of hIgG Much higher than them, at which point 0.4% injected dose / gram (i.d./g) Met. Table 3 shows the DFM^TMFor IgG and TFM^TMConsiderably higher than It is very clear that levels of radioactivity are taken up by the kidney. This DFM^TMHigher activity (radioactivity) for the kidneys than for the blood Disappears quite slowly. Early on, kidney levels were TFM^TMAnd IgG Are slightly higher, but these are^TMCompared to the level about Activity (radioactivity)^TMIs DFM^TMConsiderably faster than the kidneys Disappears from. These results for A33 show a DFM of cB72.3.^TMAnd TF M^TMConsistent with the results for Also, the kidney is TFM^TMIs consistent with the view that it is an organ that eliminates An index to measure blood clearance parameters for each monkey A functional, non-linear least squares adapted method was used. Time relationship after administration IgG, TFM to calculate the percentage of absorbed dose as a number^TMAnd DFM^TM Using the mean of the blood clearance parameters for grals). In humans⁹⁰When labeled with Y, each form of antibody (I gG, TFM^TMAnd DFM^TM), Which is believed to have been carried by An evaluation was made for all absorbed doses. Monkey data was given at an early Indicating that all of the activity (radioactivity) is in the circulation, The same was considered for humans. The calculation is¹¹¹In and⁹⁰Labeled with Y The pharmacokinetics of the antibodies obtained are identical to each other, and are the same in monkeys and humans. It was made based on this assumption. In addition, radioisotope-labeled antibodies in bone marrow Assuming no specific uptake, after several hours (<5 hours) The radioactivity was determined to be the same. To make a number that represents humans, Standard human data: 5000 ml total blood volume; bone marrow space;⁹⁰ The resorption fraction for Y beta particles; and the thickness of the inner lining was used .⁹⁰Y beta particles have high energy Therefore, the absorbed radiation dose in the bone marrow and endosseum is Is the same. FIG. 11 shows that in a cynomolgus monkey,¹¹¹InhA33 IgG (■), TFM^TM (○) and DFM^TM(▲) represents the pharmacokinetic profile. Data is broken Average percent of the implanted dose remaining at each time point, corrected for Plotted as a percentage. Due to safety considerations, these ingredients⁹⁰In Y Without¹¹¹Labeled with In. Because from previous research,⁹⁰Y-labeled IgG and fragments were¹¹¹ It shows pharmacokinetics and biodistribution very similar to those labeled with In Because it was suggested. The plasma clearance profile is shown in FIG. The half-life values of the alpha and beta phases are shown in Table 4. As predicted from pharmacokinetic data in mice and guinea pigs, TFM^TM And DFM^TMAre both cleared faster from the (blood) circulation as compared to IgG. So In addition, DFM^TMIs TFM^TMIt is removed more quickly than. Plasma chestnut When Alance was examined without correction for decay for isotopes (Table 5), Data are IgG and TFM^TMMonophasic Dynamics and DF for M^TMVery consistent with the biphasic kinetics for These days The result of the dosimetry calculation based on the⁹⁰When labeled with Y and injected with an equivalent amount of radioactivity Joint DFM^TMIndicates absorbed dose to bone marrow approximately 5 times lower than IgG (Table 5) , Suggesting that. Single chain antibody (SCA) is also prepared from mAbA33 can do. Single chain antibodies are better for tumor tissue due to their smaller size To spread. They also have a short serum half-life, so that Toxicity to is weakened. Rapid removal of SCA from blood results in tumor uptake May be lower. Single chain antibody SCA-A33 was created. This Antibodies retain the binding specificity of mAb A33 and are more intact than intact mAbs. About 3 times lower binding affinity. SCA-A33 As with other single-chain antibodies, hepatic kinetics for local (r / regional) perfusion Primary disease due to metastasis to the liver via the veins and via superior mesenteric artery perfusion It can be used therapeutically for strange. Although the invention has been described herein with reference to specific embodiments, these It is understood that the specific examples are merely illustrative of various aspects of the present invention. Should be. Accordingly, various refinements have not been made within these illustrative examples. It is possible that other combinations (arrangements) may vary in the spirit and scope of the invention. It should be understood that they can be devised without departing from the invention.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年６月２５日【補正内容】請求の範囲１．大腸ガンをわずらう患者に、薬学的に効果的な量の、マウス、ヒト化、キメラ、トリマー（trimeric）、ヘテロマー（heteromeric）、又は一本鎖化（sin gle chain）形態の抗体と抗ガン剤との結合体を投与することからなる、患者における腫瘍退縮を促進させる、又は、血清ＣＥＡレベルを減少させるための方法。２．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１の方法。３．前記モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項２の方法。４．前記抗ガン剤が、カリケアミシン（calihcheamicin）、ＱＦＡ、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシルからなるグループから選択される請求項１の方法。５．患者に、薬学的に効果的な量の、大腸ガンに特異的な抗体とペプチドとの結合体を投与することからなり、前記ペプチドは、大腸ガンのＤＮＡ活性を特異的に阻害するものである、大腸ガンをわずらう患者における腫瘍退縮を促進させる、又は、血清ＣＥＡレベルを減少させるための方法。６．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項５の方法。７．前記モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項６の方法。８．前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー（trimeric）抗体、ヘテロマー（heteromeric）抗体、及び一本鎖化（single chain）抗体からなるグループから選択される、請求項５の方法。９．患者に、薬学的に効果的な量の、マウス、ヒト化、キメラ、トリマー（tr imeric）、ヘテロマー（heteromeric）、又は一本鎖化（single chain）形態の抗体と、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、⁹⁹Ｔｃ、¹²⁵Ｔｃ、⁹⁰Ｙ、及び¹¹¹Ｉｎからなるグループから選択される放射性同位元素との結合体を投与することからなる、大腸ガンをわずらう患者における腫瘍退縮を促進させる、又は、血清ＣＥＡレベルを減少させるための方法。１０．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項９の方法。１１．前記モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ａ３３、１００−２１０及び１００−３１０からなるグループから選択される請求項１０の方法。１２．前記モノクローナル抗体Ａ３３が、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ８７７９によって産生されたものである請求項１１の方法。１３．前記モノクローナル抗体１００−２１０が、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１１７６４によって産生されたものである請求項１１の方法。１４．前記モノクローナル抗体１００−３１０が、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１１０２８によって産生されたものである請求項１１の方法。１５．前記放射性同位元素が、¹²⁵Ｉである請求項９の方法。１６．遺伝物質を大腸ガン細胞のＤＮＡに伝える方法であって、前記細胞を、前記細胞内へ取り込まれる抗体と結合した遺伝物質と接触させることからなる方法。１７．前記抗体が、モノクローナル抗体Ａ３３、モノクローナル抗体１００−２１０及びモノクローナル抗体１００−３１０からなるグループから選択される請求項１６の方法。１８．抗ガン剤を大腸ガン細胞のＤＮＡに伝える方法であって、前記細胞を、前記細胞内へ取り込まれる抗体と結合した抗ガン剤と接触させることからなり、前記抗ガン剤は、カリケアミシン（calicheamicin）、ＱＦＡ、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシルからなるグループから選択される方法。１９．前記抗体が、モノクローナル抗体Ａ３３、モノクローナル抗体１００−２１０及びモノクローナル抗体１００−３１０からなるグループから選択される請求項１８の方法。２０．大腸ガン細胞と接触させた時に、大腸ガン細胞内へ取り込まれるペプチド −抗体結合体であって、前記ペプチドは大腸ガン細胞のＤＮＡ活性を特異的に阻害するものであるペプチド−抗体結合体。２１．大腸ガン細胞と接触させた時に、大腸ガン細胞内へ組み込まれる抗ガン剤 −抗体結合体であって、前記抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、トリマー（trim eric）抗体、ヘテロマー（heteromeric）抗体、及び一本鎖化（single chain）抗体からなるグループから選択される抗ガン剤−抗体結合体。２２．前記抗ガン剤が、カリケアミシン（calicheamicin）、ＱＦＡ、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（streptozoicin）、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシルからなるグループから選択される請求項２１の方法。２３．１９９４年１１月３０日に、ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託され、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７６４としてカタログされた、モノクローナル抗体１００−２１０を分泌するハイブリドーマ。２４．ハイブリドーマＨＢ１１７６４によって分泌されるモノクローナル抗体。２５．１９９４年１１月３０日に、ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｄに寄託され、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７６４としてカタログされている、モノクローナル抗体１００−３１０を分泌するハイブリドーマ。２６．ハイブリドーマＨＢ１１７６４によって分泌されるモノクローナル抗体。２７．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られたヒト化抗体。２８．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られたキメラ抗体。２９．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られたトリマー（trimeric）抗体。３０．大腸ガン細胞に特異的なモノクローナル抗体を利用して作られた一本鎖化（sinngle chain）抗体。３１．大腸ガンをわずらう患者に、薬学的に効果的な量の、抗体及び抗体に結合したペプチドからなるグループから選択される物質を投与することからなり、前記ペプチドは大腸ガン細胞のＤＮＡ活性を特異的に阻害するものであり、そして前記抗体は大腸ガンに特異的である、患者における腫瘍退縮を促進させる、又は、血清ＣＥＡレベルを減少させるための方法。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] June 25, 1997 [Content of Amendment] Claims 1. A pharmaceutically effective amount of a mouse, humanized, chimeric, trimeric, heteromeric, or single chain form of an antibody may be administered to a patient suffering from colorectal cancer. A method for promoting tumor regression or reducing serum CEA levels in a patient, comprising administering a conjugate to a cancer agent. 2. 2. The method of claim 1, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 3. 3. The method of claim 2, wherein said monoclonal antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibodies A33, 100-210 and 100-310. 4. The method of claim 1, wherein the anticancer agent is selected from the group consisting of calihcheamicin, QFA, BCNU, streptozoicin, vincristine, and 5-fluorouracil. 5. Administering to the patient a pharmaceutically effective amount of a conjugate of a colon cancer-specific antibody and a peptide, wherein the peptide specifically inhibits colon cancer DNA activity. A method for promoting tumor regression or reducing serum CEA levels in patients suffering from colorectal cancer. 6. The method of claim 5, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 7. 7. The method of claim 6, wherein said monoclonal antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibodies A33, 100-210 and 100-310. 8. 6. The method of claim 5, wherein said antibody is selected from the group consisting of a humanized antibody, a chimeric antibody, a trimeric antibody, a heteromeric antibody, and a single chain antibody. 9. The patient can receive a pharmaceutically effective amount of a mouse, humanized, chimeric, trimeric, heteromeric, or single chain form of the antibody and ¹²⁵ I, ¹³¹ I, Administering a conjugate to a radioisotope selected from the group consisting of ⁹⁹ Tc, ¹²⁵ Tc, ⁹⁰ Y, and ¹¹¹ In, which promotes tumor regression in a patient suffering from colorectal cancer, A method for reducing CEA levels. 10. 10. The method of claim 9, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 11. 11. The method of claim 10, wherein said monoclonal antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibodies A33, 100-210 and 100-310. 12. 12. The method of claim 11, wherein said monoclonal antibody A33 was produced by the hybridoma cell line ATCC HB8 779. 13. 12. The method of claim 11, wherein said monoclonal antibodies 100-210 were produced by the hybridoma cell line ATC CHB11764. 14． 12. The method of claim 11, wherein said monoclonal antibodies 100-310 have been produced by the hybridoma cell line ATC CHB11028. 15. 10. The method of claim 9, wherein said radioisotope is ^125I . 16. A method of transferring genetic material to the colorectal cancer cell DNA, said method comprising contacting said cell with genetic material bound to an antibody that is incorporated into said cell. 17． 17. The method of claim 16, wherein said antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibody A33, monoclonal antibodies 100-210 and monoclonal antibodies 100-310. 18. A method for delivering an anticancer drug to the DNA of a colon cancer cell, comprising contacting the cell with an anticancer drug bound to an antibody incorporated into the cell, wherein the anticancer drug is calicheamicin. , QFA, BCNU, streptozoicin, vincristine, and 5-fluorouracil. 19. 19. The method of claim 18, wherein said antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibody A33, monoclonal antibodies 100-210, and monoclonal antibodies 100-310. 20. Claims 1. A peptide-antibody conjugate incorporated into a colon cancer cell when brought into contact with a colon cancer cell, wherein the peptide specifically inhibits the DNA activity of the colon cancer cell. 21. An anticancer drug-antibody conjugate incorporated into a colon cancer cell when contacted with the colon cancer cell, wherein the antibody is a humanized antibody, a chimeric antibody, a trimer antibody, a heteromeric antibody. And an anticancer agent-antibody conjugate selected from the group consisting of: a single chain antibody. 22. 22. The method of claim 21, wherein said anticancer agent is selected from the group consisting of calicheamicin, QFA, BCNU, streptozoicin, vincristine, and 5-fluorouracil. 23. Deposited with The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland on November 30, 1994; A hybridoma secreting monoclonal antibodies 100-210, cataloged as HB11764. 24. Monoclonal antibody secreted by hybridoma HB11764. 25. Deposited with The American Type Culture Collection, Rockville, Marylad on November 30, 1994; A hybridoma secreting monoclonal antibodies 100-310, cataloged as HB11764. 26. Monoclonal antibody secreted by hybridoma HB11764. 27. A humanized antibody made using a monoclonal antibody specific to colon cancer cells. 28. Chimeric antibodies made using monoclonal antibodies specific to colon cancer cells. 29. Trimeric antibody made using a monoclonal antibody specific to colon cancer cells. 30. A single chain (sinngle chain) antibody produced using a monoclonal antibody specific to colon cancer cells. 31. Administering to a patient suffering from colorectal cancer a pharmaceutically effective amount of a substance selected from the group consisting of an antibody and a peptide conjugated to the antibody, wherein said peptide increases the DNA activity of colon cancer cells A method for specifically inhibiting and wherein the antibody is specific for colon cancer, promotes tumor regression in a patient, or reduces serum CEA levels.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 51/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 43/00 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者オールド，ロイド，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (72)発明者バレンズワード，エルスィエアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (72)発明者モンタルト，ニコラス，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (72)発明者グア，アリ，オスメイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI A61K 51/00 C12P 21/08 C12N 5/10 A61K 43/00 15/02 C12N 5/00 B // C12P 21/08 15 / 00 C (C12P 21/08 C12R 1:91) (72) Inventor Old, Lloyd, Jay New York 10105 New York Avenue of the Americas 1345 (72) Inventor Ballensward, Elsie, United States New York 10105 New York Avenue Montreal, Nicholas, J. United States of America New York 10105 New York 10105 New York Avenue of the Americas 1345 (72) Inventor Gua, Ali, Osmey United States of America York 10105 New York Avenue of-the-A Merikazu 1345

Claims

[Claims] 1. A method of reducing the effects of colon cancer in a patient, comprising administering to the patient a pharmaceutically effective amount of an anti-cancer agent conjugated to the antibody, wherein said antibody is specific for colon cancer. 2. 2. The method of claim 1, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 3. 3. The method of claim 2, wherein said monoclonal antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibodies A33, 100-210 and 100-310. 4. 2. The method of claim 1, wherein said antibody is selected from the group consisting of a humanized antibody, a chimeric antibody, a trimeric antibody, a heteromeric antibody, and a single chain antibody. 5. 2. The method of claim 1, wherein said anticancer agent is selected from the group consisting of calicheamicin, QFA, BCNU, streptozoicin, vincristine, and 5-fluorouracil. 6. Administering to the patient a pharmaceutically effective amount of a conjugate of a colon cancer-specific antibody and a peptide, wherein the peptide specifically inhibits colon cancer DNA activity. , How to reduce the effects of colorectal cancer in patients. 7. 7. The method of claim 6, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 8. The method of claim 7, wherein said noclonal antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibodies A33, 100-210 and 100-310. 9. 7. The method of claim 6, wherein said antibody is selected from the group consisting of a humanized antibody, a chimeric antibody, a trimeric antibody, a heteromeric antibody, and a single chain antibody. 10. A method of reducing the effects of colorectal cancer in a patient, comprising administering to the patient a pharmaceutically effective amount of a conjugate of a colon cancer-specific antibody and a radioisotope. 11. The method of claim 10, wherein said antibody is a monoclonal antibody. 12. 12. The method of claim 11, wherein said noclonal antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibodies A33, 100-210 and 100-310. 13. 11. The method of claim 10, wherein said antibody is selected from the group consisting of a humanized antibody, a chimeric antibody, a trimeric antibody, a heteromeric antibody, and a single chain antibody. 14． The ^{^{^{radioisotope, 125 I, 131 I, 99}}} I, 125 Tc, 90 Y, and a method of claim 10 which is selected from the group consisting of ¹¹¹ I n. 15. A method of transferring genetic material to the DNA of a colon cancer cell, the method comprising contacting the cell with genetic material bound to an antibody to be taken into the cell. 16. 16. The method of claim 15, wherein said antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibodies A33, 100-210 and 100-310. 17． A method for transmitting an anticancer agent to the DNA of colon cancer cells, the method comprising contacting the cells with an anticancer agent bound to an antibody to be taken into the cells. 18. 18. The method of claim 17, wherein said antibody is selected from the group consisting of monoclonal antibodies A33, 100-210 and 100-310. 19. 18. The method of claim 17, wherein said anti-cancer agent is selected from the group consisting of calicheamicin, QFA, BCNU, streptozoicin, vincristine, and 5-fluorouracil. 20. A peptide-antibody conjugate that is taken into colon cancer cells when brought into contact with colon cancer cells. 21. An anticancer agent-antibody conjugate that is incorporated into colon cancer cells when brought into contact with colon cancer cells. 22. Deposited with The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland on November 30, 1994; A hybridoma secreting monoclonal antibodies 100-210, cataloged as HB11764. 23. Monoclonal antibody secreted by hybridoma HB11764. 24. A humanized antibody made using a monoclonal antibody specific to colon cancer cells. 25. Chimeric antibodies made using monoclonal antibodies specific to colon cancer cells. 26. Trimeric antibody made using a monoclonal antibody specific to colon cancer cells. 27. A single chain (sinngle chain) antibody produced using a monoclonal antibody specific to colon cancer cells.