JPH11506321A

JPH11506321A - タペータム特異性を付与する制御要素

Info

Publication number: JPH11506321A
Application number: JP8536010A
Authority: JP
Inventors: ギャリーエイ．ハフマン
Original assignee: パイオニアハイ−ブレッドインターナショナルインク．
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-06-08
Also published as: EP0835310A2; ZA964716B; EP0835310B1; CA2223459A1; HUP9901073A3; AU696222B2; DE69631137D1; HUP9901073A2; WO1996040925A2; AU6174596A; US5837850A; ATE256742T1; WO1996040925A3; AR002116A1

Abstract

(57)【要約】葯のタペータム特異的な遺伝子発現を付与する、94塩基対の制御要素DNAを発見し、単離し、特徴を調べた。さらに、この94塩基対の葯ボックスに突然変異を起こして、タペータム特異的な制御要素を作出した。これらのタペータム特異的な制御要素を用いて、タペータム細胞の機能を破壊する外来遺伝子の発現を調節することができる。同様に、少なくとも１個のタペータム特異的な制御要素と、少なくとも１個の葯特異的な制御要素を用いて、葯の中での花粉の産生を不能にすることができる。このように、雄性不稔植物を作出するために、タペータムに特異的な制御要素を用いて、トウモロコシの花粉産生の調節を行なうことができる。さまざまな方法を用いて、このような雄性不稔植物のF1世代において、雄性稔性を回復することができる。

Description

【発明の詳細な説明】タペータム特異性を付与する制御要素発明の背景１．発明の分野本発明は、タペータム特異性を、遺伝子発現に付与する新規な制御要素に関する。特に、本発明は、トウモロコシのSGB6遺伝子に由来するタペータムに特異的な制御要素と、このような制御要素を、遺伝子導入した雄性不稔植物を作出するために用いることを目的としている。さらに、本発明は、雄性不稔植物の後代における雄性稔性を回復するための方法を目的としている。２．背景交雑作物を作出するときに、花粉稔性を調節することが必須である。交雑トウモロコシの作出において、花粉稔性の調節は、花粉が放出される前に、雄性花序、または雄穂を物理的に摘除することによって行われる。人手による雄穂除去は、高度に労働集約的である。機械的な雄穂除去は、人手による雄穂除去よりも労働集約性は少ないが、信頼性が低く、収穫物の検査と、おそらく、補正的な人手による雄穂除去が必要となる。どちらの方法による雄穂除去も、収量低下をもたらす。雌株における花粉産生を抑制するために、植物体、または土壌に化学組成物を施用することによっても、花粉稔性を調節することができる。例えば、アクマンら（Ackmann et al.）米国特許番号4,801,326を参照。この方法により、処理した雌株を、非処理の植物からの花粉によって他家受精させて、交雑種子を産出する。しかし、化学的な方法は労働集約的であり、また、環境の中に持ち込まれる化学物質の毒性によって、問題が起こる可能性もある。稔性を調節するためのもう一つの方法は、雄性不稔に関する細胞質遺伝子を用いることに基づいている。例えば、パターソン（Patterson）、米国特許番号3,8 61,079参照。しかし、この方法に伴う問題は、ある種の細胞質雄性不稔遺伝子の発現が、病原菌に対する感受性の増加を伴うことである。例えば、cmsT細胞型を広範な使用によって、1970年代の初期に、南部トウモロコシ煤紋病（Southern C orn Leaf Blight）の大流行がもたらされた。さらに別のcms細胞型が利用できるようにはなったが、南部トウモロコシ煤紋病（Southern Corn Leaf Blight）の病原菌、または、その他の未知の病原菌に対して感受性の可能性があるとの懸念から、それらの使用は普及するには至らなかった。このため、自然に存在する雄性不稔遺伝子に依存することのない方法、または、伝統的な人手による方法、機械的な方法、および化学的な方法によらない方法で、花粉の産生を調節するための方法に対する必要性が存在している。発明の概要したがって、葯のタペータム細胞の機能を破壊する発現ベクターを用いて、雄性不稔のトウモロコシを作出するための方法を提供することが、本発明の目的である。さらに、タペータムに特異的な遺伝子発現を付与するDNA制御要素を提供することが、本発明の目的である。（ａ）配列番号１と実質的な配列類似性をもつ塩基配列、（ｂ）（ａ）の機能的な断片、および（ｃ）配列番号１の機能的な断片からなる群より選択される塩基配列を含み、タペータム特異的な制御要素である単離ＤＮＡ分子を提供することにより、本発明の態様の一つに従って、これら、および、その他の目的が達成される。配列番号１と実質的な配列類似性をもつ適当な塩基配列には、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される塩基配列をもつ、変異SGB6葯ボックスが含まれる。本発明は、また、SGB6コアプロモーター［配列番号７］、非翻訳リーダーをもつSGB6コアプロモーター［配列番号８］、非翻訳リーダーをもつG9コアプロモーター［配列番号９］、非翻訳リーダーをもつ5126コアプロモーター［配列番号10 ］、およびCaMV 35Sコアプロモーターからなる群より選択されるプロモーターのような、タペータム特異的制御要素に機能的に連結されたプロモーターを含む発現ベクターに関している。さらに、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結された外来遺伝子を含むことができる。好ましくは、外来遺伝子の産物は、タペータム細胞の機能を破壊する。本発明は、さらに、雄性不稔植物を作出するために、このような発現ベクターを使用する方法で、（1）外来遺伝子が、構造遺伝子、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、および外部ガイド配列遺伝子からなる群より選択される、発現ベクターを植物細胞の中に導入し、（２）この植物細胞から、外来遺伝子を発現する植物を産生する工程を含む方法に関している。適当な構造遺伝子には、ジフテリア毒素、アスペルギルス・オリザエ（Asperg illus oryzae）RNase-T1、バルナーゼ、およびカルラーゼ（callase）からなる群より選択される蛋白質をコードする遺伝子が含まれる。アンチセンス遺伝子の適当な産物は、カルラーゼのアンチセンスRNA、および、カルコンシンターゼＡのアンチセンスRNAからなる群より選択される。適当なリボザイム遺伝子は、カルラーゼの塩基配列を含む。同様に、適当な外来ガイド配列遺伝子は、カルラーゼの塩基配列を含む。本発明は、また、植物細胞がトウモロコシ細胞であるような方法を用いることに関している。さらに、本発明には、上記の発現ベクターをもつ遺伝子導入植物が含まれる。本発明は、さらに、雄性不稔植物を作出する方法で、（ａ）タペータム特異的制御要素、プロモーター、および外来遺伝子を含む発現ベクターにおいて、プロモーターとともにタペータム特異的制御要素が、外来遺伝子の発現を調節し、この外来遺伝子の産物がタペータム細胞の機能を破壊し、それによって、雄性不稔植物を作出する発現ベクターを構築する工程を含む方法に関している。本発明には、また、さらに、（ｂ）この発現ベクターを植物細胞の中に導入する工程を含む方法が含まれる。本発明は、また、雄性不稔交雑植物を作出するために、タペータム特異的制御要素を用いる方法において、（ａ）タペータム特異的制御要素、プロモーター、および第一の外来遺伝子を含む発現ベクターにおいて、タペータム特異的制御要素が、プロモーターとともに、第一の外来遺伝子の発現を調節し、この第一外来造伝子の産物がタペータム細胞の機能を破壊するようになっている発現ベクターを含む、第一の雄性不稔母本植物を作出し、（ｂ）タペータム特異的制御要素、プロモーター、および第二の外来遺伝子を含む発現ベクターにおいて、タペータム組織特異的制御要素が、プロモーターとともに、第二の外来遺伝子の発現を調節するようになっている発現ベクターを含む第二の母本植物を作出し、および、（ｃ）交雑植物を作出するために、第一の母本と第二の母本とを交配する工程を含む方法で、この交雑植物のタペータム細胞が第二の外来遺伝子を発現し、第二の外来遺伝子の産物が、第一の外来遺伝子の産物によって起こるタペータム細胞の機能の破壊を防ぎ、それによって、雄性稔性の交雑植物を作出する方法に関している。第二の外来遺伝子が、バルナーゼインヒビターをコードするときには、適当な第一の外来遺伝子は、バルナーゼをコードする。第二の外来遺伝子の産物が、ジフテリア毒素リボザイムであるときには、第一の外来遺伝子の産物として適当なものは、ジフテリア毒素である。本発明は、さらに、（ａ）（ｉ）配列番号１（ii）配列番号１と実質的に類似した塩基配列、および、（iii）（ｉ）または（ii）の機能的な断片からなる群より選択される塩基配列をもつ、タペータム特異的な制御要素である、少なくとも一つの第一のDNA分子の、少なくとも１コピー、（ｂ）（ｉ）配列番号11 （ii）配列番号12 （iii）配列番号11または配列番号12と実質的に類似した塩基配列、および、（iv）（ｉ）〜（iii）の機能的な断片からなる群より選択される塩基配列をもつ、葯ボックスである、少なくとも一つの第二のDNA分子の、少なくとも１コピー、ならびに、（ｃ）（ｉ）葯特異的な遺伝子に由来するプロモーターを含むか、または（ii）コアプロモーターを含むDNA断片を含み、第一のDNA分子、および第二のDNA分子に機能的に連結されている第三のDNA分子、の組み合わせを含む、キメラで葯特異的な制御カセットを含む。本発明は、配列番号１と実質的に類似した塩基配列をもつ第一のDNA分子の塩基配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される、キメラで葯特異的な制御カセットを含む。本発明は、また、このようなキメラで葯特異的な制御カセットを含む発現ベクターに関している。このような発現ベクターは、SGB6コアプロモーター［配列番号７］、非翻訳リーダーをもつSGB6コアプロモーター［配列番号８］、非翻訳リーダーをもつG9コアプロモーター［配列番号９］、非翻訳リーダーをもつ5126コアプロモーター［配列番号10］、およびCaMV 35Sコアプロモーターからなる群より選択される第三のDNA分子を含むことができる。これらの発現ベクターは、さらに、第三のDNA分子に機能的に連結した外来遺伝子を含むことができる。好ましくは、この外来遺伝子の産物は、葯における花粉の産生を破壊する。本発明は、また、このような発現ベクターを含む遺伝子導入植物を含む。本発明は、また、雄性不稔植物を作出するために、このような発現ベクターを用いる方法で、（1）外来遺伝子が、構造遺伝子、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、および外来のガイド配列遺伝子からなる群より選択される、上記の発現ベクターを植物細胞の中に導入し、ならびに、（２）この植物細胞から、外来遺伝子を発現する植物を産生する工程を含む方法に関している。適当な植物細胞には、トウモロコシ細胞が含まれる。適当な構造遺伝子には、ジフテリア毒素、アスペルギルス・オリザエ（Asperg illus oryzae）RNase-T1、バルナーゼ、およびカルラーゼ（callase）からなる群より選択される蛋白質をコードする遺伝子が含まれる。アンチセンス遺伝子の適当な産物は、カルラーゼのアンチセンスRNA、および、カルコンシンターゼＡのアンチセンスRNAからなる群より選択される。適当なリボザイム遺伝子は、カルラーゼの塩基配列を含む。同様に、適当な外来ガイド配列遺伝子は、カルラーゼの塩基配列を含む。本発明は、また、雄性不稔植物を作出する方法で、（ａ）キメラで葯特異的な制御カセット、および外来遺伝子を含み、このキメラで葯特異的な制御カセットが、外来遺伝子の発現を調節し、また、外来遺伝子の産物が、葯における花粉の産生を不能にする発現ベクターを構築する工程を含む方法に関してしている。葯特異的な制御カセットの適当な第三のDNA分子は、SGB6コアプロモーター［配列番号７］、非翻訳リーダー配列をもつSGB6コアプロモーター［配列番号８］、非翻訳先導配列をもつG9コアプロモーター［配列番号９］、非翻訳先導配列をもつ 5126コアプロモーター［配列番号10］、およびCaMV 35Sコアプロモーターからなる群より選択される。本発明は、また、さらに、（ｂ）発現ベクターを植物細胞の中に導入する工程を含む。図面の簡単な説明図１は、トウモロコシの葯タペータムクローンSGB6の上流域をサブクローニングし、配列決定するために用いられた方法を示している。SGB6のDNA断片を、ブルースクリプト（pBluescript）（商標登録）KS+、またはブルースクリプト（商標登録）SK+（ストラタジーン・クローニングシステムズ；カリフォルニア州ラホヤ）のいずれかにサブクローニングした。図２は、SGB6の5'側デリーションシリーズによる、葯組織における一過的なルシフェラーゼ活性の誘導に関する実験を示している。図３は、SGB6の5'側デリーションシリーズによる、葯組織における一過的なルシフェラーゼ活性の誘導に関する実験を示している。図４は、図３は、SGB6断片の上流をSGB6のコアプロモーターに融合してできる、SGB6の3'側デリーションシリーズによる、葯組織における一過的なルシフェラーゼ活性の誘導に関する実験を示している。図５は、内部的な欠失を含む、SGB6の上流域DNA断片による、葯組織における一過的なルシフェラーゼ活性の誘導に関する実験を示している。図６は、対照用プラスミド、94塩基対のタペータム特異的制御要素（「SGB6葯特異性ボックス」）を含む試験用プラスミド、または、その一部による、葯組織における一過的なルシフェラーゼ活性の誘導に関する実験を示している。対照用プラスミドは、CaMv 35Sプロモーター、タバコモザイクウイルス（TMV）の非翻訳リーダー領域Ω'、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１（ADH1）遺伝子の第一イントロン、および、ルシフェラーゼ遺伝子を含んでいる。全てのプラスミドは、ルシフェラーゼ遺伝子の下流に、ジャガイモのプロテイナーゼII（ PinI I）遺伝子に由来する3'転写産物プロセシング領域を持っていた。図７は、対照用プラスミド、または試験用プラスミドによる、葯、子葉鞘、根、および、トウモロコシの胚芽懸濁液におけるルシフェラーゼ活性の誘導に関する実験を示している。図８は、94塩基対のタペータム組織特異的制御要素（SGB6葯特異性ボックス）、発生の減数分裂期から四分子期にかけて発現される葯特異的な遺伝子のプロモーター（G9プロモーター）、または、SGB6葯特異性ボックスとG9プロモーターとの組合せによる、葯におけるルシフェラーゼ活性の誘導に関する実験を示している。図９は、289塩基対のG9プロモーターの塩基配列［配列番号６］を示している。図10は、SGB6葯特異性ボックスの中に作り出したリンカースキャニング突然変異（配列番号２、24、25、３、４、26、27、28、５、29）の概要を示している。変異体の塩基置換を、図の１行目に示した野生型pPHP5388の塩基配列（配列番号１）と比較した。いずれの変異体においても変更を加えられていない塩基を下線で示した。一番下の行は、野生型の配列を示しているが、大文字の塩基は、遺伝子発現の有意な低下に関係する変異部位を示している。図11は、SGB6葯ボックスのリンカースキャニング突然変異解析の結果を示している。図12は、G9葯ボックス内部に作出したリンカースキャニング突然変異（配列番号13〜23）の概要を示している。変異体の塩基置換を、大文字の連続配列として示した、G9葯ボックスの野生型の塩基配列（配列番号１）と比較した。この図は、また、野生型G9の配列を示しているが、大文字の塩基は、遺伝子発現の有意な低下に関係する変異部位を示している。好ましい態様の詳細な説明１．定義以下の説明において、多くの用語が広範に用いられている。以下の定義は、本発明を理解しやすくするために提示する。構造遺伝子とは、メッセンジャーRNA（mRNA）に転写され、次に、特定のポリペプチドの特徴であるアミノ酸の配列に翻訳されるDNA配列である。プロモーターは、構造遺伝子の転写を行わせる配列である。典型的には、プロモーターは、遺伝子の5'領域で、構造遺伝子の転写開始部位の近傍に位置する。プロモーターが誘導的なプロモーターであれば、誘導因子に応答して、転写速度が上昇する。これに対して、プロモーターが構成的なプロモーターであれば、転写速度は誘導因子によって制御されない。コアプロモーターとは、TATAボックス、および転写開始点など、プロモーター機能にとって本質的な塩基配列を含んでいる。この定義によれば、活性を促進するか、または組織特異的な活性を付与する特異的な配列がないときに、コアプロモーターは、検出可能な活性を持っていても、いなくてもよい。例えば、SGB6コアプロモーターは、SGB6遺伝子の転写開始部位の5'側約38塩基からなり、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sのコアプロモーターは、35Sゲノムの転写開始部位の5'側約33塩基からなる。タペータム特異的制御要素とは、それが結合している遺伝子の転写レベルが、植物のいくつかのまたはすべての他の組織よりも、葯のタペータム組織において高くなるようにさせるDNA配列である。例えば、本明細書に記載のSGB6遺伝子は、タペータム細胞で発現している。SGB6遺伝子のタペータム特異的制御要素は、葯組織の中において、外来遺伝子の発現させるが、根組織、または子葉鞘組織では発現できない。このように、SGB6遺伝子の94塩基対のタペータム特異的制御要素は、「SGB6葯特異性ボックス」または「SGB6葯ボックス」と呼ばれている。オペレーターとは、構造遺伝子の5'側に位置し、リプレッサー蛋白質が認識して結合する塩基配列を含むDNA分子である。リプレッサー蛋白質が、同族のオペレーターに結合すると、構造遺伝子の転写阻害が起きる。例えば、LexA遺伝子は、LexAオペレーターに結合するリプレッサー蛋白質をコードしている。単離DNA分子とは、生物のゲノムDNAに組み込まれていないDNA断片である。例えば、SGB6葯ボックスは、同系交配したトウモロコシのケノムDNAから分離されたDNA断片である。単離DNA分子のもう一つの例は、生物のゲノムDNAに組み込まれていない、化学的に合成されたDNA分子である。エンハンサーとは、転写の開始部位との距離または方向とは関係なく、転写の効率を上昇させることができるDNA制御要素である。相補DNA（cDNA）とは、mRNAの鋳型から、逆転写酵素によって作り出される一本鎖DNA分子である。典型的には、逆転写を開始させるために、mRNAの一部に相補的なプライマーが用いられる。当業者は、また、このような一本鎖DNA、および、その相補DNA鎖からなる二本鎖DNA分子を意味するために、「cDNA」という語も用いる。発現という語は、遺伝子産物の生合成を意味する。例えば、構造遺伝子の場合、発現には、構造遺伝子をmRNAに転写し、mRNAを１個以上のポリペプチドに翻訳することが含まれる。クローニングベクターとは、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどのように、宿主細胞の中で自律的に複製することができるDNA分子である。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの本質的な生物学的機能を失うことなしに決定可能な方法で外来遺伝子を挿入できる、１つまたは少数の制限酵素認識部位と、クローニングベクターによって形質転換された細胞の同定と選抜に用いるのに適当なマーカー遺伝子とを持っている。マーカー遺伝子には、典型的には、テトラサイクリン抵抗性、またはアンピシリン抵抗性を提供する遺伝子が含まれる。発現ベクターとは、宿主細胞の中で発現される遺伝子を含むDNA分子である。典型的には、遺伝子発現は、構成的、または誘導的なプロモーター、組織特異的な制御要素、およびエンハンサーを含む、ある制御要素の調節下に置かれている。外来遺伝子とは、本明細書では、少なくとも一つの異種制御要素に機能的に連結されたDNA配列を意味する。例えば、SGB6構造遺伝子以外の遺伝子の発現が、S GB6遺伝子のタペータム特異的制御要素によって調節されていれば、このような遺伝子は外来遺伝子とみなされる。組換え宿主とは、クローニングベクター、または発現ベクターのいずれかをもつどのような原核細胞または真核細胞であってもよい。この語には、また、宿主細胞の染色体またはゲノムの中にクローニングされた遺伝子が含まれるように遺伝子操作されている原核細胞、または真核細胞も含まれる。遺伝子導入植物とは、発現ベクターを含む、１種以上の植物細胞をもつ植物である。真核生物においては、RNAポリメラーゼIIが、構造遺伝子の転写を触媒して、m RNAを産生する。RNA転写物が特定のmRNAの配列に相補的な配列をもつ、RNAポリメラーゼIIの鋳型を含むように、DNA分子を設計することができる。このRNA転写物は、アンチセンスRNAと名付けられており、アンチセンスRNAをコードするDNA 配列は、アンチセンス遺伝子と名付けられている。アンチセンスRNA分子は、mRN A分子に結合することができ、mRNAの翻訳の阻害をもたらす。リボザイムは、触媒中心をもつRNA分子である。この語は、RNA酵素、自己スプライシングRNA、および自己切断RNAを含む。リボザイムをコードするDNA配列は、リボザイム遺伝子と名付けられている。外部ガイド配列は、内生的なリボザイムであるRNasePを、特定の分子種の細胞内mRNAに向けさせ、RNasePによるmRNAの切断をもたらすRNA分子である。外部ガイド配列をコードするDNA配列は、外部ガイド配列遺伝子と名付けられている。２つの塩基配列が、少なくとも50％の類似性をもっていれば、それらは、実質的な配列類似性をもつとみなされる。配列類似性の決定は、例えば、FASTAプログラム（ジェネティクス・コンピュータ・グループ；ウィスコンシン州マディソン）を用いて行うことができる。または、配列類似性の決定は、エクスペリメンタル・GENIFO(R)BLASTネットワークサービスのBLSTP（基本的部分配列検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool））を用いて行うことができる。アルトシュールら（Altschul et al.）、J．Mol．Biol．215: 403(1990)参照。また、パステルナークら（Pasternaket et al.）「配列類似性検索、複数配列（マルチプルアラインメント）、および分子系統樹作製」、グリックら（Glick et al. ）編、植物分子生物学およびバイオ技術における方法、251から267頁より（CRC プレス、1993）参照。２．タペータム特異的遺伝子からの制御要素の単離組織特異的な方法で、植物の表現形質的な発現に変化を与えるために、遺伝子工学を利用することが、当業界においてよく知られている。花粉産生を調節するための方法の一つは、タペータムにおける遺伝子発現を操作することである。タペータムは葯の中で花粉粒細胞を囲み、還元糖、アミノ酸、および脂質などの養分を発生中の花粉粒に提供する細胞層である。レツニコーバ（Reznickova）、C ． R．Acad．Bulg．Sci．31: 1067(1978); ネイブら（Nave et al.）、J．Plant．P hysiol．125: 451(1986); ソーフニーら（Sawhney et al.）、J．Plant．Physio l．125: 467(1986)。また、タペータム細胞は、花粉粒の放出を促進するβ(1,3) -グルカナーゼ(「カルラーゼ」)を産生する。マファムら(Mepham et al.)、Prot oplasma 70: １(1970)。このように、タペータムと花粉粒細胞との間には微妙な関係があるため、タペータムの機能を破壊すると、花粉粒異常が起きる可能性が高い。実際、タペータムが生成されるときに障害を与えると、雄性不稔変異体がもたらされることが知られている。コール（Kaul）「高等植物における雄性不稔」、理論および応用遺伝学に関するモノグラフ、第10巻、フランクルら（Franke l et al.）編、15〜95頁（スプリンガーフェアラーク社、1988）。したがって、タペータム特異的制御要素による調節の下で、タペータムの機能を破壊できる遺伝子を含む組換えDNA分子を用いて、花粉粒が成熟した花粉になることができないように誘導することができる。葯特異的なプロモーターおよび遺伝子が、当業界において知られている。例えば、マコーミックら（McCormick et al.）、「葯特異的な遺伝子：遺伝子導入植物における分子的特徴とプロモーター解析」、植物の生殖：花芽誘導から授粉まで、ロードら（Lord et al.）編、128〜135頁（1989）；スコットら（scott et al.）、国際出願公報番号WO 92/11379（1992）；ファンデルメールら（Van der Meer et al.）、The Plant Cell 4: 253(1992)。しかし、トウモロコシにおける遺伝子発現に、葯特異性、特にタペータム特異性を付与するDNA配列の認識に関する、一般的に認められた原則または構造的な基準はない。このため、タペータム特異的な遺伝子発現を付与するコンセンサス配列をスクリーニングすることによって、トウモロコシのゲノムライブラリーから直接に、タペータム組織特異的制御要素を単離することはできない。下記で説明されているように、本発明の新規のタペータム特異的制御要素は、 SGB6遺伝子をコードするDNA配列の上流に見出された。タペータム特異的遺伝子をコードするcDNA分子を単離してから、このcDNAをプローブとして用いて、適当なゲノムライブラリーにおける関連遺伝子を同定することによって、制御要素が得られた。Ａ．タペータム特異的遺伝子をコードするcDNA分子の単離タペータム特異的遺伝子を含むcDNAライブラリーを構築する第一段階は、葯組織から全RNA分離することである。好ましくは、葯組織の供給源は、タペータムが花粉粒の放出に決定的な役割を演じる段階を含む、発生のさまざまな段階にあるタペータム組織を含む、２インチから６インチの長さの雄穂である。もっとも好ましくは、葯組織の供給源は、トウモロコシの同系交配B73系統の２インチから６インチの長さの雄穂である。当業者に周知の技術を用いて、雄穂から全RNAを調製することができる。一般的に、RNA単離技術は、植物細胞を破壊するための方法、RNaseに誘発されるRNA 分解を阻害する方法、ならびに、DNA、蛋白質、および多糖類の混入物からRNAを分離する方法を提供しなければならない。例えば、植物組織を液体窒素の中で凍らせ、細胞を破砕するために、凍結組織を乳鉢と乳棒で磨砕し、磨砕した組織から蛋白質を除去するために、フェノール/クロロホルム溶液で抽出し、また、残った不純物から塩化リチウムによる選択的な沈澱によりRNAを分離することによって、全RNAを雄穂から単離することができる。例えば、アウスユーベルら（Aus ubel et al.）編、分子生物学最新プロトコール4.3.1〜4.3.4頁（1990）参照。または、シャーロックら（Sharrock et al.）、Genes and Development 3:1745( 1989)参照。または、磨砕組織から、グアニジン・イソチオシアネートで抽出し、有機溶媒で抽出し、また、分別のための遠心分離を用いて、混合物からRNAを分離することによって、全RNAを雄穂から単離することができる。例えば、ストロマーら（S trommer et al.）「植物mRNAの単離と特徴づけ」、グリックら（Glick et al.）編、植物分子生物学およびバイオ技術における方法、49から65頁（CRCプレス、1 993）参照。 cDNAライブラリーを構築するために、全RNAからポリ(A)＋RNAを分離しなければならない。ポリ(A)＋RNAは、標準的な技術であるオリゴ(dT)-セルロースクロマトグラフィーを用いて、全RNAから分離することができる。例えば、ストロマーら（Strommer et al.）、前記参照。当業者に周知の方法を用いて、ポリ(A)＋RNAから、二本鎖cDNA分子を合成する。例えば、アウスユーベルら（Ausubel et al.）前記、5.5.2〜5.6.8頁を参照。さらに、市販のキットを用いて、二本鎖cDNA分子を合成することができる。例えば、このようなキットは、ギブコ/BRL社(GIBCO/BRL)(メリーランド州ゲティスバーグ)、クローンテックラボラトリー社(Clonetech Laboratories Inc.)（カリフォルニア州パロアルト）、プロメガ社（Promega Corporation）（ウィスコンシン州マディソン）、およびストラタジーン・クローニングシステムズ社（Strata gene Cloning Systems）（カリフォルニア州ラホヤ）から購入することができる。さまざまなクローニングベクターが、雄穂cDNAライブラリーを構築するのに適している。例えば、λgt10ベクターのようなバクテリオファージに由来するベクターの中で、cDNAライブラリーを調製することができる。ヒューンら（Hyunh et al.）「λgt10、およびλgt11における、cDNAライブラリーの構築とスクリーニング」、DNAクローニング：実際的な方法、第１巻、グロバー（Glover）編、49 〜78頁、（IRL Press,1985）より。または、ブルースクリプト（pBluescript）（商標登録）ベクター（ストラタジーン・クローニングシステムズ；カリフォルニア州ラホヤ）などのプラスミドベクター、または、その他の市販されているベクターの中に、二本鎖cDNA分子を挿入することができる。また、適当なクローニングベクターを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（メリーランド州ロックビル）から入手することもできる。クローン化されたcDNA分子を増幅するために、標準的な技術を用いて、cDNAライブラリーを原核生物の宿主に挿入する。例えば、雄穂cDNAライブラリーを、ギブコ/BRL社(GIBCO/BRL)(メリーランド州ゲティスバーグ)から入手することができる、受容能のある大腸菌DH5細胞の中に導入することができる。ディファレンシャル・スクリーニングを用いて、cDNAライブラリーから、葯特異的な遺伝子をコードするcDNAクローンを単離することができる。例えば、雄穂、または幼植物のいずれかから単離したポリ(A)＋RNAを用いて、放射性標識されたヌクレオチドの存在下で、単鎖cDNAを合成することができる。さらに解析するために、雄穂のcDNAプローブとハイブッド形成するが、幼苗のcDNAプローブとはハイブッド形成しないcDNAクローンが分離される。ディファレンシャル・スクリーニング(differential screening)の技術は、当技術分野において周知である。例えば、サージャント（Sargent）「ディファレンシャルに発現される遺伝子の単離」、バーガーら（Berger et al.）編、分子クローニング技術の手引き、423 から432頁（Academic Press，1987）；テダーら（Tedder et al.）Proc．Natl． Acad．Sci．USA 85: 208(1988)。葯特異的なcDNAクローンを豊富にもつ、サブトラクションによる(subtracted) cDNAライブラリーを構築することによって、タペータム特異的なcDNAクローンを得るための基本的な方法を改変することができる。ヘドリックら（Hedrick et a l.）、Nature 308: 149(1984)。例えば、EcoRI末端をもつ二本鎖cDNAを、雄穂RN Aから調製し、幼苗RNAから調製した、50倍の過剰量の小さな平滑末端のcDNA断片と混合することができる。このcDNAの混合液を、二本鎖cDNAが融解するまで加熱し、単鎖cDNAをハイブリダイズさせてから、クローニングベクターのEcoRI部位に二本鎖cDNA分子を挿入する。これらの条件では、各末端にEcoRI部位をもつ二本鎖断片を再生する可能性が高い雄穂cDNA分子は、相補的なDNA断片が幼苗cDNA には存在しないcDNAである。アウスユーベルら（Ausubel et al.）前記、5.8.9 〜5.8.15頁。これらのcDNAクローンは、制限酵素解析、ノザン解析、および、インサイチューハイブリダイゼーションなど、さまざまな技術を用いて解析することができる。Ｂ．タペータム特異的遺伝子のゲノムライブラリーからの単離上記した方法を用いて、葯組織では発現されるが、幼苗組織では発現されない cDNAクローンを単離することができる。cDNAクローンをプローブに用いて、ゲノムライブラリーから一致する遺伝子を単離することができる。植物のケノムDNAライブラリーを、当技術分野において周知の方法によって調製することができる。例えば、スライトムら（Slightom et al.）「λクローンバンクの構築」、グリックら（Glick et al.）編、植物分子生物学およびバイオ技術における方法、121〜146頁より（CRCプレス、1993）参照。好ましい植物ゲノムDNAの生物源は、トウモロコシのDNAである。例えば、界面活性剤のサルコシルで植物組織を破砕し、破砕物をプロテアーゼＫで分解し、遠心分離によって、破砕液から不溶性の残渣を取り除き、イソプロパノールを用いて、この破砕液から核酸を沈澱させ、再懸濁したDNAを塩化セシウム密度勾配で精製することによって、トウモロコシの組織からゲノムDNAを単離することができる。アウスユーベルら（Ausubel et al.）前記、2.3.1〜2.3.3頁。ゲノムDNAをランダムに切断するか、ゲノムDNAを制限酵素で部分消化することによって、ゲノムライブラリーを作製するのに適したDNA断片を得ることができる。例えば、アウスユーベルら（Ausubel et al.）前記、5.3.2〜5.4.4頁、および、スライトムら（Slightom et al.）前記を参照。適当な末端を提供するための制限酵素消化の利用、DNA分子の望ましくない結合を防ぐためのアルカリホスファターゼ処理の利用、および、適当なリガーゼによるライゲーションなどの従来からの技術に従って、バクテリオファージ、またはコスミドベクターのようなベクターの中に、ゲノムDNA断片を挿入することができる。このような操作のための技術が、スライトムら（Slightom et al.）前記によって、開示されており、当業においても周知である。また、アウスユーベルら（Ausubel et al.）前記、3.0.5〜3.17.5頁参照。または、トウモロコシのゲノムライブラリーは、市販されているものを購入してもよい。好ましくは、そのようなライブラリーは、トウモロコシの同系交配系統W22から単離したゲノムDNAをSau3Aで部分消化したものに由来するEMBL3ゲノムライブラリーである（クローンテックラボラトリー社(Clonetech Laboratories Inc.)（カリフォルニア州パロアルト））。ゲノムクローンを含むライブラリーを、標準的な技術を用いて、１個以上の葯特異的なcDNAクローンでスクリーニングする。例えば、アウスユーベルら（Ausu bel et al.）前記、6.0.3〜6.6.2頁；スライトムら（Slightom et al.）前記；レイリーら（Raleigh et al.）、Genetics 122: 279(1989)参照。Ｃ．タペータム特異的制御要素の同定制限酵素解析、サザン解析、プライマー伸長解析、およびDNA配列解析など、さまざまな技術を用いて、ゲノムクローンを解析することができる。例えば、プライマー伸長解析、または、SIヌクレアーゼプロテクション解析を用いて、クローニングした遺伝子の推定転写開始部位の位置を決めることができる。アウスユーベルら（Ausubel et al．)前記、4.8.1〜4.8.5頁；ウォルムスレイら（Wlmesley et al.）「SIヌクレアーゼプロテクションアッセイによる、外来遺伝子発現の定量および定性的解析」、マレー（Murray）編、分子生物学の方法、第７巻：遺伝子導入と発現のプロトコール、271〜281頁、（Humana Press Inc，1991）。しかし、トウモロコシのタペータム特異的な制御要素のモデルが、未だ作出されていないため、構造解析だけでは、クローニングされた遺伝子に関連するタペータム特異的な制御要素を同定するには至らない。このように、機能解析を用いて、制御要素を同定しなければならない。このような機能解析の一般的な方法には、ゲノムクローンの断片を、レポーター遺伝子をもつ発現ベクターの中にサブクローニングすること、この発現ベクターをさまざまなトウモロコシ組織に導入すること、そして、レポーター遺伝子の一過的発現を検出するために、組織を測定することが含まれる。ゲノムクローンにタペータム特異的な制御要素が存在することは、レポーター遺伝子が葯組織の中で発現するのが観察され、葯組織以外ではレポーター遺伝子が発現しないことにより明らかになる。ゲノムクローンの断片を作製する方法はよく知られている。好ましくは、酵素消化を用いて、ゲノムDNA断片のネスティドデリーション(nested deletion)を作成する。例えば、アウスユーベルら（Ausubel et al.）前記、7.2.1〜7.2.20頁；アンら（An et al.）「転写プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターを単離し、特徴を明らかにするための技術」、グリックら（Glick et al.）編、植物分子生物学およびバイオ技術における方法、155から166頁より（CRCプレス、1993）参照。例えば、制御要素が、転写開始部位の「上流」または5'側に存在する可能性は、上流域を含むDNA断片をサブクローニングし、このDNA断片を5'から3'方向、または、3'から5'方向に消化してネスティドデリーション(nested deletion)を作製し、この小さな断片を一過的発現をさせるために、発現ベクターの中にサブクローニングすることによって調べることができる。この一般的な方法は、下の実施例１に例示されている。適当な発現ベクターの選択は、発現ベクターを宿主細胞の中に導入する方法に依存している。典型的には、発現ベクターは、（１）バクテリア宿主の中で、発現ベクターを増殖させ、選抜するのを可能にするために、バクテリアの複製開始点と抗生物質抵抗性マーカーをコードする原核生物のDN A要素；（２）プロモーターなどの、転写の開始を調節する、真核生物のDNA要素；（３）転写終結/ポリＡ付加配列のような、転写産物のプロセシングを調節するDNA要素；および、（４）転写開始を調節するDNA要素に機能的に連結したレポーター遺伝子を含む。有用なレポーター遺伝子には、β-グルクロニダーゼ、β- ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼなどが含まれる。好ましくは、レポーター遺伝子は、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、またはルシフェラーゼ遺伝子である。植物発現ベクター、およびレポーター遺伝子の総説は、グルーバーら（Gruber et al.）「植物形質転換のためのベクター」、グリックら（Glick et al.）編、植物分子生物学およびバイオ技術における方法、89から119頁（CRCプレス、1993）に記載されている。さらに、GUS発現ベクター、およびGUS遺伝子カセットは、クローンテックラボラトリー社(Clonetech Laboratories Inc.)（カリフォルニア州パロアルト）から購入することができ、ルシフェラーゼ発現ベクター、およびルシフェラーゼ遺伝子カセットは、プロメガ社（Promega Corporation）（ウィスコンシン州マディソン）から購入することができる。試験するゲノム断片をもつ発現ベクターを、クロロプラストの中に導入するか、そのままの組織、または単離した細胞の中に導入することができる。好ましくは、発現ベクターは、そのままの組織に導入する。植物組織の一般的な培養方法は、例えば、ミキら（Miki et al.）「外来D NAを植物に導入する方法」グリックら（Glick et al.）編、植物分子生物学およびバイオ技術における方法、57から88頁（CRCプレス、1993）、または、フィリップスら（Phillips et al.）「細胞/組織培養とインビトロ操作」、スプレイグら（Sprague et al.）編、作物および作物改良、第３版、345〜387頁（米国農業学会社（American Society of Agronomy）他、1988）。植物組織の培養方法は、実施例１および２に例示されている。発現ベクターを植物組織に導入する方法には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を直接感染させるか、植物組織とともに培養する方法がある。ホルシュら（Horsch et al.）、Science 227: 1229(198 5 )。アグロバクテリウムベクターシステム、および、アグロバクテリウムによる遺伝子導入方法に関しては、グルーバーら（Gruber et al.）前記、およびミキら（Miki et al.）前記によって説明されている。好ましくは、粒子打ち込みによる(microprojectile-mediated)輸送、DNA注入、エレクトロポレーションなどの、遺伝子の直接的な導入法を用いて、トウモロコシの組織の中に発現ベクターを導入する。例えば、グルーバーら（Gruber et al.）前記；およびミキら（Miki et al.）前記；クラインら（Klein et al.）、 Biotechnology 10: 268（1992）。より好ましくは、パーティクルガン(biolisti c)装置による、微粒子打ち込みによる(microprojectile-mediated)輸送を用いて、発現ベクターをトウモロコシの組織に導入する。この方法は、下記の実施例１〜３に例示されている。タペータム特異的な態様で遺伝子発現を制御するDNA配列を同定するために、上記の方法が用いられてきた。特に、タペータム特異的制御要素が、SGB6の転写開始部位の上流583〜490番目の塩基で区切られる94塩基対のDNA断片の中にあるのが分かった。94塩基対のSGB6葯ボックスの塩基配列は、以下の通りである。このように、本発明は、配列番号１の塩基配列をもち、タペータム特異的な制御要素の機能をもつDNA分子を含む。配列番号１に示されているヌクレオチドを欠失させたり、付加および/または置換することによって、94塩基対のSGB6葯ボックスの変異配列を作出することができる。例えば、オリゴヌクレオチド特異的な突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた突然変異誘発などによって、このような変異配列を得ることができる。アウスユーベルら（Ausubel et al.）前記、8.0.3〜8.5.9頁。また、一般的には、マクファーソン（McPherson）編、特異的な突然変異誘発：実際的なアプローチ、IRLプレス（1991）。したがって、本発明は、配列番号１に実質的な配列類似性をもち、葯ボックスとしての機能をもつ塩基配列を含むDNA分子も含む。実施例５は、94塩基対のSGB6葯ボックスに比べて、活性が低下したり、上昇した変異配列を同定するために、リンカースキャニング突然変異誘発を用いることを例示している。一定の状況においては、SGB6葯ボックスの能力を低下させるのが好都合な場合もあろう。例えば、外来遺伝子が、植物組織に容易に拡散する、特に毒性の強い分子をコードしているときなどが、この場合に当たるであろう。より典型的には、野生型SGB6葯ボックスよりも強力な変異配列の方が好まれる。このような変異配列の例には、以下の配列が含まれる。下記に説明するように、野生型SGB6葯ボックスの複数のコピーを用いるか、または、さまざまな葯ボックスを組み合わせて用いても、遺伝子発現レベルを上昇させることができる。さらにデリーション解析を行なうことによって、１個以上のタペータム特異的な制御要素の、94塩基対のSGB6葯ボックスの中の位置決定をさらに行なうことができる。SGB6葯ボックスの機能解析は、当業者にとって、日常的な実験であるが、本明細書において提示されたリンカースキャニング突然変異誘発の結果、特に興味ある領域が同定される。実施例５参照。したがって、本発明は、DNA断片がタペータム特異的な制御要素として機能する限り、配列番号１の塩基配列をもつ DNA分子の断片も含む。３．花粉産生を調節するための、タペータム特異的な制御要素の利用Ａ．雄性不稔植物の作出本発明の目的は、タペータム特異的な制御要素を用いて、花粉産生を調節するための方法を提供することである。重要なのは、SGB6葯ボックスが、葯のタペータム細胞において、発生の四分子期から中期までの間、単一核異種遺伝子の発現を誘発できることである。このようなタイミングが実際的に重要なのは、この発生段階で不稔性誘導遺伝子が発現すると、葯の成熟を初期の段階で破壊するため、圃場において、不稔性誘導システムの働きをはっきりと眼で見ることができる。したがって、生産圃場で、発生の十分早い時期に不稔性誘導遺伝子の効果が明らかであるため、不稔性誘導システムの一部、または全部の崩壊によって生じる「稔性逸出体」から、人手または機械によって雄穂除去することができる。雄性不稔を誘導する一般的な方法の一つは、タペータム細胞機能を破壊することができる蛋白質をコードする塩基配列に、葯ボックスが機能的に連結されている発現ベクターを構築することである。タペータム組織の機能を破壊することができる蛋白質には、細胞の機能に必須な巨大分子の合成を阻害する蛋白質、細胞の機能に必須な巨大分子を分解する酵素、植物ホルモンの生合成、または代謝を変更させる蛋白質、および、タペータム細胞の特異的な機能を阻害する蛋白質が含まれる。例えば、蛋白質合成の阻害因子をコードする塩基配列に、SGB6葯ボックスが機能的に連結している発現ベクターを構築することができる。例えば、ジフテリア毒素は、真核生物における蛋白質合成の阻害因子としてよく知られている。ジフテリア毒素遺伝子をコードするDNA分子は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（メリーランド州ロックビル）から、ATCC番号39359または、ATCC番号67011として入手することができる。または、生物学的に重要な巨大分子を分解できる酵素をコードするDNA配列を用いて、タペータム組織の機能を破壊することができる。例えば、マリアーニら（Mariani et al.）、Nature 347: 737(1990)は、アスペルギルス・オリザエ（A spergillus or yzae）RNase-T1、または、「バルナーゼ」と名付けられている、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のRNase をタペータム組織で発現させると、タペータム細胞の破壊を誘導して雄性不稔がもたらされることを明らかにした。クアースら（Quaas et al.）、Eur．J．Bioc hem．173: 617(1988)は、RNase-T1の化学合成を説明しており、また、バルナーゼ遺伝子の塩基配列は、ハートリー（Hartley）、J．Molec．Biol．202: 913(19 88)で開示されている。例えば、相互にプライマーとなる長いオリゴヌクレオチドをもつ遺伝子を合成することによって、RNase-T1、およびバルナーゼ遺伝子を得ることができるかもしれない。例えば、アウスユーベルら（Ausubel et al.）前記、8.2.8〜8.2.13 頁参照。また、ウォスニックら（Wosnick et al.）Gene 60: 115(1987)参照。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる最新の技術によって、長さ1.8 キロベースの大きさの遺伝子を合成できるようになった。アダングら（Adang et al.）、Pl ant Molec．Biol．21: 1131(1993)；バンボットら（Bambot et al.）、PCR Meth od and Applications 2: 266(1993)。別の方法において、オーキシンなどの植物ホルモンの代謝を変更することによって、花粉産生は阻害される。例えば、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agro bacterium rhizogenes）のrolB遺伝子は、インドキシル-β-グルコシダーゼからの遊離インドールの解離を触媒することによって、オーキシン代謝に干渉する酵素をコードしている。エストルッハら（Estruch et al.）EMBO J．11: 3125(199 1)。スペナら（Spenaet al.）、Theor．Appl．Genet．84: 520（1992）は、タバコにおいて、rolB遺伝子を約特異的に発現させると、花粉産生が非常に抑制された、萎縮した葯をもつ植物体ができることを明らかにした。したがって、rolB遺伝子は、花粉産生を調節するのに有用な遺伝子の実例である。スライトムら（Sl ightom et al.）、J．Biol．Chem．261: 108(1985)は、rolB遺伝子の塩基配列を開示している。タペータム細胞の特異的な機能を阻害することによっても、花粉産生の調節を行うことができる。例えば、タペータム細胞は、花粉粒の放出を促すβ(1,3)-グルカナーゼ、またはカルラーゼを産生する。メファムら(Mepham et al.)、Protoplasma 70: １(1970)。タペータム組織の発生過程における、カルラーゼの早期、または後期の出現は、ある種の型の雄性不稔に関連している。ウォームキら（Warmke et al.）、J．Hered．63: 103(1972)。したがって、カルラーゼ遺伝子を用いて、タペータム細胞の機能を破壊することができる。スコットら（Scott et al.）、PCT国際出願公報番号WO 93/02197(1993)は、タペータム組織特異的なカルラーゼの塩基配列を開示している。タペータム組織の機能を破壊する蛋白質を発現させるために、この蛋白質をコードするDNA配列が、タペータム特異的な態様で遺伝子の転写を制御するDNA配列に機能的に連結されている発現ベクターを構築する。一般的に、発現ベクターに必要とされる条件は、一過的な発現システムとの関連で説明されている。しかし、ここで、目的としているのは、より後期の発生時期に、成体となった植物のタペータム組織の中で外来蛋白質が発現されるように、発現ベクターを植物の胚芽組織に導入することである。染色体外での複製を提供する植物ウイルスベクターを用いれば、体細胞分裂の安定性がもたらされる。宿主の染色体の中に発現ベクターの配列を組み込むことによって、体細胞分裂の安定性を得るための他の方法で、好ましい方法が提供される。このような体細胞分裂の安定性は、下の実施例３で例示されているように、微粒子を打ち込むことによる(microprojectile-mediated)、発現ベクターの胚芽組織への輸送によって提供される。葯特異的なプロモーター、または、コアプロモーター機能を提供する、一つ以上のDNA断片、すなわち、TATAボックス、転写開始部位、および、選択的には、非翻訳リーダーと、SGB6葯ボックスを組み合わせることによって、外来遺伝子の転写を調節することができる。コアプロモーター機能を提供する好ましいDNA断片には、SGB6プロモーターと5126プロモーターが含まれる。 SGB6コアプロモーターは、SGB6遺伝子の転写開始部位の上流にある約38塩基からなる。適当なSGB6コアプロモーターは、以下の塩基配列をもっている。 SGB6遺伝子に由来する、別の適当なプロモーターは、以下のコアプロモーターと非翻訳リーダーをもっている。葯特異的なG9遺伝子に由来するコアプロモーターと非翻訳リーダーをもつDNA 断片は、以下の塩基配列を含む。葯特異的な5126遺伝子に由来するコアプロモーターと非翻訳リーダーをもつDN A断片は、以下の塩基配列を含む。上記のように、SGB6、G9、および5126プロモーターは、オリゴヌクレオチドを合成することによって得られる。当業者は、開示されているプロモーターの内部に、さらに別の１個以上のプロモーター配列の位置を決めるために、デリーション解析を行うことができると評価するであろう。葯ボックスと結合した、このようなプロモーターの「機能的断片」を用いて、葯特異的な態様で、外来遺伝子の発現を制御することができる。ウイルスのコアプロモーターと葯ボックスとの組合せが、必要な葯特異的遺伝子発現を提供する限り、ウイルスのコアプロモーターを、葯ボックスと組み合わせて用いることもできる。適当なウイルスのコアプロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）のコアプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（CaMV）のコアプロモーターなどが含まれる。グルーバーら（Gruber et al.）前記。好ましくは、ウイルスのコアプロモーターは、CaMVの35Sコアプロモーター、あるいは、その変異配列である。葯特異的なキメラ制御カセットを作り出すため、２個以上の葯特異的な遺伝子の制御要素を組み合わせることによって、外来遺伝子の発現にに関する、発生における時間枠を広げることができる。例えば、減数分裂期から四分子期にかけて発現される葯特異的な遺伝子であるG9遺伝子のプロモーターに機能的に連結した SGB6葯ボックスによって、外来遺伝子の転写を調節することができる。実施例４は、SGB6葯ボックスとG9プロモーターを組み合わせると、減数分裂から中期単一核期までの外来遺伝子の発現が広がることを明らかにしている。289塩基対のG9 プロモーターの塩基配列［配列番号６］が、図９に示されている。同様に、２つの異種遺伝子の葯ボックスを、葯特異的なプロモーターか、または、TATAボックス、転写開始部位、および、選択的には、非翻訳リーダーなど、コアプロモーター機能を提供する、一つ以上のDNA断片のいずれかとを組み合わせることによって、外来遺伝子の発現に対する発生上の枠を広げることができる。適当な葯ボックスには、SGB6葯ボックス、G9葯ボックス、および5126葯ボックス、または、それらの変異配列が含まれる。 G9葯ボックスは、以下の塩基配列を含む。好ましい別の葯ボックスは、トウモロコシ同系交配系統B73の5126遺伝子に由来している。5126制御要素は、四分子期から単一核花粉粒期前期の葯で、外来遺伝子の発現を刺激する。5126葯ボックスは、以下の塩基配列を含む。適当な葯ボックスは、また、SGB6、G9、および5126葯ボックスの機能的な断片を含む。このような機能的断片を得るための方法は、既に説明されている。例示されているように、G9葯ボックスのリンカースキャニング突然変異誘発を用いて、葯特異的な遺伝子発現を付与する領域を同定することができる。実施例５を参照。形質転換された細胞を選抜するために、発現ベクターは、除草剤耐性遺伝子などの、選抜用マーカー遺伝子を持っている。例えば、このような遺伝子は、ホスフィノスリシン（phosphinothricine）、グリホセート（glyphosate）、スルホニル尿素（sulfonyiureas）、アトラジン（atrazine）、またはイミダゾリノン（imidazolinone）に対する抵抗性を付与するかもしれない。好ましくは、選抜用マーカー遺伝子は、bar遺伝子、または、ホスフィノスリシン（phosphinothricine ）・アセチルトランスフェラーゼをコードするpat遺伝子である。bar遺伝子の塩基配列は、リーマンズら（Leemans et al.）、欧州特許出願番号0-242-246（198 7）、および、ホワイトら（White et al.）Nucleic Acids Res．18: 1062(1990) の中に見出される。ウォールベンら（Wohlleben et al.）、Gene 70: 25(1988) は、pat遺伝子の塩基配列を開示している。bar遺伝子またはpat遺伝子の発現により、グルフォシネート（glufosinate）（とりわけ、バスタ（Basta）商標登録、およびイグナイト（Ignite）商標登録として販売されている）、および、ビアラフォス（bialaphos）（ハービエース（Herbi-ace）商標登録、およびリバティー（Liberty）商標登録として販売されている）などの除草剤に対する抵抗性が付与される。発現ベクターは、葯特異的な制御要素の調節の下に、外来蛋白質をコードする cDNA配列をもち、また、構成的なプロモーターの調節下に、選抜用マーカー遺伝子をもつことができるが、選抜用マーカー遺伝子は、別の選抜用発現ベクターから宿主細胞に持ち込まれるのが好ましい。タペータム特異的な制御要素をもつ試験用発現ベクターと、選抜用発現ベクターによる、胚芽組織の、このように「共形質転換」を、下の実施例３で例示している。別の方法において、葯特異的な制御要素が、アンチセンスRNAをコードする塩基配列に機能的に連結している発現ベクターを使用して、雄性不稔を誘導することができる。アンチセンスRNAの標的mRNAへの結合によって、ハイブリッド形成による翻訳停止が起こる。パターソンら（Paterson et al.）Proc．Natl．Acad ．Sci．USA、74: 4370（1987）。したがって、適当なアンチセンスRNA分子は、タペータム細胞の機能に必要な蛋白質をコードするmRNA種の配列に相補的な配列を持っていることになる。例えば、カルラーゼのアンチセンスRNAが産生されると、花粉粒の放出に必須のカルラーゼ酵素の産生が阻害されるようである。さらに、カルコンシンターゼＡ遺伝子の3'非翻訳領域に相当するアンチセンスRNAを産生する発現ベクターを用いて、フラボノイドの生合成を阻害することによって、雄性不稔を誘導することができる。ファンデルメールら（Van der Meer et al .）、The Plant Cell 4: 253(1992)。カルコンシンターゼＡ遺伝子のクローニングと特徴は、コエスら（Koes et al.）、Gene 81: 245(1989)、および、コエスら（Koes et al.）、Plant Molec．Biol．12: 213(1989)によって開示されている。または、葯特異的な制御要素が、リボザイムをコードする塩基配列に機能的に連結された発現ベクターを構築することができる。mRNA分子の一定の標的配列に対してエンドヌクレアーゼ活性が発現されるように、リボザイムを設計することができる。例えば、シュタイネックら（Steinecke et al.）、EMBO J．11: 1525 (1992)、は、タバコのプロトプラストの中で、リボザイムによって、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を100％阻害した。より新しくは、ペリマンら（Perriman et al.）は、Antisense Research and Development 3: 253(1993) で、改良したハンマーヘッド型リボザイムを発現するベクターを用いて、タバコのプロトプラストの中で、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性を阻害した。本発明との関連において、リボザイムに対する適当な標的RNA分子には、カルラーゼmRNAのように、タペータム組織の機能に必須の蛋白質をコードするmRNA種が含まれる。さらに別の方法において、葯特異的な制御要素が、RNase Pが媒介する標的mRN A分子の切断を促すことができるRNA転写産物の産生を誘発する発現ベクターを構築することができる。この方法によれば、内生的なリボザイム、RNasePが、細胞内mRNAの特定の分子種を目的とし、その後、そのmRNAを細胞内リボザイムによって切断するように、外部ガイド配列を構築することができる。アルトマンら（Al tman et al.）、米国特許番号5,168,053。ユアンら（Yuan et al.）Science，26 3: 1269(1994)。好ましくは、外部ガイド配列は、タペータム組織の機能に必須の蛋白質をコードするmRNA種に相補的な塩基配列を10個から15個含み、Nが好ましくはプリン基であるときに、3'-NCCAという塩基配列を含む。mRNAと、それに相補的な外部ガイド配列との間で塩基対を形成することによって、外部ガイド配列の転写産物は、標的となるmRNA種に結合し、それによって、塩基対を形成した領域の5'側のヌクレオチドにおけるRNase PによるmRNAの切断を促進する。Ｂ．F1雑種における雄性稔性の回復上述した方法を用いて、同系系統間での大規模な方向づけられた交配において、F1雑種を産生するために、遺伝子導入雄性不稔トウモロコシを作出することができる。遺伝子導入雄性不稔植物のすべての卵細胞が、タペータム組織の機能を破壊するような外来遺伝子を持っていなければ、F1雑種の一部は、雄性稔性の表現型を示す。他方、遺伝子導入雄性不稔植物のすべての卵細胞に外来遺伝子が存在しているとしたら、外来遺伝子によって誘導される不稔性の方が優性であるために、F1雑種は雄性不稔形質を示す。このため、雄性稔性のあるF1雑種を産生するためには、雄性稔性回復システムを用いることが望ましい。このような雄性稔性回復システムは、収穫物が種子であるときには、特に価値がある。雄性稔性回復のための方法の一つは、遺伝子導入雄性不稔植物を、葯特異的な制御要素の調節の下に稔性回復遺伝子をもつ遺伝子導入雄性稔性植物と交配することである。例えば、マリアーニら（Mariani et al.）は、Nature 357: 384-38 7(1992)で、「バルスター(barstar)」と名付けたバルナーゼ阻害因子を発現する雄性稔性植物を、バルナーゼを発現する雄性不稔植物と交配した。ハートリー（ Hartley）は、J．Molec．Biol.202: 913（1988）で、バルスターの塩基配列を開示している。または、雄性不稔植物の中でジフテリア毒素の効果を中和するために、ジフテリア毒素リボザイムを雄性不稔植物の中で発現させることによって、雄性稔性回復を行わせることができる。つまり、雄性不稔の遺伝子導入植物で発現される特定の外来遺伝子の効果を打ち消す、特定の種類のRNA分子、またはポリペプチドを合成する雄性稔性遺伝子導入植物を作出することによって、F1雑種の中で雄性稔性を回復させることができる。雄性稔性を回復させるための別の方法において、遺伝子導入雄性不稔植物は、次の要素を含む発現ベクターを持っている。すなわち、葯特異的な制御要素、原核生物の制御要素、および、タペータム組織の機能を破壊できる外来遺伝子。葯特異的な制御要素の調節下、原核生物のペプチドを発現する遺伝子導入雄性稔性植物を作出する。F1雑種において、この原核生物のペプチドは、原核生物の制御配列に結合しで、タペータム組織の機能を破壊することができる外来遺伝子の発現を抑制する。稔性を回復させる、この方法の利点は、一つの型の遺伝子導入雄性不稔植物を用いて、遺伝子導入雄性不稔植物でタペータム組織の機能を破壊するために用いられた外来遺伝子の同一性とは無関係に、F1稔性を提供できることである。例えば、LexA遺伝子/LexAオペレーター・システムを用いて、本発明による遺伝子発現を制御することができる。米国特許番号4,833,080（「'080号特許」）、および、ワンら（Wang et al.）、Mol．Cell Biol．13: 1805(1993)を参照。より具体的には、雄性不稔植物の発現ベクターが、LexAオペレーター配列をもち、雄性稔性植物の発現ベクターが、LexAリプレッサーのコーディング配列をもつようにする。F1雑種では、LexAリプレッサーが、LexAオペレーター配列に結合して、破壊できる産物をコードする外来遺伝子の転写を阻害する [236:125(1992) ]。LexAリプレッサーをコードするDNA分子を合成して、LexA遺伝子を得ることができよう。遺伝子合成技術については、既に検討されており、LexA遺伝子の配列は、例えば、ガルリガら（Garriga et al.)、前記、によって説明されている。または、LexAリプレッサーをコードしているDNA分子は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）寄託番号6775 8のプラスミドpRB500から得ることができる。当業者は、lacリプレッサー/lacオペロンシステム、またはtrpリプレッサー/trpオペロンシステムのような、原核生物の制御システムを用いて、別の雄性稔性回復法を容易に考案することができよう。本発明は、このように概説したので、下記の実施例を参照すれば、より容易に理解されよう。下記の実施例は、例示のために提供されるものであって、本発明を制限しようとするものではない。実施例１デリーション解析によるタペータム組織特異的な制御要素の同定スティーブン・ゴフ（Stephen Goff）博士（米国農務省；カリフォルニア州アルバニー）が、SGB6と名付けられた遺伝子をもつゲノムクローンを提供してくれた。SGB6ゲノムクローンは、放射性標識されたSGB6 cDNAをプローブとして用いて、EMBL3（クローンテックラボラトリー社(Clonetech Laboratories Inc.)（カリフォルニア州パロアルト））に入れたトウモロコシW22のゲノムライブラリーから単離されている。SGB6遺伝子は、トウモロコシの葯のタペータム組織層で発現しているため、SGB6遺伝子の上流にタペータム組織特異的な制御要素が存在するか否かを決定するために実験を行なった。 SGB6の上流域の塩基配列を決定するために、上流域を含む1339塩基対のApaL1/ SmaIのDNA断片を、ブルースクリプト（pBluescript）（商標登録）KS+（ストラタジーン・クローニングシステムズ；カリフォルニア州ラホヤ）ベクターに挿入した。図１のサブクローン「DP1425」を参照。周知の技術と、ストラタジーン・クローニングシステムズ社から購入したキットを用いて、ApaL1/SmaI断片のネスティド・デリーション(nested deletion)クローンを作製した。要約すると、プラスミドDNAをBamHI、またはEcoRIで制限酵素消化して、エクソヌクレアーゼIII 消化のための開始点として、5'側単鎖DNA分節を作出した。また、プラスミドDNA を、SacIまたはKpnIのどちらかで制限酵素消化して、エクソヌクレアーゼIIIによる消化から、ベクターDNAを保護するために、3'側単鎖DNA断片を作出した。エクソヌクレアーゼIIIで消化した後、マングビーンヌクレアーゼでDNAを分解して、平滑末端を作出した。ネスティド・デリーション(nested deletion)をもつサブクローンを、サンガーら（Sanger et al.）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74 :5463（1977）のジディオキシチェーンターミネーション法によって、ABIシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社；カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて配列決定した。デリーション解析によって、SGB6遺伝子のタペータム特異的な制御要素と推定される要素の機能の特徴を明らかにした。周知の技術によって、エクソヌクレアーゼIIIとマングビーンヌクレアーゼによる消化を用いて、デリーションプラスミドを構築した。例えば、アウスユーベルら（Ausubel et al.）前記を参照。図２は、この方法によって得られたデリーションプラスミドを示したものである。デリーションプラスミドは、また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて合成した推定制御領域の断片をクローニングしても得られた。図３は、ヌクレオチド-633から-33まで、末端が50塩基ずつ増加している5'側デリーションのシリーズを示している。図４は、ヌクレオチド-589から-139まで、末端が50塩基ずつ増加している3'側デリーションのシリーズを示している。レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ（LU）を用いて、一過的発現アッセイ法によりデリーションプラスミドの機能を調べた。これらの実験のため、さまざまな発生段階にある、トウモロコシ（Z．mays）W22 r-g スタットラー（Stadler ）の雄穂から、トウモロコシの葯を分離した。発育段階を決定するために、各小花から葯を一つずつとって、ファーマー液（Farmer's Solution）（3:1；v/v；エタノール/氷酢酸）で固定した。バーリンら（Berlyn et al.）植物学のミクロ技術と細胞化学、32頁（アイオワ州立大学出版会 1976）。パレディーら（Pare ddy et al.）、Crop Sci．J．29: 1564(1989)で説明されているように、各小花から２つの葯を採って、0.5％のゲルライト寒天（GelRite agar）（スコットラボラトリー社（ Scott Laboratories，Inc.））で固まらせた雄穂成熟培地に載せた。 DNAでコートした1.8μのタングステン粒子で、組織へのパーティクルガンを打ち込んで、葯組織にプラスミドDNAを導入した。要約すると、10μl中10μgのDNA に、50μlの2.5 M塩化カルシウムと、20μlの0.1 Mのスペルミジンを加えて、硝酸で洗った約750μg（50μl）のタングステン粒子の上に沈澱させた。混合物を超音波破砕して、粒子を遠心分離によって沈澱させ、エタノールで洗浄してから、超音波によって、60μlのエタノールに再懸濁した。1000 PSIの破裂板を用いて、PDS-1000ヘリウムパーティクルガンによって打ち込むために、10μlの等量液をマクロキャリアーディスクの上で乾燥させた。粒子を打ち込んだ後、16〜24 時間、暗黒下、27℃で葯組織をインキュベートした。標準的な技術を用いて、ルシフェラーゼ活性があるかどうか、葯組織の蛋白質抽出物を調べた。例えば、デウェットら（De Wet et al.）、Mol．Cell Biol．7 ：725（1987）を参照。要約すると、氷上、100μlの磨砕バッファー（50 mM KPO₄ 、10 mM EDTA、および2 mM ジチオスレイトール；pH 7.8）の中で磨砕して、可溶性蛋白質を葯組織から抽出した。冷却微量遠心機で、混合液を５分間、全速力で遠心して、不溶性残渣を除去した。典型的には、植物抽出物の等量液20μlを、200μlのアッセイ用バッファー（25 mM トリシン、15 mM MgCl₂、25 mM ATP、および500μg/mlのウシ血清アルブミン）と100μlの500μMルシフェリン（カリウム塩）に入れてインキュベートした。モノライト2010（Monolight 2010）分析用ルミノメーターで、出力される光を測定した。これらの実験の結果によって、SGB6上流域を含むDNA断片は、葯発生における四分子期から中期単一核期までの葯の中での一過的なルシフェラーゼ発現を誘導できることが明らかになった。これに対して、減数分裂前の葯では、ルシフェラーゼ活性は全く、または殆ど検出されなかった。さらに、この結果は、ヌクレオチド-735から-489までのSGB6の転写開始部位上流域を、SGB6コアプロモーター（すなわち、転写開始部位から上流へいった最初の37ヌクレオチド）と組み合わせてもつDNA断片が、葯組織で高いレベルのルシフェラーゼ発現を誘導できることを示していた。図４参照。最後に、図３に示してある結果は、制御要素が、ヌクレオチド-583から-483の中の位置にあることを示している。実施例２ 94塩基対のタペータム組織特異的制御要素の特徴葯組織における高レベルの遺伝子発現に関係する、約100塩基対の上流域を同定するに当たって、上記の、5'および3'デリーションプラスミドを用いて、内部デリーションを含むDNA断片を作製した。図５は、100塩基対領域全てを欠失したか、または、100塩基対領域の一部を欠失した内部欠失をもつDNA断片を示している。プラスミドDP4989およびDP4999で得られた結果を比較すると、およそヌクレオチド-588からヌクレオチド-489まで続いた領域に、制御要素が存在していることが示された。ヌクレオチド-583から-490までを含む、94塩基対のDNA断片を合成し、SGB6コアプロモーターの上流にある94塩基対の断片に連結させてから、この結果できた DNA断片をルシフェラーゼベクターの中に挿入することによって、さらに、SGB6 制御要素の特徴を調べた。図６を参照。94塩基対領域の複数のコピーによって、プロモーターに対して反対方向に置かれた94塩基対領域によって、また、94塩基対領域の一部で、94塩基対領域の中央にある32塩基対または45塩基対の領域によって、さらなるベクターが構築された。対照用プラスミドは、CaMVの35Sプロモーター、タバコモザイクウイルスの非翻訳リーダー領域Ω'、および、ルシフェラーゼ遺伝子を融合させたトウモロコシADH1遺伝子の第１イントロンを含んでいた。全ての構築物は、ジャガイモのプロテイナーゼインヒビターII（PinII）に由来する3'側の転写産物プロセシング領域を持っていた。図６に示されているように、SGB6コアプロモーターに融合した94塩基対の断片を含む構築物は、遺伝子発現を誘導することができる。コアSGB6プロモーターの上流にある94塩基対の断片のコピー数を２倍、４倍にすると、遺伝子発現が増加した。さらに、94塩基対断片を反対方向に挿入しても、遺伝子発現を誘導した。したがって、この結果、94塩基対の断片は、位置および方向とは無関係に、遺伝子発現を誘導することが示されたが、これは、エンハンサーの特徴である。 94塩基対の制御要素をもつプラスミドが、子葉鞘、根、または胚芽組織で、一過的なルシフェラーゼ活性を誘導できるか否かを判定するために実験を行なった。B37の芽生えの表面を20％の漂白剤で滅菌し、滅菌蒸留水で２回洗浄した後、１時間から３時間水に浸漬してから、子葉鞘と根を採った。この芽生えは、暗所で、28℃で48時間発芽させたものである。発芽した胚と胚盤を種子から切り離して、0.5 mg/lのゼアチン（zeatin）と0.3％のゲルライト（GelRite）寒天を含む、ムラシゲとスクーグ（Murashige and Skoog）の培地の上に置いた。上記のように、DNAで被覆したタングステン粒子を組織に打ち込み、胚を暗所で、28℃で1 8〜20時間インキュベートした。上記したように行われるルシフェラーゼアッセイのために組織を磨砕する直前に、発芽した芽生えから子葉鞘と根を切り取った。胚の懸濁液は、MS塩と2.0 mg/lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含む培地で、１週間に２回継代培養しながら、暗黒下、28℃で維持した。ムラシゲら（Murash ige et al.）、Phisiol．Plant 15: 473(1962)。パーティクルガンを打ち込む前に、培養物を磨砕して、0.5 mg/lのゼアチン（zeatin）と0.3％のゲルライト（G elRite）寒天、および0.25 Mマンニトールを含む、ムラシゲとスクーグ（Murash ige and Skoog）の培地に再懸濁した。培養液は、パーティクルガンを打ち込む前に、５時間、または一晩、暗黒下、28℃で振とうしながらインキュベートした。パーティクルガンを打ち込んだ後、AT基本培地、プロリン（700 mg/l）、2,4- ジクロロフェノキシ酢酸（0.75 mg/l）、および0.3％のゲルライト（GelRite）寒天を含む培地に移した。AT基本培地は、以下の成分からなる（グラム数／水10 0リットル）。硝酸カリウム（160）、無水硫酸マグネシウム（12.2）、硫酸アンモニウム（170）、FeSO₄・XH₂O（2.039）、EDTA二ナトリウム（2.78）、ヨウ化カリウム（0.075）、ホウ酸（0.3）、MnSO₄・H₂O（1.0）、ZnSO₄・H₂O（0.125）、Na₂・ MoO₄・2H₂O（0.025）、無水硫酸銅（0.0016）、無水塩化コバルト（0.0014）、無水塩化カルシウム（22.65）、一塩基リン酸カリウム（30.0）、ピリドキシンH Cl（0.05）、チアミンHCl（0.1）、ニコチン酸（ナイアシン；0.05）、およびグリシン（ 0.02）。培養液は、暗所で、28℃で18〜20時間インキュベートした。ルシフェラーゼ遺伝子の上流にCaMVの35Sプロモーターをもつ対照用プラスミドは、葯組織、子葉鞘、根、および胚懸濁液において、強いルシフェラーゼ活性を誘導した。図７を参照。これとは対照的に、SGB6コアプロモーター、またはCa MVの35Sコアプロモーターのどちらかに結合した94塩基対を含む試験用プラスミドは、葯では強いルシフェラーゼ活性を誘導したが、子葉鞘、根、および胚懸濁液においては、ルシフェラーゼ活性を殆ど誘導しないか、全く誘導しなかった。したがって、94塩基対の制御要素は、SGB6プロモーター、または異種のプロモーターの機能を、葯特異的な態様で制御することができる。実施例３タペータム特異的な制御要素によって調節されるレポーター遺伝子のインビボでの発現タペータム特異的な制御配列の調節下に、GUS発現ベクターをもつ遺伝子導入トウモロコシを作出して、SGB6制御領域の機能を調べた。また、このベクターは、GUSレポーター遺伝子の下流に、3'nos転写プロセシング領域をもっていた。GS 2トウモロコシの胚懸濁培養（パイオニアハイブレッドインターナショナル社（P ioneer Hi-Bred International）；アイオワ州デモイン）、または、Hi-IIに由来するカルス組織のどちらかにパーティクルガンで打ち込むことによって、遺伝子導入植物を得た。GS2の培養は、MS塩と2 mg/mlの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を含む培地の中で維持した。カルス組織は、N6塩［チューら（Chu et al.）、Sc i．Sin．18: 659(1975)］、1mg/mlの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、25 mM プロリン、および、0.2％ゲルライト寒天を含む固形培地の上で維持した。パーティクルガンを打ち込む前に、上記の培地に0.25 Mのマンニトールを加えた培地に胚組織を懸濁して４時間置いていから、0.5 mlの培地で湿らせた3 MMの濾紙ディスクの上に移した。典型的には、上述したように、0.1から10μgのDNA を沈澱させた1.8μのタングステン粒子を酸で洗浄したものを用いて、650 PSIで、組織に打ち込んだ。これらの実験において、タングステン粒子は、試験用プラスミドと選抜用プラスミド1:1の混合液で被覆した。試験用プラスミドは、SGB6- GUS構築物を含んでおり、選抜用プラスミドは、CaMVの35Sプロモーターに融合したホスフィノスリシン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでいた。0.2％ゲルライト寒天で固め、3 mg/mlのビアラフォス（Bialaphos）（ホスフィノスリシン）を含む上記の培地を用いて、選抜を行なった。標準的な技術を用いて、GUS活性を測定した。ジェファーソン（Jefferson）、 Plant Mol．Biol．Rep．5: 387（1987）。 GS2に導入された試験用プラスミドpPHP2125は、GUSレポーター遺伝子に融合された、ヌクレオチド-1047からヌクレオチド+100までのSGB6の5'領域を含んでいた。これらの実験の結果、SGB6制御領域が、遺伝子導入植物の葯のタペータム組織層において、GUS遺伝子の発現を誘導できることが示された。これに対して、S GB6制御領域は、遺伝子導入植物の葉、または根ではGUS遺伝子の発現を誘導しなかった。ホスフィノスリシン抵抗性遺伝子発現ベクターのみで形質転換した対照用植物の葯では、GUS遺伝子の発現は観察されなかった。 Hi-II組織に導入された試験用プラスミドpPHP5390は、ヌクレオチド-735からヌクレオチド-489までのSGB6の5'領域、ヌクレオチド−37からヌクレオチド+100 までのSGB6コアプロモーター領域、およびGUSレポーター遺伝子を含んでいた。。実験結果は、SGB6制御領域が、遺伝子導入植物のHi-IIの葯で、GUS遺伝子の発現を誘導できることを示していた。ホスフィノスリシン抵抗性遺伝子選抜用ベクターのみで形質転換した対照用植物の葯では、GUS遺伝子の発現は観察されなかった。実施例４タペータム特異的な遺伝子の発生段階における発現期間を広げるためのG9プロモーターの利用タペータム組織特異的な遺伝子発現の発生上の時間枠を広げるために、「G9」と名付けられた葯特異的な遺伝子で、発生の減数分裂期から四分子期までの間発現される遺伝子からプロモーター配列を得た。上述してある一般的な方法を用いて、G9プロモーター配列を単離した。要約すると、トウモロコシの雌穂の茎のcD NAライブラリーと、最も成熟した葯が減数分裂期にあるトウモロコシの雄穂のcD NAライブラリーとを用いて、サブトラクションのためのハイブリダイゼーション技術によって、G9 cDNAを得た。G9のゲノムクローンを単離するために、G9 cDNA をプローブとして用いた。G9 cDNAクローンに対応するように、ゲノム配列の方向を決定し、G9遺伝子の上流域の配列を決定した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合したG9上流域配列に関する実験から、 G9プロモーターが、葯の発生の減数分裂の間と、四分子期までの間、葯の中で遺伝子発現を誘導することが示された。図８を参照。デリーション解析によって、翻訳開始点から、推定TATAボックスの192ヌクレオチド上流にあたるところにまで広がっていて、G9プロモーターを含む289塩基対の断片を同定した。289塩基対のG9プロモーターの塩基配列が、図９に示されている［配列番号６］。次の要素を配列の中に含む発現ベクターを構築した。すなわち、94塩基対のタペータム特異的制御要素（「SGB6葯特異性ボックス」）、289塩基対のG9プロモーター、および、ルシフェラーゼ遺伝子。発現ベクターを葯組織の中に導入して、一過的なルシフェラーゼ遺伝子の発現を上述のように測定した。図８に示してあるように、タペータム特異的な制御要素とG9プロモーターを組み合わせると、ルシフェラーゼ遺伝子の発現に関する発生における時間枠を広げた。キメラ制御構築物は、減数分裂の間、および、発生の中期単一核期までの間、タペータム特異的な遺伝子発現を提供した。実施例５リンカースキャニング突然変異誘発による、SGB6葯ボックスと G9葯ボックスの解析 SGB6葯ボックスの中にある、さらに別のタペータム特異的な制御要素を同定するために、上述のように、リンカースキャニング突然変異誘発を用いて、94塩基対の要素の変異体を調製した。SGB6葯特異性ボックスの中に作出されたリンカースキャニング突然変異の概要は、図10の中に示されている。変異配列SGB6葯ボックス、SGB6コアプロモーター、ルシフェラーゼレポーター遺伝子、および、ジャガイモのプロテイナーゼインヒビターII（PinII）遺伝子に由来する3'側の転写産物プロセシング領域を含む発現ベクターが調製された。上述のようにして、一過的な発現アッセイ法が行われた。SGB6葯ボックスの各変異配列によって作動される一過的なルシフェラーゼ遺伝子発現のレベルを、野生型SGB6葯ボックスをもつ対照用ベクターによって産生されるルシフェラーゼ活性の量と比較した。図11を参照。これらの実験の結果は、94塩基対のSGB6アンサーボックスの２つの離れた領域が、葯特異的な遺伝子発現に関与していることを示している。これらの領域は、図10に示したように、ボックス2/3、およびボックス6/7/8と名付けられた。同様に、リンカースキャニング突然変異誘発を用いて、さらに別の葯特異的な制御要素を同定するために、G9葯ボックスを解析した。SGB6葯特異性ボックスの中に作出されたリンカースキャニング突然変異の概要は、図12の中に示されている。これらの実験によって、ボックス6/7/8と名付けられたG9葯ボックスの不連続な領域が、葯特異的な遺伝子発現に関与することが示された。上述したところは、特定の好ましい態様について説明したものであるが、本発明が制約を受けるものでないと考えられるべきである。当業者は、開示された態様に対してさまざまな変更を加えることを考えつくであろうが、そのような変更は、以下の請求の範囲によって明らかになる、本発明の範囲内に含まれるよう意図されていると考えられるべきである。本明細書において引用された出版物と特許出願は、本発明が属する技術分野の技術水準を示すものである。各出版物と特許出願を特異的、かつ個別に、全体を参照として本明細書に組み入れられると示されているのと同じ意味で、全ての出版物と特許出願は、参照として本明細書に組み入れられる。

【手続補正書】【提出日】１９９７年１２月１１日【補正内容】請求の範囲１．タペータム特異的な制御因子である単離DNA分子において、該タペータム特異的な制御因子が、（ａ）配列番号：１の塩基配列を有するDNA分子の断片、（ｂ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５からなる群より選択される塩基配列を有するDNA分子、ならびに（ｃ）（ｂ）の断片からなる群より選択される、単離DNA分子。２．タペータム特異的制御因子が、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５からなる群より選択される塩基配列を有する、請求項１記載のDNA分子。３．請求項１記載のタペータム特異的制御因子に機能的に結合されたプロモーターを含む発現ベクター。４．プロモーターが、SGB6コアプロモーター［配列番号：７］、非翻訳リーダーを有するSGB6コアプロモーター［配列番号：８］、非翻訳リーダーを有するG9 コアプロモーター［配列番号：９］、非翻訳リーダーを有する5126コアプロモーター［配列番号：10］、およびCaMV 35Sコアプロモーターからなる群より選択される、請求項３記載の発現ベクター。５．プロモーターに機能的に結合されている外来遺伝子をさらに含む、請求項４記載の発現ベクター。６．外来遺伝子の産物がタペータム細胞の機能を破壊する、請求項５記載の発現ベクター。７．雄性不稔植物を作出するために、請求項６記載の発現ベクターを用いる方法において、（1）外来遺伝子が、構造遺伝子、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、および外部ガイド配列遺伝子からなる群より選択される、該発現ベクターを植物細胞に導入する段階と、（２）該植物細胞から、該外来遺伝子を発現する植物体を作出する段階とを含む、方法。８．構造遺伝子が、ジフテリア毒素、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillu soryzae）RNase-T1、バルナーゼ、およびカルラーゼ（callase）からなる群より選択される蛋白質をコードする、請求項７記載の方法。９．アンチセンス遺伝子の産物がカルラーゼのアンチセンスRNAおよびカルコンシンターゼＡのアンチセンスRNAからなる群より選択される、請求項７記載の方法。１０．リボザイム遺伝子がカルラーゼの塩基配列を含む、請求項７記載の方法。１１．外来ガイド配列遺伝子がカルラーゼの塩基配列を含む、請求項７記載の方法。１２．植物細胞がトウモロコシの細胞である、請求項７記載の方法。１３．請求項３記載の発現ベクターを含む、トランスジェニック植物。１４．（ａ）請求項１記載のタペータム特異的制御因子、プロモーター、および外来遺伝子を含む発現ベクターを構築する段階を含む、雄性不稔植物を作出する方法であって、プロモーターに連結したタペータム特異的制御因子が外来遺伝子の発現を調節し、該外来遺伝子の産物がタペータム細胞の機能を破壊し、それによって雄性不稔植物が作出される、方法。１５．（ｂ）発現ベクターを植物細胞の中に導入する段階をさらに含む、請求項１４記載の方法。１６．（ａ）請求項１記載のタペータム特異的制御因子、プロモーター、および第一の外来遺伝子を含む発現ベクターであって、該プロモーターに連結した該タペータム特異的制御因子が該第一の外来遺伝子の発現を調節し、該第一外来遺伝子の産物がタペータム細胞の機能を破壊する発現ベクターを含む、第一の雄性不稔母本植物を作出する段階、（ｂ）該タペータム特異的制御因子、プロモーター、および第二の外来遺伝子を含む発現ベクターであって、該プロモーターに連結した該タペータム特異的制御因子が該第二の外来遺伝子の発現を調節する発現ベクターを含む、第二の母本植物を作出する段階、ならびに（ｃ）交雑植物を作出するため、該第一の母本を該第二の母本と交雑受精させる段階を含む、雄性不稔交雑植物を作出するために、タペータム特異的制御因子を用いる方法であって、該交雑植物のタペータム細胞が該第二の外来遺伝子を発現し、該第二の外来遺伝子の産物が該第一の外来遺伝子の産物によるタペータム細胞の機能の破壊を防ぎ、それによって雄性稔性の交雑植物が作出される、方法。１７．第一の外来遺伝子がバルナーゼをコードし、第二の外来遺伝子がバルナーゼ阻害剤をコードする、請求項１６記載の方法。１８．第一の外来遺伝子の産物がジフテリア毒素であり、第二の外来遺伝子の産物がジフテリア毒素リボザイムである、請求項１６記載の方法。１９．（ａ）（ｉ）配列番号：１の塩基配列を有するDNA分子、（ii）配列番号：２の塩基配列を有するDNA分子、（iii）配列番号：３の塩基配列を有するDNA分子、（iv）配列番号：４の塩基配列を有するDNA分子、（v）配列番号：５の塩基配列を有するDNA分子、および（vi）（ｉ）〜（v）のいずれか一つに記載のDNA分子の断片からなる群より選択される、タペータム特異的制御因子である少なくとも一つの第一のDNA分子の少なくとも一コピー、ならびに、（ｂ）（ｉ）配列番号：11、（ii）配列番号：12、および（iii）（ｉ）または（ii）の機能的断片からなる群より選択される塩基配列を有し、葯ボックスである少なくとも一つの第二のDNA分子の少なくとも一コピー、ならびに、（ｃ）（ｉ）葯特異的な遺伝子に由来するプロモーターを含むか、または（ii）コアプロモーターを含むDNA断片を含み、第一のDNA分子および第二のDNA分子に機能的に結合されている第三のDNA分子、の組み合わせを含む、葯特異的キメラ制御カセット。２０．第一のDNA分子の塩基配列が、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５からなる群より選択される、請求項１９記載の葯特異的キメラ制御カセット。２１．請求項１９記載の葯特異的キメラ制御カセットを含む、発現ベクター。２２．第三のDNA分子が、SGB6コアプロモーター［配列番号：７］、非翻訳リーダーを有するSGB6コアプロモーター［配列番号：８］、非翻訳リーダーを有するG9コアプロモーター［配列番号：９］、非翻訳リーダーを有する5126コアプロモーター［配列番号：10］、およびCaMV 35Sコアプロモーターからなる群より選択される、請求項２１記載の発現ベクター。２３．第三のDNA分子に機能的に結合している外来遺伝子をさらに含む、請求項２１記載の発現ベクター。２４．外来遺伝子の産物が葯における花粉の産生を破壊する、請求項２１記載の発現ベクター。２５．（1）外来遺伝子が、構造遺伝子、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、および外来ガイド配列遺伝子からなる群より選択される、該発現ベクターを植物細胞に導入する段階と、（２）植物細胞から、該外来遺伝子を発現する植物体を作出する段階とを含む、雄性不稔植物を作出するために、請求項２４記載の発現ベクターを用いる方法。２６．構造遺伝子が、ジフテリア毒素、アスペルギルス・オリザエ（Aspergil lus oryzae）RNase-T1、バルナーゼ、およびカルラーゼ（callase）からなる群より選択される蛋白質をコードする、請求項２５記載の方法。２７．アンチセンス遺伝子の産物が、カルラーゼのアンチセンスRNAおよびカルコンシンターゼＡのアンチセンスRNAからなる群より選択される、請求項２５記載の方法。２８．リボザイム遺伝子がカルラーゼの塩基配列を含む、請求項２５記載の方法。２９．外来ガイド配列遺伝子がカルラーゼの塩基配列を含む、請求項２５記載の方法。３０．植物細胞がトウモロコシ細胞である、請求項２５記載の方法。３１．請求項２１記載の発現ベクターを含むトランスジェニック植物。３２．（ａ）請求項１９記載の葯特異的キメラ制御カセットおよび外来遺伝子を含む発現ベクターを構築する段階、を含む雄性不稔植物を作出する方法であって、該葯特異的キメラ制御カセットが外来遺伝子の発現を調節し、該外来遺伝子の産物が葯における花粉の産生を不能にし、それによって雄性不稔植物が作出される、方法。３３．（ｂ）発現ベクターを植物細胞に導入する段階をさらに含む、請求項３２記載の方法。３４．第三のDNA分子が、SGB6コアプロモーター［配列番号：７］、非翻訳リーダーを有するSGB6コアプロモーター［配列番号：８］、非翻訳リーダーを有するG9コアプロモーター［配列番号：９］、非翻訳リーダーを有する5126コアプロモーター［配列番号：10］、およびCaMV 35Sコアプロモーターからなる群より選択される、請求項３３記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号１と実質的な配列類似性をもつ塩基配列、（ｂ）（ａ）の機能的な断片、および（ｃ）配列番号１の機能的な断片からなる群より選択される塩基配列を含み、タペータム特異的な制御要素である、単離DNA分子。２．タペータム特異的制御要素が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される塩基配列をもつ変異SGB6葯ボックスである、請求項１記載のDNA分子。３．請求項１のタペータム特異的制御要素に機能的に連結されたプロモーターを含む発現ベクター。４．プロモーターが、SGB6コアプロモーター［配列番号７］、非翻訳リーダーをもつSGB6コアプロモーター［配列番号８］、非翻訳リーダーをもつG9コアプロモーター［配列番号９］、非翻訳リーダーをもつ5126コアプロモーター［配列番号10］、およびCaMV 35Sコアプロモーターからなる群より選択される、請求項３記載の発現ベクター。５．プロモーターに機能的に連結されている外来遺伝子をさらに含む、請求項４記載の発現ベクター。６．外来遺伝子の産物がタペータム細胞の機能を破壊する、請求項５記載の発現ベクター。７．雄性不稔植物を作出するために、請求項６記載の発現ベクターを用いる方法において、（1）外来遺伝子が、構造遺伝子、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、および外部ガイド配列遺伝子からなる群より選択される、該発現ベクターを植物細胞に導入する工程、ならびに（２）該植物細胞から、該外来遺伝子を発現する植物を作出する工程を含む方法。８．構造遺伝子が、ジフテリア毒素、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillu soryzae）RNase-T1、バルナーゼ、およびカルラーゼ（callase）からなる群より選択される蛋白質をコードする、請求項７記載の方法。９．アンチセンス遺伝子の産物がカルラーゼのアンチセンスRNAおよびカルコンシンターゼＡのアンチセンスRNAからなる群より選択される、請求項７記載の方法。１０．リボザイム遺伝子がカルラーゼの塩基配列を含む、請求項７記載の方法。１１．外来ガイド配列遺伝子がカルラーゼの塩基配列を含む、請求項７記載の方法。１２．植物細胞がトウモロコシの細胞である、請求項７記載の方法。１３．請求項３記載の発現ベクターを含む、遺伝子導入植物。１４．（ａ）プロモーターに連結したタペータム特異的制御要素が外来遺伝子の発現を調節し、また、該外来遺伝子の産物がタペータム細胞の機能を破壊し、それによって雄性不稔植物を作出する、請求項１記載のタペータム特異的制御要素、プロモーター、および外来遺伝子を含む発現ベクターを構築する工程を含む、雄性不稔植物を作出する方法。１５．さらに、（ｂ）発現ベクターを植物細胞の中に導入する工程を含む、請求項１４記載の方法。１６．雄性不稔交雑植物を作出するために、タペータム特異的制御要素を用いる方法において、（ａ）請求項１記載のタペータム組織特異的制御要素、プロモーター、および第一の外来遺伝子を含む発現ベクターであって、該プロモーターに連結した該タペータム特異的制御要素が該第一の外来遺伝子の発現を調節し、該第一外来遺伝子の産物がタペータム細胞の機能を破壊する発現ベクターを含む、第一の雄性不稔母本植物を作出する工程、（ｂ）該タペータム特異的制御要素、プロモーター、および第二の外来遺伝子を含む発現ベクターであって、該プロモーターに連結した該タペータム特異的制御要素が該第二の外来遺伝子の発現を調節する発現ベクターを含む、第二の母本植物を作出する工程、および、（ｃ）交雑植物を作出するための、該第一の母本と該第二の母本との交配において、該交雑植物のタペータム細胞が該第二の外来遺伝子を発現し、該第二の外来遺伝子の産物が該第一の外来遺伝子の産物によるタペータム細胞の機能の破壊を防ぎ、それによって雄性稔性の交雑植物を作出する工程、を含む方法。１７．第一の外来遺伝子がバルナーゼをコードし、第二の外来遺伝子がバルナーゼインヒビターをコードする、請求項１６記載の方法。１８．第一の外来遺伝子の産物がジフテリア毒素であり、第二の外来遺伝子の産物がジフテリア毒素リボザイムである、請求項１６記載の方法。１９．（ａ）少なくとも一コピーの、少なくとも一つの、（ｉ）配列番号１、（ii）配列番号１と実質的に類似した塩基配列、および（iii）（ｉ）または（ii）の機能的な断片からなる群より選択される塩基配列を有し、タペータム特異的な制御要素である第一のDNA分子、ならびに、（ｂ）少なくとも一コピーの、少なくとも一つ、（ｉ）配列番号11、（ii）配列番号12、（iii）配列番号11または配列番号12と実質的に類似した塩基配列、および（iv）（ｉ）〜（iii）の機能的な断片からなる群より選択される塩基配列を有し、葯ボックスである第二のDNA分子、ならびに、（ｃ）（ｉ）葯特異的な遺伝子に由来するプロモーターを含むか、または（ii）コアプロモーターを含むDNA断片を含み、第一のDNA分子および第二のDNA分子に機能的に連結されている第三のDNA分子、の組み合わせを含む、キメラで葯特異的な制御カセット。２０．配列番号１と実質的な配列類似性をもつ第一のDNA分子の塩基配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選択される、請求項１９記載のキメラで葯特異的な制御カセット。２１．請求項１９記載の、キメラで葯特異的な制御カセットを含む発現ベクター。２２．第三のDNA分子が、SGB6コアプロモーター［配列番号７］、非翻訳リーダーをもつSGB6コアプロモーター［配列番号８］、非翻訳リーダーをもつG9コアプロモーター［配列番号９］、非翻訳リーダーをもつ5126コアプロモーター［配列番号10］、およびCaMV 35Sコアプロモーターからなる群より選択される、請求項２１記載の発現ベクター。２３．さらに、外来遺伝子を含み、該外来遺伝子が第三のDNA分子に機能的に連結している、請求項２１記載の発現ベクター。２４．外来遺伝子の産物が葯における花粉の産生を破壊する、請求項２１記載の発現ベクター。２５．雄性不稔植物を作出するために、請求項２４記載の発現ベクターを用いる方法であって、（1）外来遺伝子が、構造遺伝子、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、および外来ガイド配列遺伝子からなる群より選択される、該発現ベクターを植物細胞に導入する工程、および、（２）植物細胞から、該外来遺伝子を発現する植物を作出する工程、を含む方法。２６．構造遺伝子が、ジフテリア毒素、アスペルギルス・オリザエ（Aspergil lus oryzae）RNase-T1、バルナーゼ、およびカルラーゼ（callase）からなる群より選択される蛋白質をコードする、請求項２５記載の方法。２７．アンチセンス遺伝子の産物が、カルラーゼのアンチセンスRNAおよびカルコンシンターゼＡのアンチセンスRNAからなる群より選択される、請求項２５記載の方法。２８．リボザイム遺伝子がカルラーゼの塩基配列を含む、請求項２５記載の方法。２９．外来ガイド配列遺伝子がカルラーゼの塩基配列を含む、請求項２５記載の方法。３０．植物細胞がトウモロコシ細胞である、請求項２５記載の方法。３１．請求項２１記載の発現ベクターを含む遺伝子導入植物。３２．雄性不稔植物を作出する方法であって、（ａ）請求項１９記載のキメラで葯特異的な制御カセットおよび外来遺伝子を含み、該葯特異的なキメラ制御カセットが外来遺伝子の発現を調節し、また、該外来遺伝子の産物が葯における花粉の産生を不能にし、それによって雄性不稔植物を作出する、発現ベクターを構築する工程を含む方法。３３．（ｂ）発現ベクターを植物細胞に導入する工程をさらに含む、請求項３２記載の方法。３４．第三のDNA分子が、SGB6コアプロモーター［配列番号７］、非翻訳リーダーをもつSGB6コアプロモーター［配列番号８］、非翻訳リーダーをもつG9コアプロモーター［配列番号９］、非翻訳リーダーをもつ5126コアプロモーター［配列番号：10］、およびCaMV 35Sコアプロモーターからなる群より選択される、請求項３３記載の方法。