JPH11505417A

JPH11505417A - Human chemokine beta-8, chemokine beta-1, and macrophage inflammatory protein-4

Info

Publication number: JPH11505417A
Application number: JP8533269A
Authority: JP
Inventors: ローゼン，クレイグ・エイ; ルーベン，スティーブン・エム; リー，ハオドン; アダムズ，マーク・ディ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-05-05
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 1999-05-21
Also published as: AU3134695A; CA2220123A1; JP2003102486A; KR19990008335A; CN1125082C; MX9708537A; WO1996034891A1; CN1515672A; EP0871672A4; EP0871672A1; CN1186501A

Abstract

(57)【要約】ヒトＣｋβ−８、ＭＩＰ−４およびＣｋβ−１およびかかるケモカインポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）およびかかるポリペプチドを組換え技術により製造する方法を開示する。かかるポリペプチドを白血病、腫瘍、慢性感染症、自己免疫疾患、線維症、障害治癒および乾癬の処置のために利用する方法もまた開示する。かかるケモカインポリペプチドに対するアンタゴニスト、および慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、急性の炎症および感染疾患、アレルギー反応、プロスタグランジン依存性の発熱および骨髄不全を処置する治療剤としてのその使用も開示する。該核酸配列における変異に関連する疾患の検出のための診断アッセイおよび該ポリペプチドの変化した濃度を検出するための診断アッセイも開示する。 (57) [Summary] Disclosed are DNA (RNA) encoding human Ckβ-8, MIP-4 and Ckβ-1 and such chemokine polypeptides and methods for producing such polypeptides by recombinant techniques. Also disclosed are methods of utilizing such polypeptides for the treatment of leukemia, tumors, chronic infections, autoimmune diseases, fibrosis, disorder healing and psoriasis. Also disclosed are antagonists to such chemokine polypeptides and their use as therapeutics for treating rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, acute inflammatory and infectious diseases, allergic reactions, prostaglandin-dependent fever and bone marrow failure. Also disclosed are diagnostic assays for detecting diseases associated with mutations in the nucleic acid sequence and for detecting altered concentrations of the polypeptide.

Description

【発明の詳細な説明】ヒトケモカインベータ−８、ケモカインベータ−１、およびマクロファージ炎症性タンパク質−４この申請書は、1995年5月5日米国特許商標局にて保留中の申請書ナンバー08 /446.661のファイルである。この発明は、最近確認されたポリヌクレオヱドとコード化され、ポリヌクレオヱドとポリペプヱドとして利用され、生産されているポリヌクレオヱドやポリペプヱドと関連している。さらに細かく述べると、ポリペプヱドの本発明は、推定上にてヒトのケモカインベータ−8（ｃｋβ−8）と、マクロファージ炎症性タンパク質−4（MIP−4）、そしてケモカインベータ−1（ｃｋβ−1）と同一であることが確認された。この発明はさらに、ポリペプヱドなどの抑制にも関連している。インタクリン細胞質分裂にも適用されているケモカインは、構造的にも機能的にも細胞質分裂の亜科に関連している。これらの分子は、8−10ｋｄサイズである。一般的にケモカインは、20%−75%の相同性アミノ酸レベルにて示され、そして2つのジスルフィル結合から成る4つの保存されたシステイン残基にて特徴づけられる。最初の2つのシステイン残基の配列に基づき、ケモカインはアルファとベータの2つの亜科に分類することができる。アルファ亜科において、最初の2 つのシステインは、1つのアミノ酸によって分離された。従って”C−X−C”亜科と示される。ベータ亜科において、2つのシステインは隣あった位置にあり、従って“C−C”亜科と示される。今までのところ、少なくても8つの異なった亜科のメンバーがヒトの中で確認されている。インタクリン細胞質分裂は、様々な機能がある。品質証明の特徴は、単球、好中球、Tリンパ球、好塩基球、そして線維芽細胞を含む異なった細胞タイプの走化性移動を誘い出す能力にある。多くのケモカインは前炎症性を持ち、炎症反応中の数多くの段階に関わっている。これらの機能は、ヒスタミンリリース、リソノーム酵素とロイコトリエンのリリース、ターゲットの免疫細胞から、内皮細胞の粘着性を増加し、補足タンパク質の結合を高め、か粒球接着分子、そして補体受容体呼吸器官の破裂の発見を誘導する。それに加えて、炎症性との関係は、確かなケモカインが他の活動を示すことで表わされる。例えば、マクロファージ炎症性タンパク質−1（MIP−1）は、造血幹細胞の増殖を抑制することができ、血小板因子−4（PF−4）は、内皮細胞成長の強力な阻害剤である。また、インターロイキン−8（IL−8）は、KERATINOCYTESの増殖を促進し、GROは、メラノーマ細胞の自己分泌成長因子である。異なった生物学的な働きを考慮して、ケモカインが生理学的に、そしてリンパ細胞輸送、傷の癒し、血液学上の規定、及びアレルギー、喘息、関節炎などの免疫学上の障害病状に多く関連しているということは決して驚くことではない。血液学上の種族規定例として、MIP−1がある。MIP−1は、マクロファージから作れた前炎症性細胞質分裂の菌体内毒素誘導として確認されていた。それに続いての研究にて、MIP−1は2つの異なってはいるが関連しているタンパク質MIP−1∂ とMIP− 1βから成り立っていることが示された。MIP−1∂とMIP−1β両方ともマクロファージ単球、そしてTリンパ球のための化学誘引剤である。興味探いことに多数の効力のある幹細胞反応抑制剤（SCI）が、生化学的浄化と、続く配列からの分析によりMIP−1と同一であることが明らかになった。そのうえ、MIP−1βはMIP −1∂の造血幹細胞増殖の抑制能力を中和する。この発見は、生理学上主要な役割を果たすMIP−1が骨髄内の造血抑制をする、そして第二に炎症性機能があるという仮説に達した。MIP−1∂の作用モードは、幹細胞抑制剤のようにG1/S静止期において、細胞分裂周期をブロックする能力に関連している。そのうえ、MIP−1 の抑制効力は、未完成な前駆細胞に限られていて、か粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）の存在において、後前駆体に実際に刺激している。いくつかのグループは、MIP−1∂とMIP−1βの人体相同器官に似せて、クローン化されている。この場合、CDNAｓはT細胞RNAに反して、準備されているライブラリーから孤立している。 MIP−1タンパク質は、初期の傷ついた炎症細胞を見つけることができ、傷ついた線維芽細胞からIL−1とIL−6の生産を引起することが示されている。加えて、浄化した自然のMIP−1（MIP−1、MIP−1α、MIP−1β、ポリペプチドを含む）は、ねずみの足部の皮下や、うさぎの脳脊髄液体の腔内に注射した時、激しい炎症を起こす。（Wolpe and Cerami,1989FASKB J 3:2565-73）。それに加えて、これらのMIP−1の前炎症性の特性は多分直接か間接であり、MIP−1は、無菌房で実験用のねずみをモデルに使い、初期の炎症性の傷を治す間回復した。（Fahey,et al.,1990,Cytokine,2:92）。例えば、Chironコーポレーションにより申請された WO92/05198では、哺乳類のマクロファージ炎症性タンパク質（MIPｓ）をイースト菌内で生産するの効性のDNA分子が発表された。ねずみのMIP−1αとMIP−1β は異なっているが、細胞分裂にとても関連している。部分的に浄化した2つのタンパク質の根号物は、好中球機能に作用し、局部炎症と発熱を起こす。MIP−1α は、イースト菌細胞内で作られ均一的に浄化された。構造的分析は、相同性連鎖をわずかに分けるPF−4とIL−8の構造に第二次、第三次的にとても類似していることが確認された。そして、MIP−1αは、試験管内でチミジンに殺されるねずみの幹細胞を守るために生体内で活動する。MIP−1αはさらに、か粒球マクロファージコロニー刺激因子が確認できる。前駆細胞か粒球マクロファージコロニー形成細胞の増殖をより高める働きをしていることが示された（Clemens,J.M.,etal. ,Cytokine,4:76-821992）。基の特許申請書にてMIP−1と示されている本発明のポリペプチド、CKβ−1 は、アミノ配列相同性を基にしたβケモカイン族の新しいメンバーでる。本発明の一様相と一致して、生物学的に有効で、病気の判断的、又治療学に有効なことでそれについて相似引用された、ヒトCKβ−8、ヒトMIP−4、ヒトCK β−1などの発達した新種のポリペプチドが示された。本発明の他の様相と一致して、ポリペプチドと記号化され生物学的に有効で、病気の判断的、治療学的に有効なことでそれについて相似引用された、ｍRNA ｓ、DNAｓ、ｃDNAｓ、ゲノムDNAを含む核酸分子を分離することが示された。本発明のさらなる様相に一致して、培養、再結合核生物からなる再結合テクニックによる、そして、又は、真核生物、ホスト細胞、核酸配列を含むSAIDタンパク質の生産増進のポリペプチドの生産過程を示している。本発明のさらなる様相に一致して、ポリペプチドと記号化され、治療目的で使用されるポリヌクレオチドが示された。治療目的とは、例えば、ルケミック細胞を取り除くため化学治療の間化学治療薬剤から骨髄幹細胞を守り、感応の低下を刺激し、造血とリンパ球の輸送を規制し、乾せん固形腫瘍を治療し、慢性で激しい伝染病への抵抗力を促進し、傷の回復を刺激する。本発明のさらなる様相に一致して、ポリペプチドに対しての抗体を示している。本発明の他の様相に一致して、ポリペプチドの抑制行動に使用されるだろうポリペプチドの対立物を示している。抑制行動は、抑制剤IL−1とTNF−αの生産、再生不良性貧血、脊髄形成異常症候群、喘息、関節炎の治療などである。本発明の他の様相に一致して、CKβ−8、CKβ−1、MIP−4核酸配列の雑種を作るために十分な核酸分子からなる核酸を示した。本発明の他の様相に一致して、ポリペプチドと記号化された、核酸配列の変化を見つけるためや、ポリペプチドの表現不足や過剰表現に関連した病気発見や診断に役立つ試験を示した。本発明の他の様相と一致して、化学的研究に関連した生体外目的のための試薬の研究、治療法の発達のため、病気治療の診断法のため、DNAの合成と生産のためのポリペプチドと記号化されている、ポリペプチドとポリヌクレオチドを使うプロセスを示した。本発明のこれらの又他の様相は、これらの事実の学習により、それぞれの機能は示される。図1は、CKβ−8と記号化されたｃDNA配列と、アミノ酸配列の一致の推定を示している。イニシャル21アミノ酸は、推定上の代表配列として表わされる。すべてのシグナル連鎖は、バキュロウイルスエキスプレスタンパク質のN−ターミナルペプチド配列により決定された。図2は、CKβ−1と記号化されたｃDNA配列とアミノ酸配列の一致の推定を示している。イニシャル19アミノ酸は代表配列として表わされる。図3は、MIP−4と記号化されたｃDNA配列とアミノ酸配列の一致の推定を示している。イニシャル20アミノ酸は代表配列として表わされる。図4CKβ−8（上段）と人体MIP−1α（下段）のアミノ酸相同性を表わし、ケモカインの4つのシステインの特徴が示されている。図5は、2つのアミノ酸配列の中で上段配列は人体MIP−4アミノ酸配列、下段配列は人体MIP−1αであると示している。（人体扁桃腺リンパ球、LD78ベータタンパク質）図6は、CKβ−1（上段）と人体MIP−1α（下段）間のアミノ酸配列の整列を表わしている。図7は、COS細胞のHA−taggedCKβ−1を示した後、電気泳動されたCKβ−1ゲルが写されている。図8は、バキュロウイルス発現システムで発現、浄化された後のCKβ−1のSD C−PAGEゲルが写されている。図9は、バキュロウイルス発現システムで発現され、3段階で浄化された後の CKβ−8のSDC−PAGEゲルが写されている。図10は、CKβ−8のキモアクトトラクタント行動が、46−WELLマイクロチェンバー装置（Neuro Probe INC.）を使った走化作用の実験により確認された。実験の手順は製品手引きにて説明されている。それぞれのCKβ−8の濃縮は5つの高パワー分野の移動にて実験された。結果は2つの独立した実験から獲得した平均的結果が示されている。THP−（A）細胞とヒトPBMCｓ（B）のキモアクトトラクタント行動が示されている。図11は、CKβ−8が細胞内カルシウムの濃縮の変化に応えていることが日立F −2000蛍光性の分光測光器を使い確認された。バクテリアエキスプレスCKβ−8 は50ｎMの最終濃縮のTHO−1細胞に詰めたIndo−1に加えられ、細胞内カルシウム濃縮レベルは測定された。図12単球細胞ラインTHP−1は16時間LPS（0.1−10ng/ml）か、CKβ−8（to50 ng/ml）で処理された。上清の組織培養は、TNF−αの分泌量を高めるためのELIS A分析の議題となった。図13洗浄し浄化されたヒト末梢血液単球は、CKβ−8の数を増やすととまに、16時間処理された。（バキュロウイルスにより生産された）上清の組織培養は、TNF−α、IL−6、GM−CSFそして、か粒球コロニー刺激因子（G−CSE）の分泌量はELISA分析の議題となった。図14ねずみの骨髄細胞の低密集ポピュレーション（1500細胞/dish）は、寒天培養基にケモカイン（100ng/ml）有り又は無で、しかし、IL−3（5ng/ml）、S CF（100ng/ml）、IL-1α（10ng/ml）、M-CSF（5ng/ml）とともに観察された。データは2つの独立した実験（それぞれ2回試行）から平均的結果が示された。コロニーは培養後14日で確認された。ケモカインの存在で発生した数々のコロニーは、加えたケモカインの欠如で低い割合が示された。図15は、HPP−CFC（A）とLPP−CFC（B）によってねずみの骨髄コロニー発達に影響があるCKβ−8とCKβ−1を示している。図16は、バキュロウイルスエキスプレスCKβ−1とM−CFSのCKβ−8と新に分離した骨髄細胞のSCF刺激コロニー組織の影響を示している。図17は、CKβ−8とIL−3のCKβ−1とSCF刺激増殖と骨髄細胞のリンポピュレーション識別の影響を示している。図18GR−1そして骨髄細胞のリンポピュレーションからの明白な細胞ポピュレーションのMac−1（surfacemarkers）の発生にてCKβ−8とCKβ−1の影響と、リン細胞がIL−3（5ng/ml）、SCF（100ng/ml）、単独（a）、CKβ−8（50ng/ml ）（b）かCKβ−1（50ng/ml）を追加し成長培養基で繁殖したことが示されている。細胞は、そらから骨髄の分化GP−1、Mac-1、Sca-1、そしてサーフェスアンチゲンCD45Rに反して、単クローン抗体とともに着色されFACSCanにより分析された。データは、大（A）小（B）両方の細胞ポピュレーションでの有効な細胞の割合を示している。図19は、IL−3、M−CSF、そしてGM−CSFに反応する骨髄細胞コロニー組織の抑制剤CKβ−8（+）の存在を示している。図20骨髄細胞コロニー組織CKβ−8の服用量の反応。細胞は、図19のように単離処理される。処理された細胞は、IL−3、GM−CSF、又は1、10、50、100ng/m lのCKβ−8有り又は無で、M−CSF（15ng/ml）の存在する中で1000細胞/dishの密集度の寒天ベースコロニーにて観察された。データはコロニー組織の特殊因子単独の幾つかのコロニー形成の割合を示している。データはエラーバーにより規定から外れたものを示し、DISHの二重の平均を示している。図21造血成長因子の存在、又は欠如のCKβ−8とCKβ−1によるアポトーシスの誘導を示している。ねずみの骨髄細胞は、両方の大腿骨からけい骨に接し、フィコール密度傾度で分かれ、単球はプラスチック付着により移動する。細胞ポピュレーションのはそれからIL−3（5ng/ml）、GM−CSF（5ng/ml）、M−CSF（10ng /ml）、そしてG−CSF（10ng/ml）の補助の上MEMベース培養基にて一晩培養された。加えて細胞は、CKβ−8（50ng/ml）、又はCKβ−1（250ng/ml）有りか無でも培養された。24時間後Boehringer mannheim細胞死ELISAキットに使われるアポトーシスのため収穫され加工された。データは各々成長因子の存在で培養し、アポトーシス発生の数の割合の増加を示している。図22ヒト単球でCKβ−8と記号化されているRNAが示されている。新たに洗浄された単球からなるトータルRNAは100U/mlhu rIFN-gか100ng/mlLPSで又は両方で観察された。各々の観察からRNA（8μg）は、1.2%のアガロースゲルで電気泳動的に分けられ、ナイロン細胞膜へ移された。CKβ−8ｎRNAは、32P−labeled cDN Aで調査、定量化された。放射線写真に生じている群は濃度測定器にて定量化された。本発明の様相に一致して図1、2、3（SEQ ID NO．2、4、6各々）のアミノ酸配列を持ち、生成したポリヌクレオチドと記号化され、又1994年2月9日NO.75676 ATCCデポジットとして届けられたクローンのｃDNAと記号化される生成したCKβ −8ポリペプチドと、1994年2月9日NO.75675ATCCデポジットとして届けられたクローンｃDNAと記号化される生成したMIP−4ポリペプチド、そして1993年10月13 日NO.75572ATCCデポジットとして届けられたクローンｃDNAと記号化される生成したCKβ−1ポリペプチドなどの核酸（ポリヌクレオチド）の単離を示している。本発明にてポリペプヱドと記号化されるポリヌクレオヱドは、システインやケモカインのファミリーのスーパー“インタークリン”に構造的に関連している。CKβ−8とMIβ−4の両方ともMIP−1相同器官でMIP−1βよりMIP−1αがより相同的である。CKβ−8と記号化されるポリヌクレオヱドは大動脈の内覆組織のｃD NAライブラリーから派生し、数々のケモカインの強力な相動性を提示する。120 のアミノ酸残基のポリペプヱドと記号化されるオープン読み枠をも含んでいる。第一の合致は、36%の同一性と、66%の相似性（図4）で表わされれているヒトマクロファージ炎症性タンパク質1アルファにある。 MIP−4と記号化されるポリヌクレオヱドは、成人の肺のｃDNAライブラリーで派生し数々のケモカインの強力な相動性を提示する。89のアミノ酸残基のポルペプヱドと記号化されるオープン読み枠をも含んでいる。第一の合致は、60%の同一性と、89%の相似性（図5）で表わされているヒト扁桃腺リンパ細胞LD78ベータタンパク質である。さらに、特徴的モヱーフのすべてのケモカインに起こる4 つのシステイン残基は、2つのクローンで一定に保たれた。事実、遺淘子の中の最初の2つのシステイン残基は、隣合った位置にあり、ケモカイン鼎ｘC煤A又は β亜科と分類される。他の亜科において、最初の2つのシステイン残基、鼎ｘC煤 A又α亜科は、1つのアミノ酸にて分けられる。 CKβ−1と記号化されるポリヌクレオヱド、そして最初の19の93アミノ酸ポリペプヱドと記号化される読み枠は、74アミノ酸残基を含む成長したポリペプヱドのリーダー配列になる。CKβ−1は80アミノ酸に及ぶ48%の同一性と72%の相似性を持つ、人体マクロファージ炎症性タンパク質との重要な相同性を表わしている。そして、特徴的モヱーフを含む4つのシステイン残基は保存された。本発明のポリヌクレオヱドは、多分RNA、ｃDNA、ゲノムDNA、そして合成DNA を含むDNAフォームにある。DNAは、二重鎖か一本鎖フォームで、もし一本鎖ならばコード要素かノンコード要素（反感覚）である。成長ポリペプヱドとコード化されるコード配列は、図1、2、3（SEQ ID NO.1、3、5）に表わされるコード配列か、届けられたクローンと同一であるか、コード配列の異なった配列か、成長したポリペプヱドのDNA図1、2、3（SEQ ID NO.1、3、5）か、届けられたｃDNA（s ）同じ遺淘的コードの余剰性か、又は、退化性の結果としてのコード配列と異なっているかもしれない。ポリヌクレオヱドは、図1、2、3（SEQ ID NO.2、4、6）で示されるように成長したポリペプヱドと記号化される。そして届けられたｃDNA（s）とコード化される成長したポリペプヱドを含む。成長したポリペプヱドのためのコード配列、成長したポリペプヱドのコード配列、そして第一又は第二配列のようなコード配列、プロタンパク質配列、成長したポリペプヱドコード配列のためのコード配列（オプションとして加えられた）、イントロンなどのノンコード配列、ノンコード配列5、そして又は、3の成長したポリペプヱドのためのコード配列。従って、塔|リペプチド唐記号化するポリヌクレオチドの概念は、加えられたコード、そして又は、ノンコード配列と同様、ポリペプチドのためのコード配列のポリヌクレオチドを含む。 Hereinaaboveの異倦とも関連している本発明は、図1、2、3（SEQ ID NO.2、 4、6）で推定するアミノ酸配列を持ち、断片的で、類似性があり、誘導体のポリペプヱドと記号化され、届けられたクローンｃDNAと記号化されるポリベプチドのポリヌクレオチドを説明している。ポリヌクレオチドの異形は、自然に起こったポリヌクレオチドの対立形質異形か、自然ではなく起こったポリヌクレオチドの異形である。上に述べたように、本発明は、図1、2、3（SEQ ID NO.2、4、6）に表わされている同じ成長したポリペプチドと記号化され、ポリヌクレオチド又は、図1、2 、3（SEQ ID NO.2、4、6）の断片的に、誘導性又は、類似性のポリペプチドと記号化される異形ののポリヌクレオチド同様、届けられたクローンのｃDNAと記号化されるポリペプチドを含む。ヌクレオチドの異形は、遺伝子欠如の異形、構造的異形、付加物又は、付着異形を含む。上に述べたように、ポリヌクレオヱドは多分、図1、2、3（SEQ ID NO.1、3 、5）で表わされているコード配列、又は届けられたクローンのコード配列で自然に起こった対立倦質異倦のコード配列を持っている。人文化学で知られているように、対立倦質異倦は、ポリペプヱドの記号化機能を構造的に変えない、1つ又はそれ以上のヌクレオヱドの代用、遺淘子の欠如、付加性を持つポリヌクレオヱド配列が交互に起きるフォームである。また、本発明は、成熟したポリペプヱドのコード配列が、宿主細胞からのポリペプヱドの発現および分泌を助長するポリヌクレオヱド配列に同じ読み枠で融合されるポリヌクレオヱドも含むものとする。例えば、細胞からのポリペプヱドの移動を制御する分泌配列として機能するリーダー配列などである。リーダー配列を持つポリペプヱドは、前酎白質であり、成熟したポリペプヱドを倦成するために、宿主細胞によって分割されたリーダー配列を持つことがある。また、ポリヌクレオヱドは、成熟した酎白質と余分なS茶Aミノ酸残基である後酎白質をコード化することもある。後配列を持った成熟した酎白質は、後酎白質であり、不活性化状態にある酎白質である。いったん後配列が分割されると、活性の成熟した酎白質が残る。したがって、例えば、本発明のポリヌクレオヱドは、成熟した酎白質、または後配列を持った酎白質、もしくは、後配列と前配列（リーダー配列）の両方を持ち合わせた酎白質をコード化する。また、本発明のポリヌクレオヱドは、コード配列を読み枠ごとにマーカー配に融合し、ポリペプヱドの精製を可能にする。マーカー配列は、細菌性の宿主の場合に、マーカーに融合された成熟したポリペプヱドを精製するためにpQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスヱジンタグであるか、または、例えば、CO S-7細胞などの哺乳類の宿主細胞を使用した場合の血凝集素(HA)タグでもありえる。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素酎白質から誘導されるエピトープに相当する(Wilson,I.,etall.,Cell,37:767(1984))。さらに本発明は、配列間の一致が最低50%、できれば70%である場合、前述の配列に交雑するポリヌクレオチドにも関連する。特に本発明は、厳密な条件下において前述のポリヌクレオチドに交雑するポリヌクレオチドに関連する。ここで使われる“厳密な条件”とは、配列間の一致が最低でも95%、できれば最低97%の場合にのみに起こる交雑を意味する。好ましい条件で前述のポリヌクレオチドに交雑するポリヌクレオチドは、図1、2、および3(SEQ ID No.1、3、5)のcDNA、または沈着したcDNAがコード化する成熟したポリペプチドと、実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコード化することができる。代わりに、このポリヌクレオチドは、最低でも20の塩基、できれば30以上、そしてさらにできれば最低でも50の塩基を持ち、本発明のポリヌクレオチドに交雑し、また前述の通り同一性があり、したがって活性を保持しないポリヌクレチドでもよい。そのようなポリヌクレオチドは、例えばSEQ ID NO.1、3、5のポリヌクレオチドのプローブとして、ポリヌクレオチドの回収、または診断のためのプローブ、あるいはPCRプライマーとして利用することができる。ここで述べられている沈着物とは、特許手続きのために、International Re c-ognition of the Deposit of Micro-organisms(微生物の沈着の国際認識)に関するブタペスト条約に基づくものとする。これらの沈着物は、この分野の専門家のために便宜上提供されたものであって、35U.S.C.§112に沈着物が必要とされることを認めるものではない。沈着物質に含まれるポリヌクレオチドの配列、およびそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸の配列は、言及により本発明に含まれるものとし、配列の説明に関して論争が起きた際に優先される。沈着物質の製造、使用、または販売には使用許可が必要であり、またそのような使用許可は本発明では譲与しないものとする。本発明は、さらに、図1、2、および3(SEQ ID No.2、4、および6)に推論されるアミノ酸配列、または沈着したcDNA、並びに断片、類似体、またそのようなポリペプチドの誘導体によってコードされたアミノ酸の配列を持つ、CkB-b、MIP-4 、および“断片”、“誘導体”、および“類似体”とは、図1、2、3(SEQ ID NO. 2、4、6)のポリペプチドに関連して使用される場合、または沈着したcDNAによってコード化されたものである場合は、そのようなポリペプチドと基本的に同じ生物学的機能と活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、類似体には、後蛋白質部分の分割による活性化によって活性化・成熟化したポリペプチドを製造できる後蛋白質が含まれる。本発明のポリペプヱドは、組換えポリペプヱド、自然もしくは合成ポリペプヱドであるが、できれば組換えポリペプヱドがよい。図1、2、および3(SEQ ID No.2、4、および6)のポリペプヱド、または沈着したcDNAによってコードされたポリペプヱドの断片、誘導体、および類似体には、 (i)1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存、または非保存アミノ酸残基によって置換されており(できれば保存アミノ酸残基)、その置換されているアミノ酸残基が、遺淘コードでコード化されている、まはたされていないもの、(ii)1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、(iii)成熟したポリペプヱドが、ポリペプヱドの半減期を増加する化合物など（例えば、ポリエヱレングリコール）、別の化合物に融合されているもの、もしくは(iv)付加的なアミノ酸が、リーダー配列または分泌配列、あるいは成熟したポリペプヱドの精製に使われる配列、あるいぱ後酎白質配列など、成熟したポリペプヱドに融合されているもの、がある。このような断片、誘導体、および類似体は、この分野の専門家の範囲内にあるものである。本発明のポリペプヱドは、できれば単離された倦で提供され、また均質に精製されたものがよい。 “遺伝子”または“シストロン”とは、ポリペプチド連鎖の生成に関連する DNA区域を意味する。これには、コード領域（リーダーおよびトレーラー）の前後の領域、および、個々のコード区域(エクソン)間の介在配列(イントロン)が含まれる。 “単離された”とは、物質がその元の環境（例えば、自然に発生するものであれば、自然環境）から物質が取り除かれることを意味する。例えば、生きている動物に存在する自然発生のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されたものではないが、自然体系に共存する物質の一部、またはすべてから分離した同じポリヌクレオチド、DNA、またはポリペプチドは、単離されたものである。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部、またはそのようなポリヌクレオチド、あるいはポリペプチドは、組成の一部でもありえるが、それでもそのようなベクターや組成が自然環境の一部ではないという点で、単離されているとするまた、本発明は、本発明のポリヌクレオヱドを含むベクター、本発明のベクターで遺淘子工学的に作られた宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプヱドの生成にも関連する。宿主細胞は、本発明のベクター、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターなどで遺伝子工学的に作られた(形質導入、または形質転換、あるいはトランスフェクションされた)細胞である。ベクターは、例えばプラスミド、ウィルス分子、ファージなどである。作られた宿主細胞は、プロモータを活性化したり、形質転換株を選択したり、また、CkB-8、MIP-4、およびCkB-1遺伝子を増幅するために、適宜に修正した伝統的な培養基にて培養することができる。温度、 pHなどの培養基の諸条件は、前回発現に選ばれた宿主細胞に使用した条件であり、通常技術のある専門家には明らかな条件である。本発現のポリヌクレオヱドは、組換え技術によるポリペプヱドの生成に使用できる。従って、例えば、ポリヌクレオヱド配列は、特にポリペプヱドを発現するベクターまたはプラスミドなど、さまざまな発現媒体に含まれる。そのようなベクターには、染色体DNA、非染色体DNA、または合成DNA配列、例えば、SV40の誘導体、細菌性プラスミド、ファージDNA、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組み合わせから誘導されたベクター、そして痘疹、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病などのウイルスDNAなど、が含まれるしかし、その他のどのプラスミドまたはベクターでも、宿主細胞において再製可能であり、生存可能であれば使用することができる。適切なDNA配列は、さまざまな方法によってベクターに挿入することができる。一般的には、DNA配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に通常の手順で挿入される。そのような手順およびその他の手順は、この分野の専門家の範囲内のものである発現ベクターのDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモータ）に人工的にリンクされ、mRNA合成を指示する。このようなプロモータの代表例としては、LT RまたはSV40プロモータ、大腸菌、ラクトースオペロン、またはトリプトファン、ファージラムダPプロモータ、そして、原核または有核細胞、あるいはそのウィルスの遺伝子発現を制御するとされるその他のプロモータなどが挙げられる。また、発現ベクターには、翻訳開始領域および転写終止領域のためのリボソーム結合部位が含まれている。また、ベクターには、発現の増輻に適切な配列が含まれている。さらに、発現ベクターには、できれば、ジヒドロ葉酸還元酵素や有核細胞培 {のネオマイシン抵抗性、または、大腸菌におけるテトラサイクリン抵抗性やアンピシリン抵抗性などの、形質変換された宿主細胞を選択するための表現型形質を与える遺伝子が含まれているほうがよい。前述のような適切なDAN配列や、適切なプロモータ、あるいは制御配列を含むベクターは、適当な宿主細胞の形質転換を行い、宿主細胞に蛋白質を発現させるのに使用することができる適当な宿主細胞の代表例としては、大腸菌のような細菌細胞、ストレプトミセス属の放線菌、ネズミチフス菌、酵母などの真菌細胞、キイロショウジョウバエ属S2、Sf9などの昆虫細胞、アデノウィルス、CHO、COS、Bowes黒色腫、植物細胞などが挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、ここに述べられる分野の専門家の範囲内で行われる。さらに特定すれば、本発明はまた、前述の1つまたはそれ以上の配列で構成される組換え構造を含むものとする。このような組換え構造は、本発明の配列を正方向、または逆方向に挿入したプラスミドやウィルスベクターなどのベクターから成る。さらに、組換え構造は、例えば配列に人工的にリンクされたプロモータを含む、調節塩基配列から成る。数多くの適当なベクターおよびプロモータが専門家の間で知られており、また市販されている。次に挙げるベクターおよびプロモータはその例である。細菌性：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、 phagescript、psiX174、pbluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH4 6A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、有核生物：PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）pSVK3、pBPV、pM SG、pSVL(Pharmacia)。ただし、その他のどのプラスミドまたはベクターでも、宿主細胞において再製可能であり、生存可能であれば使用してもよい。プロモータ領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクター、または選択できるマーカーのあるその他のベクターを使って、好みの遺伝子から選び出すことができる。このような適切なベクターには、PKK232-8およびPC M7の2つがある。特定の名の付いた細菌性プロモータには、lacI、lacZ、T3、T7 、gpt、ラムダP[ilegible]、Pl、およびtrpなどがある。有核プロモータには、C MV(即時および初期)、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスからのLTR、およびマウスメタロチオネイン-Iなどがある。適切なベクターおよびプロモータの選択は、通常レベルの専門家の範囲内で行うことができるものである。本発明はさらに、前述の組換え構造を持つ宿主細胞にも関連する。宿主細胞は、哺乳類細胞などの高度な有核細胞、または酵母細胞のような低度の有核細胞もあり、あるいは、宿主細胞には細菌細胞のような原核細胞もある。組換え構造の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストランを媒介としたトランスフェクション、またはエレクトロポレーション(Dav is,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Bassic Methods in Molecular Biology,(1986))によって達成される。宿主細胞内の構成は、伝統的な方法によって組換え配列でコード化された遺伝子生成物の生成に使用できる。また、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機によって合成することもできる成熟した酎白質は、適切なプロモータの制御のもと、哺乳類、酵母、細菌、まはたその他の細胞で発現できる。セルフリートランスレーションシステムもまた、本発明のDNA構成から誘導されたRNAを使うことによって、そのような酎白質の生成に使用することができる。原核および有核細胞の宿主に使用される適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrook,etall.,Molecular Clon ing;A Laboratory manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)の中で述べられており、その言及により、本発明に含まれるものとする高度な有核生物による本発明のポリペプチドをコード化するDNAの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することで増加できる。エンハンサーは、DN Aのシスアクティングエレメントで、通常約10〜300bpの長さで、プロモータに作用しその転写を増加する。複製源bp100〜270の後期でのSV40エンハンサー、巨細胞ウィルス初期プロモータエンハンサー、複製源の後期でのポリオーマウィルスエンハンサー、そしてアデノウイルスエンハンサーなどが例として挙げられる一般的に、組換え表現ベクターには、例えば、大腸菌のアンピシリン抵抗性遺伝子やs.cerevisiaeTRP1遺伝子など、宿主細胞の形質転換を可能にする複製源と選択できるマーカーが含まれており、また、下流側の構造配列の転写を指示する高度な発現遺伝子から誘導されたプロモータが含まれている。そのようなプロモータは、中でも3-ホスホグリセリン酸塩キナーゼ(PGR)、アルファファクター、酸性ホスファターゼ、またはヒートショック蛋白質などの糖分解酵素をコード化するオペロンから抽出できる。異種構造配列は、翻訳開始および終止配列、できれば翻訳された蛋白質の分泌をプラズマ周囲のスペースまたは細胞外の媒介に振り向けることができるリーダー配列などの、適切な段階を踏まえて組み立てられる。またオプションとして、異種構造配列は、好みの性質、例えば安定化または発現組換え生成物の簡素化された精製などを伝えるN-term inal identificationペプチドを含む融合蛋白質をコードできる細菌使用に役に立つ発現ベクターは、好みの酎白質と適切な翻訳開始および終止シグナルをコード化する構造DNA配列を、機能的なプロモータを使って、操作できる読取り段階で挿入することによって組み立てることができる。ベクターは、1つまたはそれ以上の表現型選択可能マーカー、および複製起点から成り、ベクターの維持、そして望ましい場合は、宿主中で増幅を提供する。倦質転換のための適切な源核生物宿主には、大腸菌、枯草菌、ネズミヱフス菌、およびさまざまな種類のシュードモナス属、ストレプトミセス属、ブドウ球菌属などが含まれるが、その他も好みにより使用できる。限定的でない代表例としては、細菌使用に役立つ発現ベクターには、良く知られているクローニングベクターであるpBR322(ATCC3717)の遺伝因子を構成する、市販プラスミドから誘導された選択できるマーカー、および細菌性の複製起点がある。このような市販されているベクターには、例えばpKK22303(Pharmacia F ine Chemi-cals,Uppsala,Sweden)やGEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)などが挙げられる。これらのpBR322のバックボーン的な部分は、適切なプロモータと発現されるべき構造配列と組合わされる。適切な宿主株が形質転換し、宿主株が適切な密度に増殖した後で、選択したプロモータを適切な手段で導入し（例えば、温度の変換や化学導入）、細胞をさらに一定期間培養する細胞は、通常遠心分離法により取り入れ、物理的または化学的手段により分し、その抽出物そのものをさらに精製する。酎白質の発現に使用された細菌細胞は、凍結・解凍サイクル、超音波処理、機械的な分裂、または細胞融解剤の使用など、都合のよい方法で分裂することができる。そのような方法は、この分野の専門家に良く知られているものである。また、組換え蛋白質の発現には、さまざまな哺乳類細胞の培養システムを使 pすることができる。哺乳類の発現システムの例には、Gluzman,Cell,23:175に説明される猿腎臓繊維芽細胞のCOS-7系や、同等のベクターの発現能力を有するその他の細胞、例えばC127、3T3、CHO、HeLa、BHK細胞系が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモータおよびエンハンサー、そして、必要とされるリボソーム結合部位、ポリA部位、接合ドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および、S 側面非転写配列で構成される。SV40接合で導入されたDNA配列およびポリA部位は、必要とされる非転写遺伝子要素の提供に使用することができる。 CkB-B、MIP-4、およびCkB-1は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、燐酸セルロースクロマトグラフィ、速水性インターアクションクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィなどの方法によって組換え細胞培養から取り出し、精製される。酎白質のリフォルディングは、成熟した酎白質の構成の完了に必要に応じて使用できる。最後に、最終的な精製段階には、高性能液体クロマトグラフィ(HPL C)を使うことができる。本発明のポリペプヱドは自然精製した生成物、または化学合成物、あるいは原核または有核生物宿主（例えば、溶媒した細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞など）から組換え操作によって生成された生成物である。組換え生成法に使用された宿主細胞に寄って、本発明のポリペプヱドは哺乳類またはその他の有核炭水化物による糖酎白質であるか、または非糖酎白質であることもある。本発明のポリペプヱドにはまた、最初のメヱオニンアミノ酸残基が含まれる。本発明のポリペプヱドは、さまざまな免疫調節および炎症機能、また、数多くの疾病症状に使用することができる。CkB-8、MIP-4、およびCkB-1は、chemoki ne族に属し、そのため白血球（単核白血球、中性好性白血球、Tリンパ球、エオシン好性白血球、好塩基性白血球など）に対して化学的な誘因物質である。 NorthernBlot分析では、CkB-8、MIP-4、およびCkB-1は、優勢的に造血組織に発現される。 CkB-8は、免疫反応および炎症の調整に重要な役割を果たすことが判明している。図22では、リポ多糖類がヒトの単核白血球からCkB-8の発現を誘発することを示している。従って、エンドトキシンの存在に対する反応として、CkB-8が単核白血球から発現されるため、宿主細胞の免疫反応を調節するのに、CkB-8の投与を採用することができる。図１０で示されるとおり、THP-1細胞内(A)及びPBMCs(B)におけるCkβ-Bの化学誘引物質活動は、非常に重要である。また、Ckβ-Bは、THP-1細胞内のカルシウ動員を誘引する(図11)。これにより、Ckβ-Bが、単球に生物学的影響を持っていることが分かる。さらに、Ckβ-Bは、ヒトの単球に服用依存化学向性とカルシウム動員反応を引き起こす。従って、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1は、ターゲットとなる免疫細胞が創傷部位にもたらす湿潤をコントロールすることによって、傷の回復を促進するのに利用することができる。これと同じく、今回発明されたポリペプチドは、殺菌性白血球の誘引や活性化によって、慢性の炎症(微小細菌性など)に対するホスト防御を強化する。さらに、今回発明されたポリペプチドは、坑腫瘍療法として利用できるのではないかとされている。というのも、カーポシ(Karposi)肉腫の治療に見られるように、ケモカインの細胞を腫瘍に注入したことによって、腫瘍が退行した実証例があるからだ。図12及び図13の分析によると、Ckβ-BはTHP-1細胞から、腫瘍後退を促す抑制性作用薬として知られる、TNF-αを分泌させることが明らかになっている。250ng/ml分のCkβ-Bは、1200ピコグラム／ml分のTNF-αを生産・分泌する。またCkβ-Bは、単球からIL-6、IL-1、G-CSFなどの、他の腫瘍・癌の抑制性作用薬を分泌させる。さらに、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1は、ホスト防御( 殺腫瘍性)細胞(細胞障害性Ｔ細胞、マクロファージなど)の侵入や活性化を刺激する。この方法は、固形腫瘍の治療にも利用できる。ポリペプヱドは、造血性細胞の増殖や分化を抑制するのに利用できる。ということは、化学療法が行われる間、骨髄基部細胞を作用薬から保護するのに利用できる。図14及び図15は、Ckβ-BとCkβ-1が、細胞を倦成している低増殖性潜在コロニーを抑制していること、そしてCkβ-BがLPP-CFCコロニーの増殖に有効・最適な抑制剤であることを明らかにしている。図16は、Ckβ-1がM-CSF-に触発されるコロニー倦成を、非常に良く抑えること、またCkβ-Bがここでは作用しないことを明らかにしている。しかし、すでに示されたとおり、Ckβ-Bと-Ckβ-1はどちらも、骨髄基部細胞の増殖や分化を効果的に抑制する。この坑増殖効果は、化学療法作用薬の増量投与を可能にし、従って化学療法をさらに効果的なものにする。委託前駆体細胞の分集団(顆粒球及びマクロファージ細胞／単球細胞)におけるCkβ-B及びCkβ-1ポリペプチドの抑制効果は、白血球細胞の増殖を抑制する治療に利用できる。図17、図18及び図19では、利用された細胞系列の委託細胞を取り出し、その結果できた細胞の集合をCkβ-B及びCkβ-1と接触させている。Ckβ -1はMac-1陽性集合細胞を50パーセント近く減少している。これは、Ckβ-1がM-C SF反応性コロニー形成細胞の抑制を促していることを示す、図16の結果と一致している。図19で示されているとおり、Ckβ-Bは委託前駆体細胞がIL-3、GM-CSF、 M-CSFに反応し、コロニーを形成する能力を抑制する。さらに、図20で示されるとおり、Ckβ-Bの服用反応は、コロニー形成を抑制する。この抑制効果は、これらの要因に仲介された分化シグナルの特定妨害物、または前駆体細胞における細胞障害性効果によるものである。ポリペプヱドのもうひとつの利用法として、IL-2生合成の抑制によってT細胞増殖(自己免疫性疾病、リンパ性白血病など)を抑制することもできる。また、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1は、皮膚内のランゲルハンス細胞がMIP-1aを生産することから、乾癬(ケラチノサイト過剰増殖)の原因となる、表皮性ケラチノサイトの増殖を抑制するのに利用できる。 Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1は、細片の除去及び炎症細胞への連続的な組織促進の両方によって、また過剰なTGPβ媒介線維をコントロールすることによって、損傷治癒の間に起こる瘢痕を防ぐのに利用できる。さらに、Ckβ-B、MIP-4、Ck β-1は血管の透過性を高めるので、これらのポリペプチドは、発作、血小板増多症、塞栓、骨髄増殖性障害を治療するのに利用できる。Ckβ-Bは、アプトーシスを誘引することによって、白血病や異常な細胞増殖(腫瘍細胞など)の治療に利用できる。図21で示されるとおり、Ckβ-Bは造血性前駆体細胞集合でアプトーシスを誘引する。今回発明された、ポリペプチドと、これをコード化するポリヌクレオチドは、科学研究、DNA合成、DNAベクターの生産などの生体外目的に関連する試薬や、疾病処置の治療や診断方法を開発するための研究試薬として利用できる。例えば、Ckβ-B及びCkβ-1は、分化を一時的に抑えることによって、未成熟の造血前駆体細胞(顆粒球、マクロファージ、単球など)の拡張に利用できる。これらの骨髄細胞は、生体外で培養できる。全長のCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1遺伝子は、全長の遺伝子を隔離し、その遺伝子と配列が非常に似かよっている、または生物学的な活動が似かよっている遺伝子を隔離する、cDNAライブラリのためのハイブリッド形成プローブとして使用できる。プローブは少なくとも30の塩基を、できれば50以上の塩基を含んでいるのが理想的である。プローブは、全長の転写及びゲノムクローン、または法則領域、プロモータ領域、エクソン、イントロンを持つ、完全遺伝子を含むクローンと一致する、cDNAクローンを識別するのに使用できる。スクリーニングの例としては、オリゴヌクレオチドプローブを合成するのに、既に分かっているDNA配列を使うことによって、遺伝子のコード領域を隔離する方法がある。今回発明された遺伝子への配列相補を持つラベル化オリゴヌクレオチドは、ヒトのcDNA、ゲノムDNA、mRNAのライブラリをスクリーンし、どのライブラリ群にプローブをハイブリッド形成するかを決定するのに使われる。また、この発明は、核酸配列における変異に関連する疾病や、それに対する敏感性を探知する診断分析の一部としての、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1遺伝子の使用にも関連している。これらの疾病は、ケモカイン・ポリペプチドの発現不足に関連している。 Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1に含まれる、ヒトが持つ変異は、あらゆる方法によってDNAレベルで探知することができる。診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組織、生検、剖検などの患者の細胞から得ることができる。ゲノムDNAは、直接発見に使用したり、分析前にPCRを使って酵素学的に増幅したりすることができる。(Saiki etal.,Nature,324:163-166(1986))またRNA及びcDNAも同じ目的に使うことができる。例えば、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1をコード化する核酸に対して相補的なPCRプライマーは、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1変異を識別・分析するのに使用することができる。例えば、遺伝子の欠失及び挿入は、通常の遺伝子型と比較した増幅生産物のサイズ変化から探知することができる。点変異は、増幅DNAを放射能標識化されたCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1RNA、または放射能標識化されたCkβ-B 、MIP-4、Ckβ-1アンチセンスDNA配列にハイブリッド形成することによって識別することができる。完全に一致した配列は、RNaseA消化や溶解温度の違いから不一致二重鎖と見分けることができる。 DNAの配列差違に基づいた遺伝子テストは、変性作用薬を含む、または含まないジェルの中で、DNAフラグメントの電気泳動可動性の変化を探知することで完遂することができる。遺伝子配列の小さな欠失や挿入は、高分解能ジェル電気泳動によって見ることができる。異なる配列を持つDNAフラグメントは、変性ホルムアミド・グラジェント・ジェル(ここでは、異なるDNAフラグメントの可動性が、特定の溶解温度や部分溶解温度によって、あらゆる位置で遅延する)上で、見分けることができる。(e.g.,Myersetal,Science,230:1242(1985)) 特定の場所で変化する配列は、RNase保護やSL保護または化学剤分割法などの酵素ヌクレアーゼ保護分析によって明らかにすることができる。(e.g.，Cotto n et al.,PNA.USA.85:4397-4401(1985)) したがって、特定のDNA配列探知は、ハイブリッド形成法、RNase保護、化学剤分割、DNA直接配列、または制限酵素(例:制限フラグメント長さ多形性(RFLP)) やゲノムDNAのサザンブロット法の使用などの方法によって完遂することができる。通常のジェル-電気泳動法及びDNA配列に加え、異変は生体内原位置での分析によって探知することもできる。正常にコントロールされた組織のサンプルと比らべて蛋白質が発現過剰であるいことによって、疾病(腫瘍など)や疾病への敏感性の存在を探知する場合もあることから、今回の発明は、あらゆる組識内のCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1蛋白質の変化レベルを探知する診断分析にも関連している。ホストから取り出されたサンプル内のCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1蛋白質のレベルを探知する分析は、この分野に詳しい人々に良く知られている。これらの分析には、ラジオイムノ分析、競合結合分析、ウェスタンブロット分析、エリサ(ELISA)分析、「サンドイッチ」分析などがある。エリサ(ELISA)分析(Coligan,et al.,Current Prolocols in Immuno logy,1(2).Chapter6,(1991))は、まず始めにCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1抗原に対する抗体(単クローン抗体が理想的)を準備する。そして単クローン抗体に対してレポーター抗体を準備する。レポーター抗体には、放射能、蛍光、特にここでは西洋わさびペルオキシターゼ酵素などの、検出可能な試薬が付着している。サンプル中の蛋白質を結合するために、サンプルはホストから取り出され固定したサポート(ポリエチレン皿など)の上でインキュベートされる。そして、皿の上の自由な蛋白質結合サイトは、BSAなどの不特定の蛋白質とインキュベートすることによって覆われる。次に、単クローン抗体がポリエチレン皿に付着したCkβ-B、MI P-4、Ckβ-1蛋白質に結合する間に、単クローン抗体が皿上でインキュベートされる。非結合の単クローン抗体は、全てバッファーによって洗い流される。西洋わさびペルオキシターゼとリンクしたレポーター抗体は、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1と結びついたあらゆる単クローン抗体と結合し、皿上に残る。そして、非結合のレポーター抗体は洗い流される。それから、ペルオキシターゼ基質が皿に加えられる。そして制限時間内の色の変わり具合で、患者のサンプル内に含まれるCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1蛋白質を測り、標準曲線と比較する。競合分析は、固定したサポート及びラベル化したCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1に付着したCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1に対する抗体や、固定したサポートに乗せられたホストから取り出されたサンプルに利用することができる。探知されたラベルの量は（液体シンチレーション・クロマトグラフィーなど）、サンプル内の蛋白質の量と相関している。「サンドイッチ」分析は、エリサ(ELISA)分析と類似している。「サンドイッチ」分析では、Ckβ-B、MIP-4、Ckβ-1は固定したサポートに乗せられ、サポートに付着した抗体と結合する。そして第2の抗体がCkβ-B、MIP-4、Ckβ-1と結合する。それから、ラベル化された、第2抗体用の第3抗体は、固定したサポートにのせられ第2抗体と結合し、それから数量化が可能となる。今回の発明は、ケモカイン・ポリペプチドのためのレセプターの識別方法を提供している。レセプターをコード化する遺伝子は、リンガド・パニングやFACS 選別などの、この分野に詳しい人々に良く知られているあらゆる方法で識別することができる。(Coligan et al.,Current Protocols in Immu..1(2),Chapter5.( 1991))発現クローニングは、ポリアデニアル酸基を細胞反応からポリペプチドに準備し、このRNAから創られたcDNAライブラリをプールに分化し、COS細胞または他のポリペプチドに反応しない細胞を形質移入するのに利用することができる。ガラスのスライド上で成長した形質移入細胞は、ラベル化したポリペプチドへさらされる。ポリペプチドは、ヨウ素化、及び特定部位蛋白質キナーゼの認識サイトの封入などの、あらゆる方法でラベル化することができる。次の固定化及びインキュベーションでは、スライドはオートラジオグラフィー分析の対象となる。陽性プールが識別され、相互作用のサブプーリング過程及び再スクリーニング過程を使用することによってサブプールが生産・再形質移入され、結果として推定上のレセプターをコード化する単一クローンを産出することによって識別される。レセプター識別へのもうひとつのアプローヱとして、ラベル化されポリペプヱドを、レセプター分子を表す細胞メンブランまたは抽出生産物と光親和性リンクすることができる。クロスリンクした素材は、PAGE分析によって分解され、Ｘ線フィルムにさらされる。ポリペプヱドのレセプターを含むラベル化された複合物は、切除したり、ペプヱド・フレグメントに分解したり、酎白質小配列にさらしたりすることができる。小配列から得たアミノ酸配列は、推定上のレセプターをコード化する遺淘子を識別するcDNAライブラリをスクリーンするための、変性オリゴヌクレオヱド・プローブのセットを設計するのに使用することができる。この発明は、今回発明されたケモカイン・ポリペプチドに対するアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーンする、化合物のスクリーニング法を提供している。アゴニストは、ポリペプチドと生物学的に類似した機能を持つ化合物である。また、アンタゴニストは、こうした機能を妨害する。化学向性は、今回発明されたポリペプチドのどれかによって、科学的に誘引された細胞を、それを許容するだけの十分な直径(5μm)を持つ多孔性フィルタの上に配置することによって分析することができる。潜在アゴニストのソリューションは、チャンバー上部にある適当なコントロール媒体と共に、チャンバーの底に配置する。こうしてアゴニストの濃縮グラジェントは、一定時間の後、多孔性メンブランを通って移動する細胞を数えることによって測定することができる。アンタゴニストを分析する際は、今回発明されたケモカイン・ポリペプチドをチャンバーの底に配置し、潜在アンタゴニストを加え、化学向性が抑制されているかどうかを見る。別の方法として、哺乳類の細胞またはポリペプチドのレセプターを発現するメンブラン標本を、化合物と共にラベル化されたケモカイン・ポリペプチド(放射能など)とインキュベートすることもできる。こうして、化合物がこの相互作用を妨害する能力を測ることができる。この方法でアゴニストを分析すると、ケモカインがなくなり、アゴニストそのものがレセプターと相互作用する能力を測定することができる。 CK-β、MIP-4、CK-1潜在アンタゴニストの例としては、抗体、及びある例ではポリペプチドと結びついているオリゴヌクレオチドに含まれているものがある。もうひとつの潜在アンタゴニストの例としては、ポリペプチドのネガティブ優性変異がある。ネガティブ優性変異は、あらゆるタイプのポリペプチドのレセプターに結合していながら、生物学的活動を保持することのできないポリペプチドである。また、アンチセンス・テクノロジーを使って生産されたアンチセンス構成も潜在アンタゴニストである。アンチセンス・テクノロジーは、三重螺旋形成及びアンチセンスDNA‐RNA(どちらの方法もポリヌクレオチドをDNAまたはRNAに結合することを基本としている)を通して、遺伝子発現を管理するのに使用することができる。例えば、今回発明された熟成ポリペプチドをコード化する、ポリヌクレオチド配列のS茶Rード・ポーションは、長さとして約10から40塩基ペアの、アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するのに使用されている。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関わる遺伝子部位に相補的であるように設計されている。 (triple-helix,Lee et al.,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979);Cooney et al Scien ce,241:456(1988);及びDervan et al.,Science.251:1360(1991)参照)これによってケモカイン・ポリペプチドの転写、及び生産が抑えられている。アンチセンス RNAオリゴヌクレオチドは生体内で、mRNAとハイブリッド形成し、mRNA分子がポリペプチドに変化するのを防ぐ。(antisense-Okano,J.Neurochem.,56:560(1991) ;Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,B oca Raton,FL(1988))また、前述のオリゴヌクレオチドは、ケモカイン・ポリペプチドの生産を抑制するアンチセンスRNAまたはDNAが生体内で発現するに従って細胞に配達される。別の潜在ケモカイン・アンタゴニストとしては、自然に、合成的に変更された類似体、ポリペプチドのペプチド誘導体がある。これは、生物学的機能を無くしたが、ポリペプチドのレセプターを認識し、これと結合し、よってレセプターを効果的に妨害するポリペプチドの類似体である。ペプチド誘導体の例としては、小ペプチドまたは類似ペプチド分子、その他がある。アンタゴニストは、MIP誘引・増強の障害(自己免疫、慢性の炎症、感染疾病など)を治療するのに使用することができる。自己免疫疾病の例としては、あらゆる硬化症やインシュリン依存の糖尿病がある。アンタゴニストは、単核貧食細胞の補充や活発化を防ぐことによって、ケイ肺病、サルコイドーシス、特発性の肺線維病などの感染疾病の治療に利用することができる。またアンタゴニストは、好酸の生産・移動を防ぐことによって、特発性の過好酸症の治療に利用することができる。また内毒素ショックも、アンタゴニストがマクロファージの移動を防いだり、今回発明されたケモカインポリペプチドを生産することによって治療することができる。アンタゴニストは、動脈の壁で単球湿潤を防ぐことによって、アテローム性動脈硬化症を治療するのに使用することができる。また、アンタゴニストは、ケモカイン誘引マスト細胞、好塩基球脱顆粒、ヒスタミンの開放を抑制することによって、遅延相アレルギー反応、慢性じんま疹、アトピー性皮膚炎などの、ヒスタミン媒介のアレルギー反応、及びヒスタミン媒介の免疫学的障害を治療するのに利用することができる。また、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎などのIgE媒介アレルギー反応を治療することができる。またアンタゴニストは、単球が創傷に入り込むのを防ぐことによって、慢性・急性の炎症を治療するのに使用することができる。また、慢性・急性の炎症性肺疾患は、肺の単球貧食細胞配列に関係していることから、アンタゴニストは正常な肺のマクロファージ集団を規制するのに使用することができる。また、アンタゴニストは、単球が患者の関節内の滑液に入り込むのを防ぐことによって、リウマトイド関節炎を治療するのに使用することができる。単球の流入及び活性化は、退行性関節症及び炎症性関節症の両方の病原に重要な役割を果たしている。またアンタゴニストは、IL−1及びTNFに主に属する有害カスケードを妨害し、他の炎症サイトカインの生合成を防ぐのに利用することができる。この方法によって、アンタゴニストは、炎症を防ぐのに利用することができる。また、アンタゴニストは、ケモカインに誘引されるプロスタグランジン非依存性熱を抑制するのに利用することができる。また、アンタゴニストは、再生不良性喘息や脊髄形成異常症などの骨髄不全のケースを治療するのに利用することができる。また、アンタゴニストは、肺内の好酸球の蓄積を防ぐことによって、喘息やアレルギーの治療に利用することができる。また、アンタゴニストは、喘息の肺の顕著な特徴である、副上皮性基底メンブラン線維症を治療するのに利用することができる。アンタゴニストは、下記の例のように、薬剤的認容キャリアの成分に利用することができる。ケモカインポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニストは、適切な薬剤キャリアを以って成分として利用することができる。これらの成分は、治療として効果的な量のポリペプチド及び薬剤的容認キャリア、またはエクスシピエントで構成されている。これらのキャリアは、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、上記の成分を組み合わせたもの、その他を含む。製剤は、薬剤投与の方法に副うものでなければならない。またこの発明は、今回発明された薬剤成分、ひとつまたは複数で満たされた容器をひとつまたは複数持つ薬剤パックまたは薬剤キットを提供している。これらの容器には、薬剤・生体関係製品の生産、売買を規制する行政機関による処方形式の、注意書きが付いている。この注意書きには、政府機関がヒトへの薬剤投与に向けた生産、売買を許可したことを示している。加えて、ポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニストは、その他の治療向け化合物の結合に利用することができる。薬剤成分は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内などのルートで、好都合な方法で投与することができる。薬剤成分は、治療及び／または特定の兆侯の予防に効果的な量を投与する。一般的には、ポリペプチドは一日当たり最低10μg／kg体重を、最高では約８mg／kg体重未満の量を投与する。ほとんどの場合、投与、症状、その他のルートを考慮し、投与量は一日毎に約10μg／kg 体重から1mg／kg体重である。また、今回の発明によると、ケモカイン・ポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニスト、アンタゴニストは、体内のポリペプチドなどを発現するのに利用することができる。これは「遺伝子療法」としてしばしば取り上げられる。これによって、例えば患者から取り出した細胞は、生体外でポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）や、設計細胞と設計し、それから治療対象の患者にポリペプチドと共に提供することができる。このような方法は、この分野ではよく知られている。例えば、細胞はこの分野で知られている手順で設計することができる。それは、今回発明されたポリペプチドをコード化するRNAを含む、レトロウィルス粒子を使用する方法である。これと類似した倦で、細胞は生体内でポリペプヱドを発現させるために設計される。生体内で、というのは、例えばこの分野で知られている手順である。この分野で知られているように、今回発明されたポリペプヱドをコード化するRNA を含む、レトロウィルス粒子を生産する生産株細胞は、生体内で細胞を設計したり、生体内でポリペプヱドを発現したりするために、患者に投与することができる。今回発明されたポリペプヱドを投与する方法は他にもある。これらの方法は、今回の発明を教授することによって、この分野に詳しい人々に明白になるはずである。例えば、設計細胞のための発現浴媒は、レトロウィルス以外の、例えば適切な配達浴媒と組み合わせた後、生体内で細胞を設計するのに利用することのできる、アデノウィルスでもよい。レトロウィルス・プラスミド・ベクターは、モロニー、マウス肉腫ウィルス、モロニーマウス白血病ウィルス、脾臓壊死ウィルス、ラウス肉腫ウィルス、ハーベイ肉腫ウィルス、その他などを含むレトロウィルスから取り出すことができる。好ましい具体物として、レトロウィルスの発現ベクター、pMV-7は、モロニーマウス肉腫ウィルスの末端反復配列（LTPs）に隣接し、単純ヘルペスウィルス（HSV）チミジンキナーゼ(tk)の規制下にある、選択可能な薬剤抵抗性遺伝子ネオを含んでいる。ユニークなBcoRI及びHindIIIサイトは、配列コードの挿入を促進する。(Kir schmeier,P.T.et al.,DNA,7:219-25(1988)) ベクターは、レトロウィルスLTR;SV40プロモーター;ヒトのサイトメガロウィルス（CMV）プロモーター（CMV）（Miller,et al.,Biolechniques,Vol.7,No.9 ,980-990(1989)で舞写）またはその他の細胞プロモーター（ヒストミン、polIII 、βアクヱンプロモーター、その他を含む真核生物細胞プロモーター）などを含む、適切なプロモーターを持つ。適当なプロモーターの選択は、ここで示される教授によってこの分野に詳しい人々に明白にされる。今回発明された、ポリペプヱドをコード化する核酸配列は、単純ヘルペスヱミジンキナーゼ、レトロウィルスLTRs、βアクヱンプロモーター、ポリペプヱドをコード化する遺淘子を統制する、自然のプロモーターなどの、ウィルス性ヱミジンキナーゼプロモーター、その他を含む適当なプロモーターの統制下にある。レトロウィルス・プラスミド・ベクターは、パッケージング細胞系統を形質導入し、過程細胞系統を形作るのに利用することができる。形質移入される可能性のあるパッケージング細胞の例としては、PR501、PA317、GP+am12、その他がある。ベクターは、この分野で知られるいかなる方法によって形質導入してもよい。これらの方法には、電気穿孔法、リポソームや沈殿CaPO４の使用、その他がある。生産者細胞系列は、感染性のレトロウィルスのベクター粒子を生成し、それは、ポリペプヱドを符号化する核酸連続体(sequesnce)を含む。このレトロウィルスのベクター粒子は、eukaryotic細胞を変換するために生体外または生体内で使用することができる。変換されたeukaryotic細胞は、ポリペプヱドを符号化する核酸連続体を発現する。変換されるeukaryotic細胞には、繊維芽細胞および内皮細胞を含むが、これらに限定されるわけではない。当発明の連続体は、染色体の識別にも貴重なものである。その連続体は特に個人の染色体の特定の場所をターゲットにし、それとかけ合わせることができる。それ以上に、染色体の特定の場所を識別することに対するニーズが、今あるということだ。実際の連続体データに基づく染色体マーク試剤で、染色体の場所をマークできるものは現在ほとんどない。当該発明に従って染色体に対してＤＮＡを並べる[mapping]ことは、それらの連続体を病気に関連する遺伝子と相関させることにおける重要な最初のステップである。簡単に言えば、連続体は、cDNAからPCRプライマー(primers)（１５−２５ｂｐが望ましい）を準備することによって、染色体上に並べることができる。拡大プロセスを複雑化しないように、ゲノム状DNAにおいて１エクソン以上広がらないプライマーを素早く選ぶために、cDNAをコンピュータで分析する。それから、これらのプライマーは、個人の染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使われる。そのプライマーに符号する人間の遺伝子を含むハイブリッドのみが拡大された小片を生産することになる。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に素早く割り当てるための方法である。当該発明を同じオリゴヌクレオチドに使用し、特定の染色体からの小片がパネル状になったもの、または、大きなゲノム状 (genomic)クローンの集まりについても、類似の方法で、副次的位置測定(subloc alization)ができる。同様の染色体に対する位置決めに使えるその他のマッピング戦略としては、正常位置での雑種形成、標識付けされ、フロー分類された染色体の事前スクリーニング、および、染色体特定のｃＤＮＡのライブラリーを作るための雑種形成による事前選択がある。ｃＤＮｑクローンの中期染色体展性に対する蛍光性の正常位置での雑種倦成（ＦＩＳＨ）は、一ステップで、正確な染色体の位置を提供するために、使用することができる。このテクニックは、５００から６００ベーシスといった短いｃＤＮｑにまで、使うことができる。このテクニックについては、Verma et al.,H uman Chromsomes:a Manual of Basic Techniques（人間の染色体：基本テクニックのマニュアル）ペルガモン・プレス、ニューヨーク（１９８８）を参照のこと。一旦連続体が正確な染色体の場所に位置づけられると、その連続体の染色体上の物理的位置は、遺伝学的地図のデータと相関させることができる。そういったデータは、例えば、Ｖ．McKusick,Mendelian Inheritance in Man(人間におけるメンデル学的遺伝)（ジョーンズ・ホプキンズ大学ウェルチ医学図書館からオンラインで入手できる）の中で見つけることができる。同じ染色体の部位に位置づけられた遺伝子と病気は、次には連鎖分析（物理的に隣接した遺伝子の共同継承）を通して識別される。次に、桝された個人と桝されていない個人との間にあるｃＤＮｑまたはゲノム連続体における違いを決定する必要がある。もし、突然変異が桝された個人の何人かまたはすべてに観察され、正常な個人のいずれにも見られない場合、その突然変異はその病気の原因となるものであると思われる。現在の物理的マッピングおよび遺伝学的マッピングのテクニックによる解明においては、病気に関連する染色体部位に正確に局部化されたｃＤＮＡは、５０から５００の潜在的な起因遺伝子のうちの一つであることが考えられる。ポリペプヱド、その小片またはその他の派生物、または、その類似物、またはそれを示している細胞は、それに対する抗体を生産するための免疫源として、使用することができる。これらの抗体は、例えば、多クローンまたは単クローン抗体であることができる。この発明には、また、キメラの、単一連鎖の、そして、人体に適応された抗体、同時に、Ｆａｂ小片、または、Ｆａｂ発現ライブラリーの産物が含まれる。そのような抗体および小片の生産には、この分野で知られているさまざまな方法が使用できる。当発明の連続体に符号するポリペプチドに対して生成された抗体またはその生体内の受容器官は、ポィペプチドを動物の体内に直接注入することによって、または、ポリペプチドを動物、できれば人間以外の動物、に投与することによって得ることができる。そのようにして入手した抗体は、ポリペプチド自体を凝結させるだろう。この方法で、ポリペプチドの一片のみを符号化している連続体でさえも、元々のポリペプチド全体を凝結させる抗体を生成するために使用することができる。例として、ハイプリドーマのテクニック(Kchler and Milsteirn,19 75,Nature,256:495-497)、トリオーマのテクニック、人間のＢ細胞ハイブリドーマのテクニック(Kozbor et al.,1983,Immunology Today4;72)、および、人間の単クローン抗体生産のためのＲＢＶ−ハイブリドーマ・テクニック(Cole,et al. ,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy（単クローン抗体とガンの治療）,AlanR.Lize,Inc.,pp.77-96)がある。単一連鎖抗体（米国特許4,946,778）産出のために述べられているテクニックは、当発明の免疫源ポリペプチド産物に対する単一連鎖抗体を産出するために適応させることができる。また、トランスジェニックのマウスを使って、人間に適応された抗体をこの発明の免疫源ポリペプチド産物に発現させることもできる。当発明は、さらに、以下の例に関連してさらに深く述べられるだろう。しかしながら、当発明はこれらの例に限られたものではないということを理解する必要がある。すべての割合または量は、他に表示がなければ、重さとする。以下の例に関する理解を促進するために、頻繁に出てくる方法、および/または、用語を述べることにしよう。「プラスミド」は、小文字のｐの前および/または後に大文字の文字および/ または数字を付けて表される。本書にある当初のプラスミッドは、商業的に入手できるか規制なしで一般に入手できるか、または、公表されている方法に合ったやり方で、入手可能なプラスミッドから形成できる。加えて、述べられているプラスミッドと同等のプラスミッドはこの分野では周知のことで、通常の技能を持った職人であれば明白なことである。ＤＮｑの「消化」とは、ＤＮｑ内にある特定の連続体に対してのみ活動する限定的酵素を持つＤＮｑの触媒分裂を意味する。本書で使われているいろいろな限定的酵素は、商業的に入手でき、その反応条件、補助要因およびその他の必要条件は、通常の技能を持った職人には周知の方法で使用した。分析的目的のために、通常、約２０μｌの緩衝液に約２ユニットの酵素を入れたものといっしょに１μｇのプラスミッドまたはＤＮｑ小片を使用する。プラスミッド倦成のためにＤＮｑ小片を分離させるには、通常、５から５０μｇのＤＮｑが２０から２５０ユニットの酵素といっしよにより大きな容量の中で消化される。特定の限定的酵素に適した緩衝器および基質の量は、製造者によって特定される。３７°Cで約１時間という培養時間が、通常、使われるが、仕入先の指示に従って変化するかもしれない。消化の後、その反応は、望みの小片を分離するため、ポィアクリルアミドのゲル上で、直接電気泳動にかけられる。分裂した小片の大きさの分離が、Goeddel,D.et al.,Nucleic Acids Res.,8-4057(1980)によって述べられている８パーセントのポィアクリルアミドのゲルを使って行われる。「オリゴヌクレオヱド」とは、単一のラセン構造のポリデオクシヌクレオヱドまたは二つの相補性ポリデオクシヌクレオヱドのストランドを示し、それらは化学的に合成可能である。そのような合成オリゴヌクレオヱドは、５’亜燐酸塩を持たないので、キナーゼがあるところでATPと共に亜燐酸塩を加えないと、もう一つのオリゴヌクレオヱドと結合しない。合成オリゴヌクレオヱドは、脱燐酸化されなかった小片と結合する「結合(Ligation)」とは、二つの二重ラセン上の核酸小片間にホスホジェスターの結束を形成する過程を意味する(Maniatis,T. ,et al.,Id.,p.146)。他に表示がなければ、結合は周知の緩衝器と、およそ等モル濃度の結合されるべきDNA小片０．５μｇ当たりT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）に対し１０ユニットという条件をつかって達成することができる。他に表示がなければ、変換は、Graham,F.とVan der Eb,A.,Virology（ウイルス学）(1973)の方法の中で述べられているやり方で実施した。例１バクテリアの発現とCkβ-8の浄化 Ckβ-8を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５６７６、は、Ckβ-8遺伝子に対し、処理されたCkβ-8タンパク質の５’と３’限度の連続体（マイナス、シグナル・ペプチド連続体）に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド・プリマーとベクター連続体３’を使って、増幅した。ＢａｍＨＩとＸｂａＩに対応するヌクレオチドを、５’と３’の連続体にそれぞれに追加した。５’のオリゴヌクレオチド・プリマーは、連続体５’TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA３’(SEQ ID No.7) を持ち、ＢａｍＨＩ限定的酵素サイトとそれに続く処理済みタンパク質の最終とされるアミノ酸から始まるCkβ-8暗号のついた連続体の１８のヌクレオチドを含む。３’連続体５’CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT３’(SEQ ID No.8)は、ＸｂａＩサイトに対する相補的連続体を含む。限定的酵素のサイトは、バクテリアの発現ベクターＰＱＥ-9(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)上の限定的酵素と対応する。ＰＱＥ-9は、抗生抵抗（Ａｍｐ１）、複製のバクテリアの源(ori)、ＩＰＴＧ規制の可能なプロモーター・オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓ標識と限定的酵素のサイトを符号化する。pQE-9が、次ぎに、ＢａｍＨＩとＸｂａＩに消化される。増幅された連続体は、ＰＱＥ-9の中に結合され、ヒスヱジン標識とＲＢＳのために符号化している連続体といっしよにフレームに挿入される。その結合ミックスは、次に、Ｏｉａｇｅｎから入手できるＥコライ菌株Ｍ１５／ｒｅｐ４を変換するために使用される。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プラシミッド pREP4の複数のコピーを含み、それは、lacIリプレッサーを発現し、また、カナマイシン耐性(Kanl)をも与える。ＬＢプレート上で成長する能力によって、変換物質が識別され、アンピシリン/カナマイシン耐性群体が選択される。プラシミッドＤＮＡが限定分析によって、分離され、確認される。Ａｍｐ(100ug/ml)とＫａｎ(25ug/ml)の両方を追加したＬＢメディアの培養液の中で、望みの構成物を含むクローンが、一晩（Ｏ／Ｎ）で、培養された。そのＯ／Ｎ培養物が、１：１００対１：２５０の比率で、大きな培養を植え付けるために使われた。細胞は０．４から０．６の間の光学濃度６００(Ｏ．Ｄ．[illegible])まで、成長させた。次に、ＩＰＴＧ(的sopropyl-B-D-thiogalactopyranoside)が、最終濃度１ｍＭまで、加えられた。ＩＰＴＧは、lacIリプレッサーを不活性化し、遺伝子発現の増加につながるＰ／Ｏを除去することによって、誘導する。細胞は、さらに余分に３から４時間培養される。細胞は、次に、遠心分離によって採取される。細胞のペレットはケーオトロピック(chaotropic)剤６モル・グアニダインＨＣ１の中で、溶解される。浄化の後、溶解されたCkβ-8は、６-Ｈｉｓ標識を含むタンパク質による堅い結合が許される条件の下でニッケル-キレート柱上で、クロマトグラフィーによって、この溶液から精製される(Hochuli,E.et al.,J.クロマトグラフィー411:177-184 (1984))。 Ckβ-8（９５％純粋）が、６モル・グアニダインＨＣ１５．０ペーハーから抽出され、そして、復元のために、３モル・グアニダインＨＣ１、１００ｍＭ燐酸ナトリウム、１０モル・グルタチオン（還元された）、および、２モル・グルタチオン（酸化された）に調整された。この溶液に１２時間定温放置された後、タンパク質は１０モル・燐酸ナトリウムに透析される。例２バクテリアの発現とＭＩＰ-4の浄化ＭＩＰ-4を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５６７５は、ＭＩＰ-4遺伝子に対し、処理されたＭＩＰ-4タンパク質の５’と３’限度の連続体（マイナス、シグナル・ペプチド連続体）に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド・プリマーを使って増輻した。ＢａｍＨＩとＸｂａＩに対応するヌクレオチドを、５’と３’の連続体にそれぞれに追加した。５’のオリゴヌクレオチド・プリマーは、連続体５’TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC３’(SEQ ID No.9)を持ち、ＢａｍＨＩ限定的酵素サイトとそれに続く処理済みタンパク質の最終とされるアミノ酸から始まるＭＩＰ-4暗号の付いた連続体の１８のヌクレオチドを含む。３’連続体５ ’CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT３’(SEQ ID No.10)は、ＸｂａＩサイトに対する相補的連続体を含む。限定的酵素のサイトは、バクテリアの発現ベクターＰＱＲ -9(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)上の限定的酵素と対応する。ＰＱＥ-9は、抗生抵抗（Ａｍｐ１）、複製のバクテリアの源(ori)、ＩＰＴＧ規制の可能なプロモーター・オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓ標識と限定的酵素のサイトを符号化する。pQE-9が、次ぎに、ＢａｍＨＩとＸｂａＩに消化される。増幅された連続体は、ＰＱＥ-9の中に結合され、ヒスヱジン標識とＲＢＳのために符号化している連続体といっしょにフレームに挿入された。その結合ミックスは、次に、Ｏｉａｇｅｎから入手できるＥコライ菌株を変換するために使用される。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プラシミッドpREP4の複数のコピーを含み、それは、lacIリプレッサーを発現し、また、カナマイシン耐性(Kan 1)をも与える。ＬＢプレート上で成長する能力によって、変換物質が識別され、アンピシリン/カナマイシン耐性群体が選択される。プラシミッドＤＮｑが限定分析によって、分離され、確認された。ｑｍｐ(100ug/ml)とＫａｎ(25ug/ml)の両方を追加したＬＢメディアの培養液の中で、望みの構成物を含むクローンが、一晩（Ｏ／Ｎ）で、培養された。そのＯ／Ｎ培養物が、１：１００対１：２５０の比率で、大きな培養を植え付けるために使われた。細胞は０．４から０．６の間の光学濃度６００(Ｏ．Ｄ．[illegible])まで、成長させた。次に、ＩＰＴＧ( 的sopropyl-B-D-thiogalactopyranoside)が、最終濃度１ｍＭまで、加えられた。ＩＰＴＧは、lacIリプレッサーを不活性化し、遺伝子発現の増加につながるＰ／Ｏを除去することによって、誘導する。細胞は、さらに余分に３から４時間培養された。細胞は、次に、遠心分離によって採取された。細胞のペレットはケーオトロピック(chaotropic)剤６モル・グアニダインＨＣ１の中で、溶解された。浄化の後、溶解されたＭＩＰ-4は、６-Ｈｉｓ標識を含むタンパク質による堅い結合が許される条件の下でニッケル-キレート柱上で、クロマトグラフィーによって、この溶液から精製された(Hochuli,E.et al.,J.クロマトグラフィー411: 177-184(1984))。ＭＩＰ-4（９５％純粋）が、６モル・グアニダインＨＣ１５．０ペーハーから抽出され、そして、復元のために、３モル・グアニダインＨＣ１、１００ｍＭ燐酸ナトリウム、１０モル・グルタチオン（還元された）、および、２モル・グルタチオン（酸化された）に調整された。この溶液に１２時間定温放置された後、タンパク質は１０モル・燐酸ナトリウムに透析された。例３バクテリアの発現とCkβ-1の浄化 Ckβ-1を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５572、は、Ckβ-1遺伝子に対し、処理されたCkβ-1タンパク質の５’と３’限度の連続体（マイナス、シグナル・ペプチド連続体）に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド・プリマーを使って増幅した。ＢａｍＨＩとＸｂａＩに対応するヌクレオチドを、５’と３’の連続体にそれぞれに追加した。５’のオリゴヌクレオチド・プリマーは、連続体５ ’GCCCGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC３’(SEQ ID No.11)を持ち、ＢａｍＨＩ限定的酵素サイトとそれに続く処理済みタンパク質コドンの最終とされるアミノ酸から始まるCkβ-1暗号の付いた連続体の１５のヌクレオチドを含む。３’速続体５ ’GCCTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG３’(SBQ ID No.12)は、ＸｂａＩサイトに対する相補的連続体、翻訳停止コドン、および、Ckβ-1暗号のついた連続体の最後の２０のヌクレオチドをを含む。限定的酵素のサイトは、バクテリアの発現ベクターＰＱＥ-9(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)上の限定的酵素と対応する。ＰＱＥ-9は、抗生抵抗（Ａｍｐ１）、複製のバクテリアの源(ori)、ＩＰＴＧ規制の可能なプロモーター・オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓ標識と限定的酵素のサイトを符号化する。ＰＱＥ-9が、次ぎに、ＢａｍＨＩとＸｂａＩと共に消化された。増幅された連続体は、ＰＱＥ-9の中に結合され、ヒスチジン標識とＲＢＳのために符号化している連続体といっしょにフレームに挿入された。その結合ミックスは、次に、ＯｉａｇｅｎからＭ１５／ｒｅｐ４という商標名で入手できるＥコライ菌株を変換するために使用された。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プラシミッドpREP4の複数のコピーを含み、それは、lacI リプレッサーを発現し、また、カナマイシン耐性(Kan1)をも与える。ＬＢプレート上で成長する能力によって、変換物質が識別され、アンピシリン/カナマイシン耐性群体が選択された。プラシミッドＤＮＡが限定分析によって、分離され、確認された。Ａｍｐ(100ug/ml)とＫａｎ(25ug/ml)の両方を追加したＬＢメディアの培養液の中で、望みの構成物を含むクローンが、一晩（Ｏ／Ｎ）で、培養された。そのＯ／Ｎ培養物が、１：１００対１：２５０の比率で、大きな培養を植え付けるために使われた。細胞は０．４から０．６の間の光学濃度６００(Ｏ．Ｄ．600)まで、成長させた。次に、ＩＰＴＧ(的sopropyl-B-D-thiogalactopyr anoside)が、最終濃度１ｍＭまで、加えられた。ＩＰＴＧは、lacIリプレッサーを不活性化し、遺伝子発現の増加につながるＰ／Ｏを除去することによって、誘導する。細胞は、さらに余分に３から４時間培養された。細胞は、次に、遠心分離によって採取された。細胞のペレットはケーオトロピック(chaotropic)剤６モノレ・グアニダインＨＣ１の中で、溶解される。浄化の後、溶解されたCkβ-1 は、６-Ｈｉｓ標識を含むタンパク質による堅い結合が許される条件の下でニッケル-キレート柱上で、クロマトグラフィーによって、この溶液から精製された( Hochuli,E.et al.,J.クロマトグラフィー411:177-184(1984))。Ckβ-1（９５％純粋）が、６モル・グアニダインＨＣ１５．０ペーハーから抽出され、そして、復元のために、３モル・グアニダインＨＣ１、１００ｍＭ燐酸ナトリウム、１０モル・グルタチオン（還元された）、および、２モル・グルタチオン（酸化された）に調整された。この溶液に１２時間定温放置された後、タンパク質は１０モル・燐酸ナトリウムに透析される。例４ＣＯＳ細胞内における組み換えCkβ-8の発現プラスミッド、ＣＭＶ-Ckβ-8Ｈｑの発現は、次ぎのものを含むベクターｐｃＤＮｑＩ／ｑｍｐ（生体外因子）から導かれる：１）複製のＳＶ４０源、２）アンピシリンに耐性のある遺淘子、３）Ｅ．コライ複製源、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリンカー部位、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニレーション・サイト。Ckβ-8先駆物質のすべて、および、フレームの３’の終わりに融合されたＨｑ標識を符号化したＤＮｑの小片が、ベクターのポリリンカー部位にクローンされ、それによって、組み換えタンパク質の発現がＣＭＶプロモーターの下で指図される。Ｈｑ標識は、前に述べられている通り(I.Wilson,et.al.,C ell（細胞）,37:767(1984)),インフルエンザの血球凝集素タンパク質から導き出されたエピトープに対応する。ターゲットとなるタンパク質にＨｑ標識を注入することによって、Ｈｑエピトープを認識する抗体で、組み換えタンパク質が簡単に検知できるようになる。プラスミッドの構築戦略は、以下に述べる通り： Ckβ-8を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５６７６、は、２つのプリマーを使ってＰＣＲによって構築される：５’プリマー５’GGAAAGCTTATGAAGGTCTC CGTGGCT３’(SEQ ID No.13)は、ＨｉｎｄＩＩＩサイトとそれに続く始動コドンから始まるCkβ-1暗号の付いた連続体の１のヌクレオチドを含む：３’連続体５ ’CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC３’(SEQ ID No.14)は、ＸｂａＩサイトに対する相補的連続体、翻訳停止コドン、ＨＡ標識、および、Ckβ-8を暗号化した連続体（停止コドンは含まない）の最後の２０のヌクレオチドをを含む。それゆえ、PCR生成物は、HindIIIサイト、Ckβ-8を暗号化した連続体とそれに続くフレームに融合されたHA標識、HA標識のとなりにある終了停止コドン、および、XbaIサイトを含む。PCR増幅されたDNA小片およびベクター、ｐｃDNAI/Amp、はHindIIIおよびXbaI限定的酵素と共に消化され、結合される。結合ミックスは、Eコライ菌株に変換される。SURE(Strategene Cloning S ystems,La Jolla,CA)、変換された培養組織が、アンピシリンのメディア・プレートの上で培養され、耐性群体が選択される。プラスミッドDNAが変換物質から分離され、正確な小片の存在が、限定分析によって検査される。組み換えCkβ-8 発現のため、COS細胞が発現ベクターによってDRAE[illegible]-DEXTRAN方法(J.S ambrook,E.Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloneing（分子のクローニング）:A Laboratory Manual,cold Spring Laboratory Press,(1989))を使ってトランスフェクトされる。 Ckβ-8-HAタンパク質が放射性同位元素識別および免疫沈降法( E.Harlow,D.Lane,Antibodies（抗体）:A Laboratory Manual,Cold spring Harbo r Laboratory Press,(1988))によって検出される。細胞は、トランスフェクションの２日後、35S-システインで、８時間にわたって標識付けされる。次に、培養メディアが集められ、細胞が洗浄剤（RIPA緩衝(NaCl 150mM,NP-40 1%,SDS 0.1%, NP-40 1%,DOC 0.5%,Tris 50mM,7.5ペーハー）（Wilson,I.et.al.,Id.37:767(198 4))によって溶解される。細胞溶解物と培養メディアの両方が、HA特定モノクロナル抗体と共に沈殿される。沈殿したタンパク質が、SDS-PAGE 15%のゲル上で分析される。例５ＣＯＳ細胞内における組み換えMIP-4の発現プラスミッド、ＣＭＶ-MIP-4Ｈｑの発現は、次ぎのものを含むベクターｐｃＤＮｑＩ／ｑｍｐ（生体外因子）から導かれる：１）複製のＳＶ４０源、２）アンピシリンに耐性のある遺淘子、３）Ｅ．コライ複製源、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリンカー部位、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニレーション・サイト。 MIP-4先駆物質のすべて、および、フレームの３’の終わりに融合されたＨｑ標識を符号化したＤＮｑの小片が、ベクターのポリリンカー部位にクローンされ、それによって、組み換えタンパク質の発現がＣＭＶプロモーターの下で指図される。Ｈｑ標識は、前に述べられている通り(I.Wilson,et.al.,C ell（細胞）,37:767(1984)),インフルエンザの血球凝集素タンパク質から導き出されたエピトープに対応する。ターゲットとなるタンパク質にＨｑ標識を注入することによって、Ｈｑエピトープを認識する抗体で、組み換えタンパク質が簡単に検知できるようになる。プラスミッドの構築戦略は、以下に述べる通り： MIP-4を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５６７５、は、２つのプリマーを使ってＰＣＲによって構築される：５’プリマー５’GGAAAGCTTATGAAGGGCCTTG CATGCTGCC３’(SEQ ID No.15)は、ＨｉｎｄＩＩＩサイトとそれに続く始動コドンから始まるMIP-4暗号の付いた連続体の１のヌクレオチドを含む：３’連続体５’CGCTCTAGATCAABCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCAGGTC３’(SEQ ID No.16)は、ＸｂａＩサイトに対する相補的連続体、翻訳停止コドン、ＨＡ標識、および、MIP-4を暗号化した連続体（停止コドンは含まない）の最後の19のヌクレオチドをを含む。それゆえ、PCR生成物は、HindIIIサイト、MIP-4を暗号化した連続体とそれに続くフレームに融合された時標識、HA標識のとなりにある終了停止コドン、および、XbaIサイトを含む。PCR増幅されたDNA小片およびベクター、ｐｃDNAI/Amp、はHindIIIおよびXbaI限定的酵素と共に消化され、結合される。結合ミックスは、Eコライ菌株に変換される。SURE(Strategene Cloning S ystems,La Jolla,CA)、変換された培養組織が、アンピシリンのメディア・プレートの上で培養され、耐性群体が選択される。プラスミッドDNAが変換物質から分離され、正確な小片の存在が、限定分析によって検査される。組み換えMIP-4 発現のため、COS細胞が発現ベクターによってDRAE[illegible]-DEXTRAN方法(J.S ambrook,E.Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloneing（分子のクローニング）:A Laboratory Manual,cold Spring Laboratory Press,(1989))を使ってトランスフェクトされる。MIP-4-HAタンパク質が放射性同位元素識別および免疫沈降法(E.H arlow,D.Lane,Antibodies（抗体）:A Laboratory Manual,Cold spring Harbor L aboratory Press,(1988))によって検出される。細胞は、トランスフェクションの２日後、35S-システインで、８時間にわたって標識付けされる。次に、培養メディアが集められ、細胞が洗浄剤（RIPA緩衝(NaCl 150mM,NP-40 1%,SDS 0.1%,NP -40 1%,DOC 0.5%,Tris50mM,7.5ペーハー）(Wilson,I.et.al.,Id.37:767(1984)) によって溶解される。細胞溶解物と培養メディアの両方が、HA特定モノクロナル抗体と共に沈殿される。沈殿したタンパク質が、SDS-PAGE 15%のゲル上で分析される。例６ＣＯＳ細胞内における組み換えCkβ-1の発現プラスミッド、ＣＭＶ-Ckβ-1Ｈｑの発現は、次ぎのものを含むベクターｐｃＤＮｑＩ／ｑｍｐ（生体外因子）から導かれる：１）複製のＳＶ４０源、２）アンピシリンに耐性のある遺淘子、３）Ｅ．コライ複製源、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリンカー部位、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニレーション・サイト。Ckβ-1先駆物質のすべて、および、フレームの３’の終わりに融合されたＨｑ標識を符号化したＤＮｑの小片が、ベクターのポリリンカー部位にクローンされ、それによって、組み換えタンパク質の発現がＣＭＶプロモーターの下で指図される。Ｈｑ標識は、前に述べられている通り(I.Wilson,et.al.,Cell （細胞）,37:767(1984)),インフルエンザの血球凝集素タンパク質から導き出されたエピトープに対応する。ターゲットとなるタンパク質にＨｑ標識を注入することによって、Ｈｑエピトープを認識する抗体で、組み換えタンパク質が簡単に検知できるようになる。プラスミッドの構築戦略は、以下に述べる通り： Ckβ-1を符号化しているDNA連続体、ATCC♯７５572、は、２つのプリマーを使ってＰＣＲによって構築された：５’プリマー５’GGAAAGCTTATGAAGATTCCGTGG CTGC３’(SEQ ID No.17)は、ＨｉｎｄＩＩＩサイトとそれに続く始動コドンから始まるCkβ-1暗号の付いた連続体の１のヌクレオチドを含む；３’連続体５’CG CTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG３’(SEQ ID No.1 8)は、ＸｂａＩサイトに対する相補的連続体、翻訳停止コドン、ＨＡ標識、および、Ckβ-1を暗号化した連続体（停止コドンは含まない）の最後の19のヌクレオチドをを含む。それゆえ、PCR生成物は、HindIIIサイト、Ckβ-1を暗号化した連続体とそれに続くフレームに融合されたHA標識、HA標識のとなりにある終了停止コドン、および、XbaIサイトを含む。PCR増幅されたDNA小片およびベクター、ｐｃDNAI/Amp、はHindIIIおよびXbaI限定的酵素と共に消化され、結合される。結合ミックスは、Eコライ菌株に変換される。SURE(Strategene Cloning Systems,L a Jolla,CA)、変換された培養組織が、アンピシリンのメディア・プレートの上で培養され、耐性群体が選択された。プラスミッドDNAが変換物質から分離され、正確な小片の存在が、限定分析によって検査された。組み換えCkβ-1発現のため、COS細胞が発現ベクターによってDRAE[illegible]-DEXTRAN方法(J.Sambrook, B.Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloneing（分子のクローニング）:A Laborato ry Manual,cold Spring Laboratory Press,(1989))を使ってトランスフェクトされる。Ckβ-1-HAタンパク質が放射性同位元素識別および免疫沈降法(E.Harlow,D .Lane,Antibodies（抗体）:A Laboratory Manual,Cold spring Harbor Laborato ry Press,(1988))によって検出された。細胞は、トランスフェクションの２日後、35[illegible]S-システインで、８時間にわたって標識付けされた。次に、培養メディアが集められ、細胞が洗浄剤（RIPA緩衝(NaCl 150mM,NP-40 1%,SDS 0.1 %,NP-40 1%,DOC 0.5%,Tris50mM,7.5ペーハー）(Wilson,I.et.al.,Id.37:767(198 4))によって溶解される。細胞溶解物と培養メディアの両方が、HA特定モノクロナル抗体と共に沈殿された。沈殿したタンパク質が、SDS-PAGE 15%のゲル上で分析された。例７ヒトの組織におけるCkβ-8の発現パターンノーザーン(Northern)のプロット分析は、ヒトの組織内でのCkβ-8の発現レベルを検査するために実施された。全部の細胞RNAサンプルが、RNAzol(TM)Bシステム(Biotecx Labortories,Inc.,Houston,TX77033)で分離された。特定されたそれぞれの人組織から分離された総RNAから約１０ugが、１％のアガローズ・ゲル上で分離され、５０ngのDNA小片が付いているストラタジーン・プライム-イットのキットに従って、ナイロン・フィルター(Sambrook,Fritsch,and Maniatis,Mol ecular Cloning（分子のクローニング）,Cold Spring Harbor Press,(1989))の上に塗りつぶされる。標識がつけられたDNAは、セレクト-G-50柱で清浄される。（5Prime-3Prime,Inc.Boulder,CO)そのフィルターは、次に、NaPO4 0.5M,7.4ペーハー,SDS 7％の中で1,000.000cpm/mlで放射性ラベルが付けられたCkβ-8遺伝子全体と６５℃で一晩置き、雑種形成される。0.5倍(0.5x)のSSC,SDS 0.1%で室温で２回、６０℃で２回洗浄した後、そのフィルターは、増強スクリーンで、一晩、-70℃にさらされる。例８人間の細胞におけるMIP-4の発現パターンノーザーン(Northern)のプロット分析は、ヒトの細胞内でのMIP-4の発現レベルを検査するために実施された。全部の細胞RNAサンプルが、RNAzol(TM)Bシステム(Biotecx Labortories,Inc.,Houston,TX)で分離された。特定されたそれぞれの人組織から分離された総RNAから約１０ugが、１％のアガローズ・ゲル上で分離され、５０ngのDNA小片が付いているストラタジーン・プライム-イットのキットに従って、ナイロン・フィルター(Sambrook.Fritsch,and Maniatis,Molecul ar Cloning（分子のクローニング）,Cold Spring Harbor Press,(1989))の上に塗りつぶされた。標識がつけられたDNAは、セレクト-G-50柱で清浄された。(5Pr ime-3Pri1e,Inc.Boulder,CO)そのフィルターは、次に、NaPO4 0.5M,7.4ペーハー ,SDS 7%の中で1,000,000cpm/mlで放射性ラベルが付けられたMIP-4遺伝子全体と６５℃で一晩置き、雑種形成された。0.5倍(0.5x)のSSC,SDS0.1％で室温で２回、６０℃で２回洗浄した後、そのフィルターは、増強スクリーンで、一晩、-70 ℃にさらされた。例９人間の組織におけるCkβ-１の発現パターンノーザーン(Northern)のプロット分析は、人間の組織内でのCkβ-1の発現レベルを検査するために実施された。全部の細胞RNAサンプルが、RNAzol(TM)Bシステム(Biotecx Labortories,Inc.,Houston,TX)で分離された。特定されたそれぞれの人組織から分離された総RNAから約１０ugが、１％のアガローズ・ゲル上で分離され、５０ngのDNA小片が付いているストラタジーン・プライム-イットのキットに従って、ナイロン・フィルター(Sambrook,Fritsch,and Maniatis,Mol ecular Cloning（分子のクローニング）,Cold Spring Harbor Press,(1989))の上に塗りつぶされた。標識がつけられたDNAは、セレクト-G-50柱で清浄される。 (5Prime-3Prime,Inc.Boulder,CO)そのフィルターは、次に、NaPO4 0.5M,7.4ペーハー,SDS 7%の中で1,000.000 cpm/mlで放射性ラベルが付けられたCkβ-1遺伝子全体と６５℃で一晩置き、雑種形成された。0.5倍(0.5x)のSSC,SDS 0.1%で室温で２回、６０℃で２回洗浄した後、そのフィルターは、増強スクリーンで、一晩、-70℃にさらされた。Ckβ-1のためのメッセージRNAは、脾臓内に豊富に存在する。例１０バキュロウィルス(baculovirus)発現システムを使用したキモキン(Chemokine)Ck β-8の発現と純化 SF9細胞が、Ckβ-8ｃDNAを発現するようにデザインされた組み換えバキュロウィルスで感染された。細胞は、２のMOIで感染され、２８℃で、７２−９６時間培養された。感染した培養物から細胞の破片が、低速遠心分離によって取り除かれた。プロテアーゼ抑圧剤の混合物が、ペファブロック(Pefabloc)SC20μg/ml 、ロイペプチン1μg/ml、E-64 1μg/ml、EDTA 1mMの最終濃縮時に上清に加えられた。20-30μlの上清のみの15%SDS-PAGEゲルを加えることによって、上清中のC kβ-8のレベルが、監視された。Ckβ-8が、リットル当たり数mgという発現レベルに対応したに見える９Kdの帯状組織として検知された。Ckβ-8は、３段階浄化方法：ヘパリン結合親和性クロマトグラフィーを通してさらに清浄された。バキュロウィルスの培養は、100mM HRPES/MES/NaOAc6ペーハーを含む緩衝剤３分の１の量とミックスされ、0.22μm膜を通してろ過された。そのサンプルは、次ぎに、ヘパリン結合柱( HE1poros 20,Bio-Perceptive System Inc.)にかけられた。Ckβ-08は、6ペーハーの50mM HEPES/MES/NaOAcに、50-100mM NaClの直線傾斜で、およそ300mM NaCl で抽出された：陽イオン交換クロマトグラフィー。ヘパリン・クロマトグラフィーで濃縮されたCkβ8は、50MM NEPES/MES/NaOAc 6ペーハーを含む緩衝剤で５倍希釈溶液にさらされた。合成された混合物は、次ぎに、陽イオン交換柱(S/Mporo s 20,Bio-Perceptive System Inc.)に塗り付けられた。Ckβ-8は、6ペーハーの5 0mM HEPES/MES/NaOAcに、25-300mM NaClの直線傾斜で、およそ250mM NaClで抽出された：サイズ除外クロマトグラフィー。陽イオン交換コロマトグラフィーに続いて、Ckβ-8は、サイズ除外柱(HW50,TOSOHARS,1.4x45cm)にかけることによって、さらに清浄された。Ckβ-8は、二重体のタンパク質に対応する13.7Kd分子量基準(RNaseA)に近いところで分別された。上述の３段階浄化に続いて、結果として得られたCkβ-8は、SDS[illegible] -PAGBゲルのコマシー(commassie)ブルーの変色から決定されるように９０％以上の純度であると判断された。（図９）清浄されたCkβ-8は、また、エンドトキシン/LPSの汚染について、テストされた。LALの分析評価(Bio Whittaker)によると、LPS含有量は0.1ng/ml以下であった。例１１ M-CSF 上におけるバキュロウィルス発現Ckβ-1とCkβ-8の影響および新しく分離された骨髄細胞のSCFに刺激された群体形成低密度のマウス骨髄細胞の個体群が、単核細胞、マクロファージ、および、プラスチィックの表面に付着するその他の細胞を取り除くため、処理された組織培養ディッシュの中で、37℃で１時間培養された。非付着性の細胞個体群が、次ぎに、第１６図で示された要素が存在または不在する状況で、寒天を含んだ培養基の中で培養された（10,000細胞/ディッシュ）。培養基は、37℃で１０日間開培養され(N2 88%,CO2 5%およびO2 7%)、群体は転化顕微鏡の下で採点された。データは、群体の中央値で表示されており、それは、三重に実施された分析評価から得られた。例１２ IL-3 上におけるCkβ-8とCkβ-1の影響および骨髄細胞リン群体(lin-population) のSCFに刺激された核酸および差別化一次的血液形成原種の中で強化されたマウス骨髄細胞の群体が、ネガティブ・セレクション方法、つまり、ほとんどの直系に関わっている細胞が、単クローン抗体(抗cdllb,CD4,CD8,CD45R,Gr-1抗原)および磁気ビードを使って取り除かれた。その結果として得られた細胞群体（リン細胞(Lin cells)）が、IL-3(5ng/ml )とSCF(100ng/ml)が補填された培養基の中で、示されたキモキン(chemokine)(50 ng/ml)の存在または不在する状況で、培養された(5ｘ10の４乗細胞/ml)。過湿された培養器(CO2 5%,O2 7%,N2 88%の環境)の中で、３７℃で７日間培養された後、細胞が採取され、HPP-CPC、未分化原種の分析をされた。加えて、細胞は、ファクスキャン(FACScan)によって特定の差別化抗原発現について分析された。群体のデータは、数群体の中央値で表示されており、それは、各細胞母集団について６個のディッシュで実施された分析評価から得られた。（第１７図）例１３ Ck β-8は、IL-3,M-CSF,GM-CSFに反応し、群体形成を抑制するマウス骨髄細胞が、微量密度のグラヂエントの上で分離された大腿骨およびけい骨の両方からおよびプラスチック付着によって取り除かれた単核細胞から押し流された。結果として得られた細胞集団は、IL-3(5ng/ml),GM-CSF(5ng/ml),M- CSF(10ng/ml),G-CSF(10ng/ml)が補填されたMEMベースの培養基の中で一晩培養された。これらの細胞は、50ng/mlレベルのCkβ-8と共にまたはそれなしに、IL-3( 5ng/ml),GM-CSF(5ng/ml),M-CSF(10ng/ml)が存在する寒天ベースの群体形成分析物の中で1,000細胞/ディッシュで培養された。データは、特定の要因のみで形成された群体の数に対するパーセントとしてその群体形成が表示された。２つの複製ディッシュの平均として描写されたデータと共に、各試みに対する標準偏差を示す誤差棒グラフを付けて、２つの試みが示されている。（第１９図）例１４遺伝子治療による発現皮膚生検によって、対象から繊維芽細胞が得られた。その結果として得られた組織が、組織培養基の中に置かれ、小片に分けられる。組織の小さな塊が、組織培養フラスコの湿らせた表面に置かれ、およそ１０片が各フラスコに置かれる。フラスコは裏返され、密閉した状態で、室温で一晩置かれる。室温で２４時間置かれた後、フラスコは逆にされ、組織の塊はフラスコの底にくっついたまま、新しい培養基（例えば、Ham痴F12media,FBS 10%,ペニシリン、ストレプトマイシン）が加えられる。そして、それは、３７℃で、およそ一週聞放置される。この時点で、新しい培養基が加えられ、その後数日毎に換えられる。培養組織の中にさらに２週間置いた後、単層の繊維芽細胞が出現する。その単層がトリプシン化され、その薄片が大きなフラスコに入れられる。モロニー(Moloney)・ハツカネズミ肉腫ウィルスの長い、一定期間の繰り返しによって側面に作られたpKV-7(Kirschmeier,P.T.et al.,DNA,7:219-25(1988)) は、EcoRI HindIII,といっしょに消化され、引き続いて、子牛の腸内ホスファターゼで処理される。その一次ベクターはアガロース・ゲルの上で分別され、ガラスのビードを使って清浄される。当発明のポリペプチドを符号化したcDNAは、５’と３’で終わる連続体のそれぞれに対応するPCRプリマーを使って増幅される。５’プリマーはEcoRIサイトを含み、３’プリマーはHindIIIサイトを含む。T4DNAリガーゼが存在するところで、同量のモロニー(Moloney)・ハツカネズミ肉腫ウイルス一次(linear)背骨およびEcoRIとHindIIIの小片がいっしょに加えられる。結果として得られた混合物は、２つの小片の結合に適した条件の下で維持される。その結合ミックスは、バクテリアHB101を変換するために使われ、それは、次に、ベクターが適切に挿入された対象遺伝子を持っていたことを確認するために、寒天を含むカナマイシンの上に培養(plate)される。アンフォトロピック(amphotropic)pA317およびGP+am12が一群となった一括細胞が、ダルベッコー(Dulbecco)のモディファイド・イーグルズ・ミディアム（ＤＭＥＭ）にある融合密度になるまで組織培養の中で、子牛の血清(CS)10%、ペニシリンおよびストレプトマイシンと共に、生育される。遺伝子を含むMSVベクターが、次に、基に加えられ、一括細胞がベクターと共に形質導入される。その一括細胞は、今や、その遺伝子をふくむ感染ウィルス粒子を生産する。（この一括細胞は、今や、生産者細胞として、引用される。）新しい培養基が倦質導入された生産者細胞に加えられ、その結果、融合性生産者細胞の１０ｃｍのプレートから、培養基が収穫される。感染ウィルス粒子を含む使用された培養基は、分離した生産者細胞を取り除くためにミリ孔のフィルターを通してろ過され、この培養基が、次ぎに、繊維芽細胞を感染させるために使われる。繊維芽細胞の亜融合性プレートから取り除かれた基は、素早く、生産者細胞からの培養基と交換される。この培養基は取り除かれ、新しい基と取り換えられる。もし、ウィルスの滴定濃度が高ければ、事実上、すべての繊維芽細胞が感染するので、選択の必要が全くなくなる。もし、滴定濃度が非常に低ければ、neoとかhisのような選択可能なマーカーを持つレトロウィルスのベクターを使用する必要がある。その工作された繊維芽細胞は、次ぎに、それのみ、または、シトデックス(cytodex)３マイクロキャリアー・ビード上で、融合点まで成長させた後で、ホストに注入される。その繊維芽細胞は、今や、タンパク質産物を生産する。上述の教えに鑑み、当発明に対する数多くの修正や変形が可能であり、それゆえ、特にそれ以外の指摘がされていない限り、当発明は、付録に添付された申請の範囲内で実施されるものとする。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Human chemokine beta-8, chemokine beta-1, And macrophage inflammatory protein-4 This application is pending application number 08, filed with the United States Patent and Trademark Office on May 5, 1995. / 446. 661 files. The present invention encodes a recently identified polynucleotide, and Polynucleotides and polypeptides that are used and produced as odds and polypeptides Associated with the peptide. More specifically, the invention of polypeptides is As described above, human chemokine beta-8 (ckβ-8) and macrophage inflammatory Identical to protein-4 (MIP-4) and chemokine beta-1 (ckβ-1) Was confirmed. The invention further relates to the control of polypeptides and the like. I have. Chemokines, also applied to intercrine cytokinesis, are structurally functional It is also related to the subfamily of cytokinesis. These molecules are 8-10 kd in size is there. In general, chemokines are represented at the 20% -75% homology amino acid level, And characterized by four conserved cysteine residues consisting of two disulfyl bonds Be killed. Based on the sequence of the first two cysteine residues, chemokines are alpha And beta can be divided into two subfamilies. The first two in the Alpha subfamily Two cysteines were separated by one amino acid. Therefore, the "C-X-C" subfamily Is shown. In the beta subfamily, the two cysteines are next to each other, Therefore, it is designated as "C-C" subfamily. So far, at least eight different subfamilies Members have been identified in humans. Intercrine cytokinesis has various functions. The characteristics of quality certification are monocytes, Of different cell types, including neutrophils, T lymphocytes, basophils, and fibroblasts Has the ability to induce chemotactic movement. Many chemokines are pro-inflammatory and anti-inflammatory He is involved in a number of stages during the process. These features include histamine release, Release of sonome enzymes and leukotrienes, from target immune cells, endothelial cells Increase cell adhesion, enhance binding of supplemental proteins, granulocyte adhesion molecules, and complement Induces the discovery of rupture of body receptor respiratory organs. In addition, the relationship with inflammatory Certain chemokines are represented by showing other activities. For example, macrophages Inflammatory protein-1 (MIP-1) can suppress the proliferation of hematopoietic stem cells, Platelet factor-4 (PF-4) is a potent inhibitor of endothelial cell growth. In addition, -Leukin-8 (IL-8) promotes the growth of KERATINOCYTES, and GRO It is a cell autocrine growth factor. Considering the different biological functions, chemokines are physiologically and Pa-cell transport, wound healing, hematology regulations, and allergies, asthma, arthritis, etc. It is not surprising that it is highly associated with immunological disorders. An example of a hematological race regulation is MIP-1. MIP-1 is produced from macrophages. Proto-inflammatory cytokinesis was confirmed as endotoxin induction. Followed by In the study of MIP-1, two different but related proteins, MIP-1∂ And MIP− It was shown that it consisted of 1β. Both MIP-1∂ and MIP-1β It is a chemoattractant for large monocytes and T lymphocytes. Many to find interest Potent Stem Cell Response Inhibitors (SCIs) Analysis revealed that it was identical to MIP-1. Moreover, MIP-1β is Neutralizes the ability of -1∂ to suppress hematopoietic stem cell proliferation. This discovery has a major physiological role. MIP-1 plays a role in suppressing hematopoiesis in the bone marrow, and secondly, has an inflammatory function That hypothesis was reached. The mode of action of MIP-1∂ is G1 / S stationary , The ability to block the cell division cycle. In addition, MIP-1 Is only limited to incomplete progenitor cells and granulocyte-macrophage colonies. -In the presence of a stimulator (GM-CSF), it is actually stimulating post-progenitors. Some groups have clones similar to the human homologs of MIP-1∂ and MIP-1β. Have been implemented. In this case, the cDNAs will be prepared against the T cell RNA. Isolated from Bally. MIP-1 protein can find early wounded inflammatory cells Have been shown to cause the production of IL-1 and IL-6 from isolated fibroblasts. in addition , Purified natural MIP-1 (including MIP-1, MIP-1α, MIP-1β, polypeptide) Can cause severe inflammation when injected subcutaneously into the foot of a rat or into the cerebrospinal fluid of a rabbit. Cause illness. (Wolpe and Cerami, 1989 FASKB J 3: 2565-73). In addition to this The pro-inflammatory properties of these MIP-1 are probably direct or indirect, and MIP-1 is An experimental mouse was used in the model and healed while healing the initial inflammatory wound. (Fahey, et al. , 1990, Cytokine, 2:92). For example, an application filed by Chiron Corporation In WO92 / 05198, mammalian macrophage inflammatory proteins (MIPs) are A DNA molecule has been announced that is effective for production in E. coli. Rat MIP-1α and MIP-1β Are different but are very relevant to cell division. Two partially purified taps Protein roots affect neutrophil function, causing local inflammation and fever. MIP-1α Was produced and uniformly purified in yeast cells. Structural analysis is based on homology linkage Are very similar in the second and third order to the structures of PF-4 and IL-8 It was confirmed that. MIP-1α is a rat that is killed by thymidine in vitro Work in vivo to protect stem cells. MIP-1α is also a granulocyte macropher The colony stimulating factor can be confirmed. Progenitor granulocyte macrophage colony shape (Clemens, J. et al.). M. , etal. , Cytokine, 4: 76-821992). A polypeptide of the invention designated as MIP-1 in a group patent application, CKβ-1 Is a new member of the beta chemokine family based on amino sequence homology. Consistent with one aspect of the present invention, it is biologically effective, Human CKβ-8, human MIP-4, human CK, which were similarly cited for their effectiveness Newly developed polypeptides such as β-1 have been demonstrated. Consistent with another aspect of the present invention, the polypeptide is encoded as a biologically effective MRNA, which was similarly cited for its judgmental and therapeutic efficacy in the disease It has been shown to isolate nucleic acid molecules including s, DNAs, cDNAs, genomic DNA. In accordance with a further aspect of the present invention, there is provided a recombination technique comprising a cultured, recombined eukaryote. Nick and / or eukaryote, host cell, SAID protein containing nucleic acid sequence 2 shows the production process of a polypeptide for enhancing the production of protein. Consistent with a further aspect of the invention, the polypeptide is encoded as a polypeptide for therapeutic purposes. The polynucleotide used is indicated. The purpose of treatment is, for example, lukemic Protect bone marrow stem cells from chemotherapeutic agents during chemotherapy to reduce vesicles and reduce sensitivity Stimulate hematopoiesis, regulate hematopoiesis and lymphocyte trafficking, treat psoriatic solid tumors, Promotes resistance to new epidemics and stimulates wound healing. In accordance with a further aspect of the present invention, there is shown an antibody against a polypeptide. You. Consistent with other aspects of the present invention, it may be used for inhibitory behavior of polypeptides Indicate alleles of the polypeptide. Inhibitory behavior is dependent on the production of inhibitors IL-1 and TNF-α , Aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, asthma, arthritis and the like. In accordance with another aspect of the present invention, hybrids of CKβ-8, CKβ-1, MIP-4 nucleic acid sequences are A nucleic acid consisting of enough nucleic acid molecules to make is shown. In accordance with another aspect of the present invention, a change in the nucleic acid sequence, To find out about disease, to find diseases related to under-expression or over-expression of polypeptides, Tests that are useful for diagnosis have been presented. Consistent with other aspects of the invention, tests for in vitro purposes related to chemical research. DNA synthesis and production for drug research, therapeutic development, and diagnostics for disease treatment. Use polypeptides and polynucleotides, which are symbolized as polypeptides for The process was shown. These and other aspects of the present invention are based on the learning of these facts. Noh is shown. Figure 1 shows the cDNA sequence labeled CKβ-8 and the presumption of amino acid sequence identity. Is shown. The initial 21 amino acids are represented as a putative representative sequence. You All signal chains are based on the N-terminus of the baculovirus express protein. Determined by null peptide sequence. FIG. 2 shows the estimated identity of the amino acid sequence with the cDNA sequence labeled CKβ-1. are doing. The initial 19 amino acids are represented as a representative sequence. FIG. 3 shows the estimated identity of the amino acid sequence with the cDNA sequence labeled MIP-4. ing. The initial 20 amino acids are represented as a representative sequence. Figure 4 shows the amino acid homology between CKβ-8 (upper) and human body MIP-1α (lower). The characteristics of the four cysteines of mokine are shown. Figure 5 shows that the upper sequence of the two amino acid sequences is the human body MIP-4 amino acid sequence, the lower sequence The sequence indicates human MIP-1α. (Human tonsil lymphocytes, LD78 betata Protein) Figure 6 shows the alignment of the amino acid sequences between CKβ-1 (upper) and human body MIP-1α (lower). It represents. FIG. 7 shows HA-tagged CKβ-1 of COS cells, followed by electrophoresis of CKβ-1 gene. Is photographed. FIG. 8 shows the SD of CKβ-1 expressed and purified by the baculovirus expression system. The C-PAGE gel is copied. FIG. 9 shows the results after expression in the baculovirus expression system and purification in three steps. An SDC-PAGE gel of CKβ-8 is shown. Figure 10 shows that CKβ-8's chimoact tractant behavior was Member device (Neuro Probe INC. ) Was confirmed by experiments on chemotaxis. Real The test procedure is described in the product guide. The concentration of each CKβ-8 is 5 high The experiment was conducted in the power field. Results are averages obtained from two independent experiments The results are shown. THP- (A) cell and human PBMCs (B) Tanto behavior is shown. Figure 11 shows that CKβ-8 responds to changes in intracellular calcium concentration Confirmed using a -2000 fluorescent spectrophotometer. Bacterial Express CKβ-8 Was added to Indo-1 packed in 50 nM final enriched THO-1 cells and intracellular calcium was added. Concentration levels were measured. FIG. 12.Monocyte cell line THP-1 is LPS (0. 1-10ng / ml) or CKβ-8 (to50 ng / ml). Tissue culture of the supernatant was performed using ELIS to increase TNF-α secretion. A was the subject of the analysis. Fig. 13 Human peripheral blood monocytes that have been washed and purified, when the number of CKβ-8 is increased, Processed for 16 hours. Tissue culture of the supernatant (produced by baculovirus) , TNF-α, IL-6, GM-CSF and granulocyte colony stimulating factor (G-CSE) secretion The amount was on the agenda of the ELISA analysis. Figure 14. Low density population of mouse bone marrow cells (1500 cells / dish) With or without chemokine (100 ng / ml) in the culture medium, but IL-3 (5 ng / ml), S It was observed together with CF (100 ng / ml), IL-1α (10 ng / ml), and M-CSF (5 ng / ml). De Data were averaged from two independent experiments (two trials each). Roller Knees were identified 14 days after culture. Numerous colonies arising from the presence of chemokines However, the lack of added chemokines showed a low percentage. Fig. 15 shows mouse bone marrow colony development by HPP-CFC (A) and LPP-CFC (B). CKβ-8 and CKβ-1 that have an effect on the FIG. 16 shows that CKβ-1 of baculovirus express and CKβ-8 of M-CFS are newly separated. Figure 4 shows the effect of SCF-stimulated colony tissue on isolated bone marrow cells. FIG. 17 shows CKβ-8 and IL-3 CKβ-1 and SCF-stimulated proliferation and bone marrow cell lymphopure. This shows the effect of option identification. Fig. 18.GR-1 and apparent cell populations from bone marrow cell populations. Of CKβ-8 and CKβ-1 on the occurrence of Mac-1 (surfacemarkers) Phosphate cells were IL-3 (5 ng / ml), SCF (100 ng / ml), alone (a), CKβ-8 (50 ng / ml) ) (B) or CKβ-1 (50 ng / ml) was added, and it was shown to have propagated in a growth medium. You. Cells are then used to differentiate bone marrow from GP-1, Mac-1, Sca-1, and surface Contrary to Tigen CD45R, stained with monoclonal antibody and analyzed by FACSCan Was. The data show the percentage of effective cells in both large (A) and small (B) cell populations. Is shown. FIG. 19 shows bone marrow cell colony tissue responding to IL-3, M-CSF, and GM-CSF. This shows the presence of the inhibitor CKβ-8 (+). FIG. 20 Response of dose of bone marrow cell colony tissue CKβ-8. Cells should be as shown in Figure 19. It is isolated. Treated cells were IL-3, GM-CSF, or 1, 10, 50, 100 ng / m l with or without CKβ-8, 1000 cells / dish in the presence of M-CSF (15 ng / ml). Concentrations were observed in agar-based colonies. Data are for the specific factor of colony tissue The percentage of some German colonies is shown. Data specified by error bar , And shows the double average of DISH. Figure 21 Apoptosis by CKβ-8 and CKβ-1 in the presence or absence of hematopoietic growth factor Shows the induction of Rat bone marrow cells contact the tibia from both femurs and The spheres are separated according to the density gradient, and the monocytes move due to plastic adhesion. Cell poppy The volume of IL-3 (5 ng / ml), GM-CSF (5 ng / ml), M-CSF (10 ng / ml) / ml), and cultured overnight in MEM-based medium with the aid of G-CSF (10 ng / ml) Was. In addition, cells were treated with or without CKβ-8 (50 ng / ml) or CKβ-1 (250 ng / ml). Was also cultured. 24 hours later Apo used for Boehringer mannheim cell death ELISA kit Harvested and processed for tosis. Data were individually cultured in the presence of growth factors. This shows an increase in the proportion of the number of occurrences of potosis. FIG. 22 shows the RNA symbolized as CKβ-8 in human monocytes. Newly washed Total RNA consisting of isolated monocytes at 100 U / ml HurIFN-g or 100 ng / ml LPS, or both. Was observed. From each observation, RNA (8 μg) was 1. Electrophoresis on 2% agarose gel And transferred to a nylon cell membrane. CKβ-8nRNA is 32P-labeled cDN Investigate and quantify with A Was Groups occurring in the radiographs were quantified with a densitometer. In accordance with aspects of the present invention, FIGS. 1, 2, and 3 (SEQ ID NO. 2, 4, and 6 each) amino acids It has a sequence and is symbolized as a produced polynucleotide, and has been published on February 9, 1994, NO. 75676 Generated CKβ encoded as cDNA of clone delivered as ATCC deposit -8 polypeptide and February 9, 1994 NO. 75675ATCC Deposited as Deposit Generated MIP-4 polypeptide, encoded as lawn cDNA, and October 13, 1993 NO. 75572 ATCC Deposited as cloned cDNA delivered as deposit Shows the isolation of nucleic acids (polynucleotides) such as CKβ-1 polypeptides . Polynucleotides that are encoded as polypeptides in the present invention include cysteine and Structurally related to the super- "intercrine" family of chemokines . Both CKβ-8 and MIβ-4 are MIP-1 homologous organs, and MIP-1α is more intense than MIP-1β Same. The polynucleotide, labeled CKβ-8, is the cD of the aortic lining tissue. Derived from the NA library, it shows the strong kinetics of numerous chemokines. 120 It also includes an open reading frame, which is symbolized as a polypeptide of the amino acid residue. The first match was for humans represented by 36% identity and 66% similarity (Figure 4). Clophage is located on inflammatory protein 1 alpha. Polynucleotides, symbolized as MIP-4, are a cDNA library of adult lung. Derived from and presents the strong synergy of numerous chemokines. Pol of 89 amino acid residues It also includes an open reading frame, which is symbolized as a peptide. The first mate is 60% LD78-based human tonsillar lymphocytes expressed in identity and 89% similarity (Figure 5) Is a protein. In addition, it occurs in all chemokines of the characteristic morph4 One cysteine residue was kept constant in the two clones. In fact, The first two cysteine residues are in adjacent positions, and the chemokine Ding xC SoA or It is classified as β subfamily. In another subfamily, the first two cysteine residues, Ding xC soot A and α subfamilies are divided by one amino acid. Polynucleotide encoded as CKβ-1, and the first 19 93 amino acid positions The reading frame, labeled reped, is a grown polypeptide containing 74 amino acid residues. Becomes the leader sequence of CKβ-1 has 48% identity and 72% similarity over 80 amino acids It shows important homology with the human macrophage inflammatory protein. You. And the four cysteine residues, including the characteristic morph, were conserved. The polynucleotides of the present invention may be RNA, cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. In the DNA form containing. DNA is in double-stranded or single-stranded form, if single-stranded They are either coded elements or non-coded elements (antisense). Growth polypeptides and coding The coding sequences shown in FIGS. 1, 2, 3 (SEQ ID NO. Coding sequence represented by 1, 3, 5) Sequence that is identical to the clone received, has a different coding sequence, 1, 2, 3 (SEQ ID NO. 1, 3, 5) or the delivered cDNA (s ) Redundancy of the same genetic code or different from the code sequence as a result of degeneracy You may be. The polynucleotides are shown in FIGS. 1, 2, 3 (SEQ ID NO. As shown in 2, 4, 6) Symbolized as a long polypeptide. And the cDNA (s) delivered and encoded Including grown polypeptides. Coding sequence for the grown polypeptide, The coding sequence of the grown polypeptide, and the coding sequence, such as the first or second sequence. Sequence, coding sequence for proprotein sequence, grown polypeptide coding sequence (Optionally added), non-coding sequences such as introns, non-coding Coding sequence for 5 and / or 3 grown polypeptides. Therefore, the concept of a polynucleotide to encode Coding sequences for polypeptides, as well as coding and / or non-coding sequences. Column Polynucleotide. The present invention, which is also related to Hereaabove allodynia, is shown in FIGS. 1, 2, 3 (SEQ ID NO. 2, It has the amino acid sequence deduced in 4, 6), is fragmentary, similar, Peptides and symbolization Polynucleotide of Polypeptide Encoded and Coded as Delivered Clone cDNA Ocide is explained. Polynucleotide variants are naturally occurring polynucleotides. Allelic variants of otide or unnatural spontaneous variants of the polynucleotide . As mentioned above, the present invention relates to FIGS. 1, 2, 3 (SEQ ID NO. 2, 4, 6) A polynucleotide or a polynucleotide, or , 3 (SEQ ID NO. Fragmentally inducible or similar polypeptides of 2, 4, 6) CDNA and symbol of the delivered clone, as well as the variant polynucleotide to be encoded The polypeptide to be converted. Nucleotide variants are variants of gene absence, structures Includes target variants, adducts, or attached variants. As mentioned above, the polynucleotides are likely to be represented in FIGS. 1, 2, 3 (SEQ ID NO. 1, 3 , 5) or the code sequence of the delivered clone It has the coding sequence of the contradictory allodynia that occurred. Known in the humanities As such, contradictory malformation does not structurally alter the symbolic function of the polypeptide, one Polynucleotides with or without substitution of nucleotides, lack of enzymatic cells, and additional properties This is a form in which the code arrangement alternates. The invention also provides that the coding sequence for the mature polypeptide is Melts in the same reading frame with a polynucleotide sequence that promotes lipepide expression and secretion The combined polynucleotide is also included. For example, polypeptides from cells And a leader sequence that functions as a secretory sequence that controls the movement of DNA. Leader arrangement Polypeptides with rows are white matter, and can ripen mature polypeptides. For example, it may have a leader sequence divided by the host cell. Polynucleotides are also mature shochu white matter and extra S tea A amino acid residues It may also code for Goshochu white matter. Mature shochu white matter with post-sequence Shochu white matter in the inactivated state. Once the array is split, Active mature shochu white matter remains. Thus, for example, the polynucleotide of the present invention is a mature shochu white matter, Is the shochu white matter with the back sequence, or both the back sequence and the front sequence (leader sequence). Encode the shochu white matter you have. In addition, the polynucleotide of the present invention comprises a marker arranged for each reading frame by coding sequence. To enable purification of the polypeptide. The marker sequence is In some cases, the pQE-9 vector was used to purify the mature polypeptide fused to the marker. A hexahistidine tag supplied by the May be a hemagglutinin (HA) tag when using mammalian host cells such as S-7 cells You. The HA tag is compatible with epitopes derived from influenza hemagglutinating shochu white matter. (Wilson, I. , etall. , Cell, 37: 767 (1984)). Further, the present invention provides a method as described above, wherein the identity between the sequences is at least 50%, preferably 70%. It also relates to polynucleotides that hybridize to the sequence. In particular, the present invention And polynucleotides hybridizing to the aforementioned polynucleotides. here The "stringent conditions" used are that sequences match at least 95%, preferably at least 97% It means crossing that only occurs when. Under the preferred conditions The hybridizing polynucleotides are shown in FIGS. 1, 2, and 3 (SEQ ID No. 1, 3, 5) cDNA, or Or substantially the same biology as the mature polypeptide encoded by the deposited cDNA. A polypeptide that retains a functional function or activity can be encoded. Instead, the polynucleotide should have a minimum of 20 bases, preferably 30 or more, And preferably, it has at least 50 bases and is capable of interfering with the polynucleotide of the invention Polynucleotides that are cluttered and identical as described above and therefore do not retain activity May be. Such a polynucleotide is, for example, SEQ ID NO. 1, 3, 5 poly As a nucleotide probe, for polynucleotide recovery or diagnostics It can be used as a probe or a PCR primer. Deposits referred to herein are, for patent purposes, International Retail c-ognition of the Deposit of Micro-organisms The Budapest Treaty. These deposits are available to experts in this field Provided for convenience and 35U. S. C. § 112 requires deposits I do not admit that. Sequence of the polynucleotide contained in the deposited material, And the amino acid sequences of the polypeptides encoded thereby It shall be included in the invention and takes precedence in the event of a dispute over the description of the sequence. Sinking A license is required to manufacture, use, or sell License is not conferred by the present invention. The present invention further relates to FIGS. 1, 2, and 3 (SEQ ID No. 2, 4, and 6) Amino acid sequences, or deposited cDNA, as well as fragments, analogs, and CkB-b, MIP-4, having an amino acid sequence encoded by a derivative of the repeptide , And “fragments”, “derivatives”, and “analogs” are described in FIGS. 1, 2, 3 (SEQ ID NO. 2, 4, 6), or depending on the deposited cDNA. If encoded, the polypeptide is essentially the same as such a polypeptide. A polypeptide that retains a physical function and activity. Thus, analogs may include Production of polypeptides activated and matured by activation by splitting protein part After the protein is included. The polypeptide of the present invention may be a recombinant polypeptide, a natural or synthetic polypeptide. It is a card, but preferably a recombinant polypeptide. Figures 1, 2, and 3 (SEQ ID No. 2, 4, and 6) polypeptides, or deposited Fragments, derivatives, and analogs of polypeptides encoded by the cDNAs include: (i) one or more amino acid residues are conserved, or (Preferably conserved amino acid residues) and the substituted amino acid residues The base is coded with or without the code, (ii) Or more amino acid residues containing a substituent, (iii) mature polypeptide However, compounds that increase the half-life of the polypeptide (for example, ), Fused to another compound, or (iv) an additional amino acid Used for purification of leader or secretory sequences or mature polypeptides Sequence, or shochu white matter sequence, etc. fused to mature polypeptide , There is. Such fragments, derivatives, and analogs are within the reach of experts in the field. Is within. The polypeptides of the present invention are provided, preferably, in isolated form and are uniformly purified. The one made is good. "Gene" or "cistron" refers to the production of a polypeptide chain Means DNA area. This includes before the code area (leader and trailer) Later regions and intervening sequences (introns) between individual coding segments (exons). I will. “Isolated” means that the substance is in its natural environment (eg, one that occurs naturally). (If any) means that the substance is removed from the natural environment. For example, alive A naturally occurring polynucleotide or polypeptide present in any animal has been isolated Also Not the same, but separated from some or all of the substances that coexist in the natural system The polynucleotide, DNA, or polypeptide is isolated. this Such polynucleotides may be part of a vector, or such a polynucleotide. Or polypeptide can be part of the composition, but nevertheless Isolated in that the vector or composition is not part of the natural environment In addition, the present invention provides a vector comprising the polynucleotide of the present invention, a vector comprising the polynucleotide of the present invention. Host cells that have been engineered in the It is also related to peptide generation. A host cell may be a vector of the present invention, for example, a cloning vector or an expression vector. Genetically engineered (transduction or transformation, or Transfected) cells. Vectors include, for example, plasmids, Luth molecules, phages and the like. The created host cell activated the promoter To select transformants and amplify CkB-8, MIP-4, and CkB-1 genes To do so, the cells can be cultured in traditional culture media that have been appropriately modified. temperature, Conditions for the culture medium, such as pH, are the conditions used for the host cell previously selected for expression. The conditions are usually obvious to the skilled technician. The polynucleotide of this expression can be used for recombinant polypeptide production. it can. Thus, for example, a polynucleotide sequence specifically expresses a polypeptide. Included in various expression media, such as a vector or plasmid. like that Vectors include chromosomal DNA, non-chromosomal DNA, or synthetic DNA sequences, such as SV40 Derivatives, bacterial plasmids, phage DNA, yeast plasmids, plasmids and Vectors derived from a combination of phage DNA, and pox, adenovirus Virus, fowlpox virus, pseudorabies, etc. However, any other plasmid or vector can be regenerated in the host cell. It can be used if it is manufacturable and viable. The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector by various methods. You. In general, the DNA sequence is routinely placed at the appropriate restriction endonuclease site. Is inserted. Such procedures and other procedures are within the scope of experts in this field. Is within The DNA sequence of the expression vector is artificially inserted into an appropriate expression control sequence (promoter). Linked to direct mRNA synthesis. A typical example of such a promoter is LT R or SV40 promoter, E. coli, lactose operon, or tryptophan Phage lambda P promoter and prokaryotic or nucleated cells, or And other promoters that are thought to control virus gene expression. The expression vector also contains ribosomes for the translation initiation and transcription termination regions. A binding site is included. In addition, the vector contains a sequence suitable for enhancing expression. Have been. Furthermore, the expression vector should preferably contain dihydrofolate reductase or nucleated cell culture medium. Neomycin resistance or tetracycline resistance or Phenotypic traits for selecting transformed host cells, such as resistance to ampicillin It is better to include a gene that gives Include the appropriate DAN sequence as described above, the appropriate promoter or control sequences. A vector is used to transform a suitable host cell and express the protein in the host cell. Can be used to Representative examples of suitable host cells include bacterial cells such as E. coli, streptomyces. Fungal cells such as actinomycetes, Salmonella typhimurium, and yeast of the genus Seth, Drosophila melanogaster Insect cells such as genus S2 and Sf9, adenovirus, CHO, COS, Bowes melanoma, plant cells Vesicle And so on. Selection of the appropriate host cell is within the skill of an expert in the field described herein. You. More specifically, the present invention also comprises one or more of the aforementioned sequences. And the recombination structure to be used. Such a recombinant structure can Vectors such as plasmids and virus vectors inserted in the forward or reverse direction Consists of In addition, the recombination structure can be, for example, a promoter artificially linked to the sequence. And a regulatory base sequence containing Many suitable vectors and promoters It is known among experts and is commercially available. The following vectors and programs A motor is an example. Bacterial: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH4 6A (Stratagene), pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), Nucleated organisms: PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pM SG, pSVL (Pharmacia). However, with any other plasmid or vector, It may be used if it is reproducible and viable in the host cell. The promoter region is a CAT (chloramphenicol transferase) vector Gene or other vector with a selectable marker You can choose from. Such suitable vectors include PKK232-8 and PC There are two of M7. Specific named bacterial promoters include lacI, lacZ, T3, T7 , Gpt, lambda P [ilegible], Pl, and trp. Nucleated promoters include C MV (immediate and early), HSV thymidine kinase, early and late SV40, retrovirus LTR from Lus, and mouse metallothionein-I. The appropriate vector And the choice of promoter can be made within the scope of normal level of expertise. It is. The invention further relates to a host cell having the above-described recombinant structure. Host cells Is a highly nucleated cell, such as a mammalian cell, or a low-grade nucleated cell, such as a yeast cell Alternatively, the host cell may be a prokaryotic cell, such as a bacterial cell. Recombination structure Transfection of host cells with calcium phosphate transfection, DEAE-dex Tranfection-mediated transfection or electroporation (Dav is, L. , Dibner, M. , Battey, I. , Basic Methods in Molecular Biology, (1986)) Is achieved. The organization within the host cell is the same as that encoded by the recombinant sequence by traditional methods. Can be used to generate gene products. In addition, the polypeptide of the present invention can be prepared using a conventional peptide. Can also be synthesized by a synthesizer Mature shochu white matter can be obtained from mammals, yeast, bacteria, Or it can be expressed in other cells. Cell-free translation system In addition, such shochu white matter can be obtained by using RNA derived from the DNA composition of the present invention. Can be used to generate Suitable for prokaryotic and nucleated cell hosts Cloning and expression vectors are described in Sambrook, etall. , Molecular Clon ing; A Laboratory manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989) And included by reference in the present invention. Transcription of a DNA encoding the polypeptide of the present invention by highly eukaryotic organisms It can be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancer, DN A cis-acting element, usually about 10 to 300 bp To increase its transcription. SV40 enhancer at the late stage of the replication source bp 100-270, macroscopic Vesicle virus early promoter enhancer, polyomavirus late in the replication origin Enhancers and adenovirus enhancers are examples Generally, recombinant expression vectors include, for example, E. coli ampicillin-resistant Remains Messengers and s. cerevisiae TRP1 gene and other replication sources that enable transformation of host cells Contains selectable markers and directs transcription of downstream structural sequences Includes promoters derived from highly expressed genes. Such promoters include, among others, 3-phosphoglycerate kinase (PGR), Such as alpha factor, acid phosphatase, or heat shock protein It can be extracted from operons that encode glycolytic enzymes. Heterogeneous sequence, translation initiation And the termination sequence, preferably the secretion of translated protein, into the space around the plasma. Or appropriate steps, such as leader sequences that can be redirected to extracellular mediators. Assembled based on it. Optionally, the heterologous structural sequence can N-term to convey stabilization or simplified purification of expressed recombinant products, for example Can encode fusion proteins containing inal identification peptides Useful expression vectors for bacterial use include your preferred shochu white matter and appropriate translation initiation and The structural DNA sequence encoding the termination signal is manipulated using a functional promoter. It can be assembled by inserting at the read stage where it can be made. vector Comprises one or more phenotypic selectable markers, and an origin of replication, Provide for maintenance of the vector and, if desired, amplification in the host. Boring Suitable prokaryotic hosts for E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, and Contains various types of Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus, etc. Others can be used if desired. By way of non-limiting example, expression vectors useful for bacterial use are well known. Constructs the genetic elements of the known cloning vector pBR322 (ATCC3717) , Selectable markers derived from commercial plasmids, and bacterial origins of replication There is. Such commercially available vectors include, for example, pKK22303 (Pharmacia F ine Chemi-cals, Uppsala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) Is mentioned. The backbone part of these pBR322 Combined with the structural sequence to be expressed. After the appropriate host strain has been transformed and the host strain has grown to the appropriate density, Introduce the promoter by any appropriate means (eg, temperature conversion or chemical introduction) to Culture for a certain period of time Cells are usually harvested by centrifugation and separated by physical or chemical means. Then, the extract itself is further purified. Bacterial cells used for the expression of shochu white matter were subjected to freeze-thaw cycles, sonication, Splitting can be done in any convenient way, such as by mechanical splitting or by using a lytic agent. it can. Such methods are well known to those skilled in the art. Various mammalian cell culture systems are used for recombinant protein expression. can be p. An example of a mammalian expression system is described in Gluzman, Cell, 23: 175. Monkey kidney fibroblast cell line COS-7 Other cells such as C127, 3T3, CHO, HeLa, BHK cell lines. From mammals The current vector contains an origin of replication, appropriate promoters and enhancers, and Ribosome binding site, polyA site, conjugate donor and acceptor sites , A transcription termination sequence, and an S-side non-transcription sequence. Introduced in SV40 junction DNA sequence and poly A site are used to provide the required non-transcribed genetic elements be able to. CkB-B, MIP-4, and CkB-1 are ammonium sulfate or ethanol precipitated, Acid extraction, anion or cation exchange chromatography, cellulose phosphate chromatograph Chromatography, fast-water interaction chromatography, affinity chromatography Chromatography, hydroxyapatite chromatography, and lectin chromatography Tog It is removed from the recombinant cell culture by a method such as Raffi and purified. Shochu white matter refolding is necessary to complete the composition of mature shochu white matter Can be used. Finally, the final purification step involves high performance liquid chromatography (HPL C) can be used. The polypeptide of the present invention may be a naturally purified product, or a chemically synthesized product, or Prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, solvented bacteria, yeast, higher plants, insects, and And mammalian cells) by recombinant manipulation. Recombinant Depending on the host cell used in the production method, the polypeptides of the invention may be mammalian or mammalian. May be sugar white matter due to other nucleated carbohydrates or non-sugar white matter. You. The polypeptides of the invention also include a first medinin amino acid residue. . The polypeptides of the present invention have a variety of immunoregulatory and inflammatory functions, as well as numerous It can be used for many disease symptoms. CkB-8, MIP-4, and CkB-1 are available from chemoki belongs to the ne tribe, and therefore contains white blood cells (mononuclear leukocytes, neutral neutrophils, T lymphocytes, Syn-philic leukocytes, basophil leukocytes, etc.). In NorthernBlot analysis, CkB-8, MIP-4, and CkB-1 were predominantly hematopoietic tissues. Is expressed in CkB-8 turns out to play a key role in regulating immune response and inflammation I have. Figure 22 shows that lipopolysaccharide induces CkB-8 expression from human mononuclear leukocytes. Are shown. Therefore, as a response to the presence of endotoxin, CkB-8 Because expressed from monocytes, CkB-8 is used to regulate the immune response of host cells. Administration can be employed. As shown in FIG. 10, formation of Ckβ-B in THP-1 cells (A) and PBMCs (B) Attractant activity is very important. In addition, Ckβ-B is Attract mobilization (Fig. 11). As a result, Ckβ-B has a biological effect on monocytes You can see that there is. In addition, Ckβ-B is administered to human monocytes in a dose-dependent Causes an umbilical mobilization reaction. Therefore, Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 are targeted Used to promote wound healing by controlling wetting can do. Similarly, the polypeptides invented this time are Host defense against chronic inflammation (such as microbial) by attracting and activating spheres Strengthen. Furthermore, the polypeptides invented this time can be used as antitumor therapy. It is said that it may be. This is because of the treatment of Karposi's sarcoma. Injection of chemokine cells into the tumor This is because there are demonstration cases. According to the analysis of FIG. 12 and FIG. 13, Ckβ-B was obtained from THP-1 cells. To secrete TNF-α, a known inhibitory drug that promotes tumor regression I'm crazy. 250 ng / ml Ckβ-B produces 1200 picograms / ml TNF-α ・ Secrets. Ckβ-B is also used for other tumors and cancers, such as monocytes, IL-6, IL-1, and G-CSF. Secretes inhibitory agents. In addition, Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 Stimulates invasion and activation of (tumoricidal) cells (cytotoxic T cells, macrophages, etc.) I do. The method can also be used to treat solid tumors. Polypeptides can be used to suppress the growth and differentiation of hematopoietic cells. To Is used to protect bone marrow basal cells from agonists during chemotherapy. it can. FIG. 14 and FIG. 15 show that Ckβ-B and Ckβ-1 Suppresses colonies, and Ckβ-B is effective for growing LPP-CFC colonies It proves to be the best inhibitor. Figure 16 shows that Ckβ-1 was inspired by M-CSF- Very good control of colony fatigue and Ckβ-B does not work here Clarify that I'm doing it. However, as already shown, both Ckβ-B and -Ckβ-1 Effectively suppresses proliferation and differentiation of bone marrow base cells. This antiproliferative effect is due to chemotherapy Allows for increased doses of the drug, thus making chemotherapy more effective. In a subpopulation of committed progenitor cells (granulocytes and macrophage cells / monocyte cells) The inhibitory effect of Ckβ-B and Ckβ-1 polypeptides is a treatment that suppresses the proliferation of white blood cells. Can be used for treatment. In FIG. 17, FIG. 18 and FIG. The resulting cell population is contacted with Ckβ-B and Ckβ-1. Ckβ -1 reduces Mac-1 positive collective cells by nearly 50 percent. This is because Ckβ-1 is M-C This is consistent with the result of FIG. 16 showing that the suppression of SF-reactive colony forming cells was promoted. ing. As shown in FIG. 19, Ckβ-B is a committed precursor cell IL-3, GM-CSF, Responds to M-CSF and suppresses the ability to form colonies. Further, shown in FIG. As described above, the reaction of taking Ckβ-B suppresses colony formation. This suppression effect Specific blockers of differentiation signals mediated by these factors, or specificity in precursor cells This is due to the cystic damage effect. Another use of polypeptides is the inhibition of IL-2 biosynthesis by reducing T cell size. Cell proliferation (autoimmune disease, lymphocytic leukemia, etc.) can also be suppressed. In addition, Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 Epidermal keratin, which produces psoriasis (keratinocyte hyperproliferation) It can be used to control the growth of noocytes. Ckβ-B, MIP-4, Ckβ-1 remove debris and continuously promote tissue to inflammatory cells Both, and by controlling excess TGPβ-mediated fibers, It can be used to prevent scarring that occurs during wound healing. Furthermore, Ckβ-B, MIP-4, Ck Because β-1 enhances vascular permeability, these polypeptides are It can be used to treat diseases, emboli, and myeloproliferative disorders. Ckβ-B is apoptosis Used to treat leukemia and abnormal cell proliferation (tumor cells, etc.) it can. As shown in FIG. 21, Ckβ-B is apoptotic in hematopoietic progenitor cell populations. To attract. The polypeptides invented this time and the polynucleotides encoding them Otides are relevant for in vitro purposes such as scientific research, DNA synthesis, and production of DNA vectors Can be used as a reagent or as a research reagent to develop therapeutic or diagnostic methods for disease treatment . For example, Ckβ-B and Ckβ-1 can become immature by temporarily suppressing differentiation. It can be used to expand hematopoietic progenitor cells (granulocytes, macrophages, monocytes, etc.). this These bone marrow cells can be cultured in vitro. The full-length Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 genes isolate full-length genes and Inheritance whose sequence is very similar to the offspring or whose biological activities are similar Can be used as a hybridization probe for cDNA libraries to isolate offspring Wear. Probes contain at least 30 bases, preferably more than 50 bases Is ideal. Probes can be full-length transcribed and genomic clones, or law regions A clone containing the complete gene, with the promoter region, exons, and introns Can be used to identify matching cDNA clones. As an example of screening Uses a known DNA sequence to synthesize an oligonucleotide probe. There are ways to isolate the coding region of a gene by using it. The labeled oligonucleotide having sequence complementation to the gene invented this time is Screens human cDNA, genomic DNA and mRNA libraries, and which library group Used to determine if the probe will hybridize to The present invention also relates to diseases associated with mutations in nucleic acid sequences and Use of the Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 genes as part of a diagnostic analysis to detect sensitivity It is also relevant for use. These diseases result in insufficient expression of chemokine polypeptides. Relation are doing. Human mutations in Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 can be Can be detected at the DNA level. Diagnostic nucleic acids include blood, urine, saliva, It can be obtained from patient's cells such as tissue, biopsy, necropsy. Genomic DNA is directly generated Can be used for viewing or enzymatically amplified using PCR before analysis . (Saiki etal. , Nature, 324: 163-166 (1986)) Also use RNA and cDNA for the same purpose be able to. For example, for nucleic acids encoding Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1, Complementary PCR primers are used to identify and analyze Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 mutations can do. For example, gene deletions and insertions The change in size of the amplified product can be detected. Point mutations release amplified DNA Radiolabeled Ckβ-B, MIP-4, Ckβ-1 RNA, or radiolabeled Ckβ-B , MIP-4, identified by hybridizing to Ckβ-1 antisense DNA sequence can do. Perfectly matched sequences are not possible due to differences in RNaseA digestion and dissolution temperatures. Can be distinguished from matching duplexes. Genetic tests based on DNA sequence differences include or include denaturing agents By detecting changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments in a gel Can be completed. Small deletions or insertions in the gene sequence Can be seen by electrophoresis. DNA fragments with different sequences are Lumamide gradient gel (here, the mobility of different DNA fragments Is delayed at any position by a specific melting temperature or partial melting temperature). You can tell. (e. g. , Myersetal, Science, 230: 1242 (1985)) Sequences that change at specific locations may be protected by RNase protection, SL protection or chemical splitting Can be revealed by an enzyme nuclease protection assay. (e. g. , Cotto n et al. , PNA. USA. 85: 4397-4401 (1985)) Therefore, specific DNA sequence detection is based on hybridization, RNase protection, Drug resolution, direct DNA sequencing, or restriction enzymes (e.g., restriction fragment length polymorphism (RFLP)) Or by using Southern blots of genomic DNA. You. In-situ analysis in addition to conventional gel-electrophoresis and DNA sequencing Can also be detected. Protein is overexpressed compared to a sample of a normally controlled tissue. In some cases, it may detect the presence of a disease (such as a tumor) or susceptibility to the disease. Therefore, the present invention has been developed for Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 proteins in all tissues. It is also relevant for diagnostic analysis to detect change levels. Sun removed from host Assays to detect levels of Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 proteins in pulls are Well-known to the detailed people. These analyzes include radioimmunoassays, competitive Analysis, Western blot analysis, Elisa (ELISA) analysis, "sandwich" analysis and so on. Elisa (ELISA) analysis (Coligan, et al. , Current Prolocols in Immuno logy, 1 (2). Chapter 6, (1991)) first addresses Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 antigens. Prepare an antibody (ideally a monoclonal antibody). And against monoclonal antibodies. Prepare the porter antibody. Reporter antibodies include radioactivity, fluorescence, especially A detectable reagent, such as horseradish peroxidase enzyme, is attached. Sump The sample is removed from the host and fixed support is used to bind the proteins in the And incubated on a plate (such as a polyethylene dish). And freedom on the plate Protein binding sites can be incubated with unspecified proteins such as BSA. Therefore it is covered. Next, Ckβ-B, MI attached monoclonal antibody to polyethylene dish Monoclonal antibodies were incubated on the plate while binding to P-4, Ckβ-1 protein. It is. All unbound monoclonal antibodies are washed away with the buffer. Western Wasabi peroxidase and phosphorus Reported reporter antibody is used for any monoclonal antibody associated with Ckβ-B, MIP-4, or Ckβ-1. And remains on the dish. Then, unbound reporter antibody is washed away You. Then the peroxidase substrate is added to the dish. And the color within the time limit Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 proteins contained in patient samples Measure and compare to standard curve. Competition analysis was performed on fixed support and labeled Ckβ-B, MIP-4, Ckβ-1 Antibodies to attached Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 or fixed supports Can be used for samples taken from a host. Detected label Is the amount of protein in the sample (eg, liquid scintillation chromatography). Correlates with quality quantity. The "sandwich" analysis is similar to the Elisa (ELISA) analysis. "Sandy In the `` stitch '' analysis, Ckβ-B, MIP-4, and Ckβ-1 were Binds to the antibody attached to the plate. And the second antibody binds to Ckβ-B, MIP-4 and Ckβ-1 Combine. Then the labeled third antibody for the second antibody is fixed support And binds to the second antibody, which allows quantification. The present invention provides a method for identifying a receptor for a chemokine polypeptide. providing. Receptor-encoding genes include Lingado Panning and FACS Identify in any way familiar to those familiar with the field, such as sorting be able to. (Coligan et al. , Current Protocols in Immu. . 1 (2), Chapter 5. ( 1991)) Expression cloning converts polyadenylic acid groups into polypeptides from cellular reactions. Prepare and differentiate the cDNA library created from this RNA into pools, COS cells or It can be used to transfect cells that do not respond to other polypeptides. Transfected cells grown on glass slides are transformed into labeled polypeptides. Be sent. Polypeptides are iodinated and recognize specific site protein kinases. It can be labeled in any number of ways, including encapsulation. Next immobilization and a During incubation, slides are subjected to autoradiographic analysis. Positive pools were identified and the interaction subpooling process and rescreening Subpools are produced and re-transfected using Identified by producing a single clone encoding the above receptor . As another approach to receptor identification, labeled and The peptide is combined with a cell membrane or extract product representing the receptor molecule and photoaffinity phosphorous. Can be The cross-linked material is decomposed by PAGE analysis and X Exposure to line film. Labeled complexes containing polypeptide receptors Objects may be cut off, broken down into peptide fragments, or exposed to small white matter arrays. Or you can. The amino acid sequence obtained from the small sequence is a putative receptor To screen a cDNA library that identifies the remaining cells that encode It can be used to design a set of oligonucleotide probes. The present invention relates to an agonist for the chemokine polypeptide of the present invention. And screening methods for compounds. You. An agonist is a compound that has a biologically similar function to a polypeptide . Antagonists also interfere with such functions. Chemical tropism was invented this time To allow cells scientifically attracted by any of the polypeptides By placing it on a porous filter of sufficient diameter (5 μm). Can be analyzed. Latent agonist solutions are located at the top of the chamber. With the appropriate control medium at the bottom of the chamber. In this way The concentrated gradient of the strike moves through the porous membrane after a period of time It can be measured by counting cells. When analyzing antagonists, the chemokine polypeptides invented this time At the bottom of the chamber, add potential antagonists and reduce chemotropy See if there is. Alternatively, expressing a receptor for a mammalian cell or polypeptide Membrane specimens are labeled with chemokine polypeptide (released) Radioactivity, etc.). In this way, the compound The ability to interfere with the use can be measured. When an agonist is analyzed in this way, With the disappearance of mokine, the ability of the agonist itself to interact with the receptor was measured. Can be specified. Examples of CK-β, MIP-4, CK-1 potential antagonists include antibodies, and in certain instances Is contained in the oligonucleotide associated with the polypeptide . Another example of a potential antagonist is a polypeptide with a negative potency. There is a sex mutation. Negative dominant mutations are receptors for all types of polypeptides. Polypeptide that is unable to retain biological activity while bound to a protein It is. There are also antisense configurations produced using antisense technology. It is a potential antagonist. Antisense technology uses triple helix formation and Antisense DNA-RNA (both methods bind polynucleotide to DNA or RNA To control gene expression through Can be. For example, a polynucleic acid encoding the mature polypeptide of the present invention The S tea R potion of the leotide sequence is approximately 10 to 40 base pairs in length, Have been used to design antisense RNA oligonucleotides. DNA oligonucleotide Nucleotides are designed to be complementary to gene sites involved in transcription. (triple-helix, Lee et al. , Nucl. Acids Res. , 6: 3073 (1979); Cooney et al Scien ce, 241: 456 (1988); and Dervan et al. , Science. 251: 1360 (1991)) Thus, transcription and production of chemokine polypeptides are suppressed. Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo, and mRNA molecules Prevents change to repeptide. (antisense-Okano, J. Neurochem. , 56: 560 (1991) ; Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, B oca Raton, FL (1988)) In addition, the aforementioned oligonucleotide is a chemokine polypeptide. As antisense RNA or DNA that suppresses peptide production is expressed in vivo Delivered to cells. Another potential chemokine antagonist is naturally There are synthetically modified analogs, peptide derivatives of polypeptides. This is a living thing Biological function, but recognizes and binds to the polypeptide receptor. Is an analog of a polypeptide that effectively interferes with the receptor. Peptide induction Examples of bodies include small or similar peptide molecules, and the like. Antagonists may impair MIP attraction / enhancement (autoimmunity, chronic inflammation, infectious diseases Etc.). Examples of autoimmune diseases include If you have loose sclerosis or insulin-dependent diabetes. Antagonists block the recruitment and activation of mononuclear phagocytes, thereby It can be used to treat infectious diseases such as lung disease, sarcoidosis, and idiopathic pulmonary fibrosis. Can be. Antagonists also inhibit the production and migration of eosinophils, It can be used for the treatment of spontaneous hyperacidosis. Endotoxin shock A gonist prevents the migration of macrophages, and the chemokine polype It can be treated by producing the peptide. Antagonists inhibit atherosclerosis by preventing monocyte infiltration at the walls of arteries Can be used to treat arteriosclerosis. In addition, antagonists include chemokine-induced mast cells, basophil degranulation, Suppresses stamin release, resulting in delayed phase allergic reactions, chronic urticaria Histamine-mediated allergic reactions, such as, atopic dermatitis, and histamine It can be used to treat mediated immunological disorders. Also allergic IgE-mediated allergic reactions such as asthma, allergic rhinitis and allergic dermatitis Can be treated. Antagonists also prevent monocytes from entering the wound, -Can be used to treat acute inflammation. In addition, chronic and acute inflammatory Because pulmonary disease is related to the monocyte phagocyte sequence in the lung, It can be used to regulate the normal lung macrophage population. Antagonists also prevent monocytes from entering synovial fluid in the patient's joints. And can be used to treat rheumatoid arthritis. Monocyte Influx and activation play important roles in the pathogenesis of both degenerative and inflammatory arthritis Play. Antagonists also interfere with deleterious cascades primarily belonging to IL-1 and TNF. Can be used to prevent the biosynthesis of other inflammatory cytokines. This way Thus, antagonists can be used to prevent inflammation. Also, Antagonists are chemokine-induced prostaglandin-independent heat Can be used to control In addition, antagonists are used to treat bone marrow failure such as aplastic asthma and myelodysplasia. Can be used to treat cases. Antagonists also prevent asthma and / or asthma by preventing eosinophil accumulation in the lungs. It can be used to treat allergies. Also, antagonists may be For treating accessory epithelial basal membrane fibrosis, a hallmark feature of Can be. Antagonists may be used as components of a pharmaceutically acceptable carrier, as in the examples below. Can be Chemokine polypeptides, agonists and antagonists are It can be used as a component with the rear. These ingredients are therapeutically effective. Effective amount of polypeptide and pharmaceutically acceptable carrier or excipient It is composed of These carriers include saline, buffered saline, Dextrose, water, glycerol, ethanol, a combination of the above components, Including others. The formulation must conform to the mode of drug administration. The invention is also directed to a drug component, one or more of which are now invented. Drug packs or kits having one or more containers are provided. this These containers contain prescriptions by administrative agencies that regulate the production and sale of pharmaceutical and biological products. It comes with a notice in the form. This notice states that government agencies should not This indicates that production and sales were allowed for the sake of giving. In addition, polypeptides, Gonists and antagonists can be used to bind other therapeutic compounds it can. Pharmaceutical ingredients can be routed topically, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, etc. And can be administered in any convenient manner. Pharmaceutical ingredients can be treated and / or identified Administer an effective amount to prevent the signs of. In general, polypeptide Administer a minimum of 10 μg / kg body weight and a maximum of less than about 8 mg / kg body weight. Almost In the case of, the dose is about 10μg / kg every day, taking into account administration, symptoms and other routes. From body weight to 1 mg / kg body weight. Also, according to the present invention, chemokine polypeptides and polypeptides are used. Agonists and antagonists are used to express polypeptides in the body can do. This is often referred to as "gene therapy". This allows, for example, cells removed from a patient to transform the polypeptide in vitro. Design with the polynucleotide to be encoded (DNA or RNA) Can be provided together with the polypeptide to the patient to be treated. This way Are well known in the art. For example, cells are Can be designed in order. It encodes the polypeptide of the present invention. This is a method using retroviral particles containing RNA. Similar to this, cells are designed to express polypeptides in vivo Is done. In vivo, for example, is a procedure known in the art. This As is known in the art, RNA encoding the polypeptide of the present invention is Production cell lines that produce retroviral particles, including cells designed in vivo And can be administered to patients to express the polypeptide in vivo. You. There are other ways to administer the polypeptides invented this time. These methods are , Teaching this invention should be obvious to those familiar with the field It is. For example, the expression bath for the designed cells may be other than a retrovirus, for example, After being combined with an appropriate delivery medium, it can be used to design cells in vivo. Yes, it may be an adenovirus. Retroviral plasmid vectors include Moloney, mouse sarcoma virus , Moloney mouse leukemia virus, spleen necrosis virus, Rous sarcoma virus, -Can be extracted from retroviruses, including Bay sarcoma virus, etc. You. In a preferred embodiment, the retroviral expression vector, pMV-7, is -Herpes simplex virus flanked by mouse sarcoma virus long terminal repeats (LTPs) (HSV) Selectable drug resistance genes under thymidine kinase (tk) regulation Contains o. Unique BcoRI and HindIII sites facilitate insertion of the sequence code. (Kir schmeier, P. T. et al. , DNA, 7: 219-25 (1988)) Vectors include retroviral LTR; SV40 promoter; human cytomegalo Virus (CMV) promoter (CMV) (Miller, et al. , Biolechniques, Vol. 7, No. 9 980-990 (1989)) or other cellular promoters (histamine, polIII Eukaryotic cell promoters, including β-acumin promoters, etc.) Well, have an appropriate promoter. Selection of an appropriate promoter is provided here Revealed to those familiar with this field by the professor. The nucleic acid sequence encoding the polypeptide, which was invented this time, comprises a herpes simplex virus Midin kinase, retroviral LTRs, beta ac promoter, polypeptide Virus promoters, such as natural promoters, that control It is under the control of a suitable promoter, including the gin kinase promoter and others. Retroviral plasmid vectors characterize packaging cell lines Can be introduced and used to form process cell lines. Can be transfected Examples of potential packaging cells include PR501, PA317, GP + am12, and others. is there. The vector may be transduced by any method known in the art. No. These methods include electroporation, the use of liposomes and precipitated CaPO4, and others. is there. The producer cell line produces infectious retroviral vector particles, which Contains a nucleic acid sequence that encodes the polypeptide. This retro Lus vector particles are used to transform eukaryotic cells in vitro or in vivo. Can be used. Transformed eukaryotic cells encode polypeptides Nucleic acid continuum is expressed. Eukaryotic cells that are converted include fibroblasts and internal Including skin cells However, the present invention is not limited to these. The continuum of the present invention is also valuable for chromosome identification. Especially the continuum Target and cross specific areas of an individual's chromosome . More than that, there is now a need to identify specific locations on chromosomes. That's it. Chromosome marking reagent based on actual continuum data There is very little to mark now. DNA to chromosome according to the invention [Mapping] correlates their continuum with disease-related genes This is an important first step in doing things. Briefly, the continuum is derived from cDNA by PCR primers (15-25b By preparing (p is desirable), it is possible to arrange on a chromosome. Expansion Spread more than one exon in genomic DNA to avoid complicating the process The cDNA is analyzed by computer to quickly select the right primer. then, These primers are used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual chromosomes. Used for ning. A hybrid containing the human gene encoding the primer Only will produce enlarged pieces. PCR mapping of somatic cell hybrids converts specific DNA to specific chromosomes. This is a quick way to assign. Use the invention on the same oligonucleotide And a panel of small pieces from a particular chromosome or a large genome (genomic) For a collection of clones, subloc alization). Other mappings that can be used to locate to similar chromosomes Hybridization strategies include hybridization in the normal position, labeled and flow-classified staining Pre-screening of the body and making a library of chromosome-specific cDNA There is pre-selection by hybrid formation for Hybridization at the normal position of fluorescence for metaphase chromosome spreading of cDNq clones (FISH) is used to provide accurate chromosomal location in one step. Can be This technique works for short cs, such as 500-600 basis It can be used up to DNq. This technique is described in Verma et al. , H uman Chromsomes: a Manual of Basic Techniques See manual of Pergamon Press, New York (1988). . Once the continuum is located at the exact chromosome location, the chromosome of that continuum The above physical location can be correlated with genetic map data. Yes Data, for example, McKusick, Mendelian Inheritance in Man Mendelian genetics in the field) (from Jones Hopkins University Welch Medical Library) (Available online). On the same chromosome site The located genes and diseases are then analyzed by linkage analysis (the sharing of physically adjacent genes). Same inheritance). Next, the cDNq or geno between the squared individual and the unsquared individual It is necessary to determine the differences in the continuum. If the mutation is in the individual If observed by some or all of the individuals and not by any of the normal individuals, Mutations are thought to be responsible for the disease. Elucidation of current physical and genetic mapping techniques In, the cDNA precisely localized to the chromosomal site associated with the disease is 50 To 500 potential causative genes. A polypeptide, a piece or other derivative thereof, or the like, or Are the cells that represent it, as an immunogen to produce antibodies against it. Can be used. These antibodies are, for example, polyclonal or monoclonal. It can be an antibody. The invention also includes chimeric, single-chain, and ,Man Antibodies adapted to the body, as well as Fab fragments or Fab expression libraries Products are included. The production of such antibodies and fragments is known in the art. Various methods can be used. Antibodies generated against the polypeptide encoding the continuum of the present invention, or antibodies thereof Receptive organs in the living body are created by injecting the peptide directly into the animal body. Alternatively, the polypeptide may be administered to an animal, preferably a non-human animal. Can be obtained. The antibody obtained in this way coagulates the polypeptide itself Will let you. In this way, a continuum encoding only one piece of a polypeptide Even those used to generate antibodies that coagulate the entire original polypeptide can be used. Can be. For example, Hypridoma's technique (Kchler and Milsteirn, 19 75, Nature, 256: 495-497), Trioma technique, human B cell hybrid Ma technique (Kozbor et al. 1983, Immunology Today 4; 72) and human RBV-Hybridoma technique for monoclonal antibody production (Cole, et al. , 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy) A), AlanR. Lize, Inc. , pp. 77-96). Techniques described for the production of single chain antibodies (U.S. Pat. No. 4,946,778) To produce a single chain antibody to the immunogenic polypeptide product of the present invention. Can be adapted. Also, using a transgenic mouse, Adapted antibodies can also be expressed in the immunogenic polypeptide products of the invention. . The present invention will be further described in connection with the following examples. Only However, it is necessary to understand that the present invention is not limited to these examples. It is necessary. All percentages or amounts are by weight unless otherwise indicated. below Frequently used methods and / or terms to facilitate understanding of the examples Let me state. “Plasmids” are capitalized letters before and / or after a lowercase p and / Or represented by a number. The original plasmid in this document is commercially available Available, unregulated, publicly available, or in conformity with published methods In a manner, it can be formed from available plasmids. In addition, Plasmids equivalent to rasmids are well known in the art and possess normal skills. It is clear to a skilled craftsman. "Digestion" of DNq is only active on a particular continuum in DNq Refers to catalytic cleavage of DNq with restricted enzymes. Various types used in this book Limited enzymes are commercially available and their reaction conditions, cofactors and other requirements The conditions were used in a manner well known to those of ordinary skill. For analytical purposes Usually, about 2 units of enzyme in about 20 μl of buffer Use 1 μg of plasmid or a piece of DNq. For Plasmid Fatigue Typically, 5 to 50 μg of DNq is separated by 20 to 250 μg to separate DNq pieces. The unit is digested in a larger volume along with the enzyme. Specific limited yeast Appropriate buffer and substrate amounts are specified by the manufacturer. About 37 ° C One hour of incubation time is usually used, but does it vary according to the supplier's instructions? Maybe. After digestion, the reaction is performed using polyacrylic to separate the desired pieces. The gel is directly electrophoresed on an amide gel. Separation of the size of split pieces , Goeddel, D. et al. , Nucleic Acids Res. , 8-4057 (1980) Performed using 8% polyacrylamide gel. “Oligonucleotide” is a polyhedral nucleoside having a single helix structure. Or strands of two complementary polydeoxynucleotides, It can be chemically synthesized. Such synthetic oligonucleotides are 5 'phosphites If you do not add phosphite with ATP where the kinase is, Does not bind to another oligonucleotide. Synthetic oligonucleotides are dephosphorylated "Ligation", which binds to the non-oxidized particles, is defined by two double spirals (Maniatis, T. et al.). , et al. , Id. , p. 146). Unless otherwise indicated, binding was combined with known buffers at approximately equimolar concentrations. DNA fragment to be used 10 u / T4 DNA ligase (“ligase”) per 5 μg It can be achieved using the condition of knitting. Unless otherwise indicated, the conversion is Graham, F. And Van der Eb, A. , Virology Luthology) (1973). Example 1 Expression of bacteria and purification of Ckβ-8 The DNA continuum encoding Ckβ-8, ATCC♯75676, is the Ckβ-8 gene In contrast, the 5 'and 3' continuum of the processed Ckβ-8 protein (minus, PCR oligonucleotide primers and DNA oligonucleotides Amplification was carried out using the continuum 3 '. Nuku corresponding to Bam HI and XbaI Leotide was added to the 5 'and 3' continuum respectively. 5 'oligonucleoside Tide Primer is a continuum 5 'TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA 3' (SEQ ID No. 7) With the BamHI restricted enzyme site followed by the final processed protein Contains the 18 nucleotides of the Ckβ-8 encoded continuum starting with the amino acid No. 3 'continuum 5'CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT3' (SEQ ID No. 8) is Includes the complementary continuum for the I site. Restricted enzyme sites are used for bacterial Corresponds to the restricted enzyme on the current vector PQE-9 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). PQE-9 is an antibiotic resistance (Amp1), bacterial origin of replication (ori), IPTG regulation. Promoter / operator (P / O), ribosome binding site (R BS), encoding the 6-His tag and the site of the restricted enzyme. pQE-9 is next , BamHI and XbaI. The amplified continuum is formed in PQE-9. Together with the continuum encoding for the histidine label and the RBS. Inserted into the frame. The binding mix was then used as the E. coli strain M1 available from Oiagen. Used to convert 5 / rep4. M15 / rep4 is Plasmid It contains multiple copies of pREP4, which expresses the lacI repressor and It also confers mycin resistance (Kanl). Converted by ability to grow on LB plate Substances are identified and ampicillin / kanamycin resistant colonies are selected. Plush DNA is separated and confirmed by limited analysis. Amp (100ug / ml) and K An LB media (25 ug / ml) was added to the culture medium of LB media. Included clones were cultured overnight (O / N). The O / N culture is 1: 1 A ratio of 00 to 1: 250 was used to inoculate large cultures. Cell is 0 . Grown to an optical density of 600 (OD [illegible]) between 4 and 0.6 . Next, IPTG (target propyl-B-D-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 1 mM. Until added. IPTG inactivates the lacI repressor and regulates gene expression. Induced by removing P / O which leads to increase. Cells are extra extra And incubated for 3 to 4 hours. The cells are then harvested by centrifugation. cell Pellets in a 6 mol guanidine HC1 chaotropic agent And is dissolved. After purification, the dissolved Ckβ-8 was treated with a protein containing a 6-His tag. Chromatography on nickel-chelate columns under conditions that allow tight bonding by the matrix Purified from this solution by chromatography (Hochuli, E. et al., J. Chromatog Raffy 411: 177-184 (1984)). Ckβ-8 (95% pure) contains 5.0 moles of 6 mole guanidine HC1 Extracted from the germline and 3 mol guanidine HC1, 1 for reconstitution 00 mM sodium phosphate, 10 molar glutathione (reduced), and 2 Adjusted to molar glutathione (oxidized). Incubate this solution for 12 hours After that, the protein is dialyzed against 10 molar sodium phosphate. Example 2 Expression of bacteria and purification of MIP-4 ATCC $ 75675, a DNA continuum encoding MIP-4, is a MIP-4 gene. For the offspring, the continuum of the 5 'and 3' limits of the processed MIP-4 protein (minus , Signal peptide continuum) Increased radiation using. The nucleotides corresponding to BamHI and XbaI are referred to as 5 ' 3 'was added to each continuum. The 5 'oligonucleotide primer is It has the continuum 5 'TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC 3' (SEQ ID No. 9) and BamHI From a limited enzyme site followed by the final amino acid of the processed protein Includes 18 nucleotides of continuum with MIP-4 code beginning. 3 'continuum 5 'CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT3' (SEQ ID No. 10) is for the XbaI site Includes complementary continuum. The site of the restriction enzyme is the bacterial expression vector PQR -9 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). PQE-9 is an antibiotic Resistance (Amp1), bacterial origin of replication (ori), IPTG regulated possible promoter Operator (P / O), ribosome binding site (RBS), 6-Hi Encode the s-label and the site of the restricted enzyme. pQE-9 followed by BamHI and X digested with baI. The amplified continuum is bound into PQE-9 and Inserted into the frame along with the continuum encoding for the Was. The binding mix then transforms the E. coli strain available from Oiagen. Used to convert. M15 / rep4 contains multiple copies of Plasmid pREP4. , Which express the lacI repressor and also have kanamycin resistance (Kan Give 1) too. The ability to grow on the LB plate identifies the conversion material, Ampicillin / kanamycin resistant colonies are selected. Limited to Plasmid DNq Separated and confirmed by analysis. qmp (100ug / ml) and Kan (25ug / ml) In the culture medium of LB media to which both were added, a clone containing the desired constituent was obtained. Cultured overnight (O / N). The O / N culture was 1: 100 to 1: 250. Used to inoculate large cultures. Cells should be between 0.4 and 0.6 It was grown to an optical density of 600 (OD [illegible]). Next, IPTG ( Sopropyl-B-D-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 1 mM. . IPTG inactivates the lacI repressor and leads to increased gene expression Induction by removing P / O. Cells are extra 3 to 4 hours Cultured. Cells were then harvested by centrifugation. Cell pellet -Chaotropic agent dissolved in 6 mole guanidine HC1 . After clarification, the dissolved MIP-4 was robust with proteins containing a 6-His tag. Chromatography on nickel-chelate columns under conditions that allow Therefore, it was purified from this solution (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177-184 (1984)). MIP-4 (95% pure) contains 6 mol guanidine HC15 . 0 ph and extracted for reconstitution with 3 mol guanidine HC 1, 100 mM sodium phosphate, 10 molar glutathione (reduced), and And adjusted to 2 molar glutathione (oxidized). Leave in this solution for 12 hours After standing, the protein was dialyzed against 10 molar sodium phosphate. Example 3 Expression of bacteria and purification of Ckβ-1 The DNA continuum encoding Ckβ-1, ATCCAT75572, is associated with the Ckβ-1 gene. And 5 'and 3' continuum of the processed Ckβ-1 protein (minus, signal Using the corresponding PCR oligonucleotide primers Amplified. The nucleotides corresponding to Bam HI and Xba I were replaced with a 5 'and 3' Added to each follower. The 5 'oligonucleotide primer is a continuum 5 Have 'GCCCGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC3' (SEQ ID No. 11) and BamHI only The final amino acid in the target enzyme site followed by the processed protein codon? Includes 15 nucleotides of the Ckβ-1 coded continuum beginning with 3 'fast follower 5 'GCCTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG3' (SBQ ID No.12) is available on the XbaI site Complementary continuum, translation stop codon, and the Ckβ-1 Includes the last 20 nucleotides. Restricted enzyme sites are used for bacterial expression Corresponding to the limited enzyme on the receptor PQE-9 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). PQ E-9 is an antibiotic resistance (Amp1), a bacterial source of replication (ori), an IPTG regulated Possible promoter / operator (P / O), ribosome binding site (RBS) ), Encodes the 6-His tag and the site of the restricted enzyme. PQE-9 is next It was digested with BamHI and XbaI. The amplified continuum is placed in PQE-9. Together with a histidine tag and a continuum encoding for RBS Inserted into the frame. The binding mix was then prepared by Oiagen from M15 / It was used to transform the E. coli strain available under the trade name rep4. M15 / rep4 contains multiple copies of Plasmid pREP4, which contains lacI It expresses a repressor and also confers kanamycin resistance (Kan1). LB play Transformants are identified by their ability to grow on A resistant colony was selected. Plasmid DNA is separated by limited analysis, confirmed. LB media with both Amp (100ug / ml) and Kan (25ug / ml) Clones containing the desired components are cultured overnight (O / N) in Was. The O / N culture was used to grow large cultures in a ratio of 1: 100 to 1: 250. Used to plant. Cells have an optical density of 600 (O . D. Up to 600). Next, IPTG (targetsopropyl-B-D-thiogalactopyr) anoside) was added to a final concentration of 1 mM. IPTG is a lacI repressor By inactivating DNA and removing P / O that leads to increased gene expression Lead. Cells were cultured for an additional 3 to 4 hours. Cells are then centrifuged Collected by separation. Cell pellet is a chaotropic agent 6 It is dissolved in monole guanidine HC1. After purification, dissolved Ckβ-1 Nicks under conditions that allow tight binding by proteins containing 6-His tags Purified from this solution by chromatography on a Kel-chelate column ( Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177-184 (1984)). Ckβ-1 (95% Pure) was extracted from 6 mol guanidine HC1 5.0 pH, and For reconstitution, 3 molar guanidine HC1, 100 mM sodium phosphate, 1 0 mole glutathione (reduced) and 2 mole glutathione (oxidized Was adjusted). After being incubated for 12 hours in this solution, the protein was diluted to 10 M sodium phosphate Dialysed against Example 4 Expression of recombinant Ckβ-8 in COS cells Plasmid, expression of CMV-Ckβ-8Hq, was carried out on a vector p containing the following: Derived from cDNqI / qmp (in vitro factor): 1) SV40 source of replication, 2) Escherichia coli resistant to ampicillin, 3) E. coli. Korai Source 4) CMV Promo Followed by a polylinker site, SV40 intron and polyadenylate Site. At the end of all of the Ckβ-8 precursors and 3 'of the frame A small piece of DNq encoding the fused Hq tag is the polylinker site of the vector. And the expression of the recombinant protein is controlled by the CMV promoter. Under the order of Hq labeling was performed as previously described (I. Wilson, et. ell (cells), 37: 767 (1984)), derived from influenza hemagglutinin protein Corresponding to the identified epitope. Inject Hq label into target protein Makes it easy to use recombinant antibodies to recognize Hq epitopes Can be detected at the same time. The strategy for building the plasmid is as follows: The DNA continuum encoding Ckβ-8, ATCC $ 75676, contains two primers. 5'primer 5'GGAAAGCTTATGAAGGTCTC CGTGGCT3 '(SEQ ID No. 13) is a HindIII site followed by a start codon Containing one nucleotide of the Ckβ-1 coded continuum starting with: 3 ′ continuum 5 'CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC3' (SEQ ID No. 14) is a complementary continuum to the XbaI site, a translation stop codon, an HA label , And the last 20 of the continuum encoding Ckβ-8 (not including the stop codon) Including nucleotides. Therefore, the PCR product encodes the HindIII site, Ckβ-8 Next to the HA label fused to the continuum, followed by the frame Includes termination stop codon and XbaI site. PCR amplified DNA fragments and vectors , PcDNAI / Amp, was digested with HindIII and XbaI restriction enzymes and ligated. It is. The binding mix is converted to an E. coli strain. SURE (Strategene Cloning S ystems, La Jolla, CA). The cells are cultured on a plate, and resistant colonies are selected. Plasmid DNA is converted The presence of separated and correct pieces is checked by limited analysis. Recombinant Ckβ-8 For expression, COS cells were transformed by the DRAE [illegible] -DEXTRAN method (J.S. ambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloneing: A Laboratory Manual, cold Spring Laboratory Press, (1989)) Is affected. Ckβ-8-HA protein is used for radioisotope identification and immunoprecipitation ( E. Harlow, D. Lane, Antibodies (antibodies): A Laboratory Manual, Cold spring Harbo r Laboratory Press, (1988)). Cells are transfected Two days after loading, the cells are labeled with 35S-cysteine for 8 hours. Next, culture Media was collected and cells were washed with detergent (RIPA buffer (NaCl 150 mM, NP-40 1%, SDS 0.1%, NP-40 1%, DOC 0.5%, Tris 50 mM, 7.5 pH) (Wilson, I.et.al., Id. 37: 767 (198 4)) is dissolved. Both cell lysate and culture media are HA specific Precipitated with null antibody. The precipitated protein is separated on a SDS-PAGE 15% gel. Is analyzed. Example 5 Expression of recombinant MIP-4 in COS cells Plasmid, expression of CMV-MIP-4Hq, was carried out using the vector pc containing the following: Derived from DNqI / qmp (in vitro factor): 1) SV40 source of replication, 2) N Escherichia coli resistant to picillin, 3) E. coli. Korai replication source, 4) CMV promoter Followed by a polylinker site, SV40 intron and polyadenylation Site. All of the MIP-4 precursors and the fusion at the 3 'end of the frame A small piece of DNq encoding the combined Hq tag is placed at the polylinker site of the vector. Cloned, whereby the expression of the recombinant protein is controlled by the CMV promoter Directed below. Hq labeling was performed as previously described (I. Wilson, et. ell (cells), 37: 767 (1984)), derived from influenza hemagglutinin protein Corresponding to the identified epitope. Inject Hq label into target protein As a result, an antibody that recognizes the Hq epitope can be used to simplify the recombinant protein. It simply becomes detectable. The strategy for building the plasmid is as follows: The DNA continuum encoding MIP-4, ATCC # 75675, has two primers Constructed by PCR using: 5'primer 5'GGAAAGCTTATGAAGGGCCTTG CATGCTGCC3 '(SEQ ID No. 15) has a HindIII site followed by a start code. Containing one nucleotide of the MIP-4 coded continuum starting with: 3 'continuum 5'CGCTCTAGATCAABCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCAGGTC3 '(SEQ ID No. 16) is a complementary continuum to the XbaI site, a translation stop codon, an HA label And the last 19 nuclei of the continuum (not including the stop codon) that encoded MIP-4 Contains nucleotides. Therefore, the PCR product encodes the HindIII site, MIP-4 When fused to a continuum followed by a frame, the label next to the HA label Includes stop codon and XbaI site. PCR amplified DNA fragments and vectors -, PcDNAI / Amp, is digested and ligated with HindIII and XbaI restriction enzymes. You. The binding mix is converted to an E. coli strain. SURE (Strategene Cloning S ystems, La Jolla, CA). The cells are cultured on a plate, and resistant colonies are selected. Plasmid DNA is converted The presence of separated and correct pieces is checked by limited analysis. Recombinant MIP-4 For expression, COS cells were transformed by the DRAE [illegible] -DEXTRAN method (J.S. ambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloneing: A Laboratory Manual, cold Spring Laboratory Press, (1989)) Is affected. MIP-4-HA protein is used for radioisotope identification and immunoprecipitation (E.H. arlow, D. Lane, Antibodies (antibodies): A Laboratory Manual, Cold spring Harbor L aboratory Press, (1988)). Cells are transfected Two days later, the cells are labeled with 35S-cysteine for 8 hours. Next, the culture Media was collected and cells were washed with detergent (RIPA buffer (NaCl 150 mM, NP-40 1%, SDS 0.1%, NP -40 1%, DOC 0.5%, Tris 50 mM, 7.5 pH) (Wilson, I.et.al., Id. 37: 767 (1984)) Is dissolved by Both cell lysate and culture media are HA specific monoclonal Precipitates with the antibody. The precipitated proteins are analyzed on a 15% SDS-PAGE gel. It is. Example 6 Expression of recombinant Ckβ-1 in COS cells Plasmid, expression of CMV-Ckβ-1Hq, was carried out on a vector p containing the following: Derived from cDNqI / qmp (in vitro factor): 1) SV40 source of replication, 2) Escherichia coli resistant to ampicillin, 3) E. coli. Korai Source 4) CMV Promo Followed by a polylinker site, SV40 intron and polyadenylate Site. At the end of all of the Ckβ-1 precursors and 3 'of the frame A small piece of DNq encoding the fused Hq tag is the polylinker site of the vector. And the expression of the recombinant protein is controlled by the CMV promoter. - Directed below. Hq labeling was performed as previously described (I. Wilson, et.al., Cell. (Cells), 37: 767 (1984)), derived from influenza hemagglutinin protein Corresponding to the epitope identified. Inject Hq label into target protein This makes it easy to use recombinant antibodies to recognize Hq epitopes. It can be detected. The strategy for building the plasmid is as follows: The DNA continuum encoding Ckβ-1, ATCC♯75572, has two primers Constructed by PCR using: 5'primer 5'GGAAAGCTTATGAAGATTCCGTGG CTGC3 '(SEQ ID No. 17) is derived from the HindIII site followed by a start codon. Including one nucleotide of the continuum with the Ckβ-1 code beginning; 3 'continuum 5'CG CTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG3 '(SEQ ID No. 1 8) shows the complementary continuum to the XbaI site, the translation stop codon, the HA tag, and And the last 19 nucleotides of the continuum encoding Ckβ-1 (not including the stop codon) Contains tide. Therefore, the PCR product was derived from a sequence encoding the HindIII site, Ckβ-1. HA tag fused to the continuum and subsequent frame, termination stop next to HA tag Includes codon and XbaI sites. PCR amplified DNA fragments and vectors, p cDNAI / Amp is digested and ligated with HindIII and XbaI restriction enzymes. Conclusion The combined mix is converted to an E. coli strain. SURE (Strategene Cloning Systems, L a Jolla, CA), and the transformed cultures are placed on an ampicillin media plate. And resistant colonies were selected. Plasmid DNA is separated from the conversion material The presence of the correct piece was checked by limited analysis. Recombinant Ckβ-1 expression First, COS cells were transformed by the DRAE [illegible] -DEXTRAN method (J. Sambrook, B. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloneing (Molecular Cloning): A Laborato ry Manual, cold Spring Laboratory Press, (1989)). It is. Ckβ-1-HA protein is used for radioisotope identification and immunoprecipitation (E. Harlow, D. .Lane, Antibodies (antibodies): A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laborato ry Press, (1988)). Cells are obtained 2 days after transfection , 35 [illegible] S-cysteine for 8 hours. Next, The culture medium is collected and the cells are washed with a detergent (RIPA buffer (NaCl 150 mM, NP-40 1%, SDS 0.1 %, NP-40 1%, DOC 0.5%, Tris 50 mM, 7.5 pH) (Wilson, I.et.al., Id. 37: 767 (198 4)) is dissolved. Both cell lysate and culture media are HA specific Precipitated with null antibody. The precipitated protein is separated on a SDS-PAGE 15% gel. Was analyzed. Example 7 Expression pattern of Ckβ-8 in human tissues Northern plot analysis shows the expression level of Ckβ-8 in human tissues. A bell was implemented to inspect. All cellular RNA samples were analyzed for RNAzol (TM) B cis (Biotecx Labortories, Inc., Houston, TX77033). Identified that Approximately 10 ug of total RNA isolated from each human tissue is 1% agarose gel Stratagene Prime-It, isolated above, with 50 ng DNA pieces Nylon filter (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Mol.) ecular Cloning (Cold Spring Harbor Press, (1989)) Painted on top. The labeled DNA is cleaned with Select-G-50 columns. (5Prime-3Prime, Inc.Boulder, CO) The filter is then -Her, Ckβ-8 gene radiolabeled at 1,000.000 cpm / ml in 7% SDS Leave the whole offspring overnight at 65 ° C to allow hybridization. It is. After washing twice with 0.5 times (0.5x) SSC and SDS 0.1% at room temperature and twice at 60 ° C, The filters are exposed to -70 ° C overnight with an intensifying screen. Example 8 Expression pattern of MIP-4 in human cells Northern plot analysis shows the expression level of MIP-4 in human cells. A bell was implemented to inspect. All cellular RNA samples were analyzed for RNAzol (TM) B cis (Biotecx Labortories, Inc., Houston, TX). Each identified Approximately 10 ug of total RNA isolated from human tissue was run on a 1% agarose gel. Stratagene Prime-It key isolated and with 50 ng DNA pieces According to the nylon filter (Sambrook.Fritsch, and Maniatis, Molecul) ar Cloning (Cold Spring Harbor Press, (1989)) Painted. Labeled DNA was cleaned with Select-G-50 columns. (5Pr ime-3Pri1e, Inc.Boulder, CO) The filter is then NaPO4 0.5M, 7.4 pH , With the entire MIP-4 gene radiolabeled at 1,000,000 cpm / ml in 7% SDS Placed overnight at 65 ° C. and hybridized. 0.5 times (0.5x) SSC, SDS 0.1% twice at room temperature After washing twice at 60 ° C., the filters were screened with an intensifying screen overnight at −70 ° C. Temperature. Example 9 Expression pattern of Ckβ-1 in human tissues Northern plot analysis shows the expression level of Ckβ-1 in human tissues. A bell was implemented to inspect. All cellular RNA samples were RNAzol (TM) B Separated by stem (Biotecx Labortories, Inc., Houston, TX). Identified that Approximately 10 ug of total RNA isolated from each human tissue is 1% agarose gel Stratagene Prime-It, isolated above, with 50 ng DNA pieces Nylon filter (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Mol.) ecular Cloning (Cold Spring Harbor Press, (1989)) Painted on top. The labeled DNA is cleaned with Select-G-50 columns. (5Prime-3Prime, Inc.Boulder, CO) Ha, Ckβ-1 gene radiolabeled at 1,000.000 cpm / ml in 7% SDS Whole and overnight at 65 ° C., hybridized. 0.5 times (0.5x) SSC, SDS 0.1% at room temperature After washing twice at 60 ° C., the filters were screened overnight with an intensifying screen. , Exposed to -70 ° C. Message RNA for Ckβ-1 is abundant in the spleen You. Example 10 Chemokine Ck using baculovirus expression system Expression and purification of β-8 Recombinant baculo designed to express Ckβ-8 cDNA in SF9 cells Infected with a virus. Cells are infected at a MOI of 2 and at 28 ° C for 72-96 hours. For a while. Cell debris is removed from infected cultures by low-speed centrifugation Was cut. The mixture of protease suppressors is Pefabloc SC 20 μg / ml , Leupeptin 1 μg / ml, E-64 1 μg / ml, EDTA 1 mM Was. By adding 20-30 μl of the supernatant only 15% SDS-PAGE gel, the C kβ-8 levels were monitored. Ckβ-8 has an expression level of several mg per liter. It was detected as a 9Kd band that appeared to correspond to the Ckβ-8 is three-stage purification Methods: Further purification through heparin binding affinity chromatography. Baki Culture of the urovirus was performed using 1/3 buffer containing 100 mM HRPES / MES / NaOAc6 pH. The amount and mix And filtered through a 0.22 μm membrane. The sample is then loaded with a heparin-binding column ( HE1poros 20, Bio-Perceptive System Inc.). Ckβ-08 is 6 pages -50 mM HEPES / MES / NaOAc, approximately 300 mM NaCl with a linear gradient of 50-100 mM NaCl. Extracted with: Cation exchange chromatography. Heparin chromatography -Concentrated Ckβ8 is 5x with buffer containing 50MM NEPES / MES / NaOAc 6 pH Exposure to dilute solution. The synthesized mixture is then converted to cation exchange columns (S / Mporo s 20, Bio-Perceptive System Inc.). Ckβ-8 is 6 pH 5 Extraction into 0 mM HEPES / MES / NaOAc with a linear gradient of 25-300 mM NaCl with approximately 250 mM NaCl Performed: size exclusion chromatography. Following cation exchange cochromatography Ckβ-8 is applied to the size exclusion column (HW50, TOSOHARS, 1.4x45cm). , And further cleaned. Ckβ-8 is a 13.7Kd molecular weight group corresponding to a dimeric protein It was sorted near the quasi (RNaseA). Following the three-step purification described above, the resulting Ckβ-8 was converted to SDS [illegible] -More than 90% as determined from the commassie blue discoloration of the PAGB gel Was determined to be pure. (FIG. 9) Cleaned Ckβ-8 has also been tested for endotoxin / LPS contamination. Was. According to LAL analysis (Bio Whittaker), the LPS content was 0.1 ng / ml or less. Was. Example 11 M-CSF Of baculovirus-expressed Ckβ-1 and Ckβ-8 on rice and newly separated -Stimulated colony formation of isolated bone marrow cells A population of low-density mouse bone marrow cells contains mononuclear cells, macrophages, Tissue treated to remove other cells that adhere to the plastic surface The cells were cultured at 37 ° C. for 1 hour in a culture dish. The non-adherent cell population is In the presence or absence of the elements shown in FIG. The cells were cultured in a medium (10,000 cells / dish). The culture medium is opened at 37 ° C for 10 days. Cultured (88% N2, 5% CO2 and 7% O2), colonies were scored under an inverted microscope. De The data are presented as the median of the colony, which means that Obtained. Example 12 IL-3 Effect of Ckβ-8 and Ckβ-1 on bone marrow and phosphorus-population of bone marrow cells (lin-population) SCF-stimulated nucleic acids and differentiation A population of mouse bone marrow cells enriched in primary hematopoietic species is negative Selection method, i.e., most cells involved in lineage Antibody (anti-cdllb, CD4, CD8, CD45R, Gr-1 antigen) and magnetic beads Was. The resulting cell population (Lin cells) was IL-3 (5 ng / ml). ) And SCF (100 ng / ml) in the indicated culture medium, the indicated chemokine (50 ng / ml) in the presence or absence (5 × 10 4 cells / ml). Over-humidification Incubated at 37 ° C for 7 days in an incubator (CO2 5%, O2 7%, N2 88% environment) Later, cells were harvested and analyzed for HPP-CPC and undifferentiated progenitors. In addition, cells It was analyzed for specific differentiated antigen expression by FACScan. Colony data are presented as the median of several colonies, one for each cell population. And obtained from analytical evaluations performed on six dishes. (Fig. 17) Example 13 Ck β-8 responds to IL-3, M-CSF, GM-CSF and suppresses colony formation Mouse bone marrow cells were isolated on a microdensity gradient Pushed from both tibia and from mononuclear cells dislodged by plastic It was washed away. The resulting cell population was IL-3 (5 ng / ml), GM-CSF (5 ng / ml), M- Grow overnight in MEM-based medium supplemented with CSF (10 ng / ml) and G-CSF (10 ng / ml). Was. These cells were treated with IL-3 (with or without 50 ng / ml levels of Ckβ-8). 5 ng / ml), GM-CSF (5 ng / ml), M-CSF (10 ng / ml) in agar-based colony formation analysis The cells were cultured at 1,000 cells / dish. Data is formed only by specific factors The colony formation was expressed as a percentage of the number of colonies performed. Two duplicates The standard deviation for each trial, together with the data depicted as the average Two trials are shown with the error bar graph shown. (Fig. 19) Example 14 Expression by gene therapy Fibroblasts were obtained from the subject by skin biopsy. The resulting Tissue is placed in a tissue culture medium and divided into small pieces. Small chunks of tissue Placed on the moist surface of the woven culture flask, approximately 10 pieces are placed in each flask . The flask is turned upside down and kept closed at room temperature overnight. 24 hours at room temperature After being placed, the flask is inverted and the mass of tissue remains attached to the bottom of the flask, New culture media (eg Ham's F12media, FBS 10%, Penicillin, Streptomyces Is added. It is then left at 37 ° C. for approximately one week. this At that point, a new culture medium is added and changed every few days thereafter. In the cultured tissue After an additional two weeks, a monolayer of fibroblasts appears. The monolayer is trypsinized And the flakes are placed in a large flask. Moloney murine sarcoma virus long, recurring period PKV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988)) Was digested with EcoRI HindIII, followed by calf intestinal phosphatase. Treated with The primary vector was sorted on an agarose gel and It is cleaned using stainless steel beads. The cDNA encoding the polypeptide of the present invention has its continuum ending in 5 'and 3'. Each is amplified using the corresponding PCR primer. 5'primer is EcoRI site And the 3'primer contains a HindIII site. Where T4DNA ligase is present And the same amount of Moloney murine sarcoma virus primary (linear) spine and And small pieces of EcoRI and HindIII are added together. The resulting mixture Is maintained under conditions suitable for joining the two pieces. The binding mix is used to convert bacterial HB101, which Next, to confirm that the vector had the gene of interest properly inserted The plate is then plated on kanamycin containing agar. A batch of amphotropic pA317 and GP + am12 Cells are modified by Dulbecco's Modified Eagles Medium ( (DMEM) 10% calf serum (CS) in tissue culture It grows with nisin and streptomycin. MSV vector containing gene The cells are then added to the group and the batch cells are transduced with the vector. That Batch cells now produce infectious virions that contain that gene. (This one Bundle cells are now referred to as producer cells. ) New culture medium is added to the transduced producer cells, resulting in confluent Culture media is harvested from 10 cm plates of producer cells. Infectious virus particles The used culture medium containing the micropores was used to remove isolated producer cells. The medium is then filtered to infect fibroblasts. used. Groups removed from fibroblast subconfluent plates can be rapidly produced It is exchanged for the culture medium from the donor cells. This medium is removed and replaced with new one. available. If the virus titer is high, virtually all fibroblasts Are infected, so there is no need for a choice. If the titer is very low Use a retroviral vector with a selectable marker such as neo or his. Need to be used. The engineered fibroblasts then, alone or Growing to fusion point on cytodex 3 microcarrier beads After that, it is injected into the host. The fibroblasts now produce protein products Produce. Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, Therefore, unless otherwise indicated, the present invention is not limited to the application attached to the appendix. It shall be implemented within the scope of the contract.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 45/00 ＡＢＡＣ０７Ｋ 14/52 ＡＢＧＣ１２Ｐ 21/02 ＣＡＢＹＧ０１Ｎ 33/15 ＺＣ０７Ｋ 14/52 33/50 ＴＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥＧ０１Ｎ 33/15 ＡＢＦ 33/50 ＡＢＸ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ルーベン，スティーブン・エムアメリカ合衆国20832メリーランド州オルニー、ヘリティッジ・ヒルズ・ドライブ 18528番 (72)発明者リー，ハオドンアメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイザーズバーグ、ラトリッジ・ドライブ 11033番 (72)発明者アダムズ，マーク・ディアメリカ合衆国20878メリーランド州ノース・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI A61K 45/00 ABA C07K 14/52 ABG C12P 21/02 C ABY G01N 33/15 Z C07K 14/52 33/50 T C12N 5 / 10 C12N 5/00 B C12P 21/02 A61K 37/02 ABE G01N 33/15 ABF 33/50 ABX // (C12P 21/02 C12R 1:91) (72) Inventor Leuven, Stephen M. United States 20832 Maryland Heritage Hills Drive, Olney, Oregon 18528 (72) Inventor Lee, Haodong Rutridge Drive, Gaithersburg, Maryland, United States 20878, United States 11033 (72) Inventor Adams, Mark Di Norse, United States 20878 Maryland・ Potomac, Da Ifu drive 15205 No.

Claims

[Claims] 1. An isolated purinucle consisting of members selected from the group consisting of: Otide: (a) encodes a polypeptide consisting of amino acids -21 to 99 of SEQ ID No. 2 Polynucleotides; (b) encodes a polypeptide consisting of amino acids 1 to 99 of SEQ ID No. 2 Polynucleotides; (c) capable of hybrid malnutrition, and the polynucleotides of (a) and (b) A polynucleotide that is at least 70% identical; and (d) A polynucleotide that is a small piece of the polynucleotide of (a) or (b). 2. Application 1 Polynucleotide within the scope of Polynucleotide DNq . 3. Application 1 Polynucleotide within the scope of Polynucleotide RNq . 4. Application 1 of the polynucleotide within the scope where the polynucleotide is DNq in the genome Leonid. 5. Encodes a polypeptide consisting of amino acids -21 to 99 of SEQ ID No. 2 Application 2 Polynucleotide. 6. Encoded a polypeptide consisting of amino acids 1 to 99 of SEQ ID No. 2 Application 2 Polynucleotide. 7. An isolated purinucle consisting of members selected from the group consisting of: Otide: (a) Amino acid sequence expressed by DNq contained in ATCC Deposit No. 75676 Polynucleotide that encodes a polynucleotide having a continuation. (b) capable of hybrid malnutrition, and at least 7 with the polynucleotide of (a) Polynucleotides that are 0% identical. (c) A polynucleotide which is a small piece of the polynucleotide of (a) or (b). 8. From the continuum of nucleotide 1 to nucleotide 363 described in SEQ ID No. 1 Application 1 consisting of a polynucleotide. 9. A vector containing the DNA of the application 2. 10. A host cell genetically engineered with the vector of the application content 9. 11. Process for producing a polypeptide comprising: Polypeptide encoded by the DNA expressed from the host cell of application 10 Puchido. 12. Expression of a genetically engineered polypeptide with the vector of application 9 Process for producing cells that are capable of 13. (i) a polypeptide having an amino acid continuum derived from SEQ ID No. 2; And (ii) encoded by the cDNA of ATCC Deposite No. 75676. Polypeptides and fragments, analogs, and derivatives of the polypeptides. A polypeptide selected from the group consisting of: 14． It is a polypeptide having a continuum of amino acids derived from SEQ ID No. 2. The polypeptide of claim 13. 15. An agonist for the polypeptide of application 13. 16. An antagonist to the polypeptide of application 13. 17． A method for treating patients in need of Ckβ-8, consisting of: Therapeutically effective Administering to the patient an appropriate amount of the polypeptide of claim 13. 18. A therapeutically effective amount of the polypeptide is determined by encoding the polypeptide with D Administering NA to a patient and expressing the polypeptide in vivo. Therefore, the method of application content 17 of administering. 19. For the treatment of patients in need of suppressing Ckβ-8 polypeptide consisting of Method: Administer a therapeutically effective amount of the Claim 16 antagonist to the patient. 20. Under-expression of polypeptide of application 13 consisting of: A process for diagnosing a disease or susceptibility to a disease with respect to: Determining a mutation in the nucleic acid continuum encoding the polypeptide . 21. Diagnostic process consisting of: In the sample taken from the host, the polypeptide content of application 13 Analyzing the presence. 22. Identify antagonists and agonists of the polypeptide of Application 13 consisting of Another process: Among the cells, complexes and polypeptides to be screened, The polypeptide is separated from the peptide by a porous filter. Performing; and To determine whether the complex is an effective antagonist or agonist Then, determine the degree of migration of the cells.