JPH11512610A

JPH11512610A - Short form chemokine β-8

Info

Publication number: JPH11512610A
Application number: JP9513722A
Authority: JP
Inventors: ホワイト，ジョン; アペルバウム、エドワード; オシャネシー，ダニエル; フォーンウァルド，ジェイムズ・アラン; オドネル，ケビン
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 1999-11-02
Also published as: CZ92198A3; MX9802380A; PL326080A1; EA199800352A1; BR9610671A; CN1198186A; WO1997012041A1; CN1405180A; AU7379096A; AU711573B2; NO981387L; ZA968204B; BG102413A; HUP9802699A2; HUP9802699A3; NO981387D0; TR199800575T1; EP0859842A4; KR19990063834A; EP0859842A1

Abstract

(57)【要約】本発明はヒトＣｋβ−８の末端切断形の新規ポリペプチドを提供する。また、該ポリペプチドの使用法も提供される。 (57) [Summary] The present invention provides novel polypeptides in truncated form of human Ckβ-8. Also provided are methods of using the polypeptides.

Description

【発明の詳細な説明】短縮形ケモカインβ−８発明の背景本発明はケモカインベーター８（ｃｋβ−８）の短縮形をコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列に関する。特に、本発明はポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の産生、およびポリペプチドの作用の抑制に関する。ケモカインは、相互分泌サイトカインとも称するが、構造および機能的に関連したサイトカインの亜科である。これらの分子は小さく、誘発可能なプロ炎症タンパク質である。一般に、ケモカインはアミノ酸レベルで２０ないし７５％の相同性を示し、２つのジスルフィド結合を形成する４つの保存システイン残基により特徴づけられる。はじめの２つのシステイン残基の配列に基づいて、ケモカインは２つの亜科アルファとベータにに分類されている。アルフ亜科においては、はじめの２つのシステインはアミノ酸により分離され、したがって、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」亜科と称する。ベータ亜科においては、２つのシステインは隣接する位置にあり、したがって、「Ｃ−Ｃ」亜科と称する。１番目のシステインは３番目のシステインと、２番目は４番目とジスルフィド結合を形成し、その結果、多くのケモカインについて類似した三次構造をもたらす。構造的に、多くのケモカインがタンパク質加水分解プロセシングを受けて、機能的に「成熟した」タンパク質を生じる。これは通常タンパク質のＮ−末端部分で短いリーダー配列の開裂を含む。少なくとも１４の別個のα−ケモカインおよび１２のβ−ケモカインがタンパク質および／またはｃＤＮＡレベルで記載されている。相互分泌サイトカインは広範囲におよぶ機能を示す。重要な特徴の１つは、単球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球、および線維芽細胞などの異なる細胞種の走化性遊走を刺激する能力である。αおよびβ亜種は、その細胞標的選択性においていくぶん異なる。αケモカインのほとんどは好中球、線維芽細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を誘引する。β−ケモカインは主に単球およびＴリンパ球を誘引する。多くのケモカインはプロ炎症活性を有し、炎症反応中の多段階に関与する。これらの活性は、ヒスタミン放出の刺激、リソソーム酵素およびロイコトリエン放出、標的免疫細胞の内皮細胞への付着の増加、補体タンパク質の結合の増加、顆粒球付着分子および補体レセプターの発現の誘発、および呼吸器系バーストを包含する。その炎症における関与に加えて、他の活性を示すことが実証されているケモカインもある。例えば、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１）は造血幹細胞増殖を抑制でき、血小板因子４（ＰＦ−４）は内皮細胞増殖の有力な抑制物質であり、インターロイキン−８（ＩＬ−８）はケラチノサイトの増殖を促進し、ＧＲＯは黒色腫細胞の自己分泌増殖因子である。ケモカインは多くの生理学的状態および病気の状態、特に炎症性成分を有する状態に関与する。これらは、リンパ球交換、傷の癒合、造血調整および免疫学的障害、例えばアレルギー、喘息および関節炎を包含するが、これに限定されない。多くのケモカインは、はじめは炎症性応答の産物として単離された。例えば、ＭＩＰ−１はもともとマクロファージにより産生される内毒素−誘発性プロ炎症サイトカインとして単離された。この亜科の他の要素は、炎症誘発ならびにアミノ酸配列相同性に基づいて同様に同定された。これは、完全長ならびに短縮形の本発明のＣｋβ−８オリゴヌクレオチドを包含する。発明の要約本発明の一態様によると、ヒトＣｋβ−８の切断された形態である新規ポリペプチドの混合物、ならびにその生物学的に活性で診断上または治療上有用なフラグメント、類似体および誘導体が提供される。本発明の他の態様によると、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡを包含するこのようなポリペプチドならびにその生物学的に活性で、診断上または治療上有用なフラグメント、類似体および誘導体をコードする単離された核酸分子が提供される。本発明のさらに別の態様によると、核酸配列を有する組換え原核および／または真核宿主細胞を前記タンパク質の発現を促進する条件下で培養し、続いて前記タンパク質を回収することからなる組換え技術による、このようなポリペプチドの産生法が提供される。本発明のさらに別の態様によると、治療目的、例えば骨髄幹細胞を化学療法期間中化学療法剤から保護するため、または傷の癒合を刺激するための、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの利用法が提供される。本発明の別の態様によると、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のさらに別の態様によると、このようなポリペプチドに対する拮抗物質であって、このようなポリペプチドの作用を抑制するため、例えば再生不能性貧血、せき髄形成異常症候群、喘息および関節炎を治療するために用いられるものが提供される。本発明の他の態様によると、Ｃｋβ−８核酸配列と特異的にハイブリッド形成をするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブも提供される。本発明のさらに別の態様によると、ポリペプチドの不十分な発現および過剰発現に関連する病気を検出するため、およびこのようなポリペプチドをコードする核酸配列における突然変異を検出するための診断法が提供される。本発明のさらに別の態様によると、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連したｉｎｖｉｔｒｏ目的、ヒトの病気の治療についての治療法および診断法を開発する目的に関する研究試薬としての利用法が提供される。本発明のこれらのまた他の態様は本明細書の内容から当業者には明らかである。発明の詳細な記載プロ炎症性「相互分泌」ケモカイン超科に構造的に関連したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は記載されている。完全長Ｃｋβ−８(１２０アミノ酸)をコードするポリヌクレオチド配列は大動脈内皮ｃＤＮＡライブラリー由来であった。本発明は長い形態の８２、７６、７５または７４Ｃ−末端アミノ酸だけを含むＣｋβ−８の新規短縮形に関する。Ｎ−末端アミノ酸ならびに２１残基シグナルペプチド配列を開裂する。Ｃｋβ−８の長い形態に関しては、これらのクローン中の最初の２つのシステイン残基は「Ｃ−Ｃ」となる隣接した位置にあるかまたはケモカインのベータ亜科である。このモチーフの存在により、これらは最初の２つのシステイン残基がアミノ酸により分断されているケモカインの亜科（「ＣＸＣ」）と区別される。成熟ポリペプチド（配列番号１、２、３および４）をコードするポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドに結合した追加のコーディングおよび非コーディング配列を含むＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなどのいずれかの核酸形態で表される。さらに、アミノ酸コードの同義性のために、同じ成熟ポリペプチドをコードするいずれのＤＮＡコーディング配列も本発明の範囲内であると考えられる。いずれのこの配列の変異体型、対立遺伝子のものまたは天然に存在しないものも包含される。本発明はさらに、タンパク質の細胞からの発現または分泌を助けるかまたは細胞中のタンパク質を同定するためのマーカー（例えば、ＨＡタグ）として働くコーディング配列が同じリーディングフレーム内で他のＤＮＡ配列と融合したポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに記載した配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％の配列同一性でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列に関する。これらのポリヌクレオチドは好ましくは成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。別法として、配列は、本発明の配列と同一性を有し、ハイブリッド形成するが、活性を保持しない好ましくは５０塩基を有するポリヌクレオチドである。このような配列はプローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであってもよい。これらのポリペプチドの誘導体は、１またはそれ以上のアミノ酸置換が存在するもの；１またはそれ以上のアミノ酸が置換基を含有するもの；１またはそれ以上の成熟タンパク質が他の化合物と縮合しているもの；または別のアミノ酸が成熟タンパク質と縮合しているものである。本発明のポリペプチドは好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは均質になるまで精製される。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、このベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。宿主細胞は本発明のベクター（クローニングまたは発現）で遺伝子操作される。これらの細胞についてのプロモーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、または切断されたＣｋβ−８遺伝子を増幅するための培養条件は、当業者には明らかである。このポリヌクレオチド配列は、これらが宿主細胞中で複製可能で、生存可能なかぎり、種々の発現ベクターのいずれかに包含される。発現ベクター中に挿入されたポリヌクレオチド配列はｍＲＮＡ合成を行う適当なプロモーター（例えば、ＬＴＲプロモーター）の制御下にある。発現ベクターはさらに、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、転写ターミネーター、転写を増加させるエンハンサーエレメント(例えば、ＳＶ４０後期エンハンサー)、および宿主中のベクターの維持を確実にするための適当な選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）も含有する。宿主細胞は、哺乳動物または昆虫細胞などの高等な真核性細胞、酵母などの低級な真核細胞、または細菌などの原核細胞であり得る。この構築物の宿主細胞中への導入は、種々のプロトコルにより行いうる。前記工程はすべて当業者には明らかである。クローニング段階およびに宿主およびベクター選択は当業界で周知である。[Ｓambrookら、モレキュラ・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual)、第２版、コールド・スプリング・ハーバー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor,Ｎ.Ｙ)(１９８９)]。タンパク質は適当なプロモーターの制御下で宿主細胞中で合成できる。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いたこのようなタンパク質の産生に用いることができる。別法として、本発明のポリペプチドは通常のペプチド合成器により合成できる。適当な宿主株の形質転換またはトランスフェクションおよび宿主株の適当な細胞密度までの増殖の後、選択したプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘発）により誘発させ、細胞を更なる期間培養する。細胞を典型的には遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破砕し、種々の方法（例えば、クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）により均質になるまで精製する。採用した宿主細胞によって、ポリペプチドを何らかの方法で（例えば、グリコシル化）修飾してもよい。本発明のポリペプチドはさらに最初のメチオニン残基も包含する。Ｃｋβ−８の長形は白血球の化学誘引物質であり、したがって種々の免疫調節および炎症機能ならびに種々の病気の状態に用いられる。このタンパク質は造血起源の組織において主に発現される。Ｃｋβ−８ポリペプチドの白血球に対する重要な生物学的効果の一つは、Ｃａ＋＋予備の動員の刺激である。この動員は細胞の機能的活性化に関与する。Ｃｋβ−８の４つの短縮形（配列番号１−４）を含む混合物での分化したＥＯＬ−３細胞の刺激は量に応じて細胞内Ｃａ＋＋を即時的に増加させる。個々に試験した場合、配列番号４を有する短縮形がもっとも活性である。対照的に、Ｃｋβ−８の長形はＣａ＋＋の動員で短縮形のおよそ１０００倍効力が低い。本発明の短縮形の効力は、化学療法中の化学療法剤からの骨髄幹細胞の保護、白血病性細胞の除去、免疫応答の刺激、造血の調節、リンパ球交換、乾癬、固体腫瘍の治療、耐性慢性および急性感染症に対する宿主防御の向上、および傷癒合の刺激などを包含する（これに限定されない）このケモカインの治療用途の有効性に関与する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは研究試薬として、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造において、またヒトの病気（例えば、未熟造血先祖細胞の膨張において）の治療のための療法および診断法の開発の目的で用いられる。この切断されたＣｋβ−８ポリヌクレオチド配列のフラグメントも、高い配列類似性を有する他の遺伝子を単離するためにハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。この種の実験に関する技術は当業者には公知である。本発明はさらにこれらの配列の、核酸配列における突然変異の存在に関連した病気または病気に対する感受性を検出するための診断法の一部としての使用に関する。このような病気はケモカインポリペプチドの不十分な発現に関連する。例えば、Ｃｋβ−８遺伝子中に突然変異を有する個体はＰＣＲなどの種々の技術によりＤＮＡレベルで検出される。ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝子試験は変性剤を含むかまたは含まないゲル中でのＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出することにより行われる。特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列化、ＲＦＬＰ分析、およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングなどの方法により達成される。突然変異はさらに正常部位分析にっても検出できる。本発明はまた、正常な対照組織サンプルと比べてのタンパク質の過剰発現は病気の存在または病気に対する感受性、例えば腫瘍を検出するので、種々の組織におけるＣｋβ−８たんぱくのレベルの変化を検出する診断法に関する。宿主由来のサンプルにおけるＣｋβ−８のレベルの検出に用いる分析法は当業者には周知であり、放射線免疫検定法、競合性結合分析、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ検定および「サンドウィッチ」検定を包含する。本発明はケモカインポリペプチドに関するレセプターの同定法を提供する。レセプターをコードする遺伝子はリガンドパンニングおよびＦＡＣＳ選別を包含する当業者に公知の多くの方法により同定できる。レセプター同定の別法は、標識したポリペプチドの細胞膜またはレセプター分子を発現する抽出物に対するフォトアフィニティー結合を含む。標識した複合体は単離でき、タンパク質のマイクロシーケンシングに付す。得られたアミノ酸配列を、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするための１組の同義性オリゴヌクレオチドプローブをデザインするために用いる。本発明は、本発明のケモカインポリペプチドに対する作用物質および拮抗物質を同定するための化合物のスクリーン法を提供する。走化性は、これらのポリペプチドにより化学的に誘引された細胞を、細胞が通り抜けられるほどの大きさの孔（５ｍｍ）を有するフィルターの上面に置くことにより分析する。有効な作用物質または拮抗物質の溶液をボトムチャンバー中に入れ、一定期間にわたり細胞が膜を通って遊走するかまたは遊走しないようにする。別法として、Ｃｋβ−８の受容体を化合物の存在下で標識したポリペプチドとともにインキュベートする。化合物のこの相互作用をブロックするかまたはポリペプチドの非存在下で受容体と相互作用するかのいずれかの能力を測定できる。有効な切断Ｃｋβ−８拮抗物質の例は、抗体、ポリペプチドと結合するオリゴヌクレオチドまたは野生型ポリペプチドの受容体と結合するが生物学的活性を保持しないポリペプチドを包含する。遺伝子発現を制御するのに用いるアンチセンス技術も有効な拮抗物質でありえる。前記技術の利用可能性は当業者には明らかである。拮抗物質は、珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症、特発性過好酸球増加症候群、および内毒素ショックなどの、すべて本発明のポリペプチドの産生を防止することによる感染症の治療に用いられる。拮抗物質はさらに、動脈壁中の単球の浸潤を防止することによるアテローム性動脈硬化症の治療にも用いられる。拮抗物質はヒスタミンに媒介されるアレルギー反応および真皮を含む種々の免疫学的障害の治療に用いられる。拮抗物質はさらに傷部分への単球の誘引を防ぐことによる慢性および急性炎症の治療にも用いられる。これらはまた、病気にかかった部位への単球の流入を防ぐことによる、炎症性肺疾患、一般的炎症、および慢性関節リウマチの治療にも用いられる。拮抗物質はさらに再生不能性貧血またはせき髄形成異常症候群における骨髄不全の患者の治療にも用いられる。これらはまた、喘息およびアレルギーならびに喘息肺の特徴である上皮下基底膜線維症の治療にも用いられる。ケモカインポリペプチドおよび作用物質および拮抗物質は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせなどの適当な医薬担体と組み合わせて用いられる。処方物は投与様式にあったものでなければならない。本発明はさらに、１またはそれ以上の本発明の医薬組成物の成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。ポリペプチド、作用物質、および拮抗物質を他の治療化合物と組み合わせて用いてもよい。医薬組成物は、特定の適応症の治療に関して有効な量で、局所、静脈内、腹膜組織内、筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によるなど都合よい方法で投与される。これらの用途は当業者に明らかである。ケモカインポリペプチド、作用物質、またはポリペプチドである拮抗物質は本発明にしたがってこのようなポリペプチドのｉｎｖｉｖｏでの発現により用いられる。この種の遺伝子療法は当業者には周知である。例えば、患者からの細胞を、ｅｘｖｉｖｏでＣｋβ−８ポリペプチドの短縮形をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを用いて操作し、これらのポリペプチドを発現する操作した細胞を患者に投与する。同様に、細胞をｉｎｖｉｖｏのポリペプチドの発現のためにｉｎｖｉｖｏで操作してもよい。当業界で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を用いてもよい。レトロウイルスプラスミドベクターを用いて、種々の手段（例えばエレクトロポレイション）によりパッケージングセルライン（例えば、ＰＥ５０１）を導入してプロデューサーセルラインを形成する。好ましい具体例において、ポリヌクレオチド配列を含有するレトロウイルス発現ベクターはＬＴＲなどのプロモーターの制御下にあり、選択可能な薬剤耐性マーカー（例えば、ｎｅｏ）を含有する。これらのベクターの調製および得られたセルラインは当業者に、また本明細書に記載されている技術からよく知られたものである。プロデューサーセルラインはポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクター粒子を用いて線維芽細胞または内皮細胞などの真核細胞をｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏのいずれかで導入する。導入された真核細胞は次にタンパク質をコードする核酸配列を発現する。本発明の配列はさらに染色体同定について重要である。配列は特異的に標的にされ、個々の染色体上の特定の位置でハイブリッド形成できる。染色体についてのＤＮＡのマッピングは病気に関連する遺伝子の相関において重要な段階である。当業者に公知の技術の１つでは、個々のヒトの染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに用いるプライマーの調製を含む。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するこれらのハイブリッドだけが増幅されたフラグメントを生じる。当業者に公知の他のマッピング法は、正常部位ハイブリダイゼーション、標識した流動分別染色体でのプレスクリーニング、同じＰＣＲプライマーを用いた特定の染色体のフラグメントへのサブローカライゼーション、および染色体特異性−ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択を包含するが、これに限定されない。分裂中期染色体に対するｃＤＮＡクローンの蛍光正常部位ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、１工程における正確な染色体位置を得るために用いることができる。配列を正確な染色体位置に決定すると、配列の物理的位置を遺伝子地図データと相関させることができる。遺伝子と病気との関係は連関分析により確認できる。病気にかかった個体とかかっていない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列におけるいずれの違いも病気を表示しうる。例えば、病気にかかった個体にのみ見いだされるＤＮＡにおける突然変異は、病気の原因物質であり得る。ポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、あるいはその類似体、またはこれらを発現する細胞を免疫原として用いて、これに対する抗体を産生することができる。これらの抗体は、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明はさらに、キメラ、単鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物も包含する。当業界で公知の種々の手順を、このような抗体およびフラグメントの産生について用いる。標準法によりに調製したポリクローナル抗体を、該ポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するのに用いることができる。モノクローナル抗体の調製について、連続セルライン培養により産生される抗体を提供するいずれの技術も用いることができる。さらに、本発明の免疫原性ポリペプチドに対するヒト化抗体を産生するのに、単鎖抗体の産生について記載された技術を用いてもよい。また、本発明の免疫原性ポリペプチドに対するヒト化抗体を発現するのに、トランスジェニックマウスを用いてもよい。本発明をさらに以下の実施例を参照して記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないと理解される。以下の実施例の理解を助けるために、頻出法および／または用語を記載する。本発明における出発プラスミドは、市販されているか、無制限に公に入手可能であるか、または公開された手順にしたがって入手可能なプラスミドから構築できる。加えて、記載されているものと等価なプラスミドは当業界で公知であり、当業者には明らかである。本発明においてＤＮＡの「消化」に用いる種々の制限酵素は商業的に入手可能であり、その反応条件、コファクターおよび他の要件は、当業者に知られているようにして用いた。開裂したフラグメントの寸法分離を８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。オリゴヌクレオチドは化学的に合成された一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２本の相補ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを意味する。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’ホスフェートを有しないので、キナーゼの存在下でホスフェートにＡＴＰを添加しないで他のオリゴヌクレオチドと結紮できない。合成オリゴヌクレオチドを脱ホスホリル化していないフラグンメントと結紮する。特記しないかぎり、形質転換は、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅｂ，Ａ、バイロロジー（Ｖirology）１９７３、５２、４５６−４５７の方法において記載されているようにして行った。以下の実施例は例示目的のみで提示されたものであって、本発明の範囲をなんら制限するものではない。実施例実施例１：Ｃｋβ−８の細菌性発現および精製Ｃｋβ−８をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７６を、まず処理したＣｋβ−８タンパク質の５’および３’末端配列(シグナルペプチド配列を除く) およびＣｋβ−８遺伝子に対するベクター配列３’に対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは配列５’ＴＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ３’(配列番号：５)を有し、３’プライマーは配列５’ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３ ’(配列番号：６)を有する。これらのプライマーはそれぞれアンピシリン耐性細菌発現ベクターＰＱＥ−９[キアゲン・インコーポレイテッド(Ｑuigen,Ｉnc.，Ｃhatswarth，ＣＡ)]のポリリンカー領域中へのクローニングに用いられるＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限部位を含む。増幅された配列をフレーム中ＰＱＥ− ９中にヒスチジンタグおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）をコードする配列と結紮した。この結紮を、複数のプラスミドｐＲＥＰ４を含有するイー・コリＭ１５／ｒｅｐ４株（キアゲン）を形質転換するのに用いた。ｐＲＥＰ４はｌａｃＩリプレッサーを発現し、さらにカナマイシン耐性を付与する。形質転換体をそのアンピシリン／カナマイシンを補足したＬＢプレート上で増殖する能力により選択した。望ましい構造を有するクローン（制限分析により単離し、確認）をＡｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方で補足したＬＢ培地中液体培地中で一夜増殖させた。この培養物を用いて、大きな培養物に１：１００ないし１：２５０の割合で接種した。細胞を０．４と０．６間の光学密度６００まで増殖させた。ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド）を次に最終濃度１ｍＭに添加した。細胞をさらに３ないし４時間増殖させ、遠心分離により収穫した。細胞ペレットをカオトロフィー剤、６ＭグアニジンＨＣｌ中に可溶化させ、清澄化させ、６−Ｈｉｓタグを含有するタンパク質による緊密な結合をもたらすような条件下でニッケル−キレートカラム上クロマトグラフィーにかけた[Ｈochuli,Ｅ.ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Ｊ.Ｃhromatography）１９８４、４１１、１７７−１８４]。切断Ｃｋβ− ８（９５％純度）を６ＭグアニジンＨＣｌｐＨ５中カラムから溶出させ、復元のために３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元）および２ｍＭグルタチオン（酸化）に調節した。この溶液中１２時間インキュベートした後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透析した。実施例２：ＣＯＳ細胞における組換えＣｋβ−８の発現プラスミド、ＣＭＶ−Ｃｋβ−８ＨＡの発現は、アンピシリン耐性遺伝子およびＣＭＶプロモーター、それに続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、ならびにポリアデニル化部位を含有するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロゲン）から誘導される。切断Ｃｋβ−８配列およびフレーム中で３’末端と融合したＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントをベクターのポリリンカー領域中にクローンし；組換えタンパク質発現をＣＭＶプロモーター下で行う。ＨＡタグはすでに記載されているようにインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する[Ｉ.Ｗilsonら、セル（Ｃell）１９８４、３７：７６７]。ＨＡタグの標的タンパク質への浸出により、ＨＡエピトープを認識する抗体での組換えタンパク質の検出が容易になる。Ｃｋβ−８の組換え短縮形の発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−デキストラン法により発現ベクターでトランスフェクションする[Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆri tsch、Ｔ.Ｍaniatis、モレキュラ・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル( Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabora tory Ｐress)(１９８９)]。細胞を８時間３５Ｓ−システインでトランスフェクションの２日後に標識する。培地を次に集め、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液(１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５)）で溶解させる[Ｗilson,Ｉ. ら、同上、１９８４、３７：７６７]。細胞溶解物および培地の両方をＨＡ特異性モノクローナル抗体で沈殿させる。析出したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析する。実施例３：バクロウイルス発現系を用いたケモカインＣｋβ−８の短縮形の発現および精製ＳＦ９細胞を、Ｃｋβ−８ｃＤＮＡを発現するようにデザインされた組換えバクロウイルスで感染させた。細胞を１０リットルの培地中、感染多重度２で感染させ、低血清条件下、２８℃で７２ないし９６時間感染させた。感染培地からの細胞片を低速遠心分離により除去した。プロテアーゼ抑制物質カクテルを上清に最終濃度２０μｇ／ｍｌ（１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌＥ−６４および１ｍＭＥＤＴＡ）で添加した。これらの特定の培養条件（すなわち、低血清）によりＣｋβ−８ポリペプチドのいくつかのＮＨ−２末端切断形態が得られる。２０ないし３０μｌの上清を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にかけることにより上清中のＣｋβ−８のレベルをモニターした。Ｃｋβ−８の短縮形を数ｍｇ／リットルの発現レベルに対応する可視バンドとして検出した。末端切断Ｃｋ β−８を３段階精製法によりさらに精製した：１）ヘパリン結合アフィニティークロマトグラフィー。バクロウイルス培養物の上清を、１００ｍＭＨＥＰＥ／ＭＥＭ／ＮａＯＡｃｐＨ６を含有する１／３体積の緩衝液と混合し、０．２２μｍ膜を通して濾過した。サンプルを次にヘパリン結合カラム（ＨＥ１多孔性２０、バイオ−パースペクティブ・システム・インコーポレイテッド）にかけた。ＣＫβ−８の短縮形を約３００ｍＭＮａＣｌで５０ｍＭＨＥＰＥ／ＭＥＳ／ＮａＯＡｃ（ｐＨ６）中５０ないし５００ｍＭＮａＣｌの直線的勾配で溶出し；２）カチオン交換クロマトグラフィー。ヘパリンクロマトグラフィーにより富化したタンパク質を５０ｍＭＨＥＰＥ／ＭＥＳ／ＮａＯＡｃ（ｐＨ６）を含有する緩衝液で５倍希釈にした。得られた混合物を次にカチオン交換カラム（Ｓ／Ｍ多孔性２０、バイオ−パースペクティブ・システム・インコーポレイテッド）にかけた。末端切断されたＣｋβ−８を５０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＭＥＳ／ＮａＯＡｃ（ｐＨ６）中２５から３００ｍＭのＮａＣｌの直線的勾配中２５０ｍＭＮａＣｌで溶出し；３）サイズ排除クロマトグラフィー。カチオン交換クロマトグラフィーの後に、末端切断されたＣｋβ−８をサイズ排除カラム（ＨＷ５０、ＴＯＳＯＨＡＡＳ、１．４×４５ｃｍ）によりさらに精製した。精製したサンプルのアミノ酸配列化により、タンパク質の４つの切断形態（配列番号１、２、３、および４）に対応する少なくとも４つの主な配列が判明した。実施例４：Ｃｋβ−８の短縮形を含む混合物でのＥＯＬ−３細胞およびＰＢＳの刺激ＥＯＬ−３細胞を標準的増殖条件下で増殖させ、２週間１μＭＮａブチラートで分画した。ＰＢＬ（末梢血白血球）をヒトドナーから静脈穿刺により得た。ＰＢＬを標準的技術により精製した。両細胞調製物に別々にＦＵＲＡ−２（１μ Ｍ）を４５分間添加た。１×１０⁶／ｍｌ（合計２ｍｌ）の細胞をプラスチック製キュベットに移した。ＣＫβ−８の短縮形（８７１ａ、８７１ｂ、８７１ｃ、８７１ＰＲ）または長形（８８９）を０．３３ないし３３ｎＭの濃度で添加する前に、蛍光分光光度計を調節して、ベースライン記録を得た。蛍光の増加を分光光度計でモニターした。細胞内部のフリーなＣａ＋＋における変化を、まず細胞を過剰のＣａ＋＋の存在下でＴｒｉｔｏｎ×１００で溶解させ(Ｆｍａｘを得るため)、次にＦｍｉｎを得るために５ｍＭＥＧＴＡを添加することにより計算した。フリーなＣａ＋＋の割合は最小および最大値から計算できる。ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）は公知のケモカインであり、正の対照として用いた。 Detailed Description of the Invention Truncated Chemokine β-8 Background of the Invention The present invention relates to polypeptide and polynucleotide sequences that encode truncated forms of chemokine beta 8 (ckβ-8). In particular, the present invention relates to the use of polypeptides and polynucleotides, the production of polynucleotide and polypeptide sequences, and the inhibition of the action of polypeptides. Chemokines, also called reciprocal cytokines, are a subfamily of structurally and functionally related cytokines. These molecules are small, inducible pro-inflammatory proteins. In general, chemokines exhibit 20-75% homology at the amino acid level and are characterized by four conserved cysteine residues forming two disulfide bonds. Based on the sequence of the first two cysteine residues, chemokines have been classified into two subfamilies, alpha and beta. In the Alf subfamily, the first two cysteines are separated by amino acids and are therefore referred to as the "CXC" subfamily. In the Beta subfamily, the two cysteines are in adjacent positions and are therefore referred to as the "CC" subfamily. The first cysteine forms a disulfide bond with the third cysteine and the second with the fourth, resulting in a similar tertiary structure for many chemokines. Structurally, many chemokines undergo proteolytic processing to yield a functionally "mature" protein. This usually involves cleavage of a short leader sequence at the N-terminal portion of the protein. At least 14 distinct α-chemokines and 12 β-chemokines have been described at the protein and / or cDNA level. Reciprocal cytokines exhibit a wide range of functions. One of the key features is the ability to stimulate chemotactic migration of different cell types, such as monocytes, neutrophils, T lymphocytes, basophils, and fibroblasts. The α and β subspecies differ somewhat in their cell target selectivity. Most of the alpha chemokines attract neutrophils, fibroblasts, T cells, and NK cells. β-chemokines mainly attract monocytes and T lymphocytes. Many chemokines have pro-inflammatory activity and are involved in multiple steps during the inflammatory response. These activities include stimulation of histamine release, release of lysosomal enzymes and leukotrienes, increased attachment of target immune cells to endothelial cells, increased complement protein binding, induction of expression of granulocyte adhesion molecules and complement receptors, and Includes respiratory bursts. In addition to its involvement in inflammation, some chemokines have been demonstrated to exhibit other activities. For example, macrophage inflammatory protein (MIP-1) can inhibit hematopoietic stem cell proliferation, platelet factor 4 (PF-4) is a potent inhibitor of endothelial cell proliferation, and interleukin-8 (IL-8) is a potent inhibitor of keratinocytes. Promotes proliferation, GRO is an autocrine growth factor for melanoma cells. Chemokines are involved in many physiological and disease states, especially those with inflammatory components. These include, but are not limited to, lymphocyte exchange, wound healing, hematopoietic regulation and immunological disorders such as allergies, asthma and arthritis. Many chemokines were initially isolated as products of an inflammatory response. For example, MIP-1 was originally isolated as an endotoxin-induced pro-inflammatory cytokine produced by macrophages. Other members of this subfamily were similarly identified based on pro-inflammatory as well as amino acid sequence homology. This includes full length as well as truncated Ckβ-8 oligonucleotides of the invention. SUMMARY OF THE INVENTION According to one aspect of the present invention, a mixture of novel polypeptides that are truncated forms of human Ckβ-8, and biologically active, diagnostically or therapeutically useful fragments, analogs and derivatives thereof are provided. Provided. According to another aspect of the present invention, such polypeptides, including mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA, and their biologically active, diagnostically or therapeutically useful fragments, analogs and derivatives are encoded. An isolated nucleic acid molecule is provided. According to yet another aspect of the present invention, a recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host cell having a nucleic acid sequence is cultured under conditions that promote expression of said protein, followed by recovery of said protein. Techniques for producing such polypeptides are provided by the art. According to yet another aspect of the invention, such a polypeptide, or such a polypeptide, for therapeutic purposes, for example, to protect bone marrow stem cells from chemotherapeutic agents during chemotherapy or to stimulate wound healing. Uses of the polynucleotides encoding the peptides are provided. According to another aspect of the present invention, there are provided antibodies against such polypeptides. According to yet another aspect of the present invention, there is provided an antagonist to such a polypeptide, which suppresses the action of such a polypeptide, for example, treating aplastic anemia, spinal dysplasia syndrome, asthma and arthritis. What is used to do so is provided. According to another aspect of the invention, there is also provided a nucleic acid probe comprising a nucleic acid molecule of sufficient length to specifically hybridize with a Ckβ-8 nucleic acid sequence. According to yet another aspect of the invention, a diagnostic method for detecting diseases associated with insufficient and overexpression of a polypeptide and for detecting mutations in a nucleic acid sequence encoding such a polypeptide Is provided. According to yet another aspect of the present invention, such polypeptides, or polynucleotides encoding such polypeptides, for in vitro purposes in connection with scientific studies, DNA synthesis and DNA vector production, human Uses are provided as research reagents for the purpose of developing therapeutics and diagnostics for the treatment of disease. These and other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION DNA sequences encoding polypeptides structurally related to the proinflammatory "mutual secretion" chemokine superfamily have been described. The polynucleotide sequence encoding full-length Ckβ-8 (120 amino acids) was from an aortic endothelial cDNA library. The present invention relates to novel truncations of Ckβ-8 that contain only the long form 82, 76, 75 or 74 C-terminal amino acids. Cleave the N-terminal amino acid as well as the 21 residue signal peptide sequence. For the long form of Ckβ-8, the first two cysteine residues in these clones are in adjacent positions to become “CC” or are members of the chemokine beta subfamily. The presence of this motif distinguishes them from the chemokine subfamily ("CXC"), in which the first two cysteine residues are interrupted by amino acids. The polynucleotide sequence encoding the mature polypeptide (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4) may be in any nucleic acid form, such as RNA, ssDNA, genomic DNA, including additional coding and non-coding sequences attached to the polypeptide. expressed. Furthermore, because of the synonymity of the amino acid codes, any DNA coding sequence that encodes the same mature polypeptide is considered to be within the scope of the present invention. Variants, allelic or non-naturally occurring forms of any of this sequence are also included. The present invention further provides that a coding sequence that facilitates expression or secretion of the protein from the cell or acts as a marker (eg, an HA tag) for identifying the protein in the cell is fused to other DNA sequences in the same reading frame. And polynucleotides. The invention further relates to polynucleotide sequences that hybridize with at least 50%, preferably 70%, sequence identity to the described sequences. These polynucleotides preferably encode a polypeptide that retains the same biological function or activity as the mature polypeptide. Alternatively, the sequence is a polynucleotide having preferably 50 bases that has identity and hybridizes to the sequence of the invention, but does not retain activity. Such a sequence is used as a probe or PCR primer. The polypeptide of the present invention may be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide, or a synthetic polypeptide. Derivatives of these polypeptides are those in which one or more amino acid substitutions are present; those in which one or more amino acids contain a substituent; one or more mature proteins condensed with other compounds. Or another amino acid is condensed with the mature protein. The polypeptides of the present invention are preferably provided in an isolated form, and preferably are purified to homogeneity. The invention further relates to a vector comprising a polynucleotide of the invention, a host cell genetically engineered with this vector, and the production of a polypeptide of the invention by recombinant techniques. Host cells are genetically engineered with the vectors (cloning or expression) of the present invention. Culture conditions for activating the promoter, selecting transformants, or amplifying the truncated Ckβ-8 gene for these cells will be apparent to those skilled in the art. The polynucleotide sequences are included in any of a variety of expression vectors, as long as they are replicable and viable in the host cell. The polynucleotide sequence inserted into the expression vector is under the control of a suitable promoter that directs mRNA synthesis (eg, the LTR promoter). The expression vector further includes a ribosome binding site for translation initiation, a transcription terminator, an enhancer element that increases transcription (eg, the SV40 late enhancer), and a suitable selectable marker (eg, such as the SV40 late enhancer) to ensure that the vector is maintained in the host. , Ampicillin resistance gene). Host cells can be higher eukaryotic cells, such as mammalian or insect cells, lower eukaryotic cells, such as yeast, or prokaryotic cells, such as bacteria. Introduction of this construct into host cells can be accomplished by a variety of protocols. All of the above steps will be apparent to those skilled in the art. Cloning steps and host and vector selection are well known in the art. [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.M. Y) (1989)]. The protein can be synthesized in the host cell under the control of a suitable promoter. Cell-free translation systems can also be used to produce such proteins using RNA from the DNA constructs of the present invention. Alternatively, the polypeptides of the present invention can be synthesized on a conventional peptide synthesizer. After transformation or transfection of the appropriate host strain and growth of the host strain to the appropriate cell density, the selected promoter is induced by appropriate means (eg, temperature shift or chemical induction) and the cells are cultured for an additional period. I do. Cells are typically harvested by centrifugation, disrupted by physical or chemical means, and purified to homogeneity by various methods (eg, chromatography, HPLC). Depending on the host cell employed, the polypeptide may be modified in some way (eg, by glycosylation). The polypeptides of the present invention also include an initial methionine residue. The long form of Ckβ-8 is a chemoattractant for leukocytes and is therefore used for various immunomodulatory and inflammatory functions and various disease states. This protein is mainly expressed in tissues of hematopoietic origin. One of the important biological effects of Ckβ-8 polypeptide on leukocytes is the stimulation of Ca ++ reserve mobilization. This recruitment is involved in the functional activation of the cell. Stimulation of differentiated EOL-3 cells with a mixture containing four truncated forms of Ckβ-8 (SEQ ID NOs: 1-4) results in an immediate increase in intracellular Ca ++ in a dose-dependent manner. When tested individually, the truncated form having SEQ ID NO: 4 is the most active. In contrast, the long form of Ckβ-8 is approximately 1,000 times less potent than the truncated form with Ca ++ mobilization. The efficacy of the truncated form of the present invention is to protect bone marrow stem cells from chemotherapeutic agents during chemotherapy, eliminate leukemic cells, stimulate the immune response, modulate hematopoiesis, lymphocyte exchange, psoriasis, treat solid tumors, It is involved in the efficacy of this chemokine in therapeutic use, including but not limited to improving host defense against chronic and acute infections, and stimulating wound healing. The polynucleotides and polypeptides of the invention can be used as research reagents in the synthesis of DNA and production of DNA vectors, and in the development of therapeutics and diagnostics for the treatment of human diseases (eg, in the expansion of immature hematopoietic progenitor cells). Used for purposes. Fragments of this truncated Ckβ-8 polynucleotide sequence can also be used as hybridization probes to isolate other genes with high sequence similarity. Techniques for such experiments are known to those skilled in the art. The invention further relates to the use of these sequences as part of a diagnostic method for detecting a disease or susceptibility to a disease associated with the presence of a mutation in a nucleic acid sequence. Such diseases are associated with insufficient expression of chemokine polypeptides. For example, individuals having a mutation in the Ckβ-8 gene are detected at the DNA level by various techniques such as PCR. Genetic testing based on DNA sequence differences is performed by detecting changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments in gels with or without denaturing agents. Detection of specific DNA sequences is achieved by methods such as hybridization, RNase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing, RFLP analysis, and Southern blotting of genomic DNA. Mutations can also be detected by normal site analysis. The present invention also provides diagnostics for detecting altered levels of Ckβ-8 protein in various tissues, as overexpression of a protein relative to a normal control tissue sample will detect the presence or susceptibility to the disease, eg, a tumor. About the law. Assays for detecting levels of Ckβ-8 in a sample derived from a host are well known to those of skill in the art and include radioimmunoassays, competitive binding assays, western blot assays, ELISA assays and “sandwich” assays. . The present invention provides a method for identifying a receptor for a chemokine polypeptide. The gene encoding the receptor can be identified by a number of methods known to those skilled in the art, including ligand panning and FACS sorting. An alternative method of receptor identification involves photoaffinity binding of the labeled polypeptide to cell membranes or extracts that express the receptor molecule. The labeled complex can be isolated and subjected to protein microsequencing. The resulting amino acid sequence is used to design a set of synonymous oligonucleotide probes to screen a cDNA library to identify the gene encoding the putative receptor. The present invention provides a compound screening method to identify agents and antagonists for the chemokine polypeptides of the present invention. Chemotaxis is analyzed by placing cells chemically attracted by these polypeptides on top of a filter that has pores (5 mm) large enough to allow the cells to pass through. A solution of the active agent or antagonist is placed in the bottom chamber and cells are allowed to migrate or not migrate through the membrane for a period of time. Alternatively, the receptor for Ckβ-8 is incubated with the labeled polypeptide in the presence of the compound. The ability of the compound to either block this interaction or to interact with the receptor in the absence of the polypeptide can be measured. Examples of effective truncated Ckβ-8 antagonists include antibodies, oligonucleotides that bind the polypeptide, or polypeptides that bind to the receptor for the wild-type polypeptide but do not retain biological activity. Antisense technology used to control gene expression can also be an effective antagonist. The applicability of the technique will be apparent to those skilled in the art. Antagonists are used to treat infectious diseases, such as silicosis, sarcoidosis, idiopathic pulmonary fibrosis, idiopathic hypereosinophilic syndrome, and endotoxin shock, all by preventing the production of the polypeptides of the invention. Can be Antagonists are also used in the treatment of atherosclerosis by preventing the infiltration of monocytes in the arterial wall. Antagonists are used to treat histamine-mediated allergic reactions and various immunological disorders, including the dermis. Antagonists are also used to treat chronic and acute inflammation by preventing the attraction of monocytes to the wound site. They are also used in the treatment of inflammatory lung disease, general inflammation, and rheumatoid arthritis by preventing the influx of monocytes to diseased sites. Antagonists are also used to treat patients with bone marrow failure in aplastic anemia or myelodysplastic syndrome. They are also used in the treatment of asthma and allergy and subepithelial basement membrane fibrosis, a characteristic of asthmatic lungs. Chemokine polypeptides and agents and antagonists are used in combination with a suitable pharmaceutical carrier, such as saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, and combinations thereof. The formulation must suit the mode of administration. The present invention further provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. Polypeptides, agents, and antagonists may be used in combination with other therapeutic compounds. The pharmaceutical compositions are administered in an effective amount, such as by the topical, intravenous, intraperitoneal tissue, intramuscular, intratumoral, subcutaneous, intranasal, or intradermal route, in an amount effective for the treatment of the particular indication. . These uses will be apparent to those skilled in the art. Antagonists that are chemokine polypeptides, agents, or polypeptides are used in accordance with the invention by expression of such polypeptides in vivo. This type of gene therapy is well known to those skilled in the art. For example, cells from a patient are engineered ex vivo with DNA or RNA encoding a truncated form of the Ckβ-8 polypeptide, and the engineered cells expressing these polypeptides are administered to the patient. Similarly, cells may be engineered in vivo for expression of the polypeptide in vivo. As is known in the art, retroviral particles containing RNA encoding a polypeptide of the invention may be used. Using a retroviral plasmid vector, a packaging cell line (eg, PE501) is introduced by various means (eg, electroporation) to form a producer cell line. In a preferred embodiment, the retroviral expression vector containing the polynucleotide sequence is under the control of a promoter such as the LTR and contains a selectable drug resistance marker (eg, neo). The preparation of these vectors and the resulting cell lines are well known to those of skill in the art and from the techniques described herein. The producer cell line produces infectious retroviral vector particles that contain the nucleic acid sequence encoding the polypeptide. Such retroviral vector particles are used to introduce eukaryotic cells, such as fibroblasts or endothelial cells, either in vitro or in vivo. The introduced eukaryotic cells then express the nucleic acid sequence encoding the protein. The sequences of the present invention are further important for chromosome identification. Sequences are specifically targeted and can hybridize at specific locations on individual chromosomes. Mapping DNA for chromosomes is an important step in the correlation of disease-related genes. One technique known to those of skill in the art involves the preparation of primers for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Only those hybrids containing the human gene corresponding to the primer will yield an amplified fragment. Other mapping methods known to those skilled in the art include normal site hybridization, pre-screening on labeled flow-sorted chromosomes, sublocalization to specific chromosomal fragments using the same PCR primers, and chromosome-specific-cDNA libraries , But is not limited to, pre-selection by hybridization to construct Fluorescent normal site hybridization (FISH) of a cDNA clone to a metaphase chromosome can be used to obtain a precise chromosomal location in one step. Once the sequence has been determined to the exact chromosomal location, the physical location of the sequence can be correlated with genetic map data. The relationship between genes and diseases can be confirmed by association analysis. Any difference in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals may indicate a disease. For example, mutations in DNA found only in diseased individuals may be causative agents of the disease. Antibodies to the polypeptide, its fragments or other derivatives, or analogs thereof, or cells expressing them can be used as immunogens. These antibodies can be, for example, polyclonal or monoclonal antibodies. The invention further encompasses chimeric, single-chain and humanized antibodies, as well as Fab fragments, or the products of a Fab expression library. Various procedures known in the art are used for the production of such antibodies and fragments. Polyclonal antibodies prepared by standard methods can be used to isolate a polypeptide from a tissue that expresses the polypeptide. For preparation of monoclonal antibodies, any technique which provides antibodies produced by continuous cell line cultures can be used. In addition, techniques described for the production of single-chain antibodies may be used to produce humanized antibodies to the immunogenic polypeptides of the invention. Also, transgenic mice may be used to express humanized antibodies to the immunogenic polypeptides of the invention. The present invention will be further described with reference to the following examples; however, it is understood that the present invention is not limited to such examples. Frequently used methods and / or terms are described to assist in understanding the following examples. The starting plasmids in the present invention are either commercially available, publicly available without limitation, or can be constructed from available plasmids according to published procedures. In addition, plasmids equivalent to those described are known in the art and will be apparent to those skilled in the art. The various restriction enzymes used for "digestion" of DNA in the present invention are commercially available and their reaction conditions, cofactors and other requirements were used as would be known to one of skill in the art. Dimensional separation of the cleaved fragments is performed using an 8% polyacrylamide gel. Oligonucleotide means either a chemically synthesized single stranded polydeoxynucleotide or two complementary polydeoxynucleotide chains. Such synthetic oligonucleotides have no 5 'phosphate and cannot be ligated to other oligonucleotides without the addition of ATP to the phosphate in the presence of the kinase. The synthetic oligonucleotide is ligated with a fragment that has not been dephosphorylated. Unless otherwise specified, transformation was performed by Graham, F. et al. And Van der Eb, A, Virology 1973, 52, 456-457. The following examples are offered for illustrative purposes only and do not limit the scope of the invention in any way. EXAMPLES Example 1 Bacterial Expression and Purification of Ckβ-8 The DNA sequence encoding Ckβ-8, ATCC # 75676, was obtained by first treating the 5 ′ and 3 ′ terminal sequences of the treated Ckβ-8 protein (excluding the signal peptide sequence). ) And the PCR primers corresponding to the vector sequence 3 ′ for the Ckβ-8 gene. The 5 'oligonucleotide primer has the sequence 5' TCAGGA TCCGTCCAAAAGATAGCAGA 3 '(SEQ ID NO: 5) and the 3' primer has the sequence 5 'CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT3' (SEQ ID NO: 6). These primers were each used for the ampicillin-resistant bacterial expression vector PQE-9 [Qiagen, Inc. , Chatswarth, Calif.) Contains the BamHI and XbaI restriction sites used for cloning into the polylinker region. The amplified sequence was ligated in frame with the sequence encoding the histidine tag and ribosome binding site (RBS) in PQE-9. This ligation was used to transform E. coli strain M15 / rep4 (Qiagen) containing multiple plasmids pREP4. pREP4 expresses the lacI repressor and further confers kanamycin resistance. Transformants were selected for their ability to grow on LB plates supplemented with ampicillin / kanamycin. Clones with the desired structure (isolated and confirmed by restriction analysis) were grown overnight in liquid medium in LB medium supplemented with both Amp (100 μg / ml) and Kan (25 μg / ml). This culture was used to inoculate a large culture at a ratio of 1: 100 to 1: 250. Remove cells to 0. 4 and 0. Grow to an optical density of 600 between 6. IPTG (isopropyl-BD-thiogalacto-pyranoside) was then added to a final concentration of 1 mM. Cells were grown for an additional 3-4 hours and harvested by centrifugation. The cell pellet was solubilized in a chaotic agent, 6M guanidine HCl, clarified, and chromatographed on a nickel-chelate column under conditions that resulted in tight binding by a protein containing a 6-His tag [Hochuli , E. Et al., Journal of Chromatography (J. Chromatography) 1984, 411, 177-184]. Cleaved Ckβ-8 (95% purity) was eluted from the column in 6M guanidine HCl pH5 and adjusted to 3M guanidine HCl, 100 mM sodium phosphate, 10 mM glutathione (reduced) and 2 mM glutathione (oxidized) for reconstitution. After incubation in this solution for 12 hours, the protein was dialyzed against 10 mM sodium phosphate. Example 2: Expression of recombinant Ckβ-8 in COS cells Expression of the plasmid, CMV-Ckβ-8 HA, is a vector containing the ampicillin resistance gene and the CMV promoter, followed by a polylinker region, the SV40 intron, and a polyadenylation site. Derived from pcDNAI / Amp (Invitrogen). A DNA fragment encoding the truncated Ckβ-8 sequence and the HA tag fused in frame with the 3 ′ end is cloned into the polylinker region of the vector; recombinant protein expression is performed under the CMV promoter. The HA tag corresponds to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein as described previously [I. Wilson et al., Cell 1984, 37: 767]. Leaching of the HA tag into the target protein facilitates detection of the recombinant protein with an antibody that recognizes the HA epitope. For expression of a recombinant truncated form of Ckβ-8, COS cells are transfected with an expression vector by the DEAE-dextran method [J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molecular Cloning: A Laboratory Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989)]. Cells are labeled with 35S-cysteine for 8 hours two days after transfection. The medium was then collected and the cells were washed with detergent (RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0. 1% SDS, 1% NP-40, 0. 5% DOC, 50 mM Tris, pH7. 5)) [Wilson, I. 1984, 37: 767]. Both cell lysate and medium are precipitated with an HA-specific monoclonal antibody. The precipitated protein is analyzed on a 15% SDS-PAGE gel. Example 3 Expression and Purification of Truncated Form of Chemokine Ckβ-8 Using Baculovirus Expression System SF9 cells were infected with a recombinant baculovirus designed to express Ckβ-8 cDNA. Cells were infected at a multiplicity of infection of 2 in 10 liters of medium and infected for 72 to 96 hours at 28 ° C. under low serum conditions. Cell debris from the infection medium was removed by low speed centrifugation. A protease inhibitor cocktail was added to the supernatant at a final concentration of 20 μg / ml (1 μg / ml leupeptin, 1 μg / ml E-64 and 1 mM EDTA). These particular culture conditions (ie, low serum) result in several NH-2 truncated forms of Ckβ-8 polypeptide. The level of Ckβ-8 in the supernatant was monitored by running 20-30 μl of the supernatant on a 15% SDS-PAGE gel. The truncated form of Ckβ-8 was detected as a visible band corresponding to an expression level of a few mg / liter. The truncated Ck β-8 was further purified by a three-step purification procedure: 1) Heparin-binding affinity chromatography. The supernatant of the baculovirus culture was mixed with 1/3 volume of buffer containing 100 mM HEPE / MEM / NaOAc pH6, and the mixture was added to 0. Filtered through a 22 μm membrane. The sample was then applied to a heparin binding column (HE1 porosity 20, Bio-Perspective Systems, Inc.). The truncated form of CKβ-8 was eluted with about 300 mM NaCl with a linear gradient of 50 to 500 mM NaCl in 50 mM HEPE / MES / NaOAc (pH 6); 2) Cation exchange chromatography. The protein enriched by heparin chromatography was diluted 5-fold with a buffer containing 50 mM HEPE / MES / NaOAc (pH 6). The resulting mixture was then applied to a cation exchange column (S / M porosity 20, Bio-Perspective Systems, Inc.). Truncated Ckβ-8 was eluted with 250 mM NaCl in a linear gradient of 25 to 300 mM NaCl in 50 mM HEPES / MES / NaOAc (pH 6); 3) Size exclusion chromatography. After cation exchange chromatography, the truncated Ckβ-8 was converted to a size exclusion column (HW50, TOSO HAAS, 1. (4 × 45 cm). Amino acid sequencing of the purified sample revealed at least four major sequences corresponding to the four truncated forms of the protein (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4). Example 4: Stimulation of EOL-3 cells and PBS with a mixture containing a truncated form of Ckβ-8 EOL-3 cells were grown under standard growth conditions and fractionated with 1 μM Na butyrate for 2 weeks. PBLs (peripheral blood leukocytes) were obtained by venipuncture from human donors. PBL was purified by standard techniques. FURA-2 (1 μM) was added separately to both cell preparations for 45 minutes. 1 × 10 ⁶ / Ml (total 2 ml) cells were transferred to plastic cuvettes. Prior to addition of truncated (871a, 871b, 871c, 871PR) or long (889) forms of CKβ-8 at concentrations of 0.33 to 33 nM, the fluorescence spectrophotometer was adjusted to obtain a baseline record. . The increase in fluorescence was monitored with a spectrophotometer. Changes in free Ca ++ inside the cells were calculated by first lysing the cells with Triton x 100 in the presence of excess Ca ++ (to obtain Fmax) and then adding 5 mM EGTA to obtain Fmin. The percentage of free Ca ++ can be calculated from the minimum and maximum values. MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1) is a known chemokine and was used as a positive control.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オシャネシー，ダニエルアメリカ合衆国19468ペンシルベニア州リマリック、ヒッコリー・グローブ・ドライブ912番 (72)発明者フォーンウァルド，ジェイムズ・アランアメリカ合衆国19403ペンシルベニア州ノーリスタウン、リングネック・ロード 2849番 (72)発明者オドネル，ケビンアメリカ合衆国19002ペンシルベニア州アンバー、イースト・パーク・アベニュー 204番──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI C12N 5/10 C12Q 1/02 C12P 21/02 1/68 A C12Q 1/02 C12N 5/00 B 1/68 A61K 37/02 // (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:91) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES , FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN , TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, BB , BG, BR, C A, CN, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KG, KP, KR, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO , SG, SI, SK, TR, TT, UA, US, UZ, VN Alan United States 19403 Ringneck Road, Norristown, Pennsylvania 2849 (72) Inventor O'Donnell, Kevin United States 19002 East Park Avenue, Amber, Pennsylvania 204

Claims

[Claims] 1. A polypeptide comprising SEQ ID NO: 1. 2. A polypeptide comprising SEQ ID NO: 2. 3. A polypeptide comprising SEQ ID NO: 3. 4. A polypeptide comprising SEQ ID NO: 4. 5. A composition comprising a mixture of the polypeptides of claims 1, 2, 3, and 4. 6. A polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1, 2, 3, or 4. Vector containing the code. 7. A host cell genetically engineered with the vector of claim 6. 8. A method for producing the polypeptide according to claim 1, 2, 3, or 4, wherein the method comprises Comprising a polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1, 2, 3, or 4. Those consisting of expressing the polypeptide from a host cell genetically engineered with a vector Law. 9. An agent relating to the polypeptide according to claim 1, 2, 3, or 4. 10. An antagonist for the polypeptide according to claim 1, 2, 3, or 4. 11. Administering to the patient an effective amount of the polypeptide of claim 1, 2, 3, or 4. Administering Ckβ-8 to a patient in need thereof. 12. Ckβ comprising administering to a patient an effective amount of the composition of claim 5. Treatment of patients in need of -8. 13. C comprising administering to the patient an effective amount of the antagonist of claim 10. A method of treating a patient in need of kβ-8 suppression. 14． An antagonist and agonist of the polypeptide according to claim 1, 2, 3, or 4. Identification of the test substance, the selected test cells, the compounds to be screened and the Combining the polypeptides of claims 1, 2, 3, or 4; To determine whether it is an effective agent or antagonist How to be. 15. An underexpression of the polypeptide according to claim 1, 2, 3, or 4. A method of diagnosing a disease or suspicion for a disease, wherein the nucleus encodes a polypeptide. A method comprising determining whether there is a mutation in the acid sequence.