JPH11504658A - 細胞マイトジェネシス及びモトジェネシスのペプチドアンタゴニスト及びその治療的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】

Description

【発明の詳細な説明】 細胞マイトジェネシス及びモトジェネシスの ペプチドアンタゴニスト及びその治療的使用 発明の技術分野 本発明は新規化合物と、腫瘍増殖及び／又は腫瘍転移を含めた癌及び乾癬等の 増殖性疾患の防除又は治療と炎症、アレルギー、自己免疫、ウイルス及び心臓血 管疾患の防除又は治療に有用な薬剤として前記化合物を含有する医薬組成物に関 する。これらの新規化合物は、全細胞レセプター及びサイトソルトランスデュー サー内の数種のホスホチロシン含有モチーフがシグナル伝達過程の種々の経路に 介在するサイトソルトランスデューサー及び他のエフェクタータンパク質に含ま れる広範なＳＨ２ドメインにより認識されるのを阻害するというユニークな性質 をもち、マイトジェネシスと侵入及び転移をもたらす活性であるモトジェネシス を導く経路に介在する重要な要素であるアダプタートランスデューサーＧｒｂ２ のＳＨ２ドメインに対して特に高い親和性をもつ。本発明は更に、前記化合物の 製造方法と、前記化合物を利用した治療方法にも関する。発明の背景 レセプターから核に至るサイトソルシグナル伝達経路は細胞外増殖因子と細胞 膜に封入されたそれらのレセプターとの相互作用に従い、適正な生物学的応答を 刺激するために核にシグナルを導く部分的に未知の生化学事象の複雑な連鎖から なる。マイトジェネシスを誘導するシグナル伝達では、活性化レセプターはメカ ニズムで中枢的役割を果たすと思われるタンパク質、即ちｐ２１^ras等のサイト ソル又は膜結合タンパク質に何らかの方法でシグナルを伝達する。他方、これら のタンパク質は更にシグナルを多段階で核に伝達することができる。数種のヒト 腫瘍で活性化ｒａｓ癌原遺伝子が検出されている。活性化の頻度は非常に高いと 言え、例えば活性化ｒａｓ遺伝子は全造血新生物の３０％、外分泌膵の腫瘍の＞ ９０％に存在する。一般に癌原遺伝子は細胞シグナル伝達に密接に関与するチロ シンキナーゼレセプター及びトランスデューサー等の正常タンパク質に導かれる 。数種の癌遺伝子は突然変異もしくは過剰発現形態又は染色体転位からのキメラ 遺伝子であり、シグナル伝達メカニズムで作用するタンパク質をコードし、腫瘍 進行の原因となる無制御細胞増殖を誘発する構成的に活性化されたシグナル伝達 タンパク質を生じる。細胞内シグナル伝達はその成分の種類とそれらの役割に関 する解明が進みつつあり、腫瘍治療の新規アプローチに有望な報告が発表されつ つある。 活性化レセプターから核へのシグナル伝達は、多少なりとも連携し合う恐らく 冗長な経路で相互作用する数種のタンパク質により行われると思われる。該当す る主な分子事象のうちで特に関係のあるものを挙げると、１）タンパク質チロシ ンリン酸化（キナーゼ活性）、２）認識（特定タンパク質ドメイン間の物理的結 合）、３）タンパク質セリン／スレオニンリン酸化(キナーゼ活性)、４）チロシ ンとセリン／スレオニンリン酸化のどちらも逆効果により調節されるので、特定 酵素（ホスファターゼ）による脱リン酸化が挙げられる。これらの事象がシグナ ル伝達経路網で２回以上発生することもある。これらの主要相互作用のうちで、 治療アプローチに利用できると思われるのは「サイトソルトランスデューサー」 によるリン酸化チロシンドメインの認識である。 第１段階として、増殖因子（例えばＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ等）は そのレセプターである細胞膜にまたがるタンパク質と相互作用してレセプター分 子を相互に接近させること によりこのレセプターを活性化させる。実際に、レセプター分子は相互に接近し 、細胞の内側で隣接分子のサイトソル部分の数個のチロシン残基上の１分子のキ ナーゼドメインにより細胞内ドメインのレベルで相互リン酸化が可能になり、又 は結合したチロシンキナーゼによりリン酸化される。レセプターのサイトソル領 域がチロシンでリン酸化された部位を数個もつようになると、これらのリン酸化 部位と数種の他のタンパク質の適正なドメインとの間に分子認識が生じ得る。 これらのタンパク質は「サイトソルトランスデューサー」であり、実際にシグ ナル伝達経路を持続し、リガンドとレセプターの結合を遺伝子の転写を制御する 核因子の調節に結び付け、従って、最終的に細胞増殖等の生物学的応答の発生に 結び付ける（Ｊ．ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒとＡ．Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｎｅｕｒｏ ｎ，１９９２，９，３８３； Ｊ．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９３，１８，２７３）。これらのタンパク質は 全てＳＨ２（Ｓｒｃ相同２）と呼ばれるドメインをもち、該ドメインは一次構造 に高い相同度をもち、三次構造ではより高度に保存されている。これらの短い（ 約１００アミノ酸）ＳＨ２ドメインはホスホチ ロシン含有タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｃ）セグメントとの結合に関与する非触媒 領域である（Ｔ．ＰａｗｓｏｎとＧ．Ｄ．Ｇｉｓｈ，Ｃｅｌｌ，１９９２，７１ ，３５９）。これらのＳＨ２ドメインの構造及び役割に関する関心及び研究はこ こ数年間に急激に高まっている。ＳＨ３ドメイン（Ｓｒｃ相同３）にも同様の関 心が寄せられており、このドメインの機能は特性決定が進んでいないが、サイト ソルトランスデューサーでＳＨ２ドメインと併存していることが多い。ＳＨ３ド メインもグリシン−プロリン高含有ドメインに親和性をもつと思われる相同度の 高い非触媒領域である。ＳＨ２及びＳＨ３領域はいずれもシグナル伝達で分子内 認識に中枢的役割をもつと考えられる。ＳＨ２を含むタンパク質群としては、固 有酵素活性をもち、従って、ＳＨ２ドメイン以外に触媒ドメイン（キナーゼドメ イン等）をもつタンパク質、例えばＳｒｃ、Ａｂｌ、Ｓｙｃ、ＰＴＰｌＣ、ＰＬ Ｃｇ、ＧＡＰ、ｖａｖ等のタンパク質が挙げられる。別の群は公知触媒ドメイン をもたないＳＨ２含有タンパク質であり、触媒特性をもつ他のタンパク質をレセ プターに補充するアダプターの機能をもつと思われる。例えば、このようなアダ プターとしては、活性化（リン酸化）レセプターとホス ファチジル−イノシトール−３’−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性を結び付けるｐ ８５が挙げられる。Ｇｒｂ２（増殖因子レセプター結合タンパク質２）もアダプ ターの１種であり、ｐ２１^rasにグアニンヌクレオチド交換活性をもつタンパク 質にリン酸化レセプター（ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＨＧＦ−Ｒ等）を結び付 け、マイトジェネシスに直接関係するｒａｓ等の系を活性化する。この他、Ｓｈ ｃ、Ｃｒｋ、Ｎｃｋ等もＳＨ２含有アダプターであると思われる。上記トランス デューサーのいくつか、特にＧｒｂ２とＨＧＦＲ等のレセプター上の関連結合部 位、特にＨＧＦレセプターのＴｙｒ １３５６を含む部位は細胞モトジェネシス 、侵入及び最終的に転移に密接に関連すると思われる。 このＳＨ２ドメインはリン酸化チロシンとレセプター又は他の何らかの中間タ ンパク質のフランキング配列を認識することができる。高度に保存された構造の コアエレメントは２個のα螺旋の間にサンドイッチされた逆平行βシートと、サ ンドイッチから突出する小さいβシートからなり、この構造はＳｒｃＳＨ２ドメ インの場合と同様に結合ペプチドとの複合形態でもＸ線及びＮＭＲ試験により解 明されている（Ｇ．Ｗａｋｓｍａ ｎ，Ｄ．Ｋｏｍｉｎｏｓ，Ｓ．Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｎ．Ｐａｎｔ，Ｄ．Ｂ ａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｒ．Ｂ．Ｂｉｒｇｅ，Ｄ．Ｃｏｗｂｕｒｎ，Ｈ．Ｈａｎａｆ ｕｓａ，Ｂ．Ｊ．Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｏｖｅｒｄｕｉｎ，Ｍ．Ｄ．Ｒｅｓｈ，Ｃ． Ｂ．Ｒｉｉｏｓ，Ｌ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ及びＪ．Ｋｕｒｉｙａｎ，Ｎａｔｕｒ ｅ，１９９２，３５８，６４６； Ｇ．Ｗａｋｓｍａｎ，Ｓ．Ｅ．Ｓｈｏｅｌｓ ｏｎ，Ｎ．Ｐａｎｔ，Ｄ．Ｃｏｗｂｕｒｎ及びＪ．Ｋｕｒｉｙａｎ，Ｃｅｌｌ， １９９３，７２，７７９； Ｍ．Ｏｖｅｒｄｕｉｎ，Ｃ．Ｂ．Ｒｉｏｓ，Ｂ．Ｊ ．Ｍａｙｅｒ，Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ及びＤ．Ｃｏｗｂｕｒｎ，Ｃｅｌｌ，１ ９９２，７０，６９７）。いずれにせよ、ループと螺旋は数種のトランスデュー サー間で異なり、認識特異性に結び付けることができる。リン酸化レセプターと サイトソルトランスデューサーの相互作用を分析すると、１）数個のレセプター の各々がほぼ同一タンパク質と結合し、２）その各々が所定の領域特異度で結合 することができ、即ち数個のレセプターで異なるＳＨ２含有トランスデューサー がレセプターサイトソルドメインの異なるホスホチロシン残基と結合することが 認められる（Ｊ．Ａ．Ｅｓｃｏｂｅｄｏ，Ｄ．Ｒ．Ｋａｐｌａｎ， Ｗ．Ｍ．Ｋａｖａｎａｕｇｈ，Ｃ．Ｗ．Ｔｕｒｃｋ及びＬ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍ ｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，１１，１１２５； Ａ．Ｋａｓ ｈｉｓｈｉａｎ，Ａ．Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ及びＪ．Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，ＥＭＢ Ｏ Ｊ．，１９９２，１１，１３７３； Ｃ．−Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９２，１１，４２５１）。ホスホチロシンの周囲の配列、特に下流に は高い特異性があり、トランスデューサー毎に異なる認識モチーフが存在する（ Ｗ．Ｊ．Ｆａｎｔｌ，Ｊ．Ａ．Ｅｓｃｏｂｅｄｏ，Ｇ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ． Ｗ．Ｔｕｒｃｋ，Ｍ．ｄｅｌ Ｒｏｓａｒｉｏ，Ｆ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ及びＬ ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃｅｌｌ，１９９２，６９，４１３）。ホスホペプチ ドライブラリーで数種のサイトソルトランスデューサーの配列特異性が分析され 、相対コンセンサス配列が決定されている（Ｚ．Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｓ．Ｅ．Ｓ ｈｏｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｇ．Ｇｉｓｈ，Ｔ．Ｐａｗｓｏｎ， Ｗ．Ｇ．Ｈａｓｅｒ，Ｆ．Ｋｉｎｇ．Ｔ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｒａｔｎｏｆｓ ｋｙ，Ｒ．Ｊ．Ｌｅｃｈｌｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｇ．Ｎｅｅｌ，Ｒ．Ｂ．Ｂｉｒｇｅ ，Ｊ．Ｅ．Ｆａｊａｒｄｏ，Ｍ．Ｍ．Ｃｈｏｕ，Ｈ．Ｈａｎａｆｕｓ ａ，Ｂ．Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ及びＬ．Ｃ．Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｃｅｌｌ，１ ９９３，７２，７６７）。 実際に、肝細胞の強力な一次増殖マイトジェンであり且つインビボ肝再生の主 要なメディエーターである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のレセプター（Ｐ．Ｍ．Ｃ ｏｍｏｇｌｉｏ，Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−Ｓｃａ ｔｔｅｒ Ｆａｃｔｅｒ（ＨＧＦ−ＳＦ） ａｎｄ ｃ−Ｍｅｔｒｅｃｅｐｔｏ ｒ．Ｉ．Ｄ．ＧｏｌｄｂｅｒｇとＥ．Ｍ．Ｒｏｓｅｎ編（Ｂａｓｅｌ）、スイス ：Ｂｉｒｋａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９３，１３１−１６５）では、全サ イトソルトランスデューサーの相互作用は２個の近接するホスホチロシン残基を 含む同一「スーパーサイト」に集中していると思われる（Ｃ．Ｐｏｎｚｅｔｔｏ ，Ａ．Ｂａｒｄｅｌｌｉ，Ｚ．Ｚｈｅｎ，Ｐ．ｄａｌｌａ Ｚｏｎｃａ，Ｆ．Ｍ ａｉｎａ，Ｓ．Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ａ．Ｇｒａｚｉａｎｉ，Ｇ．Ｐａｎａｙｏｔ ｏｕ及びＰ．Ｍ．Ｃｏｍｏｇｌｉｏ，Ｃｅｌｌ，１９９４，７７，２６１）。 増殖因子レセプター結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）は、単に２個のＳＨ３ドメ インにより挟まれたＳＨ２ドメインにより構 成される比較的小さいアダプターであり、Ｇｒｂ２は別のタンパク質ＳｏＳのＣ 末端ドメインに位置するプロリン含量の高い３１アミノ酸領域とそのＳＨ３ドメ インとの結合を介してタンパク質ＳｏＳとインビボ複合体を形成し、ＳｏＳはｒ ａｓ系と相互作用することができる。同様にＳｏＳとの複合形態に含まれるＧｒ ｂ２はそのＳＨ２ドメインを介して種々のレセプター又はトランスデューサーの 特定チロシン−リン酸化部位と結合することができる。また、サイトソルタンパ ク質Ｓｈｃのリン酸化形態はＧｒｂ２のＳＨ２ドメインと結合することができる （Ｓ．Ｅ．Ｅｇａｎ，Ｂ．Ｗ．Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｍ．Ｗ．Ｂｒｏｏｋｓ，Ｌ． Ｂｕｄａｙ，Ａ．Ｍ．Ｓｉｚｅｌａｎｄ及びＲ．Ａ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ ｕｒｅ，１９９３，３６３，４５）。Ｇｒｂ２／ＳｏＳ複合体とＲａｓ系の関係 はＨＧＦＲで立証されており（Ａ．Ｇｒａｚｉａｎｉ，Ｄ．Ｇｒａｍａｇｌｉａ ，Ｐ．ｄａｌｌａ Ｚｏｎｃａ及びＰ．Ｍ．Ｃｏｍｏｇｌｉｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８，９１６５）、種々の生物種で他のレセプター（ ＥＧＦＲ、ＥＲＳ−１）との類似により強く裏付けられている（Ｊ．Ｓｃｈｌｅ ｓｓｉｎｇｅｒとＡ．Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９２， ９，３８３；Ｊ．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｓｉ．，１９９３，１８，２７３； Ｐ．ＰｏｌａｋｉｓとＦ．ＭｃＣｏｒｍ ｉｃｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８，９１５７）。タンパク 質ＳｏＳは「エクスチェンジャー」グアニンヌクレオチド解離刺激物質（ＧＤＳ ）としても知られており、Ｇｒｂ２と結合したその活性形態では、不活性Ｒａｓ −ＧＤＰ複合体からの迅速なＧＤＰ放出を助長することができる（Ｃ．Ｆ．Ａｌ ｂｒｉｇｈｔ，Ｂ．Ｗ．Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｊ．Ｌｉｕ，Ｍ．Ｖｉｔｏ及びＲ． Ａ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９３，１２，３３９）。従って、 ｐ２１^Rasは迅速にＧＴＰを取り込んで活性Ｒａｓ−ＧＴＰを形成し、ｒａｓ系 のエフェクターに作用して（ＭＡＰキナーゼカスケードを介して）下流の核にシ グナルを伝達することができる。膜結合複合体Ｒａｓ−ＧＴＰは、エフェクター に作用して核にマイトジェネシスシグナルを伝達する活性形態である。そのレベ ルはエクスチェンジャー（ＧＤＳ又はＳｏＳ）活性により増加し、ＧＡＰ（ＧＴ Ｐアーゼ活性化タンパク質）活性により低下する。これらの調節酵素はいずれも 増殖因子レセプター刺激の影響を受け、更にそれらの活性は他の調節因子 にも依存する。２種の調節酵素ＧＤＳ及びＧＡＰは種々の細胞種でＲａｓ系に異 なる作用を及ぼすことができる。実際に、Ｒａｓ系の上記調節には膜に結合する のに適したｐ２１^rasの成熟形態が必要である（Ｃ．Ｊ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｓ ｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２５９，１８６５）。これらの場合には、Ｒａｓ系は 該当癌遺伝子形質転換を阻止するのに有用な材料であることが細胞培養結果から 確認された（Ｊ．Ｂ．Ｇｉｂｂｓ，Ａ．Ｏｌｉｆｆ及びＮ．Ｅ．Ｋｏｈｌ，Ｃｅ ｌｌ，１９９４，７７，１７５）。更にシグナル伝達経路を辿ると（Ｒａｓの下 流）、Ｒａｓ系の活性形態、即ちＲａｓ ＧＴＰはセリン／スレオニンキナーゼ Ｒａｆとして最近同定されたそれ自体のエフェクターのＮ末端と相互作用し、こ うして「マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ」（ＭＡＰ）によるリン酸化の カスケードを開始する。実際に、Ｒａｆは直接リン酸化を提供し、従ってＭＡＰ キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）の活性化を提供し、こうしてＭＡＰＫを活性化し、 核における転写（転写因子ＡＰ１）の活性化をもたらす（Ｍ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａ ｌｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９３，１８，２５０）。発明の要約 より長い配列内にＹ^PＶＮＶモチーフを含むペプチドは、サイトソルトランス デューサーＳｈｃ又はＧｒｂ２又はｐ８５と活性化（リン酸化）ＨＧＦレセプタ ーとの結合を阻害できることが知られている（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９４／ ０１９４３号）。今般、本発明者らは以下の点を知見した。 １）リン酸化チロシンから出発するペプチド内でカルボキシ末端から下流の配列 を短縮即ちヘプタペプチドからテトラペプチドに短縮すると、トランスデューサ ーＧｒｂ２に対する親和性が予想外に増加し、従って、Ｇｒｂ２−ＨＧＦレセプ ター複合体形成の阻害力価が増加する。実際に、ホスホペプチドの親和性は長さ の減少（例えば１２アミノ酸から５アミノ酸まで）と共に減少する（６０倍にも 及ぶ）ことがＳＨ２認識に関する文献から公知であり（Ｇ．Ｂ．Ｃｏｈｅｎら， Ｃｅｌｌ，１９９５,８０,２３７； Ｓ.Ｅ.Ｓｈｏｅｌｓｏｎら,ＥＭＢＯ Ｊ. ,１９９３，１２，７９５； Ｅ．Ｐｉｃｃｉｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，１９９３，３２，３１９７）、１例では親和性には少なくとも５アミノ酸長 が必要であると記載されている（Ｗ．Ｊ．Ｆａｎｔｌら，Ｃｅｌｌ，１９９２， ６９， ４１３）ので、これは予想外の結果である。 ２）リン酸化チロシンのアミノ基をアシル化すると、前記活性は大幅に増加する 。このアシル基はホルミル、アセチル、プロピオニル又はより複雑な基でもよく 、例えばアミノアシル、ビオチニル−６−アミノヘキサノイル、ミリストイル、 オクタノニル、又はシクロヘキシルアセチル基でもよく、これらの基は細胞浸透 を改善する親油性アンカーを提供する。文献によると、ＳＨ２認識に使用される ほぼ全てのホスホペプチドはＮ末端に遊離アミノ基をもつ。 ３）前記ペプチドはＧｒｂ２及び他の数種のトランスデューサー（例えばＳｈｃ 、ｐ８５、Ｓｒｃ、ＧＡＰ、ＰＬＣｇ、Ｚａｐ７０、Ｓｙｃ、Ｓｔａｔ）と高い 親和性で結合してこれらをブロックし、これらのトランスデューサーがそのＳＨ ２ドメインを介して任意のチロシンリン酸化レセプター（例えばＨＧＦ−Ｒ、Ｐ ＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ）、細胞質ドメインを維持するその截頭又は突然変異形 態（例えばｅｒｂＢ２、Ｔｐｒ−ＭＥＴ及びＭＥＴファミリーの他のメンバー、 例えばＳＥＡ及びＲＯＮ）、ＩＲＳ−１、チロシンリン酸化トランスデューサー 又はアダプター（例えばｂｃｒ−Ａｂｌ、Ｓｈｃ、Ｓｒｃ、 Ｓｙｃ、Ｓｔａｔ）と結合するのを阻止する。他の配列は高特異性であることが 示されているので、これらのペプチドのこの予想外の特性は前代未聞である。 ４）ホスホチロシン又はパラホスホノメチルフェニルアラニン、パラホスホノジ フルオロメチルフェニルアラニン等の類似体を含むテトラペプチドモチーフより も短いペプチドであっても、Ｇｒｂ２−ＳＨ２とリン酸化ＨＧＦレセプターの結 合を阻害するその活性を維持したという知見も全く予想外であった。トリペプチ ドのような短いホスホペプチドがＳＨ２認識に高い親和性をもつことは全く前例 がない。他の配列ではホスホノメチルフェニルアラニル誘導体はホスファターゼ 耐性であるが、通常は対応するリン酸類似体よりも低力価である（６〜１０倍） ことが知られている（Ｓ．Ｍ．Ｄｏｍｃｈｅｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９２，３１，９８６５）が、予想外にも本発明者らは本発明の特定ペプチド のホスホノメチルフェニルアラニル類似体がＧｒｂ２−ＳＨ２認識の阻害に親リ ン酸とほぼ等力価であることを知見した。 ５）チロシンリン酸化形態のこれらのペプチド又はホスホチロシンをパラホスホ ノメチルフェニルアラニンもしくはパラホス ホノジフルオロメチルフェニルアラニンで置換したその類似体が細胞移動の強力 な阻害剤であり、抗腫瘍剤のみならず抗転移剤としても有用であると知見も全く 予想外であった。 理論に拘束する意図はないが、この阻害は恐らくホスホペプチド又はその類似 体がＳＨ２ドメイン上の同一結合部位に関してリン酸化レセプター又はリン酸化 トランスデューサーと競合する競合阻害の結果であると思われる。この結合の阻 害は、エフェクタータンパク質により利用されるシグナル伝達経路からＴＫレセ プター又はリン酸化トランスデューサーを有効に分離することができる。当該技 術分野で周知の通り、このストラテジーの主な欠点はこのブロック点がシグナル 伝達経路の冗長によりバイパスされる可能性が高いことであるので、本発明の化 合物が数種のＳＨ２認識を阻害するという前代未聞の能力は無制御シグナル伝達 網のレベルを低下させるのに有効な要因であると考えられる。 従って、本発明の目的はホスホチロシンを含むレセプター又はトランスデュー サーと、増殖及び移動／散乱シグナルに不可欠の他の膜結合又はサイトソルトラ ンスデューサーのＳＨ２ドメインとの結合を阻害することができ、従って、腫瘍 や乾癬に 見られるような無制御増殖のレベルを低下させることができ、転移に密接に関与 する細胞侵入を阻害することができる小分子化合物である。 本発明の新規化合物は、特にＨＧＦレセプター、他の増殖因子レセプター（例 えばＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ、ＦＧＦＲ）及び他のチロシン リン酸化トランスデューサー（例えばＳｒｃ、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｓｔａｔ、ＩＲ Ｓ−１）のホスホチロシンドッキング部位とＧｒｂ２トランスデューサーの結合 を阻害することが判明した。他方、前記化合物は力価は異なるが、ホスホチロシ ンドッキング部位を含むタンパク質と他のＳＨ２含有トランスデューサー（例え ばｐ８５−ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣｇ、Ｓｒｃ、Ｓｈｃ、Ｓｔａｔ、Ｚａｐ７０、Ａｂ ｌ、Ｓｙｃ、ＰＴＰ１Ｃ）との結合も阻害する。発明の詳細な説明 １好適態様によると、本発明は式： ［式中、ＹはＨ−、Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（式中、ＲはＨ−、ＣＨ₃−、又は直 鎖、分枝鎖もしくは環式のいずれでもよい低級アルキルもしくは長鎖アルキルで ある）、又はＮ置換アミノ酸もしくはペプチド残基、好ましくはＲ−Ｃ（＝Ｏ） −Ｇｌｙ−、Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｔｈｒ−、Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｌａ−Ｔｈｒ−（ 式中、Ｒは上記と同義である）及び前記モチーフを含むもっと長いＮ置換ペプチ ド残基であり、Ｘは−ＯＰＯ₃Ｈ₂又は好ましくは非限定的な例として以下の基： −ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＦ₂ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨＦＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＳＯ₃Ｈ、−Ｃ Ｆ₂ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨＦＳＯ₃Ｈ、−ＳＰＯ₃Ｈ₂、−ＯＰＳＯ₂Ｈ₂、−ＳＰＳＯ₂Ｈ₂ 、−ＯＰＳ₂ＯＨ₂、−ＯＰ（ＣＨ₃）Ｏ₂Ｈ、−ＳＰ（ＣＨ₃）Ｏ₂Ｈ、−ＯＰ（ ＣＨ₃）ＳＯＨ、−ＯＰ（ＣＦ₃）Ｏ₂Ｈ、−ＯＰ（ＣＨＦ₂）Ｏ₂Ｈ、−ＳＰ（Ｃ Ｆ₃）Ｏ₂Ｈ、−ＳＰ（ＣＨＦ₂）Ｏ₂Ｈもしくはその低級アルキルエステルから選 択され得るその類似体であり、Ａは低級アルキル、好ましくはＣＨ₃−、ＣＨ₃Ｃ Ｈ₂−、（ＣＨ₃）₂ＣＨ−、（ＣＨ₃）₃Ｃ−、ＣＨ₃ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）−、（Ｃ Ｈ₃）₂ＣＨＣＨ₂−であり、ＢはＨ−、ＣＨ₃−又は低級アルキルであり、ＺはＨ 、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ²、−ＣＯＲ²であり、ここで Ｒ₂＝Ｈ、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ³であり、Ｒ³は−ＣＨ₃、低級アルキル、好ましく は−ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂、又はカルボン酸もしくはアミド化形態のアミノ酸も しくはジペプチド、好ましくは−Ｖａｌ−ＮＨ２、−Ｖａｌ−ＯＨ、−Ｖａｌ− Ｌｙｓ−ＮＨ₂、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ｅＮ−Ａｃ）− ＮＨ₂、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ｅＮ−Ａｃ）−ＯＨ、−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−ＮＨ₂、− Ｖａｌ−Ｓｅｒ−ＯＨ、−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＯＨ、−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＮＨ₂で ある］をもつ塩又は非塩形態のペプチド及びペプチド類似化合物を含む。低級ア ルキルとは一般にＣ₁〜Ｃ₆アルキル、例えばＣ₁〜Ｃ₄アルキル、例えばメチル、 エチル、ｉ−プロピル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ペンチル又は ヘキシルを意味する。長鎖アルキルとは例えばＣ₇〜Ｃ₃₀アルキル、例えばＣ₁₀ 〜Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁₂〜Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁₈〜Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₂₀〜Ｃ₃₀アルキ ル、Ｃ₇〜Ｃ₂₅アルキル、Ｃ₁₀〜Ｃ₂₅アルキル、Ｃ₁₀〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₁₀〜Ｃ_{1 8} アルキル又はＣ₁₂〜Ｃ₂₅アルキルであり得る。いずれの場合もアルキル基は直 鎖、分枝鎖又は環式のいずれでもよい。 −ＯＰＯ₃Ｈ₂基の機能的誘導体は式（Ｉ）中のＸ基として導 入したときに−ＯＰＯ₃Ｈ₂自体と同一又は同様に機能する基の構造類似体である 。 本発明の関連では、前記「機能的誘導体」とは一般式（Ｉ）にＸ基として導入 したときに−ＯＰＯ₃Ｈ₂基と同様に作用するホスホリル誘導体である。 Ｙの定義におけるＮ置換アミノ酸又はペプチド残基は式Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ− （式中、Ｚは単一アミノ酸残基又は２個以上のアミノ酸残基の連鎖、例えばジペ プチド、トリペプチド又はオリゴペプチドである）の残基が適切である。Ｚの例 としては、−Ｇｌｙ−、−Ｔｈｒ−及び−Ａｌａ−Ｔｈｒ−が挙げられる。Ｙの 定義において、Ｎ置換アミノ酸又はペプチド部分を含むポリペプチド残基は、そ の鎖中にＮ置換部分、例えば上記式Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ−の部分を含む長鎖ペプ チド残基である。 上記モチーフを含むもっと長いペプチドでもよい。 本発明によると、典型的なアミノ酸側鎖はＬ構造であるべきであり、各位置の Ｄ類似体は著しく活性が劣ることが確認された。実際に、上記ホスホペプチド又 はそれらの類似体の非リン酸化チロシン含有形態も本願に含まれ、これらの形態 はインビボリン酸化できるので、実際に活性な形態の前駆物質である。 本発明の範囲に含まれ、特に請求の対象とする代表的化合物を以下に挙げる（ Ａｃはアセチルを意味する）。 本発明の化合物は中性ｐＨ溶液中で化学的に安定であり、ペプチドの種類に応 じて酸又は塩基を加えることにより医薬的に許容可能な塩を形成することができ る。本発明はこれらの全形態を含むものとする。適切な塩としては、アルカリ金 属塩（例えばナトリウム又はカリウム塩）、アンモニウム塩、及び酸付加物（例 えば塩酸塩、酢酸塩及びトリフルオロ酢酸塩）が挙げられる。 本発明のペプチドはＥｓｃｏｂｅｄｏ，Ｊ．Ａ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ ｏｌ．１１： １１２５−１１３２（１９９１）又はＴｕｒｃｋ，Ｃ．Ｗ．Ｐｅ ｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．５：１５６−１６０（１９９２）に記載されているような 標準方法に従い、例えば保護予備リン酸化チロシン残基を使用して合成すること ができる。あるいは、非保護チロシンを導入し、固相又は液相上でペプチド延長 後にリン酸化することによりホスホペプチドを製造することもできる。 特に、ペプチドは当業者に公知の液相又は固相法により製造することができる （Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｖｏｌ．Ｉ，Ａｃａ ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６５； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら，“Ｐｅｐｔｉｄ ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ，１９６６； ＭｃＯｍｉｅ（編）“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９７ ３； 又はＢａｒａｎｙら，“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ”２，第１章、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ ｅｓｓ，１９８０）。従って、本発明は単一アミノ酸及び／又は２個以上のアミ ノ酸残基から予備形成したペプチドからペプチドを化学的に合成することを特徴 とする、本発明のペプチドの製造方法を包含する。 チロシン残基がリン酸化されたペプチドを製造しようとする場合には、固相合 成中に予備リン酸化保護チロシン残基を導入してもよいし、ペプチドを固体支持 体に結合しながら保護予備形成ペプチドのチロシン残基をリン酸化してもよい。 固相合成の場合には、任意の手動又は自動ペプチド合成器を 使用することができ、Ｂｏｃ又はＦｍｏｃストラテジーを用いて樹脂支持体上で ペプチドを段階的に合成することができる。 出発材料として使用する全試薬は市販されており、あるいは当業者に公知の方 法により製造及び精製できる。 脱保護したペプチドはアセトニトリルの直線勾配を使用することにより０．０ ５％トリフルオロ酢酸中でＣ１８−Ｖｙｄａｃカラム（Ｈｅｓｐｅｒｉａ Ｃａ ｌｉｆ．）で逆相高性能液体クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥により 単離する。全ホスホペプチドはポリ水和ポリトリフルオロ酢酸塩として得られる 。全生成物のペプチド含量は６５〜９０％であり、クロマトグラフィー純度はｌ ＝２１５〜２２０ｎｍでＨＰＬＣピーク相対積分によると９５％を上回る。 アミノ酸分析は酸水解物で実施した(６Ｎ ＨＣｌ＋０.１％フェノール中１１ ０℃で２２時間)。あるいは、まず非リン酸化チロシンを含むペプチドを合成し た後、酵素的又は化学的方法によりチロシン残基にリン酸基を導入してもよい（ その場合にはリン酸化剤と反応する恐れのある他の官能基を適切に保護する必要 がある）。 本明細書でアミノ酸及び保護基に使用する略記は生化学命名 に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会の勧告に基づく（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．，ｖｏｌ １３８，９−３７，１９８４参照）。特に、明細書全体を通して 次の略記を使用した。Ｂｏｃ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔＢｕ＝ｔ−ブチ ル、Ｂｚｌ＝ベンジル、ＣｌＺ＝４−クロロベンジルオキシカルボニル、ＤＩＣ ＝ジイソプロピルカルボジイミド、ＤＣＭ＝ジクロロメタン、ＤＩＥＡ＝ジイソ プロピルエチルアミン、ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド、ＤＭＳ＝ジメチルスル フィド、Ｄｎｐ＝ジニトロフェニル、ＥＣＣ＝エチルクロロカーボネート、Ｆｍ ｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル、ＮＭＭ＝Ｎ−メチルモルホリン、 ＮＭＰ＝Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ＲＰ−ＨＰＬＣ＝逆相高性能液体クロマ トグラフィー、ＴＢＴＵ＝テトラフルオロ硼酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール −１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム、Ｔｒｔ＝トリチル。 本発明のペプチドがサイトソルシグナルトランスデューサーとチロシンキナー ゼレセプター又は他のチロシンリン酸化トランスデューサーとの結合を阻害する 能力は、実験の項に示すＢＩＡコア分析等の結合阻害実験により評価することが できる。 本発明のペプチドの生物学的効果は、肝細胞増殖因子レセプター（ＨＧＦ−Ｒ ）等のレセプターチロシンキナーゼにより媒介される生物学的応答を阻害する能 力からも立証される。本発明の範囲に含まれる代表的化合物を用いた実験の項に 示すように、本発明のペプチドはＨＧＦ−Ｒにより媒介される細胞移動、細胞増 殖、細胞侵入及び管形成を阻害することができる。 当業者に周知の通り、これらの生物学的応答は新生物疾患の発生に密接に関連 している。従って、本発明のペプチドは人体又は動物体の治療、例えば新生物疾 患の治療に使用することができる。 本発明のペプチドはリン酸化されていてもいなくてもよい。ペプチドの活性形 態は一般にリン酸化されているが、非リン酸化形態のペプチドを投与し、患者の 体内でペプチドをリン酸化させたほうが有利な場合もある。これは、非リン酸化 時のほうがペプチドを細胞に取り込み易いためである。 本発明のペプチドは任意の簡便な非経口経路で患者にそのまま投与してもよい し、酵素安定性及び細胞透過性を増すように適当な結合形態で投与してもよい。 皮下、静脈内又は筋肉内投与のいずれを用いるか、投与量、 投与頻度の選択は種々の因子に依存する。これらの因子は、投与目的、治療する 患者の年齢及び体重、並びに患者の症状を含む。治療的に有効な量を投与する。 但し、一般には各投与経路で１０〜１０００ｍｇ／用量、より好ましくは５０〜 ５００ｍｇ／用量のペプチドを投与する。ペプチドを医薬組成物に調合してもよ い。医薬組成物は更に医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤も含有する。投 与経路に応じて任意の適当なキャリヤー又は希釈剤を使用することができる。化合物の生物学的試験 本発明の新規化合物は、特にＧｒｂ２トランスデューサーとＨＧＦレセプター のホスホチロシンドッキング部位との結合を阻害し、前記化合物は更に、ホスホ チロシンドッキング部位を含むタンパク質と他のＳＨ２含有トランスデューサー （例えばｐ８５−ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣｇ、Ｓｒｃ）との結合も阻害することが判明 した。この阻害活性の例を表１及び表２に示す。ＢＩＡコア分析 ＢＩＡコア装置で生体特異的相互作用分析により親和性を測定した（Ｊｏｎｓ ｓｏｎ，Ｕ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９１，１１，５２０−５２ ７； Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ． ら，Ｆ．Ｔｕｒｎｅｒ（編），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ，ｖｏｌ．２，ＪＡＩ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９２，ｐ．２９１−３ ３６； Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１９９ １，１４５，２２９−２４６）。ホスホペプチドがヒト肝細胞増殖因子レセプタ ー中にＹ₁₃₄₉及びＹ₁₃₅₆を含む固定化ホスホペプチド（ＦＣＥ２８９４２：６− ビオチンアミド−ヘキサノイル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉ ｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ）−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ −Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌ ｙｓ−ＯＨ（配列番号２１）又はＦＣＥ２８９４９：６−ビオチンアミド−ヘキ サノイル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ −Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ （ＰＯ₃Ｈ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ（配列番号２１））とＳ Ｈ２ドメインとの相互作用を阻害する能力を測定することにより相対親和性を測 定した。表１及び表２はトランスデューサーと該トランスデューサーのＨＧＦレ セプター結合部位を示す長いビオチン化ホスホペプチ ド（アビジンを加えたチップに固定）との結合阻害％としてこれらの測定の結果 を示す。表１はＧｒｂ２−ＳＨ２相互作用の阻害に関するデータを報告し、表２ は他のトランスデューサー（ｐ８５、ＰＬＣｇ、Ｓｒｃ）に関する阻害データを 報告する。ＢＩＡコア法により別のシステムで高活性化合物も試験し、即ち循環 （flowing）Ｇｒｂ２−ＳＨ２又はｐ８５−ＳＨ２と、チップに固定化した全活 性リン酸化形態のＨＧＦレセプターの全サイトソル部分との結合を阻害する能力 も試験した。手間がかかるが一般的なこの方法は長い固定化ホスホペプチドを使 用した上述の方法と完全に等価であることが判明した。 結合阻害の評価： Ａ）固定化ビオチン化ホスホペプチドによるＢＩＡコア分析 ＢＩＡコアシステムは高分子間の相互作用を試験するために確実で再現可能な 方法を提供する。結合は温度や流速等の正確に制御された条件下でリアルタイム で測定される。ＢＩＡコアバイオセンサーの構成と動作原理の詳細は従来記載さ れている（Ｐａｎａｙｏｔｏｕら，１９９３）。使用したプロトコールは以下の 通りである。これらの実験で使用したＳＨ２ドメインはＰｈａｒｍａｃｉａカラ ム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０プレパックシステム）で脱塩し、２０ｍＭ Ｈ ｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３．４ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０ ０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び４ｍＭ ＤＴＴから構成されるＢＩＡコア試験用 緩衝液に緩衝液を交換した。実験は、カルボキシメチル化デキストラン層にスト レプトアビジンを予め固定化したＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐｓ（ＳＡ５，Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）を使用して実施した。ＨＧＦレセプターホスホチロシン１３５６単 独又はＨＧＦレセプターホスホチロシン１３４９及び１３５６を含むビオチン化 ホスホペプチドＦＣＥ２８９４９（配列番号２２）及び２８９４２（配列番号２ １） を５ｍＬ／秒の流速で５０秒間ストレプトアビジン化チップに固定化した。非特 異的に結合したホスホペプチドを０．１％ＳＤＳの短パルス（４秒）で除去した 。ＧＳＴ−ＳＨ２ドメイン融合タンパク質を一連の濃度（試験の大部分では２０ ｍＭと１ｍＭ）の試験競合ホスホペプチドと混合し、２５℃の一定温度で５ｍＬ ／分で１２０秒間表面に注入した。表面に結合した材料を０．１％ ＳＤＳの４ 秒パルスで除去し、シグナルをバックグラウンドレベルにした。 Ｂ）固定化ＧＳＴ／ＨＧＦ−Ｒ融合タンパク質によるＢＩＡコア分析 ビオチン化ホスホペプチドについて上述したように分析を行った。但し、これ らの実験では精製ＧＳＴ／ＨＧＦ−ＲをＢＩＡコアチップに直接固定化した。Ｎ −ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチ ルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１：１ 混合物で活性化後に、ＧＳＴ／ＨＧＦ−Ｒ（０．５ｍｇ／ｍＬ）をセンサーチッ プ表面に固定化した。過剰の反応基をエタノールアミン（１．０Ｍ）でブロック した。 ＨＧＦ−Ｒにより媒介される生物学的応答、即ち（ａ）細胞 移動、（ｂ）細胞増殖、（ｃ）細胞侵入、（ｄ）管形成を阻害する能力に基づい て化合物の生物学的効果を評価した。細胞移動に及ぼす化合物の効果 ＭＤＣＫ細胞はＨＧＦの刺激を受けて移動する（Ｓｔｏｋｅｒ，Ｍ．，Ｅ．Ｇ ｈｅｒａｒｄｉ，Ｍ．Ｐｅｒｒｙｍａｎ及びＪ．Ｇｒａｙ，Ｎａｔｕｒｅ，１９ ８７，３２７：２３９−２４２）。この効果は移動シグナルを伝達するＨＧＦ− Ｒにより媒介される。細胞ザッピング（下記実験手順の項参照）と呼ばれる新規 ｉｎ ｓｉｔｕエレクトロポレーション法を用いてペプチドをＭＤＣＫ細胞に導 入し、化合物がＨＧＦに媒介される細胞移動を阻害する能力を試験した。まずビ オチン化ペプチドを用いてペプチドの有効な細胞送達をモニターした。細胞内送 達後、フルオレセイン標識アビジンを用いてビオチン化ペプチドを追跡した。こ のアプローチによると、ペプチドは細胞に非毒性であり、少なくとも２４時間安 定であった。ＨＧＦ−Ｒに媒介される細胞移動に及ぼす化合物の効果を評価する ために、エレクトロポレートした化合物を含むＭＤＣＫ細胞を使用して散乱アッ セイを実施した。別法では、これらの細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ装置（Ｃｏｓｔ ａｒ）に播種し、多孔質膜を貫通す るようにＨＧＦにより刺激した（下記実験手順の項参照）。細胞移動に及ぼす代 表的化合物の効果を図１Ａ及び図２に示す。これらの実験から明らかなように、 例えばＦＣＥ２９４０８(配列番号７)等の化合物は細胞移動を有効に阻害するが 、ホスホチロシン類似体の位置にフェニルアラニンをもつ関連ペプチド（ＦＣＥ ２９６０６：Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ）（配列番号２４） はそうではない（負の対照）。細胞増殖に及ぼす化合物の効果 ＨＧＦの刺激を受けると上皮細胞は増殖し、この効果はＨＧＦ−Ｒにより媒介 される（Ｍｅｄｉｃｏ，Ｅ．，Ｍｏｎｇｉｏｖｉ，Ａ．，Ｈｕｆｆ，Ｊ．，Ｊｅ ｌｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｆｏｌｌｅｎｚｉ Ａ．，ＧａｕｄｉｎｏＧ．，Ｐａｒｓｏ ｎｓ Ｊ．Ｔ．及びＣｏｍｏｇｌｉｏ Ｐ．Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｏｆ ｔ ｈｅ Ｃｅｌｌ，１９９６，印刷中）。細胞増殖アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ） （下記実験手順の項参照）を使用して化合物がＨＧＦ−Ｒにより媒介される細胞 増殖に及ぼす効果をモニターした。細胞ザッピングによりペプチドをＭＤＣＫ細 胞に送達した。次に、化合物を含む細胞がチミジン類似体５−ブロモ−２’−デ オキシウリジン（ＢｒｄＵ）を取り込む能力 を測定した。代表的化合物が細胞増殖に及ぼす効果を図１Ｃに示す。これらの実 験はＦＣＥ２９４０８（配列番号７）を負の対照ＦＣＥ２９６０６（配列番号２ ４）と比較し、化合物が細胞増殖を有効に阻害することを示している。細胞侵入に及ぼす化合物の効果 ＨＧＦ／ＳＦレセプターは構成的に活性なＴｐｒ−Ｍｅｔタンパク質に形質転 換カウンターパートをもつ（Ｐｏｎｚｅｔｔｏ，Ｃ．，Ｂａｒｄｅｌｌｉ，Ａ． ，Ｚｈｅｎ，Ｚ．，Ｍａｉｎａ，Ｆ．，Ｄａｌｌａ Ｚｏｎｃａ，Ｐ．，Ｇｉｏ ｒｄａｎｏ，Ｓ．，Ｇｒａｚｉａｎｉ，ａ．，Ｐａｎｏｙｏｔｏｕ，Ｇ．及びＣ ｏｍｏｇｌｉｏ Ｐ．Ｍ．（１９９４） Ｃｅｌｌ ７７，１−２０）。Ｔｐｒ −Ｍｅｔ形質転換細胞はインビボで高度に腫瘍形成性であり、インビトロで細胞 外マトリックスに侵入する。化学侵入アッセイ（下記実験手順の項参照）を使用 して化合物がＴｐｒ−Ｍｅｔにより媒介される細胞侵入に及ぼす効果を評価した 。細胞ザッピングによりペプチドをＴｐｒ−Ｍｅｔ形質転換細胞に送達し、化合 物を含む細胞が再構成基底膜（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）に侵入する能力をモニターし た。代表的化合物が細胞侵入に及ぼす効果を図１Ｂに示す。これらの 実験は、ＦＣＥ２９４０８（配列番号７）を負の対照ＦＣＥ２９６０６（配列番 号２４）と比較し、化合物が細胞侵入を有効に阻害することを示している。管形成に及ぼす化合物の効果 管形成は上皮細胞自体が三次元構造で組織化する複雑な形態学的プロセスであ る。細胞外マトリックスと同様の環境で培養すると、ＭＤＣＫ細胞はＨＧＦで刺 激後に管を形成する（Ｍｅｄｉｃｏ，Ｅ．，Ｍｏｎｇｉｏｖｉ，Ａ．，Ｈｕｆｆ ，Ｊ．，Ｊｅｌｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｆｏｌｌｅｎｚｉ Ａ．，Ｇａｕｄｉｎｏ,Ｇ. ,Ｐａｒｓｏｎｓ Ｊ.Ｔ.及びＣｏｍｏｇｌｉｏ Ｐ．Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，１９９６，印刷中）。化合物がこの現象に及ぼす効 果を試験するために、被験化合物を細胞ザッピングによりＭＤＣＫに送達した（ 下記実験手順の項参照）。コラーゲンマトリックスで被覆してＨＧＦの存在下で 成長させた単層を毎日モニターし、管生長を観察した。図３はＭＤＣＫのエレク トロポレーション後２日培養物の外観を示す顕微鏡写真である。対照ペプチド（ 負の対照ＦＣＥ２９６０６：Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ）（ 配列番号２４）は通常管構造で細胞を組織化させるが、 ＦＣＥ２９４０８（配列番号７）はＨＧＦにより誘導される管形成を完全に阻害 する。 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定され るものではない。 添付図中、図１は細胞移動（図１Ａ）、細胞侵入（図１Ｂ）及び細胞増殖（図 １Ｃ）に及ぼす本発明の代表的化合物（ＦＣＥ２９４０８）（配列番号７）の効 果を示す。各グラフの縦座標には運動（１Ａ）、侵入（１Ｂ）及び増殖（１Ｃ） の阻害の百分率を示す。実験の項に説明するように、ＦＣＥ２９６０６（配列番 号２４）を負の対照として使用する。 図２は実験の項に記載するように細胞移動に及ぼすＦＣＥ２９４０８（配列番 号７）の生物学的効果を示す顕微鏡写真である。 図３は実験の項に説明するようにＨＧＦにより誘導される管形成の阻害を示す 顕微鏡写真であり、ＭＤＣＫのエレクトロポレーション後２日培養物の外観を示 す。 実施例１ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２８５４ ０）（配列番号４）の調製 以下のアミノ酸（添加順）：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔ ｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨの逐次結合に よる手動固相合成により樹脂上で保護ペプチドを合成した。最後の結合後、（ホ スホラミダイト化学及び連続酸化を使用することにより）固相上でチロシン残基 をリン酸化した。リン酸化後に酸処理して側鎖を脱保護し、樹脂から分離した。 詳細に説明すると、Ｆｍｏｃ−２，４−ジメトキシ−４’−（カルボキシメチル オキシ）ベンズヒドリルアミン−アミノメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニ ルベンゼン）樹脂（Ｋｎｏｒｒ）（０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）０．５６ｇ（０．２ ５ｍｍｏｌ）を次の処理段階１）〜５）： １）ＮＭＰ洗浄、 ２）ＮＭＰ中ピペリジン（２０％）、 ３）ＮＭＰ、次いでＤＣＭ、次いでＮＭＰ、 ４）ＮＭＰ中Ｆｍｏｃ−アミノ酸の予備形成１−ヒドロキシベンゾトリアゾール エステル（０．５ｍｍｏｌ）、 ５）ＮＭＰ、次いでＤＣＭ、次いでＮＭＰ からなるサイクルにかけた。洗浄剤及び試薬容量は１０〜２０ｍｌとした。樹脂 の完全な反応（段階２、４）又は樹脂から前 段階の試薬の完全な置換（段階１、３、５）に必要な回数だけ各段階を繰り返し た。各サイクル後に樹脂サンプルを取り出し、ＤＣＭで洗浄し、ニンヒドリン試 験により反応の完了を確認した。 Ｆｍｏｃ−アミノ酸の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルは、使用直 前にＮＭＰ中でＦｍｏｃ−アミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾ トリアゾール（０．５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１ｍｍｏｌ）及びＴＢＴＵ（０． ５ｍｍｏｌ）を反応させることにより形成した。 標記化合物の配列を提供するように、各アミノ酸残基毎に段階１〜５の反応サ イクルを繰り返した。以下の保護アミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ −Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ をこの順序で加えた。最後のサイクル後にペプチジル樹脂をＤＣＭで数回洗浄し て乾燥した。出発樹脂に対して０．１９ｇの重量利得が得られた。 最後のサイクル後にペプチジル樹脂を１Ｈ−テトラゾール３０当量とジ−ｔ− ブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト１０当量の蒸留ＴＨＦ溶液で ２５℃で１．５時間、次 いでトルエン中ｔ−ブチルヒドロペルオキシド３０当量で２５℃で１．５時間処 理することにより、樹脂にまだ結合しているペプチド上でＴｙｒ残基を直接リン 酸化した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ保護基を２０％ピペリジン−ＤＭＦで脱離後に、ペプ チジル樹脂をＮＭＰ中無水酢酸５当量とＤＩＥＡ５当量で２５℃で３０分間処理 することによりＮ末端アセチル化した。ペプチジル樹脂０．７９ｇにトリフルオ ロ酢酸／水９５：５混合物２０ｍｌを加えて室温で１．５時間撹拌した。脱保護 ペプチドをジエチルエーテルで沈殿させ、濾取した。 ４５分間かけて水中アセトニトリル５→３２．５％の直線勾配を使用して０． ０５％トリフルオロ酢酸中Ｃ１８−Ｖｙｄａｃ（Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）カラ ム（２．２×２５ｃｍ）でＲＰ−ＨＰＬＣにより粗ペプチドを精製した。純形態 の生成物を含むフラクションをあわせ、アセトニトリルを減圧蒸発させ、残留溶 液を凍結乾燥した。クロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９９．９％で標記化合 物が得られた（６４ｍｇ）。アミノ酸比：Ｖａｌ ２（２）； Ａｓｘ １．２ （１）； Ｔｙｒ ０．９（１）。ペプチド含量：８８％。ＦＡＢ質量スペクト ロスコピー：ｍ／ｚ ６１５［ＭＨ］⁺。（ＭＷ６１４．６）。 実施例２ Ａｃ−Ｐｈｅ（Ｐ−ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（ＦＣＥ ２９４０８）（配列番号７）の調製 ０．５ｍｍｏｌの４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノ メチル）フェノキシアセトアミド−ノルロイシル−４−メチルベンズヒドリルア ミン−ポリスチレン樹脂（Ｒｉｎｋ ＭＢＨＡ）から出発し、保護アミノ酸：Ｆ ｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ −ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ₂ＰＯ₃Ｅｔ₂）−ＯＨをこの順序で加えて 実施例１に記載したと同様の方法で樹脂上でホスホノメチルペプチドを合成した 。ペプチジル樹脂をＮＭＰ中無水酢酸５当量とＤＩＥＡ５当量で２５℃で３０分 間処理することによりＮ末端アセチル化した。実施例１に記載したように樹脂か ら分離し、ホスホン酸エチル基以外の保護基を脱離した。トリメチルブロモシラ ン１ｍＬを含む還流ＤＣＭに粗ペプチド２７０ｍｇを２時間懸濁した。溶媒の蒸 発後、完全に脱保護されたペプチドを（アセトニトリル勾配を５→４３．５％と した以外は）実施例１に記載したようにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製すると、クロ マトグラフィー純度（ＨＰＬＣ） ９８．０％で標記化合物が得られた。アミノ酸比：Ｖａｌ ２（２）； Ａｓｘ １．３（１）。ペプチド含量：１００％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ ／ｚ ６１３［ＭＨ］⁺。（ＭＷ６１２．６）。 実施例３ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂（ＦＣ Ｅ２９０２１）の調製 標記化合物の調製には別の合成ストラテジーを考案した。ａ−カルボキシ基で Ｎ−アルキルアミド化した対応するアスパラギン酸誘導体から出発し、分離後に ｂ−アミド基をもつようにアミド生成樹脂に側鎖カルボキシ基を結合することに よりアスパラギンＮ−アルキルアミドを導入した。 Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔ．Ｂｕ）−ＯＨ（１０ｍｍｏｌ）及びイソブチルアミン （１１ｍｍｏｌ）を混合無水物法によりＮＭＭ１０当量及びＥＣＣ１０当量と４ 時間反応させた後、ｔ−ブチルをＴＦＡ／水９５：５の溶液で脱保護することに より、非市販アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ(ＣＨ₃)₂を得た。 ０．３５ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−４−メトキシ−４’−（ｇ− カルボキシプロピルオキシ）ベンズヒドリルアミン−アラニルアミノメチル−ポ リスチレン樹脂（ＤＯＤ）から出発し、以下のアミノ酸:Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｎ Ｈ−ＣＨ₂−ＣＨ(ＣＨ₃)₂、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ をこの順序で加えて実施例１に記載したと同様の方法で樹脂上でホスホペプチド を合成し、リン酸化及びアセチル化した。この樹脂を使用してＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ／ ＤＭＳ９５：５：５混合物で３７℃で２時間開裂させた。溶媒の蒸発後、完全に 脱保護されたペプチドを実施例１に記載したようにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製す ると、クロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９９．８％で標記化合物が得られた 。アミノ酸比：Ａｓｘ ０．９（１）； Ｖａｌ （１）； Ｔｙｒ１．１（１ ）。ペプチド含量：７３％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ５７２［ ＭＨ］⁺。（ＭＷ５７１．６）。 実施例４ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（ＦＣＥ ２８４０５）（配列番号１）の調製 自動合成器Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ ｈｅｓｉｚｅｒ ４３０Ａを使用した以外は 実施例１に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９ ６．４％で標記化合物を得た。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ７４３ ［ＭＨ］⁺。（ＭＷ７４２．８）。 実施例５ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＮＨ₂ （ＦＣＥ２８７８２）（配列番号２）の調製 実施例１に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ） ９８．９％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ｌｙｓ １（１）； Ｖａｌ １ ．７３（２）； Ａｓｘ １．２７（１）； Ｔｙｒ ０．８７（１）。ペプチ ド含量：８３％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ７８５［ＭＨ］⁺。 （ＭＷ７８４．８）。 実施例６ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（ＦＣＥ２８５３９ ）（配列番号３）の調製 ４−ヒドロキシメチルベンジルオキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニ ルベンゼン）樹脂（Ｗａｎｇ）を使用した以外は実施例１に記載したと同様の方 法により標記化合物を得た。 第１のアミノ酸（この場合はＦｍｏｃＶａｌ（Ｂｏｃ）ＯＨ）を対称無水物（ア ミノ酸誘導体１２当量をＤＣＭ中ＤＩＣ６当量で処理し、濾過及び蒸発させるこ とにより生成）としてＤＭＦに溶かして樹脂にロードし、触媒量のＤＭＡＰの存 在下で樹脂と２時間反応させた。このローディングをスペクトロフォトメトリー により測定した。実施例１に記載したと同様に調製を続けた。クロマトグラフィ ー純度（ＨＰＬＣ）９９．３％で化合物が得られた。アミノ酸比：Ｖａｌ １． ６（２）； Ａｓｘ １（１）； Ｔｙｒ ０．７（１）。ペプチド含量：８３ ％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ６１６［ＭＨ］⁺。（ＭＷ６１５ ．６）。 実施例７ Ｈ₂Ｏ₃ＰＯ−Ｐｈ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（ＦＣ Ｅ２８４０４）の調製 樹脂の使用と第１のアミノ酸の導入については実施例６に記載したと同様の方 法に従い、合成の他の点については、自動合成器Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ４３０Ａを使用した以外は 実施例１に記載したと同様の方法により標記化合物を得た。化合物はク ロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９９．０％で得られた。アミノ酸比：Ｖａｌ １．９（２）； Ａｓｘ １（１）。ペプチド含量：４１％。ＦＡＢ質量スペ クトロスコピー：ｍ／ｚ５５９［ＭＨ］⁺。（ＭＷ５５８．５）。 実施例８ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９０２２）の調 製 Ｆｍｏｃ−４−メトキシ−４’−（ｇ−カルボキシプロピルオキシ）ベンズヒ ドリルアミン−アラニルアミノメチル−ポリスチレン樹脂（ＤＯＤ）を使用した 以外は実施例１に記載したと同様の方法により標記化合物を得た。この樹脂を使 用してＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ／ＤＭＳ９５：５：５混合物で３７℃で２時間開裂させた 。溶媒の蒸発後、完全に脱保護されたペプチドを実施例１に記載したようにＲＰ −ＨＰＬＣにより精製すると、クロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９８．７％ で標記化合物が得られた。アミノ酸比：Ｖａｌ １(１)； Ａｓｘ １．３(１) ； Ｔｙｒ ０．９（１）。ペプチド含量：８１％。ＦＡＢ質量スペクトロスコ ピー：ｍ／ｚ ５１６［ＭＨ］⁺。（ＭＷ５１５．５）。 実施例９ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂（ＦＣＥ２９０ １８）の調製 Ａｓｎ誘導体の代わりにＦｍｏｃ−ｂＡｌａＯＨを使用した以外は実施例８に 記載したと同様の方法により標記化合物を得た。化合物はクロマトグラフィー純 度（ＨＰＬＣ）９７．０％で得られた。アミノ酸比：Ｖａｌ １（１）； Ｔｙ ｒ１．３（１）。ペプチド含量：５６％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ ｚ ４７３［ＭＨ］⁺。（ＭＷ４７２．４）。 実施例１０ Ａｃ−Ｐｈｅ（ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（Ｆ ＣＥ２８６１５）（配列番号５）の調製 Ｆｍｏｃ−２，４−ジメトキシ−４’−（カルボキシメチルオキシ）ベンズヒ ドリルアミン−アミノメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）樹脂 （Ｋｎｏｒｒ）を使用した以外は実施例２に記載したと同様の方法により標記化 合物を得た。化合物はクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９９．１％で得られ た。アミノ酸比：Ｌｙｓ １（１）； Ｖａｌ １．７（２）； Ａｓｘ １． １（１）。ペプチド含量：９５％。 ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ７４１［ＭＨ］⁺。（ＭＷ７４０．８ ）。 実施例１１ Ａｃ−Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４０ ６）の調製 実施例２に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ） ９８．４％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ａｓｘ １（１）； Ｖａｌ ０ ．８（１）；。ペプチド含量：１００％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ ｚ ５１４［ＭＨ］⁺。（ＭＷ５１３．５）。 実施例１２ Ａｃ−Ｐｈｅ（ＣＨ₂ＳＯ₃Ｈ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２８ ９９５）（配列番号６）の調製 Ｆｍｏｃ−４−メトキシ−４’−（ｇ−カルボキシプロピルオキシ）ベンズヒ ドリルアミン−アラニルアミノメチル−ポリスチレン樹脂（ＤＯＤ）を使用し、 ジエチルホスホニルメチル誘導体の代わりにＦｍｏｃＰｈｅ（ＣＨ₂ＳＯ₃Ｈ）Ｏ Ｈを使用した以外は実施例２に記載したと同様の方法により標記化合物を得た。 この樹脂を使用してＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ／ＤＭＳ９５：５： ５混合物で３７℃で２時間開裂させた。クロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９ ７．０％で標記化合物が得られた。アミノ酸比：Ｖａｌ ２（２）； Ａｓｘ １．１（１）。ペプチド含量：６９％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ６１３［ＭＨ］⁺。（ＭＷ６１２．７）。 実施例１３ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−ＮＨ₂（ＦＣＥ ２８７８５）（配列番号８）の調製 実施例１に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ） ９９．１％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ｓｅｒ １（１）； Ｖａｌ ２ ．０（２）； Ａｓｘ １．２（１）； Ｔｙｒ ０．９（１）。ペプチド含量 ：９７％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ７０２［ＭＨ］⁺。（ＭＷ ７０１．７）。 実施例１４ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ ２８８８３）（配列番号９）の調製 実施例１に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ） ９６．５％で標記化合物を得た。アミノ酸比： Ｇｌｘ １（１）； Ｖａｌ １．７（２）； Ａｓｘ １．２（１）； Ｔｙ ｒ ０．７（１）。ペプチド含量：８０％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ ／ｚ ７４３［ＭＨ］⁺。（ＭＷ７４２．４）。 実施例１５ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−ＮＨ₂（ＦＣＥ ２８７０２）（配列番号１４）の調製 実施例１に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ） ９９．３％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ｓｅｒ ０．９（１）； Ｇｌｘ １（１）； Ａｓｘ １．１（１）； Ｉｌｅ ０．８（１）； Ｔｙｒ ０ ．７（１）。ペプチド含量：９２％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ７４５［ＭＨ］⁺。（ＭＷ７４４．７）。 実施例１６ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−ＮＨ２（ＦＣＥ ２８７０３）（配列番号１５）の調製 実施例１に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ） ９９．０％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ａｓｘ １（１）； Ｇｌｘ ０ ．９（１）； Ｉｌｅ ０．８（１）； Ｖａｌ ０．９（１）； Ｔｙｒ ０．８（１）。ペプチド含 量：９３％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ７９６［ＭＮａ］＋、７ ５８［ＭＨ］⁺、５１５［Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ₂］⁺ 。（ＭＷ７５６．７）。 実施例１７ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（ＦＣＥ ２８７３７）（配列番号１６）の調製 実施例１に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ） ９３．０％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ｌｙｓ １（１）； Ｉｌｅ １ ．７７（２）； Ａｓｘ １．１７（１）； Ｔｙr ０．８（１）。ペプチド 含量：７８％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ７７１［ＭＨ］⁺。（ ＭＷ７７０．８）。 実施例１８ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｍｅ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９０ ９１）（配列番号１１）の調製及び Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃ＨＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９１ １６）（配列番号１２）の調製 Ｆｍｏｃ−４−メトキシ−４’−（ｇ−カルボキシプロピルオキシ）ベンズヒ ドリルアミン−アラニルアミノメチル−ポリスチレン樹脂（ＤＯＤ）を使用し、 チロシン誘導体の代わりにＦｍｏｃＴｙｒ（ＰＯ₃Ｍｅ₂）ＯＨを使用し、従って リン酸化段階を省略した以外は実施例１に記載したと同様の方法により標記化合 物を得た。この樹脂を使用してＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ／ＤＭＳ９５：５：５混合物で３ ７℃で２時間開裂させた。化合物は混合物として得られ、ＲＰ−ＨＰＬＣにより 単離した。 Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｍｅ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９ ０９１）はクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９７．０％で得られた。アミノ 酸比：Ｖａｌ ２（２）；Ａｓｘ １．１（１）； Ｔｙｒ ０．９（１）。ペ プチド含量：８３％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ６４３［ＭＨ］⁺ 。（ＭＷ６４２．６３）。 Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃ＨＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９ １１６）はクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９８．０％で得られた。アミノ 酸比：Ｖａｌ ２（２）；Ａｓｘ １．１（１）； Ｔｙｒ １．０（１）。ペ プチド含量：８４％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ６５１ ［ＭＮａ］⁺、６６７［ＭＫ］⁺。（ＭＷ６２８．６）。 実施例１９ ＢｏｃＴｙｒＯＢｚｌの調製 ＢｏｃＴｙｒＯＨ（２ｇ，７ｍｍｏｌ）及びベンジルアルコール（０．８７３ ｍｌ，８．４ｍｍｏｌ）をＤＣＣ（１．８ｇ，８．７５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ （８５ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ）とＴＨＦ中で０℃で１時間及び室温で一晩反応さ せることにより標記化合物を得た。ＤＣＵの濾過後、溶媒を減圧濃縮し、残渣を ＥｔＯＡｃに溶かし、５％ＮａＨＣＯ₃溶液と飽和ＮａＣｌ溶液で数回洗浄した 。有機相を乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）及び濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグ ラフィー（溶離剤：石油エーテル／酢酸エチル９／１→８／２ｖ／ｖ）により精 製し、標記化合物１．５ｇを得た（収率５７％）。Ｈ¹ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ ，ＣＤＣｌ₃）ｄ（ｐｐｍ）＝７．４−６．６５（ｍ，９Ｈ，芳香族），５．１ （ｄ，２Ｈ，ＣＯＯＣＨ ₂Ｆ），４．６（ｍ，１Ｈ，Ｎ−ＣＨ−ＣＯ），３．０ （ｄ，２Ｈ，ＣＨ−ＣＨ ₂−Ｆ），１．４（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）。 ＢｏｃＴｙｒ（ＰＯ₃Ｅｔ₂）ＯＢｚｌの調製 ＢｏｃＴｙｒＯＢｚｌ（３７１ｍｇ，１ｍｍｏｌ）及びジエ チルホスホロクロリデート（２５８ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下 に乾燥ジオキサン中で過剰のＮａＨ（鉱油中６０％）と５０℃で３．５時間反応 させることにより標記化合物を調製した。溶媒を減圧濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ に溶かし、５％ＮａＨＣＯ₃溶液、１０％クエン酸溶液及び飽和ＮａＣｌ溶液で 数回洗浄した。有機相を乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）及び濃縮し、油状物２５４ｍｇ（収 率５０％）を得、これを精製せずに次段階で使用した。ＦＡＢ質量スペクトロス コピー：ｍ／ｚ ５０８［ＭＨ］⁺、５３０［ＭＮａ］⁺。Ｈ¹ ＮＭＲ（２００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）ｄ（ｐｐｍ）＝７．４−６．８５（ｍ，９Ｈ，芳香族）， ５．１（ｄ，２Ｈ，ＣＯＯＣＨ ₂Ｆ） ４．６（ｍ，１Ｈ，Ｎ−ＣＨ−ＣＯ）， ４．３−４（ｍ，４Ｈ，Ｐ−Ｏ−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），３（ｔ，２Ｈ，ＣＨ−ＣＨ ₂ −Ｆ），１．４（ｍ，１５Ｈ，ＣＨ ₃−ＣＨ₂＋ｔＢｕ）。 ＢｏｃＴｙｒ（ＰＯ₃Ｅｔ₂）ＯＨの調製 メタノール／酢酸混合物中で粗ＢｏｃＴｙｒ（ＰＯ₃Ｅｔ₂）ＯＢｚｌ（１ｍｍ ｏｌ）及びギ酸アンモニウム（４ｍｍｏｌ）を木炭担持１０％Ｐｄと５０℃で２ ０分間反応させることにより標記化合物を調製した。触媒の濾過後、溶媒を減圧 濃縮し、 残渣をＥｔＯＡｃに溶かし、飽和ＮａＣｌ溶液で数回洗浄した。有機相を乾燥（ Ｎａ₂ＳＯ₄）及び濃縮し、油状物２７０ｍｇ（収率７０％）を得、これを精製せ ずに次段階で使用した。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ４０９［ＭＮ ａ］⁺。Ｈ¹ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ⁶）ｄ（ｐｐｍ）＝７．３− ７（ｄｄ，４Ｈ，芳香族），４．１（ｍ，４Ｈ，Ｐ−Ｏ−ＣＨ ₂−ＣＨ₃），３− ２．７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ−ＣＨ ₂−Ｆ），１．４−１．２（ｍ，１５Ｈ，ＣＨ ₃− ＣＨ₂＋ｔＢｕ）。 Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｅｔ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９１ ４５）（配列番号１３）の調製 ＢｏｃＴｙｒ（ＰＯ₃Ｅｔ₂）ＯＨを使用した以外は実施例１８に記載したと同 様の方法により標記化合物を得た。粗Ｈ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｅｔ₂）−Ｖａｌ−Ａｓ ｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂をＤＭＦ中ＤＩＥＡ１．５当量及び無水酢酸５当量で２５℃ で２時間処理することによりＮ−アセチル化を実施した。クロマトグラフィー純 度（ＨＰＬＣ）９０．０％で最終化合物を得た。アミノ酸比：Ｖａｌ ２（２） ； Ａｓｘ １．１７（１）；Ｔｙｒ ０．８７（１）。ペプチド含量：８３％ 。ＦＡＢ質量 スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ６７１［Ｍ−Ｈ］⁺。（ＭＷ６７０．１）。 実施例２０ ６−ビオチンアミド−ヘキサノイル−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖ ａｌ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９１２８）（配列番号１０）の調製 アセチル化の代わりにビオチン化を実施した以外は実施例８に記載したと同様 の方法により標記化合物を得た。Ｎ末端ビオチン化は、２０％ピペリジン−ＤＭ ＦでＮ末端保護基の脱離後に、ＤＭＦ中６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸スル ホスクシンイミジル３．３当量とＮ−メチルモルホリン数滴で２５℃で７０時間 （ニンヒドリン試験により反応の完了が確認されるまで）ペプチジル樹脂を処理 することにより行った。最終化合物はクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９８ ．８％で得られた。アミノ酸比：Ｖａｌ ２（２）； Ａｓｘ １．２（１）； Ｔｙｒ １．０（１）。ペプチド含量：９７％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピ ー：ｍ／ｚ ９１２［Ｍ］。（ＭＷ９１２．０２）。 実施例２１ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９２６７）の調 製 ４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキ シアセトアミド−ノルロイシル−４−メチルベンズヒドリルアミン−ポリスチレ ン樹脂（Ｒｉｎｋ ＭＢＨＡ）を使用した以外は実施例１に記載したと同様の方 法により標記化合物を得た。化合物はクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９８ ．６％で得られた。アミノ酸比：Ａｓｘ １（１）；Ｇｌｙ ０．９（１）； Ｔｙｒ ０．８（１）。ペプチド含量：７７％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー ：ｍ／ｚ ４７４［ＭＨ］⁺。（ＭＷ４７３．４）。 実施例２２ Ａｃ−Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９２６ ８）の調製 実施例２に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ） １００％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ａｓｘ １（１）； Ｔｙｒ ０． ９（１）。ペプチド含量：８８％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ４ ７２ ［ＭＨ］⁺。（ＭＷ４７１．４）。 実施例２３ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４０９）の調 製 ４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキ シアセトアミド−ノルロイシル−４−メチルベンズヒドリルアミン−ポリスチレ ン樹脂（Ｒｉｎｋ ＭＢＨＡ）を使用した以外は実施例１に記載したと同様の方 法により標記化合物を得た。化合物はクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９９ ．３％で得られた。アミノ酸比：Ｇｌｘ １（１）；Ｖａｌ ０．８（１）； Ｔｙｒ ０．８（１）。ペプチド含量：８１％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー ：ｍ／ｚ ５３０［ＭＨ］⁺。（ＭＷ５２９．５）。 実施例２４ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４１０） の調製 実施例２３に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ ）９９．０％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ａｓｘ １（１）； Ｖａｌ ０．８（１）； Ｔｙｒ ０．９（１）。ペプチド含量：８７％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ５１６［ＭＨ］⁺。（ＭＷ５１５．５）。 実施例２５ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ｈｓｅ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４１１）の調 製 実施例２３に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ ）８６．５％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ｖａｌ ０．８（１）； Ｔｙ ｒ １（１）。ペプチド含量：８８％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ５０３［ＭＨ］⁺。（ＭＷ５０２．５）。 実施例２６ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｄ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４１３） の調製 実施例２３に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ ）９９．１％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ａｓｘ １（１）； Ｖａｌ ０．７（１）； Ｔｙｒ ０．８（１）。ペプチド含量：８２％。ＦＡＢ質量ス ペクトロスコピー：ｍ／ｚ ５１６［ＭＨ］⁺。（ＭＷ５１５．５）。 実施例２７ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ａｂｕ−Ａｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４１４）の調 製 実施例２３に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ ）９９．７％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ａｓｘ １（１）； Ｔｙｒ ０．９（１）。ペプチド含量：８７％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ５０２［ＭＨ］⁺。（ＭＷ５０１．４）。 実施例２８ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−ｔｅｒＬｅｕ−Ａｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４１５ ）の調製 実施例２３に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ ）９８．７％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ａｓｘ １．２（１）； ｔｅ ｒＬｅｕ １（１）； Ｔｙｒ １．０（１）。ペプチド含量：７７％。ＦＡＢ 質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ５３０［ＭＨ］⁺。（ＭＷ５２９．５）。 実施例２９ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４２１）の調 製 実施例２３に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ ）９８．９％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ａｓｘ １（１）； Ａｌａ ０．７３（１）； Ｔｙｒ０．７（１）。ペプチド含量：８３％。ＦＡＢ質量ス ペクトロスコピー：ｍ／ｚ ４８８［ＭＨ］⁺。（ＭＷ４８７）。 実施例３０ Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ａｉｂ−Ａｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４７５）の調 製 実施例２３に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ ）９７．２％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ａｓｘ １（１）； Ｔｙｒ ０．８（１）。ペプチド含量：７７％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ５０２［Ｍ−Ｈ］⁺。（ＭＷ５０１．４４）。 実施例３１ ＣＨ₃−（ＣＨ₂）₁₂−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａ ｓｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４０２） （配列番号１７）の調製 実施例８に記載したと同様の方法により毛管電気泳動純度（ＥＦ）９５％で標 記化合物を得た。アミノ酸比：Ｖａｌ ２（２）； Ａｓｘ １．１（１）； Ｔｙｒ １．０（１）； Ｇｌｙ １．９（２）。ペプチド含量：９４％。ＦＡ Ｂ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ８９７［Ｍ］。（ＭＷ８９７．０）。 実施例３２ ＣＨ₃−（ＣＨ₂）₁₂−ＣＯ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｎ Ｈ₂（ＦＣＥ２９４０３）（配列番号１８）の調製 実施例８に記載したと同様の方法により毛管電気泳動純度（ＥＦ）９５％で標 記化合物を得た。アミノ酸比：Ｖａｌ１．７（２）； Ａｓｘ １．１（１）； Ｔｙｒ ０．８（１）。ペプチド含量：８７％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピ ー：ｍ／ｚ ７８３［ＭＨ］⁺。（ＭＷ７８２．９）。 実施例３３ ＣＨ₃−（ＣＨ₂）₆−ＣＯ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｎ Ｈ₂（ＦＣＥ２９４０４）（配列番号１９）の調製 実施例８に記載したと同様の方法により毛管電気泳動純度（ＥＦ）７２％で標 記化合物を得た。アミノ酸比：Ｖａｌ １．８（２）； Ａｓｘ １（１）； Ｔｙｒ ０．９（１）。ペプチド含量：８７％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー ：ｍ／ｚ ６９９［ＭＨ］⁺。（ＭＷ６９８．７）。 実施例３４ Ｃ₆Ｈ₁₁−ＣＨ₂−ＣＯ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＮＨ₂ （ＦＣＥ２９４０５）（配列番号２０）の調製 実施例８に記載したと同様の方法により毛管電気泳動純度（ＥＦ）７５％で標 記化合物を得た。アミノ酸比：Ｖａｌ１．８（２）； Ａｓｘ １（１）； Ｔ ｙｒ １．０（１）。ペプチド含量：９６％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー： ｍ／ｚ ６９７［ＭＨ］⁺。（ＭＷ６９６．７）。 実施例３５ ＣＨ₃−ＣＯ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａ ｓｎ−ＮＨ₂（ＦＣＥ２９４０７）の調製 実施例２に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ） ８８．３％で標記化合物を得た。アミノ酸比： Ａｓｘ １（１）； Ｖａｌ ０．８（１）。ペプチド含量：９９％。ＦＡＢ質 量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ５７０［ＭＨ］⁺。（ＭＷ５６９．７）。 実施例３６ ６−ビオチンアミド−ヘキサノイル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ −Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ）−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖ ａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ −Ｌｙｓ−ＯＨ（ＦＣＥ２８９４２）（配列番号２１）の調製 ４−ヒドロキシメチルフェノキシアセトアミドメチル−ポリエチレングリコー ル−ポリスチレン樹脂と、エステル結合を介して樹脂に予め結合しておいた第１ のアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１．１ｇ；０．１８ｍｍｏ ｌ／ｇ）から出発してＭｉｌｌｉｇｅｎ ９０５０ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ ｈｅｓｉｚｅｒで連鎖合成を実施した。処理段階１〜６内に二度のカップリング を含む下記のサイクルに樹脂をかけた。 １）２０％ピペリジン−ＤＭＦを使用してＦｍｏｃ保護基を７分間脱離、 ２）ＤＭＦで１２分間洗浄、 ３）ＤＭＦ中Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体４当量と３０分間第１のカップリング、 ４）ＤＭＦで８分間洗浄、 ５）ＤＭＦ中Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体４当量と３０分間第２のカップリング、 ６）ＤＭＦで８分間洗浄。 以下の側鎖保護アミノ酸誘導体：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆ ｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ） −ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＲ（ここでＲは水素又はＰｆ ｐである）を使用してカルボキシ末端からアミノ末端に向かって標記化合物の配 列を提供するように、段階１〜６の反応サイクルを各アミノ酸残基で繰り返した 。 各サイクルで第１のカップリング反応（段階３）はＦｍｏｃ−アミノ酸ペンタ フルオロフェニルエステルを使用して実施し但し、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒ ｔ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ペプチド鎖 の２及び４位）は使用直前にＦｍｏｃ−アミノ酸、ＴＢＴＵ、１−ヒド ロキシベンゾトリアゾール（各々４当量）及びＮ−メチルモルホリン（８当量） を反応させることにより形成した１−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステルと してカップリングした。各サイクルで第２のカップリング反応（段階５）は上記 のように使用直前に形成したＦｍｏｃ−アミノ酸１−ヒドロキシベンゾトリアゾ リルエステルを使用することにより実施したが、但し、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ− ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢ ｕ）−ＯＨはそれらのペンタフルオロフェニルエステルを使用してカップリング した。 最終サイクル後にペプチジル樹脂をＤＣＭで数回洗浄して乾燥した。出発樹脂 に対して１．２ｇの重量利得が得られた。Ｔｙｒ残基のリン酸化は、ペプチジル 樹脂を１Ｈ−テトラゾール３０当量とジ−ｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル ホスホラミダイト１０当量の蒸留ＴＨＦ溶液で２５℃で１．５時間、次いでトル エン中ｔ−ブチルヒドロペルオキシド３０当量で２５℃で１．５時間処理するこ とにより、樹脂にまだ結合しているペプチド上で直接実施した。Ｎ末端ビオチン 化は、Ｎ末端Ｆｍｏｃ保護基を２０％ピペリジン−ＤＭＦで脱離後にペプチジル 樹脂をＤＭＦ中６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸スルホ スクシンイミジル３．３当量とＮ−メチルモルホリン数滴で２５℃で７０時間（ ニンヒドリン試験により反応の完了が確認されるまで）処理することにより実施 した。ペプチジル樹脂をＤＣＭで数回洗浄して乾燥した。出発樹脂に対して１． ５ｇの重量利得が得られた。ペプチジル樹脂０．７０ｇにトリフルオロ酢酸／水 ／ＥＭＳの９５：２．５：２．５混合物８ｍｌを加えて室温で１．５時間撹拌し た。脱保護したペプチドをジエチルエーテルで沈殿させ、濾取した。 ＵＶ検出器を２２０ｎｍ波長で使用し、０．０５Ｎ ＡｃＯＮＨ₄水溶液中順 次１３．２５％２５分間、１６％３５分間、１８．７５％３０分間及び２１．５ ％１０分間の段階的アイソクラチック条件で溶離することにより、Ｃ１８−Ｖｙ ｄａｃ（Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）カラム（２．２×２５ｃｍ）で流速１８ｍｌ ／分でＲＰ−ＨＰＬＣにより粗ペプチドを精製した。純形態の生成物を含むフラ クションをあわせ、アセトニトリルを減圧蒸発させ、残留溶液を２回凍結乾燥し た。クロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９１．５％で標記化合物が得られた（ １２ｍｇ）。アミノ酸比：Ｌｙｓ １（１）； Ａｓｘ ２．３７（２）； Ｇ ｌｙ ６．００（６）； Ｉｌｅ ０．９（１）； Ｔｈｒ １．００（１）； Ａｌａ １．００（１）； Ｈｉ ｓ １．７３（２）； Ｇｌｘ １．１０（１）； Ｖａｌ ３．６３（４）； Ｔｙｒ １．８３（２）。ペプチド含量：８２％。ＦＡＢ質量スペクトロスコ ピー：ｍ／ｚ２６２７．２［ＭＨ］⁺； ｍ／ｚ２６２５．５［Ｍ−Ｈ］^-。（Ｍ Ｗ２６２７．７４）。 実施例３７ ６−ビオチンアミド−ヘキサノイル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ −Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ −Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｏ Ｈ（ＦＣＥ２８９４９）（配列番号２２）の調製 実施例３６に記載したと同様の方法によりクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ ）９１．８％で標記化合物を得た。アミノ酸比：Ｌｙｓ １（１）； Ｖａｌ ３．６７（４）； Ａｓｘ ２．４（２）； Ｔｙｒ １．８３（２）； Ｔｈ ｒ １．０（１）； Ａｌａ １．０７（１）； Ｈｉｓ １．６（２）；Ｇｌ ｘ １．１（１）； Ｉｌｅ ０．９３（１）； Ｇｌｙ ６．３（６）。ペプ チド含量：６８％。ＦＡＢ質量スペクト ロスコピー：ｍ／ｚ ２５４７．１［Ｍ＋Ｈ］⁺； ２５４５［Ｍ−Ｈ］^-。（Ｍ Ｗ２５４７．８）。 実施例３８ Ｈ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ（ＦＣＥ２８ ４０７）（対照）（配列番号２３）の調製 自動合成器Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ ｈｅｓｉｚｅｒ ４３０Ａを使用し、実施例１に記載したようにリン酸化段階を 実施した以外は、実施例６に記載したと同様の方法により標記化合物を得た。化 合物はクロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９９．０％で得られた。アミノ酸比 ：Ｌｙｓ ０．８（１）； Ｖａｌ １．６（２）； Ａｓｘ １（１）。ペプ チド含量：８０％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ７０２［ＭＨ］⁺ 。（ＭＷ７０１．７）。 実施例３９ Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（ＦＣＥ２９６０６）（対照）（ 配列番号２４）の調製 樹脂の使用と第１のアミノ酸の導入については実施例６に記載したと同様の方 法に従い、合成の他の点については実施例１に記載したと同様の方法により標記 化合物を得た。化合物はク ロマトグラフィー純度（ＨＰＬＣ）９７．６％で得られた。アミノ酸比：Ｖａｌ ２（２）； Ａｓｘ １．４（１）； Ｐｈｅ ０．９（１）。ペプチド含量 ：９８％。ＦＡＢ質量スペクトロスコピー：ｍ／ｚ ５２０［ＭＨ］⁺。（ＭＷ ５１９．６）。 実施例４０ 細菌発現系を使用した組換えＳＨ２ドメインの調製 大量の純粋な機能的タンパク質を迅速に生産するために、主にＤ．Ｂ．Ｓｍｉ ｔｈとＫ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅｎｅ，１９８８，６７，３１）に記載され ているような手順を利用した。ポリメラーゼ連鎖反応によりＳＨ２ドメインをグ ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として得、ｐＧ ＥＸ細菌発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。細菌発現後 に融合タンパク質はグルタチオン−アガロースクロマトグラフィーにより容易に 精製された。使用したプロトコールは以下の通りである。ｐＧＥＸベクターで形 質転換した大腸菌細胞（ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ）を、（１００ｇ／ｍｌ）アンピシ リンを含むＬＢ培地１Ｌに接種するために使用した以外のＬＢ１０ｍＬ中で３７ ℃で震盪して一晩増殖させ た。これを、ＯＤ₆₀₀＝０．５〜０．６まで３７℃で強く曝気しながら３〜４時 間増殖させた。ＩＰＴＧを最終濃度０．２〜０．４ｍＭまで加えることにより組 換えタンパク質の発現を誘導し、３７℃で４〜８時間更に増殖させた。次に２０ ００ｇで１５分間遠心分離することにより細菌細胞をペレット化し、ＰＢＳで２ 回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含有するＥＢ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール， １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）４０ｍｌ中で氷上溶解させた。細胞を温和な 音波処理にかけた後、氷上に更に３０分間放置した。溶解物を４℃で２０分間１ ４，０００ｒｐｍで遠心分離することにより細胞破片を除去した。上清をＥＢ緩 衝液で予備洗浄したグルタチオンアガロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）５ｍｌと共 に４℃で２時間回転下にインキュベートし、組換えタンパク質を親和性結合させ た。次にビーズをＥＢで４回、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２ 回洗浄した。タンパク質をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０ｍｌ中２０ｍＭ グルタチオンと競合させることによりビーズから溶離させ、１ｍｌフラクション として集め、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質含量を定量した。その後 、精製ＧＳＴ融合タンパク質をＢＩＡコア及び生化学分析に使用した。 実施例４１ バキュロウイルス発現系を使用した組換えＨＧＦ−Ｒの調製 ＧＳＴ融合タンパク質としてのヒトＨＧＦ−Ｒ ｃＤＮＡの細胞内ドメインを バキュロウイルス導入ベクターＰＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に挿入した。組換えベクターをリポフェクション法（Ｇｉ ｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によりＢｓｕＩで消化した ＢａｃＰａｋ６ウイルスＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）と共にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒ ｄａ昆虫細胞（Ｓｆ９）に同時トランスフェクトした。陽性クローンを同定し、 ドットブロットハイブリダイゼーション及びプラークアッセイにより精製した。 組換えウイルスを使用してＳｆ９細胞に１０^-1、１０^-2、１０^-3、１０^-6希釈液 を感染させた。１週間後に感染細胞抽出物をナイロンフィルターにブロットし、 放射性標識全長ヒトＨＧＦ−Ｒ ｃＤＮＡでプローブした。次に、 ＨＧＦ−Ｒ ｃＤＮＡ遺伝子を含むウイルスをプラークアッセイにより精製した 。単一ウイルスクローンを単離し、Ｓｆ９細胞の大規模感染に使用した。ウイル スクローンの発現をウエスタンブロッティングによりモニターした後、高レベル 発現クローンを大規模タンパク質生産に使用した。ＧＳＴ／ＨＧＦ−Ｒ融合タン パク質の精製はほぼＳＨ２ドメインについて記載したように実施した。 実施例４２ ｉｎ ｓｉｔｕ接着細胞のエレクトロポレーション：細胞ザッピング ペプチドを接着細胞に有効に導入するために、新規ｉｎ ｓｉｔｕ電気透過ア プローチを利用した（Ｌ．ＲａｐｔｉｓとＫ．Ｌ．Ｆｉｒｔｈ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，９，６１５−６２１）。この方法は、 （１）細胞膜がトリプシン処理により変性されず、（２）細胞が基質から分離す る付加応力を受けず、（３）細胞生存率が通常のエレクトロポレーション法より も高く、（４）エレクトロポレーション後に顕微鏡検査により細胞変性を直接試 験できるという点で従来のエレクトロポレーション法よりも好ましい。エレクト ロポ レーション装置（Ｅｐｉｚａｐ ＥＺ−１１．Ａｓｋ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）はコンデンサーの充放電用回路 と、細胞にパルスを送達するためのアセンブリから構成した。前記アセンブリは 導電性で光学的に透明なイリジウム−錫酸化物を塗布したガラススライドと、ア ルミニウム負極と、アルミニウム正極から構成した。実験前日にガラススライド を１０ｃｍペトリ皿に入れ、エタノールで滅菌した。ＭＤＣＫ細胞を導電性表面 にプレーティングした。パルス印加の前に増殖培地（ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ）を 取り出し、細胞をエレクトロポレーション用緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム ，ｐＨ７．０，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＫＣｌ）で２回洗浄した。次に 、導入しようとする被験化合物を(エレクトロポレーション用緩衝液中１ｍＭ溶 液として)補充した同一緩衝液を細胞に加えた。以下のパラメーター：５０〜１ ００Ｖ及び１〜２０ｍＦに従って単パルスとしてエレクトロポレーションを実施 した。パルス後に細胞を増殖培地で２回洗浄し、３７℃で２時間再生させた。エ レクトロポレーションから２時間後にトリパンブルーを加えて細胞生存率を調べ た。次に、エレクトロポレートした細胞をガラススライドから 分離し、移動及び侵入アッセイで直接使用した。 実施例４３ トランスウェル移動及び侵入アッセイ Ｃｏｓｔａｒｓ培養チャンバートランスウェル（６．５ｍｍ，Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ） を使用して細胞侵入の刺激を測定した。トランスウェルの上部区画の底にポリカ ーボネート膜（細孔寸法８ｍｍ）を敷いて使用した。実施例４７に記載したよう に被験化合物のエレクトロポレーション後に、培地２００ｍｌ中細胞１０⁵個を 上部区画のポリカーボネート膜上に置いた。刺激因子（高度精製ＨＧＦ４００単 位）を含むか又は単独のＤＭＥＭ５％ＦＣＳ１ｍｌを下部区画に加えた。プレー トをＨ₂Ｏで飽和した５％ＣＯ₂雰囲気内で３７℃で２４時間インキュベートした 。インキュベーションが終了したらポリカーボネートフィルターの上側の細胞を 機械的に取り出した。細胞侵入の試験時には、上皮基底膜構造に似ており、ＩＶ 型コラーゲン、ラミニン及び他の基底膜成分を含むマトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏ ｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｗａｌｔｈａｍ ，ＭＡ）１．２ｍｇ／ｍｌでポリカーボネ ートフィルターを被覆した。細胞侵入の評価時には、インキュベーションを４８ 時間まで延長した。フィルターの下側に移動している細胞を１１％グルテルアル デヒドで室温で１５分間固定し、蒸留水で３回洗浄し、０．１％クリスタルバイ オレット−２０％メタノールで室温で２０分間染色した。３回水洗及び室温で完 全に乾燥後、フィルターを１０％酢酸３００ｍｌに（室温で５分間）浸漬させる ことにより、クリスタルバイオレットを可溶化させた。可溶化クリスタルバイオ レットの濃度を５９０ｎｍの吸光度として評価した。 実施例４４ 細胞増殖アッセイ 細胞増殖アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してチミジン類似体５−ブロモ −２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みにより細胞増殖の刺激を測定 した。実施例４７に記載したように被験化合物をエレクトロポレーション後のＭ ＤＣＫ細胞を準集密に達するようにマイクロタイタープレートに入れ、ＤＭＥＭ ０．２％ＦＣＳ中で２４〜４８時間飢餓後に精製組換えＨＧＦで刺激した。６時 間後にＢｒｄＵを加え、更に２時間放置して取り込ませた。特異的モノクローナ ル抗体とペルオキ シダーゼ結合二次抗体によりＢｒｄＵの取り込みを検出した。色原体ペルオキシ ダーゼ基質と共にインキュベートすると、４１０ｎｍの吸光度として読取り可能 な可溶性緑色色素を生成する。 実施例４５ 管形成アッセイ 慣用管形成アッセイ（Ｍｅｄｉｃｏら，１９９６）を改変し、エレクトロポレ ートした細胞でｉｎ ｓｉｔｕ実施した。ＭＤＣＫ細胞を導電性スライド上でＤ ＭＥＭ１０％ＦＣＳ中で集密まで増殖させた。実施例４７に記載したように被験 化合物をザッピング後に、主にＩ型の精製コラーゲンの２％混合物を含む合成細 胞外マトリックス（Ｓｅｒｏｍｅｄ）でＭＤＣＫを被覆した。被覆した単層を精 製組換えＨＧＦの存在下で４〜５日間培養した。２日置きにＨＧＦ補充培地を取 り換えた。倒立光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で４００倍で毎日観察することにより 管形成をモニターした。ＨＧＦ刺激から２日後に管構造は明白になった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 デ・ローザ，サブリナ イタリー国、イ−84013・カバ・デイ・テ イレーニ、ビア・ラゴーネ、54 (72)発明者 コラツデイ，フアビオ イタリー国、イ−20100・ミラノ、ビアー レ・ベアトリス・デステ、47 (72)発明者 コモツリヨ，パオロ イタリー国、イ−10131・トリノ、ストラ ーダ・バル・サリチエ、183／８ (72)発明者 バルデツリ，アルベルト イタリー国、イ−10121・トリノ、ビア・ アルチベスコバード、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下式（Ｉ）： ［式中、Ｙは水素、Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（式中、Ｒは水素、低級アルキル又は 長鎖アルキルであり、いずれの場合もアルキル基は直鎖、分枝鎖又は環式のいず れでもよい）、Ｎ置換アミノ酸もしくはペプチド残基、又はＮ置換アミノ酸もし くはペプチド部分を含むポリペプチド残基であり、Ｘは−ＯＰＯ₃Ｈ₂又はその機 能的誘導体であり、Ａは低級アルキルであり、ＢはＨ−又は低級アルキルであり 、ＺはＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＲ²、−ＣＯＲ²であり、ここでＲ²＝Ｈ、− ＮＨ₂、−ＮＨＲ³であり、Ｒ³は低級アルキル、又はカルボン酸もしくはアミド 化形態のアミノ酸もしくはジペプチドである］のペプチド又は 医薬的に許容可能なその塩。 ２．Ｎ置換アミノ酸又はペプチド残基がＲ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｇｌｙ−、Ｒ−Ｃ（＝ Ｏ）−Ｔｈｒ−又はＲ−Ｃ（＝Ｏ）−Ａｌａ−Ｔｈｒ−（式中、Ｒは請求項１に 定義した通りである）である請求項１に記載の化合物。 ３．−ＯＰＯ₃Ｈ₂の機能的誘導体が−ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＦ₂ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ ＦＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＳＯ₃Ｈ、−ＣＦ₂ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨＦＳＯ₃Ｈ、−ＳＰＯ₃Ｈ₂ 、−ＯＰＳＯ₂Ｈ₂、−ＳＰＳＯ₂Ｈ₂、−ＯＰＳ₂ＯＨ₂、−ＯＰ（ＣＨ₃）Ｏ₂Ｈ 、−ＳＰ（ＣＨ₃）Ｏ₂Ｈ、−ＯＰ（ＣＨ₃）ＳＯＨ、−ＯＰ（ＣＦ₃）Ｏ₂Ｈ、− ＯＰ（ＣＨＦ₂）Ｏ₂Ｈ、−ＳＰ（ＣＦ₃）Ｏ₂Ｈ、−ＳＰ（ＣＨＦ₂）Ｏ₂Ｈ及びそ れらの低級アルキルエステルから選択される請求項１又は２に記載の化合物。 ４．ＡがＣＨ₃−、ＣＨ₃ＣＨ₂−、（ＣＨ₃）₂ＣＨ−、（ＣＨ₃）₃Ｃ−、ＣＨ₃Ｃ Ｈ₂ＣＨ（ＣＨ₃）−又は（ＣＨ₃）₂ＣＨＣＨ₂−である請求項１から３のいずれ か一項に記載の化合物。 ５．Ｒ³が−ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂であるか又は、−Ｖａｌ−ＮＨ₂、−Ｖａｌ− ＯＨ、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ （ｅＮ−Ａｃ）−ＮＨ₂、 −Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ｅＮ−Ａｃ）−ＯＨ、−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−ＮＨ₂、−Ｖａｌ −Ｓｅｒ−ＯＨ、−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＯＨ及び−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＮＨ₂から選 択される請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。 ６．サイトソルシグナルトランスデューサーに結合することができる請求項１か ら５のいずれか一項に記載の化合物。 ７．サイトソルシグナルトランスデューサーとレセプターチロシンキナーゼ又は 別のチロシンリン酸化トランスデューサーとの結合を阻害することができる請求 項６に記載の化合物。 ８．サイトソルシグナルトランスデューサーがＧｒｂ−２、Ｓｈｃ、ホスファチ ジルイノシトール３’キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のｐ８５サブユニット、Ｓｒｃ、ｒ ａｓ ＧＴＰアーゼアクチベータータンパク質（ＧＡＰ）、ホスホリパーゼＣγ （ＰＬＣγ）、ＺＡＰ７０、Ｓｙｃ及びＳｔａｔから構成される群から選択され 、レセプターチロシンキナーゼが肝細胞増殖因子レセプター（ＨＧＦ−Ｒ）、血 小板由来増殖因子レセプター（ＰＤＧＦ−Ｒ）、上皮増殖因子レセプター（ＥＧ Ｆ−Ｒ）及び細胞質ドメインを維持するそれらの截頭又は突然変異形から構成さ れる群から選択される請求項７に記載の化合物。 ９．トランスデューサーがＧｒｂ−２、Ｓｈｃ、ホスファチジルイノシトール３ ’キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のｐ８５サブユニット、Ｓｒｃ、ｒａｓ ＧＴＰアーゼ アクチベータータンパク質（ＧＡＰ）、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）、ＺＡ Ｐ７０、Ｓｙｃ及びＳｔａｔから構成される群から選択される請求項７に記載の 化合物。 １０．サイトソルシグナルトランスデューサーがＧｒｂ−２であり、レセプター チロシンキナーゼがＨＧＦ−Ｒ又はその関連形、例えばＴｐｒ−ＭＥＴや、ＳＥ Ａ及びＲＯＮ等の同一ファミリーの他のメンバーである請求項８に記載の化合物 。 １１．下記化合物： から選択される請求項１に記載の化合物。 １２．単一アミノ酸及び／又は２種以上のアミノ酸残基から予備形成したペプチ ドから式（Ｉ）のペプチドを化学的に合成することを特徴とする請求項１から１ １のいずれか一項に記載の化合物の製造方法。 １３．固相合成中に予備リン酸化保護チロシン残基をペプチドに導入する請求項 １２に記載の方法。 １４．ペプチドを固体支持体に結合しながら保護予備形成ペプチドのチロシン残 基をリン酸化する請求項１２に記載の方法。 １５．ペプチドを医薬的に許容可能なその塩に変換する請求項１２から１４のい ずれか一項に記載の方法。 １６．生理的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と活性成分として請求項１から １１のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。 １７．人体又は動物体の治療に用いる請求項１から１１のいずれか一項に記載の 化合物。 １８．新生物疾患の治療に用いる請求項１７に記載の化合物。 １９．新生物疾患の治療用医薬の製造における請求項１から１１のいずれか一項 に記載の化合物の使用。