JPH11500906A

JPH11500906A - 脂質細胞壁成分の単離および精製法

Info

Publication number: JPH11500906A
Application number: JP8525506A
Authority: JP
Inventors: アンドリアヌスバーショアー，ジャン
Original assignee: アドコック、イングラム、リミテッド
Priority date: 1995-02-22
Filing date: 1996-02-22
Publication date: 1999-01-26
Also published as: AU4728796A; HUP9900378A2; ATE395428T1; CA2213428A1; CN1183811A; DE69637522D1; US6171830B1; HUP9900378A3; RU2155230C2; EP0811075A1; EP0811075B1; ZA961412B; AU720288B2; WO1996026288A1

Abstract

(57)【要約】多相溶媒系を用いて、相当する細胞の培養物から抽出することができるまたは合成することができる細胞壁成分、またはその誘導体または類似体である様々な種類の化合物を同時に精製および分離するための方法。細胞壁成分は、一群としての不純物から分離することができる微生物由来の脂質細胞壁成分であることができる。

Description

【発明の詳細な説明】脂質細胞壁成分の単離および精製法発明の背景本発明は、Mycobacterium、Corynebacterium、Nocardia、またはRhodococcus 属と見なされる細菌であって、最もよく見られかつヒトの健康の寒天から最も重要な細菌がMycobacterium であるものに由来する脂質細胞壁成分の単離および精製に関する。 Mycobacterium 属は、多数の腐生性および病原性種を含んでいる。この属の最もよく知られているものであるM．tuberculosis およびM．leprae は、ヒトで起こる極めて危険な疾病のうちのそれぞれ結核およびハンセン病の起因菌である。結核：現状結核は、世界中至る所における主要な伝染病であると考えられている。医科学および有効な薬剤の範囲が大きく進歩して、一時はこの疾病を克服したという印象を生んだにも拘らず、かつ組織された国際的努力にも拘らず、結核は世界の健康問題の極めて大きな部分を占めている。世界人口の約１／３がM.tuberculosis に感染しており(Fauci,1995)、世界中で８百万を越える新たな症例および１９９０年だけでも３百万を越える死亡が報告された(Snider,1994)。世界保険機構によってなされた予測では、２０００年までに年間数は新規症例は１０．２百万および死亡は３．５百万に達し、アジアおよびサハラ砂漠以南のアフリカが最も被害の大きい大陸であることが示唆されている(De Cock et al.,1992;Dolin Ravig lione and Kochi,1994;Raviglione,Snider and Kochi,1995;Wilkinson and de C ock,1996)。最近発表された「結核の流行についてのＷＨＯ報告、１９９５年(WH O Report on the Tuberculosis Epidermic,1955)」によれば、次の１０年間に予想される数字は、更に驚くべきものであり、新たな感染者は３００百万人であり、死亡者は３０百万人である(Holler，1995)。事実上、結核は世界的な公衆衛生の緊急事態であることが１９９３年にＷＨＯによって報告された (Bloomfield，1995; Wilkinson and de Cock,1996)。結核のこの劇的な盛り返しと衰えを知らない蔓延の主な理由は、 1) ＢＣＧ^*)の使用による世界的なワクチン接種計画によって提供された不十分な予防、^*) ＢＣＧ：(Bacillus of Calmette and Guerin)CalmetteとGuerinは、M.bovis の菌株をグリセリンと雄ウシ胆汁を含む培地で１３年に亙って２３１回継代培養することによって減弱した。 2) 結核の検出に関する問題、 3) 結核の治療に関する問題、およびM.tuberculosis の多剤耐性菌の出現、 4) ＨＩＶ感染症との相互作用、 5) 社会経済的側面であると考えられる。１．ＢＣＧの使用による世界的なワクチン接種計画によって提供された不十分な予防 M．tuberculosis による感染に対する抵抗力を誘導することによる結核の蔓延を防止する試みは、今世紀の初めにＢＣＧによるワクチン接種を用いて開始された。管理された多くの研究に基づき、ＢＣＧによるワクチン接種で得られる予防効果は０〜８０％であることが確認され（Snider，1994; Hersfield，1995）、また公表された文献分析に基づいて、ＢＣＧワクチン接種はおおよそ５０％有効であることが判った(Colditz et al.，1994; O′Brien，1995)。この不満足な状態に対して多数の仮説／説明が提出されている(Fine，1994)。最も重要なものは、下記の通りである。 i) 菌株の変動によってまたは製造法の差異によって引き起こされるＢＣＧワクチンの変動、 ii) M．tuberculosis の病原性の差異、 iii) 環境中のマイコバクテリアに対する暴露の差異−環境中のマイコバクテリアは、ＢＣＧと拮抗的または相乗的に作用することがある、 iv) ＢＣＧのワクチン接種を受けた個体群の遺伝学的差異、 v) 各種の個体群の栄養および日光への暴露の差異、 vi) 各種の研究のデザインの差異、 vii) ＢＣＧのワクチン接種の予防作用の評価に用いられる基準の不適切さ。２．結核の検出に関する問題結核および関連したマイコバクテリアによる疾病を精確かつ時宜を得て検出することは、これらの疾病を克服するのに一層可能性の高い包括的方法を開発する上で重要な要件の一つである。従来の実験室的検出法の主な欠点は、生菌および死菌を区別することができず（迅速かつ簡単なZiehl-Neelsen 染色）、またはこれらの方法により生菌の存在を確認する場合には（直接培養）、実験室試験を完了するまでに数週間を要することである。また、これにより、治療の開始が遅れることがあり、疾病が更に蔓延する可能性がある。結核の診断に対する最近開発された分子的方法(Godfrey-Faussett，1994; Ric heldi，Barnini and Saltini，1995; Bloomfield，1995; Vlaspolder，Singer a nd Roggeveen，1995）により、先進国の進歩した実験室ではこれらの迅速かつ感度の高い検出装置の導入が計られたが、それらの装置は高価であり、特別に訓練した人員を必要とする。これらの理由により、この疾患を抑制する費用の重荷を既に負っている資源に乏しい結核流行地域では、これらは結核のスクリーニング／検出には適さない(O′Brien，1995; Voelker，1995)。同様な状況は迅速薬剤感受性試験(Schaberg et al.，1995; Pretorium et al. ,1996)、およびMycobacterium の迅速培養(Bloomfield，1995)の分野にも見られる。これらの分野における顕著な進歩は、財政的理由により、結核の流行病に酷く冒されている国々では用いることはできない。３．結核の治療に関する問題、およびM．tuberculosis の多剤耐性菌の出現結核の効果的な化学療法の開発により患者の治療が可能となり、この疾病の大流行を防止することができた。殺菌作用の認められている抗結核薬（リファンピシリン、イソニアシドおよびピラジナミド）並びに制菌または耐性防止特性を有する薬剤（ストレプトマイシン硫酸塩、エタンブトールおよびチアセタゾン）は用いられるが(Weil，1994)、この疾病を克服する世界的な成功は、２つの主要な要因、すなわち所定の養生法に患者が従わないこと、および発展途上国に見られる財政的限界、によってこれまでのところ達成されていない。発展途上国における結核の抑制に関するイソニアジドによる予防法の影響は、確定的なものではない。この方法は、北米では広く実施されているが、２つの主要な欠点を有する。第一に、結核患者が生存している限り投与しなければならないことがあり、第二に、特に年間の患者当たり４米ドルの量しか健康管理全体に利用できないほとんどの罹患地域では、その価格、すなわち１８米ドル／患者／６か月間が非常に高いものとなることがある(O′Brien，1995)。患者に対する有害な効果は別として、治療の中断および／または未完了により、M．tuberculosis の多剤耐性菌の緊急事態および蔓延を招き、全体的状況を更に複雑にしている(Beyers et al.,1996)。最近のＷＨＯの試算によれば、世界中の５０百万人の人々が、最も普通に用いられている抗結核薬の１種類以上に耐性を有するM．tuberculosis 菌を既に保菌している可能性があることを示している。１９９１年には、ニューヨークの全結核患者の１／３が少なくとも１種類の薬剤に耐性であり、約２０％がリファンピシリンおよびイソニアジドの配合薬に耐性であることが明らかになった(Henderson，1995)。４．ＨＩＶ感染症との相互作用結核とＨＩＶ感染症との間で明らかにされている緊密な関連性並びにこれらの疾患の療法が同時に存在することが多いことが、状況を深刻にしている(Torres et al.,1990;De Cock,1994;Cantwell and Binkin,1994;Murray,1994;Antonucci et al.,1995;Mofeson et al.,1995;Davies,Wilkinson and Colvin,1996;Wilkins on and Moore,1996)。アジアにおいて結核を発症している人々の多くは、平行してＨＩＶにも感染しているため、Public Health Reports によればこの１０年間で７倍に増加すると予想されている(1995)。 M．tuberculosis および他の非定型マイコバクテリアの菌株での多剤耐性の出現により、この問題に別の次元が生じた(Blumberg，Miller and Koomhof，1994; Morse，1994; Yew and Chau，1995)。５．社会経済的側面失業、過密人口、経済状態の総体的低下、アルコール中毒および公衆衛生施設の老朽化などのこの疾病の一層の蔓延の原因となる理由が、最近Darbyshire(199 5)、Fauci(1995)、Law et al．(1995)およびMangtani et al．(1995)概説されている。流行地域から結核がかなり抑制されているアメリカ合衆国などの国々への移民の流入増加により、結核の蔓延を含む別の問題が生じている(Huebner and Castr o，1995)。米国への移民における結核の発病率は、生粋の人口に見られる発病率の１２倍であることが報告されている(Ballew and Becker,1995)。上記の傾向により、流行地域および発展途上国の両方における結核患者のケース管理の現在行われている方法の改良、および結核を予防しおよび／または治療することのできる新規な薬剤の開発に強い圧力が加えられている(Cole,1995;Voe lker,1995)。慎重な楽観主義がこれらの両分野の研究者には見られるが(Mwinga ， 1995; Grosset，1995)、先進国においても現在広く行われている経済的制限により、新規な抗結核薬の開発に要する資金供給に大きな制限が加えられており、この薬剤の価格はそれぞれの新規な化合物について１５０百万ドルと試算されている(Grosset，1995)。予防および治療の免疫学的考察上記の問題の重要性、現在用いられている結核の治療法に関連した制限、および新たな形態の化学的予防法および化学療法を開発する費用を考慮して、免疫学的方法により、適切かつ現実的な結核および関連疾患の抑制および治療に効果的かつ経済的に利用できる解決法を見いだすための代替法を得ることができる。 M．vaccae の死菌による処理を用いる多数の試みから得られた結果は(Stanfor d and Grange,1994)は、この腐生微生物を結核の免疫療法に単一薬剤として(Bah r et al.,1990a;Bahr et al.,1990b;Stanford et al.,1990a)または化学療法と結合させて(Stanford et al.,1990b;Prior et al.,1995;Onybebujoh et al.,199 5)適用することができることを示している。サリドマイドの使用による炎症工程の調節は、近年結核の治療に利用されてきた。Cole(1995)によって報告された結核の臨床的症状に対するサリドマイドの有益な効果により、この疾患の治療におけるこの薬剤の免疫調節特性を考察する素地が提供される。これらのサリドマイドの効果は、腫瘍壊死因子である結核に付随する炎症工程に関与するサイトカインに対する強力な阻害作用に起因している。これらの２種類の方法から得られる利点は、結核の薬物耐性形態の治療に拡大することができる。これに関して有望なデーターが、イラン(Etemadi,Farid and Stanford,1992)およびクウェート、ルーマニア、ベトナムおよびインド(Stanfo rd and Grange，1993)で行った多数の試験から報告されている。免疫学的標的過去数十年に亙るM．tuberculosis の免疫学的に活性な成分の同定の試みは、主としてタンパク質(Daniel，1984; Chaparas，1984; Yanez et al.，1986; Des hpande et al.，1994; Torres et al.，1994)、多糖類(Daniel，1984; Misaki, Azuma and Yamamura，1987)、ペプチド糖脂質およびリン脂質(Brennan，1984), リポ多糖類(Hunter，Gaylord and Brennan，1986)、糖脂質(Brennan，1984; Mc Neil et al.，1989)、およびリポアラビノマンナン(Arya，1993; Sieling et al .，1995)に集中していた。脂質細胞壁成分はM．tuberculosis の毒性と関連していたが(Collins，1994) 、脂質性状を有するこれらの化合物、すなわちβ−ヒドロキシ脂肪酸は免疫源特性を持たないと考えられていた。ミコール酸は、M．tuberculosis の感染に対する人体の（複数の）免疫学的応答の複雑な工程において重要な役割を果たしているという可能性は、つい最近になって明らかになった。ミコール酸−ＢＳＡ複合体に対する体液応答は、最初に１９９４年に観察された（南アフリカ国特許出願第９５／３０７７号明細書、およびＰＣＴ特許出願第ＷＯ９５／２８６４２号明細書）。ほぼ同じ時期に、ミコール酸に対する測定可能な細胞性免疫応答が、Beckman et al．(1994)によって示された。著者らは、これらの化合物が、ヒトのダブル・ネガティブＴ細胞(double-negative T-cells )の微量サブセットの増殖を刺激することを見いだし、マクロファージおよび樹状細胞のような専門の抗原提供細胞上にあるＣＤ１分子による抗原提供の新たな方法を記載した(Beckman et al.，1994; Beckman et al.，1995; Rosat et al., 1995)。同様に、プレニル＝ピロホスフェートは、抗原提供細胞上のＣＤ１分子によって提供されることも見いだされた(Morita et al.，1995)。マイコバクテリアの脂質細胞壁成分マイコバクテリア細胞壁は、脂質含量が極めて高いことを特徴とする高度に分化した複雑な構造であり、これが細胞壁マスの約６０％を構成していると考えられている(Grange，1988)。その模式的表現を、Ｆｉｇ．１に示す。マイコバクテリアの細胞壁の主要な脂質であるミコール酸(Petit and Lederer , 1984）は、外側の透過性バリヤーの主要成分であると考えられ(Wheeler et al ., 1994)、この群の微生物の「抗酸性」に関与している(Grange，1988)。様々な型の遊離脂質と関連したミコール酸が多量に存在することにより、マイコバクテリア壁の完全性の基礎が構成されている(Besra et al.，1993)。ミコール酸は、天然では様々な型の混合物として存在する。それらは炭水化物とエステルを形成することが多く、例えばアラビノースと共に主要細胞壁パリセードを形成し、トレハロースと共にジミコーリルトレハロース、すなわちM．tub erculosisの毒性に関係しているいわゆるコードファクターを形成する。マイコバクテリア以外の細菌種、すなわちCorynebacterium およびNocardiaのミコール酸が報告されている(Goren，1972)。従って、３つの主要な種類のミコール酸、すなわち i) コリノミコール酸（Ｃ₂₈〜Ｃ₄₀アシル鎖長） ii) ノカルドミコール酸（Ｃ₄₀〜Ｃ₆₀アシル鎖長） iii) マイコバクテリア性ミコール酸（Ｃ₆₀〜Ｃ₉₀アシル鎖長）が識別されている(The Merck Index，1989)。ミコール酸は、α位に中程度の長さの脂肪族鎖を有する高分子量のβ−ヒドロキシ脂肪酸である。これらの化合物の一般式を、Ｆｉｇ．２に示す。総ての既知のミコール酸は、基本構造がＲ²ＣＨ（ＯＨ）ＣＨＲ¹ＣＯＯＨであり、Ｒ¹はＣ₂₀〜Ｃ₂₄の線状アルカンであり、Ｒ²は様々な数の炭素−炭素二重結合および／またはシクロプロパン環、メチル分岐またはＣ＝Ｏ、ＣＨ₃ＯＣＨ＝、ＣＯＯＨのような酸素官能基を含むことができる３０〜６０個の炭素原子の一層複雑な構造である(The Merck Index，1989)。極めて多種多様のミコール酸が存在するが、長さを除き、α分岐は如何なる群のミコール酸でも本質的に不変／一定である(Goren，1972)。ミコール酸は極めて限定された範囲の溶媒に可溶性であるため、その精製が複雑になり(Brennan and Nikaido，1995)、長たらしくかつ費用がかかるプロトコールとなる。Beckman et al．(1994)は、例えばM．tuberculosis からのミコール酸の精製を、パラ−ブロモフェナシルブロミドで誘導体形成、逆相ＨＰＬＣ分離、ミコール酸ピーククラスター画分の収集、再ケン化、および抽出の後にのみ達成した。脂質細胞壁成分、特にミコール酸が結核の免疫療法および免疫予防に、および／またはその副作用に果たす潜在的役割を予想し、これらの成分を多量に精製する新規で更に効果的な方法を、本発明において記載する。発明の概要本発明によれば、特異的な微生物細胞壁成分またはその誘導体または類似体と不純物との抽出混合物から、または細胞壁成分またはその類似体または誘導体と不純物との合成混合物から、細胞壁成分を分離し、精製する方法は、抽出した混合物または合成混合物を多相溶媒に溶解して、溶液を形成し、この溶液に液相−液相抽出を施す段階を含んでいる。特異的な細胞壁成分またはその誘導体または類似体は、脂質または糖であることができる。特異的な細胞壁成分またはその類似体または誘導体は、脂質であるのが好ましい。更に好ましくは、脂質は脂肪酸である。更に好ましくは、脂質はミコール酸である。更に好ましくは、細胞壁成分は成分の一群またはその類似体または誘導体であり、この群はミコール酸の混合物またはその誘導体または類似体である。微生物細胞壁成分は、細菌、真菌または酵母から誘導することができる。微生物細胞壁成分は、マイコバクテリア、コリネバクテリア、ノカルディア、ロドコッカス、アミコラータ、および他の好適な細菌種から選択することができる細菌から誘導されるのが好ましい。細菌がマイコバクテリアから選択されるときには、これはM．tuberculosis 、 M．aviumおよびM．vaccae の菌株から選択することができる。多相溶媒系は、クロロホルム、メタノールおよび水を含んでなるのが好ましい。多相溶媒系は二相溶媒系であるのが更に好ましい。二相溶媒系は、液体上相と液体下相都を含んでなるのが好ましい。この方法は、溶媒系の上相および下相を混合し、平衡にする段階も含むのが好ましい。上相の組成は１２〜１８％のクロロホルム、４５〜５５％のメタノール、および２５〜４０％の水であるのが好ましい。上相の組成は１５％のクロロホルム、５２％のメタノールおよび３３％の水であるのが更に好ましい。下相の組成は、５０〜８０％のクロロホルム、１５〜４０％のメタノール、および２〜８％の水であるのが好ましい。下相の組成は、６８％のクロロホルム、２７％のメタノール、および５％の水であるのが更に好ましい。液相−液相抽出は、向流抽出または相の一方の多重抽出であることができる。精製した細胞壁成分、またはその類似体または誘導体にアセトン抽出を施して、不純物を除去することができる。細胞壁成分、またはその類似体または誘導体は、化学的誘導体形成を行って、微生物成長、微生物成長培地または合成混合物から生じる可能性のあるあらゆる不純物からそれを分離する必要がないことが好ましい。精製した細胞壁成分またはその誘導体または類似体をケン化して、そのメチルエステル化を逆転することができる。図面の簡単な説明本発明を、添付の図面（グラフ）に関して単なる実施例として更に詳細に説明する。第１ａ図は、粗製のM．tuberculosis 抽出物のＨＰＬＣであり、第１ｂ図は、粗製の試薬抽出物のＨＰＬＣであり、第１ｃ図は、粗製の培地抽出物のＨＰＬＣであり、第２ａ図は、粗製のM．tuberculosis 抽出物のアセトン抽出した上清のＨＰＬＣであり、第２ｂ図は、粗製の試薬抽出物のアセトン抽出した上清のＨＰＬＣであり、第２ｃ図は、粗製の培地抽出物のアセトン抽出した上清のＨＰＬＣであり、第３ａ図は、アセトン抽出した粗製のM．tuberculosis 抽出物のＨＰＬＣであり、第３ｂ図は、アセトン抽出した粗製の試薬抽出物のＨＰＬＣであり、第３ｃ図は、アセトン抽出した粗製の培地抽出物のＨＰＬＣであり、第４ａ図は、アセトン抽出した粗製の抽出物からのM．tuberculosis の向流精製したミコール酸のＨＰＬＣであり、第４ｂ図は、アセトン抽出した粗製の抽出物からの向流精製した試薬のＨＰＬＣであり、第４ｃ図は、アセトン抽出した粗製の抽出物からの向流精製した培地のＨＰＬＣであり、第５ａ図は、アセトンで抽出しないM．tuberculosis の粗製抽出物からの向流精製したミコール酸のＨＰＬＣであり、第５ｂ図は、アセトンで抽出しない粗製の試薬抽出物からの向流精製した試薬のＨＰＬＣであり、第５ｃ図は、アセトンで抽出しない粗製の培地抽出物からの向流精製した培地のＨＰＬＣであり、第６ａ図は、向流精製の後にアセトンで抽出したM．tuberculosis からのミコール酸のアセトン上清のＨＰＬＣであり、第６ｂ図は、向流精製の後にアセトンで抽出した試薬のアセトン上清のＨＰＬＣであり、第６ｃ図は、向流精製の後にアセトンで抽出した培地のアセトン上清のＨＰＬＣであり、第７ａ図は、向流精製の後にアセトンで抽出したM．tuberculosis からの精製したミコール酸のＨＰＬＣであり、第７ｂ図は、向流精製の後にアセトンで抽出した精製試薬のＨＰＬＣであり、第７ｃ図は、向流精製の後にアセトンで抽出した精製培地のＨＰＬＣであり、第８ａ図は、再ケン化したM．vaccae からの粗製抽出物のＨＰＬＣであり、第８ｂ図は、向流精製の後にアセトンで洗浄したM．vaccae からのミコール酸のＨＰＬＣである。細菌の細胞壁成分の粗製抽出物について行った各種の精製手続き、およびＨＰＬＣを行った各種の段階の模式的表現を、下記のＦｉｇ．３に示す。好ましい態様の説明発明の目的本発明の目的は、下記１〜８に用いられる微生物の脂質細胞壁成分およびその誘導体および類似体、特に各種の微生物菌株由来のミコール酸を単離して、精製することである。１．ヒトおよび獣医用のワクチンなどの抗結核および他の抗微生物性の免疫予防製剤の開発。このような製剤は、他の微生物細胞成分を同時に含むまたは含まないミコール酸を基剤とすることができ、インターロイキンなどの各種の型のアジュバントを用いる必要がありまたは必要がない。このような製剤の開発は、ミコール酸または他の細胞壁の脂質成分に免疫源性を与えるのに必要な任意の操作（例えば、免疫源性複合体、サブユニットワクチンの製造）を含む。２．痰、脳脊髄液、血液、尿、糞便などのような試料中にマイコバクテリア細胞の存在を確かめるための診断試験の開発および生産。３．研究または他の目的（例えば、標準としての使用または診断試験の開発のため）での個々の精製した細胞壁成分の生産および商業化。４．自己免疫副作用などのマイコバクテリアおよび他の期限の疾患の免疫療法。５．多剤耐性マイコバクテリア感染症の免疫療法。６．免疫または感染工程に対する体液性または細胞性免疫系の反応（体液性または細胞性免疫系の刺激の程度）を測定するための試験（イン・ビボまたはイン・ビトロ）の開発。７．細胞壁合成の阻害を目的とした新規な抗結核薬の開発。８．腫瘍性障害の免疫抑制。高純度のミコール酸は、ワクチンのような免疫予防製剤、免疫療法、および／または検出法の開発に重要であり、更に具体的には、 i) 複合体の調製が起こる溶媒系の決定、 ii) 実験動物の免疫に要する複合体の調製、 iii) キャリヤー分子に対するミコール酸のカップリング、すなわち抱合工程の監視のための、の効率の決定、 iv) 免疫の工程の監視およびＥＬＩＳＡ型イムノアッセイの開発に要する他の複合体の調製、 v) 産生された抗体およびその特性決定のための特異性の評価、 vi) 細菌の細胞壁合成の阻害を目的とした新規な抗結核薬の開発にとって重要である。本発明は、細胞壁成分またはその誘導体または類似体であって関連細胞の培養物から抽出されることがあり、または合成されることがある様々な種類の化合物の同時精製および分離のための二相溶媒系を用いる方法を提供する。本発明の好ましい態様では、微生物起源の脂質細胞壁成分は、不純物から分離することができ、また不純物から群として分離することができる。精製した脂質細胞壁成分、例えばミコール酸、並びにマイコバクテリア、コリネバクテリア、ノカルディアおよびロドコッカスのような微生物の細菌細胞壁由来の他の脂質細胞壁成分は、この方法によって一群として分離することができる。この方法は、総てのマイコバクテリア、コリネバクテリア、ノカルディアおよびロドコッカス菌株に適用できるが、実施例では２種のマイコバクテリア菌株に関して実験の詳細を示す。本質的には、本発明の方法は、独特な二相溶媒系に溶解した微生物の細胞壁成分の粗製抽出物を向流液／液分離に付し、特定の細胞壁成分を大規模に精製することを含んでいる。ミコール酸の場合には、この方法では、精製したミコール酸を粗製の細胞抽出物の乾燥重量の約３〜１２％生じる。この方法は、細菌、例えばマイコバクテリアの細胞の成育物を収集した後、ケン化して、脂質細胞壁成分を抽出することを含んでいる。ケン化段階は、細胞骨格の残りのものから脂質成分を放出しまたは任意のそのエステル型から遊離の脂肪酸塩を放出するのに必要であり、抽出段階は、細胞壁成分／試薬混合物からケン化剤を除去するのに必要である。大規模抽出工程から得られる粗製の細胞抽出物を、二相溶媒系の下相に溶解し、二相溶媒系の上相の量を加える。次いで、溶液を、約２５サイクルのシリーズにより向流分配に付し、各サイクルは上相および下相の混合、両相の分離および分離した相の清浄な上相および下相への移しかえを含んでいる。精製した脂質細胞壁成分のメチルエステル化は、これがメタノール含有溶媒中に長時間止まるときに起こる。これは、ケン化、すなわち室温で試薬Ａを加え、方法に記載されているように再抽出することによって容易に逆転する。細胞壁からの脂肪酸の各種の群は、上相または下相でのそれらの乳化パターンによって各種の試験管中で同定することができる。例えば、ミコール酸画分は、最初の数本の試験管内の主として下相におけるその乳化パターンによって容易に認めた。次に、向流分離した材料を試験管から抜き取る。ミコール酸画分は、向流分配によって精製した後でも、幾らかの不純物を含むことが判った。一定量のアセトンを精製した試料に加え、これによりこれらの不純物が抽出されることが判った。（アセトンを粗製抽出物に加えると、細菌の培地の成分に由来することがある不純物の総てではないが幾らかが抽出されることが判った。）精製したミコール酸をＨＰＬＣ分析に付し、それらの純度、輪郭および収率を決定した。本発明の方法を、M．tuberculosis 、M．aviumおよびM．vaccae 由来のミコール酸の精製に適用し、マイコバクテリアのこれらの菌株の総てに対して有効であることが判った。従って、本発明の方法を用いると、ミコール酸または他の特定の脂質細胞壁成分を比較的多量に初めて分離し、それらを上記の用とのいずれか一つなどに続いて用いるためそれらを精製することが可能であった。実施例材料培養物 Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294 感染したヒトの肺から初めて単離した有毒な菌株を、実験に用いた。 Mycobacterium vaccae ATCC 15483 牛乳から最初に単離された菌株。培養物は、American Type Culture Collection(ATCC)、メリーランド、米国から凍結乾燥した形態で購入した。培地 M．tuberculosis およびM．vaccae の培養には、下記の培地を用いた。液体培地： Dubos ブロス個体培地： Loevwnstein-Jensen（LJ）培地 Middlebrook 7H-10 培地培地は、ガイド・フォー・ザ・レベルIII ラボラトリー(a Guide for the Lev el III Laboratory)、Public Health U.S．Department of Health and Human Se rvice 、アトランタにおいてKent and Kubica(1985)によって推奨されている方法で調製した。試薬抽出したミコール酸の精製では、下記の試薬を用いた。クロロホルム（Saarchem、分析級）メタノール（Merck 、化学的に純粋）アセトン（BDH 、分析級）。ミコール酸の抽出、誘導体形成、および高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析に用いた試薬の調製には、ＨＰＬＣ級メタノールおよび２回蒸留した脱イオン水を用いた。試薬Ａ：メタノール−水（１：１）に溶解した２５％水酸化カリウム（分析級）：水酸化カリウム６２．５ｇを水１２５ｍｌに溶解し、メタノール１２５ｍｌ（BDH 、ＨＰＬＣ級）を加えた。試薬Ｂ：濃塩酸（BDH 、分析級）を水で１：１に希釈したもの。試薬Ｃ：メタノール−水（１：１）に溶解した２％重炭酸カリウム（BDH 、分析級）：重炭酸カリウム１０ｇを水２５０ｍｌに溶解し、メタノール２５０ｍｌを加えた。試薬Ｄ：パラ−ブロモフェナシルブロミド／クラウンエーテル（Pi erce Chemical Co.,カタログ番号48891 ）を、テフロンコーティングした隔膜を有する小さな琥珀色のねじキャップ付きバイアル瓶に５００μｌずつの量を採取した。キャップを占めて、バイアル瓶をパラフィルムで包装した。試薬Ｄを４℃に保存した。試薬Ｅ：試薬Ｅは、試薬Ｂをメタノールと１：１で混合することによって調製した。ＨＰＬＣ標準： Ribi ImmunoChem Research Company、カタログ番号R-50からの高分子量内部標準（Ｃ−１００）。この標準１ｍｇを塩化メチレン２．０ｍｌに懸濁し、３５０ μｌの分量をテフロンコーティングした隔膜を有する小さな琥珀色のねじキャップ付きバイアル瓶に３５０μｌずつ採取した。バイアル瓶をパラフィルムで包装して、４℃で保存した。クロロホルム(Associated Chemical Enterprises，Chemically Pure Grade) 塩化メチレン（BDH 、ＨＰＬＣ級）試薬Ａ，Ｂ，ＣおよびＥは、必要とされるすべての安全を考慮して、実験前に新しいものを調製した。向流分配装置 H O POST，Instrument Company Inc．、ミドル・ビレッジ、ニューヨーク製の向流分配装置を、研究に使用した。プレトリア大学の生化学部で利用できる装置の写真を、Ｆｉｇ．４に示す。このモデルの「列」は、２×２５０本の相互に結合した試験管からなっていた。任意の他の化学的に設計した向流分配の装置を用いることができることは勿論である。赤外スペクトル装置向流によって精製したミコール酸の赤外スペクトル分析は、BOMEM Michelson 100FTIR 装置およびHewlett Packard プロッターを用いて行った。方法実験操作では、下記の方法を用いた。細菌菌株の培養細菌は、 Dubos ブロス、 Loewenstein-Jensen培地（斜面）、および Middelbrook 7H-10 寒天培地（斜面）を用いて、３７℃で培養した。培地の接種、およびマイコバクテリア培養物の処理は、ガイド・フォー・ザ・レベルIII ラボラトリー(a Guide for the Level III Laboratory)、Public Hea lth U.S．Department of Health and Human Service 、アトランタにおいてKent and Kubica(1985)によって推奨されている手続きに従って行った。細菌試料からの脂質細胞壁成分の調製細菌試料の調製は、マイコバクテリア細胞の収集、ケン化、および脂肪酸の抽出の３段階を含んでいた。収集は、斜面培地の表面から細菌成長物を掻き取ることによって行った。成長物は、液体培養物から遠心分離によっても収集した。均質な細菌懸濁液を、試薬Ａでは、収集した細胞を殺菌したガラスビーズと共に振盪または攪拌することによって調製し、約１×１０⁷ｃｆｕ^*／ｍｌの最終濃度とした。^* ｃｆｕ＝コロニー形成単位試薬Ａでのマイコバクテリアのケン化は、１２１℃のオートクレーブで１時間行った。脂肪酸のケン化、抽出および誘導体形成は、Butler，Jost and Kilburn（1991 ）によって記載された方法で行った。脂質細胞壁成分の抽出試料を冷却し、試薬Ｂ１．５ｍｌを各試料に加えた。攪拌後、それぞれ試料のｐＨをチェックして、必要ならば試薬ＢでｐＨ１に調整した。次いで、クロロホルム２．０ｍｌを各試料に加え、３０秒間攪拌した。層を分離させた。下層をパスツールピペットで取り出して、WISPバイアル瓶に移し、窒素気流中で加熱ブロック−蒸発装置中で８５℃で蒸発乾固した。除去されないで残った微量の酸を中和するため、試薬Ｃ１００μｌを各試料に加え、流動物を窒素気流中で加熱ブロック−蒸発装置中で８５℃で蒸発乾固した。試料は、ＨＰＬＣによって使用されまたは分析されるまで４℃でアセトン中に暗所保存した。ＨＰＬＣ分析のための脂肪酸の誘導体形成抽出して、精製した脂肪酸（ミコール酸）を、下記のようにして誘導体形成した。試料からアセトンを窒素気流中で加熱ブロック−蒸発装置中で８５℃で蒸発させることによって除去した。それぞれの冷却した試料に、試薬Ａ２．０ｍｌを加えた。試料を３０秒間攪拌し、試薬Ｂ（１．５ｍｌ）を加え、試料を再度混合し、必要ならばｐＨ１．０までｐＨ調整した。次いで、クロロホルム（２．０ｍｌ）を加えた後、試薬Ｃ１００μｌを加えた。キャップした試料を３０秒間攪拌し、加熱ブロック−蒸発装置上で８５℃で５分間加熱し、窒素気流を導入することによって乾燥した。誘導体形成は、クロロホルム１．０ｍｌおよび試薬Ｄ１００〜１５０μｌを加え、試料を３０秒間攪拌し、試料を入れたバイアル瓶を密封し、これを８５℃ の加熱ブロック−蒸発装置上に２０分間置いた。試料を冷却した後、試薬Ｅ（１．０ｍｌ）を加えた。試料を再度３０秒間攪拌し、層を分離させた。下層をパスツールピペットで取り出して、WISP−バイアル瓶に移した。バイアル瓶を加熱ブロック−蒸発装置上に置き、その内容物を窒素の気流を用いて８５℃で蒸発乾固した。残渣を塩化メチレン０．２１２ｇ（１６０μｌに相当する）に再懸濁し、キャップをして、攪拌した。それぞれの再構成した試料で、これに５μｌのＨＰＬＣ内部標準を加えたものを０．４５μｍメンブランフィルターで濾過して琥珀色の WISP−バイアル瓶に入れた。再度キャップしたバイアル瓶を、ＨＰＬＣ分析の準備ができるまで４℃で保存した。ミコール酸のＨＰＬＣ分析および定量ＨＰＬＣ分析のため、各試料２５μｌ（処理中氷上に保持）を分析した。対照試料、すなわち濾過した塩化メチレン２５μｌを、各組の試料を分析する前に流した。多数の試料を分析するときには、ＨＰＬＣ装置の信頼性を実証するため、対照試料を３または４個の試験試料の後毎に流した。逆相ＨＰＬＣ分析は、システム・コントローラー（Waters 600E）検出器(Waters 486 Tunalde) オートサンプラー(Waters 712 WISP) データーモジュール(Microsep M 741) Column Waters（Nova-Pak C18 60 A，４μｍ，３．９×１５０ｍｍ）、およびスチールカートリッジカラム用の末端コネクターセットガードカラム（Guard-Pak/Nova-Pak C18）からなるWaters System High Performance Liquid Chromatography装置（ミルフォート、マサチューセッツ）を用いて行った。分析条件は、下記の通りであった。移動相：：溶媒Ａ：ＨＰＬＣ級メタノール溶媒Ｂ：ＨＰＬＣ級塩化メチレン流速：２．５ｍｌ／分カラム温度：３０℃ 検出器は、２６０ｎｍに設定した。ＨＰＬＣグラディエントは、最初は９８％（容量／容量）メタノール（溶媒Ａ）および２％（容量／容量）塩化メチレン（溶媒Ｂ）であった。グラディエントを１分で８０％Ａおよび２０％Ｂまで、１０分で３５％Ａおよび６５％Ｂまで直線的に増加し、５秒間保持した後、１０秒間かけて９８％Ａおよび２％Ｂまで減少させた。この比率を６分間保持し、系を安定化させた後、次の試料を注入した。ミコール酸の数学的定量は、試験試料の合わせたピーク面積を高分子量ＨＰＬＣ標準の導入した量のピーク面積と皮革することによって行った。ミコール酸の精製および他の脂肪酸の群分離番号が０〜２４の２５本の試験管を含んでなる向流分配例を実験に用いた。緩衝液溜めに、上相約９００ｍｌを導入した。試験管番号０には、大規模抽出実験から得たM．tuberculosis の粗製細胞抽出物の試料（３０〜１５０ｍｇ）を下相１０ｍｌおよび上相１０ｍｌに溶解したものを導入した。残りの２４本の試験管には、下相１０ｍｌの分量を導入した。サイクル当たり１０ｍｌの容量の上相を、試験管番号０に自動的に分配し、繰り返し２５サイクルでは約１６時間の操作となった。従って２５向流サイクルを行い、それぞれのサイクルは２０回の混合振り子(pendula)と４０分の相分離時間からなっていた。工程を、Ｆｉｇ．５に図式的に示す。それぞれの転移では、試料由来であって上相にある任意の溶質は、次の試験管に運ばれる。２５回の転移の完了後、分離した溶質画分は、２５本の試験管の列に沿って分配する。２５本の試験管での脂肪酸の分布を確かめるため、上相および下相での乳化パターンを試験管列内で観察し、画分をこれに応じて決定した。次に、向流分離した材料を、テフロンチューブを取り付けた５０ｍｌガラスシリンジを用いて試験管から抜き取った。材料を７個の画分にプールし、それぞれ７０℃のBuchi 蒸発装置で真空乾燥し、乾燥した材料をクロロホルム、メタノールまたは水（約５ｍｌ）に再溶解し、琥珀色のWISP−バイアル瓶に移して、必要なときまで４℃で保存した。アセトン抽出向流により精製した材料に含まれている総ての残留不純物を除去するため、アセトンを用いて追加の抽出を下記のようにして行った。 WISPバイアル瓶に入れた精製したミコール酸（約５．０ｍｇ）の試料に、アセトンの分量（３．０ｍｌ）を加え、試料を攪拌混合した。沈降の後、アセトンを吸引によって除去し、この工程を２回繰り返した。最終的に精製した抽出試料を、アセトン中に保存した。向流分離によって精製したミコール酸の収率精製／分離のおおよその収率を計算するため、向流分離／精製の後に得られた試料に含まれるミコール酸の秤量した量を、ミコール酸ピーククラスターの相対ピーク面積から計算した向流装置に導入された粗製細胞抽出物に含まれるこれらの化合物の量、および粗製細胞抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムにおける標準のピーク面積から計算した量と比較した。あるいは、精製したミコール酸のＨＰＬＣクロマトグラムのミコール酸ピーククラスターからのピーク面積を、粗製抽出物から得たものと比較して、生成物の収率および純度を評価した。精製したミコール酸の赤外スペクトル分析赤外スペクトル分析は、M．tuberculosis から抽出した向流精製した試料（１ｍｇ）を用いて行った。ミコール酸を１ｍｌのＨＰＬＣ級クロロホルムに溶解し、液体バイアル瓶に注射した。対照として、ＨＰＬＣ級クロロホルムを用いた。次に、対照の吸収を、試料の輪郭から差し引いた。結果 M．tuberculosis からのミコール酸の精製ミコール酸の単離についてButler，Jost and Kilburn（1991）によって提案された方法に従ってM．tuberculosis H37Rv（ATCC27294）から抽出した材料（３７．５ｍｌ）は、２５サイクルの向流抽出の後には１０％未満のミコール酸を含むことが判った（Ｆｉｇ．６）。ミコール酸は、ＨＰＬＣによって画分１および２だけにあると同定され、これは合わせて、向流装置に負荷された粗製抽出物の乾燥マスの９．３％となった。ミコール酸は分配係数が０．０８に過ぎず、分配係数が約１．２６のケン化した短鎖脂肪酸から完全に分離した（Ｆｉｇ．６）。ミコール酸画分は、最初の数本の試験管に向流試験管列の乳化パターンによって容易に認められ、続く３本の試験管は、有意な量の材料を含んでいなかった。ケン化した短鎖脂肪酸は下相のエマルジョンを含む４本の試験管で同定することができ、直後の８本の試験管は上相のエマルジョンを含み、分離中に解離した（上相エマルジョン）とプロトン化した（下相エマルジョン）脂肪酸との間の平衡を示していた。残りの画分６および７は、ミコール酸を含む可能性も除外する特性であるクロロホルムに可溶性でないためＨＰＬＣによって分析することができなかった。 M．tuberculosis 由来の粗製抽出物のＨＰＬＣ輪郭／クロマトグラム、使用した試薬、および細菌の培地を、それぞれ第１ａ、１ｂ、および１ｃ図に示す。向流分配によって精製したミコール酸は、幾らかの不純物を未だ含んでおり、これは４〜６分の範囲の保持時間でＨＰＬＣで検出することができた（第５ａ図）。これらの不純物を試料から抽出するためのアセトンの用い方を示す模式図を、Ｆｉｇ．３に示す。この模式図は、ＨＰＬＣ輪郭の直接比較し、相対的収率を計算するためのM．tuberculosis 由来の粗製抽出物の単一の大バッチについての系統的研究を表している。不純物ピークは、抽出および精製手続き（第５ｂ図）で用いた試薬からは生じず、細菌の培地の成分に由来する可能性があった（第５ｃ図）。向流精製の前にアセトンによる抽出を粗製抽出物について行ったところ、細菌試料（第２ａ図）および成長培地試料（第２ｃ図）から幾らかの程度の不純物の抽出は見られたが、最終的な向流荷よって精製された生成物から総ての不純物を除去するには不十分であった（第４ａ図）。乾燥した向流によって精製したミコール酸をアセトンで抽出したところ、不純物はアセトンに可溶性であると思われた（第６ａおよび６ｃ図）。アセトン洗浄したミコール酸のＨＰＬＣ分析は、この画分が、誘導体形成試薬によるものおよび精製試薬（第７ｂ図）および成長培地（第７ｃ図）からの対照抽出物で見られたものを除き、不純物を全く含まないことを示していた（第７ａ図）。これらの結果に基づいて、Butler，Jost and Kilburn（1991）の方法に従って得られ、上記の向流分離の後アセトン抽出によって精製したマイコバクテリアの粗製抽出物は、ＨＰＬＣによって検出可能な不純物を含まないミコール酸を精製すると主張される（第７ａ図）。ミコール酸の純度は、向流精製した材料のマスをＨＰＬＣクロマトグラムの吸収ピークの面積に基づいたミコール酸の計算収率と比較することによっても評価された。アセトン洗浄の前の向流精製したミコール酸（第５ａ図；０．３ｍｇ）を、上記の方法で誘導体形成した後にＨＰＬＣによって分析した。内部標準（５．０１μｇ）の吸収ピークの面積をミコール酸の面積と比較したところ、ミコール酸の０．２７ｍｇの収率が計算され、秤量した材料の９０％であった。幾らかの材料が誘導体形成および抽出工程中にバイアル瓶の間の相の転移によって失われ、幾らかの不純物はアセトン抽出によって除去されることを考慮すれば、第７ａのＨＰＬＣ輪郭によって表されるミコール酸画分の純度はほぼ１００％と見なされる。向流精製では、ミコール酸をメチルエステル誘導体として生成した。これは、アセトン抽出の前の向流精製したミコール酸の赤外スペクトル（Ｆｉｇ．７）から、および精製後の試薬Ａでの再ケン化を省略するときのＨＰＬＣ分析（結果は明細書に記載していない）によって明らかである。試薬Ａを加えると遊離酸が再生し、パラブロモフェナシルブロミドで誘導体形成することが必要である。M ．vaccae からのミコール酸の精製 M．vaccae の成長物を、M．tuberculosis と同じ方法で抽出して、精製した。粗製抽出物のＨＰＬＣ分析（第８ａ図）は、５分より長い保持時間を有する３本のピークのクラスターと保持時間が２分より短い幅広い試薬／短鎖脂肪酸ピーククラスターを示した。向流精製およびアセトン洗浄の後、ピークの２個のクラスターはＨＰＬＣカラム上に５分より長い保持時間で残った（第８ｂ図）。更に、試薬／短鎖脂肪酸ピーククラスターはかなり狭く、検出可能な不純物の痕跡も見られなかった。質量に基づけば、ミコール酸は約５％の収率まで精製されたが、粗製および精製したミコール酸抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムのミコール酸ピーククラスターの面積を比較することによって、４．３％の収率が計算された。同様な結果が、M．avium（ATCC 25291）から抽出した向流精製したミコール酸で得られた。これらの結果は、収率が幾分低い他は、M．tuberculosis からのミコール酸の精製について見られた結果と同様であり、従って、マイコバクテリアの種においてミコール酸の向流精製法を一層広く応用できることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｃ 59/42 Ｃ０７Ｃ 59/42 Ｃ１１Ｂ 1/10 Ｃ１１Ｂ 1/10 Ｃ１１Ｃ 1/04 Ｃ１１Ｃ 1/04 1/08 1/08 //(Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｇ０１Ｎ 33/48 ＰＣ１２Ｒ 1:32）Ｇ０１Ｎ 33/48 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．特異的な微生物細胞壁成分またはその誘導体または類似体と不純物との抽出混合物から、または細胞壁成分またはその類似体または誘導体と不純物との合成混合物から、細胞壁成分を分離し、精製する方法であって、抽出した混合物または合成混合物を多相溶媒に溶解して、溶液を形成し、この溶液に液相−液相抽出を施す段階を含んでなる、方法。２．特異的な細胞壁成分またはその誘導体または類似体が、免疫制御特性を有する化合物である、請求の範囲第１項に記載の方法。３．特異的な細胞壁成分またはその誘導体または類似体が、脂質または糖である、請求の範囲第１項または２項に記載の方法。４．特異的な細胞壁成分が脂質である、請求の範囲第３項に記載の方法。５．脂質が脂肪酸である、請求の範囲第４項に記載の方法。６．脂肪酸がミコール酸である、請求の範囲第５項に記載の方法。７．ミコール酸と不純物との抽出または合成混合物由来の群としてミコール酸の混合物を分離して、精製する、請求の範囲第６項に記載の方法。８．微生物の細胞壁成分が、細菌、真菌または酵母由来である、請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に記載の方法。９．微生物細胞壁成分が細胞由来である、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．微生物が、マイコバクテリア、コリネバクテリア、ノカルディア、ロドコッカスおよびアミコラタから選択される、請求の範囲第９項に記載の方法。１１．細菌がM．tuberculosis 、M．aviumおよびM．vaccae から選択される、請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．多相溶媒系が、クロロホルム、メタノールおよび水を含んでなる、請求の範囲第１〜１１項のいずれか一項に記載の方法。１３．多相溶媒系が二相溶媒系である、請求の範囲第１２項に記載の方法。１４．二相溶媒系が、上相の液相と下相の液相を含んでなる、請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．溶媒系の上相および下相を混合して、平衡にする段階をも含んでなる、請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．上相の組成が、クロロホルム１２〜１８％、メタノール４５〜５５％および水２５〜４０％である、請求の範囲第１５項に記載の方法。１７．上相の組成が、クロロホルム１５％、メタノール５２％および水３３％である、請求の範囲第１６項に記載の方法。１８．下相の組成が、クロロホルム５０〜８０％、メタノール１５〜４０％および水２〜８％である、請求の範囲第１４〜１７項のいずれか一項に記載の方法。１９．下相の組成が、クロロホルム６８％、メタノール２７％および水５％である、請求の範囲第１８項に記載の方法。２０．液相−液相抽出が、向流抽出または相の一つの多重抽出である、請求の範囲第１〜１９項のいずれか一項に記載の方法。２１．精製した細胞壁成分またはその類似体または誘導体をアセトン抽出に付し、不純物を除去する段階をも含んでなる、請求の範囲第１〜２０項のいずれか一項に記載の方法。２２．細胞壁成分またはその類似体または誘導体が、それを不純物から分離するのに化学的誘導体形成を必要としない、請求の範囲第１〜２１項のいずれか一項に記載の方法。２３．精製し、分離した細胞壁成分、またはその誘導体または類似体をケン化する段階をも含んでなる、請求の範囲第１〜２２項のいずれか一項に記載の方法。２４．実施例に関して実質的に本明細書に記載されている、請求の範囲第１項に記載の方法。