JPH11346770A - 糖鎖分岐組成改変体インターフェロンγ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 動物細胞で生産されるヒトインターフェロン
γの糖鎖の分岐鎖数を増加させる方法を提供すること。 【解決手段】 Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ
ェラーゼ−ＩＶ遺伝子をヒトインターフェロンγを産生
する動物宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞を培
地で培養し、培地中に分泌される分岐鎖数の増大した糖
鎖分岐組成改変体ヒトインターフェロンγを分離回収す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糖転移酵素、Ｎ−
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＶ（Ｇ
ｎＴ−ＩＶ）の遺伝子を導入することにより、当該糖転
移酵素活性を強化したヒトインターフェロンγ（ヒトＩ
ＦＮ−γ）産生動物細胞、当該細胞より得られる糖鎖分
岐組成が改変されたヒトインターフェロンγならびにそ
れらの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】１９８０年代よりの分子生物学の進展に
より、遺伝子工学を応用して各種の有用組換え蛋白質が
生産されているが、近年になっては蛋白質に付加する糖
鎖の生理的役割が解明されてくるにおよび、ますます蛋
白質に付加する糖鎖の重要性が認識されるに至ってい
る。組換え蛋白質を生産するにあたり、初期に用いられ
ていたような大腸菌などの原核生物を宿主とした場合、
蛋白質に糖鎖が付加することはなく、また、酵母や昆虫
細胞などの、ヒトと遠縁の真核生物を宿主とした場合、
蛋白質に付加する糖鎖が動物細胞のものとは大きく異な
ることが知られている。そのため、ヒト由来の血中酵素
類、サイトカイン類など、少量で高付加価値のある組換
え蛋白質の生産では、宿主として動物細胞が多く利用さ
れるに至っている。

【０００３】動物細胞内での蛋白質への糖鎖付加及び糖
鎖自体の修飾は、細胞内の小胞体、ゴルジ装置に局在す
る数多くの糖転移酵素が介在する複雑な機構を通して行
われており、現在、動物細胞由来の各種糖転移酵素の精
製と遺伝子クローニング、クローン化された遺伝子の大
腸菌や動物細胞での発現、糖鎖合成に関する変異株の作
出、などの研究が盛んになってきている。

【０００４】これまで報告されている例としては、ウシ
β１−４ガラクトース転移酵素が糖転移酵素として初め
てクローニングされ（Narimatsu, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 83, 4720 (1986); D'Agostaro, et a
l., Eur. J. Biochem., 183,211 (1989)）、これを動物
細胞で発現させた例（Masibay, A. S., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5733 (1989)）、また、ウ
シα１−３ガラクトース転移酵素のクローニング（Jozi
asse, D. H., et al., J. Biol. Chem., 264,14290 (19
89)）、齧歯類由来同酵素の発現クローニング（Larsen,
R. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 822
7 (1989), Smith, D. F., et al., J.Biol. Chem, 265,
6225 (1990)）の例など多くの例を挙げることが出来
る。また、Ｎ−アセチルグルコサミン残基を転移する酵
素、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−
Ｖ（ＧｎＴ−Ｖ）の遺伝子に関しては、１９９３年にジ
ョージア大学のマイケル ピアスらによりラットから
（Shoreibah et al.，J. Biol. Chem.，268，15381 (19
93)，特表平6-510914号公報）、1994年に大阪大学医学
部の谷口らによりヒトから（Saito et al.，Biochem．B
iophys．Res. Commun., 198，318 (1994)、特開平6-197
756号公報）、そのcDNAがそれぞれクローニングされて
おり、同じ遺伝子を用いた糖鎖分岐の例が、エリスロポ
エチン（特開平9-84582号公報）で示されている。

【０００５】動物細胞で生産される蛋白質の糖鎖につい
て、既にエリスロポエチンでは、分岐度の高い特定の糖
鎖型が高い薬効を示す（Takeuchi,M., et al., Glycobi
ology, 1, 337 (1991)）ことが知られており、また、糖
鎖に制御あるいは改変を加えることは、個々の蛋白質分
子に付加した糖鎖の型をすべて同一とすることにより組
換え蛋白質としての均一性を向上させたり、糖鎖の分岐
構造を増やすことにより血中クリアランス時間の延長が
期待できるなど、産業上高い有用性があるのは明らかで
ある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、動物
細胞で生産可能な組換えヒトインターフェロンγの糖鎖
分岐組成の改変によってその薬理特性を向上させること
にある。本発明の他の目的は、糖鎖分岐組成か改変され
た薬理特性が向上している組換えヒトインターフェロン
γ及びその製造方法、並びにこの組換えヒトインターフ
ェロンγを生産する組換え動物細胞を提供することにあ
る。本発明の他の目的は、この組換えヒトインターフェ
ロンγから得られる糖鎖化合物を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、糖転移酵素である
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＶ
の遺伝子をヒトインターフェロンγを産生する動物細胞
に導入することにより、糖鎖分岐組成が、天然型とは異
なり、薬理特性が改善された糖鎖分岐組成改変体ヒトイ
ンターフェロンγが得られることを見い出し、本発明を
完成した。

【０００８】本発明の糖鎖分岐組成改変体ヒトインター
フェロンγの製造方法は、Ｎ−アセチルグルコサミニル
トランスフェラーゼ−ＩＶ遺伝子をヒトインターフェロ
ンγを産生する動物宿主細胞に導入して形質転換細胞を
得る工程と、該形質転換細胞を培地で培養して糖鎖分岐
組成改変体ヒトインターフェロンγを生産させる工程
と、生産された糖鎖分岐組成改変体ヒトインターフェロ
ンγを前記培地から回収する工程とを有することを特徴
とする。この方法によって、天然型とは異なる糖鎖分岐
組成のヒトインターフェロンγを得ることができる。ま
た、この糖鎖分岐組成改変体ヒトインターフェロンγか
ら糖鎖化合物を分離することができる。

【０００９】本発明の糖鎖分岐組成改変体ヒトインター
フェロンγ生産動物細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニ
ルトランスフェラーゼ−ＩＶ遺伝子を有し、ヒトインタ
ーフェロンγを産生することを特徴とする。

【００１０】本発明の医薬製剤は、上記の方法により得
られる糖鎖分岐組成改変体ヒトインターフェロンγを有
効成分として含有することを特徴とする。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明における糖鎖分岐組成の改
変とは、具体的には、糖鎖の分岐数を増大させること
で、分岐数の大きい糖鎖の含有割合を増加させることを
いう。このように分岐数の多い糖鎖構造の含有割合が増
大した糖蛋白は、生体内での活性の増大、血液中でのク
リアランス時間の延長という点において優れている（Ta
keuchi et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 781
9‐7822 (1989)）。本発明における糖鎖分岐組成改変体
における糖鎖分岐組成としては、例えば、３本鎖型が３
０〜７０％、好ましくは４０〜７０％、より好ましくは
５０〜６４％である組成を挙げることができる。

【００１２】本発明において、糖転移酵素であるＮ−ア
セチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＶ（以
下、ＧｎＴ−ＩＶと略す）は、２本鎖構造または３本鎖
構造のＮ−結合糖鎖に、Ｎ−アセチルグルコサミニル基
を触媒的に転移することにより、３本鎖構造または４本
鎖構造の糖鎖を生じせしめる（図１）。このＧｎＴ−Ｉ
Ｖの遺伝子は哺乳動物、例えばウシ由来のものが使用で
きる。また、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェ
ラーゼ−Ｖ（以下、ＧｎＴ−Ｖと略す）の遺伝子は哺乳
動物、例えばヒト由来のものが使用できる。

【００１３】ＧｎＴ−ＩＶまたは−Ｖ遺伝子を動物細胞
に導入し、発現させるためのベクターとしては、動物細
胞で目的遺伝子を発現する事が出来るものならいかなる
ものでも利用できるが、例えば、動物ウイルスを利用し
たものとして、ＳＶ４０、ＢＰＶ（ウシパピローマウイ
ルス）、アデノウイルス、レトロウイルス系が挙げられ
る。動物ウイルスは、一般的に、宿主細胞で働くプロモ
ーター、ＲＮＡスプライシングシグナルとポリＡ付加シ
グナル、さらにプロモーターの活性を増大させるエンハ
ンサーなど遺伝子発現に必要なシグナルに加えて自己複
製能を有するため、このような動物ウイルスを利用した
ベクターを用いることにより、目的遺伝子を細胞内で増
殖させ、その発現量を増加させることができる。

【００１４】目的遺伝子を発現させるための制御部位で
ある、プロモーターやエンハンサーとしては、動物細胞
内で機能するもので目的とする効果が得られるものを使
用することができ、例えば、ＬＴＲ（レトロウイルスの
long terminal repeat）、ＳＶ４０、ＣＭＶ（サイトメ
ガロウイルス）、ＭＴ（メタ口チオネイン）、アクチン
などのプロモーターや、ＬＴＲ、ＳＶ４０、ＣＭＶなど
のエンハンサー配列が挙げられる。また、ヒトインター
フェロンγをより効率的かつ大量に生産する上では、遺
伝子が導入された目的の細胞を選択するための選択マー
カーの利用や、目的遺伝子を増幅して使用するのが好ま
しい。マーカーとしては、例えば、Ｅｃｏｇｐｔ遺伝
子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺
伝子、等が挙げられ、またマーカー及び増幅機能を有す
るものとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦ
Ｒ）遺伝子を挙げることが出来る。また、これらは、単
独で使用することも出来るし、同時に使用しても差し支
えない。

【００１５】本発明において使用し得る動物細胞用発現
ベクターとしては、具体的にはニワトリβ−アクチン遺
伝子プロモーターの一部の塩基配列をウサギβ−グロビ
ン由来の遺伝子に置き換えることにより外来遺伝子の高
発現を可能にするベクターであるｐＣＸＮ系の発現ベク
ター、その中でも特にｐＣＸＮ２（Niwa, H., Yamamur
a, K. and Miyazaki, J., Gene, 108, 193 (1991)、特
開平03-168087号公報）が挙げられるが、その他、動物
細胞用発現ベクターであれば特に限定されない。

【００１６】本発明において、ＧｎＴ−ＩＶまたは−Ｖ
遺伝子を導入するヒトインターフェロンγを産生する動
物細胞宿主としては、ヒトインターフェロンγを産生す
る能力を有し、糖蛋白質性の有用物質の生産に利用され
ている細胞、あるいは利用可能性のある細胞であればよ
く、具体的には、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター
卵巣細胞）、サルＶｅｒｏ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨ
Ｋ、φ２（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＣ１２７細胞、サル
ＣＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞、マウスミエロ―マ等にヒト
インターフェロンγ産生機能を付与したものが挙げられ
る。

【００１７】動物細胞への遺伝子導入の方法としては、
最も一般的なリン酸カルシウム法のほか、エレクトロポ
レーション法、マイクロインジェクション法、プロトプ
ラスト融合法、リポソーム融合法、赤血球ゴースト融合
法、等が用いられる。

【００１８】糖転移酵素、ＧｎＴ−ＩＶ及び−Ｖの活性
測定は、西河らの方法（Nishikawaet al., Biochim. Bi
ophys. Acta., 1035，313 (1990)）を応用して行うこと
が出来る。即ち、２−アミノピリジンにより還元末端を
蛍光ラベルしたアシアロ・アガラクト２本鎖糖鎖、及び
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを緩衝液中にて細胞
抽出液と反応させた後、反応生成物を高速液体クロマト
グラフィーにより同定・定量することにより行うことが
できる。これらの糖転移酵素遺伝子の導入後の細胞株の
選抜は、これらの糖転移酵素の活性の上昇を指標として
行うことができる。

【００１９】本発明の方法により得られた細胞又は細胞
株の培養は各種公知の方法を用いて行うことができ、細
胞株の増殖および糖蛋白質の生産を阻害しないものであ
れば特に制限はない。例えばタンクでの浮遊培養、細胞
をスチレン製のマイクロビーズ表面あるいはローラーボ
トル内壁等に付着させた接着培養、フラスコを用いた静
置培養等を細胞株に応じて適宜選択することができる。
培養時間は、バッチ法で培養する場合には十分に細胞が
増殖して糖蛋白質が十分に生産されるまで行えばよく、
通常１週間〜６カ月程度である。培養に際して培地の一
部を無菌的に交換しながら連続的に培養を行なう場合
は、培養時間は１週間〜６カ月程度である。また培養に
際しては、糖蛋白質を生産する細胞株を播種した後、適
当な温度、通気状態、培地のｐＨを保ちながら該細胞株
を培養する。

【００２０】本発明の方法により得られた細胞株の培養
に使用できる培地としては、基本培地に血清等の添加物
を添加したものを用いることができる。基本培地として
は市販されている細胞培養用の培地を用いることがで
き、例えばイーグル最小必須培地、ＲＰＭＩ-１６４０
培地、ハムＦ１２培地、ダルベッコ変法イーグル培地、
ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（GIBCO、BRL）、Ｏｐｔｉ
−ＭＥＭ培地（GIBCO、BRL）等を、単独或いは適宜混合
して使用すればよい。また、細胞株の培養を細胞数の増
加と糖蛋白質の生産との二段階に区別して行い、異なる
２種類の培地を用いることもできる。この場合、増殖培
地としては例えば上記基本培地に１〜３０％濃度のウシ
胎児血清（ＦＣＳ）を添加した栄養培地を、生産培地と
してはウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含まない上記基本培地
を使用できる。

【００２１】上述のようにして得られた培養物からの糖
蛋白質の回収は通常の方法により可能である。細胞外に
分泌生産されるヒトインターフェロンγは、適時培養液
を交換する方法により回収した培養液から、例えばイオ
ン交換、生物学的親和性、吸着或いは疎水度、親水度、
分子サイズ、限外濾過等を利用した各種公知の精製方法
で分離、精製することができる。

【００２２】培養液中のヒトインターフェロンγ蛋白質
の定量は、免疫的な定量法を利用することができ、ま
た、回収・純化されたヒトインターフェロンγ蛋白質の
定量についは吸光度による定量法も利用することが出来
る。

【００２３】さらに、上記により得た、ヒトインターフ
ェロンγから糖鎖化合物の遊離には、ヒドラジンの使用
等の化学的な方法を使用しても良いし、エンドグリコシ
ダーゼあるいは、グリコペプチダーゼ等の酵素を利用す
ることもできる。遊離した糖鎖は、各種のカラムクロマ
トグラフィーを用いて純化単離する事が出来る。

【００２４】また、本発明の糖鎖分岐組成が改変された
ヒトインターフェロンγは医薬品として有効であり、こ
れは一般的な医療製剤の形態で用いられる。そのような
本発明のヒトインターフェロンγを有効成分として含有
する医薬製剤は、通常使用される充填剤、増量剤、結合
剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤等の担体、希
釈剤或いは賦形剤を用いて調製される。本発明の医薬製
剤として各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その
代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、
乳剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤（液剤、懸濁製剤）
が挙げられる。

【００２５】本発明の医薬製剤には更に必要に応じて着
色剤、保存剤、風味剤、甘味料や他の医薬品を含有する
ことが出来る。

【００２６】本発明の医薬製剤中に含有されるべき有効
成分化合物の量は特に限定されず、広範囲から適宜選択
される。

【００２７】本発明の医薬製剤の投与方法及び投与量は
特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、そ
の他の条件により適宜選択すればよい。

【００２８】

【実施例】以下、実施例等を挙げて本発明を更に詳細に
説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何等限定
するものではない。

【００２９】参考例 （ＨＩＩＦＤ株の糖鎖構造の解析） （１）ＨＩＩＦＤ株の培養・培地取得 細胞株として、ヒトインターフェロンγ（以後、ヒトＩ
ＦＮ−γと省略）生産ＣＨＯ細胞、ＨＩＩＦＤ株（ＡＴ
ＴＣより購入、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８２００）（元株、
ＩＭ４と略記することがある）を用いた。

【００３０】４×１０⁶個のＨＩＩＦＤ細胞をＴ１７５
フラスコ３５ｍｌに播き、２０％の透析済ウシ胎児血清
（ｄＦＣＳ）、２５０ｎＭ ＭＴＸ（methotrexate）を
含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（GIBCO BRL）を使用
し３日間培養後、トリプシン処理により細胞を遊離させ
て遠心回収し、全細胞をＴ５００トリプルフラスコ／２
００ｍｌに同じ培地で継代した。４日後、培地を除去
し、ＰＢＳ（−）３０ｍｌで洗浄した後、Ｌ−グルタミ
ンを加えたヒトＩＦＮ−γ生産用無血清ＣＤ−ＣＨＯ培
地（GIBCO BRL）２００ｍｌに交換した。２４時間ごと
に培地を回収し、新鮮な培地に交換した。回収した ５
００ｍｌの培地は、遠心後、０．２２μｍフィルター濾
過後−２０℃に凍結保存した。

【００３１】（２）ヒトＩＦＮ−γの精製単離 上記により得たヒトＩＦＮ−γ生産培地上清５００ｍｌ
を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過後、抗ヒトＩＦ
Ｎ−γ抗体結合カラムを用いたアフィニティークロマト
グラフィーでヒトＩＦＮ−γを精製した。抗体結合カラ
ムは、抗ヒトＩＦＮ−γポリクローナル抗体（ウサギ）
（林原生物化学研究所）を担体 HiTrapNHS-activated S
epharose HP （アマシャムファルマシアバイオテク）に
固定化して作製した。抗体約６ｍｇを固定化したカラム
（体積５ｍｌ）を２本作製し、連結して使用した。具体
的な精製操作は次の通りである。

【００３２】まず、孔径０．２２μｍのフィルターでろ
過した培養液上清５００ｍｌをカラムに通液し、ヒトＩ
ＦＮ−γを吸着させた後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌの６０ｍｌで洗
浄し、続いて洗浄液Ａ（日本ガイシ製）５０ｍｌで洗浄
した。その後、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌバッファー
（ｐＨ ２．５）を通液してヒトＩＦＮ−γを溶離させ
た。カラムからの溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を
測定し、タンパクを検出した。

【００３３】溶離したヒトＩＦＮ−γ画分には、１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）を少量加えて中和し
た後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）で
透析後、凍結乾燥を行って精製ヒトＩＦＮ−γ標品とし
た。得られたＩＦＮ−γ蛋白質をＳＤＳ電気泳動上で分
子量、純度を確認した結果、大部分が糖鎖の付加された
ものとして検出され、分子量24,000及び20,000を示し
た。糖鎖の付加しない分子量 17,000 のものはわずかで
あった。

【００３４】（３）ヒトＩＦＮ−γ結合糖鎖の構造同定 ヒトＩＦＮ−γより糖鎖の単離と蛍光ラベル付加 ヒトＩＦＮ−γには糖鎖結合部位が二箇所存在する。２
本の糖鎖を一括して切り出し、混合物として精製した。 ａ．糖ペプチドの分離 凍結乾燥したヒトＩＦＮ−γ ０．５ ｍｇを６Ｍ Ｕｒ
ｅａ ２００μｌに溶解して６０℃で１時間加温した
後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、
１ｍＭ ＣａＣｌ₂を１ｍｌ加え、Modified Trypsin（P
romega社製）を酵素／ヒトＩＦＮ−γ（質量／質量）＝
１／５０ 量添加し、３７℃で一晩、酵素消化を行っ
た。その後１００℃で１０分間加熱して反応を停止さ
せ、０．４５ミクロンのフィルターでろ過した後、Seph
adex G-25（アマシャム ファルマシアバイオテク）に
よるゲルろ過を行い、糖ペプチド画分を回収した。バッ
ファーには１０ｍＭ ＮＨ₄ＨＣＯ₃を用いた。糖ペプチ
ドの検出にはオルシノール硫酸法を使用した。糖ペプチ
ド画分は凍結乾燥して次操作に用いた。 ｂ．糖鎖の切り出しと精製 約１０〜１００ｎｍｏｌ量の糖ペプチド゛を１００ｍＭ
クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ ５．０）１ｍｌに溶
解し、アーモンド由来のグリコペプチダーゼＡ（生化学
工業）０．４ｍＵを加えて３７℃で一晩反応させた。こ
の反応液からの糖鎖の精製はSep-Pak C18 カートリッジ
（Waters製）を用いて行った。反応液を、Sep-Pak C18
カートリッジに供し、糖鎖を０．１％ ＴＦＡ／５％
アセトニトリル溶液で溶出させた。これを凍結乾燥して
精製糖鎖標品とした。 ｃ．糖鎖の蛍光標識（ピリジルアミノ化） 約１０〜１００ｎｍｏｌの糖鎖に対して４０μｌの２-
アミノピリジン溶液（２７６ｍｇの２−アミノピリジン
を１００μｌの酢酸に溶かしたもの）を加え、９０℃、
６０分間加熱した。次に、１４０μｌのBorane-dimethy
lamine complex溶液（１５０ｍｇのBorane-dimethylami
ne complexに酢酸６０μｌとＨ₂Ｏ ３８μｌを加えたも
の）を加えて、８０℃で３５分間加熱した。

【００３５】次に、１０ｍＭ ＮＨ₄ＨＣＯ₃を緩衝液と
してSephadex G-15（アマシャム ファルマシアバイオ
テク）によるゲルろ過を行い、標識糖鎖を精製した。精
製した標識糖鎖を以後の分析に使用した。

【００３６】ＰＡ化糖鎖の構造同定 ＰＡ化糖鎖をArthrobacter ureafaciens由来のシアリダ
ーゼ（ナカライテスク社製）を用いて消化し、アシアロ
（シアル酸を脱離した）画分を陰イオン交換カラムMono
Q HR5/5（内径５ｍｍ×長さ５０ｍｍ、ファルマシア社
製）を用いたＨＰＬＣで分取した。シアル酸を除去した
糖鎖（アシアロ糖鎖）はＨＰＬＣを用いて、逆相カラム
（Shim-pack CLC-ODS、内径６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、島
津製作所製）およびアミド吸着カラム（TSKgel Amide-8
0、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、東ソー製）で分離
を行い、これらのパターンからそれぞれのヒトＩＦＮ−
γ糖鎖の構造推定及び定量を行った。各成分の糖鎖構造
は、ＰＡ化グルコースオリゴマー（重合度：３〜２２ま
たは３〜１５、宝酒造製）の溶出位置に対する相対的グ
ルコース重合度を求めてグルコース単位として表し、高
橋及び富谷らの２次元糖鎖マップ（高橋禮子、糖蛋白質
糖鎖研究法 生化学実験法23、学会出版センター１９８
９年、及び高橋禮子他、蛋白質核酸酵素増刊、共立出
版、37、p.2117、1992年）により構造を推定した。図２
に逆相ＨＰＬＣのクロマトグラム結果を示す。また、そ
れぞれの構造を確認するため、各成分の糖鎖を各種のグ
リコシダーゼ（ウシ腎臓由来のα−Ｌ−フコシダーゼ
（Boehringer Mannheim社製）、ナタマメ由来のβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダ
ーゼ（生化学工業株式会社製）、または、Escherichia
Freundii由来エンド−β−ガラクトシダーゼ（生化学工
業株式会社製）を用いて消化後、消化産物の挙動を同様
に２次元糖鎖マップ上で解析した。試料糖鎖構造と同一
の標準ＰＡ化糖鎖が市販されているものについては、両
者をＨＰＬＣで共打ちすることにより、単一ピ−クにな
ることを確認した。ＨＩＩＦＤ株の産生するヒトＩＦＮ
−γの糖鎖構造をＨＰＬＣによって同定・定量した結果
を表１に示す。その結果、ＨＩＩＦＤ株の産生するヒト
ＩＦＮ−γの２箇所に結合する糖鎖の構造は、表１の通
り大部分が二本鎖構造であることがわかった。

【００３７】表１は細胞株、ＨＩＩＦＤ株、ＧｎＴ−Ｉ
Ｖ高発現株（ＩＭ４／ＩＶ４）、ＧｎＴ−Ｖ高発現株
（ＩＭ４／Ｖ２６）、ＧｎＴ−ＩＶ及び−Ｖ高発現株
（ＩＭ４／Ｖ２６／ＩＶ５）株のそれぞれが生産するヒ
トＩＦＮ−γに付加する糖鎖について、構造の解析、定
量結果を、糖鎖の骨格構造でまとめたものである。各分
類の中には、骨格構造の先（非還元末端側）に、ガラク
トースあるいはＮ−アセチルラクトサミンの繰り返し構
造を持つもの、さらにその先にシアル酸が付加されたも
のなどが含まれる。

【００３８】実施例１ （ＧｎＴ−ＩＶ高発現ヒトＩＦＮ−γ産生ＣＨＯ株の産
生するヒトＩＦＮ−γの糖鎖構造） （１）ＧｎＴ−ＩＶ発現ベクターｐＣＸＮ２−ｂＧｎＴ
−ＩＶの作製 一般的なＤＮＡ操作法は文献（Sambrook, J., et.al.,
Molecular Cloning ALaboratory Manual. Second Editi
on, Cold Spring Harbor Laboratory Press.(1989)）に
従って行った。ＧｎＴ−ＩＶ遺伝子（ウシ由来）は配列
表の配列番号：１に示す配列を使用した。ベクタ−には
pCXN2（Niwa, H., Yamamura, K. andMiyazaki, J., Gen
e, 108, 193 (1991)）を使用した。ＧｎＴ−ＩＶ発現ベ
クタ−、ｐＣＸＮ２−ｂＧｎＴ−ＩＶは図３に示す方法
で作製した。

【００３９】（２）ＧｎＴ−ＩＶ高発現株の取得 ＨＩＩＦＤ株へのＧｎＴ−ＩＶ発現ベクターｐＣＸ
Ｎ２−ｂＧｎＴ−ＩＶの導入 ＨＩＩＦＤ株の培養は、２０％ｄＦＣＳ、２５０ｎＭＭ
ＴＸ、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（GIBCO、BRL）で培
養した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（GIBCO、BRL）０．４ｍ
ｌに４×１０⁶個のＨＩＩＦＤ細胞を懸濁し、エレクト
ロポレーション法を用いてＧｎＴ−ＩＶ発現ベクターｐ
ＣＸＮ２−ｂＧｎＴ−ＩＶを導入した。１０分静置後、
処理した細胞２×１０⁵個〜６×１０³個を１０ｍｌの２
０％ｄＦＣＳ、２５０ｎＭ ＭＴＸ、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦ
ＭＩＩ培地に加え１０ｃｍシャーレに播種して、ＣＯ₂
インキュベーター中で静置培養した。２日後、ネオマイ
シンを、３００μｇ／ｍｌとなるように添加し、培養を
継続した。約2週間後、出現してきたコロニーを、クロ
ーニングリングを用いてトリプシン処理し、２４ｗｅｌ
ｌプレートに拡大培養した。

【００４０】 Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−
ＩＶ（ＧｎＴ−ＩＶ）およびＮ−アセチルグルコサミン
転移酵素−Ｖ（ＧｎＴ−Ｖ）活性測定 ２．５×１０⁵個の細胞をサンプルチューブに遠心回収
し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。５μｌの細胞懸濁保
存液（１％Triton Ｘ−１００を含む酵素反応緩衝液）
に懸濁、−８０℃にて保存した。これを、氷上で融解
後、バス型超音波破砕装置（Bioruptor UC100-D2、OLYMP
US）により、氷水中破砕した。細胞破砕液を酵素源と
し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを基質、ＰＡ化アガラクトシ
ルバイアンテナ型糖鎖を受容体糖鎖として、酵素反応を
行わせ、未反応受容体糖鎖の残存率の経時的推移により
その酵素活性を評価した。すなわち、５μｌの細胞破砕
液の入ったサンプルチューブ中に、あらかじめ３７℃に
加温した２０μl量の活性測定用反応液を添加すること
により反応を開始し、３７℃条件下、酵素反応を行っ
た。反応液中より経時的に５μlを５０μlの反応停止液
（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ)中にサンプ
リングし、３分間の煮沸により反応を停止した。この一
部をShim-pack CLC-ODS（Shimadzu）を用いてＨＰＬＣ
分析し、経時的な受容体糖鎖の残存率を定量した。時間
軸−受容体糖鎖残存率の対数値（ｌｏｇ）の示す傾き
（基質濃度が低い場合の反応速度定数に相当）を各細胞
ごとの相対活性値とした。

【００４１】２５μｌ中ＧｎＴ−ＩＶ反応液組成は、２
５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３）、８０ｍＭ ＵＤＰ−
ＧｌｃＮＡｃ、１５ｍＭ ＭｎＣｌ₂ 、４００ｍＭ Ｎ
−アセチルグルコサミン、１％Triton Ｘ−１００、４
μM ＰＡ化アガラクトシルバイアンテナ型糖鎖、ＧｎＴ
−Ｖ反応液組成は、２５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．２
５）、８０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、２００ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、４００ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン、１％T
riton Ｘ−１００、４μM ＰＡ化アガラクトシルバイア
ンテナ型糖鎖で行った。

【００４２】ＧｎＴ−ＩＶ高発現株のスクリ−ニング 上記でクローニングした細胞をＴ１５０フラスコにま
で拡大培養し、各細胞をトリプシン処理によって遊離さ
せ、トリパンブルー染色にて生細胞数を計測後、上記
の方法に従い細胞内のＧｎＴ−ＩＶおよびＧｎＴ−Ｖの
活性量測定、および、各細胞のヒトＩＦＮ−γ生産量評
価を行った。その結果、ＧｎＴ−ＩＶの酵素活性が元株
のＨＩＩＦＤ株に比較して約８０倍を示した株、ＩＭ４
／ＩＶ４を得た。

【００４３】（３） 培養・培地取得 上記で得た細胞株、ＩＭ４／ＩＶ４を用い、培養液
に、ネオマイシン３００μｇ／ｍｌを含むことを除き、
参考例の細胞増殖培養、及び上記のヒトＩＦＮ−γ
生産培養と同一の方法で株ＩＭ４／ＩＶ４を培養し、５
００ｍｌの培養液を取得した。

【００４４】（４） ヒトＩＦＮ−γの精製単離 上記（３）で得た培養液５００ｍｌを用い、参考例と同
一の方法でヒトＩＦＮ−γ、０．５ ｍｇを単離して得
た。単離したＩＦＮ−γは不純物を含まず、大部分が糖
鎖の付加したものであった。

【００４５】（５） ヒトＩＦＮ−γ結合糖鎖の構造同
定 上記（４）で得たヒトＩＦＮ−γ蛋白質０．５ｍｇにつ
いて参考例と同一の方法で糖鎖構造の同定を行った、逆
相ＨＰＬＣの結果を図２に、同定して得た構造の結果を
表１に表す。この表からわかるように、ＧｎＴ−ＩＶ遺
伝子を導入することにより、本来２分岐構造（バイアン
テナ構造）であった糖鎖を効率的に三分岐糖鎖に変換す
ることが出来た。

【００４６】実施例２ （ＧｎＴ−Ｖ高発現ヒトＩＦＮ−γ産生ＣＨＯ株の作
製） （１） ＧｎＴ−Ｖ発現ベクターｐＣＸＨ−ｈＧｎＴ−
Ｖの作製 一般的なＤＮＡ操作法は文献（Sambrook, J. et.al., M
olecular Cloning A Laboratory Manual.Second Editio
n, Cold Spring Harbor Laboratory Press., (1989)）
に従って行った。ＧｎＴ−Ｖ遺伝子（ヒト由来）は配列
表の配列番号：２に示す配列を使用した。ベクタ−には
ｐＣＸＮ２（Niwa, H., Yamamura, K. and Miyazaki,
J., Gene, 108, 193 (1991)）を使用した。ＧｎＴ−Ｖ
発現ベクタ−、ｐＣＸＨ−ｈＧｎＴ−Ｖは図４及び図５
に示す方法で作成した。

【００４７】（２）ＧｎＴ−Ｖ高発現株の取得 上記（１）で得た形質転換細胞を用い、選択培地に、２
００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加する以外実施
例１の（２）と同一の方法でＧｎＴ−Ｖ高発現株を選抜
し、元のＨＩＩＦＤ株に対し、約１５０倍のＧｎＴ−Ｖ
活性を示す株、ＩＭ４／Ｖ２６を得た。

【００４８】実施例３ （ＧｎＴ−ＩＶ及びＧｎＴ−Ｖ高発現ヒトＩＦＮ−γ産
生ＣＨＯ株の産生するヒトＩＦＮ−γの糖鎖構造） （１） ＧｎＴ−ＩＶ−ＧｎＴ−Ｖ高発現株の取得 上記実施例２の（２）で得た細胞株ＩＭ４／Ｖ２６を用
い、これに、実施例１で作製したＧｎＴ−ＩＶの発現ベ
クターを実施例１と同一の方法で導入した。更に得られ
た細胞を、培養液にハイグロマイシン２００μｇ／ｍ
ｌ、ネオマイシン３００μｇ／ｍｌを含有する選択培地
を用いることを除き、実施例１と同一の方法で培養選抜
した。その結果、ＧｎＴ−ＩＶ活性を元株のＨＩＩＦＤ
株に比べて約７０倍、ＧｎＴ−Ｖ活性を元株のＨＩＩＦ
Ｄに比べて約１２０倍発現する株、ＩＭ４／Ｖ２６／Ｉ
Ｖ５を取得した。

【００４９】（２） ＧｎＴ−ＩＶ−ＧｎＴ−Ｖ高発現
株ＩＭ４／Ｖ２６／ＩＶ５の培養・培地取得 上記（１）で得た細胞株、ＩＭ４／Ｖ２６／ＩＶ５を用
い、培養液にハイグロマイシン２００μｇ／ｍｌ、ネオ
マイシン３００μｇ／ｍｌを含有することを除き、参考
例の細胞増殖培養及び上記のヒトＩＦＮ−γ生産培
養と同一の方法で培養及び培養液の取得を行い、５００
ｍｌのヒトＩＦＮ−γを含有する培地を得た。

【００５０】（３）ヒトＩＦＮ−γの精製単離 上記（２）で得た培養液５００ｍｌを用い、参考例と同
一の方法で培地中よりヒトＩＦＮ−γを精製し、ヒトＩ
ＦＮ−γ、０．５ ｍｇを単離した。

【００５１】（４）ヒトＩＦＮ−γ結合糖鎖の構造同定 上記（３）で得たヒトＩＦＮ−γ ０．５ ｍｇを用い
参考例と同一の方法を用いてヒトＩＦＮ−γの糖鎖構造
を同定した。結果得た、逆相ＨＰＬＣのクロマトグラム
を図２に、同定された構造の結果を表１にまとめる。こ
の表からわかるように、ＧｎＴ−ＩＶ遺伝子を導入する
ことにより、ＧｎＴ−Ｖのみが高発現した細胞では、３
分岐構造（トリアンテナ構造）であった糖鎖を効率的に
四分岐糖鎖に変換することが出来た。

【００５２】

【表１】 なお、表１中の糖鎖骨格構造は以下のとおりである。

【００５３】

【化１】

【００５４】

【発明の効果】本発明によれば、糖転移酵素（Ｎ―アセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＶ）遺伝子
を動物細胞に導入することにより該酵素活性を高レベル
に維持するヒトインターフェロンγを産生する動物細胞
が得られ、また該細胞を培養することにより、治療上ま
たは産業上有用である糖鎖分岐組成改変体ヒトインター
フェロンγを得ることできる。

【００５５】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１６０８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列： ATG AGG CTC CGA AAT GGA ACT GTA GCC ACT GTT TTA GCA TTT ATC ACC 48 Met Arg Leu Arg Asn Gly Thr Val Ala Thr Val Leu Ala Phe Ile Thr 5 10 15 TCG TTC CTC ACT TTA TCT TGG TAT ACA ACA TGG CAA AAT GGG AAA GAA 96 Ser Phe Leu Thr Leu Ser Trp Tyr Thr Thr Trp Gln Asn Gly Lys Glu 20 25 30 AAA GTG ATT GCT TAT CAA CGA GAA TTT CTT GCT CTG AAA GAA CGT CTC 144 Lys Val Ile Ala Tyr Gln Arg Glu Phe Leu Ala Leu Lys Glu Arg Leu 35 40 45 CGA ATA GCT GAA CAT CGA ATC TCT CAG CGC TCT TCT GAG CTC AGT GCC 192 Arg Ile Ala Glu His Arg Ile Ser Gln Arg Ser Ser Glu Leu Ser Ala 50 55 60 ATT GTA CAG CAA TTC AAG CGT GTA GAA GCA GAA ACA AAC AGG AGT AAG 240 Ile Val Gln Gln Phe Lys Arg Val Glu Ala Glu Thr Asn Arg Ser Lys 65 70 75 80 GAT CCA GTG AAT AAA TTT TCA GAT GAT ACC CTA AAG ATA CTA AAG GAG 288 Asp Pro Val Asn Lys Phe Ser Asp Asp Thr Leu Lys Ile Leu Lys Glu 85 90 95 TTA ACA AGC AAA AAG TCT CTT CAA GTG CCA AGT ATT TAT TAT CAT TTG 336 Leu Thr Ser Lys Lys Ser Leu Gln Val Pro Ser Ile Tyr Tyr His Leu 100 105 110 CCT CAT TTA TTG CAA AAT GAA GGA AGC CTT CAA CCT GCC GTG CAG ATC 384 Pro His Leu Leu Gln Asn Glu Gly Ser Leu Gln Pro Ala Val Gln Ile 115 120 125 GGA AAT GGA CGA ACA GGA GTT TCA ATA GTA ATG GGA ATT CCT ACA GTG 432 Gly Asn Gly Arg Thr Gly Val Ser Ile Val Met Gly Ile Pro Thr Val 130 135 140 AAG AGA GAA GTT AAA TCT TAC CTC ATA GAA ACT CTT CAT TCC CTT ATT 480 Lys Arg Glu Val Lys Ser Tyr Leu Ile Glu Thr Leu His Ser Leu Ile 145 150 155 160 GAT AAT CTG TAT CCT GAA GAG AAG TTG GAC TGT GTT ATA GTA GTC TTC 528 Asp Asn Leu Tyr Pro Glu Glu Lys Leu Asp Cys Val Ile Val Val Phe 165 170 175 ATA GGA GAG ACA GAT ACT GAT TAT GTA AAT GGT GTT GTA GCC AAC CTG 576 Ile Gly Glu Thr Asp Thr Asp Tyr Val Asn Gly Val Val Ala Asn Leu 180 185 190 GAG AAA GAA TTT TCT AAA GAA ATC AGT TCT GGC TTG GTG GAA ATA ATA 624 Glu Lys Glu Phe Ser Lys Glu Ile Ser Ser Gly Leu Val Glu Ile Ile 195 200 205 TCA CCT CCT GAA AGC TAT TAT CCT GAC CTG ACG AAC TTA AAG GAG ACA 672 Ser Pro Pro Glu Ser Tyr Tyr Pro Asp Leu Thr Asn Leu Lys Glu Thr 210 215 220 TTT GGA GAT TCT AAA GAA AGA GTA AGA TGG AGA ACA AAG CAA AAC CTA 720 Phe Gly Asp Ser Lys Glu Arg Val Arg Trp Arg Thr Lys Gln Asn Leu 225 230 235 240 GAT TAT TGT TTT CTA ATG ATG TAT GCT CAG GAA AAA GGC ACA TAC TAC 768 Asp Tyr Cys Phe Leu Met Met Tyr Ala Gln Glu Lys Gly Thr Tyr Tyr 245 250 255 ATC CAG CTT GAA GAT GAT ATT ATT GTC AAA CAG AAT TAC TTT AAC ACC 816 Ile Gln Leu Glu Asp Asp Ile Ile Val Lys Gln Asn Tyr Phe Asn Thr 260 265 270 ATA AAG AAT TTT GCA CTT CAA CTT TCT TCT GAG GAA TGG ATG ATA CTT 864 Ile Lys Asn Phe Ala Leu Gln Leu Ser Ser Glu Glu Trp Met Ile Leu 275 280 285 GAG TTC TCC CAG CTG GGA TTC ATT GGT AAA ATG TTT CAA GCA CCT GAC 912 Glu Phe Ser Gln Leu Gly Phe Ile Gly Lys Met Phe Gln Ala Pro Asp 290 295 300 CTC ACT CTG ATT GTG GAA TTC ATA TTT ATG TTC TAT AAG GAG AAG CCC 960 Leu Thr Leu Ile Val Glu Phe Ile Phe Met Phe Tyr Lys Glu Lys Pro 305 310 315 320 ATC GAC TGG CTC TTG GAC CAT ATT CTG TGG GTC AAA GTC TGC AAC CCG 1008 Ile Asp Trp Leu Leu Asp His Ile Leu Trp Val Lys Val Cys Asn Pro 325 330 335 GAA AAA GAT GCA AAA CAC TGT GAT CGA CAG AAG GCA AAT CTG CGA ATT 1056 Glu Lys Asp Ala Lys His Cys Asp Arg Gln Lys Ala Asn Leu Arg Ile 340 345 350 CGT TTC AGA CCG TCC CTT TTC CAA CAC GTT GGT CTG CAT TCT TCA CTC 1104 Arg Phe Arg Pro Ser Leu Phe Gln His Val Gly Leu His Ser Ser Leu 355 360 365 ACA GGA AAA ATT CAG AAA CTC ACG GAT AAA GAT TAC ATG AAA CCA TTA 1152 Thr Gly Lys Ile Gln Lys Leu Thr Asp Lys Asp Tyr Met Lys Pro Leu 370 375 380 CTG CTC AAA ATC CAT GTA AAC CCC CCT GCA GAG GTA TCT ACT TCT TTG 1200 Leu Leu Lys Ile His Val Asn Pro Pro Ala Glu Val Ser Thr Ser Leu 385 390 395 400 AAG GTC TAC CAA GGT CAT ACA CTG GAG AAA ACT TAC ATG GGT GAG GAC 1248 Lys Val Tyr Gln Gly His Thr Leu Glu Lys Thr Tyr Met Gly Glu Asp 405 410 415 TTC TTC TGG GCT ATA ACC CCA GTA GCT GGA GAC TAC ATC CTA TTT AAA 1296 Phe Phe Trp Ala Ile Thr Pro Val Ala Gly Asp Tyr Ile Leu Phe Lys 420 425 430 TTC GAC AAG CCA GTC AAT GTG GAA AGT TAT TTG TTC CAT AGT GGC AAC 1344 Phe Asp Lys Pro Val Asn Val Glu Ser Tyr Leu Phe His Ser Gly Asn 435 440 445 CAG GAT CAT CCA GGG GAT ATT CTG CTC AAC ACA ACG GTG GAA GTT CTG 1392 Gln Asp His Pro Gly Asp Ile Leu Leu Asn Thr Thr Val Glu Val Leu 450 455 460 CCT TTG AAG AGT GAA GGT TTG GAC ATC AGC AAA GAA ACC AAA GAC AAA 1440 Pro Leu Lys Ser Glu Gly Leu Asp Ile Ser Lys Glu Thr Lys Asp Lys 465 470 475 480 CGA TTA GAA GAT GGC TAT TTC AGA ATA GGG AAA TTT GAA AAC GGT GTT 1488 Arg Leu Glu Asp Gly Tyr Phe Arg Ile Gly Lys Phe Glu Asn Gly Val 485 490 495 GCG GAA GGG ATG GTG GAT CCC AGC CTA AAC CCC ATT TCG GCC TTC CGA 1536 Ala Glu Gly Met Val Asp Pro Ser Leu Asn Pro Ile Ser Ala Phe Arg 500 505 510 CTT TCA GTT ATT CAG AAT TCT GCT GTT TGG GCC ATT CTT AAT GAG ATC 1584 Leu Ser Val Ile Gln Asn Ser Ala Val Trp Ala Ile Leu Asn Glu Ile 515 520 525 CAT ATT AAA AAA GTC ACA AAC TGA 1608 His Ile Lys Lys Val Thr Asn *** 530 535 配列番号：２ 配列の長さ：２２２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列： ATG GCT CTC TTC ACT CCG TGG AAG TTG TCC TCT CAG AAG CTG GGC TTT 48 Met Ala Leu Phe Thr Pro Trp Lys Leu Ser Ser Gln Lys Leu Gly Phe 5 10 15 TTC CTG GTG ACT TTT GGC TTC ATT TGG GGT ATG ATG CTT CTG CAC TTT 96 Phe Leu Val Thr Phe Gly Phe Ile Trp Gly Met Met Leu Leu His Phe 20 25 30 ACC ATC CAG CAG CGA ACT CAG CCT GAA AGC AGC TCC ATG CTG CGC GAG 144 Thr Ile Gln Gln Arg Thr Gln Pro Glu Ser Ser Ser Met Leu Arg Glu 35 40 45 CAG ATC CTG GAC CTC AGC AAA AGG TAC ATC AAG GCA CTG GCA GAA GAA 192 Gln Ile Leu Asp Leu Ser Lys Arg Tyr Ile Lys Ala Leu Ala Glu Glu 50 55 60 AAC AGG AAT GTG GTG GAT GGG CCA TAC GCT GGA GTC ATG ACA GCT TAT 240 Asn Arg Asn Val Val Asp Gly Pro Tyr Ala Gly Val Met Thr Ala Tyr 65 70 75 80 GAT CTG AAG AAA ACC CTT GCT GTG TTA TTA GAT AAC ATT TTG CAG CGC 288 Asp Leu Lys Lys Thr Leu Ala Val Leu Leu Asp Asn Ile Leu Gln Arg 85 90 95 ATT GGC AAG TTG GAG TCG AAG GTG GAC AAT CTT GTT GTC AAT GGC ACC 336 Ile Gly Lys Leu Glu Ser Lys Val Asp Asn Leu Val Val Asn Gly Thr 100 105 110 GGA ACA AAC TCA ACC AAC TCC ACT ACA GCT GTT CCC AGC TTG GTT GCA 384 Gly Thr Asn Ser Thr Asn Ser Thr Thr Ala Val Pro Ser Leu Val Ala 115 120 125 CTT GAG AAA ATT AAT GTG GCA GAT ATC ATT AAC GGA GCT CAA GAA AAA 432 Leu Glu Lys Ile Asn Val Ala Asp Ile Ile Asn Gly Ala Gln Glu Lys 130 135 140 TGT GTA TTG CCT CCT ATG GAC GGC TAC CCT CAC TGT GAG GGA AAG ATC 480 Cys Val Leu Pro Pro Met Asp Gly Tyr Pro His Cys Glu Gly Lys Ile 145 150 155 160 AAG TGG ATG AAA GAC ATG TGG CGT TCA GAT CCC TGC TAC GCA GAC TAT 528 Lys Trp Met Lys Asp Met Trp Arg Ser Asp Pro Cys Tyr Ala Asp Tyr 165 170 175 GGA GTG GAT GGA TCC ACC TGC TCT TTT TTT ATT TAC CTC AGT GAG GTT 576 Gly Val Asp Gly Ser Thr Cys Ser Phe Phe Ile Tyr Leu Ser Glu Val 180 185 190 GAA AAT TGG TGT CCT CAT TTA CCT TGG AGA GCA AAA AAT CCC TAC GAA 624 Glu Asn Trp Cys Pro His Leu Pro Trp Arg Ala Lys Asn Pro Tyr Glu 195 200 205 GAA GCT GAT CAT AAT TCA TTG GCG GAA ATT CGT ACA GAT TTT AAT ATT 672 Glu Ala Asp His Asn Ser Leu Ala Glu Ile Arg Thr Asp Phe Asn Ile 210 215 220 CTC TAC AGT ATG ATG AAA AAG CAT GAA GAA TTC CGG TGG ATG AGA CTA 720 Leu Tyr Ser Met Met Lys Lys His Glu Glu Phe Arg Trp Met Arg Leu 225 230 235 240 CGG ATC CGG CGA ATG GCT GAC GCA TGG ATC CAA GCA ATC AAG TCC CTG 768 Arg Ile Arg Arg Met Ala Asp Ala Trp Ile Gln Ala Ile Lys Ser Leu 245 250 255 GCA GAA AAG CAG AAC CTT GAA AAG AGA AAG CGG AAG AAA GTC CTC GTT 816 Ala Glu Lys Gln Asn Leu Glu Lys Arg Lys Arg Lys Lys Val Leu Val 260 265 270 CAC CTG GGA CTC CTG ACC AAG GAA TCT GGA TTT AAG ATT GCA GAG ACA 864 His Leu Gly Leu Leu Thr Lys Glu Ser Gly Phe Lys Ile Ala Glu Thr 275 280 285 GCT TTC AGT GGT GGC CCT CTT GGT GAA TTA GTT CAA TGG AGT GAT TTA 912 Ala Phe Ser Gly Gly Pro Leu Gly Glu Leu Val Gln Trp Ser Asp Leu 290 295 300 ATT ACA TCT CTG TAC TTA CTG GGC CAT GAC ATT AGG ATT TCA GCT TCA 960 Ile Thr Ser Leu Tyr Leu Leu Gly His Asp Ile Arg Ile Ser Ala Ser 305 310 315 320 CTG GCT GAG CTC AAG GAA ATC ATG AAG AAG GTT GTA GGA AAC CGA TCT 1008 Leu Ala Glu Leu Lys Glu Ile Met Lys Lys Val Val Gly Asn Arg Ser 325 330 335 GGC TGC CCA ACT GTA GGA GAC AGA ATT GTT GAG CTC ATT TAC ATT GAT 1056 Gly Cys Pro Thr Val Gly Asp Arg Ile Val Glu Leu Ile Tyr Ile Asp 340 345 350 ATT GTA GGA CTT GCT CAA TTC AAG AAA ACT CTT GGA CCA TCC TGG GTT 1104 Ile Val Gly Leu Ala Gln Phe Lys Lys Thr Leu Gly Pro Ser Trp Val 355 360 365 CAT TAC CAG TGC ATG CTC CGA GTC CTT GAT TCA TTT GGT ACT GAA CCC 1152 His Tyr Gln Cys Met Leu Arg Val Leu Asp Ser Phe Gly Thr Glu Pro 370 375 380 GAA TTT AAT CAT GCA AAT TAT GCC CAA TCG AAA GGC CAC AAG ACC CCT 1200 Glu Phe Asn His Ala Asn Tyr Ala Gln Ser Lys Gly His Lys Thr Pro 385 390 395 400 TGG GGA AAA TGG AAT CTG AAC CCT CAG CAG TTT TAT ACC ATG TTC CCT 1248 Trp Gly Lys Trp Asn Leu Asn Pro Gln Gln Phe Tyr Thr Met Phe Pro 405 410 415 CAT ACC CCA GAC AAC AGC TTT CTG GGG TTT GTG GTT GAG CAG CAC CTG 1296 His Thr Pro Asp Asn Ser Phe Leu Gly Phe Val Val Glu Gln His Leu 420 425 430 AAC TCC AGT GAT ATC CAC CAC ATT AAT GAA ATC AAA AGG CAG AAC CAG 1344 Asn Ser Ser Asp Ile His His Ile Asn Glu Ile Lys Arg Gln Asn Gln 435 440 445 TCC CTT GTG TAT GGC AAA GTG GAT AGC TTC TGG AAG AAT AAG AAG ATC 1392 Ser Leu Val Tyr Gly Lys Val Asp Ser Phe Trp Lys Asn Lys Lys Ile 450 455 460 TAC TTG GAC ATT ATT CAC ACA TAC ATG GAA GTG CAT GCA ACT GTT TAT 1440 Tyr Leu Asp Ile Ile His Thr Tyr Met Glu Val His Ala Thr Val Tyr 465 470 475 480 GGC TCC AGC ACA AAG AAT ATT CCC AGT TAC GTG AAA AAC CAT GGT ATC 1488 Gly Ser Ser Thr Lys Asn Ile Pro Ser Tyr Val Lys Asn His Gly Ile 485 490 495 CTC AGT GGA CGG GAC CTG CAG TTC CTT CTT CGA GAA ACC AAG TTG TTT 1536 Leu Ser Gly Arg Asp Leu Gln Phe Leu Leu Arg Glu Thr Lys Leu Phe 500 505 510 GTT GGA CTT GGG TTC CCT TAC GAG GGC CCA GCT CCC CTG GAA GCT ATC 1584 Val Gly Leu Gly Phe Pro Tyr Glu Gly Pro Ala Pro Leu Glu Ala Ile 515 520 525 GCA AAT GGA TGT GCT TTT CTG AAT CCC AAG TTC AAC CCA CCC AAA AGC 1632 Ala Asn Gly Cys Ala Phe Leu Asn Pro Lys Phe Asn Pro Pro Lys Ser 530 535 540 AGC AAA AAC ACA GAC TTT TTC ATT GGC AAG CCA ACT CTG AGA GAG CTG 1680 Ser Lys Asn Thr Asp Phe Phe Ile Gly Lys Pro Thr Leu Arg Glu Leu 545 550 555 560 ACA TCC CAG CAT CCT TAC GCT GAA GTT TTC ATC GGG CGG CCA CAT GTG 1728 Thr Ser Gln His Pro Tyr Ala Glu Val Phe Ile Gly Arg Pro His Val 565 570 575 TGG ACT GTT GAC CTC AAC AAT CAG GAG GAA GTA GAG GAT GCA GTG AAA 1776 Trp Thr Val Asp Leu Asn Asn Gln Glu Glu Val Glu Asp Ala Val Lys 580 585 590 GCA ATT TTA AAT CAG AAG ATT GAG CCA TAC ATG CCA TAT GAA TTT ACG 1824 Ala Ile Leu Asn Gln Lys Ile Glu Pro Tyr Met Pro Tyr Glu Phe Thr 595 600 605 TGC GAG GGG ATG CTA CAG AGA ATC AAT GCT TTC ATT GAA AAA CAG GAC 1872 Cys Glu Gly Met Leu Gln Arg Ile Asn Ala Phe Ile Glu Lys Gln Asp 610 615 620 TTC TGC CAT GGG CAA GTG ATG TGG CCA CCC CTC AGC GCC CTA CAG GTC 1920 Phe Cys His Gly Gln Val Met Trp Pro Pro Leu Ser Ala Leu Gln Val 625 630 635 640 AAG CTT GCT GAG CCC GGG CAG TCC TGC AAG CAG GTG TGC CAG GAG AGC 1968 Lys Leu Ala Glu Pro Gly Gln Ser Cys Lys Gln Val Cys Gln Glu Ser 645 650 655 CAG CTC ATC TGC GAG CCT TCT TTC TTC CAG CAC CTC AAC AAG GAC AAG 2016 Gln Leu Ile Cys Glu Pro Ser Phe Phe Gln His Leu Asn Lys Asp Lys 660 665 670 GAC ATG CTG AAG TAC AAG GTG ACC TGC CAA AGC TCA GAG CTG GCC AAG 2064 Asp Met Leu Lys Tyr Lys Val Thr Cys Gln Ser Ser Glu Leu Ala Lys 675 680 685 GAC ATC CTG GTG CCC TCC TTT GAC CCT AAG AAT AAG CAC TGT GTG TTT 2112 Asp Ile Leu Val Pro Ser Phe Asp Pro Lys Asn Lys His Cys Val Phe 690 695 700 CAA GGT GAC CTC CTG CTC TTC AGC TGT GCA GGC GCC CAC CCC AGG CAC 2160 Gln Gly Asp Leu Leu Leu Phe Ser Cys Ala Gly Ala His Pro Arg His 705 710 715 720 CAGA GG GTC TGC CCC TGC CGG GAC TTC ATC AAG GGC CAG GTG GCT CTC 2208 Gln Arg Val Cys Pro Cys Arg Asp Phe Ile Lys Gly Gln Val Ala Leu 725 730 735 TGC AAA GAC TGC CTA TAG 2226 Cys Lys Asp Cys Leu *** 740

【図面の簡単な説明】

【図１】ＧｎＴ−ＩＶの触媒する化学反応を示す図であ
る。

【図２】ＨＩＩＦＤ株、ＧｎＴ−ＩＶ高発現株（ＩＭ４
／ＩＶ４）、ＧｎＴ−Ｖ高発現株（ＩＭ４／Ｖ２６）、
ＧｎＴ−ＩＶ及び−Ｖ高発現株（ＩＭ４／Ｖ２６／ＩＶ
５）株より得られた、ヒトインターフェロンに付加され
る糖鎖の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。

【図３】ＧｎＴ−ＩＶ発現用プラスミド、ｐＣＸＮ２−
ｂＧｎＴ−ＩＶの作製方法を示す図である。

【図４】ＧｎＴ−Ｖ発現用プラスミドを得るためのｐＣ
ＸＨ１の作製方法を示す図である。

【図５】ＧｎＴ−Ｖ発現用プラスミド、ｐＣＸＨ−ｈＧ
ｎＴ−Ｖの作製方法を示す図である。

【符号の説明】

ＧｌｃＮＡｃ Ｎ−アセチルグルコサミン Ｍａｎ マンノース ＵＤＰ ウリジン二リン酸 Ｇ ガラクトース ＧＮ Ｎ−アセチルグルコサミン Ｍ マンノース Ｆ フコース

【手続補正書】

【提出日】平成１１年４月１５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項３

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項４

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００８】本発明の糖鎖分岐組成改変体ヒトインター
フェロンγの製造方法は、Ｎ−アセチルグルコサミニル
トランスフェラーゼ−ＩＶ遺伝子及びＮ−アセチルグル
コサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ遺伝子の少なくとも
１つをヒトインターフェロンγを産生する動物宿主細胞
に導入して形質転換細胞を得る工程と、該形質転換細胞
を培地で培養して糖鎖分岐組成改変体ヒトインターフェ
ロンγを生産させる工程と、生産された糖鎖分岐組成改
変体ヒトインターフェロンγを前記培地から回収する工
程とを有することを特徴とする。この方法によって、天
然型とは異なる糖鎖分岐組成のヒトインターフェロンγ
を得ることができる。また、この糖鎖分岐組成改変体ヒ
トインターフェロンγから糖鎖化合物を分離することが
できる。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００９】本発明の糖鎖分岐組成改変体ヒトインター
フェロンγ生産動物細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニ
ルトランスフェラーゼ−ＩＶ遺伝子及びＮ−アセチルグ
ルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子の少なくとも
１つを有し、ヒトインターフェロンγを産生することを
特徴とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 尾前 二三雄 千葉県茂原市東郷1144番地 三井化学株式 会社内 (72)発明者 福田 一弘 千葉県茂原市東郷1144番地 三井化学株式 会社内 (72)発明者 箕輪 真理 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麟 麟麦酒株式会社基盤技術研究所内 (72)発明者 竹内 誠 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麟 麟麦酒株式会社基盤技術研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ
   ェラーゼ−ＩＶ遺伝子をヒトインターフェロンγを産生
   する動物宿主細胞に導入して形質転換細胞を得る工程
   と、該形質転換細胞を培地で培養して糖鎖分岐組成改変
   体ヒトインターフェロンγを生産させる工程と、生産さ
   れた糖鎖分岐組成改変体ヒトインターフェロンγを前記
   培地から回収する工程とを有することを特徴とする糖鎖
   分岐組成改変体ヒトインターフェロンγの製造方法。
2. 【請求項２】 前記動物宿主細胞がＣＨＯ株である請求
   項１に記載の製造方法。
3. 【請求項３】 Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ
   ェラーゼ−ＩＶ遺伝子を有し、ヒトインターフェロンγ
   を産生することを特徴とする動物細胞。
4. 【請求項４】 ヒトインターフェロンγを産生するＣＨ
   Ｏ株に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラー
   ゼ−ＩＶ遺伝子を導入して得られたものである請求項３
   に記載の動物細胞。
5. 【請求項５】 請求項１または２に記載の方法により得
   られる糖鎖分岐組成改変体ヒトインターフェロンγ。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の糖鎖分岐組成改変体ヒ
   トインターフェロンγを有効成分として含有する医薬製
   剤。