JPH11225800A - 体液を用いた癌検出方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 非常に正確に大腸癌を検出することができ、
誤った陽性結果又は誤った陰性結果を回避することので
きる、大腸癌検出方法を提供する。 【解決手段】 腸管洗浄液におけるテロメラーゼを分析
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、大腸癌分析方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、大腸癌スクリーニング検査法とし
て広く行なわれているのは、便潜血反応法である。しか
し、この検査法では、早期の大腸癌に対する陽性率はそ
れほど高くないので、早期の大腸癌を看過してしまう欠
点があり、更に、健常者での偽陽性率も高いという問題
点があった。前記の問題点を解決することを目的とし
て、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙらは、糞便中の癌細胞における
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異を検出する大腸癌分析方法
について報告している［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６，１０
２−１０５（１９９２）］。しかしながら、大腸癌組織
では、約４割程度の症例でしかＫ−ｒａｓ遺伝子の突然
変異が認められないので、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙらの方法
は、実用的な大腸癌の早期検出方法としては充分なもの
ではなかった。

【０００３】テロメラーゼは、細胞の癌化や老化との関
わりにおいて近年注目されている酵素であり、悪性腫瘍
とテロメラーゼとの関連性について種々の研究が行なわ
れている。例えば、ヒトにおいては、生殖系列（ｇｅｒ
ｍ ｌｉｎｅ）でテロメラーゼ活性が検出される場合が
あるが、一般的には成人の正常組織ではテロメラーゼ活
性は検出されない［Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，１８，１７３
−１７９（１９９６）］。一方、多くの悪性腫瘍におい
ては、テロメラーゼの高い活性が、テロメアの伸長とと
もに認められている。例えば、特開平９−２６２１００
号公報には、尿試料中のテロメラーゼ活性を測定するこ
とにより、ヒト膀胱癌細胞を検出する方法が開示されて
いる。しかし、この方法においても、膀胱癌患者２３名
の内、テロメラーゼ活性が検出されなず、陰性と誤って
判断された患者が３名おり、陽性と判断されたのは、８
６．９％（２０／２３）であった。

【０００４】また、大腸癌においては、癌細胞又は癌組
織を試料とした研究で、９０％以上の高率でテロメラー
ゼ活性が認められ、大腸腺種においても高率にテロメラ
ーゼ活性が認められることが報告されている［Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１，１２
４５−１２５１（１９９５）］。一方、吉田らは、切除
大腸癌標本を生理食塩水により洗浄し、その洗浄液の約
６０％においてのみ、テロメラーゼ活性が検出されるこ
とを報告している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このように、悪性腫瘍
とテロメラーゼとの間に強い相関関係があることを支持
するデータが蓄積されつつあるが、前記の記載から明ら
かなように、或る程度の確率で、誤った陽性結果又は誤
った陰性結果が生じることは、避けられなかった。本発
明者は、被検試料として腸管洗浄液を用いることによ
り、非常に正確に大腸癌を検出することができ、誤った
陽性結果又は誤った陰性結果を回避することができるこ
とを見出した。本発明は、こうした知見に基づくもので
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、腸管洗浄液に
おけるテロメラーゼを分析することを特徴とする、大腸
癌検出方法に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の大腸癌分析方法においては、被検試料として、
被検対象から採取した腸管洗浄液を使用する。前記被検
対象としては、例えば、動物、好ましくはヒトを含む哺
乳動物、特にはヒトを挙げることができる。

【０００８】本明細書において、「分析」には、例え
ば、被検試料におけるテロメラーゼの存在の有無の検
出、及び被検試料に含まれるテロメラーゼの半定量的又
は定量的測定などが含まれる。

【０００９】本明細書において、「テロメアＤＮＡ」と
は、染色体の末端領域に存在し、短い反復単位が数十回
から数百回繰り返す塩基配列からなるＤＮＡを意味す
る。例えば、ヒト又はマウスの反復単位の塩基配列は、 ５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’ である。本明細書において、「テロメラーゼ」とは、タ
ンパク質部分とＲＮＡ部分（以下、鋳型ＲＮＡと称す
る）とからなるリボヌクレオタンパク質であり、鋳型Ｒ
ＮＡを介して、染色体末端部にテロメアＤＮＡを合成す
ることのできる酵素を意味する。

【００１０】本明細書において、鋳型ＲＮＡの「鋳型領
域」とは、鋳型ＲＮＡの内、テロメアＤＮＡに相補的な
領域を意味する。前記「鋳型領域」は、テロメアＤＮＡ
を認識して結合することのできる「認識領域」と、テロ
メアＤＮＡの反復単位を延長する際に鋳型となることの
できる「延長領域」とからなる。例えば、ヒト又はマウ
スの鋳型領域の塩基配列は、 ５’−ＣＡＡＵＣＣＣＡＡＵＣ−３’ である。テロメラーゼは、微生物から高等動物（ヒトを
含む）に至る生物一般に存在する酵素であり、現在、各
種生物において、テロメア配列における前記反復配列、
及び鋳型領域の配列が知られているが、現在のところ、
その配列が明らかにされていない生物の前記各配列も、
公知の手段により容易に決定することができる。

【００１１】本明細書において、「腸管洗浄液」とは、
洗浄用液を経口又は経直腸投与し、それを直腸から回収
した溶液、検査機器（例えば、大腸内視鏡など）を直腸
から挿入した際に吸引採取した溶液、直腸から挿入した
検査機器による検査後に吸引採取した溶液、あるいは、
直腸から挿入した検査機器を洗浄した後の洗浄用液を意
味する。前記洗浄用液としては、例えば、大腸内視鏡検
査用洗浄用液などを挙げることができる。前記の大腸内
視鏡検査用洗浄用液としては、市販の大腸内視鏡検査用
製剤を水に溶解した水溶液などを挙げることができ、前
記大腸内視鏡検査用製剤としては、例えば、ニフレック
（森下ルセル社）などを挙げることができる。

【００１２】本発明の大腸癌分析方法において、前記腸
管洗浄液として、洗浄用液を経口又は経直腸投与（好ま
しくは経口投与）し、それを直腸から回収した溶液を用
いる場合には、例えば、新規に調製した洗浄用液を経口
又は経直腸投与（好ましくは経口投与）し、前記投与か
ら所定時間（経口投与では、通常、３〜５時間；経直腸
投与では、通常、１〜３時間）が経過した後であって、
大腸内視鏡検査又は注腸検査を実施する前、実施中、又
は実施後（好ましくは実施前）に、直腸に残存している
溶液を内視鏡下に吸引回収することにより、被検試料を
採取することができる。

【００１３】本発明の大腸癌分析方法においては、公知
のテロメラーゼ分析方法（検出方法又は測定方法）を使
用することにより、腸管洗浄液におけるテロメラーゼを
分析することができる。公知のテロメラーゼ分析方法と
しては、例えば、テロメラーゼ量を検出若しくは測定す
る方法、テロメラーゼをコードするｍＲＮＡの量を検出
若しくは測定する方法、テロメラーゼ活性を検出若しく
は測定する方法、又はテロメアＤＮＡ長を測定する方法
などを挙げることができる。

【００１４】テロメラーゼ量を検出又は測定する前記方
法としては、例えば、テロメラーゼに特異的な抗体（モ
ノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）を用いる、
ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＥＬＩＳＡ
法、若しくはディップスティック（ｄｉｐ ｓｔｉｃ
ｋ）法、又は臨床上実際に使用されているその他の方法
などを挙げることができる。

【００１５】テロメラーゼをコードするｍＲＮＡの量を
検出若しくは測定する前記方法としては、例えば、テロ
メラーゼをコードするｍＲＮＡの塩基配列に相補的な塩
基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いるノー
ザンブロッティング法などを挙げることができる。

【００１６】テロメアＤＮＡ長を測定する前記方法とし
ては、例えば、サザンハイブリダイゼーション法を挙げ
ることができる。前記サザンハイブリダイゼーション法
では、例えば、被検試料（例えば、細胞又は組織）から
染色体ＤＮＡを抽出し、これを適当な制限酵素（例え
ば、Ｈｉｎｆ Ｉ）で切断した後に、アガロースゲル電
気泳動にかけ、テロメア配列の反復配列を含むオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用いることにより、テロメ
アＤＮＡ長を測定することができる。

【００１７】本発明の大腸癌分析方法においては、前記
の腸管洗浄液から測定用サンプルを調製し、得られた測
定用サンプルに含まれる可能性のあるテロメラーゼを、
テロメア反復配列増幅プロトコル（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ
ｒｅｐｅａｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌ；以下、ＴＲＡＰと称する）法［Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２６６，２０１１−２０１５（１９９４年）］を
用いて分析することが好ましい。通常のＴＲＡＰ法で
は、被検試料（例えば、細胞又は組織など）に、テロメ
アＤＮＡ反復配列延長用プライマーを加えると、そのプ
ライマーを構成するオリゴヌクレオチドの３’末端に、
テロメラーゼによってテロメアＤＮＡ反復配列が付加さ
れる。続いて、前記延長反応により合成されたテロメラ
ーゼ産物を増幅することのできるポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）用プライマーを更に加え、ＰＣＲ法により前
記テロメラーゼ産物を増幅し、得られたＰＣＲ産物を分
析することによって、前記被検試料中に含まれるテロメ
ラーゼ活性を分析することができる。このＴＲＡＰ法
は、ＰＣＲ法をベースとする技術であり、非常に低いレ
ベルのテロメラーゼ活性であっても、それを検出するこ
とが可能である。

【００１８】本発明の大腸癌分析方法は、例えば、 （１）腸管洗浄液から採取した細胞を破砕し、サンプル
（例えば、細胞破砕液、又は細胞破砕液の上清など）を
得る工程（以下、サンプル調製工程と称する）； （２）テロメラーゼの鋳型ＲＮＡの鋳型領域におけるテ
ロメアＤＮＡ認識領域に結合して、１以上のテロメアＤ
ＮＡ反復単位を３’末端に延長することができ、蛍光物
質で標識された第１のプライマーと、工程（１）で得ら
れたサンプルとを接触させる工程（以下、延長反応工程
と称する）； （３）工程（２）で得られた生成液を有機溶媒で処理
し、得られた水性相を低級アルコールで処理してＤＮＡ
を分離する工程； （４）前記の第１プライマーと組み合わせて使用する
と、前記第１プライマーとその３’末端に連結した１以
上のテロメアＤＮＡ反復単位とからなるオリゴヌクレオ
チドを増幅することのできる第２のプライマーと、工程
（３）で得られた生成液と、前記の第１プライマーと
を、ポリメラーゼ連鎖反応が可能な条件下で接触させる
工程（以下、増幅反応工程と称する）；及び （５）工程（４）で得られた、第１プライマーとその
３’末端に連結した１以上のテロメアＤＮＡ反復単位と
からなるオリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡシークエン
サーにより分析する工程（以下、分析工程と称する）を
含むことが好ましい。

【００１９】本発明の大腸癌分析方法における工程
（１）、すなわち、サンプル調製工程では、例えば、以
下の手順により、腸管洗浄液からサンプル（例えば、細
胞破砕液、又は細胞破砕液の上清など）を調製すること
ができる。すなわち、被検対象から採取した腸管洗浄液
を遠心し、上清を除去することにより、沈殿物として細
胞を採取する。採取した細胞を適当な細胞溶解緩衝液に
懸濁し、ホモジナイズすることにより細胞破砕液を調製
することができる。また、得られた細胞破砕液を更に遠
心し、上清を回収することにより、細胞破砕液の上清を
調製することができる。

【００２０】本発明の大腸癌分析方法における工程
（２）、すなわち、延長反応工程では、例えば、所定量
の前記サンプルに、蛍光物質で標識された第１のプライ
マーを加えることができる。前記の第１プライマーとし
ては、テロメラーゼの鋳型ＲＮＡの鋳型領域におけるテ
ロメアＤＮＡ認識領域に結合して、そのプライマーの
３’末端に、１以上のテロメアＤＮＡ反復単位を延長す
ることができるオリゴヌクレオチドである限り、特に限
定されるものではなく、例えば、 ５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’ の塩基配列（配列表の配列番号１の配列）からなるＴＳ
プライマーを用いることができる。また、蛍光標識化に
用いることのできる蛍光物質としては、例えば、フルオ
レッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフルオ
レスカミンなどを挙げることができる。

【００２１】本発明の大腸癌分析方法における延長反応
工程においては、前記サンプル中にテロメラーゼが含ま
れている場合には、そのテロメラーゼにより、テロメア
ＤＮＡ反復単位の延長反応が進行し、前記第１プライマ
ーの３’末端に１以上のテロメアＤＮＡ反復単位が付加
される。その結果、前記第１プライマーとその３’末端
に連結した１以上のテロメアＤＮＡ反復単位とからなる
オリゴヌクレオチド（以下、テロメアＤＮＡ付加プライ
マーと称することがある）が生成される。テロメアＤＮ
Ａ反復単位の延長反応の進行の程度は、サンプル中に含
まれるテロメラーゼの活性に依存する。一方、前記サン
プル中にテロメラーゼが含まれていない場合には、テロ
メアＤＮＡ反復単位の延長反応は進行しない。

【００２２】本発明の大腸癌分析方法における工程
（３）、すなわち、分離工程では、例えば、以下の手順
により、前記の延長反応工程で得られた生成液から、Ｄ
ＮＡを分離することができる。すなわち、延長反応工程
を実施して得られた反応溶液に、適当な有機溶媒適当量
を加えて攪拌し、遠心する。遠心により分離された水性
相と有機相の内、水性相を取り出す。続いて、前記水性
相に適当な低級アルコール適当量を添加してオリゴヌク
レオチドを沈殿させ、上清を除去する。得られた残査を
適当な緩衝液に溶解し、この溶液を次の工程に用いるこ
とができる。本工程を実施することにより、前記の延長
反応工程で得られた生成液から、その中に含まれるＰＣ
Ｒ阻害物質を除去することができ、その結果、テロメラ
ーゼの分析感度を向上させることができる。

【００２３】前記有機溶媒抽出に用いることのできる有
機溶媒としては、例えば、フェノール、クロロホルム、
炭素数１〜８のアルコール（好ましくはアミルアルコー
ル、より好ましくはイソアミルアルコール）などを挙げ
ることができる。本発明の大腸癌分析方法における分離
工程においては、前記有機溶媒を混合して用いることが
好ましく、例えば、フェノール／クロロホルム／アルコ
ール混合溶液、又はフェノール／クロロホルム混合溶液
などを挙げることができる。フェノール／クロロホルム
／アルコール混合溶液を使用する場合には、その混合比
は、９０〜３０：７０〜１０：６０〜０であることが好
ましく、５０：４８：２であることが特に好ましい。ま
た、フェノール／クロロホルム混合溶液を使用する場合
には、その混合比は、９０〜３０：７０〜１０であるこ
とが好ましく、５０：５０であることが特に好ましい。
有機溶媒抽出により、ＰＣＲ阻害タンパク質を除去する
ことができる。

【００２４】水溶性成分の除去に用いることのできる前
記低級アルコールとしては、炭素数１〜４の低級アルコ
ール、例えば、エタノール、又はプロパノールなどを挙
げることができる。低級アルコールで処理してＤＮＡを
分離することにより、ＰＣＲ阻害水溶性成分を除去する
ことができる。

【００２５】本発明の大腸癌分析方法における工程
（４）、すなわち、増幅反応工程では、ＰＣＲを実施す
ることが可能な条件下で、前記の分離工程で得られた生
成液と、蛍光標識化第１プライマーと、第２のプライマ
ーとを接触させる。例えば、前記分離工程で得られた生
成物に、蛍光標識化第１プライマーと第２のプライマー
とを加え、更にＴａｑポリメラーゼを加えることによ
り、ＰＣＲ法を実施することができる。なお、充分量の
蛍光標識化第１プライマーを前記延長反応工程で使用し
た場合には、前記分離工程で得られた生成液中に、蛍光
標識化第１プライマーが残存しているので、本工程（増
幅反応工程）で蛍光標識化第１プライマーを新たに加え
る必要はない。

【００２６】前記の第２プライマーとしては、前記の第
１プライマーと組み合わせて使用すると、前記第１プラ
イマーとその３’末端に連結した１以上のテロメアＤＮ
Ａ反復単位とからなるオリゴヌクレオチドを増幅するこ
とのできるオリゴヌクレオチドである限り、特に限定さ
れるものではなく、例えば、 ５’−（ＣＣＣＴＴＡ）₅ ＣＣＣＴＡＡ−３’ の塩基配列からなるプライマー、又は前記プライマーの
５’末端から１〜１８個の塩基が欠失しているプライマ
ーであることができ、特には、 ５’−（ＣＣＣＴＴＡ）₃ ＣＣＣＴＡＡ−３’ の塩基配列（配列表の配列番号２の配列）からなるＣＸ
プライマーを用いることができる。

【００２７】本発明の大腸癌分析方法における増幅反応
工程においては、前記分離工程で得られた生成液に、前
記延長反応工程で合成されたテロメアＤＮＡ付加プライ
マー（すなわち、前記第１プライマーとその３’末端に
連結した１以上のテロメアＤＮＡ反復単位とからなるオ
リゴヌクレオチド）が含まれている場合には、ＰＣＲ法
により前記テロメアＤＮＡ付加プライマーが増幅され
る。ＰＣＲの条件（例えば、１サイクルを構成する各ス
テップの反応温度及び反応時間、又はサイクル数など）
は、使用するプライマーの塩基配列に応じて適宜決定す
ることができる。増幅反応後に得られるＰＣＲ産物の量
は、前記分離工程で得られた生成液に含まれるテロメア
ＤＮＡ付加プライマーの初期量に依存する。このテロメ
アＤＮＡ付加プライマーの初期量は、先に説明したよう
に、サンプル中に含まれるテロメラーゼの活性に依存す
るので、従って、増幅反応後に得られるＰＣＲ産物の量
は、サンプル中に含まれるテロメラーゼの活性に依存す
る。一方、前記分離工程で得られた生成液に、前記延長
反応工程で合成されたテロメアＤＮＡ付加プライマーが
含まれていない場合、すなわち、前記サンプル中にテロ
メラーゼが存在せず、前記延長反応工程でテロメアＤＮ
Ａ付加プライマーが合成されない場合には、本工程（増
幅反応工程）ではＰＣＲ産物が合成されない。

【００２８】本発明の大腸癌分析方法における工程
（５）、すなわち、分析工程では、前記の増幅反応工程
で増幅されたテロメアＤＮＡ付加プライマーを、自動Ｄ
ＮＡシークエンサー（蛍光シークエンサー）により、例
えば、以下の手順に従って分析（例えば、存在の有無の
検出、又は半定量的若しくは定量的測定）することがで
きる。すなわち、工程（４）で得られた生成液から電気
泳動用サンプルを調製し、自動ＤＮＡシークエンサーに
より前記電気泳動用サンプルを測定する。なお、電気泳
動用サンプルを調製する際に、インターナルコントロー
ルとして適当なオリゴヌクレオチド（例えば、塩基長が
２０〜４４であるオリゴヌクレオチド）を前記電気泳動
用サンプルに添加しておく。

【００２９】自動ＤＮＡシークエンサーから得られる波
形データから、各種オリゴヌクレオチドに由来する各ピ
ークの面積をそれぞれ算出する。得られた各ピークの面
積の値から、（１）サンプルの波形データにおけるテロ
メアＤＮＡ付加プライマーに由来する各ピークの面積の
和（Ｓ_X ）、（２）サンプルの波形データにおけるイン
ターナルコントロール由来のピークの面積（Ｃ_X ）、
（３）陽性コントロールの波形データにおけるテロメア
ＤＮＡ付加プライマーに由来する各ピークの面積の和
（Ｓ_O ）、及び（４）陽性コントロールの波形データに
おけるインターナルコントロール由来のピークの面積
（Ｃ_O ）を計算し、例えば、計算式（Ｉ）： ＴＰＧ＝［（Ｓ_X ／Ｃ_X ）／（Ｓ_O ／Ｃ_O ）］×１００ （Ｉ） ［式中、ＴＰＧは、テロメラーゼ活性（Ｔｏｔａｌ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ；単位＝ｕｎｉｔｓ
／μｇタンパク質）を意味する］により、テロメラーゼ
活性を求めることができる。前記のデータ処理には、例
えば、自動解析ソフト（例えば、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｍ
ａｎａｇｅｒ ＶＩ．１；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ，ウプサラ，スウェーデン）を使用することが
できる。

【００３０】これまでの説明で明らかなように、本発明
の大腸癌分析方法においては、腸管洗浄液から採取した
細胞中にテロメラーゼ活性が存在する場合には、テロメ
アＤＮＡ付加プライマーが合成され、それに対して、腸
管洗浄液から採取した細胞中にテロメラーゼ活性が存在
しない場合には、テロメアＤＮＡ付加プライマーが合成
されない。従って、本発明の大腸癌分析方法における前
記分析工程において、テロメアＤＮＡ付加プライマーの
存在が確認された場合には、腸管洗浄液から採取した細
胞中にテロメラーゼ活性が存在し、前記細胞は大腸癌細
胞であると判定することができる。それに対して、テロ
メアＤＮＡ付加プライマーが存在しなかった場合には、
腸管洗浄液から採取した細胞中にテロメラーゼ活性が存
在せず、前記細胞は癌細胞でないと判定することができ
る。

【００３１】また、前記分析工程において、テロメアＤ
ＮＡ付加プライマーの存在が確認され、その量を定量的
に測定することができた場合には、前記細胞中のテロメ
ラーゼ活性を定量化することができる。本発明の大腸癌
分析方法においては、標識化手段として蛍光物質を用
い、分析手段として自動ＤＮＡシークエンサーを用いる
ので、放射性同位元素を用いる必要がなく、操作が簡便
になると共に、放射性同位元素を用いる場合に比べて定
量性が向上する。

【００３２】本発明の大腸癌分析方法においては、被検
対象から採取した腸管洗浄液におけるテロメラーゼを分
析することによって、被検対象の大腸癌を検出すること
ができる。前記大腸癌には、例えば、横行結腸癌、Ｓ状
結腸癌、又は直腸癌などが含まれる。本発明の大腸癌分
析方法においては、前記腸管洗浄液中にテロメラーゼが
検出された場合には、被検対象は大腸癌に関して陽性で
あると判断することができ、一方、前記腸管洗浄液中に
テロメラーゼが検出されなかった場合には、被検対象は
大腸癌に関して陰性であると判断することができる。

【００３３】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【実施例１】（１）腸管洗浄液の採取 以下に示す手順に従って、大腸癌患者８名と、大腸内視
鏡検査により異常病変が観察されなかった健常者１名と
から腸管洗浄液を採取した。大腸癌患者８名には、横行
結腸癌患者２名、Ｓ状結腸癌患者４名、及び直腸癌患者
２名が含まれ、その組織学的深達度（ｈｉｓｔｏｌｏｇ
ｉｃａｌ ｄｅｐｔｈ）は、Ｔ３が５名、Ｔ２が１名、
Ｔ１が２名であった。大腸内視鏡検査用製剤（ニフレッ
ク，森下ルセル社；散剤１３７．１５５ｇ中の含有成分
＝塩化ナトリウム２．９３ｇ，塩化カリウム１．４８５
ｇ，炭酸水素ナトリウム３．３７ｇ，及び無水硫酸ナト
リウム１１．２７ｇ）を適当量の水（大腸内視鏡検査用
製剤１３７．１５５ｇ当たり水２リットル）に溶解し、
大腸内視鏡検査用洗浄用液を調製した。この大腸内視鏡
検査用洗浄用液を大腸癌患者又は健常人にそれぞれ経口
投与（１人当たり２リットル）し、約５時間後に、直腸
に残存している前記腸管洗浄液約１０〜１５ｍｌを内視
鏡下に吸引回収した。腸管洗浄液の採取を完了した大腸
癌患者及び健常人は、引き続き、通常の大腸内視鏡検査
を実施した。

【００３４】（２）テロメラーゼ活性の測定 前記（１）で採取した腸管洗浄液１０〜１５ｍｌを４℃
で１０分間遠心（回転数＝２０００ｒｐｍ）し、得られ
た沈殿物をリン酸緩衝溶液［ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕ
ｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；以下、ＰＢＳと称する；
組成＝１４０ｍＭ−ＮａＣｌ，２．７ｍＭ−ＫＣｌ，１
０ｍＭ−Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ，及び１．８ｍＭ−ＫＨ₂ ＰＯ
₄ （ｐＨ７．２）］１０ｍｌで洗浄し、４℃１０分間遠
心（回転数＝２０００ｒｐｍ）した。得られた沈殿物
を、氷冷した１×ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液［１０ｍＭ−Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ−ＭｇＣｌ₂ ，
１ｍＭ−ＥＧＴＡ，０．１ｍＭベンズアミジン，５ｍＭ
−β−メルカプトエタノール，０．５％ＣＨＡＰＳ，及
び１０％グリセロール］２００μｌに懸濁し、ホモジナ
イズした後に、氷上で３０分間インキュベートした。イ
ンキュベートした溶解物を４℃で２０分間遠心（１２０
００×ｇ）し、得られた上清を液体窒素中で急冷し、−
８０℃で保管した。

【００３５】冷凍保管していた前記サンプルを解凍し、
タンパク質濃度測定試薬（クーマシープロテインアッセ
イ試薬；ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて前記サンプルのタン
パク質濃度を決定した。所定量の前記サンプル（タンパ
ク質量換算で１μｇ）１μｌに、フルオレッセンスイソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化ＴＳプライマー［塩
基配列＝５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ
−３’；配列表の配列番号１の配列］０．１ｎｇを含有
する反応用緩衝液４８μｌを加え、３０℃で３０分間イ
ンキュベートすることにより、テロメラＤＮＡ反復配列
の延長反応を実施した。なお、前記反応用緩衝液として
は、市販のＴｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（ＴＲＡＰｅｚｅ^TM；Ｏｎｃｏｒ社，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州，米国）に含まれて
いるマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）をその
まま使用した。前記延長反応は、サンプル中に含まれる
可能性のあるテロメラーゼによって進行し、延長反応の
程度は、前記テロメラーゼの量及び活性に依存する。

【００３６】続いて、ＴＥ緩衝液［１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ−ＥＤＴＡ］５０μ
ｌを加え、更に、フェノール／クロロホルム／イソアミ
ルアルコール混合溶液（５０／４８／２）１００μｌを
加え、よく攪拌した後に、５分間遠心（１２０００×
ｇ）し、水層（上層）を新しいチューブに移すことによ
り、ＰＣＲ阻害タンパク質を除去した。次に、５Ｍ酢酸
アンモニウムを最終濃度が２．５Ｍになるように加え、
３倍容量のエタノールを加えた。ドライアイス上で３０
分間インキュベートした後に、１０分間遠心（１２００
０×ｇ）した。注意しながら上清を除去することにより
ＰＣＲ阻害水溶性成分を除去し、７５％エタノール水溶
液で沈殿物を洗浄し、５分間遠心（１２０００×ｇ）し
た。上清を除去し、沈殿物を乾燥させた後に、蒸留水２
０μｌに溶解した。

【００３７】この溶液に、５０ｎｇ／μｌ−ＦＩＴＣ標
識化ＴＳプライマー２μｌ、５０ｎｇ／μｌ−ＣＸプラ
イマー［塩基配列＝５’−（ＣＣＣＴＴＡ）₃ ＣＣＣＴ
ＡＡ−３’；配列表の配列番号２の配列］２μｌ、ｄＮ
ＴＰ混合物（各ヌクレオチドの濃度＝２．５ｍＭ）４μ
ｌ、０．５ユニット／μｌＴａｑポリメラーゼ（ＥｘＴ
ａｑポリメラーゼ；宝酒造．京都，日本）０．５μｌ、
０．５μｇ／μｌ−Ｔ₄ ｇｅｎｅ３２タンパク質（ベー
リンガーマンハイム社）２μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液
［Ｅｘ Ｔａｑバッファー；宝酒造．京都，日本；（組
成）１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び５０ｍ
Ｍ−ＫＣｌ］５μｌ、及び蒸留水１４．５μｌを加え、
以下の条件でＰＣＲ法を実施した。すなわち、変性工程
を９４℃で３０秒間行ない、アニーリング工程を６０℃
で３０秒間行ない、ＤＮＡ合成工程を７２℃で４５秒間
行なうことからなるサイクルを、３１サイクル実施し
た。

【００３８】得られた反応液を自動ＤＮＡシークエンサ
ー（ＡＬＦｒｅｄ ＤＮＡシークエンサー；Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ウプサラ，スウェーデン）
で分析した。前記分析においては、インターナルコント
ロールとして前記キット付属のＴＳＲ８（塩基長＝３６
塩基）を電気泳動用サンプルに添加した後、６Ｍ尿素含
有１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動（出
力＝４５Ｗ；ゲル温度＝４５℃）を実施した。

【００３９】前記自動ＤＮＡシークエンサーから得られ
た結果を図１に示す。図１において、レーン１は、陽性
コントロールとしてのセルペレット（１×１０⁶ 細胞）
［市販の前記Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（ＴＲＡＰｅｚｅ^TM）］の結果を示し；レー
ン２は、健常者から採取した腸管洗浄液の結果を示し；
レーン３〜１０は、大腸癌患者から採取した腸管洗浄液
の結果を示す。また、図１において、矢印Ａで示すピー
クは、ＦＩＴＣ標識化ＴＳプライマーに由来するピーク
であり；矢印Ｂで示すピークは、インターナルコントロ
ールに由来するピークであり；矢印Ｃ〜Ｇで示すピーク
は、それぞれ、５０塩基、５６塩基、６２塩基、６８塩
基、及び７４塩基からなる各オリゴヌクレオチドに由来
するピークである。

【００４０】前記自動ＤＮＡシークエンサーから得られ
たデータを自動解析ソフト（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｍａｎ
ａｇｅｒ ＶＩ．１；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ，ウプサラ，スウェーデン）で解析し、ＰＣＲ産物
である各種オリゴヌクレオチドに由来する各々のピーク
の面積を算出した。得られた数値から、前記計算式
（Ｉ）に基づいてテロメラーゼ活性（ＴＰＧ；単位＝ｕ
ｎｉｔｓ／μｇタンパク質）を決定した。

【００４１】大腸癌患者８名から採取した腸管洗浄液の
テロメラーゼ活性を、患者の性別・年齢、及び癌の進行
状態と併せて、表１に示す。表１において、「番号」
は、図１におけるレーン番号を意味し、「癌の部位」欄
における記号「Ｔ」、「Ｓ」、及び「Ｒ」は、それぞれ
「横行結腸」、「Ｓ状結腸」、及び「直腸」を意味し；
「癌の大きさ」欄の数値の単位は「ｍｍ］である。「組
織学的深度」欄の記号「Ｔ１」〜「Ｔ３」、及び「リン
パ節転移」欄の記号「Ｎ０」〜「Ｎ３」は、それぞれ、
ＵＩＣＣ（Ｕｎｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ
Ｃｏｎｔｒｅｌａ Ｃａｎｃｅｒ）分類の定義に基づ
き、その意味は、以下のとおりである。 Ｔ１：腫瘍が粘膜下層に浸潤。 Ｔ２：腫瘍が固有筋層に浸潤。 Ｔ３：腫瘍が固有筋層を越え、漿膜下層又は腹膜被覆の
ない結腸傍又は直腸傍組織に湿潤。 Ｎ０：所属リンパ節転移なし。 Ｎ１：１〜３個の結腸傍又は直腸傍リンパ節への転移。 Ｎ２：４個以上の結腸傍又は直腸傍リンパ節への転移。 Ｎ３：支配血管（名称の付いた血管）幹の走行に沿うリ
ンパ節への転移。

【００４２】表１において、「組織型」欄における記号
「Ｗ」及び「Ｍ」は、それぞれ「高分化型腺癌」及び
「中分化型腺癌」を意味する。「Ｄｕｋｅｓ段階」と
は、大腸癌の進行度を意味し、「Ｄｕｋｅｓ段階」欄に
おける記号「Ａ」〜「Ｄ」の意味は、以下のとおりであ
る。 Ａ：腫瘍が腸壁内に限局するもの。 Ｂ：癌腫が腸壁を貫いて浸潤するが、リンパ節転移のな
いもの。 Ｃ：リンパ節転移のあるもの。 Ｄ：遠隔転移が認められるもの。 「便潜血」欄において、記号「＋」は陽性であること
を、記号「−」は陰性であることを、記号「ＮＤ」は検
査を実施しなかったことを示す。大腸癌患者（８名）の
腸管洗浄液における定量的テロメラーゼ活性（ＴＰＧ）
の平均値は、５．９２（標準誤差＝１．０５）であっ
た。一方、健常人（１名）では、テロメラーゼ活性は検
出されなかった。

【００４３】

【表１】 番 性 年齢 テロメラ 癌の 癌の大 組織学 リンパ 組織 Dukes 便号 別 ーゼ活性 部位 きさ 的深度 節転移 型 段階 潜血 ３ 男 ６８ ７．９０ Ｔ １５ Ｔ１ Ｎ０ Ｗ Ａ − ４ 男 ７５ ５．７２ Ｓ ４２ Ｔ３ Ｎ１ Ｍ Ｃ ＋ ５ 男 ５８ ３．４０ Ｓ ２５ Ｔ２ Ｎ０ Ｍ Ａ ＋ ６ 男 ６０ ６．２２ Ｓ ３８ Ｔ３ Ｎ３ Ｍ Ｄ ＮＤ ７ 男 ７０ ６．３９ Ｒ １４ Ｔ１ Ｎ１ Ｍ Ｃ ＋ ８ 女 ５９ ６．２３ Ｒ ８３ Ｔ３ Ｎ０ Ｍ Ｂ ＋ ９ 女 ６１ ５．３８ Ｔ ５０ Ｔ３ Ｎ０ Ｍ Ｂ ＮＤ10 女 ６２ ５．１９ Ｓ ３５ Ｔ３ Ｎ１ Ｍ Ｃ −

【００４４】

【発明の効果】本発明方法によれば、非常に正確に大腸
癌を検出することができ、誤った陽性結果又は誤った陰
性結果を回避することができる。また、本発明方法にお
いては、標識化手段として蛍光物質を用い、分析手段と
して自動ＤＮＡシークエンサーを用いるので、放射性同
位元素を用いる必要がなく、操作が簡便になる。

【００４５】

【配列表】

【００４６】配列番号 ： １ 配列の長さ： １８ 配列の型 ： 核酸 配列 AATCCGTCGA GCAGAGTT 18

【００４７】配列番号 ： ２ 配列の長さ： ２４ 配列の型 ： 核酸 配列 CCCTTACCCT TACCCTTACC CTAA 24

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲ産物の自動ＤＮＡシークエンサーによる
分析の結果を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石岡 恵子 東京都小平市鈴木町２丁目180番 ８号棟 103号 (72)発明者 井野口 英司 群馬県館林市北成島町734の２

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腸管洗浄液におけるテロメラーゼを分析
   することを特徴とする、大腸癌検出方法。
2. 【請求項２】 腸管洗浄液に含まれる細胞の細胞破砕液
   におけるテロメラーゼ活性を分析する、請求項１に記載
   の大腸癌検出方法。
3. 【請求項３】 テロメラーゼの鋳型ＲＮＡの鋳型領域に
   おけるテロメアＤＮＡ認識領域に結合して、１以上のテ
   ロメアＤＮＡ反復単位を３’末端に延長することがで
   き、標識されたプライマーを用いる、請求項２に記載の
   大腸癌分析方法。
4. 【請求項４】 （１）腸管洗浄液に含まれる細胞の細胞
   破砕液を得る工程； （２）テロメラーゼの鋳型ＲＮＡの鋳型領域におけるテ
   ロメアＤＮＡ認識領域に結合して、１以上のテロメアＤ
   ＮＡ反復単位を３’末端に延長することができ、標識さ
   れた第１のプライマーと、工程（１）で得られた細胞破
   砕液とを接触させる工程； （３）（ａ）前記の標識化第１プライマー、（ｂ）前記
   の標識化第１プライマーと組み合わせて使用することに
   より、前記標識化第１プライマーとその３’末端に連結
   した１以上のテロメアＤＮＡ反復単位とからなるオリゴ
   ヌクレオチドを増幅することのできる第２のプライマ
   ー、及び（ｃ）工程（２）で得られた生成液を、ポリメ
   ラーゼ連鎖反応が可能な条件下で接触させる工程；及び （４）工程（３）で得られた、標識化第１プライマーと
   その３’末端に連結した１以上のテロメアＤＮＡ反復単
   位とからなるオリゴヌクレオチドを分析する工程を含
   む、請求項３に記載の大腸癌分析方法。
5. 【請求項５】 （１）腸管洗浄液に含まれる細胞の細胞
   破砕液の上清を得る工程； （２）テロメラーゼの鋳型ＲＮＡの鋳型領域におけるテ
   ロメアＤＮＡ認識領域に結合して、１以上のテロメアＤ
   ＮＡ反復単位を３’末端に延長することができ、標識さ
   れた第１のプライマーと、工程（１）で得られた細胞破
   砕液の上清とを接触させる工程； （３）（ａ）前記の標識化第１プライマー、（ｂ）前記
   の標識化第１プライマーと組み合わせて使用することに
   より、前記標識化第１プライマーとその３’末端に連結
   した１以上のテロメアＤＮＡ反復単位とからなるオリゴ
   ヌクレオチドを増幅することのできる第２のプライマ
   ー、及び（ｃ）工程（２）で得られた生成液を、ポリメ
   ラーゼ連鎖反応が可能な条件下で接触させる工程；及び （４）工程（３）で得られた、標識化第１プライマーと
   その３’末端に連結した１以上のテロメアＤＮＡ反復単
   位とからなるオリゴヌクレオチドを分析する工程を含
   む、請求項３に記載の大腸癌分析方法。
6. 【請求項６】 前記工程（２）と前記工程（３）との間
   に、前記工程（２）で得られた生成液を有機溶媒で処理
   し、得られた水性相を低級アルコールで処理してＤＮＡ
   を分離する工程を含む、請求項４又は５に記載の大腸癌
   分析方法。
7. 【請求項７】 標識された第１のプライマーが、蛍光物
   質で標識された第一のプライマーであり；前記工程
   （４）において、標識化第１プライマーとその３’末端
   に連結した１以上のテロメアＤＮＡ反復単位とからなる
   オリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡシークエンサーによ
   り分析する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の大腸
   癌分析方法。