JPH11196868A - メタノール資化性酵母の培養方法 - Google Patents
メタノール資化性酵母の培養方法Info
- Publication number
- JPH11196868A JPH11196868A JP147898A JP147898A JPH11196868A JP H11196868 A JPH11196868 A JP H11196868A JP 147898 A JP147898 A JP 147898A JP 147898 A JP147898 A JP 147898A JP H11196868 A JPH11196868 A JP H11196868A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- methanol
- yeast
- added
- culture
- serine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】
【課題】異種蛋白質をコードする遺伝子がメタノール添
加により誘導し得るプロモーターの制御下に置かれた遺
伝子を導入し形質転換したメタノール資化性酵母を培養
して異種蛋白質を発現せしむる際に、異種蛋白質の生産
性を向上できる方法を提供すること。 【解決手段】異種蛋白質をコードする遺伝子を導入し形
質転換したメタノール資化性酵母を培養して異種蛋白質
を発現せしむる方法であって、メタノールを添加しつ
つ、その添加量に対して一定の相関を有する量のセリン
回路における中間代謝物を添加することを特徴とするメ
タノール資化性酵母の培養法により前記課題を解決す
る。
加により誘導し得るプロモーターの制御下に置かれた遺
伝子を導入し形質転換したメタノール資化性酵母を培養
して異種蛋白質を発現せしむる際に、異種蛋白質の生産
性を向上できる方法を提供すること。 【解決手段】異種蛋白質をコードする遺伝子を導入し形
質転換したメタノール資化性酵母を培養して異種蛋白質
を発現せしむる方法であって、メタノールを添加しつ
つ、その添加量に対して一定の相関を有する量のセリン
回路における中間代謝物を添加することを特徴とするメ
タノール資化性酵母の培養法により前記課題を解決す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、異種蛋白質をコー
ドする遺伝子を導入し形質転換したメタノール資化性酵
母を培養する方法に関するものであり、該異種蛋白質を
効率的に生産する方法に関するものである。
ドする遺伝子を導入し形質転換したメタノール資化性酵
母を培養する方法に関するものであり、該異種蛋白質を
効率的に生産する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】組み換えＤＮＡ技術の進歩により、多種
多様の有用なペプチドや蛋白質を微生物により生産する
ことが可能になった。このような蛋白質の生産は、目的
とする蛋白質をコードする遺伝子を宿主微生物に導入し
て形質転換した宿主微生物を培養することにより行う。
多様の有用なペプチドや蛋白質を微生物により生産する
ことが可能になった。このような蛋白質の生産は、目的
とする蛋白質をコードする遺伝子を宿主微生物に導入し
て形質転換した宿主微生物を培養することにより行う。
【０００３】宿主微生物としては、一般的に大腸菌が用
いられている。大腸菌は異種蛋白質の発現量が多く、優
れた特徴を有している。しかしながら大腸菌を宿主とし
て用いる場合、問題点がないわけではない。
いられている。大腸菌は異種蛋白質の発現量が多く、優
れた特徴を有している。しかしながら大腸菌を宿主とし
て用いる場合、問題点がないわけではない。
【０００４】問題点のひとつは、発現された蛋白質が細
胞封入体（インクルージョンボディ）を形成して不溶化
し、活性を有しない構造に折り畳まれてしまうことであ
る。その結果、生理活性を有するヒト蛋白質を得ようと
する場合には、まず変性剤等を用いて可溶化処理を行
い、続いて再賦活化処理を行う必要がある。ところが更
には、これら操作に起因して目的蛋白質の構造類縁体が
生じることもありる。大腸菌を宿主として製造した蛋白
質を回収する際の困難さや、製造された蛋白質が時には
低い生理活性しか有していないという問題は、大腸菌が
遺伝子組み換えにより生産された蛋白質の翻訳後プロセ
ッシング（例えばグリコシル化）を行い得ないことに起
因すると思われる。
胞封入体（インクルージョンボディ）を形成して不溶化
し、活性を有しない構造に折り畳まれてしまうことであ
る。その結果、生理活性を有するヒト蛋白質を得ようと
する場合には、まず変性剤等を用いて可溶化処理を行
い、続いて再賦活化処理を行う必要がある。ところが更
には、これら操作に起因して目的蛋白質の構造類縁体が
生じることもありる。大腸菌を宿主として製造した蛋白
質を回収する際の困難さや、製造された蛋白質が時には
低い生理活性しか有していないという問題は、大腸菌が
遺伝子組み換えにより生産された蛋白質の翻訳後プロセ
ッシング（例えばグリコシル化）を行い得ないことに起
因すると思われる。
【０００５】大腸菌とは異なり、真核微生物である酵母
は、動物細胞と同様に小胞体やゴルジ体等を有し、真核
細胞由来の異種蛋白質を生理活性を発現し得る高次構造
を有した状態で生産し得ることが知られており、単細胞
で増殖し、しかも動物細胞等に比べて増殖速度も速いた
め大量培養が容易である等の優位点を有している。
は、動物細胞と同様に小胞体やゴルジ体等を有し、真核
細胞由来の異種蛋白質を生理活性を発現し得る高次構造
を有した状態で生産し得ることが知られており、単細胞
で増殖し、しかも動物細胞等に比べて増殖速度も速いた
め大量培養が容易である等の優位点を有している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】酵母の中では、サッカ
ロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が異種蛋白質をコードする遺伝子
を発現させるための宿主として広く用いられている。
ロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が異種蛋白質をコードする遺伝子
を発現させるための宿主として広く用いられている。
【０００７】しかしながら、サッカロミセス・セレビシ
エは高い細胞密度まで増殖させることが困難であり、培
養液当たりの生産量が多くない。
エは高い細胞密度まで増殖させることが困難であり、培
養液当たりの生産量が多くない。
【０００８】これに対して、ピキア・パストリス（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモル
ファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、
キャンディダ・ボイディニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉ
ｄｉｎｉｉ）等のメタノール資化性酵母は、培養液当た
りの生産量等の面において工業的規模での異種蛋白質生
産に用いるのに好適である。これらの酵母は、唯一の炭
素源としてグリセロール又はメタノールのいずれかを利
用することで高い細胞密度まで培養することができるの
である。
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモル
ファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、
キャンディダ・ボイディニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉ
ｄｉｎｉｉ）等のメタノール資化性酵母は、培養液当た
りの生産量等の面において工業的規模での異種蛋白質生
産に用いるのに好適である。これらの酵母は、唯一の炭
素源としてグリセロール又はメタノールのいずれかを利
用することで高い細胞密度まで培養することができるの
である。
【０００９】ピキア・パストリス等のメタノール資化性
酵母における異種蛋白質発現には、通常、メタノールに
より誘導可能なプロモーターが利用される。即ち、流加
培養法により、グリセロールを添加することにより高い
細胞密度に達するまで培養した後、メタノールを連続的
又は周期的に添加にして蛋白質発現を誘導するのであ
る。その際にメタノール濃度が一定の範囲内に収まるよ
うにその添加速度は決定される。
酵母における異種蛋白質発現には、通常、メタノールに
より誘導可能なプロモーターが利用される。即ち、流加
培養法により、グリセロールを添加することにより高い
細胞密度に達するまで培養した後、メタノールを連続的
又は周期的に添加にして蛋白質発現を誘導するのであ
る。その際にメタノール濃度が一定の範囲内に収まるよ
うにその添加速度は決定される。
【００１０】ピキア・パストリス等のメタノール資化性
酵母はメタノールを単一の炭素源とし、アンモニアを単
一の窒素源として増殖することが可能である。メタノー
ルは細胞内においてホルムアルデヒドを経て蟻酸に酸化
され、最終的には炭酸ガスと水に分解される。メタノー
ル資化性酵母は、以上の反応を炭素源の異化代謝として
エネルギーを獲得するが、アミノ酸等の生体成分の合成
反応、即ち同化代謝につなげるためには、セリン回路と
呼ばれる代謝系を経ることが必要である。そして、酵母
に異種蛋白質を生産させるためには、増殖に必要なエネ
ルギーを上回るエネルギーの獲得や構成成分としてのア
ミノ酸の合成能力の増強が必要と考えられる。このため
には、代謝工学の観点から考えると、エネルギー獲得の
ための異化代謝系を活性化するとともに、アミノ酸合成
等の同化代謝系を活性化することが必要と考えられる。
酵母はメタノールを単一の炭素源とし、アンモニアを単
一の窒素源として増殖することが可能である。メタノー
ルは細胞内においてホルムアルデヒドを経て蟻酸に酸化
され、最終的には炭酸ガスと水に分解される。メタノー
ル資化性酵母は、以上の反応を炭素源の異化代謝として
エネルギーを獲得するが、アミノ酸等の生体成分の合成
反応、即ち同化代謝につなげるためには、セリン回路と
呼ばれる代謝系を経ることが必要である。そして、酵母
に異種蛋白質を生産させるためには、増殖に必要なエネ
ルギーを上回るエネルギーの獲得や構成成分としてのア
ミノ酸の合成能力の増強が必要と考えられる。このため
には、代謝工学の観点から考えると、エネルギー獲得の
ための異化代謝系を活性化するとともに、アミノ酸合成
等の同化代謝系を活性化することが必要と考えられる。
【００１１】従って本発明の目的は、異種蛋白質をコー
ドする遺伝子がメタノール添加により誘導し得るプロモ
ーターの制御下に置かれた遺伝子を導入し形質転換した
メタノール資化性酵母を培養して異種蛋白質を発現せし
むる際に、異種蛋白質の生産性を向上できる方法を提供
することにある。
ドする遺伝子がメタノール添加により誘導し得るプロモ
ーターの制御下に置かれた遺伝子を導入し形質転換した
メタノール資化性酵母を培養して異種蛋白質を発現せし
むる際に、異種蛋白質の生産性を向上できる方法を提供
することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成すべく成
された本発明は、異種蛋白質をコードする遺伝子を導入
し形質転換したメタノール資化性酵母を培養して異種蛋
白質を発現せしむる方法であって、メタノールを添加し
つつ、その量に対して一定の相関を有する量のセリン回
路における中間代謝物を添加することを特徴とするメタ
ノール資化性酵母の培養法である。以下、本発明を詳細
に説明する。
された本発明は、異種蛋白質をコードする遺伝子を導入
し形質転換したメタノール資化性酵母を培養して異種蛋
白質を発現せしむる方法であって、メタノールを添加し
つつ、その量に対して一定の相関を有する量のセリン回
路における中間代謝物を添加することを特徴とするメタ
ノール資化性酵母の培養法である。以下、本発明を詳細
に説明する。
【００１３】本発明では、メタノールにより誘導し得る
プロモーターの制御下に異種蛋白質をコードする遺伝子
を連結した発現ベクターにより形質転換されたメタノー
ル資化性酵母を使用する。
プロモーターの制御下に異種蛋白質をコードする遺伝子
を連結した発現ベクターにより形質転換されたメタノー
ル資化性酵母を使用する。
【００１４】本発明では、メタノール資化性酵母を宿主
として使用する。メタノール資化性酵母としては、例え
ばピキア属、ハンヌセラ属又はキャンディダ属に属する
ものを例示することができる。中でもピキア・パストリ
ス、ハンセヌラ・ポリモルファ又はキャンディダ・ボイ
ディニィ等を特に好ましい酵母として例示できる。
として使用する。メタノール資化性酵母としては、例え
ばピキア属、ハンヌセラ属又はキャンディダ属に属する
ものを例示することができる。中でもピキア・パストリ
ス、ハンセヌラ・ポリモルファ又はキャンディダ・ボイ
ディニィ等を特に好ましい酵母として例示できる。
【００１５】本発明の方法を用いることで、種々の異種
蛋白を効率的に生産することが可能となる。発現させる
異種蛋白質には特に制限がなく、ヒトやその他の哺乳動
物の蛋白質等が例示できる。中でも生理活性を有するヒ
ト蛋白質は医薬品等の分野において重要な蛋白質であ
り、本発明における重要な異種蛋白質として例示でき
る。このような生理活性を有するヒト蛋白質としては、
例えばインターロイキン６、インターロイキン６レセプ
ター及びこれらの誘導体からなる群から選ばれるものが
ある。
蛋白を効率的に生産することが可能となる。発現させる
異種蛋白質には特に制限がなく、ヒトやその他の哺乳動
物の蛋白質等が例示できる。中でも生理活性を有するヒ
ト蛋白質は医薬品等の分野において重要な蛋白質であ
り、本発明における重要な異種蛋白質として例示でき
る。このような生理活性を有するヒト蛋白質としては、
例えばインターロイキン６、インターロイキン６レセプ
ター及びこれらの誘導体からなる群から選ばれるものが
ある。
【００１６】以上のような異種蛋白質をコードする遺伝
子は、メタノールによって誘導し得るプロモーターの制
御下（下流側）に連結して使用する。該プロモーター
は、メタノール代謝系の酵素をコードする遺伝子発現の
ためのプロモーターであり、例えばピキア・パストリス
から単離されたアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモ
ーターなどが例示できる。異種蛋白質をコードする遺伝
子をプロモーターの制御下に連結した遺伝子を含む発現
ベクターを用いて酵母を形質転換する方法としては通常
の方法が使用できる。
子は、メタノールによって誘導し得るプロモーターの制
御下（下流側）に連結して使用する。該プロモーター
は、メタノール代謝系の酵素をコードする遺伝子発現の
ためのプロモーターであり、例えばピキア・パストリス
から単離されたアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモ
ーターなどが例示できる。異種蛋白質をコードする遺伝
子をプロモーターの制御下に連結した遺伝子を含む発現
ベクターを用いて酵母を形質転換する方法としては通常
の方法が使用できる。
【００１７】本発明は、培養中の酵母の状態をモニタリ
ングするために、ｐＨ、溶存酸素濃度、撹拌速度、温度
又は通気量等の酵母の増殖に関与する因子のうち一つ以
上をモニタリングし、かつ、制御しつつ実施することが
好ましい。このような培養を実施するための培養装置は
従来から知られており、市販の装置を使用することがで
きる。また、培養方法としては、メタノールを連続的又
は周期的に添加する以外は特に制限されず、回分培養
法、流加培養法、連続培養法等、従来使用されている方
法を使用することができる。
ングするために、ｐＨ、溶存酸素濃度、撹拌速度、温度
又は通気量等の酵母の増殖に関与する因子のうち一つ以
上をモニタリングし、かつ、制御しつつ実施することが
好ましい。このような培養を実施するための培養装置は
従来から知られており、市販の装置を使用することがで
きる。また、培養方法としては、メタノールを連続的又
は周期的に添加する以外は特に制限されず、回分培養
法、流加培養法、連続培養法等、従来使用されている方
法を使用することができる。
【００１８】メタノールの添加は、前記したように酵母
の増殖に関与する因子をモニタリングしつつ、ポンプ等
を用いて行えば良いが、該モニタリングの結果に応じて
添加量を自動的に制御することが特に好ましい。またそ
の添加時期は、異種蛋白質を発現せしめる際、即ち通常
であれば酵母の培養を開始し、細胞数が異種蛋白質を生
産するのに充分な量となった後に開始するのが好ましい
が、本発明はこれに制限されない。即ち、培養開始当初
からメタノールやセリン回路における中間代謝物を添加
する場合であっても本発明の実施の範囲である。なお、
メタノールの添加については、連続的又は周期的に添加
することが例示できるが、前記したモニタリングの結果
に従って不定期に添加する場合であっても、その際にメ
タノールの添加量に対して一定の相関を有する量のセリ
ン回路における中間代謝物を添加する場合は本発明の実
施の範囲である。
の増殖に関与する因子をモニタリングしつつ、ポンプ等
を用いて行えば良いが、該モニタリングの結果に応じて
添加量を自動的に制御することが特に好ましい。またそ
の添加時期は、異種蛋白質を発現せしめる際、即ち通常
であれば酵母の培養を開始し、細胞数が異種蛋白質を生
産するのに充分な量となった後に開始するのが好ましい
が、本発明はこれに制限されない。即ち、培養開始当初
からメタノールやセリン回路における中間代謝物を添加
する場合であっても本発明の実施の範囲である。なお、
メタノールの添加については、連続的又は周期的に添加
することが例示できるが、前記したモニタリングの結果
に従って不定期に添加する場合であっても、その際にメ
タノールの添加量に対して一定の相関を有する量のセリ
ン回路における中間代謝物を添加する場合は本発明の実
施の範囲である。
【００１９】本発明は、酵母を培養しつつメタノールを
添加して異種蛋白質をコードする遺伝子を発現させる培
養方法において、異種蛋白質を発現せしめる際、即ち少
なくとも導入した遺伝子を発現させて異種蛋白質を製造
させる際に、メタノールの添加量に対して一定の相関を
有する量のセリン回路における中間代謝物を添加し、こ
れによりメタノール資化酵母による異種蛋白質の生産を
増強するものである。酵母のセリン回路における中間代
謝物であり、本発明で使用できるものとしては、例え
ば、セリン、グリシン、ヒドロキシピルビン酸、オキザ
ロ酢酸、リンゴ酸、グリオキシル酸等を例示できる。中
でもセリン及び／又はグリシンを特に好ましいセリン回
路における中間代謝物として例示できる。これらは単独
で添加しても良いし、２種以上を混合して或いは別個に
添加しても良いが、２種以上使用する場合は総量が前記
したようにメタノールの添加量に対して相関を有するよ
うにすれば良い。
添加して異種蛋白質をコードする遺伝子を発現させる培
養方法において、異種蛋白質を発現せしめる際、即ち少
なくとも導入した遺伝子を発現させて異種蛋白質を製造
させる際に、メタノールの添加量に対して一定の相関を
有する量のセリン回路における中間代謝物を添加し、こ
れによりメタノール資化酵母による異種蛋白質の生産を
増強するものである。酵母のセリン回路における中間代
謝物であり、本発明で使用できるものとしては、例え
ば、セリン、グリシン、ヒドロキシピルビン酸、オキザ
ロ酢酸、リンゴ酸、グリオキシル酸等を例示できる。中
でもセリン及び／又はグリシンを特に好ましいセリン回
路における中間代謝物として例示できる。これらは単独
で添加しても良いし、２種以上を混合して或いは別個に
添加しても良いが、２種以上使用する場合は総量が前記
したようにメタノールの添加量に対して相関を有するよ
うにすれば良い。
【００２０】セリン回路における中間代謝物の添加はメ
タノールの添加と同様、例えばポンプ等を用いて行えば
良いが、メタノールの添加量に相関してその添加量が自
動的に制御されるようにすることが好ましい。
タノールの添加と同様、例えばポンプ等を用いて行えば
良いが、メタノールの添加量に相関してその添加量が自
動的に制御されるようにすることが好ましい。
【００２１】セリン回路における中間代謝物の添加量
は、例えばメタノールの添加量を単位時間当たりの添加
量として求め、該値に相関するように単位時間当たりに
添加されるべき量を決定することが例示できる。むろ
ん、周期的又は不定期にメタノールを添加するのであれ
ば、その添加の度に、メタノール添加量に相関するよう
に添加されるべき量を決定して添加することも可能であ
る。またセリン回路における中間代謝物の添加は、メタ
ノールの添加と完全に同時に行う必要はなく、時間的に
添加が多少ずれても良い。
は、例えばメタノールの添加量を単位時間当たりの添加
量として求め、該値に相関するように単位時間当たりに
添加されるべき量を決定することが例示できる。むろ
ん、周期的又は不定期にメタノールを添加するのであれ
ば、その添加の度に、メタノール添加量に相関するよう
に添加されるべき量を決定して添加することも可能であ
る。またセリン回路における中間代謝物の添加は、メタ
ノールの添加と完全に同時に行う必要はなく、時間的に
添加が多少ずれても良い。
【００２２】メタノールの添加量とセリン回路における
中間代謝物の添加量の相関関係は、該中間代謝物の添加
量／メタノールの添加量が重量比で１／１０〜１／５０
０の範囲内、好ましくは１／５０〜１／２００の範囲内
である。この相関関係は一回の培養操作の間一定とする
必要はなく、前記範囲内であれば変更することもでき
る。
中間代謝物の添加量の相関関係は、該中間代謝物の添加
量／メタノールの添加量が重量比で１／１０〜１／５０
０の範囲内、好ましくは１／５０〜１／２００の範囲内
である。この相関関係は一回の培養操作の間一定とする
必要はなく、前記範囲内であれば変更することもでき
る。
【００２３】
【発明の実施の形態】以下、実施例に基づき本発明を更
に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるもの
ではない。
に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるもの
ではない。
【００２４】実施例１ メタノール資化性酵母としてピキア・パストリス、メタ
ノールで誘導されるプロモーターとしてアルコールオキ
シダーゼ１のプロモーター（ＡＯＸ１）を用い、ヒトイ
ンターロイキン６レセプター（以下ＩＬ−６Ｒと略す
る）を異種蛋白質として発現させた。
ノールで誘導されるプロモーターとしてアルコールオキ
シダーゼ１のプロモーター（ＡＯＸ１）を用い、ヒトイ
ンターロイキン６レセプター（以下ＩＬ−６Ｒと略す
る）を異種蛋白質として発現させた。
【００２５】１００ｍＬの培地（１ＬあたりＨ３ＰＯ４
３ｇ、Ｋ２ＳＯ４ ２．３８ｇ、ＫＯＨ ０. ６５
ｇ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．１５ｇ、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ １．９ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １．４ｍ
ｇ、ＫＩ ０．１８ｍｇ、ＭｎＳＯ・Ｈ２Ｏ ０．７ｍ
ｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ
３ ０．００５ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１２
ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ４．７ｍｇ、ＦｅＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ １５．２ｍｇ、ビオチン ０．０４６ｍ
ｇ、グリセロール １０ｇを含む）が仕込まれた５００
ｍＬ容量の振とうフラスコに２０％グリセロール凍結菌
株を接種し、３０℃で２０時間振とう培養し前培養とし
た。
３ｇ、Ｋ２ＳＯ４ ２．３８ｇ、ＫＯＨ ０. ６５
ｇ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．１５ｇ、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ １．９ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １．４ｍ
ｇ、ＫＩ ０．１８ｍｇ、ＭｎＳＯ・Ｈ２Ｏ ０．７ｍ
ｇ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ
３ ０．００５ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．１２
ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ４．７ｍｇ、ＦｅＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ １５．２ｍｇ、ビオチン ０．０４６ｍ
ｇ、グリセロール １０ｇを含む）が仕込まれた５００
ｍＬ容量の振とうフラスコに２０％グリセロール凍結菌
株を接種し、３０℃で２０時間振とう培養し前培養とし
た。
【００２６】１Ｌの培地（１ＬあたりＨ３ＰＯ４ １８
ｇ、Ｋ２ＳＯ４ １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、Ｃ
ａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
１１．７ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ８．４ｍｇ、Ｋ
Ｉ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ ４．２ｍｇ、Ｎａ
ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ ０．０
３ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ
４・７Ｈ２Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ９１
ｍｇ、ビオチン ０．２８ｍｇ、グリセロール２５ｇを
含む）が仕込まれた２Ｌ容量のジャーファーメンター
（オリエンタル酵母（株）製）に前培養液１００ｍＬを
接種し、３０℃にて通気攪拌培養を開始した。ｐＨ調整
及び窒素源添加の目的でアンモニア水を添加した。
ｇ、Ｋ２ＳＯ４ １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、Ｃ
ａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
１１．７ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ８．４ｍｇ、Ｋ
Ｉ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ ４．２ｍｇ、Ｎａ
ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ ０．０
３ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ
４・７Ｈ２Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ９１
ｍｇ、ビオチン ０．２８ｍｇ、グリセロール２５ｇを
含む）が仕込まれた２Ｌ容量のジャーファーメンター
（オリエンタル酵母（株）製）に前培養液１００ｍＬを
接種し、３０℃にて通気攪拌培養を開始した。ｐＨ調整
及び窒素源添加の目的でアンモニア水を添加した。
【００２７】培養開始後２４時間後より、発現誘導及び
炭素源補充の目的でメタノールを添加した。発酵用オン
ラインメタノールセンサー（エイブル株式会社製アルコ
ールセンサー）にて培養液中のメタノール濃度を連続的
に測定しメタノールが０．８〜１．２％の範囲になるよ
うにメタノールをチュービングポンプにて自動的に添加
した。セリン１０％水溶液を調製し、リザーバーに仕込
んだ。単位時間当たりに添加されるメタノールの重量に
対して、セリン１０％（重量／重量）水溶液として１／
１０の重量が単位時間当たりに添加されるように、メタ
ノールの添加に連動してセリン水溶液を添加した。これ
により、本例においては、単位時間当たりのセリンの添
加重量はメタノールの添加量の１／１００となる。
炭素源補充の目的でメタノールを添加した。発酵用オン
ラインメタノールセンサー（エイブル株式会社製アルコ
ールセンサー）にて培養液中のメタノール濃度を連続的
に測定しメタノールが０．８〜１．２％の範囲になるよ
うにメタノールをチュービングポンプにて自動的に添加
した。セリン１０％水溶液を調製し、リザーバーに仕込
んだ。単位時間当たりに添加されるメタノールの重量に
対して、セリン１０％（重量／重量）水溶液として１／
１０の重量が単位時間当たりに添加されるように、メタ
ノールの添加に連動してセリン水溶液を添加した。これ
により、本例においては、単位時間当たりのセリンの添
加重量はメタノールの添加量の１／１００となる。
【００２８】培養開始後２１０時間で培養を終了した。
培養液のＯＤを測定した結果、ＯＤ６００ｎｍの値は３
００であった。
培養液のＯＤを測定した結果、ＯＤ６００ｎｍの値は３
００であった。
【００２９】培養液を１００００×ｇで遠心分離し、上
清中のＩＬ−６Ｒの濃度をＥＩＳＡ法で定量したところ
５０ｍｇ／Ｌであった。なお、ＥＬＩＳＡによる定量に
は一次抗体としてマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒモノクローナ
ル抗体二次抗体としてウサギ抗ヒトＩＬ−Ｒポリクロー
ナル抗体を用い、検出にアルカリフォスファターゼ標識
ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。
清中のＩＬ−６Ｒの濃度をＥＩＳＡ法で定量したところ
５０ｍｇ／Ｌであった。なお、ＥＬＩＳＡによる定量に
は一次抗体としてマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒモノクローナ
ル抗体二次抗体としてウサギ抗ヒトＩＬ−Ｒポリクロー
ナル抗体を用い、検出にアルカリフォスファターゼ標識
ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。
【００３０】比較のため、前記と同じ菌株を用い、前記
同様の条件で２Ｌ容量のジャーファーメンターによる培
養を行った。但し、炭素源及び窒素源の流加はメタノー
ル及びアンモニアのみとし、セリン水溶液は添加しなか
った。
同様の条件で２Ｌ容量のジャーファーメンターによる培
養を行った。但し、炭素源及び窒素源の流加はメタノー
ル及びアンモニアのみとし、セリン水溶液は添加しなか
った。
【００３１】前記と同様に培養開始後２１０時間で培養
を終了し、培養液のＯＤを測定した結果、ＯＤ６００ｎ
ｍの値は３３０であった。また培養液を遠心分離して上
清のＩＬ−６Ｒの濃度をＥＬＩＳＡ法で定量したとこ
ろ、２０ｍｇ／Ｌであった。
を終了し、培養液のＯＤを測定した結果、ＯＤ６００ｎ
ｍの値は３３０であった。また培養液を遠心分離して上
清のＩＬ−６Ｒの濃度をＥＬＩＳＡ法で定量したとこ
ろ、２０ｍｇ／Ｌであった。
【００３２】このように、セリン水溶液を添加せずメタ
ノールのみを添加して形質転換酵母を培養した場合は、
セリン水溶液をメタノールに連動して流加した場合に比
べて半分以下のＩＬ−６Ｒの生産量しかなかった。
ノールのみを添加して形質転換酵母を培養した場合は、
セリン水溶液をメタノールに連動して流加した場合に比
べて半分以下のＩＬ−６Ｒの生産量しかなかった。
【００３３】実施例２ 実施例１と同じ菌株を用い、同様の条件で２Ｌ容量のジ
ャーファーメンターによる培養を行った。培地の組成は
実施例１と同様であり、その仕込み量は１Ｌであった。
本例においては、グリシン１０％（ｗ／ｗ）水溶液を用
い、その単位時間当たりの添加量を、メタノールの単位
時間当たりの添加量の１／１０とした。実施例１と同様
に培養開始後２１０時間で培養を終了し、培養液のＯＤ
を測定した結果、ＯＤ６００ｎｍの値は３３０であっ
た。また培養液を遠心分離して上清のＩＬ−６Ｒの濃度
をＥＬＩＳＡ法で定量したところ５５ｍｇ／Ｌであっ
た。 実施例３ グリシン１０％（ｗ／ｗ）水溶液の添加量をメタノール
の添加量の１／５とした以外は実施例２と同様の操作を
行った。前記と同様にして培養開始後２１０時間で培養
を終了し、培養液のＯＤを測定した結果、ＯＤ６００ｎ
ｍの値は３４０であった。培養液を遠心分離して上清の
ＩＬ−６Ｒの濃度をＥＬＩＳＡ法で定量したところ４５
ｍｇ／Ｌであった。
ャーファーメンターによる培養を行った。培地の組成は
実施例１と同様であり、その仕込み量は１Ｌであった。
本例においては、グリシン１０％（ｗ／ｗ）水溶液を用
い、その単位時間当たりの添加量を、メタノールの単位
時間当たりの添加量の１／１０とした。実施例１と同様
に培養開始後２１０時間で培養を終了し、培養液のＯＤ
を測定した結果、ＯＤ６００ｎｍの値は３３０であっ
た。また培養液を遠心分離して上清のＩＬ−６Ｒの濃度
をＥＬＩＳＡ法で定量したところ５５ｍｇ／Ｌであっ
た。 実施例３ グリシン１０％（ｗ／ｗ）水溶液の添加量をメタノール
の添加量の１／５とした以外は実施例２と同様の操作を
行った。前記と同様にして培養開始後２１０時間で培養
を終了し、培養液のＯＤを測定した結果、ＯＤ６００ｎ
ｍの値は３４０であった。培養液を遠心分離して上清の
ＩＬ−６Ｒの濃度をＥＬＩＳＡ法で定量したところ４５
ｍｇ／Ｌであった。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、異種蛋白質をコードす
る遺伝子を導入し形質転換したメタノール資化性酵母を
培養して異種蛋白質を発現させる際に、メタノールを添
加すると共に該メタノールの添加量に相関する量のセリ
ン回路における中間代謝物を添加するという簡単な操作
により異種蛋白質の発現量を増強することが可能とな
る。 従って本発明によれば、メタノール資化性酵母を
宿主として利用する場合に、従来よりも効率的に異種蛋
白質を生産することが可能となる。
る遺伝子を導入し形質転換したメタノール資化性酵母を
培養して異種蛋白質を発現させる際に、メタノールを添
加すると共に該メタノールの添加量に相関する量のセリ
ン回路における中間代謝物を添加するという簡単な操作
により異種蛋白質の発現量を増強することが可能とな
る。 従って本発明によれば、メタノール資化性酵母を
宿主として利用する場合に、従来よりも効率的に異種蛋
白質を生産することが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/38 Ｃ１２Ｎ 1/38 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｋ Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:72）
Claims (7)
- 【請求項１】異種蛋白質をコードする遺伝子を導入し形
質転換したメタノール資化性酵母を培養して異種蛋白質
を発現せしむる方法であって、メタノールを添加しつ
つ、その添加量に対して一定の相関を有する量のセリン
回路における中間代謝物を添加することを特徴とするメ
タノール資化性酵母の培養法。 - 【請求項２】酵母がピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌ
ラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）又はキャンディダ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ）属の酵母であることを特徴とする請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】酵母がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈ
ａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）又はキャン
ディダ・ボイディニィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎ
ｉ）種であることを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】遺伝子がコードする異種蛋白質が生理活性
を有するヒト蛋白質であることを特徴とする、請求項１
〜３いずれかの項に記載の方法。 - 【請求項５】生理活性蛋白質が、インターロイキン６、
インターロイキン６レセプター及びこれらの誘導体から
なる群から選ばれる生理活性蛋白質であることを特徴と
する請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】添加するメタノールに対して重量比で１／
１０〜１／５００のセリン回路における中間代謝物を添
加することを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】セリン回路における中間代謝物がセリン及
び／又はグリシンであることを特徴とする請求項１又は
６に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP147898A JPH11196868A (ja) | 1998-01-07 | 1998-01-07 | メタノール資化性酵母の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP147898A JPH11196868A (ja) | 1998-01-07 | 1998-01-07 | メタノール資化性酵母の培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11196868A true JPH11196868A (ja) | 1999-07-27 |
Family
ID=11502566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP147898A Pending JPH11196868A (ja) | 1998-01-07 | 1998-01-07 | メタノール資化性酵母の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11196868A (ja) |
-
1998
- 1998-01-07 JP JP147898A patent/JPH11196868A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cos et al. | Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters: a review | |
| Hélène et al. | High-level secretory production of recombinant porcine follicle-stimulating hormone by Pichia pastoris | |
| US8927256B2 (en) | Fermentation medias and processes thereof | |
| Minjie et al. | Process control and optimization for heterologous protein production by methylotrophic Pichia pastoris | |
| CN107937361B (zh) | 一种丙氨酸脱氢酶突变体及其应用 | |
| Strandberg et al. | Batch and fed batch cultivations for the temperature induced production of a recombinant protein in Escherichia coli | |
| CN113186147A (zh) | 一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法 | |
| Pons et al. | Influence of acetate on growth kinetics and production control of Saccharomyces cerevisiae on glucose and ethanol | |
| EP0794256B1 (en) | Method for culturing microorganisms having methanol metabolic pathway | |
| US6140077A (en) | Method for producing phytase | |
| CN112391329A (zh) | 一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用 | |
| Coppella et al. | α‐Factor directed expression of the human epidermal growth factor in Saccharomyces cerevisiae | |
| KR100405944B1 (ko) | 단백질 제조방법 | |
| JPH11196868A (ja) | メタノール資化性酵母の培養方法 | |
| JP4240558B2 (ja) | メタノール資化性酵母の培養法 | |
| CN109402039A (zh) | 一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法 | |
| JP2003530823A (ja) | 微生物発酵工程において組換え蛋白質の収率を高めるための方法 | |
| KR100677952B1 (ko) | 재조합 단백질 생산을 위한 재조합 숙주 세포의 배양방법 | |
| US20210371844A1 (en) | New mutant protein for improving malic acid yield | |
| CN101134963A (zh) | 重组人甲状旁腺素(1～34肽)的串联表达方法 | |
| CN110295213B (zh) | 一种基于指数流加补料原理的鲜味肽发酵生产方法 | |
| CN108265061B (zh) | 一种大规模制备重组人成纤维细胞生长因子21(fgf21)的生产方法 | |
| Pyun et al. | Effects of oxygen on invertase expression in continuous culture of recombinant Saccharomyces cerevisiae containing the SUC2 gene | |
| KR100528552B1 (ko) | 메탄올대사경로를가진미생물의배양방법 | |
| KR0177321B1 (ko) | 재조합 효모로부터 인간 알파 인터페론의 대량 생산 방법 |