JPH11190736A

JPH11190736A - 傷の診断用の試験片、装置および方法

Info

Publication number: JPH11190736A
Application number: JP10276389A
Authority: JP
Inventors: Tyrone C Hutchinson; タイロン・シー・ハッチンソン; Hansen P Swaniker; ハンセン・ピー・スワニカー
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-09-14
Publication date: 1999-07-13
Also published as: CA2247280A1; EP0902288A2; EP0902288A3; US5912114A

Abstract

(57)【要約】【課題】迅速かつ正確で非侵襲性の傷の状態を診断す
る方法を提供する。【解決手段】傷の滲出液中に存在するコルチゾール値
を定量化することにより、傷の状態の診断および評価を
行なう。加えて、当該診断および評価のための装置およ
び試験片を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は傷滲出液に存在する
コルチゾールの定量的な値による傷の診断および状態評
価に関する。また、本発明は傷の状態を評価するための
試験片、装置および方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルココルチコイドは副腎皮質により生
成されて分泌される。このグルココルチコイドは代謝と
免疫応答において重要な役割を果たし、主に、炎症抑制
に関与する。コルチゾールは人間の血漿中において発見
されたグルココルチコイドである。人体における内因性
グルココルチコイド供給のほぼ９５％はコルチゾールで
ある。体に病気や外傷のような生理的ストレスが作用す
ると、増加したコルチゾールが血流内に放出される。

【０００３】このコルチゾールの放出は視床下部におい
て開始する生理的カスケード応答により調整される。す
なわち、この視床下部はコルチコトロピン放出因子（Ｃ
ＲＦ）を生成し、このＣＲＦは下垂体前葉を刺激して副
腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を放出させる。この結
果、副腎がＡＣＴＨにより刺激されて付加的なコルチゾ
ールが分泌される。このようなストレス因子誘発性の生
理的要求が満足されると、下垂体前葉は刺激されてＡＣ
ＴＨの生成および放出を減少する（Howser,R.L. （１９
９５年）の「コルチコステロイド療法（Ｃorticosteroi
d Therapy)」（American Jounal of Nursing、第４４頁
〜第４９頁））。血漿コルチゾールの値は主に約０．０
０５ｎｇ／ｍｌおよび約０．０２０ｎｇ／ｍｌの間で変
化する。

【０００４】当該技術分野において、例えば、Fox,S.I.
（１９８４年）の「内分泌系ステロイドホルモン（The
Endocrine System,Steroid Hormones)」（Human Physio
logy,W.C.Ｂrown 出版、第５６４頁〜第５９５頁）に記
載されるように、血流中における遊離のコルチゾールは
細胞質コルチゾールと平衡関係にあるということが知ら
れている。しかしながら、外傷や病気のような生理的ス
トレス因子に応答して、そのようなコルチゾールの平衡
関係が無くなり、血液中のコルチゾール値がそのストレ
ス因子によって上昇する。

【０００５】傷の診断については、現在では、このよう
な傷を処置する業界においてまだ改善の余地がある。す
なわち、傷の診断は経験的に行なわれており、開業医等
の担当者の経験と知識によるところが大きい。しかしな
がら、糖尿性潰瘍、静脈うっ滞性の傷および床ずれのよ
うな傷の不適正な診断は望ましくない、あるいは、時に
深刻な事態を引き起こす場合がある。これまで、傷の視
覚的評価は傷の凡その深さ、幅および滲出液の状態を示
してきた。例えば、静脈うっ滞性の傷は継続的に滲出液
が出て、幅広で浅く（例えば、１センチメートル乃至２
センチメートルの深さ）なりやすい。また、糖尿性潰瘍
は静脈うっ滞性の傷に比してより乾いていてより深くな
りやすい。このような種類の傷は共に患者の下肢におい
て頻繁に見られる。すなわち、糖尿性潰瘍は一般に両足
の下側に見られ、静脈うっ滞性の傷は一般にふくらはぎ
や向こうずねに見られる。しかしながら、これらの傷は
胴体上部および腕にも見ることができる。また、視覚的
な傷の評価は、特に、慢性の傷の場合における適正な診
断法ではないことが知られている。つまり、傷の大きさ
の縮小や不快感の減少のような改善の兆候を示す多くの
患者が彼らの生命を守るために手足の切断を必要とする
場合もある壊疽を含む日和見感染症に発展することがあ
る。

【０００６】多くの場合、医者は傷の性質および実際の
程度を知らないので、侵襲性療法を初期的な視覚的傷評
価の後に指示することはない。例えば、壊死組織切除剤
（壊死組織を破壊する酵素）の使用が慢性または再燃性
の傷に不適切となることがある。また、誤診の床ずれに
使用される圧縮バンデージが実際の静脈うっ滞性の傷を
悪化させることになる場合もある。基本的に、医者は傷
が治りやすいか否かを知らないのである。それゆえ、慢
性すなわち非治癒性の傷を持つ患者には数ヶ月にわたる
試行錯誤の治療が行なわれる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者は傷
の状態を診断するための迅速かつ正確で非侵襲性の方法
を提供するものであり、同方法においては、適正な治療
と組織（例えば皮膚）移植の適否を評価するための傷の
合理的評価が可能になる。本発明により特異的に決定さ
れるように、慢性または悪化した傷は傷の滲出液におけ
る遊離のコルチゾールを測定することにより診断でき
る。本発明によって、傷の滲出液におけるコルチゾール
の増加値は、健康な患者における正常な血漿における値
に対して、大きな非治癒性の傷に相関関係があることを
見出している。また、本発明においては、傷の滲出液に
おけるコルチゾールの増加値が炎症や感染症に相関する
ことも分かった。すなわち、非治癒性の傷における炎症
や感染症の早期発見によって、医者は、進行した傷に対
処する薬物を使用する前に、抗生物質や抗炎症剤の投与
を開始できる。また、非治癒性の傷における炎症や感染
症の早期検出によって、組織（例えば皮膚）移植の拒絶
反応の可能性が分かる。

【０００８】また、本発明によって、傷治療の評価方法
が大幅に改善される。これまでは、医者は単に外観に基
づいて傷を治療していた。例えば、静脈うっ滞性の傷は
これまで抗生物質、アルギン酸塩包帯剤および／または
組織移植によって治療していた。しかしながら、このよ
うな方法は当たり外れがあり、その処方および／または
組織移植が妥当であれば、患者は短期間に回復するが、
その治療方法が不適であれば、患者は高費用の数ヶ月の
無駄な治療と付加的な組織移植を受けることになり得
る。一方、本発明によれば、医者はより迅速に、より正
確に、かつ、より非侵襲的に傷の性質を決定して短期間
で回復できる適切な治療を処方することができる。すな
わち、本発明は医者に傷の性質および程度についての決
定的な情報を提供することができる。さらに、侵襲性の
傷療法の適否も本発明により決定されるように患者の傷
の滲出液中のコルチゾール値によって決めることができ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は傷の診断、特
に、傷の状態の診断方法に関する。この場合の傷の状態
とは、傷が短期間（例えば数日）で治癒するものか、ま
たは、その傷が慢性的または悪化したものであって非治
癒性のものであるかを予知する可能性を意味する。この
ような非治癒性の傷は本明細書において不全な状態（in
competent)として特徴づけられる。傷の状態の診断は、
本発明によって最初に、診断医により迅速（例えば、２
日乃至５日）かつ正確に非侵襲的に行なわれる。

【００１０】本発明の一実施形態においては、傷の状態
は傷におけるコルチゾール値の計測により決定できる。
さらに、好ましい実施形態においては、傷の状態は傷の
滲出液をコルチゾールに対して反応する抗体と、一定時
間で、抗原−抗体複合体を形成するのに十分な条件下に
おいて、接触させることにより評価できる。この抗原−
抗体複合体はその後同定されて、従来法によりその量が
定量化される。

【００１１】別の実施形態においては、種々の連続的な
傷サンプルを得て、それぞれのコルチゾール値を、例え
ば、約３日から約７日のような適当な期間にわたって従
来法により定量化することによって、経時的な傷のコル
チゾール値における変化を決定する。さらに別の実施形
態においては、形成した複合体の量を健康体から得た対
照の血液サンプルと比較する。

【００１２】さらに、別の実施形態においては、約３日
から約７日の期間における対照または基準値に対する増
加した傷のコルチゾール値によって、医者は、移植拒絶
の可能性の増加によって、組織移植を回避すべきことを
知ることができる。

【００１３】好ましい実施形態においては、本発明は試
験片またはディップスティックに関し、当該片状スティ
ック上に抗原−抗体／ラベル複合体が形成されていて、
診断中の傷におけるコルチゾール値に相関する呈色反応
が行なわれる。

【００１４】本発明のさらに別の実施形態は区画化され
た装置に関し、当該装置は傷の状態を診断するためのコ
ルチゾールに反応する抗体を収容するように構成された
少なくとも１個の容器を備えている。

【００１５】本発明のさらに別の実施形態は存在するコ
ルチゾールの量を定量化して標準的な正常の血漿コルチ
ゾール値と傷のコルチゾール値を比較することによって
傷の部分における炎症や感染症の程度を診断する方法に
関する。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明は傷の状態を診断するため
の方法を提供する。本発明によれば、傷は皮膚の連続性
に破断部を生じる全ての損傷を言う。また、傷の状態と
は、数日から数ヶ月にわたって観察することによって、
傷が治癒性であるか非治癒性であるかが分かる傷の状態
を言う。

【００１７】本発明による治癒性の傷とは、正常な一連
の段階を経て良化するものを言う。この治癒段階には、
炎症、再構成、上皮形成および成熟が含まれる。また、
本発明による治癒性の傷とは、数日から数ヶ月を経て正
常または標準のコルチゾール値に減少するものを言う。

【００１８】炎症とは、体の傷に対する最初の生化学的
応答である。傷の部分における組織損傷によって不全シ
ステムが生じて、マスト細胞からヒスタミンが放出さ
れ、血管拡張や毛細管透過性の増加が引き起こされる。
キニンシステムもまた活性化されて、好中球が傷部分に
誘引される。このキニンはまた感覚神経末端部を刺激し
て痛みを引き起こす。

【００１９】毛細管が膨脹して透過性が高まると、流体
は傷ついた組織に流れ込む。傷の滲出液には血漿、たん
ぱく質、抗体、赤血球および白血球、および血小板が含
まれる。

【００２０】傷治癒の第２の段階は再構成である。この
再構成段階においては、マクロファージが線維芽細胞を
傷に誘引してコラーゲンの生成を刺激する成長因子を生
成する。この再構成においては、傷が組織構成を開始す
るので、傷の表面積が減少する。通常、この再構成段階
は約２４日継続する。

【００２１】次に、傷治癒の第３段階は上皮形成であ
る。この段階において、傷は上皮細胞および瘢痕組織に
より被覆され、その傷の表面積は減少し続ける。さら
に、最終の成熟段階においては、瘢痕組織が整形されて
正常組織と同等になる。この成熟段階は１年以上にわた
って継続し得る。

【００２２】本発明によれば、例えば、糖尿性の傷、静
脈うっ滞性の傷または床ずれのような非治癒性または不
全な傷は傷の回復処理による良化が抑止されて慢性的に
炎症しているものとして特徴づけられる。生理的には、
非治癒性の傷は金属結合たんぱく酵素のような酵素量の
増加の結果による細胞外基質（ＥＣＭ）の機能亢進性の
衰弱により特徴づけられる。さらに、不全な傷は約３０
ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌのコルチゾール値を
有するものとして特徴づけられる。また、不全な傷は、
本発明によれば、数日乃至数週にわたる期間においてコ
ルチゾールが増加するものとして特徴づけられる。加え
て、不全な傷は数ヶ月乃至数年にわたって存在する傷と
して定義される。

【００２３】傷の診断は傷の滲出液におけるコルチゾー
ルの量を計測または検出することによって正確に決定で
きる。さらに、傷の診断は傷の滲出液サンプルにおける
コルチゾールの量を標準または正常な血漿コルチゾール
の量と相関することによって決定できる。

【００２４】すなわち、（ａ）傷の滲出液をコルチゾー
ルに対して反応性の抗体と、一定時間で、抗原−抗体複
合体を形成するのに十分な条件下において接触させて、
形成した抗原−抗体複合体を検出する工程と、（ｂ）工
程（ａ）において得た複合体の量を定量化する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を繰り返して経時的な傷
のコルチゾール値における変化を決定する工程と、およ
び／または（ｄ）工程（ｂ）において得た複合体の量を
正常な血漿コルチゾールの量と比較する工程とから成
り、当該正常な血漿コルチゾール値に対するコルチゾー
ルの増加値が不全な傷に相関する傷の滲出液におけるコ
ルチゾールの計測方法が、本発明によって最初に、迅速
かつ正確に非侵襲的に行なわれる。

【００２５】本発明により、上記コルチゾール値が傷の
大きさ（以下の表１参照）、炎症および感染症の程度
（以下の表２参照）に相関することも分かった。特に、
傷のコルチゾールの増加値（健康個体からの正常な血清
コルチゾール値に対する）は大きな非治癒性の傷に相関
する。傷の大きさは例えば平面面積測定法による傷の表
面積の決定により測定される。なお、この平面面積測定
法は平面形状の境界線をトレースすることによりその面
積を測定する方法である。具体的には、傷の写真を取っ
て、その傷の境界線をトレースする。その後、傷の境界
線に基づく表面積がコンピュータ内に操作入力されて、
傷の大きさがその傷の境界線内に充填される画素数に基
づいて決定される。本発明においては、シグマスキャン
（SigmaScan)バージョン２．０（Jandel Scientific
社、サン・ラファエル、カリフォリニア州）および当該
技術分野において従来より使用されている同様の画像計
測ソフトウエアのようなコンピュータソフトウエアを用
いる。また、本発明においては、傷の大きさは傷の外周
部を計測することによっても評価できる。

【００２６】傷のコルチゾール増加値はまた組織移植拒
絶性の指示手段としても作用する。従って、本発明によ
れば、医者は、傷のコルチゾール値の増加に基づいて、
皮膚移植のような組織移植における失敗の可能性を予知
することができる。すなわち、皮膚移植しようとする部
位における増加した傷のコルチゾール値が、例えば、傷
治療用の薬物投与によりそのコルチゾール値を正常化す
るまで、皮膚移植が失敗する可能性があることを警告す
る役目を果たすことが知られている。

【００２７】また、増加した傷のコルチゾール値は傷の
部位における上述の定義のような炎症に対する標識とし
て作用する。従って、炎症は、（ａ）傷の滲出液をコル
チゾールに対して反応性の抗体と、一定時間で、抗原−
抗体複合体を形成するのに十分な条件下において接触さ
せて、形成した抗原−抗体複合体を検出する工程と、
（ｂ）工程（ａ）において得た複合体の量を定量化する
工程と、（ｃ）工程（ｂ）において得た複合体の量を正
常な血漿コルチゾールの量と比較する工程とから成り、
当該正常な血漿コルチゾール値に対するコルチゾールの
増加値が炎症に相関する本発明の方法によって診断でき
る。

【表１】傷の滲出液中のコルチゾール濃度と傷の大きさ患者サンプリングサンプリングコルチゾール濃度傷の大きさ認識記号点認識記号ｎｇ／ｍｌＳＤ画素数ＢＬＰ１Ｐ 180.4 10.2 11545 Ｐ２Ｍ 137.2 23.2 11545 Ｐ３１０ 229.7 23.3 14080 Ｐ４Ｃ８ 130.2 31.4 6717 Ｐ５Ｔ２７ 68.8 29.8 2571 ＥＤＰ１Ｃ９ 39.3 4.9 1781 Ｐ２Ｔ２ 62.0 3.9 5253 Ｐ３Ｔ５ 153.9 4.8 2255 ＥＪＲＰ１Ｉ検出不能 − 3963 Ｐ２Ｆ 40.3 10.1 3981 Ｐ３１Ｘ検出不能 − 2431 Ｐ４３Ｎ検出不能 − 2007 Ｐ５Ｃ２６検出不能 − 2477 ＪＹＰ１１Ｒ 38.8 2.6 11248 Ｐ２３Ｐ 38.1 1.2 11819 Ｐ３３Ｑ 43.0 0.0 11819 Ｐ４２Ｐ 91.7 n/a 8238 Ｐ５７２ 38.5 5.3 7153

【表２】患者Ｘ時間コルチゾールサンプル認識番号液体／血清濃度ｎｇ／ｍｌ１１．０２３２．３２２．０６９．０３３．０３４．３４６．０３５．１５２４．０４７．２６４８．０３８．０７７２．０１８．０

【００２８】本発明によれば、例えば、一定の有効期間
にわたる繰り返しの簡単な免疫評価によって、傷を診断
することができる。好ましくは、この「有効な期間」
は、約２ヶ月乃至約５ヶ月の間に１ヶ月に１回である。
さらに好ましくは、この有効期間は約３日乃至約７日に
わたって１日に１回である。例えば、約３日乃至約７日
の、有効期間にわたって特定の傷に対するコルチゾール
の各量が決まると、医者は適当な物理療法による正確な
評価を行なって最適な治癒と最小の治療コストが実現で
きる。例えば、不全な傷を認識する場合、医者は傷の部
位に対して有効な傷の看護品を迅速に使い始めることが
可能になる。例えば、３日乃至５日の期間にわたる傷の
コルチゾールの計測によって、増加または上昇するコル
チゾール値により医者が患者に適当かつ有効な看護品を
処方できるような基本線を得ることができる。なお、傷
のコルチゾール値が基準値に対して上昇している場合
は、基本線の設定に先立って有効な傷の看護品を使用し
てもよい。さらに、医者は後続の傷のコルチゾール値の
計測に基づいて、必要に応じて、看護品の投与を変更で
きる。このような有効な傷の看護品には、例えば、ハイ
ドロゲル、圧縮バンデージ、アンアブート（unaboot
s）、発泡包帯材、親水性コロイド、アルギン酸包帯
剤、鮮創剤および適当な抗生物質が含まれる。上記のよ
うにして不全な傷が認識されると、医者は治癒を早め患
者の不快を減少し多くの場合に手足の切断を防止する適
当な物理療法を処方することができる。

【００２９】本発明によれば、傷の滲出液の採集は少な
くとも２箇所で行なわれるのが好ましく、各傷において
３箇所の異なる場所で行なわれるのが好ましい。例え
ば、傷の滲出液はフィルター紙に吸収される。このフィ
ルター紙は傷に対して時計方向にあてがわれて、例え
ば、１２時，３時，６時，９時および中心位置において
傷の滲出液を吸収する。このサンプリングの方法は限定
的なものではないが、少なくとも２箇所乃至３箇所の傷
の場所で行なう必要がある。つまり、コルチゾール濃度
が各場所において異なるからである。しかしながら、傷
の滲出液は傷における単一の場所から吸収することもで
きる。その後、この傷の滲出液を従来法によりフィルタ
ー紙から抽出して、例えば、酵素結合免疫吸収評価（Ｅ
ＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）、ポリアクリルアミド電気泳動または放射線免疫評
価により評価する。

【００３０】好ましい抗体は抗コルチゾール・ラビット
抗体（Neogen社、レキシントン、ケンタッキー州）であ
る。而して、本発明は不全な傷を診断する方法を提供
し、当該方法は不全な傷における試験すべき個体から得
た傷の滲出液を、一定時間、抗原−抗体複合体を形成す
るのに十分な条件下でコルチゾールに反応する抗体に接
触させ、その抗原−抗体複合体を検出し定量化すること
を含む。

【００３１】別の実施形態において、本発明はまた傷に
おけるコルチゾールを検出する装置を提供する。本発明
によるこの装置は例えば実験室や病院において使用する
ことができる。一般的に、このコルチゾール検出装置は
少なくとも１個の抗コルチゾール抗体を含む。このよう
な抗コルチゾール抗体は標識分子（reporter molecule)
によりラベル化できるが、ラベル化していないものでも
よい。ただし、このようなラベル化していない抗体は標
識分子を含むように装置使用者により修飾される。この
装置は、例えば、標準または正の対照として作用する既
知濃度溶液のコルチゾールの第１の容器と、溶液中に遊
離する抗コルチゾール抗体の第２の容器と、上記第１の
抗体と反応する標識分子に供給結合する第２の抗体の溶
液を収容する第３の容器を含むように区分化されてい
る。さらに、第４の容器および第５の容器は上記標識分
子の視覚化に適する基質または試薬を収容する。

【００３２】好ましい実施形態において、本発明は迅速
な傷診断用のコルチゾール反応性のラベル化した抗体を
浸潤した試験片またはディップスティックに関する。こ
の試験片またはディップスティックは例えば臨床的に若
しくは実験室等において使用できる。

【００３３】本発明の試験片またはディップスティック
は例えば抗体と発色体基質を塗布した非多孔質材料によ
り形成できる。所望の傷サンプルをこの装置に接触させ
ると、例えば、抗体／基質および傷に存在するコルチゾ
ールが反応して装置上で呈色反応を起こす。

【００３４】また、別の実施形態においては、上記装置
は試験片とすることができ、上記抗体／基質は例えば繊
維状の材料片の長さ方向に沿って１個以上の領域に収容
されている。この試験片の一端部を傷の滲出液における
コルチゾールに接触すると、同液はその繊維状材料に沿
って移動する。この時、抗体／基質の反応と検出可能な
標識により傷の滲出液中のコルチゾールの存在が分か
る。すなわち、カラーチャートにより色の深さとコルチ
ゾールの量が相関づけられる。例えば、極めて薄い赤色
は正常値（例えば、０．００５ｎｇ／ｍｌ乃至０．０２
０ｎｇ／ｍｌ）のコルチゾールを示し、深い赤色は例え
ば２３０ｎｇ／ｍｌのコルチゾールを示す。また、試験
片の計測領域はコルチゾール基質と不動の抗コルチゾー
ル抗体を収容する幾つかの部位を含む。つまり、これら
の検出部位は異なる量、すなわち、第１の検出部位にお
いてより多量で後続の部位においてより少量に基質およ
び不動の抗コルチゾール抗体を含む。例えば、２０ナノ
グラムの抗体が２０ｎｇ／ｍｉｎ／ｍｌの当量のコルチ
ゾールを捕捉すれば、この試験片の第１の検出部位は４
０ナノグラムの抗コルチゾール抗体を含むが、後続部位
は６０，８０，１００および１２０ナノグラム等の抗体
を含む。傷の滲出液の付加によって、検出可能な標識を
表示する部位の数が傷の滲出液サンプルにおけるコルチ
ゾールの量を定量的に示す。

【００３５】また、本発明の試験片またはディップステ
ィックは、コルチゾールを含む試験サンプルが毛細管ま
たは浸透作用により移動できるような、吸収性、多孔質
の適当なクロマトグラフまたは毛細管材料であればよ
い。さらに、この試験片はセルロース材およびニトロセ
ルロース材、ファイバーグラス、布、シリカゲルのよう
な多孔質ゲル、アガロース、デキストランおよびゼラチ
ン等の材料により形成することもできるが、これに限定
されない。この試験片は一定の固有強度を有する必要が
あり、さもなければ、補助的支持材による強度賦与が可
能である。

【００３６】この試験片またはディップスティックの寸
法は傷の大きさや医者の特別な要求等によって決められ
る。患者の傷の滲出液におけるコルチゾールの存在は異
なる種類の免疫評価において当該技術分野で従来から使
用されている抗体を用いて検出できる。例えば、Harlow
他（１９８８年）の抗体：実験室マニュアル（ＣoldSpr
ing Harbor 出版）およびＥＬＩＳＡ技法および放射線
免疫評価法をそれぞれ含む米国特許第４，０１６，０４
３号および同第４，４２４，２７９号のような参考文献
に記載される広範な免疫評価技法が利用できる。もちろ
ん、上記文献は単一部位および２部位または非競争型の
「サンドイッチ法」ならびに競争型の結合評価方法を含
む。このサンドイッチ評価法は最も有用かつ一般的に用
いられている方法の一つである。このサンドイッチ評価
法には多数の変更態様が存在し、これらの全ては本発明
の範囲に入る。要するに、上記の典型的な評価法におい
ては、ラベル化されていない抗体は個体基質において不
動であり、試験すべきサンプルは結合した分子に接触す
る。適当な反応時間、すなわち、抗原−抗体の二成分複
合体を形成するのに十分な時間の経過後に、第２の検出
可能な標識を生成し得る標識分子によりラベル化された
抗体が加えられて抗体−ラベル化抗体から成る三成分複
合体の形成に足る時間において反応が行われる。その
後、未反応材料が全て洗い出されて、抗原の存在が標識
分子により生成された標識の観察により決定される。こ
の評価結果は視覚可能な標識の簡単な観察により定量的
に行なうことができ、また、既知量のコルチゾールを含
む対照サンプルとの比較による定量化も行なうことがで
きる。

【００３７】上述の評価方法の変更態様には、サンプル
とラベル化抗体を結合抗体に同時に加える同時評価法
や、ラベル化抗体と試験すべきサンプルとまず組合せて
反応させた後にラベル化していない表面の結合抗体に加
える逆評価法が含まれる。これらの技法は当業者におい
て周知であり、補足的な変形を考案することは容易であ
る。すなわち、ここで使用する「サンドイッチ評価法」
は基本的な二部位評価技法における全ての変形例を包含
するように構成されている。

【００３８】コルチゾールは競争結合評価法により検出
することも可能であり、この評価法においては、コルチ
ゾールに特異的な一定量の抗体を未知量のコルチゾール
を含む一定量のサンプルと検出可能にラベル化した既知
量のコルチゾールを含む溶液に混合する。ラベル化した
分子とラベル化していない分子が抗体において有効な結
合部位に競争して反応する。遊離の抗体結合分子の相分
離によって、各層中に存在するラベル体の量が計測で
き、これによって、試験サンプルにおける抗原の量が指
示できる。

【００３９】適当な任意の既知の免疫評価法において、
実施上の目的から、抗体または抗原の一方が主に固相に
結合し、第２の分子、すなわち、サンドイッチ評価法ま
たは競争結合評価法のいずれかにおける第２の抗体、既
知量の抗原が検出可能なラベルまたは標識分子を担持し
て抗体−抗原反応の視覚的検出を可能にする。サンドイ
ッチ評価法におけるように、２種の抗体を用いる場合、
これらの抗体の一方がコルチゾールに対して特異的であ
ればよい。以下に、典型的な前方サンドイッチ評価法を
説明するが、その一般的技法は免疫評価法のいずれにも
適用できると解するべきである。

【００４０】典型的な前方サンドイッチ評価法において
は、コルチゾールに対して特異性を有する第１の抗体が
共有結合的または受動的に固体表面に結合する。この固
体表面は主にポリマーであり、最も一般に用いられるポ
リマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、
ポリスチレン、塩化ポリビニルまたはポリプロピレンで
ある。この固体の支持体はスティック状、チューブ、ビ
ーズ、ディスクまたはマイクロプレートのような免疫評
価を行なうのに適する任意の形状であればよい。この結
合処理は当業界において周知であり、一般に架橋、共有
結合または分子の不溶性キャリヤに対する物理的吸着か
ら成る。この結合処理に続いて、ポリマー−抗体複合体
はテストサンプル作成用に洗浄される。次いで、試験す
べきサンプルの一部をその固相複合体に加えて、抗体に
存在するサブユニットが全て結合するに足る時間で、約
４℃乃至約３７℃の適当な温度範囲（例えば２５℃）に
おいて反応する。この反応時間は場合により変化する
が、一般に、約１分乃至４０分乃至数時間の範囲であ
る。この反応に続いて、抗体サブユニット固相は洗浄乾
燥されて、上記第１の抗体に特異的な第２の抗体との反
応が行なわれる。この第２の抗体は当該第２の抗体の第
１の抗体に対する結合を示すために使用する標識分子に
結合している。また、第１の抗体を当該第１の交代のコ
ルチゾールに対する単一工程における結合を示すために
使用する標識分子に結合してもよい。

【００４１】本明細書および特許請求の範囲における
「標識分子（reporter molecule)」とは、その化学的性
質によって抗原−結合抗体の検出を可能にする分析的に
認識可能な信号を供給する分子を意味する。この検出は
定量的または定性的のいずれでもよい。この種の評価に
おいて大半の一般に使用されている標識分子は放射線同
位体、酵素、蛍光発光体または放射線核種を含む分子で
ある。好ましい標識分子はヒドラジンである。さらに、
最も好ましい標識分子は２，４−ジニトロフェニルヒド
ラジンである。

【００４２】酵素免疫評価の場合、一般的にグルタルア
ルデヒドまたはぺリオデートによって、酵素は第２の抗
体と結合する。なお、容易に認識できることであるが、
当業界において容易に行なえる、広範に異なる結合手法
が存在する。一般に用いられる酵素には、西洋わさびパ
ーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラク
トーシダーゼおよびアルカリホスファターゼ等が含まれ
る。また、上記特定酵素と共に用いられる基質として
は、一般に、対応する酵素による加水分解時に検出可能
な色変化を生ずるように選択される。例えば、ｐ−ニト
ロフェニルホスフェートはアルカリホスファターゼ結合
に伴う使用に適している。なお、上述の発色性基質の代
わりに蛍光発光物質を生じる蛍光原基質の使用も可能で
ある。一実施形態において、酵素ラベル化抗体が第１抗
体−コルチゾール複合体に加えられて結合し、過剰の試
薬が洗浄で除かれる。その後、適当な基質を含む溶液が
この抗体−抗原−抗体から成る三成分複合体に加えられ
る。この基質は第２抗体に結合する酵素と反応して定性
的な視覚信号を生じ、この信号はさらに、例えば、分光
分析によって定量化されてサンプルに存在するコルチゾ
ールの量を呈示する。

【００４３】また、フルオレセインやローダミンのよう
な蛍光化合物は抗体とその結合能力を変えることなく化
学的に結合できる。この結果、特定波長の光の照射によ
り活性化すると、蛍光発光ラベル化した抗体はその光エ
ネルギーを吸収して分子における励起状態を生じ、光マ
イクロスコープにより視覚的に検出可能な特定の色の光
を発光する。この蛍光ラベル化した抗体は上記第１抗体
−コルチゾール複合体に結合可能である。未結合試薬を
洗い除いた後、残った三成分複合体を適当な波長の光に
曝すことにより観察できる蛍光によってコルチゾールの
存在が分かる。このような免疫蛍光技法は当該技術分野
において極めて高度に確立されている。しかしながら、
化学的発光物質や生物発光分子のような他の標識分子も
また使用することができる。なお、必要な目的に適合す
るためにその処理を変更することは当業者においては極
めて容易かつ明らかなことである。

【００４４】以下、実施例において、本発明をさらに詳
述する。実施例１傷滲出液サンプルの作成傷滲出液サンプルを、Tegapore（登録商標）プレフィル
タを静脈うっ滞性傷上に配置して収集した。サンプルを
各患者に対して同日のほぼ同時間に集めた。このサンプ
リング方法は限定的ではないが、各患者の固体別の生理
作用の結果としてのコルチゾール作用の変動を制限する
ために時間を一致させる。このプレフィルタは、例え
ば、細胞外たんぱく質、細胞破片および傷跡組織が第２
のTegaporeフィルターに拡散することを防ぐので、精製
された傷滲出液がこの第２フィルターに吸収される。予
め計量したTegaporeフィルターをTegapore（登録商標）
プレフィルターの上に配置する。傷滲出液サンプルを再
計量収集フィルター紙により定量化して、傷滲出液の量
を差し引くことにより計算する。その後、傷滲出液サン
プルを、０．１％ＳＤＳを含む１０ｍＭトリエタノール
アミン（ｐＨ７．４）の４９倍溶液（５０：１希釈液）
を一晩震盪して、フィルターから抽出した。

【００４５】患者ＢＬは静脈うっ滞性傷の兆候を現し、
１８０．４ｎｇ／ｍｌの初期（同日）コルチゾール濃度
および１１５４５画素数の傷サイズを示した。Ｐ２にお
いては、コルチゾール濃度は低下（１３７．２ｎｇ／ｍ
ｌ）したが、傷サイズはそのままであった。このＰ１お
よびＰ２におけるコルチゾール濃度の差は同一傷におけ
る２個の異なる部位でのサンプリングによるものであ
る。Ｐ２とＰ３との間には約１ヶ月の時間経過がある。
このＰ３において、濃度は増加（２２９．７ｎｇ／ｍ
ｌ）し、これに付随して傷サイズの増加（１４０８０画
素数）した。６週間後、傷コルチゾール値はＰ１の値以
下に減少（１３０．２ｎｇ／ｍｌ）し、傷サイズも減少
（６７１７画素数）した。初期計測から約６ヶ月後、患
者ＢＬは６８．８ｎｇ／ｍｌの傷コルチゾール濃度で２
５７１画素数（図２（Ａ）および図２（Ｂ）参照）にな
っていた。患者ＢＬの各サンプリングポイントを防腐剤
のINADINE （登録商標）で処置した。

【００４６】患者ＥＤは足の潰瘍を有していて、３９．
３ｎｇ／ｍｌの初期コルチゾール濃度で１７８１画素数
（Ｐ１）の傷サイズであった。５ヶ月後（すなわちＰ２
において）、ＥＤは傷滲出液のコルチゾール濃度が増加
（６２．０ｎｇ／ｍｌ）し、傷サイズも増加（５２５３
画素数）した。１ヶ月後（Ｐ３）、ＥＤはさらに増加
（１５３．９ｎｇ／ｍｌ）したコルチゾール値と減少し
た傷サイズ（２２５５画素数）を示した。この増加した
コルチゾール値は不充分な傷滲出液サンプルに帰因する
（図３（Ａ）および図３（Ｂ）参照）。患者ＥＤは初期
（Ｐ１）に抗生物質（FLＡMAZINE（登録商標））とTELF
A （登録商標）包帯剤により処置されている。Ｐ２にお
いて、アルギネートゲル包帯剤と抗生物質BACTEROBAN
（登録商標）を投与した。

【００４７】患者ＥＪＲは静脈うっ滞性傷を有している
が３ヶ月にわたって計測可能な傷滲出液のコルチゾール
値を示さなかった。ＥＪＲは３９６３画素数の傷サイズ
を呈しており、このサイズは上記計測期間において減少
（図４（Ａ）および図４（Ｂ）参照）した。ＥＪＲはIN
ADINE （登録商標）、FLAMAZINE （登録商標）およびア
ルギネートゲル包帯剤により治療した。

【００４８】患者ＪＹは足の潰瘍を有していて、３８．
８ｎｇ／ｍｌの初期（Ｐ１）コルチゾール濃度と１１２
４８画素数の傷サイズを呈していた。４週間経過以前
に、ＪＹの傷を２回（Ｐ２およびＰ３）サンプリングし
た結果、安定した傷コルチゾール値であった。Ｐ４（Ｐ
１から約２ヶ月後）において、傷コルチゾール値は増加
（９１．７ｎｇ／ｍｌ）したが、傷サイズは減少した。
このＰ４におけるコルチゾール値の増加は不充分な傷滲
出液サンプルに起因する。Ｐ５において、傷コルチゾー
ル値は基準線（Ｐ１における３８．５ｎｇ／ｍｌ）に戻
り、傷サイズは７１５３画素数に増加した。Ｐ１乃至Ｐ
４においてINADINE （登録商標）を投与したが、Ｐ５
（図５（Ａ）および図５（Ｂ）参照）においてはIODOFL
EX（登録商標）防腐剤とINADINE （登録商標）を投与し
た。

【００４９】患者Ｘは急性および悪性の足の潰瘍を有し
ていて初期コルチゾール濃度が２３２．３ｎｇ／ｍｌで
あった。その後、７２時間にわたり、防腐剤（INADINE
(登録商標））により治療した結果、悪化が抑えられ、
傷コルチゾール値が１８ｎｇ／ｍｌに減少（表２参照）
した。

【００５０】実施例２ SigmaScan 画像計測ソフトウエアバージョン２．０（Ja
ndel Scientific 社、およびSPSS社）により傷マッピン
グの計測を行なった。この傷マッピングは傷サイズを正
確に計測できる。さらに、この傷マップはパーソナルコ
ンピュータ内に走査される。その後、SigmaScan ソフト
ウエアを傷マップ画像の面積計測に使用した。このソフ
トウエアによる「充填計測」方式を各傷の面積を計算す
るために用いた。特に、画素を計測単位として、各傷の
面積およびサイズを決定した。すなわち、面積を決定し
た傷マップの境界線内の空間を充填するのに要する画素
数により各傷の大きさを決定した。

【００５１】患者ＢＬの傷は約８ヶ月の治療期間中に４
回計測した。傷面積はＰ１およびＰ２に比してＰ３にお
いて増加するが、Ｐ４およびＰ５において徐々に減少
（図２（Ｂ）参照）する。

【００５２】患者ＥＤの傷は約４ヶ月の治療期間中に３
回計測した。傷面積はＰ１に比してＰ２において増加
し、Ｐ３において急激に減少（図３（Ｂ）参照）する。

【００５３】患者ＥＪＲの傷は３ヶ月の治療期間中に５
回計測した。傷面積はINADINE （登録商標）、FLAMAZIN
E （登録商標）およびアルギン酸塩傷包帯剤による治療
により減少した（図４（Ｂ）参照）。

【００５４】患者ＪＹの傷は７ヶ月の治療期間中にほぼ
１ヶ月毎に計測した。Ｐ３とＰ５の間で傷サイズはINAD
INE （登録商標）による治療によって減少した。

【００５５】実施例３コルチゾールディップスティック評価発色性基質および２，４−ジニトロフェニルヒドラジン
のような標識分子を不動性の抗コルチゾール抗体を有す
るフィルター紙片に供給して乾燥した。この基質／標識
分子の量はコルチゾールとの反応により視覚的に検出可
能な反応が生じるように予め決められている。次に、こ
の紙片の先端を傷滲出液サンプルに接触させた。この試
験サンプルが増加量のコルチゾールを含めば、抗体／基
質複合体がコルチゾールと反応して検出可能な色変化を
生じる。

【００５６】本発明の具体的な実施態様は以下の通りで
ある。（１）前記診断方法がさらに、傷の滲出液をコルチゾ
ールに対して反応性の抗体と、一定時間で、抗原−抗体
複合体を形成するのに十分な条件下において接触させ
て、形成した抗原−抗体複合体を検出して定量化する工
程と、当該形成した抗原−抗体複合体の量を正常な血漿
コルチゾール値と比較する工程と、当該コルチゾール値
と傷の状態を相関する工程とから成る請求項１に記載の
方法。（２）前記抗体が抗コルチゾールラビット抗体である
実施態様（１）に記載の方法。（３）前記傷が皮膚潰瘍、糖尿性潰瘍、静脈うっ滞性傷
または床ずれである実施態様（１）に記載の方法。（４）さらに、前記第１容器の抗体を検出可能な標識分
子を収容するように構成された少なくとも１個の第２の
容器から成る請求項２に記載の区画化された装置。（５）前記標識分子が酵素、放射線同位体、蛍光発光性
分子、化学発光性分子または生物発光性分子から成る実
施態様（４）に記載の区画化された装置。

【００５７】（６）さらに、血漿コルチゾール基準物を
収容するように構成された少なくとも１個の第３の容器
から成る実施態様（４）に記載の区画化された装置。（７）前記抗体が抗コルチゾールラビット抗体である請
求項３に記載の試験片。（８）前記標識分子が２，４−ジニトロフェニルヒドラ
ジンである請求項３に記載の試験片。（９）さらに、請求項３の試験片に傷滲出液を接触させ
る工程からなる実施態様（１）に記載の方法。（１０）前記工程（ａ）および（ｂ）が約３日乃至約７
日内に繰り返される請求項６に記載の方法。

【００５８】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
迅速かつ正確で非侵襲性の傷の状態を診断する方法が提
供でき、同方法においては、適正な治療と組織移植の適
否を評価するための傷の合理的評価が可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ステロイドホルモン（Ｈ）の目的細胞への作用
のメカニズムを示す図である。

【図２】（Ａ）は患者ＢＬにおけるコルチゾール値と傷
サイズとの間の相関を示すグラフ図であり、（Ｂ）は形
状、大きさおよび滲出液サンプリング位置を示す患者Ｂ
Ｌの潰瘍性傷の傷マップ図である。

【図３】（Ａ）は患者ＥＤにおけるコルチゾール値と傷
サイズとの間の相関を示すグラフ図であり、（Ｂ）は形
状、大きさおよび滲出液サンプリング位置を示す患者Ｅ
Ｄの潰瘍性傷の傷マップ図である。

【図４】（Ａ）は患者ＥＪＲにおけるコルチゾール値と
傷サイズとの間の相関を示すグラフ図であり、（Ｂ）は
形状、大きさおよび滲出液サンプリング位置を示す患者
ＥＪＲの潰瘍性傷の傷マップ図である。

【図５】（Ａ）は患者ＪＹにおけるコルチゾール値と傷
サイズとの間の相関を示すグラフ図であり、（Ｂ）は形
状、大きさおよび滲出液サンプリング位置を示す患者Ｊ
Ｙの潰瘍性傷の傷マップ図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハンセン・ピー・スワニカーアメリカ合衆国、76017 テキサス州、アーリントン、コーンバレー・ドライブ 5227

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】傷におけるコルチゾール値を検出するこ
とから成る患者における傷の治癒状態を診断する方法。
【請求項２】コルチゾールに対して特異性を有する抗
体を収容するように構成された少なくとも１個の容器か
ら成る傷の状態を診断する区画化された装置。
【請求項３】傷の滲出液に接触してコルチゾールに対
応して特定の色を呈する標識分子に結合する抗体を有す
る支持面から成る傷滲出液試料を試験して増加コルチゾ
ール値を指示する試験片。
【請求項４】（ａ）傷の滲出液をコルチゾールに対し
て反応性の抗体と、一定時間で、抗原−抗体複合体を形
成するのに十分な条件下において接触させて、形成した
抗原−抗体複合体を検出する工程と、（ｂ）工程（ａ）において得た複合体の量を定量化する
工程と、（ｃ）工程（ｂ）において得た複合体の量を正常な血漿
コルチゾールの量と比較する工程とから成り、当該正常
な血漿コルチゾール値に対するコルチゾールの増加値が
不全な傷に相関する傷の治癒状態を検出する方法。
【請求項５】（ａ）傷の滲出液をコルチゾールに対し
て反応性の抗体と、一定時間で、抗原−抗体複合体を形
成するのに十分な条件下において接触させて、形成した
抗原−抗体複合体を検出する工程と、（ｂ）工程（ａ）において得た複合体の量を定量化する
工程と、（ｃ）工程（ｂ）において得た複合体の量を正常な血漿
コルチゾールの量と比較する工程とから成り、当該正常
な血漿コルチゾール値に対するコルチゾールの増加値が
炎症に相関するコルチゾール値を検出してその値と炎症
を相関する方法。
【請求項６】（ａ）傷の滲出液をコルチゾールに対し
て反応性の抗体と、一定時間で、抗原−抗体複合体を形
成するのに十分な条件下において接触させて、形成した
抗原−抗体複合体を検出する工程と、（ｂ）工程（ａ）において得た複合体の量を定量化する
工程と、（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を繰り返して経時的な傷
のコルチゾール値における変化を決定する工程とから成
る傷を評価するための方法。