JPH11166893A - 複数の広帯域フィルタと、そのためのハードウェアとを用いて、ピクセルのスペクトルに応じてピクセルをグループに分類するための方法 - Google Patents
複数の広帯域フィルタと、そのためのハードウェアとを用いて、ピクセルのスペクトルに応じてピクセルをグループに分類するための方法Info
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- JPH11166893A JPH11166893A JP10279276A JP27927698A JPH11166893A JP H11166893 A JPH11166893 A JP H11166893A JP 10279276 A JP10279276 A JP 10279276A JP 27927698 A JP27927698 A JP 27927698A JP H11166893 A JPH11166893 A JP H11166893A
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】
【解決手段】 発蛍光団から選択した単一の発蛍光団あ
るいは発蛍光団の組合せに関連させて複数のピクセルを
ピクセルのグループに分類するための方法。各発蛍光団
は特徴的な励起及び発光スペクトルと特定的な励起及び
発光ピークを持ち、この方法は次のステップからなる。
（ａ）複数の対の広帯域励起フィルタ及び広帯域の発光
フィルタを提供するステップ。（ｂ）広帯域励起フィル
タの一つを介した光でピクセルの各々の発蛍光団を励起
し、その対の発光フィルタを介して通過させた発光輝度
を記録するステップ。（ｃ）ピクセルの各々を、複数の
フィルタの対の数に等しい複数の次元からなるベクトル
によって表すことができるように、全ての複数対のフィ
ルタに対してステップ（ｂ）を繰り返すステップ。
（ｄ）各ピクセルにおける複数の発蛍光団の各々の存在
を評価するためにアルゴリズムを用いることによって、
単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させて
各ピクセルをピクセルのグループに分類するステップ。
るいは発蛍光団の組合せに関連させて複数のピクセルを
ピクセルのグループに分類するための方法。各発蛍光団
は特徴的な励起及び発光スペクトルと特定的な励起及び
発光ピークを持ち、この方法は次のステップからなる。
（ａ）複数の対の広帯域励起フィルタ及び広帯域の発光
フィルタを提供するステップ。（ｂ）広帯域励起フィル
タの一つを介した光でピクセルの各々の発蛍光団を励起
し、その対の発光フィルタを介して通過させた発光輝度
を記録するステップ。（ｃ）ピクセルの各々を、複数の
フィルタの対の数に等しい複数の次元からなるベクトル
によって表すことができるように、全ての複数対のフィ
ルタに対してステップ（ｂ）を繰り返すステップ。
（ｄ）各ピクセルにおける複数の発蛍光団の各々の存在
を評価するためにアルゴリズムを用いることによって、
単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させて
各ピクセルをピクセルのグループに分類するステップ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、複数の広帯域フィ
ルタを介したスペクトルによって、ピクセルをピクセル
のグループに分類することに関し、さらには、１ピクセ
ル内に存在する発蛍光団の量を測定することに関する。
特に、本発明は、本来の位置で蛍光彩色された染色体に
存在するピクセルをピクセルのグループに分類するため
の方法及び装置（この場合、各グループは、異なる染色
体から得られた遺伝物質に関わる）、そして、（ｉｉ）
それらピクセルに存在する発蛍光団の量を測定するため
の方法及び装置に関する。
ルタを介したスペクトルによって、ピクセルをピクセル
のグループに分類することに関し、さらには、１ピクセ
ル内に存在する発蛍光団の量を測定することに関する。
特に、本発明は、本来の位置で蛍光彩色された染色体に
存在するピクセルをピクセルのグループに分類するため
の方法及び装置（この場合、各グループは、異なる染色
体から得られた遺伝物質に関わる）、そして、（ｉｉ）
それらピクセルに存在する発蛍光団の量を測定するため
の方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛍光染料（すなわち、蛍光プローブ、発
蛍光団、蛍光色素、これらすべてをこの明細書では互換
的に用いる）を用いることは、組織及び及び細胞を分析
するための最も強力な、そして一般的な道具の一つであ
る。したがって、蛍光顕微鏡検査法は、光学顕微鏡検査
法に用いられる最も重要な実験方法の一つである（「蛍
光分光分析法の原理」 [Lakowicz (1983) Principles o
f fluorescence spectroscopy, Plenum Press, New Yor
k, London] を参照）。
蛍光団、蛍光色素、これらすべてをこの明細書では互換
的に用いる）を用いることは、組織及び及び細胞を分析
するための最も強力な、そして一般的な道具の一つであ
る。したがって、蛍光顕微鏡検査法は、光学顕微鏡検査
法に用いられる最も重要な実験方法の一つである（「蛍
光分光分析法の原理」 [Lakowicz (1983) Principles o
f fluorescence spectroscopy, Plenum Press, New Yor
k, London] を参照）。
【０００３】蛍光プローブの能力は、主に、特性染料が
結び付くことが可能な生物学的構造の素晴らしい多種多
様性によるものである（「生体医学における蛍光の応
用」 [Waggoner (1986) Applications of fluorescence
in the biomedical sciences,Eds. Taylor et al., Ne
w York: Alan R. Liss, Inc. pp. 3-28] を参照）。
蛍光プローブの詳細な論評については、「生物学の技術
シリーズ、 生物学的活動に対する蛍光及び発光性プロ
ーブ」 [Mason (editor) (1993) Fluorescent and Lumi
nescent Probes for Biological Activity, Biological
Techniques Series, edited by Sattelle, Academic P
ress Limited, London] 及び「蛍光顕微鏡検査法入門」
[Ploem and Tanke (1987) Introduction to Fluoresce
nce Microscopy, Oxford University Press, Royal Mic
roscopical Society]）を参照すべきである。
結び付くことが可能な生物学的構造の素晴らしい多種多
様性によるものである（「生体医学における蛍光の応
用」 [Waggoner (1986) Applications of fluorescence
in the biomedical sciences,Eds. Taylor et al., Ne
w York: Alan R. Liss, Inc. pp. 3-28] を参照）。
蛍光プローブの詳細な論評については、「生物学の技術
シリーズ、 生物学的活動に対する蛍光及び発光性プロ
ーブ」 [Mason (editor) (1993) Fluorescent and Lumi
nescent Probes for Biological Activity, Biological
Techniques Series, edited by Sattelle, Academic P
ress Limited, London] 及び「蛍光顕微鏡検査法入門」
[Ploem and Tanke (1987) Introduction to Fluoresce
nce Microscopy, Oxford University Press, Royal Mic
roscopical Society]）を参照すべきである。
【０００４】新しく、より洗練された多色の蛍光染料分
子の急速な開発は、これら染料の可能性をフルに利用可
能な、より進んだ蛍光結像技術を絶えず必要としてい
る。蛍光染料が今日の研究のやり方に革命的な衝撃をも
たらしたことへの論議については、「光学顕微鏡検査法
の新しいビジョン」 [Taylor et al. (1992) The New V
ision of Light Microscopy, American Scientist, Vo
l. 80, pp. 322-335] を参照すべきである。
子の急速な開発は、これら染料の可能性をフルに利用可
能な、より進んだ蛍光結像技術を絶えず必要としてい
る。蛍光染料が今日の研究のやり方に革命的な衝撃をも
たらしたことへの論議については、「光学顕微鏡検査法
の新しいビジョン」 [Taylor et al. (1992) The New V
ision of Light Microscopy, American Scientist, Vo
l. 80, pp. 322-335] を参照すべきである。
【０００５】多数の蛍光プローブの検出が有意義な利点
となる重要な例としては、 FISH （fluorescent in sit
u hybridization : 蛍光 DNA ハイブリダイゼーショ
ン）がある。 FISH は、染色体レベルで遺伝子を分析
し、遺伝子及び染色体の増幅、欠失、転座、配置替え、
その他の起こり得る遺伝子欠陥を見つけるために用いら
れる（「成長遺伝学とホルモン９」 [Emanuel (1993) G
rowth Genetics and Hormones 9, pp. 6-12] を参
照）。
となる重要な例としては、 FISH （fluorescent in sit
u hybridization : 蛍光 DNA ハイブリダイゼーショ
ン）がある。 FISH は、染色体レベルで遺伝子を分析
し、遺伝子及び染色体の増幅、欠失、転座、配置替え、
その他の起こり得る遺伝子欠陥を見つけるために用いら
れる（「成長遺伝学とホルモン９」 [Emanuel (1993) G
rowth Genetics and Hormones 9, pp. 6-12] を参
照）。
【０００６】多くの癌及び先天性異常を含む特定の病気
及び疾患は、いくつかの遺伝子の不良（すなわち突然変
異）によって起こされる遺伝子障害である。多くの他の
病気も、遺伝子の要素、すなわち、遺伝子欠陥が存在す
るためであると知られている、あるいは信じられてい
る。遺伝子欠陥は、単独では病気を引き起こさないが、
病気の発生に寄与する、あるいは、後に病気になる可能
性を増すものである。この現象は、本技術において多因
子の病気及び遺伝子的疾病素質として知られている。
及び疾患は、いくつかの遺伝子の不良（すなわち突然変
異）によって起こされる遺伝子障害である。多くの他の
病気も、遺伝子の要素、すなわち、遺伝子欠陥が存在す
るためであると知られている、あるいは信じられてい
る。遺伝子欠陥は、単独では病気を引き起こさないが、
病気の発生に寄与する、あるいは、後に病気になる可能
性を増すものである。この現象は、本技術において多因
子の病気及び遺伝子的疾病素質として知られている。
【０００７】明らかな遺伝子欠陥と既知の病気との相関
関係は、医者が決定的な診断を行い、多くの病気を早期
に発見し処置することを可能とする。遺伝カウンセリン
グは、その可能性がある親や、その危険性がある人々が
持つ、将来における潜在的に重大な医学的問題の可能性
を示し、それを阻止する注意を喚起することができる。
関係は、医者が決定的な診断を行い、多くの病気を早期
に発見し処置することを可能とする。遺伝カウンセリン
グは、その可能性がある親や、その危険性がある人々が
持つ、将来における潜在的に重大な医学的問題の可能性
を示し、それを阻止する注意を喚起することができる。
【０００８】８,０００以上もの遺伝子障害が確認され
たが、その多くのは同義遺伝子障害に関連している。染
色体が遺伝情報のキャリアであることが発見された後、
科学者は、特定の疾患に責任がある染色体が持つ、目に
見える欠陥を記録することが可能であると理論的に考え
た。
たが、その多くのは同義遺伝子障害に関連している。染
色体が遺伝情報のキャリアであることが発見された後、
科学者は、特定の疾患に責任がある染色体が持つ、目に
見える欠陥を記録することが可能であると理論的に考え
た。
【０００９】１９６０年代に、ガラスのスライドに広げ
られた分裂中期染色体の顕微鏡検査法に基づく分類のた
めに着色技術が開発された。過去数十年間、染色体のバ
ンディング・パターンの視覚的分析は、人間の遺伝子障
害を、分裂中期染色体の観察された構造的な異常へ関連
づけるために用いられている。染色体は、それらの長さ
に沿った特有の明暗のバンドを明らかにするために、通
常、ギームザ染色（Ｇバンディング）を施した後に明視
野顕微鏡検査法によって、あるいは、蛍光染色（Ｒ -
バンディング）の後に蛍光顕微鏡検査法によって調べら
れる。患者のバンディング・パターンを正常染色体のパ
ターンに注意深く比較することによって、奇形及び遺伝
病を起こす転座（染色体間あるいは染色体内における遺
伝物質の交換）、欠失（染色体あるいはその断片が欠け
ている）、付加、逆位等の異常が明らかになる。しかし
ながら、従来の染色体バンディング技術には分解能に限
界がある。
られた分裂中期染色体の顕微鏡検査法に基づく分類のた
めに着色技術が開発された。過去数十年間、染色体のバ
ンディング・パターンの視覚的分析は、人間の遺伝子障
害を、分裂中期染色体の観察された構造的な異常へ関連
づけるために用いられている。染色体は、それらの長さ
に沿った特有の明暗のバンドを明らかにするために、通
常、ギームザ染色（Ｇバンディング）を施した後に明視
野顕微鏡検査法によって、あるいは、蛍光染色（Ｒ -
バンディング）の後に蛍光顕微鏡検査法によって調べら
れる。患者のバンディング・パターンを正常染色体のパ
ターンに注意深く比較することによって、奇形及び遺伝
病を起こす転座（染色体間あるいは染色体内における遺
伝物質の交換）、欠失（染色体あるいはその断片が欠け
ている）、付加、逆位等の異常が明らかになる。しかし
ながら、従来の染色体バンディング技術には分解能に限
界がある。
【００１０】蛍光 DNA ハイブリダイゼーション（FIS
H）は、複数の補足的な技術の改良を受けて、過去２５
年間に渡って発展したものである。この技術は、染色体
上に遺伝子の正確な位置をマップし、染色体の、従来の
染色によっては目に見えない非常に小さな遺伝子欠陥を
も検出する良い道具を開発したいという、細胞遺伝学者
の願望によって生まれたものである。
H）は、複数の補足的な技術の改良を受けて、過去２５
年間に渡って発展したものである。この技術は、染色体
上に遺伝子の正確な位置をマップし、染色体の、従来の
染色によっては目に見えない非常に小さな遺伝子欠陥を
も検出する良い道具を開発したいという、細胞遺伝学者
の願望によって生まれたものである。
【００１１】ヒト・ゲノム・プロジェクト（HGP）、人
間のすべての遺伝子を識別しマップする大胆なイニシア
ティブは、 FISH に興味を示し、必要な DNA プローブ
の開発を早めた。現行の FISH 技術は、強力な免疫プロ
ーブの同時の開発、顕微鏡検査法及び分光分析法のため
の優秀な蛍光染料の多種多様な増加、そして蛍光顕微鏡
検査法に用いられる対物レンズ、照明装置及びフィルタ
ーの劇的な改良によって可能になった。
間のすべての遺伝子を識別しマップする大胆なイニシア
ティブは、 FISH に興味を示し、必要な DNA プローブ
の開発を早めた。現行の FISH 技術は、強力な免疫プロ
ーブの同時の開発、顕微鏡検査法及び分光分析法のため
の優秀な蛍光染料の多種多様な増加、そして蛍光顕微鏡
検査法に用いられる対物レンズ、照明装置及びフィルタ
ーの劇的な改良によって可能になった。
【００１２】FISH の性能及び実用性は、多くの要因に
よる。（ｉ） FISH は、単に、単離した染色体及び核に
用いられるばかりでなく、固定パラフィンに埋め込まれ
た組織内における細胞全体にも用いられる。（ｉｉ）比
較的小さな欠陥を検出できる（より小さな欠陥を検出す
るようにと、性能は常に改善されている）。（ｉｉｉ）
比較的速く結果を提供できる。（ｉｖ）適度なコスト
は、大部分の臨床検査室や研究所でそれが用いられるこ
とを可能にする。（ｖ）種々のプローブ及び試料タイプ
に使用できるように改良が可能である。（ｖｉ）短時
間、通常２時間ほどで、高い特定性及び感度が達成可能
である。
よる。（ｉ） FISH は、単に、単離した染色体及び核に
用いられるばかりでなく、固定パラフィンに埋め込まれ
た組織内における細胞全体にも用いられる。（ｉｉ）比
較的小さな欠陥を検出できる（より小さな欠陥を検出す
るようにと、性能は常に改善されている）。（ｉｉｉ）
比較的速く結果を提供できる。（ｉｖ）適度なコスト
は、大部分の臨床検査室や研究所でそれが用いられるこ
とを可能にする。（ｖ）種々のプローブ及び試料タイプ
に使用できるように改良が可能である。（ｖｉ）短時
間、通常２時間ほどで、高い特定性及び感度が達成可能
である。
【００１３】多くの FISH の用途において必要なこと
は、単に、細胞遺伝学者が、顕微鏡のアイピースを介し
て、あるいはモニタ上の画像において、蛍光ラベルが存
在するか否かを測定するだけである。幾分複雑な試料に
ついては、１あるいは２色のラベルを単純にカウントす
るだけでよい。しかしながら、デジタル画像を処理し、
それらから数値データを抽出する能力は、 FISH 技術に
新しい巨大な機能を加えるものである。
は、単に、細胞遺伝学者が、顕微鏡のアイピースを介し
て、あるいはモニタ上の画像において、蛍光ラベルが存
在するか否かを測定するだけである。幾分複雑な試料に
ついては、１あるいは２色のラベルを単純にカウントす
るだけでよい。しかしながら、デジタル画像を処理し、
それらから数値データを抽出する能力は、 FISH 技術に
新しい巨大な機能を加えるものである。
【００１４】適切な結像方法によって、かなり不明瞭な
FISH 画像の明瞭度が向上するため、標識された染色体
及び遺伝子座が明確に確認可能となる。容易に達成可能
な実験条件下で、標識サイト数は自動的に計測可能であ
る。また、各標識サイトの輝度が測定され、例えば、特
定の遺伝子の存在数を明らかにする DNA 量が計算され
る。
FISH 画像の明瞭度が向上するため、標識された染色体
及び遺伝子座が明確に確認可能となる。容易に達成可能
な実験条件下で、標識サイト数は自動的に計測可能であ
る。また、各標識サイトの輝度が測定され、例えば、特
定の遺伝子の存在数を明らかにする DNA 量が計算され
る。
【００１５】上記で論じたように、 FISH は、標識した
プローブの位置、各染色体上の標識サイト数及び各サイ
トにおける標識の輝度（遺伝物質の量）についての情報
を提供する。動原体（反復 DNA）プローブ及び染色体ペ
イントは、目標に定められた各染色体を標識し、コピー
数を数えるために用いられる。遺伝子座特定プローブ
は、遺伝物質の小さな領域の位置をマップするために用
いられる。これらのタイプのプローブは、そのままの細
胞分裂間期核及び分裂中期の染色体スプレッドに用いる
ことが可能で、視覚的にあるいは適当なアルゴリズムに
よって自動的に計数可能であり、特定の染色体、染色体
分裂片、あるいは遺伝子があまりに多いあるいはあまり
にも少ないために起こる遺伝病を識別するために決まっ
て用いられる。
プローブの位置、各染色体上の標識サイト数及び各サイ
トにおける標識の輝度（遺伝物質の量）についての情報
を提供する。動原体（反復 DNA）プローブ及び染色体ペ
イントは、目標に定められた各染色体を標識し、コピー
数を数えるために用いられる。遺伝子座特定プローブ
は、遺伝物質の小さな領域の位置をマップするために用
いられる。これらのタイプのプローブは、そのままの細
胞分裂間期核及び分裂中期の染色体スプレッドに用いる
ことが可能で、視覚的にあるいは適当なアルゴリズムに
よって自動的に計数可能であり、特定の染色体、染色体
分裂片、あるいは遺伝子があまりに多いあるいはあまり
にも少ないために起こる遺伝病を識別するために決まっ
て用いられる。
【００１６】いくつかの癌の非常に早期の段階において
は、細胞が明らかに異常であると確認されるかなり以前
に、特定の遺伝子の数が増加することがある。この現象
は、遺伝子増幅としてこの技術分野で知られているが、
遺伝子座特定プローブを用いることによって、均一に染
色された領域（HSR）そして／あるいは二重の微細な染
色体として探知可能である。癌細胞における染色体異常
を検出するために FISH を用い、その病気の発達段階を
指摘することによって、病期に応じて有効度が異なる多
くの治療方法から、最も適当な治療を選択できる可能性
もある。最も効率的な段階特性治療を選択することによ
って、貴重な時間が節約されると共に、患者の苦痛も最
小になる。
は、細胞が明らかに異常であると確認されるかなり以前
に、特定の遺伝子の数が増加することがある。この現象
は、遺伝子増幅としてこの技術分野で知られているが、
遺伝子座特定プローブを用いることによって、均一に染
色された領域（HSR）そして／あるいは二重の微細な染
色体として探知可能である。癌細胞における染色体異常
を検出するために FISH を用い、その病気の発達段階を
指摘することによって、病期に応じて有効度が異なる多
くの治療方法から、最も適当な治療を選択できる可能性
もある。最も効率的な段階特性治療を選択することによ
って、貴重な時間が節約されると共に、患者の苦痛も最
小になる。
【００１７】染色体を（例えば、音波破砕によって）物
理的に、あるいは（例えば、ランダムな、あるいは一連
のエンドヌクレアーゼによって）酵素的に切り刻み、
（例えば、流動細胞計算法を用いて）単離し、分裂片全
てに対してプローブのセットを生成することによって、
一つの特定な染色体の全面に一様に標識することが可能
である。染色体ペイントとしても知られている染色体プ
ローブの全体は、ターゲット染色体のすべてのコピーに
蛍光標識する。染色体彩色の一つの重要な用途は、特徴
的に特定の癌の早期に起こる、二つの染色体間における
遺伝物質の転座や挿入を検出することにある。しかしな
がら、他の染色体異常も検出可能である。
理的に、あるいは（例えば、ランダムな、あるいは一連
のエンドヌクレアーゼによって）酵素的に切り刻み、
（例えば、流動細胞計算法を用いて）単離し、分裂片全
てに対してプローブのセットを生成することによって、
一つの特定な染色体の全面に一様に標識することが可能
である。染色体ペイントとしても知られている染色体プ
ローブの全体は、ターゲット染色体のすべてのコピーに
蛍光標識する。染色体彩色の一つの重要な用途は、特徴
的に特定の癌の早期に起こる、二つの染色体間における
遺伝物質の転座や挿入を検出することにある。しかしな
がら、他の染色体異常も検出可能である。
【００１８】例えば、もし染色体Ａが緑のペイントで標
識され、染色体Ｂが赤のペイントで標識されたなら、Ａ
からＢへの遺伝物質のいかなる転座も赤色染色体上に緑
の領域として現われる（また、逆も同様である）。通
常、正常な染色体から生成された染色体ペイントが、異
常な（患者の）染色体上の欠失あるいは転座を検出する
ために用いられる。逆方向の染色体彩色は、異常な染色
体から生成されたプローブを、その異常な染色体に物質
を寄付した種々の正常な染色体から DNA を識別するた
めに用いる。
識され、染色体Ｂが赤のペイントで標識されたなら、Ａ
からＢへの遺伝物質のいかなる転座も赤色染色体上に緑
の領域として現われる（また、逆も同様である）。通
常、正常な染色体から生成された染色体ペイントが、異
常な（患者の）染色体上の欠失あるいは転座を検出する
ために用いられる。逆方向の染色体彩色は、異常な染色
体から生成されたプローブを、その異常な染色体に物質
を寄付した種々の正常な染色体から DNA を識別するた
めに用いる。
【００１９】本発明の方法は、下記の例に実証されるよ
うに、一回の交雑そして一回の短い測定によって、ヒト
核型（すなわち、ゲノム）を構成する２４の異なる染色
体を各々が異なる色に彩色し、同時に検出して識別し有
意義にカラーのヒト核型を示すことを可能とする。
うに、一回の交雑そして一回の短い測定によって、ヒト
核型（すなわち、ゲノム）を構成する２４の異なる染色
体を各々が異なる色に彩色し、同時に検出して識別し有
意義にカラーのヒト核型を示すことを可能とする。
【００２０】本発明は、染色体分析に関連のない、多く
の他の状況や用途に用いることができることは明らかで
ある。例えば、本発明による方法は、腫瘍や他の病気の
発症と進行に関わる遺伝子及びタンパク質の検出とマッ
ピングのために、多くの蛍光標識された DNA そして／
あるいはタンパク質（抗体）プローブが細胞に導入され
るマルチプローブ免疫組織化学に用いることができる。
の他の状況や用途に用いることができることは明らかで
ある。例えば、本発明による方法は、腫瘍や他の病気の
発症と進行に関わる遺伝子及びタンパク質の検出とマッ
ピングのために、多くの蛍光標識された DNA そして／
あるいはタンパク質（抗体）プローブが細胞に導入され
るマルチプローブ免疫組織化学に用いることができる。
【００２１】染色体ペイントを標識するために用いる多
色蛍光染料における注目すべき改善は、少数の基本的な
蛍光染料を種々に組合せて用いる組合せ蛍光戦略（例え
ば、組合せによる標識化や組合せによる交雑）の導入に
ある。組合せ標識の詳細については、「組合せ蛍光及び
デジタル結像顕微鏡検査法を用いる DNA ハイブリダイ
ゼーションによる七つの異なる DNA プローブの同時の
視覚化」 [Ried et al., (1992) Simultaneous visuali
zation of seven different DNA probes by insitu hyb
ridization using combinatorial fluorescence and di
gital imagingmicroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 89, 1388-1392] 及び「遺伝子診断における蛍光 DNA
ハイブリダイゼーション」 [Ried (Jan. 1994) Fluore
szenzin situ Hybridizierung in der genetischen Dia
gnostik, Faculty of theoretical medicine, Ruprecht
-Karls University Heidelberg] を参照。組合せ交雑の
詳細については、「比較ゲノム DNA ハイブリダイゼー
ションによる染色体の完全な、そして部分的な増加及び
減少の検出」 [du-Manoir et al. (1993) Detection o
f complete and partial chromosome gains and losses
by comparative genomic in situ hybridization. Hu
m. Genet. 90, 590-610] を参照。
色蛍光染料における注目すべき改善は、少数の基本的な
蛍光染料を種々に組合せて用いる組合せ蛍光戦略（例え
ば、組合せによる標識化や組合せによる交雑）の導入に
ある。組合せ標識の詳細については、「組合せ蛍光及び
デジタル結像顕微鏡検査法を用いる DNA ハイブリダイ
ゼーションによる七つの異なる DNA プローブの同時の
視覚化」 [Ried et al., (1992) Simultaneous visuali
zation of seven different DNA probes by insitu hyb
ridization using combinatorial fluorescence and di
gital imagingmicroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 89, 1388-1392] 及び「遺伝子診断における蛍光 DNA
ハイブリダイゼーション」 [Ried (Jan. 1994) Fluore
szenzin situ Hybridizierung in der genetischen Dia
gnostik, Faculty of theoretical medicine, Ruprecht
-Karls University Heidelberg] を参照。組合せ交雑の
詳細については、「比較ゲノム DNA ハイブリダイゼー
ションによる染色体の完全な、そして部分的な増加及び
減少の検出」 [du-Manoir et al. (1993) Detection o
f complete and partial chromosome gains and losses
by comparative genomic in situ hybridization. Hu
m. Genet. 90, 590-610] を参照。
【００２２】二つの異なる染料からなる混合物のスペク
トルは、個々の染料のスペクトルとは異なるため、組合
せ蛍光戦略は、単に非常に少数の染料を用いることによ
って、一つの試料におけるスペクトルの多種多様性を向
上させることができる。例えば、正常な男性の分裂中期
の場合では、２４の異なる染色体を、単に五つの異なる
染料の組合せを用いることによって、２４の異なるスペ
クトルで蛍光を発するように標識することができる。
トルは、個々の染料のスペクトルとは異なるため、組合
せ蛍光戦略は、単に非常に少数の染料を用いることによ
って、一つの試料におけるスペクトルの多種多様性を向
上させることができる。例えば、正常な男性の分裂中期
の場合では、２４の異なる染色体を、単に五つの異なる
染料の組合せを用いることによって、２４の異なるスペ
クトルで蛍光を発するように標識することができる。
【００２３】ビオチンあるいはジゴキシゲニン等のハプ
テンが酵素反応を用いて DNA に取り入れられる間接的
な方法を含み、 FISH 分析に用いるために DNA プロー
ブを標識する多数の方法が利用可能である。分裂中期の
染色体スプレッドへ、あるいは細胞分裂間期の核への交
雑後、免疫学的方法を用いることによってハイブリッド
を蛍光標識する。最近では、蛍光染料は、直接的にプロ
ーブに取り入れられ、中間ステップを用いることなく検
出される。標準的な FISH の染料には、フルオレセイ
ン、ローダミン、 テキサス・レッド及びカスケード・
ブルーが含まれ、マルチプローブ FISH 分析は、異なる
プローブを、異なるハプテンあるいは蛍光染料あるいは
それらの組合せで標識することによって達成される。こ
れは、この技術において組合せプローブとして知られる
（「組合せ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用
いる DNA ハイブリダイゼーションによって七つの異な
る DNA プローブの同時の視覚化」 [Ried et al., (199
2) Simultaneous visualization of seven different D
NA probes by in situ hybridization using combinato
rial fluorescence and digital imaging microscopy.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1388-1392; and, Ri
ed (Jan. 1994) Fluoreszenz in situ Hybridizierung
in der genetischen Diagnostik, Faculty of theoreti
cal medicine, Ruprecht-Karls University Heidelber
g] を参照）。択一的に、任意のプローブのプールを、
各々が異なる発蛍光団で標識されたサブ・プールに分
け、これらサブ・プールを、同様の交雑結果が得られる
ように再編成する。この方法は、本技術において組合せ
交雑として知られている（「比較ゲノム DNA ハイブリ
ダイゼーションによる染色体の完全な、そして部分的な
増加及び減少の検出」 [du-Manoir et al. (1993) Det
ection of complete and partial chromosome gains an
d losses by comparative genomic in situ hybridizat
ion. Hum. Genet. 90, 590-610] を参照）。これら
の両分類戦略により、組合せプローブが得られる。した
がって、この明細書、特に請求項において、用語「発蛍
光団の組合せ」あるいは「組合せ蛍光戦略」が用いられ
た場合、それは上記に説明したように、組合せ標識及び
組合せ交雑の両方に言及するものである。
テンが酵素反応を用いて DNA に取り入れられる間接的
な方法を含み、 FISH 分析に用いるために DNA プロー
ブを標識する多数の方法が利用可能である。分裂中期の
染色体スプレッドへ、あるいは細胞分裂間期の核への交
雑後、免疫学的方法を用いることによってハイブリッド
を蛍光標識する。最近では、蛍光染料は、直接的にプロ
ーブに取り入れられ、中間ステップを用いることなく検
出される。標準的な FISH の染料には、フルオレセイ
ン、ローダミン、 テキサス・レッド及びカスケード・
ブルーが含まれ、マルチプローブ FISH 分析は、異なる
プローブを、異なるハプテンあるいは蛍光染料あるいは
それらの組合せで標識することによって達成される。こ
れは、この技術において組合せプローブとして知られる
（「組合せ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用
いる DNA ハイブリダイゼーションによって七つの異な
る DNA プローブの同時の視覚化」 [Ried et al., (199
2) Simultaneous visualization of seven different D
NA probes by in situ hybridization using combinato
rial fluorescence and digital imaging microscopy.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1388-1392; and, Ri
ed (Jan. 1994) Fluoreszenz in situ Hybridizierung
in der genetischen Diagnostik, Faculty of theoreti
cal medicine, Ruprecht-Karls University Heidelber
g] を参照）。択一的に、任意のプローブのプールを、
各々が異なる発蛍光団で標識されたサブ・プールに分
け、これらサブ・プールを、同様の交雑結果が得られる
ように再編成する。この方法は、本技術において組合せ
交雑として知られている（「比較ゲノム DNA ハイブリ
ダイゼーションによる染色体の完全な、そして部分的な
増加及び減少の検出」 [du-Manoir et al. (1993) Det
ection of complete and partial chromosome gains an
d losses by comparative genomic in situ hybridizat
ion. Hum. Genet. 90, 590-610] を参照）。これら
の両分類戦略により、組合せプローブが得られる。した
がって、この明細書、特に請求項において、用語「発蛍
光団の組合せ」あるいは「組合せ蛍光戦略」が用いられ
た場合、それは上記に説明したように、組合せ標識及び
組合せ交雑の両方に言及するものである。
【００２４】染色体彩色及び核型作成、染色体多色バン
ディング及び比較ゲノム交雑に対する組合せ発蛍光団の
使用については、１９９６年４月２２日に出願された米
国特許出願第０８/６３５,８２０号及び雑誌『サイエン
ス』「ヒト染色体の多色スペクトル核型分析」 [E, Sch
roeck et al. (1996) Multicolor spectral karyotypi
ng of human chromosomes. Science, 273, 494-497]
に詳細に説明されている。
ディング及び比較ゲノム交雑に対する組合せ発蛍光団の
使用については、１９９６年４月２２日に出願された米
国特許出願第０８/６３５,８２０号及び雑誌『サイエン
ス』「ヒト染色体の多色スペクトル核型分析」 [E, Sch
roeck et al. (1996) Multicolor spectral karyotypi
ng of human chromosomes. Science, 273, 494-497]
に詳細に説明されている。
【００２５】『サイエンス』に説明された主な進歩は、
蛍光 DNA ハイブリダイゼーション（FISH）後、スペク
トル結像による全ゲノム走査によって、各ヒト染色体に
対する定義発光スペクトルの瞬間的な視覚化が可能にな
ることである。スペクトルのコンピュータによる分離
（分類）によって、スペクトル的に重なり合う染色体特
定 DNA プローブが確認可能となり、すべてのヒト染色
体が同時に識別される。
蛍光 DNA ハイブリダイゼーション（FISH）後、スペク
トル結像による全ゲノム走査によって、各ヒト染色体に
対する定義発光スペクトルの瞬間的な視覚化が可能にな
ることである。スペクトルのコンピュータによる分離
（分類）によって、スペクトル的に重なり合う染色体特
定 DNA プローブが確認可能となり、すべてのヒト染色
体が同時に識別される。
【００２６】このスペクトル結像によるアプローチは、
フーリエ分光分析法、電荷結合素子（ＣＣＤ）結像及び
光学顕微鏡検査法を組み合わせ、可視及び近赤外のスペ
クトル範囲において試料のすべてのポイントにおける発
光スペクトルを同時に測定するもので、スペクトル的に
重なり合う多数のプローブの使用を可能にする。このア
プローチは、（多くの異なる波長において測定される各
ピクセルの輝度シーケンスから識別される）個々のスペ
クトルの測定に基づいており、多数の発蛍光団の識別が
容易になる。蛍光色素の識別が、蛍光色素特定光学フィ
ルタ（狭帯域フィルタ）を介した単一輝度の測定に基づ
く従来の蛍光外顕微鏡検査法（epifluorescence micros
copy） [Speicher et al. (1996) Nature Genetics 12:
368-375;and Speicher et al. (1996) Bioimaging 4:52
-64 を参照] とは対照的に、スペクトル核型分析を用い
ることで、放射光線のスペクトル内におけるすべての情
報を分析に用いることが可能になる。
フーリエ分光分析法、電荷結合素子（ＣＣＤ）結像及び
光学顕微鏡検査法を組み合わせ、可視及び近赤外のスペ
クトル範囲において試料のすべてのポイントにおける発
光スペクトルを同時に測定するもので、スペクトル的に
重なり合う多数のプローブの使用を可能にする。このア
プローチは、（多くの異なる波長において測定される各
ピクセルの輝度シーケンスから識別される）個々のスペ
クトルの測定に基づいており、多数の発蛍光団の識別が
容易になる。蛍光色素の識別が、蛍光色素特定光学フィ
ルタ（狭帯域フィルタ）を介した単一輝度の測定に基づ
く従来の蛍光外顕微鏡検査法（epifluorescence micros
copy） [Speicher et al. (1996) Nature Genetics 12:
368-375;and Speicher et al. (1996) Bioimaging 4:52
-64 を参照] とは対照的に、スペクトル核型分析を用い
ることで、放射光線のスペクトル内におけるすべての情
報を分析に用いることが可能になる。
【００２７】スペクトル的に重なり合う発蛍光団を識別
（分類）するためのスペクトルに基づく方法は、各蛍光
色素の発光スペクトルに測定可能な一貫した違いがある
という条件で、多数の蛍光色素に容易に拡張できる。
（分類）するためのスペクトルに基づく方法は、各蛍光
色素の発光スペクトルに測定可能な一貫した違いがある
という条件で、多数の蛍光色素に容易に拡張できる。
【００２８】また、分裂中期の試料における各々のヒト
染色体の同時識別、すなわちスペクトル核型分析として
言及されるアプローチについても報告がある。この目的
に対して、流れに沿って分類したヒト染色体から重合酵
素連鎖反応（PCR）によって生成した染色体特定複合ラ
イブラリを、五つの異なる発蛍光団あるいはその組合せ
に共役したヌクレオチドで直接的に標識する。次に、２
４の染色体すべてを含む複合プローブ・セットを分裂中
期の染色体に交雑し、染色体特定標識を抑制交雑によっ
て達成する。特に、複合ライブラリにおける反復シーケ
ンスは、標識のないヒトＣｏｔ−１ DNA を過剰に加え
ることによって阻止する。
染色体の同時識別、すなわちスペクトル核型分析として
言及されるアプローチについても報告がある。この目的
に対して、流れに沿って分類したヒト染色体から重合酵
素連鎖反応（PCR）によって生成した染色体特定複合ラ
イブラリを、五つの異なる発蛍光団あるいはその組合せ
に共役したヌクレオチドで直接的に標識する。次に、２
４の染色体すべてを含む複合プローブ・セットを分裂中
期の染色体に交雑し、染色体特定標識を抑制交雑によっ
て達成する。特に、複合ライブラリにおける反復シーケ
ンスは、標識のないヒトＣｏｔ−１ DNA を過剰に加え
ることによって阻止する。
【００２９】この交雑は、ＲＧＢ表示及び分類色の両方
で示される。スペクトル結像の後、表示色によって、ヒ
ト染色体のすべてが容易に視覚化でき、各ピクセルにお
けるスペクトル測定に基づき、染色体分類アルゴリズム
を適用し、スペクトル的にヒト染色体のすべての核型を
作成する。最も重要な分析アルゴリズムの一つとして
は、画像内の多数の異なるスペクトルを識別し分類色で
強調表示するスペクトルに基づく分類アルゴリズムがあ
る。ヒト染色体のすべてに対して、それらのスペクトル
に基づき特定の分類色を割当てることが可能になる。こ
のアルゴリズムは、各染色体の（参照）スペクトルが既
に測定されコンピュータ内の参照ライブラリに保存され
ていることを想定している。画像の各ピクセルへの分類
色の割り当ては、その任意のピクセルにおけるスペクト
ルに最も類似する基準スペクトルに割り当てられている
分類色に応じて行われる。式（１）に示す最少平方誤差
アルゴリズムが、すべてのピクセルに対して計算され
る。
で示される。スペクトル結像の後、表示色によって、ヒ
ト染色体のすべてが容易に視覚化でき、各ピクセルにお
けるスペクトル測定に基づき、染色体分類アルゴリズム
を適用し、スペクトル的にヒト染色体のすべての核型を
作成する。最も重要な分析アルゴリズムの一つとして
は、画像内の多数の異なるスペクトルを識別し分類色で
強調表示するスペクトルに基づく分類アルゴリズムがあ
る。ヒト染色体のすべてに対して、それらのスペクトル
に基づき特定の分類色を割当てることが可能になる。こ
のアルゴリズムは、各染色体の（参照）スペクトルが既
に測定されコンピュータ内の参照ライブラリに保存され
ていることを想定している。画像の各ピクセルへの分類
色の割り当ては、その任意のピクセルにおけるスペクト
ルに最も類似する基準スペクトルに割り当てられている
分類色に応じて行われる。式（１）に示す最少平方誤差
アルゴリズムが、すべてのピクセルに対して計算され
る。
【００３０】
【数１】
【００３１】ここで、Ｉx,y（λ）は、ピクセル座標
ｘ、ｙにおける正規化スペクトルであり、Ｉｎ（λ）
は、各染色体（ｎ＝１、２・・・、２３、２４）の正規
化基準スペクトルを表す。すべての基準スペクトルに対
するＳx,y,n の値を計算した後、最小値が選択され、そ
のピクセルに最も類似する基準スペクトルに割り当てら
れている分類色に応じて人工の分類色が割り当てられ
る。
ｘ、ｙにおける正規化スペクトルであり、Ｉｎ（λ）
は、各染色体（ｎ＝１、２・・・、２３、２４）の正規
化基準スペクトルを表す。すべての基準スペクトルに対
するＳx,y,n の値を計算した後、最小値が選択され、そ
のピクセルに最も類似する基準スペクトルに割り当てら
れている分類色に応じて人工の分類色が割り当てられ
る。
【００３２】染色体異常のスクリーニング方法としての
スペクトル核型分析の可能性を、以前、従来のバンディ
ング方法、あるいは染色体彩色プローブによるＦＩＳＨ
を行ったことがある多数の研究室からの臨床試料を分析
することによって、さらに調査した。例外なく、Ｇバン
ディングとスペクトル核型分析は一貫した結果を示し
た。あるケースでは、ギームザ・バンディングは、染色
体異常を完全に解釈するに十分ではなかった。これらの
ケースに対しては、スペクトル核型分析による染色体異
常の診断を、従来の二色ＦＩＳＨ分析で確認した。この
報告のために分析された識別可能な最小の異常は、相互
転座が従来のバンディング分析によっては識別すること
ができない転座ｔ（１；１１）（ｑ４４；ｐ１５.３ ）
であった。相互転座の一因となった染色体物質の起源を
正確に分類できた。染色体１及び１１上の転座セグメン
トを、染色体１ｑ及び１１ｐに対する副末端小粒（subt
elomere）特定コスミド・プローブによって確認した。
用いたプローブの位置に基づいて、変質の大きさを＞
１,５００ｋｂｐであると推定した。第二のケースで
は、バンディング分析は、染色体４のセグメントの染色
体１２への転座を示唆したが、スペクトル核型分析は、
追加の染色体物質の起源を、染色体４からのものである
とはっきりと識別し分類した。スペクトル核型分析の感
度の限界を測定するために、染色体１６及び１７を伴う
（分裂中期及び前中期の染色体において識別が不可能
な）超顕微鏡的な転座のケースを調べた。このｔ（１
６；１７）は、以前、コスミド・プローブを用いるＦＩ
ＳＨで実証され、染色質の相互交換はおよそ５００ｋｂ
ｐと概算されたものである。この患者からの分裂中期染
色体で行ったスペクトル核型分析は、既知のｔ（１６；
１７）を識別することに失敗した。これは、現在利用可
能な彩色プローブによる分裂中期の染色体分析の感度の
限界が５００から１,５００ｋｂｐであることを示唆す
る。
スペクトル核型分析の可能性を、以前、従来のバンディ
ング方法、あるいは染色体彩色プローブによるＦＩＳＨ
を行ったことがある多数の研究室からの臨床試料を分析
することによって、さらに調査した。例外なく、Ｇバン
ディングとスペクトル核型分析は一貫した結果を示し
た。あるケースでは、ギームザ・バンディングは、染色
体異常を完全に解釈するに十分ではなかった。これらの
ケースに対しては、スペクトル核型分析による染色体異
常の診断を、従来の二色ＦＩＳＨ分析で確認した。この
報告のために分析された識別可能な最小の異常は、相互
転座が従来のバンディング分析によっては識別すること
ができない転座ｔ（１；１１）（ｑ４４；ｐ１５.３ ）
であった。相互転座の一因となった染色体物質の起源を
正確に分類できた。染色体１及び１１上の転座セグメン
トを、染色体１ｑ及び１１ｐに対する副末端小粒（subt
elomere）特定コスミド・プローブによって確認した。
用いたプローブの位置に基づいて、変質の大きさを＞
１,５００ｋｂｐであると推定した。第二のケースで
は、バンディング分析は、染色体４のセグメントの染色
体１２への転座を示唆したが、スペクトル核型分析は、
追加の染色体物質の起源を、染色体４からのものである
とはっきりと識別し分類した。スペクトル核型分析の感
度の限界を測定するために、染色体１６及び１７を伴う
（分裂中期及び前中期の染色体において識別が不可能
な）超顕微鏡的な転座のケースを調べた。このｔ（１
６；１７）は、以前、コスミド・プローブを用いるＦＩ
ＳＨで実証され、染色質の相互交換はおよそ５００ｋｂ
ｐと概算されたものである。この患者からの分裂中期染
色体で行ったスペクトル核型分析は、既知のｔ（１６；
１７）を識別することに失敗した。これは、現在利用可
能な彩色プローブによる分裂中期の染色体分析の感度の
限界が５００から１,５００ｋｂｐであることを示唆す
る。
【００３３】スペクトル核型分析は、従来のバンディン
グ分析を補完するために用いることができるアプローチ
であるということを証明するために、先にＧバンディン
グされた染色体に対する交雑をも行った。恐らく、Ｇバ
ンディングのために必要なトリプシン消化が原因で、先
にＧバンディングされていない分裂中期のものと比較し
て、信号輝度が僅かに減少した。信号輝度の損失はおよ
そ１０％であり、これは、露光時間を延ばすことによっ
て容易に補正することが可能である。Ｇバンディングさ
れなかった染色体に比較して、先にＧバンディングされ
た染色体の縁には、ノイズが僅かに増したことが観察さ
れた。しかしながら、分裂中期の分類は容易に達成する
ことが可能である。
グ分析を補完するために用いることができるアプローチ
であるということを証明するために、先にＧバンディン
グされた染色体に対する交雑をも行った。恐らく、Ｇバ
ンディングのために必要なトリプシン消化が原因で、先
にＧバンディングされていない分裂中期のものと比較し
て、信号輝度が僅かに減少した。信号輝度の損失はおよ
そ１０％であり、これは、露光時間を延ばすことによっ
て容易に補正することが可能である。Ｇバンディングさ
れなかった染色体に比較して、先にＧバンディングされ
た染色体の縁には、ノイズが僅かに増したことが観察さ
れた。しかしながら、分裂中期の分類は容易に達成する
ことが可能である。
【００３４】
【発明が解決しようとする課題】だが、雑誌『サイエン
ス』に開示された方法、すなわち上記に説明した方法に
は限界がある。各スペクトルに対して３００ｘ３００の
ピクセルと５０の波長とで構成されるスペクトル画像
は、およそ４.５メガバイトのファイルになる。『サイ
エンス』に説明されたシステムにおいては、各ピクセル
に対するインターフェログラムは、フーリエ変換が行わ
れる前に各測定に対して少なくとも二倍の数のデータ、
９.０メガバイトを含んでいる。これは多量のデータで
あり、収集に長時間を要するとともに多量のメモリを費
やすものである。
ス』に開示された方法、すなわち上記に説明した方法に
は限界がある。各スペクトルに対して３００ｘ３００の
ピクセルと５０の波長とで構成されるスペクトル画像
は、およそ４.５メガバイトのファイルになる。『サイ
エンス』に説明されたシステムにおいては、各ピクセル
に対するインターフェログラムは、フーリエ変換が行わ
れる前に各測定に対して少なくとも二倍の数のデータ、
９.０メガバイトを含んでいる。これは多量のデータで
あり、収集に長時間を要するとともに多量のメモリを費
やすものである。
【００３５】スピーチャ（Speicher）氏らが説明するよ
うに（Speicher et al. (1996) Nature Genetics. 12:3
68-375 及び Speicher et al. (1996) Bioimaging 4:52
-64を参照）、蛍光色素識別が狭励起フィルタを介した
励起、そして蛍光色素特定光学フィルタ（第二の狭帯域
フィルタ）を介した蛍光発光測定に基づく蛍光外顕微鏡
検査法は、染色体分類にも適用可能であるが、この方法
には次のような固有の限界がある。
うに（Speicher et al. (1996) Nature Genetics. 12:3
68-375 及び Speicher et al. (1996) Bioimaging 4:52
-64を参照）、蛍光色素識別が狭励起フィルタを介した
励起、そして蛍光色素特定光学フィルタ（第二の狭帯域
フィルタ）を介した蛍光発光測定に基づく蛍光外顕微鏡
検査法は、染色体分類にも適用可能であるが、この方法
には次のような固有の限界がある。
【００３６】データを得るために用いるフィルタには蛍
光色素特定性がある。染色体彩色に利用可能なほとんど
の発蛍光団の励起及び発光スペクトルは、かなりの部分
が重なり合うため、これらのフィルタは、（ｉ）非常に
狭く（例えば、各々、５から１０ｎｍ）そして、（ｉ
ｉ）用いる発蛍光団に厳密に、そして励起及び発光スペ
クトルが重なり合う度合いに応じて選択される。多くの
場合、フィルタは外周光（励起あるいは発光ピークから
ではなく、肩の部分からの光）をフィルタするよう選ば
れる。
光色素特定性がある。染色体彩色に利用可能なほとんど
の発蛍光団の励起及び発光スペクトルは、かなりの部分
が重なり合うため、これらのフィルタは、（ｉ）非常に
狭く（例えば、各々、５から１０ｎｍ）そして、（ｉ
ｉ）用いる発蛍光団に厳密に、そして励起及び発光スペ
クトルが重なり合う度合いに応じて選択される。多くの
場合、フィルタは外周光（励起あるいは発光ピークから
ではなく、肩の部分からの光）をフィルタするよう選ば
れる。
【００３７】ゆえに、これらのフィルタは、試験試料に
存在するデータの大部分を取り除いてしまう、あるいは
言い換えれば、未収集のままにするため、最終的なピク
セル分類の感度及び特定性が低くなる。この方法におけ
る光子の損失は、（励起及び発光経路の両方で起こるた
め）かなり大きく、信号は、フィルタを通さない場合の
発光測定に比べて、振幅が二乗の割合で減少する。
存在するデータの大部分を取り除いてしまう、あるいは
言い換えれば、未収集のままにするため、最終的なピク
セル分類の感度及び特定性が低くなる。この方法におけ
る光子の損失は、（励起及び発光経路の両方で起こるた
め）かなり大きく、信号は、フィルタを通さない場合の
発光測定に比べて、振幅が二乗の割合で減少する。
【００３８】しかしながら、干渉法による結像と比べる
と、蛍光外顕微鏡検査法には一つの利点がある。小数の
フィルタを用いる蛍光外顕微鏡検査法には、本発明に従
って開発がなされるなら、スペクトル情報をフルに収集
する干渉法スペクトル画像処理の場合よりも少ないフレ
ームを収集するようにして、信号対雑音比を損なうこと
なく測定時間を短くできる可能性がある。
と、蛍光外顕微鏡検査法には一つの利点がある。小数の
フィルタを用いる蛍光外顕微鏡検査法には、本発明に従
って開発がなされるなら、スペクトル情報をフルに収集
する干渉法スペクトル画像処理の場合よりも少ないフレ
ームを収集するようにして、信号対雑音比を損なうこと
なく測定時間を短くできる可能性がある。
【００３９】したがって、本発明の目的は、フィルタに
基づく蛍光外顕微鏡検査法の利点と、干渉法による結像
の高い信号対雑音比とを併せ持つ方法を提供することに
ある。
基づく蛍光外顕微鏡検査法の利点と、干渉法による結像
の高い信号対雑音比とを併せ持つ方法を提供することに
ある。
【００４０】
【課題を解決するための手段】本発明は、ピクセルのス
ペクトルに応じてピクセルをピクセルのグループに分類
するための、そしてピクセルに存在する発蛍光団の量を
測定するための方法及び装置を提供する。
ペクトルに応じてピクセルをピクセルのグループに分類
するための、そしてピクセルに存在する発蛍光団の量を
測定するための方法及び装置を提供する。
【００４１】下記の本発明の実施例における特徴によれ
ば、各発蛍光団が特徴的な発光スペクトル及び特定的な
発光ピークを持つ複数の発蛍光団から選択した単一の発
蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させてピクセル
をピクセルのグループに分類する方法が提供される。こ
の方法は次のステップからなる。（ａ）複数の広帯域発
光フィルタを提供する。（ｂ）ピクセルの各々に対し
て、複数の発光フィルタの一つを通過した発光の輝度を
記録することによって、ピクセルの各々を、広帯域発光
フィルタの数に等しい複数の次元からなるベクトルによ
って表す。（ｃ）各ピクセルにおける複数の発蛍光団の
各々の存在を評価するためのアルゴリズムを用いること
によって、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに
関連させて各ピクセルをピクセルのグループに分類す
る。
ば、各発蛍光団が特徴的な発光スペクトル及び特定的な
発光ピークを持つ複数の発蛍光団から選択した単一の発
蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させてピクセル
をピクセルのグループに分類する方法が提供される。こ
の方法は次のステップからなる。（ａ）複数の広帯域発
光フィルタを提供する。（ｂ）ピクセルの各々に対し
て、複数の発光フィルタの一つを通過した発光の輝度を
記録することによって、ピクセルの各々を、広帯域発光
フィルタの数に等しい複数の次元からなるベクトルによ
って表す。（ｃ）各ピクセルにおける複数の発蛍光団の
各々の存在を評価するためのアルゴリズムを用いること
によって、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに
関連させて各ピクセルをピクセルのグループに分類す
る。
【００４２】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍光団あるい
は発蛍光団の組合せに関連させて、ピクセルをピクセル
のグループに分類するための方法が提供される。各発蛍
光団は特徴的な励起及び発光スペクトル及び特定的な励
起及び発光ピークを持ち、この方法は次のステップから
なる。（ａ）複数の対の広帯域励起フィルタ及び広帯域
の発光フィルタを提供する。（ｂ）広帯域励起フィルタ
の一つを介した光でピクセルの各々の発蛍光団を励起
し、その対の発光フィルタを通過させた発光の輝度を記
録する。（ｃ）複数対のフィルタのすべてに対して、ス
テップ（ｂ）を繰り返すことによって、ピクセルの各々
を、複数のフィルタの対の数に等しい複数の次元からな
るベクトルによって表す。（ｄ）各ピクセルにおける複
数の発蛍光団の各々の存在を評価するアルゴリズムを用
いることによって、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の
組合せに関連させて、ピクセルの各々をピクセルのグル
ープに分類する。
ば、複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍光団あるい
は発蛍光団の組合せに関連させて、ピクセルをピクセル
のグループに分類するための方法が提供される。各発蛍
光団は特徴的な励起及び発光スペクトル及び特定的な励
起及び発光ピークを持ち、この方法は次のステップから
なる。（ａ）複数の対の広帯域励起フィルタ及び広帯域
の発光フィルタを提供する。（ｂ）広帯域励起フィルタ
の一つを介した光でピクセルの各々の発蛍光団を励起
し、その対の発光フィルタを通過させた発光の輝度を記
録する。（ｃ）複数対のフィルタのすべてに対して、ス
テップ（ｂ）を繰り返すことによって、ピクセルの各々
を、複数のフィルタの対の数に等しい複数の次元からな
るベクトルによって表す。（ｄ）各ピクセルにおける複
数の発蛍光団の各々の存在を評価するアルゴリズムを用
いることによって、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の
組合せに関連させて、ピクセルの各々をピクセルのグル
ープに分類する。
【００４３】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍光団あるい
は発蛍光団の組合せに関連させて、ピクセルをピクセル
のグループに分類するための装置が提供される。発蛍光
団の各々は特徴的な励起及び発光スペクトル及び特定的
な励起及び発光ピークを持ち、この装置は次のものから
なる。（ａ）光源。（ｂ）複数対の広帯域励起フィルタ
及び広帯域発光フィルタ。（ｃ）制御装置。この制御装
置は、（ｉ）前記複数の対の一対を選択し、（ｉｉ）広
帯域励起フィルタの一つを介した光源からの光でピクセ
ルの各々の発蛍光団を励起し、そして（ｉｉｉ）複数対
のフィルタの全てに対してステップ（ｉ）−（ｉｉ）を
繰り返すことによって、ピクセルの各々を、複数のフィ
ルタの対の数に等しい複数の次元のベクトルによって表
すためのものである。（ｄ）発光フィルタを通過させた
後の発光輝度を記録するための光輝度記録装置。そして
（ｅ）各ピクセルにおける複数の発蛍光団の各々の存在
を評価するアルゴリズムを含み、これによって、単一の
発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させてピクセ
ルの各々をピクセルのグループに分類する演算装置。
ば、複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍光団あるい
は発蛍光団の組合せに関連させて、ピクセルをピクセル
のグループに分類するための装置が提供される。発蛍光
団の各々は特徴的な励起及び発光スペクトル及び特定的
な励起及び発光ピークを持ち、この装置は次のものから
なる。（ａ）光源。（ｂ）複数対の広帯域励起フィルタ
及び広帯域発光フィルタ。（ｃ）制御装置。この制御装
置は、（ｉ）前記複数の対の一対を選択し、（ｉｉ）広
帯域励起フィルタの一つを介した光源からの光でピクセ
ルの各々の発蛍光団を励起し、そして（ｉｉｉ）複数対
のフィルタの全てに対してステップ（ｉ）−（ｉｉ）を
繰り返すことによって、ピクセルの各々を、複数のフィ
ルタの対の数に等しい複数の次元のベクトルによって表
すためのものである。（ｄ）発光フィルタを通過させた
後の発光輝度を記録するための光輝度記録装置。そして
（ｅ）各ピクセルにおける複数の発蛍光団の各々の存在
を評価するアルゴリズムを含み、これによって、単一の
発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させてピクセ
ルの各々をピクセルのグループに分類する演算装置。
【００４４】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、演算装置は、ピクセルのグループの各々に属するピ
クセルに、グループの各々に属するピクセルが互いに区
別可能なように独特な人工色を与える。
ば、演算装置は、ピクセルのグループの各々に属するピ
クセルに、グループの各々に属するピクセルが互いに区
別可能なように独特な人工色を与える。
【００４５】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、広帯域発光フィルタの少なくとも二つは、重なり合
う帯域を持つ。
ば、広帯域発光フィルタの少なくとも二つは、重なり合
う帯域を持つ。
【００４６】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、広帯域励起フィルタの少なくとも二つは、重なり合
う帯域を持つ。
ば、広帯域励起フィルタの少なくとも二つは、重なり合
う帯域を持つ。
【００４７】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、ピクセルのグループの各々に属するピクセルは、各
グループに属するピクセルが互いに区別可能なように独
特な人工色が与えられる。
ば、ピクセルのグループの各々に属するピクセルは、各
グループに属するピクセルが互いに区別可能なように独
特な人工色が与えられる。
【００４８】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、アルゴリズムは線形分解アルゴリズムである。
ば、アルゴリズムは線形分解アルゴリズムである。
【００４９】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、発蛍光団は分裂中期の染色体の遺伝物質に結び付く
ため、分裂中期染色体の各々の遺伝物質は、異なる発蛍
光団あるいは発蛍光団の組合せに結びつく。
ば、発蛍光団は分裂中期の染色体の遺伝物質に結び付く
ため、分裂中期染色体の各々の遺伝物質は、異なる発蛍
光団あるいは発蛍光団の組合せに結びつく。
【００５０】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、複数の発蛍光団の数は５である。
ば、複数の発蛍光団の数は５である。
【００５１】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、複数の対のフィルタの数は５である。
ば、複数の対のフィルタの数は５である。
【００５２】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、複数の発蛍光団の数は複数の対のフィルタの数に等
しい。
ば、複数の発蛍光団の数は複数の対のフィルタの数に等
しい。
【００５３】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、広帯域発光フィルタの各々は、一方で、複数の発蛍
光団の一つの発蛍光団の発光スペクトルに対応する帯域
を持つように、他方で、一つの発蛍光団からの発光のス
ループットが高くなるように選ばれる。
ば、広帯域発光フィルタの各々は、一方で、複数の発蛍
光団の一つの発蛍光団の発光スペクトルに対応する帯域
を持つように、他方で、一つの発蛍光団からの発光のス
ループットが高くなるように選ばれる。
【００５４】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、広帯域励起フィルタの各々は、一方で、複数の発蛍
光団の一つの発蛍光団の励起スペクトルに対応する帯域
を持つように、他方で、励起光のスループットが高くな
るように選ばれる。
ば、広帯域励起フィルタの各々は、一方で、複数の発蛍
光団の一つの発蛍光団の励起スペクトルに対応する帯域
を持つように、他方で、励起光のスループットが高くな
るように選ばれる。
【００５５】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、広帯域発光フィルタの少なくとも一つの帯域は、そ
の対応する発蛍光団の発光ピークに重なり合うように選
ばれる。
ば、広帯域発光フィルタの少なくとも一つの帯域は、そ
の対応する発蛍光団の発光ピークに重なり合うように選
ばれる。
【００５６】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、広帯域励起フィルタの少なくとも一つの帯域は、そ
の対応する発蛍光団の励起ピークに重なり合うように選
ばれる。
ば、広帯域励起フィルタの少なくとも一つの帯域は、そ
の対応する発蛍光団の励起ピークに重なり合うように選
ばれる。
【００５７】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、広帯域発光フィルタは単一のチューナブル・フィル
タによって代表される。
ば、広帯域発光フィルタは単一のチューナブル・フィル
タによって代表される。
【００５８】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、広帯域励起フィルタは単一のチューナブル・フィル
タによって代表される。
ば、広帯域励起フィルタは単一のチューナブル・フィル
タによって代表される。
【００５９】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、チューナブル・フィルタは AOTF及び LCTF からな
るグループから選択される。
ば、チューナブル・フィルタは AOTF及び LCTF からな
るグループから選択される。
【００６０】また、上記の方法及び装置は、ピクセルに
おける発蛍光団の量（相対的な、あるいは絶対的な量）
を測定するために用いることができる。
おける発蛍光団の量（相対的な、あるいは絶対的な量）
を測定するために用いることができる。
【００６１】したがって、好適実施例における特徴によ
れば、ピクセルに関わる複数の発蛍光団から選択した単
一の発蛍光団あるいは組合せの発蛍光団の量を測定する
ための方法が提供される。発蛍光団の各々は、特徴的な
発光スペクトル及び特定的な発光ピークを持ち、この方
法は次のステップからなる。（ａ）複数の広帯域の発光
フィルタを提供する。（ｂ）複数の発光フィルタの一つ
を通過させた後の発光輝度を記録する。ピクセルを、複
数の広帯域発光フィルタの数に等しい複数の次元からな
るベクトルによって表す。（ｃ）ピクセルにおける複数
の発蛍光団の各々の量を評価するためにアルゴリズムを
用いる。
れば、ピクセルに関わる複数の発蛍光団から選択した単
一の発蛍光団あるいは組合せの発蛍光団の量を測定する
ための方法が提供される。発蛍光団の各々は、特徴的な
発光スペクトル及び特定的な発光ピークを持ち、この方
法は次のステップからなる。（ａ）複数の広帯域の発光
フィルタを提供する。（ｂ）複数の発光フィルタの一つ
を通過させた後の発光輝度を記録する。ピクセルを、複
数の広帯域発光フィルタの数に等しい複数の次元からな
るベクトルによって表す。（ｃ）ピクセルにおける複数
の発蛍光団の各々の量を評価するためにアルゴリズムを
用いる。
【００６２】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、ピクセルに関わる複数の発蛍光団から選択した単一
の発蛍光団あるいは組合せの発蛍光団の量を測定するた
めの方法が提供される。発蛍光団の各々は特徴的な励起
及び発光スペクトル及び特定的な励起及び発光ピークを
持ち、この方法は次のステップからなる。（ａ）複数の
対の広帯域励起フィルタ及び広帯域発光フィルタを提供
する。（ｂ）広帯域励起フィルタの一つを介した光でピ
クセルの発蛍光団を励起し、その対の発光フィルタを通
過させた後の発光の輝度を記録する。（ｃ）複数の対の
フィルタ全てに対してステップ（ｂ）を繰り返すことに
よって、ピクセルを、複数のフィルタの対の数に等しい
複数の次元からなるベクトルによって表す。（ｄ）ピク
セルにおける複数の発蛍光団の各々の量を評価するため
にアルゴリズムを用いる。
ば、ピクセルに関わる複数の発蛍光団から選択した単一
の発蛍光団あるいは組合せの発蛍光団の量を測定するた
めの方法が提供される。発蛍光団の各々は特徴的な励起
及び発光スペクトル及び特定的な励起及び発光ピークを
持ち、この方法は次のステップからなる。（ａ）複数の
対の広帯域励起フィルタ及び広帯域発光フィルタを提供
する。（ｂ）広帯域励起フィルタの一つを介した光でピ
クセルの発蛍光団を励起し、その対の発光フィルタを通
過させた後の発光の輝度を記録する。（ｃ）複数の対の
フィルタ全てに対してステップ（ｂ）を繰り返すことに
よって、ピクセルを、複数のフィルタの対の数に等しい
複数の次元からなるベクトルによって表す。（ｄ）ピク
セルにおける複数の発蛍光団の各々の量を評価するため
にアルゴリズムを用いる。
【００６３】さらに、好適実施例における特徴によれ
ば、ピクセルに関わる複数の発蛍光団から選択した単一
の発蛍光団あるいは組合せの発蛍光団の量を測定するた
めの装置が提供される。発蛍光団の各々は特徴的な励起
及び発光スペクトル及び特定的な励起及び発光ピークを
持ち、この装置は次のものからなる。（ａ）光源。
（ｂ）複数の対の広帯域励起フィルタ及び広帯域の発光
フィルタ。（ｃ）制御装置。この制御装置は、（ｉ）複
数の対の一対を選択し、（ｉｉ）広帯域励起フィルタの
一つを介した光源からの光でピクセルの発蛍光団を励起
し、そして（ｉｉｉ）複数の対のフィルタ全てに対して
ステップ（ｉ）−（ｉｉ）を繰り返すことによって、ピ
クセルを、複数のフィルタの対の数に等しい複数の次元
からなるベクトルによって表す。（ｄ）発光フィルタを
通過させた後の発光輝度を記録するための光輝度記録装
置。そして（ｅ）ピクセルにおける複数の発蛍光団の各
々の量を評価するためのアルゴリズムを含む演算装置。
ば、ピクセルに関わる複数の発蛍光団から選択した単一
の発蛍光団あるいは組合せの発蛍光団の量を測定するた
めの装置が提供される。発蛍光団の各々は特徴的な励起
及び発光スペクトル及び特定的な励起及び発光ピークを
持ち、この装置は次のものからなる。（ａ）光源。
（ｂ）複数の対の広帯域励起フィルタ及び広帯域の発光
フィルタ。（ｃ）制御装置。この制御装置は、（ｉ）複
数の対の一対を選択し、（ｉｉ）広帯域励起フィルタの
一つを介した光源からの光でピクセルの発蛍光団を励起
し、そして（ｉｉｉ）複数の対のフィルタ全てに対して
ステップ（ｉ）−（ｉｉ）を繰り返すことによって、ピ
クセルを、複数のフィルタの対の数に等しい複数の次元
からなるベクトルによって表す。（ｄ）発光フィルタを
通過させた後の発光輝度を記録するための光輝度記録装
置。そして（ｅ）ピクセルにおける複数の発蛍光団の各
々の量を評価するためのアルゴリズムを含む演算装置。
【００６４】本発明は、ピクセルのスペクトルに応じて
ピクセルを分類し、ピクセルに存在する発蛍光団の量を
測定するシステムを提供することによって、現在既知の
機器構成の欠点を改善するもので、特定性及びスループ
ットの両方を考慮することによって、測定に最適な信号
対雑音比をもたらす。
ピクセルを分類し、ピクセルに存在する発蛍光団の量を
測定するシステムを提供することによって、現在既知の
機器構成の欠点を改善するもので、特定性及びスループ
ットの両方を考慮することによって、測定に最適な信号
対雑音比をもたらす。
【００６５】本発明の目的は、染色体の分析方法及びシ
ステムを提供することである。
ステムを提供することである。
【００６６】本発明のもう一つの目的は、染色体異常の
迅速な検出のための方法及びシステムを提供することで
ある。
迅速な検出のための方法及びシステムを提供することで
ある。
【００６７】さらに、本発明のもう一つの目的は、カラ
ー核型を提供するための方法及びシステムを提供するこ
とである。
ー核型を提供するための方法及びシステムを提供するこ
とである。
【００６８】さらに、本発明のもう一つの目的は、デー
タ収集のために広帯域フィルタを用いることによって、
高い信号対雑音比と短い時間で、本発明の上記の目的を
達成することが可能な方法及びシステムを提供すること
である。本発明のこれらの目的及び他の目的ついての詳
細を下記に説明する。
タ収集のために広帯域フィルタを用いることによって、
高い信号対雑音比と短い時間で、本発明の上記の目的を
達成することが可能な方法及びシステムを提供すること
である。本発明のこれらの目的及び他の目的ついての詳
細を下記に説明する。
【００６９】
【発明の実施の形態】本発明は、複数の広帯域励起そし
て／あるいは発光フィルタを介してフィルタされた蛍光
スペクトルに応じて、ピクセルをピクセルのグループに
分類するための、また、ピクセルに存在する発蛍光団の
量を、相対的あるいは絶対的に測定するための方法及び
装置に関する。本発明は、本来の位置で蛍光彩色された
染色体に存在するピクセルを、各グループが異なる染色
体から得られる遺伝物質に関連するピクセルのグループ
に分類するために、また、いずれのピクセルに存在する
発蛍光団の量をも測定するために用いることができる。
特に、本発明は、カラー（スペクトル）核型を提供し、
それによって染色体異を検出する目的で、染色体の分類
に用いることができる。
て／あるいは発光フィルタを介してフィルタされた蛍光
スペクトルに応じて、ピクセルをピクセルのグループに
分類するための、また、ピクセルに存在する発蛍光団の
量を、相対的あるいは絶対的に測定するための方法及び
装置に関する。本発明は、本来の位置で蛍光彩色された
染色体に存在するピクセルを、各グループが異なる染色
体から得られる遺伝物質に関連するピクセルのグループ
に分類するために、また、いずれのピクセルに存在する
発蛍光団の量をも測定するために用いることができる。
特に、本発明は、カラー（スペクトル）核型を提供し、
それによって染色体異を検出する目的で、染色体の分類
に用いることができる。
【００７０】図面及びその説明から、本発明による方法
の原理及び作用を理解することができる。
の原理及び作用を理解することができる。
【００７１】スペクトル結像は、物体のすべてのポイン
ト（ピクセル）から発光するスペクトルの測定を可能に
する技術である。スペクトル映像装置（結像分光計とし
てもここに言及する）は、その視野に置かれた物体のす
べてのポイントからの発光スペクトルを測定し、後の検
索及び分析のためにメモリに保存する計測器である。ス
ペクトル画像は、スペクトル映像装置によって測定され
た物体のスペクトルのコレクションであり、通常、二次
元が画像（ｘ及びｙ）で一次元がスペクトル軸（λ）で
ある三次元空間に輝度関数として定義され整理される。
ゆえに、スペクトル画像は、通常、データの「立方体」
すなわち「スペクトル・キューブ」として言及される。
ト（ピクセル）から発光するスペクトルの測定を可能に
する技術である。スペクトル映像装置（結像分光計とし
てもここに言及する）は、その視野に置かれた物体のす
べてのポイントからの発光スペクトルを測定し、後の検
索及び分析のためにメモリに保存する計測器である。ス
ペクトル画像は、スペクトル映像装置によって測定され
た物体のスペクトルのコレクションであり、通常、二次
元が画像（ｘ及びｙ）で一次元がスペクトル軸（λ）で
ある三次元空間に輝度関数として定義され整理される。
ゆえに、スペクトル画像は、通常、データの「立方体」
すなわち「スペクトル・キューブ」として言及される。
【００７２】従来の技術には、スペクトル画像（すなわ
ち、スペクトル・キューブ）を測定するための色々な方
法がある。これらの方法に従ってデザインされた装置
は、集光光学素子、分散要素（例えば、格子）、フィル
タ（例えば、狭干渉フィルタ、AOTF あるいは LCTF）あ
るいは干渉計、集束光学素子、そして検出器の二次元ア
レイ（通常、可視域におけるＣＣＤ、そして赤外線域に
おける他タイプの検出器）を含む。
ち、スペクトル・キューブ）を測定するための色々な方
法がある。これらの方法に従ってデザインされた装置
は、集光光学素子、分散要素（例えば、格子）、フィル
タ（例えば、狭干渉フィルタ、AOTF あるいは LCTF）あ
るいは干渉計、集束光学素子、そして検出器の二次元ア
レイ（通常、可視域におけるＣＣＤ、そして赤外線域に
おける他タイプの検出器）を含む。
【００７３】各々の方法には、利点と欠点とがあるが、
米国特許第５,５３９,５１７号と顕微鏡検査法のジャー
ナル [Vol. 182, pp. 133-140, 1996] に示されるよう
に、特別なタイプの三角形の干渉計に基づくスペクトル
映像装置には、以前のスペクトル映像装置にない、コン
パクトで安定性が良いという利点がある。米国特許第
５,５３９,５１７号に開示された発明によるスペクトル
映像装置は、イスラエルのアプライド・スペクトラル・
イメージング社 (Applied Spectral Imaging Ltd., Ind
ustrial Park, Migdal Haemek, Israel) によって開発
されたもので、下記にスペクトラキューブとして言及さ
れる。
米国特許第５,５３９,５１７号と顕微鏡検査法のジャー
ナル [Vol. 182, pp. 133-140, 1996] に示されるよう
に、特別なタイプの三角形の干渉計に基づくスペクトル
映像装置には、以前のスペクトル映像装置にない、コン
パクトで安定性が良いという利点がある。米国特許第
５,５３９,５１７号に開示された発明によるスペクトル
映像装置は、イスラエルのアプライド・スペクトラル・
イメージング社 (Applied Spectral Imaging Ltd., Ind
ustrial Park, Migdal Haemek, Israel) によって開発
されたもので、下記にスペクトラキューブとして言及さ
れる。
【００７４】下記により詳細に表されるスペクトラキュ
ーブ・システムを、彩色染色体を示すピクセルのスペク
トルを得るために用い、その後、そのスペクトルを本発
明の方法による分類を行うために用いた。
ーブ・システムを、彩色染色体を示すピクセルのスペク
トルを得るために用い、その後、そのスペクトルを本発
明の方法による分類を行うために用いた。
【００７５】スペクトル画像測定の重要性は、物体を形
成する物質の成分についての情報がその発光スペクトル
から得られるという事実にある。したがって、（例え
ば、白黒あるいはカラーの通常の映像化によって）さも
なければ見ることができないような現象をマッピングし
視覚化するために用いることができる。カラー画像が白
黒画像後の次のステップであるように、スペクトル画像
はカラー画像に続く次のステップである。二つの異なる
タイプの樹木の葉の、あるいは若い葉と古い葉との間の
緑色の色合いに違いがあるように、テキサス・レッド及
びローダミン等の二つの蛍光染料は、肉眼には同じ色の
ように見えるが、１０ナノメートルの解像度を持つスペ
クトルグラフによれば十分に識別可能である。ギムザで
染色された白血球等の複雑な生物学系は、白色光の透過
による顕微鏡を介した眼には、異なるレベルの輝度にあ
る紫、青、そして赤色の領域から構成された構造を持つ
物体として写る。肉眼で認知される色は、単に三色、
赤、緑及び青（ＲＧＢ）の組合せから構成されるため、
細胞中の、色によって分類可能な異なる領域の数は非常
に限られている。同じ細胞の各ポイントに対して、スペ
クトル映像装置は、そのポイントに存在する化学物質に
依存するスペクトルを測定するもので、そのスペクトル
は、カラー画像のように単に三色からなるのではなく、
（物質及び測定スペクトル解像度に応じて）５０から２
００程度のデータを含む波長の関数である。したがっ
て、眼では同色のクラスに属すると認識されてしまうよ
うなピクセル間の小さなスペクトル差あるいは移行も、
スペクトル映像装置には検出可能であるため、肉眼ある
いは同等な手段（例えば、従来のＲＧＢカラー画像）に
比べ、スペクトル映像装置を用いることで、細胞内のよ
り多くの生物学的構造あるいは構成要素が分類及び識別
可能である。
成する物質の成分についての情報がその発光スペクトル
から得られるという事実にある。したがって、（例え
ば、白黒あるいはカラーの通常の映像化によって）さも
なければ見ることができないような現象をマッピングし
視覚化するために用いることができる。カラー画像が白
黒画像後の次のステップであるように、スペクトル画像
はカラー画像に続く次のステップである。二つの異なる
タイプの樹木の葉の、あるいは若い葉と古い葉との間の
緑色の色合いに違いがあるように、テキサス・レッド及
びローダミン等の二つの蛍光染料は、肉眼には同じ色の
ように見えるが、１０ナノメートルの解像度を持つスペ
クトルグラフによれば十分に識別可能である。ギムザで
染色された白血球等の複雑な生物学系は、白色光の透過
による顕微鏡を介した眼には、異なるレベルの輝度にあ
る紫、青、そして赤色の領域から構成された構造を持つ
物体として写る。肉眼で認知される色は、単に三色、
赤、緑及び青（ＲＧＢ）の組合せから構成されるため、
細胞中の、色によって分類可能な異なる領域の数は非常
に限られている。同じ細胞の各ポイントに対して、スペ
クトル映像装置は、そのポイントに存在する化学物質に
依存するスペクトルを測定するもので、そのスペクトル
は、カラー画像のように単に三色からなるのではなく、
（物質及び測定スペクトル解像度に応じて）５０から２
００程度のデータを含む波長の関数である。したがっ
て、眼では同色のクラスに属すると認識されてしまうよ
うなピクセル間の小さなスペクトル差あるいは移行も、
スペクトル映像装置には検出可能であるため、肉眼ある
いは同等な手段（例えば、従来のＲＧＢカラー画像）に
比べ、スペクトル映像装置を用いることで、細胞内のよ
り多くの生物学的構造あるいは構成要素が分類及び識別
可能である。
【００７６】例えば、Ｘ・Ｆ・ワン氏及びＢ・ハーマン
氏によって編集された蛍光結像分光分析法及び顕微鏡検
査法（Fluorescence Imaging Spectroscopy and Micros
copy, edited by X. F. Wang and B. Herman, Vol. 137
pp. 87-124, 1996, John Wiley & Sons）においては、
壁が核の一部と認知される単純カラー画像とは正反対
に、スペクトル画像では、核壁が核の他の部分からはっ
きりと区別されて示されている（同書１１５ページ図
４.１０ｄを参照）。
氏によって編集された蛍光結像分光分析法及び顕微鏡検
査法（Fluorescence Imaging Spectroscopy and Micros
copy, edited by X. F. Wang and B. Herman, Vol. 137
pp. 87-124, 1996, John Wiley & Sons）においては、
壁が核の一部と認知される単純カラー画像とは正反対
に、スペクトル画像では、核壁が核の他の部分からはっ
きりと区別されて示されている（同書１１５ページ図
４.１０ｄを参照）。
【００７７】Ｅ．シュロエク氏らのヒト染色体の多色ス
ペクトル核型分析（E. Schroeck et al. (1996) Multi
color spectral karyotyping of human chromosomes.
Science, 273, 494-497）においては、米国特許第５,５
３９,５１７号に開示されたスペクトル映像装置を、蛍
光 DNA ハイブリダイゼーション（FISH）技術と組合せ
て用い、組合せ彩色染色体（人間及び動物）を分析する
方法が示されている。これによれば、核型分析、染色体
数及び染色体異常を、容易に、そして確実に見つけ特徴
づけることができる。
ペクトル核型分析（E. Schroeck et al. (1996) Multi
color spectral karyotyping of human chromosomes.
Science, 273, 494-497）においては、米国特許第５,５
３９,５１７号に開示されたスペクトル映像装置を、蛍
光 DNA ハイブリダイゼーション（FISH）技術と組合せ
て用い、組合せ彩色染色体（人間及び動物）を分析する
方法が示されている。これによれば、核型分析、染色体
数及び染色体異常を、容易に、そして確実に見つけ特徴
づけることができる。
【００７８】この技術によれば、各染色体は、多数の染
料のセットの中から選んだ蛍光染料の異なる組合せを含
む相補的な DNA 物質で交雑されるため、分裂中期スプ
レッドの各染色体は、その表面上に、異なる蛍光スペク
トルを均一に発光する。通常、各染色体を、五つの染料
のセットから選択した最大で三つの染料（例えば、一
つ、二つあるいは三つの染料）からの異なる組合せで標
識することで、各染色体に対して一つずつ、２４の異な
る蛍光スペクトルをもたらすことができる。これは、
（２４の異なるスペクトル、すなわち染料の２４の組合
せを必要とする）ヒト染色体、（２４とは数が異なる）
ネズミ及びサル染色体、そして健康な、そして病んだ
（例えば、癌性の）細胞に対して行われる。この方法を
用いることで、転座のスペクトルが明らかに周囲の染色
体とは異なり際立つため、瞬時に、そして確実に転座を
検出及び識別することができる。他方、今日広く用いら
れているＧバンディング技術によって得られる情報は、
この目的においてそれほど有効ではない。
料のセットの中から選んだ蛍光染料の異なる組合せを含
む相補的な DNA 物質で交雑されるため、分裂中期スプ
レッドの各染色体は、その表面上に、異なる蛍光スペク
トルを均一に発光する。通常、各染色体を、五つの染料
のセットから選択した最大で三つの染料（例えば、一
つ、二つあるいは三つの染料）からの異なる組合せで標
識することで、各染色体に対して一つずつ、２４の異な
る蛍光スペクトルをもたらすことができる。これは、
（２４の異なるスペクトル、すなわち染料の２４の組合
せを必要とする）ヒト染色体、（２４とは数が異なる）
ネズミ及びサル染色体、そして健康な、そして病んだ
（例えば、癌性の）細胞に対して行われる。この方法を
用いることで、転座のスペクトルが明らかに周囲の染色
体とは異なり際立つため、瞬時に、そして確実に転座を
検出及び識別することができる。他方、今日広く用いら
れているＧバンディング技術によって得られる情報は、
この目的においてそれほど有効ではない。
【００７９】各スペクトルに対して３００ｘ３００のピ
クセルと５０の波長とで構成されるスペクトル画像は、
およそ４.５メガバイトのファイルになる。米国特許第
５,５３９,５１７号に説明されたシステムにおいては、
各ピクセルに対するインターフェログラムは、フーリエ
変換が行われる前に各測定に対して少なくとも二倍の数
のデータ、９.０メガバイトを含んでいる。これは多量
のデータであり、収集に長時間を要するとともに多量の
メモリを費やすものである。
クセルと５０の波長とで構成されるスペクトル画像は、
およそ４.５メガバイトのファイルになる。米国特許第
５,５３９,５１７号に説明されたシステムにおいては、
各ピクセルに対するインターフェログラムは、フーリエ
変換が行われる前に各測定に対して少なくとも二倍の数
のデータ、９.０メガバイトを含んでいる。これは多量
のデータであり、収集に長時間を要するとともに多量の
メモリを費やすものである。
【００８０】スピーチャ氏らが説明するように（Speich
er et al. (1996) Nature Genetics. 12:368-375 及び
Speicher et al. (1996) Bioimaging 4:52-64 を参
照）、蛍光色素識別が蛍光色素特定光学フィルタ（狭帯
域フィルタ）を介した単一輝度測定に基づく蛍光外顕微
鏡検査法は、染色体分類にも適用可能であるが、上記発
明の背景で説明したように、データを得るために用いる
フィルタには蛍光色素特定性があるため、この方法には
固有の限界がある。染色体彩色に利用可能なほとんどの
発蛍光団の発光スペクトルは、かなりの部分が重なり合
うため、これらのフィルタは、（ｉ）非常に狭く（例え
ば、各々、５から１０ｎｍ）そして、（ｉｉ）用いる発
蛍光団に厳密に、そして発光スペクトルが重なり合う度
合いに応じて選択される。多くの場合、フィルタは外周
光（励起あるいは発光ピークからではなく、肩の部分か
らの光）をフィルタするよう選ばれる。ゆえに、これら
のフィルタは、試験試料に存在する情報の大部分を取り
除いてしまうため、信号対雑音比が低くなり、分類の不
確実性が増す。その結果、この分析による診断の感度及
び特定性が低くなる。
er et al. (1996) Nature Genetics. 12:368-375 及び
Speicher et al. (1996) Bioimaging 4:52-64 を参
照）、蛍光色素識別が蛍光色素特定光学フィルタ（狭帯
域フィルタ）を介した単一輝度測定に基づく蛍光外顕微
鏡検査法は、染色体分類にも適用可能であるが、上記発
明の背景で説明したように、データを得るために用いる
フィルタには蛍光色素特定性があるため、この方法には
固有の限界がある。染色体彩色に利用可能なほとんどの
発蛍光団の発光スペクトルは、かなりの部分が重なり合
うため、これらのフィルタは、（ｉ）非常に狭く（例え
ば、各々、５から１０ｎｍ）そして、（ｉｉ）用いる発
蛍光団に厳密に、そして発光スペクトルが重なり合う度
合いに応じて選択される。多くの場合、フィルタは外周
光（励起あるいは発光ピークからではなく、肩の部分か
らの光）をフィルタするよう選ばれる。ゆえに、これら
のフィルタは、試験試料に存在する情報の大部分を取り
除いてしまうため、信号対雑音比が低くなり、分類の不
確実性が増す。その結果、この分析による診断の感度及
び特定性が低くなる。
【００８１】分類の目的に用いる蛍光外顕微鏡検査法の
アプローチには、干渉法のアプローチに比べて、さら
に、下記の限界が伴う。
アプローチには、干渉法のアプローチに比べて、さら
に、下記の限界が伴う。
【００８２】米国特許出願第０８/５７５,１９１号、０
８/６３５,８２０号、０８/７１８,８３１号及び０８/
７５９,３４２号、染色体分類のための方法及び装置に
おいては、全染色体ペイントを用いて染色体を彩色する
ステップが共有されている。このステップの後、用いる
分析及び装置は、選択する方法によって異なる。
８/６３５,８２０号、０８/７１８,８３１号及び０８/
７５９,３４２号、染色体分類のための方法及び装置に
おいては、全染色体ペイントを用いて染色体を彩色する
ステップが共有されている。このステップの後、用いる
分析及び装置は、選択する方法によって異なる。
【００８３】一つの方法によれば、分析試料の各ピクセ
ルからの全蛍光スペクトルを収集するために、干渉計に
基づくスペクトル映像装置が用いられている。この方法
では、各ピクセルは、その後、基準テンプレートを用い
て分析される。
ルからの全蛍光スペクトルを収集するために、干渉計に
基づくスペクトル映像装置が用いられている。この方法
では、各ピクセルは、その後、基準テンプレートを用い
て分析される。
【００８４】もう一つの方法によれば、主成分分析（PC
A）等の、測定スペクトルの非相関統計分析に基づいて
デザインされた一連の専用広帯域非相関整合フィルタ
（例えば、広波長帯あるいは他のもので電子的に駆動さ
れる干渉 AOTF や LCTF ）が、分析試料から非相関スペ
クトル・データを収集するために用いられる。
A）等の、測定スペクトルの非相関統計分析に基づいて
デザインされた一連の専用広帯域非相関整合フィルタ
（例えば、広波長帯あるいは他のもので電子的に駆動さ
れる干渉 AOTF や LCTF ）が、分析試料から非相関スペ
クトル・データを収集するために用いられる。
【００８５】これらの測定装置はすべて、光子除去率が
非常に低いため、信号対雑音比が高いという特徴があ
る。干渉計による方法は、波長分離のための狭いフィル
タによって限定されることはなく、非相関整合フィルタ
は、（完全透過ではないが）蛍光発光のスペクトル範囲
全体を透過させる。したがって、これらの方法を、ここ
に「高光子スループット・システム」あるいは HPTS と
して言及する。
非常に低いため、信号対雑音比が高いという特徴があ
る。干渉計による方法は、波長分離のための狭いフィル
タによって限定されることはなく、非相関整合フィルタ
は、（完全透過ではないが）蛍光発光のスペクトル範囲
全体を透過させる。したがって、これらの方法を、ここ
に「高光子スループット・システム」あるいは HPTS と
して言及する。
【００８６】また、１９９６年のスピーチャ氏らの「自
然遺伝学」（Nature Genetics. 12:368-375）及び「生
物結像」（Bioimaging 4:52-64）に表された、性能的に
狭い微分フィルタのセットを用いる染色体分類方法を、
ここに「低光子スループット・システム」あるいは LPT
S として言及する。 LPTS 微分フィルタにおいては、励
起フィルタは、狭いが、一度にほとんど一つの染料だけ
が励起される波長を透過させるように選択される。同様
に、対応する発光フィルタも、狭いが、一度にほとんど
一つの染料だけが発光する狭い波長範囲で選択される。
然遺伝学」（Nature Genetics. 12:368-375）及び「生
物結像」（Bioimaging 4:52-64）に表された、性能的に
狭い微分フィルタのセットを用いる染色体分類方法を、
ここに「低光子スループット・システム」あるいは LPT
S として言及する。 LPTS 微分フィルタにおいては、励
起フィルタは、狭いが、一度にほとんど一つの染料だけ
が励起される波長を透過させるように選択される。同様
に、対応する発光フィルタも、狭いが、一度にほとんど
一つの染料だけが発光する狭い波長範囲で選択される。
【００８７】組合せ彩色に用いられた各染料が励起さ
れ、そして重なり合わない波長範囲で測定される場合に
のみ、 LPTS の概念は、（低い信号対雑音比においてで
さえ）優れた染料分離を提供することができる。残念な
ことに、既存のすべての、そして実用化された染料は、
励起及び発光帯域においてかなりの部分が重なり合うた
め、測定信号に完全な染料特定性があるとは言えない。
この現象は図３から明白である。
れ、そして重なり合わない波長範囲で測定される場合に
のみ、 LPTS の概念は、（低い信号対雑音比においてで
さえ）優れた染料分離を提供することができる。残念な
ことに、既存のすべての、そして実用化された染料は、
励起及び発光帯域においてかなりの部分が重なり合うた
め、測定信号に完全な染料特定性があるとは言えない。
この現象は図３から明白である。
【００８８】図３は、例えば、テキサス・レッド及びス
ペクトラム・オレンジあるいはＣｙ５及びＣｙ５.５等
の、重なり合う励起及び発光スペクトルを持つ第一の発
蛍光団（Ｔ）及び第二の発蛍光団（Ｓ）の励起（Ｘ）及
び発光（Ｍ）スペクトルを示す。これらの染料と共に従
来の LPTS 技術で用いられるであろう各狭励起及び発光
フィルタ（Ｆ）（この場合１０ｎｍ）を矢印で示す。低
信号対雑音比が次の二つの要因から起こることは明らか
である。（ｉ）狭フィルタの光子拒否比率が高い、そし
て（ｉｉ）フィルタの透過波長が励起及び発光スペクト
ルのピークから遠く離れている。
ペクトラム・オレンジあるいはＣｙ５及びＣｙ５.５等
の、重なり合う励起及び発光スペクトルを持つ第一の発
蛍光団（Ｔ）及び第二の発蛍光団（Ｓ）の励起（Ｘ）及
び発光（Ｍ）スペクトルを示す。これらの染料と共に従
来の LPTS 技術で用いられるであろう各狭励起及び発光
フィルタ（Ｆ）（この場合１０ｎｍ）を矢印で示す。低
信号対雑音比が次の二つの要因から起こることは明らか
である。（ｉ）狭フィルタの光子拒否比率が高い、そし
て（ｉｉ）フィルタの透過波長が励起及び発光スペクト
ルのピークから遠く離れている。
【００８９】フィルタによって個別に各染料を特定し、
可能な限り重なり合いを避けるためには（決して完全に
避けることはできないが）、フィルタは非常に狭くなけ
ればならない。狭ければ狭いほど良い。しかし、そうす
ると、励起路において試料に入射する光子の数と、発光
路において測定される光子の数との両方がその性質上小
さくなってしまう。その結果、測定信号対雑音比は、非
常に低く、フィルタを通さない測定、あるいは本発明の
好適実施例による HPTS 測定よりも振幅が１０の二乗程
度低くなる。
可能な限り重なり合いを避けるためには（決して完全に
避けることはできないが）、フィルタは非常に狭くなけ
ればならない。狭ければ狭いほど良い。しかし、そうす
ると、励起路において試料に入射する光子の数と、発光
路において測定される光子の数との両方がその性質上小
さくなってしまう。その結果、測定信号対雑音比は、非
常に低く、フィルタを通さない測定、あるいは本発明の
好適実施例による HPTS 測定よりも振幅が１０の二乗程
度低くなる。
【００９０】本発明においては、分類のために広帯域の
励起及び発光フィルタが用いられる。このようなフィル
タは本質的に光子スループットが高いため、信号対雑音
比及び測定に対する信頼性が比較的に高くなり、この測
定に基づく診断に高い感度が得られ、診断の特定性が向
上する。
励起及び発光フィルタが用いられる。このようなフィル
タは本質的に光子スループットが高いため、信号対雑音
比及び測定に対する信頼性が比較的に高くなり、この測
定に基づく診断に高い感度が得られ、診断の特定性が向
上する。
【００９１】下記の例のところでさらに詳細に説明する
が、用いる蛍光染料の励起及び発光スペクトルの両方に
おけるスペクトルの重なり合いを、信号の直線性の仮定
の下で、専用の線形分解数学的アルゴリズムによって考
慮する。
が、用いる蛍光染料の励起及び発光スペクトルの両方に
おけるスペクトルの重なり合いを、信号の直線性の仮定
の下で、専用の線形分解数学的アルゴリズムによって考
慮する。
【００９２】手短かに、次のポイントを指摘する。第一
に、本発明によれば、従来の LPTS技術に比べて、励起
及び発光フィルタの幅が比較的に大きいために信号の特
定性が低くなることを、信号対雑音比をより高くするこ
とによって、また、線形分解アルゴリズムを用いること
によって補うことができる。
に、本発明によれば、従来の LPTS技術に比べて、励起
及び発光フィルタの幅が比較的に大きいために信号の特
定性が低くなることを、信号対雑音比をより高くするこ
とによって、また、線形分解アルゴリズムを用いること
によって補うことができる。
【００９３】第二に、下記に示す例は組合せ標識及びヒ
ト染色体の分類に関するが、本発明は、異なる発蛍光団
あるいはその組合せで染色された、すなわち標識された
多数の領域を含む如何なるタイプの試料にでも適用可能
であることは、同業者には明白である。
ト染色体の分類に関するが、本発明は、異なる発蛍光団
あるいはその組合せで染色された、すなわち標識された
多数の領域を含む如何なるタイプの試料にでも適用可能
であることは、同業者には明白である。
【００９４】したがって、本発明の目的は、データ収集
のために広帯域フィルタを用いることによって、蛍光外
顕微鏡検査法に関連して小数のフィルタを介して得られ
る小数のフレームの測定時間が潜在的に短く、干渉法ス
ペクトル画像処理における信号対雑音比の能力が高い方
法を提供することにある。
のために広帯域フィルタを用いることによって、蛍光外
顕微鏡検査法に関連して小数のフィルタを介して得られ
る小数のフレームの測定時間が潜在的に短く、干渉法ス
ペクトル画像処理における信号対雑音比の能力が高い方
法を提供することにある。
【００９５】本発明によれば、単一の発蛍光団あるいは
発蛍光団の組合せ（例えば、二つ、三つあるいは四つの
異なる発蛍光団）に関連させて、ピクセルをピクセルの
グループに分類する方法が提供される。これらの発蛍光
団は、複数の発蛍光団（例えば、四つの、あるいはそれ
以上の異なる発蛍光団）から選択される。異なるため、
発蛍光団の各々は、特徴のある励起及び発光スペクト
ル、そして特定の励起及び発光ピークを持つ（例えば、
図４ｂを参照）。
発蛍光団の組合せ（例えば、二つ、三つあるいは四つの
異なる発蛍光団）に関連させて、ピクセルをピクセルの
グループに分類する方法が提供される。これらの発蛍光
団は、複数の発蛍光団（例えば、四つの、あるいはそれ
以上の異なる発蛍光団）から選択される。異なるため、
発蛍光団の各々は、特徴のある励起及び発光スペクト
ル、そして特定の励起及び発光ピークを持つ（例えば、
図４ｂを参照）。
【００９６】本発明による方法の一つの実施例において
は、発蛍光団の特徴的な発光スペクトルとピークとを利
用する。このため、分類すべきピクセルの各々からデー
タを収集するために経時的に利用可能な複数の広帯域発
光フィルタを設け、ピクセルの各々に対して、複数の発
光フィルタの各々一つを（一度に）通過した後の光線の
輝度を記録する。この結果、各ピクセルを、複数の次元
を持つベクトルによって表すことができる。この場合、
次元の数は、用いた広帯域発光フィルタの数と等しい。
その後、各ピクセルに存在する複数の発蛍光団の各々を
評価するために、適当なアルゴリズムを用いることによ
って、各ピクセルを、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団
の任意の組合せとの関連に応じて、ピクセルのグループ
に分類する。
は、発蛍光団の特徴的な発光スペクトルとピークとを利
用する。このため、分類すべきピクセルの各々からデー
タを収集するために経時的に利用可能な複数の広帯域発
光フィルタを設け、ピクセルの各々に対して、複数の発
光フィルタの各々一つを（一度に）通過した後の光線の
輝度を記録する。この結果、各ピクセルを、複数の次元
を持つベクトルによって表すことができる。この場合、
次元の数は、用いた広帯域発光フィルタの数と等しい。
その後、各ピクセルに存在する複数の発蛍光団の各々を
評価するために、適当なアルゴリズムを用いることによ
って、各ピクセルを、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団
の任意の組合せとの関連に応じて、ピクセルのグループ
に分類する。
【００９７】本発明による方法のもう一つの好適実施例
においては、発蛍光団の特徴的な発光及び励起スペクト
ルとピークとの両方を利用する。このため、分類すべき
ピクセルの各々からデータを収集するために経時的に利
用可能な広帯域励起フィルタ及び広帯域発光フィルタの
複数の対を設け、各ピクセルの発蛍光団を、広帯域励起
フィルタの一つを介した光で励起し、その対になる発光
フィルタを通過させ放射光線の輝度を記録する。この手
順をすべての対のフィルタに対して繰り返すことによっ
て、各ピクセルを、次元の数がフィルタの対の数に等し
い複数の次元を持つベクトルによって表すことができ
る。先の方法と同様に、適当なアルゴリズムを用いて、
各ピクセルに存在する複数の発蛍光団の各々を評価す
る。その結果、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合
せとの関連に応じて、各ピクセルをピクセルのグループ
に分類する。
においては、発蛍光団の特徴的な発光及び励起スペクト
ルとピークとの両方を利用する。このため、分類すべき
ピクセルの各々からデータを収集するために経時的に利
用可能な広帯域励起フィルタ及び広帯域発光フィルタの
複数の対を設け、各ピクセルの発蛍光団を、広帯域励起
フィルタの一つを介した光で励起し、その対になる発光
フィルタを通過させ放射光線の輝度を記録する。この手
順をすべての対のフィルタに対して繰り返すことによっ
て、各ピクセルを、次元の数がフィルタの対の数に等し
い複数の次元を持つベクトルによって表すことができ
る。先の方法と同様に、適当なアルゴリズムを用いて、
各ピクセルに存在する複数の発蛍光団の各々を評価す
る。その結果、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合
せとの関連に応じて、各ピクセルをピクセルのグループ
に分類する。
【００９８】本発明のもう一つの実施例においては、透
過スペクトルに対して広帯域である以外に条件をつけず
（例えば、スペクトル範囲幅の１０分の１程度の、例え
ば２０から７０ｎｍ、好ましくは３０から５０ｎｍ）、
分類すべきピクセルの各々からデータを収集するために
対として経時的に利用可能な広帯域励起及び発光フィル
タの複数の対を設ける。
過スペクトルに対して広帯域である以外に条件をつけず
（例えば、スペクトル範囲幅の１０分の１程度の、例え
ば２０から７０ｎｍ、好ましくは３０から５０ｎｍ）、
分類すべきピクセルの各々からデータを収集するために
対として経時的に利用可能な広帯域励起及び発光フィル
タの複数の対を設ける。
【００９９】したがって、各ピクセルの発蛍光団を、広
帯域励起フィルタの一つを介した光で励起し、その対に
なる発光フィルタを通過させた放射光線の輝度を記録す
る。この手順をすべての対のフィルタに対して繰り返す
ことによって、各ピクセルを、次元数がフィルタの対の
数に等しい複数の次元を持つベクトルによって表す。先
の方法と同様、適当なアルゴリズムを用いて、各ピクセ
ルにおける複数の発蛍光団の各々の存在を評価する。そ
の結果、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せとの
関連に応じて、各ピクセルをピクセルのグループに分類
する。
帯域励起フィルタの一つを介した光で励起し、その対に
なる発光フィルタを通過させた放射光線の輝度を記録す
る。この手順をすべての対のフィルタに対して繰り返す
ことによって、各ピクセルを、次元数がフィルタの対の
数に等しい複数の次元を持つベクトルによって表す。先
の方法と同様、適当なアルゴリズムを用いて、各ピクセ
ルにおける複数の発蛍光団の各々の存在を評価する。そ
の結果、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せとの
関連に応じて、各ピクセルをピクセルのグループに分類
する。
【０１００】スピーチャ氏らの文献（Speicher et al.
(1996) Nature Genetics. 12:368-375 及び Speicher
et al. (1996) Bioimaging 4:52-64）に表された従来の
技術における方法に用いられるフィルタと、本発明の方
法に用いられる広帯域フィルタとは、多くの点で異な
る。フィルタの物理的な性質の説明に移る前に、フィル
タを選択する上で考慮すべき点を簡単に述べる。主に考
慮すべき二つの点は、スループット及び染料特定性であ
る（染料特定性の欠如は下記のアルゴリズムによって補
正できるため、スループットがより重要である）。
(1996) Nature Genetics. 12:368-375 及び Speicher
et al. (1996) Bioimaging 4:52-64）に表された従来の
技術における方法に用いられるフィルタと、本発明の方
法に用いられる広帯域フィルタとは、多くの点で異な
る。フィルタの物理的な性質の説明に移る前に、フィル
タを選択する上で考慮すべき点を簡単に述べる。主に考
慮すべき二つの点は、スループット及び染料特定性であ
る（染料特定性の欠如は下記のアルゴリズムによって補
正できるため、スループットがより重要である）。
【０１０１】最大の特定性と択一的に最大なスループッ
トの各々が独立的により高い信号対雑音比をもたらすた
め、単独に選択することができるなら、染料特定性及び
スループットの両方が最大になるように選択すべきであ
る。しかし、染料特定性とスループットとは、両立しな
いパラメータであるため、最適化する必要がある。
トの各々が独立的により高い信号対雑音比をもたらすた
め、単独に選択することができるなら、染料特定性及び
スループットの両方が最大になるように選択すべきであ
る。しかし、染料特定性とスループットとは、両立しな
いパラメータであるため、最適化する必要がある。
【０１０２】したがって、唯一の条件が染料特定性であ
る場合は、各励起フィルタを、特定の発蛍光団を励起さ
せるようにほぼ特定させて選択し、各発光フィルタを、
特定の発蛍光団からの発光を透過するようにほぼ特定さ
せて選択する。他方、唯一の条件がスループットである
場合は、励起及び発光フィルタの両方を非常に広く選択
し、スループットを最大にする。しかし、染料特定性と
スループットとがそれぞれ単独の条件となることはない
ため、最終結果として最大の信号対雑音比を得るよう、
特定性とスループットとの両方に補正が必要である。し
たがって、本発明においては、励起及び発光フィルタの
帯域幅を、選択した発蛍光団に最適な補正となるように
選ぶことが好ましい。また、フィルタの透過にスペクト
ルが依存することからも、最適化が可能であることがわ
かる。例えば、通常、このようなスペクトルは、中央に
位置する３分の１の領域においてピークに達するため、
どの特定の発蛍光団においても、励起あるいは発光スペ
クトルの中央の３分の１において高いスループットが得
られる。他方、特定性は、全く重なり合わない、あるい
は僅かに重なり合う領域で（例えば、一つの発蛍光団が
非常に強く発光するのに対して、他のものが弱く発光す
る波長範囲において）得られる。本発明においては、こ
れらの相いれない条件から、最も適切な励起及び発光フ
ィルタを選択することになる。適当なフィルタは、およ
そ３０から７０ｎｍ、あるいはそれ以上の広帯域を持ち
（下記の表４を参照）、広帯域フィルタの帯域幅は、選
択した発蛍光団にかなり依存し、特に、選択した発蛍光
団の励起あるいは発光スペクトルが重なり合う程度に依
存する。
る場合は、各励起フィルタを、特定の発蛍光団を励起さ
せるようにほぼ特定させて選択し、各発光フィルタを、
特定の発蛍光団からの発光を透過するようにほぼ特定さ
せて選択する。他方、唯一の条件がスループットである
場合は、励起及び発光フィルタの両方を非常に広く選択
し、スループットを最大にする。しかし、染料特定性と
スループットとがそれぞれ単独の条件となることはない
ため、最終結果として最大の信号対雑音比を得るよう、
特定性とスループットとの両方に補正が必要である。し
たがって、本発明においては、励起及び発光フィルタの
帯域幅を、選択した発蛍光団に最適な補正となるように
選ぶことが好ましい。また、フィルタの透過にスペクト
ルが依存することからも、最適化が可能であることがわ
かる。例えば、通常、このようなスペクトルは、中央に
位置する３分の１の領域においてピークに達するため、
どの特定の発蛍光団においても、励起あるいは発光スペ
クトルの中央の３分の１において高いスループットが得
られる。他方、特定性は、全く重なり合わない、あるい
は僅かに重なり合う領域で（例えば、一つの発蛍光団が
非常に強く発光するのに対して、他のものが弱く発光す
る波長範囲において）得られる。本発明においては、こ
れらの相いれない条件から、最も適切な励起及び発光フ
ィルタを選択することになる。適当なフィルタは、およ
そ３０から７０ｎｍ、あるいはそれ以上の広帯域を持ち
（下記の表４を参照）、広帯域フィルタの帯域幅は、選
択した発蛍光団にかなり依存し、特に、選択した発蛍光
団の励起あるいは発光スペクトルが重なり合う程度に依
存する。
【０１０３】スピーチャ氏らの文献（Speicher et al.
(1996) Nature Genetics, 12:368-375 及び Speicher e
t al. (1996) Bioimaging 4:52-64）に表された従来の
技術による方法における唯一の条件は、特定性にあっ
た。特定性を制限することなく適用可能な場合にのみ、
スループットは二次的なものとして考慮された。ゆえ
に、そこに用いたフィルタ、励起及び発光フィルタの両
方は、それに用いた発蛍光団の励起あるいは発光スペク
トルの肩の一部分（極端な３分の１）をカバーするため
に、通常、スペクトルに沿って配置されたフィルタに重
なり合わないように、非常に狭く選択された（例えば、
約１０ｎｍ）。
(1996) Nature Genetics, 12:368-375 及び Speicher e
t al. (1996) Bioimaging 4:52-64）に表された従来の
技術による方法における唯一の条件は、特定性にあっ
た。特定性を制限することなく適用可能な場合にのみ、
スループットは二次的なものとして考慮された。ゆえ
に、そこに用いたフィルタ、励起及び発光フィルタの両
方は、それに用いた発蛍光団の励起あるいは発光スペク
トルの肩の一部分（極端な３分の１）をカバーするため
に、通常、スペクトルに沿って配置されたフィルタに重
なり合わないように、非常に狭く選択された（例えば、
約１０ｎｍ）。
【０１０４】本発明の好適実施例においては、少なくと
も二つ、好ましくはそれ以上、三つ、四つ、あるいはそ
れ以上の広帯域発光フィルタは、重なり合う帯域を持
つ。同様に、本発明のもう一つの好適実施例において
も、少なくとも二つ、好ましくはそれ以上、三つ、四
つ、あるいはそれ以上の広帯域励起フィルタは、重なり
合う帯域を持つ。したがって、二つ以上の（励起あるい
は発光）フィルタが、二つ以上の発蛍光団からの発光を
励起あるいは通過させる。
も二つ、好ましくはそれ以上、三つ、四つ、あるいはそ
れ以上の広帯域発光フィルタは、重なり合う帯域を持
つ。同様に、本発明のもう一つの好適実施例において
も、少なくとも二つ、好ましくはそれ以上、三つ、四
つ、あるいはそれ以上の広帯域励起フィルタは、重なり
合う帯域を持つ。したがって、二つ以上の（励起あるい
は発光）フィルタが、二つ以上の発蛍光団からの発光を
励起あるいは通過させる。
【０１０５】広帯域発光フィルタの各々を、一方で、複
数の発蛍光団の中の一つの発蛍光団の発光スペクトルに
対応する帯域を持つように、他方で、その発蛍光団から
の発光のスループットが最高になるように選ぶことが好
ましい。また、広帯域発光フィルタの少なくとも一つ
（一つ以上、二つ、三つあるいは四つ等が好ましい）の
帯域を、その対応する発蛍光団の発光ピークに重なり合
うように選ぶことが好ましい。
数の発蛍光団の中の一つの発蛍光団の発光スペクトルに
対応する帯域を持つように、他方で、その発蛍光団から
の発光のスループットが最高になるように選ぶことが好
ましい。また、広帯域発光フィルタの少なくとも一つ
（一つ以上、二つ、三つあるいは四つ等が好ましい）の
帯域を、その対応する発蛍光団の発光ピークに重なり合
うように選ぶことが好ましい。
【０１０６】同様に、広帯域励起フィルタの各々を、一
方、複数の発蛍光団の中の一つの発蛍光団の励起スペク
トルに対応する帯域を持つように、他方、励起光のスル
ープットが最高になるように選ぶ。広帯域励起フィルタ
の少なくとも一つ（一つ以上で、二つ、三つあるいは四
つ等が好ましい）の帯域を、その対応する発蛍光団の励
起ピークに重なり合うように選ぶことが好ましい。
方、複数の発蛍光団の中の一つの発蛍光団の励起スペク
トルに対応する帯域を持つように、他方、励起光のスル
ープットが最高になるように選ぶ。広帯域励起フィルタ
の少なくとも一つ（一つ以上で、二つ、三つあるいは四
つ等が好ましい）の帯域を、その対応する発蛍光団の励
起ピークに重なり合うように選ぶことが好ましい。
【０１０７】さらに、下記に詳細に説明するが、本発明
に望ましいアルゴリズムは、線形分解アルゴリズムであ
る。このようなアルゴリズムは次のように機能する。第
一に、異なる分子の蛍光スペクトルは加算されるもの
で、一つのピクセルのスペクトルは、その中に存在する
すべての分子のスペクトルの総計であると仮定する。第
二に、交雑のために選ばれたｎ個の蛍光染料のスペクト
ルは、各々他から独立している、すなわち、それらのい
ずれもが他のものの一次結合として得られるものではな
い、と仮定する。第三に、ｎ対の励起／発光フィルタの
各々を介して測定したピクセルから、ｎ染料の各々から
得た信号の和として、同フィルタを介して測定し、その
特定の染料のピクセルに存在する分子の相対数（ｎ未知
数）で加重したものとして、数学的に信号を表現するこ
とによって、ｎ個の未知数を持つｎ一次方程式のセット
を作る。第四に、すべてのピクセルに対して、このｎ未
知数のｎ一次方程式を解くことによって、すべてのピク
セルに存在する各染料の相対量を見いだす。第五に、各
染色体に対して（各染色体が交雑された染料の組合せを
示す）既知の彩色計画を用い、各ピクセルに染色体番号
を割り当てる。そして第六に、各グループに属するピク
セルが互いに区別可能なように、各ピクセルを、その割
り当てられた染色体番号に応じた人工色で表示する。
に望ましいアルゴリズムは、線形分解アルゴリズムであ
る。このようなアルゴリズムは次のように機能する。第
一に、異なる分子の蛍光スペクトルは加算されるもの
で、一つのピクセルのスペクトルは、その中に存在する
すべての分子のスペクトルの総計であると仮定する。第
二に、交雑のために選ばれたｎ個の蛍光染料のスペクト
ルは、各々他から独立している、すなわち、それらのい
ずれもが他のものの一次結合として得られるものではな
い、と仮定する。第三に、ｎ対の励起／発光フィルタの
各々を介して測定したピクセルから、ｎ染料の各々から
得た信号の和として、同フィルタを介して測定し、その
特定の染料のピクセルに存在する分子の相対数（ｎ未知
数）で加重したものとして、数学的に信号を表現するこ
とによって、ｎ個の未知数を持つｎ一次方程式のセット
を作る。第四に、すべてのピクセルに対して、このｎ未
知数のｎ一次方程式を解くことによって、すべてのピク
セルに存在する各染料の相対量を見いだす。第五に、各
染色体に対して（各染色体が交雑された染料の組合せを
示す）既知の彩色計画を用い、各ピクセルに染色体番号
を割り当てる。そして第六に、各グループに属するピク
セルが互いに区別可能なように、各ピクセルを、その割
り当てられた染色体番号に応じた人工色で表示する。
【０１０８】好適実施例においては、下記の例において
実証するように、ここに説明した方法を、分裂中期の染
色体を分類するために、そして染色体の異常を検出する
ために用いる。このため、分裂中期染色体の遺伝物質に
発蛍光団を（交雑によって）結びつけることによって、
分裂中期染色体の各遺伝物質を、異なる発蛍光団あるい
は発蛍光団の組合せに結び付ける。これによって、上記
に説明したように、人工色をピクセルのグループに適用
すると、各染色体の遺伝物質を、他から識別可能な異な
る色に分類することができる。
実証するように、ここに説明した方法を、分裂中期の染
色体を分類するために、そして染色体の異常を検出する
ために用いる。このため、分裂中期染色体の遺伝物質に
発蛍光団を（交雑によって）結びつけることによって、
分裂中期染色体の各遺伝物質を、異なる発蛍光団あるい
は発蛍光団の組合せに結び付ける。これによって、上記
に説明したように、人工色をピクセルのグループに適用
すると、各染色体の遺伝物質を、他から識別可能な異な
る色に分類することができる。
【０１０９】本発明の好適実施例においては、発光フィ
ルタそして／あるいは励起フィルタの数は、用途に依存
し、用いる発蛍光団の数に等しいが、必ずしもそうであ
る必要はなく、少なく、あるいは多くフィルタを用い
て、適当な分解アルゴリズムあるいは他のもので分析す
ることが可能なベクトルを得ることができる。
ルタそして／あるいは励起フィルタの数は、用途に依存
し、用いる発蛍光団の数に等しいが、必ずしもそうであ
る必要はなく、少なく、あるいは多くフィルタを用い
て、適当な分解アルゴリズムあるいは他のもので分析す
ることが可能なベクトルを得ることができる。
【０１１０】本発明の一つの実施例においては、広帯域
励起そして／あるいは発光フィルタは単一のチューナブ
ル・フィルタによって代表される。このチューナブル・
フィルタは、 AOTF あるいは LCTF であることが好まし
い。複数の広帯域フィルタを代表するようチューナブル
・フィルタを連続的に調整するための情報をセットする
ことによって、可動部分を備える必要がないという利点
が生じる。
励起そして／あるいは発光フィルタは単一のチューナブ
ル・フィルタによって代表される。このチューナブル・
フィルタは、 AOTF あるいは LCTF であることが好まし
い。複数の広帯域フィルタを代表するようチューナブル
・フィルタを連続的に調整するための情報をセットする
ことによって、可動部分を備える必要がないという利点
が生じる。
【０１１１】さらに、本発明による上記の方法のため
に、その方法を実行するための装置が提供される。この
装置は、複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍光団あ
るいは発蛍光団の組合せに関連してピクセルをピクセル
のグループに分類するのためのものであり、各発蛍光団
には、特徴のある励起及び発光スペクトル及び特定的な
励起及び発光ピークがある。この装置には、選択した発
蛍光団を励起するに適当な範囲の波長の光を含む光線を
提供する光源が含まれる。さらに、この装置には、上記
の特徴を持つ複数の対の広帯域励起フィルタと広帯域発
光フィルタとが含まれる。さらに、この装置には、（コ
ンピュータ等の）自動、手動あるいは 半自動の制御装
置が含まれる。制御装置は、複数の対の中から一対を選
択し、広帯域励起フィルタの一つを介した光源からの光
で、各ピクセルの発蛍光団を励起し、そして、フィルタ
のすべての対に対して上記手順を繰り返すためのもので
ある。さらに、この装置には、発光フィルタを透過した
放射光線の輝度を記録するための光輝度記録装置が含ま
れる。その結果、各ピクセルを、次元数がフィルタの複
数の対の数に等しい複数の次元を持つベクトルによって
表すことができる。さらに、この装置には、各ピクセル
における複数の発蛍光団の各々の存在を評価するための
アルゴリズムを含む演算装置が含まれる。この演算装置
は、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連さ
せて、各ピクセルをピクセルのグループに分類するため
のものである。好適実施例においては、演算装置は、ピ
クセルが属するピクセルの各グループに独特な人工色を
与えるため、各グループに属するピクセルは、互いに識
別が可能である。
に、その方法を実行するための装置が提供される。この
装置は、複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍光団あ
るいは発蛍光団の組合せに関連してピクセルをピクセル
のグループに分類するのためのものであり、各発蛍光団
には、特徴のある励起及び発光スペクトル及び特定的な
励起及び発光ピークがある。この装置には、選択した発
蛍光団を励起するに適当な範囲の波長の光を含む光線を
提供する光源が含まれる。さらに、この装置には、上記
の特徴を持つ複数の対の広帯域励起フィルタと広帯域発
光フィルタとが含まれる。さらに、この装置には、（コ
ンピュータ等の）自動、手動あるいは 半自動の制御装
置が含まれる。制御装置は、複数の対の中から一対を選
択し、広帯域励起フィルタの一つを介した光源からの光
で、各ピクセルの発蛍光団を励起し、そして、フィルタ
のすべての対に対して上記手順を繰り返すためのもので
ある。さらに、この装置には、発光フィルタを透過した
放射光線の輝度を記録するための光輝度記録装置が含ま
れる。その結果、各ピクセルを、次元数がフィルタの複
数の対の数に等しい複数の次元を持つベクトルによって
表すことができる。さらに、この装置には、各ピクセル
における複数の発蛍光団の各々の存在を評価するための
アルゴリズムを含む演算装置が含まれる。この演算装置
は、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連さ
せて、各ピクセルをピクセルのグループに分類するため
のものである。好適実施例においては、演算装置は、ピ
クセルが属するピクセルの各グループに独特な人工色を
与えるため、各グループに属するピクセルは、互いに識
別が可能である。
【０１１２】本発明による方法及び装置は、少ないフィ
ルタと高いスループットに基づいているため、スペクト
ル解像度を高めるために多くのＣＣＤフレームの収集を
必要とし測定時間が長い従来の技術における干渉法に基
づくシステム（「ヒト染色体の多色スペクトル核型分
析」 E. Schroeck et al. (1996) Multicolor spectral
karyotyping of human chromosomes, Science, 273, 49
4-497）に比較して、少数のフレームを収集するだけで
よく、測定時間が短い。上記干渉法に基づくシステム
は、それでも、従来の技術におけるもう一つのフィルタ
に基づくシステム（「自然遺伝学」及び「生物結像」 S
peicher et al. (1996) Nature Genetics. 12:368-375;
and Speicher et al. (1996) Bioimaging 4:52-64）に
比べて、高いスループットを提供するものである。
ルタと高いスループットに基づいているため、スペクト
ル解像度を高めるために多くのＣＣＤフレームの収集を
必要とし測定時間が長い従来の技術における干渉法に基
づくシステム（「ヒト染色体の多色スペクトル核型分
析」 E. Schroeck et al. (1996) Multicolor spectral
karyotyping of human chromosomes, Science, 273, 49
4-497）に比較して、少数のフレームを収集するだけで
よく、測定時間が短い。上記干渉法に基づくシステム
は、それでも、従来の技術におけるもう一つのフィルタ
に基づくシステム（「自然遺伝学」及び「生物結像」 S
peicher et al. (1996) Nature Genetics. 12:368-375;
and Speicher et al. (1996) Bioimaging 4:52-64）に
比べて、高いスループットを提供するものである。
【０１１３】試料のピクセルに存在する発蛍光団の、相
対的な、あるいは絶対的な量を測定するために、さらに
同様なステップや装置構成要素を用いることができるこ
とは同業者には明らかである。これは、生物学の研究や
診断における多くの分野に利益をもたらす。
対的な、あるいは絶対的な量を測定するために、さらに
同様なステップや装置構成要素を用いることができるこ
とは同業者には明らかである。これは、生物学の研究や
診断における多くの分野に利益をもたらす。
【０１１４】さて、次の例を参照するが、これらの例
は、限定せずに、上記の説明と共に本発明を説明するも
のである。
は、限定せずに、上記の説明と共に本発明を説明するも
のである。
【０１１５】例１ 測定すべき染色体の準備
【０１１６】多色 FISH の出現は、基本研究及び遺伝子
の診断における分子細胞遺伝学の応用を広げた。すべて
の既存の多色 FISH 技術は、発光スペクトルが光学フィ
ルタで分離され得る蛍光プローブを用いることを必要と
する（「組合せ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法
を用いる DNA ハイブリダイゼーションによる七つの異
なる DNA プローブの同時の視覚化」 [Ried et al., (1
992) Simultaneous visualization of seven different
DNA probes by in situ hybridization usingcombinat
orial fluorescence and digital imaging microscopy.
Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89, 1388-1392; and, Ri
ed (Jan. 1994) Fluoreszenz in situHybridizierung i
n der genetischen Diagnostik, Faculty of theoretic
al medicine, Ruprecht-Karls University Heidelberg]
を参照）。
の診断における分子細胞遺伝学の応用を広げた。すべて
の既存の多色 FISH 技術は、発光スペクトルが光学フィ
ルタで分離され得る蛍光プローブを用いることを必要と
する（「組合せ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法
を用いる DNA ハイブリダイゼーションによる七つの異
なる DNA プローブの同時の視覚化」 [Ried et al., (1
992) Simultaneous visualization of seven different
DNA probes by in situ hybridization usingcombinat
orial fluorescence and digital imaging microscopy.
Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89, 1388-1392; and, Ri
ed (Jan. 1994) Fluoreszenz in situHybridizierung i
n der genetischen Diagnostik, Faculty of theoretic
al medicine, Ruprecht-Karls University Heidelberg]
を参照）。
【０１１７】染色体を分類し、それによって染色体異常
を検出するという目的で、多数のスペクトル的に重なり
合う標識プローブを（単一で、また、組合せで）測定し
分析するためにスペクトラキューブ・システムを用い
る、 FISH のための新規なアプローチが、最近紹介され
た（「ヒト染色体の多色スペクトル核型分析」 E. Schr
oeck et al. (1996) Multicolor spectral karyotyping
of human chromosomes.Science, 273, 494-497 を参
照）。
を検出するという目的で、多数のスペクトル的に重なり
合う標識プローブを（単一で、また、組合せで）測定し
分析するためにスペクトラキューブ・システムを用い
る、 FISH のための新規なアプローチが、最近紹介され
た（「ヒト染色体の多色スペクトル核型分析」 E. Schr
oeck et al. (1996) Multicolor spectral karyotyping
of human chromosomes.Science, 273, 494-497 を参
照）。
【０１１８】この新規なアプローチによれば、生物学的
試料のすべてのポイントにおいて正確なスペクトル・デ
ータを同時に測定可能なフーリエ分光分析法、 CCD 結
像及び光学顕微鏡検査法の組合せであるスペクトル生体
結像検査法が、ヒト染色体のすべてのタイプ（すなわ
ち、２４種）の、交雑に基づく多色の出現を視覚化し、
ヒトの核型カラー・マップを生成するために用いられ
る。
試料のすべてのポイントにおいて正確なスペクトル・デ
ータを同時に測定可能なフーリエ分光分析法、 CCD 結
像及び光学顕微鏡検査法の組合せであるスペクトル生体
結像検査法が、ヒト染色体のすべてのタイプ（すなわ
ち、２４種）の、交雑に基づく多色の出現を視覚化し、
ヒトの核型カラー・マップを生成するために用いられ
る。
【０１１９】ヒトの２４の染色体の各々、あるいは他の
動物の核種の各染色体を特定して標識するために、多く
の異なるセットの発蛍光団及びその組合せを用いること
ができることは同業者には明らかである。この例におい
ては、五つの染料のセットを用い、２４のヒト染色体の
各々を区別して標識するために、最高四つの染料の組合
せを用いる。しかし、これらの染料あるいは組合せを用
いる目的は、単に、説明のためであり、特定の染料そし
て／あるいはそれらの組合せの使用に、本発明の範囲を
限定する意図はない。
動物の核種の各染色体を特定して標識するために、多く
の異なるセットの発蛍光団及びその組合せを用いること
ができることは同業者には明らかである。この例におい
ては、五つの染料のセットを用い、２４のヒト染色体の
各々を区別して標識するために、最高四つの染料の組合
せを用いる。しかし、これらの染料あるいは組合せを用
いる目的は、単に、説明のためであり、特定の染料そし
て／あるいはそれらの組合せの使用に、本発明の範囲を
限定する意図はない。
【０１２０】現時点において好ましい染料及びそれらの
組合せを下記に説明する。
組合せを下記に説明する。
【０１２１】組合せ交雑アプローチに従って五つの発蛍
光団のセットから選択した４以下の異なる発蛍光団（ａ
からｅ、表１）の異なる組合せで各々を標識した２４の
染色体ペイント（１から２２、Ｘ及びＹ、表１）（異な
る発蛍光団及びそれらのスペクトルの特徴については表
３を、２４の染色体ペイントを得るために、表１にリス
トアップした発蛍光団を割当てることについては表２を
参照）を、リエド氏らの著書（「組み合わせ蛍光発光及
びデジタル結像顕微鏡検査法を用いる DNA ハイブリダ
イゼーションによる七つの異なる DNA プローブの同時
の視覚化」 [Ried et al., (1992) Simultaneous visua
lization of seven different DNA probes by in situ
hybridization using combinatorial fluorescence and
digitalimaging microscopy. Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 89, 1388-1392] を参照）で説明されているよう
に、準備した少数の無関係の男性の白血球の有糸分裂染
色体スプレッドに同時に交雑した。
光団のセットから選択した４以下の異なる発蛍光団（ａ
からｅ、表１）の異なる組合せで各々を標識した２４の
染色体ペイント（１から２２、Ｘ及びＹ、表１）（異な
る発蛍光団及びそれらのスペクトルの特徴については表
３を、２４の染色体ペイントを得るために、表１にリス
トアップした発蛍光団を割当てることについては表２を
参照）を、リエド氏らの著書（「組み合わせ蛍光発光及
びデジタル結像顕微鏡検査法を用いる DNA ハイブリダ
イゼーションによる七つの異なる DNA プローブの同時
の視覚化」 [Ried et al., (1992) Simultaneous visua
lization of seven different DNA probes by in situ
hybridization using combinatorial fluorescence and
digitalimaging microscopy. Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 89, 1388-1392] を参照）で説明されているよう
に、準備した少数の無関係の男性の白血球の有糸分裂染
色体スプレッドに同時に交雑した。
【０１２２】交雑した染色体を、スペクトラキューブ・
システムに接続した逆蛍光顕微鏡を介して視検し、各ピ
クセルの発光スペクトルを測定した。
システムに接続した逆蛍光顕微鏡を介して視検し、各ピ
クセルの発光スペクトルを測定した。
【０１２３】同様に、他の発蛍光団、発蛍光団の他の組
合せ、そして異なる標識化アプローチ（例えば、組合せ
標識）を用いることができることは同業者には明白であ
る。したがって、下記の表１及び表２にリストした情報
は、単に説明のためのものであり、本発明の範囲を、リ
ストした発蛍光団、発蛍光団の組合せ、そして／あるい
は標識化技術に限定する意図は全くない。
合せ、そして異なる標識化アプローチ（例えば、組合せ
標識）を用いることができることは同業者には明白であ
る。したがって、下記の表１及び表２にリストした情報
は、単に説明のためのものであり、本発明の範囲を、リ
ストした発蛍光団、発蛍光団の組合せ、そして／あるい
は標識化技術に限定する意図は全くない。
【０１２４】
【表１】
【０１２５】
【表２】
【０１２６】例２ スペクトルに関連したピクセルを
検索するために用いる装置
検索するために用いる装置
【０１２７】図１は、米国特許第５,５３９,５１７号に
開示された従来の技術による結像分光計の主構成要素を
示すブロック図である。この結像分光計は、高いスペク
トル解像度（波長に応じて約４から１４ｎｍ）及び空間
解像度（約３０／Ｍ μｍ、Ｍは顕微鏡あるいは前部光
学素子の有効拡大率）を持つ。
開示された従来の技術による結像分光計の主構成要素を
示すブロック図である。この結像分光計は、高いスペク
トル解像度（波長に応じて約４から１４ｎｍ）及び空間
解像度（約３０／Ｍ μｍ、Ｍは顕微鏡あるいは前部光
学素子の有効拡大率）を持つ。
【０１２８】したがって、図１の従来の結像分光計は、
２０と符号が付いた採光光学系、ブロック２２で示され
た一次元スキャナ、ブロック２４で示された光路差（OP
D）発生器あるいは干渉計、ブロック２６で示された一
次元あるいは二次元検出アレイ（二次元の方が好まし
い）及びブロック２８で示されたシグナル・プロセッサ
及びディスプレイを含む。
２０と符号が付いた採光光学系、ブロック２２で示され
た一次元スキャナ、ブロック２４で示された光路差（OP
D）発生器あるいは干渉計、ブロック２６で示された一
次元あるいは二次元検出アレイ（二次元の方が好まし
い）及びブロック２８で示されたシグナル・プロセッサ
及びディスプレイを含む。
【０１２９】システム２０における重要な要素は、 OPD
発生器あるいは干渉計２４であり、それは、分析され
る情景の各ピクセルから放射された光のスペクトル輝度
の一次結合の所定セットに対応する被変調光を出力する
ものである。干渉計からの出力は検出アレイに集束され
る。したがって、すべての必要な光学的位相差は、スペ
クトルの再構築に必要なすべての情報を得るために、視
野のすべてのピクセルに対して同時に走査される。情景
内のすべてのピクセルのスペクトルは、結像情報と共に
同時に集められるため、リアルタイムでの画像分析を可
能にする。
発生器あるいは干渉計２４であり、それは、分析され
る情景の各ピクセルから放射された光のスペクトル輝度
の一次結合の所定セットに対応する被変調光を出力する
ものである。干渉計からの出力は検出アレイに集束され
る。したがって、すべての必要な光学的位相差は、スペ
クトルの再構築に必要なすべての情報を得るために、視
野のすべてのピクセルに対して同時に走査される。情景
内のすべてのピクセルのスペクトルは、結像情報と共に
同時に集められるため、リアルタイムでの画像分析を可
能にする。
【０１３０】米国特許第５,５３９,５１７号による装置
は多種多様の構成が可能である。特に、用いられる干渉
計は、米国特許第５,５３９,５１７号の関連する図面に
示されるように、他の鏡と組み合わせてもよい。
は多種多様の構成が可能である。特に、用いられる干渉
計は、米国特許第５,５３９,５１７号の関連する図面に
示されるように、他の鏡と組み合わせてもよい。
【０１３１】したがって、米国特許第５,５３９,５１７
号によれば、別タイプの干渉計を用いることも可能であ
る。これらには、次のものが含まれる。（１）光を変調
するために OPD が変えられる可動タイプ干渉計、すな
わち、スキャン厚があるファブリ‐ペロ干渉計、（２）
採光光学系及びスキャナから光線を受け二つの光路に光
線を分けるビーム・スプリッタを含むマイケルソン型干
渉計、（３）オプションとして、上記に引用した米国特
許出願（同出願の図１４を参照）に述べられた、四つの
鏡とビーム・スプリッタとを持つ干渉計等の、他の光学
的手段と結合されるサグナック干渉計（この干渉計内で
は、 OPD は、入ってくる光の入射角に応じて変化す
る）。
号によれば、別タイプの干渉計を用いることも可能であ
る。これらには、次のものが含まれる。（１）光を変調
するために OPD が変えられる可動タイプ干渉計、すな
わち、スキャン厚があるファブリ‐ペロ干渉計、（２）
採光光学系及びスキャナから光線を受け二つの光路に光
線を分けるビーム・スプリッタを含むマイケルソン型干
渉計、（３）オプションとして、上記に引用した米国特
許出願（同出願の図１４を参照）に述べられた、四つの
鏡とビーム・スプリッタとを持つ干渉計等の、他の光学
的手段と結合されるサグナック干渉計（この干渉計内で
は、 OPD は、入ってくる光の入射角に応じて変化す
る）。
【０１３２】図２は、OPD が入射光の入射角に応じて変
化する干渉計を利用して米国特許第５,５３９,５１７号
に従って構成された結像分光計を示す。光軸に対して小
さな角度で干渉計に入る光線は、この角度に対し直線的
にかなり変化する OPD を生じる。
化する干渉計を利用して米国特許第５,５３９,５１７号
に従って構成された結像分光計を示す。光軸に対して小
さな角度で干渉計に入る光線は、この角度に対し直線的
にかなり変化する OPD を生じる。
【０１３３】図２の干渉計においては、すべてのピクセ
ルの源３０からのすべての光は、採光光学系３１によっ
て一直線にされた後、メカニカルスキャナ３２によって
走査される。光は、ビーム・スプリッタ３３を介して第
一の反射鏡３４へ、そして第二の反射鏡３５へ通され
る。この第二の反射鏡３５への光は、反射してビーム・
スプリッタ３３そして集束レンズ３６を介して検出器３
７（例えば、 CCD）のアレイへ送られる。この光線は、
ビーム・スプリッタ３３によって反射された光線に、次
に第二の反射鏡３５によって反射された光線に、最後に
第一の反射鏡３４によって反射された光線に干渉する。
ルの源３０からのすべての光は、採光光学系３１によっ
て一直線にされた後、メカニカルスキャナ３２によって
走査される。光は、ビーム・スプリッタ３３を介して第
一の反射鏡３４へ、そして第二の反射鏡３５へ通され
る。この第二の反射鏡３５への光は、反射してビーム・
スプリッタ３３そして集束レンズ３６を介して検出器３
７（例えば、 CCD）のアレイへ送られる。この光線は、
ビーム・スプリッタ３３によって反射された光線に、次
に第二の反射鏡３５によって反射された光線に、最後に
第一の反射鏡３４によって反射された光線に干渉する。
【０１３４】一回の走査の最後には、すべてのピクセル
がすべての OPD を介して測定されてしまうため、情景
の各ピクセルのスペクトルはフーリエ変換によって再構
築されることが可能である。光軸に平行な光線は補正さ
れ、光軸に対して角度（θ）にある光線は、ビーム・ス
プリッタ３３の厚さ、屈折率及び角度θの関数であるOP
D を生じる。小さな角度において OPD はθに比例す
る。適切な逆変換を適用することによって、また、注意
深いブックキーピングを行うことによって、すべてのピ
クセルのスペクトルが計算される。
がすべての OPD を介して測定されてしまうため、情景
の各ピクセルのスペクトルはフーリエ変換によって再構
築されることが可能である。光軸に平行な光線は補正さ
れ、光軸に対して角度（θ）にある光線は、ビーム・ス
プリッタ３３の厚さ、屈折率及び角度θの関数であるOP
D を生じる。小さな角度において OPD はθに比例す
る。適切な逆変換を適用することによって、また、注意
深いブックキーピングを行うことによって、すべてのピ
クセルのスペクトルが計算される。
【０１３５】図２の構成においては、角度β（図２では
β ＝ ４５度）にあるビーム・スプリッタ上に入射する
光線は、干渉計を OPD ＝ ０で通り抜けるが、一般の
角度β−θで入射する光線は、方程式（２）で与えられ
る OPD を生じる。
β ＝ ４５度）にあるビーム・スプリッタ上に入射する
光線は、干渉計を OPD ＝ ０で通り抜けるが、一般の
角度β−θで入射する光線は、方程式（２）で与えられ
る OPD を生じる。
【０１３６】
【数２】
【０１３７】この式において、βはビーム・スプリッタ
上への光線の入射角であり、θは、光軸からの光線の角
距あるいは中央位置に対する干渉計の回転角度であり、
ｔはビーム・スプリッタの厚みであり、ｎはビーム・ス
プリッタの屈折率である。
上への光線の入射角であり、θは、光軸からの光線の角
距あるいは中央位置に対する干渉計の回転角度であり、
ｔはビーム・スプリッタの厚みであり、ｎはビーム・ス
プリッタの屈折率である。
【０１３８】方程式２から、中央位置に対する正及び負
の両角度を走査することによって、すべてのピクセルに
対する両面の干渉写真が得られることが明らかであり、
このことは、位相誤差を消去するに助けとなり、フーリ
エ変換の計算により正確な結果が得られることになる。
走査振幅は、達成可能な最大 OPD を決めるため、測定
されたスペクトル解像度に影響を与える。角度ステップ
の大きさが OPD ステップを決定するが、 OPD ステップ
は、逆に、システム感度の良い最も短い波長によって規
定される。事実、試料採取の定理（「干渉分光分析法の
原理」 [Chamberlain (1979) The principles of inter
ferometric spectroscopy, John Wiley and Sons, pp.
53-55] を参照）によれば、この OPD ステップは、シス
テム感度の良い最も短い波長の半分よりも小さくなけれ
ばならない。
の両角度を走査することによって、すべてのピクセルに
対する両面の干渉写真が得られることが明らかであり、
このことは、位相誤差を消去するに助けとなり、フーリ
エ変換の計算により正確な結果が得られることになる。
走査振幅は、達成可能な最大 OPD を決めるため、測定
されたスペクトル解像度に影響を与える。角度ステップ
の大きさが OPD ステップを決定するが、 OPD ステップ
は、逆に、システム感度の良い最も短い波長によって規
定される。事実、試料採取の定理（「干渉分光分析法の
原理」 [Chamberlain (1979) The principles of inter
ferometric spectroscopy, John Wiley and Sons, pp.
53-55] を参照）によれば、この OPD ステップは、シス
テム感度の良い最も短い波長の半分よりも小さくなけれ
ばならない。
【０１３９】考慮すべきもう一つのパラメータは、マト
リクスにおける検出器要素の限られた大きさである。集
束光学素子を介して、この要素は、干渉計内に有限の O
PDを生じ、干渉写真に直角関数を巻き込む効果がある。
このことは、結果として、短い波長におけるシステム感
度の減少を引き起こし、要素によって生じる OPD以下の
波長に対してはゼロに落ちてしまう。この理由のため、
変調伝達関数（MTF）の条件が満足していることを保証
しなくてはならない。すなわち、干渉計内に検出器要素
によって生じる OPD は、この計測器の感度を満たす最
短波長よりも小さくなくてはならない。
リクスにおける検出器要素の限られた大きさである。集
束光学素子を介して、この要素は、干渉計内に有限の O
PDを生じ、干渉写真に直角関数を巻き込む効果がある。
このことは、結果として、短い波長におけるシステム感
度の減少を引き起こし、要素によって生じる OPD以下の
波長に対してはゼロに落ちてしまう。この理由のため、
変調伝達関数（MTF）の条件が満足していることを保証
しなくてはならない。すなわち、干渉計内に検出器要素
によって生じる OPD は、この計測器の感度を満たす最
短波長よりも小さくなくてはならない。
【０１４０】したがって、米国特許第５,５３９,５１７
号に開示された発明に従って構成された結像分光計は、
ただ単に、視野内のすべてのピクセルから来る光の輝度
のみを測るものではなく、予め定められた波長範囲内の
各ピクセルのスペクトルをも測るものである。また、ど
の時点においても、視野内の各ピクセルによって発せら
れた光が全てより良く利用されるため、先に説明したよ
うに、フレーム時間をかなり減少し分光計の感度をかな
り増加するものである。このような結像分光計は、種々
のタイプの干渉計、採光光学系及び集束システムを含ん
でもよく、そのため、医学的診断及び治療や生物学の研
究における用途、また、地質学や農業における調査等の
ための遠隔測定を含む多種多様な用途に用いられ得るも
のである。
号に開示された発明に従って構成された結像分光計は、
ただ単に、視野内のすべてのピクセルから来る光の輝度
のみを測るものではなく、予め定められた波長範囲内の
各ピクセルのスペクトルをも測るものである。また、ど
の時点においても、視野内の各ピクセルによって発せら
れた光が全てより良く利用されるため、先に説明したよ
うに、フレーム時間をかなり減少し分光計の感度をかな
り増加するものである。このような結像分光計は、種々
のタイプの干渉計、採光光学系及び集束システムを含ん
でもよく、そのため、医学的診断及び治療や生物学の研
究における用途、また、地質学や農業における調査等の
ための遠隔測定を含む多種多様な用途に用いられ得るも
のである。
【０１４１】上記のように、米国特許第５,５３９,５１
７号に開示された発明による結像分光計は、イスラエル
共和国にあるスペクトラル・ダイアグノスティクス社
（Spectral Diagnostics Ltd.; Industrial Park, Migd
al Haemek, Israel）によって開発されたもので、ここ
にスペクトラキューブ（SpectraCubeTM）として言及す
る。
７号に開示された発明による結像分光計は、イスラエル
共和国にあるスペクトラル・ダイアグノスティクス社
（Spectral Diagnostics Ltd.; Industrial Park, Migd
al Haemek, Israel）によって開発されたもので、ここ
にスペクトラキューブ（SpectraCubeTM）として言及す
る。
【０１４２】蛍光顕微鏡に光学的に接続されたスペクト
ラキューブ・システムを、彩色染色体試料からスペクト
ル・データを収集するために用い、本発明の方法に従っ
て、収集データを分析することによって、本方法の適用
性及びオペラビリティを証明する。スペクトル映像装置
として特別に用いたスペクトラキューブ・システムに
は、下記の表３にリストアップした特徴がある。
ラキューブ・システムを、彩色染色体試料からスペクト
ル・データを収集するために用い、本発明の方法に従っ
て、収集データを分析することによって、本方法の適用
性及びオペラビリティを証明する。スペクトル映像装置
として特別に用いたスペクトラキューブ・システムに
は、下記の表３にリストアップした特徴がある。
【０１４３】
【表３】
【０１４４】上記に説明したように、分裂中期の、本来
の位置で彩色した染色体の各ピクセルからスペクトル・
データを得るために、従来の技術によるスペクトラキュ
ーブ・システムを用いた。下記に説明するが、このデー
タは、発光フィルタをシミュレートすることによって、
本発明による方法のオペラビリティを確認するのに役立
った。
の位置で彩色した染色体の各ピクセルからスペクトル・
データを得るために、従来の技術によるスペクトラキュ
ーブ・システムを用いた。下記に説明するが、このデー
タは、発光フィルタをシミュレートすることによって、
本発明による方法のオペラビリティを確認するのに役立
った。
【０１４５】例３ 染色体の分類に数学的広帯域フィ
ルタを用いる本発明の方法のシミュレーション
ルタを用いる本発明の方法のシミュレーション
【０１４６】組合せ彩色においては、各染色体の遺伝物
質を、その染色体に特定性がある単一の発蛍光団あるい
は発蛍光団の組合せで標識した相補的な DNA 鎖で交雑
する。ヒト・ゲノムの２４の異なる染色体を検出し識別
するために、五つの特別に選択した発蛍光団の中から、
一つから四つを組み合わせる計画（上記例１を参照）を
開発した。しかし、原理的に、他の同様な計画を用いる
ことも可能であることは明白である。
質を、その染色体に特定性がある単一の発蛍光団あるい
は発蛍光団の組合せで標識した相補的な DNA 鎖で交雑
する。ヒト・ゲノムの２４の異なる染色体を検出し識別
するために、五つの特別に選択した発蛍光団の中から、
一つから四つを組み合わせる計画（上記例１を参照）を
開発した。しかし、原理的に、他の同様な計画を用いる
ことも可能であることは明白である。
【０１４７】結果として、分裂中期のピクセルは、その
ピクセルが、背景（染色体間の領域）に、あるいは特定
の染色体の遺伝物質に関わっているかどうかに依存する
蛍光スペクトルを発光する。背景における理論的な信号
はゼロであるはずだが、実際は、分裂中期染色体からの
散乱があるため、そして、さらに核酸物質が残留してい
るため、背景からも低い信号が測定される。
ピクセルが、背景（染色体間の領域）に、あるいは特定
の染色体の遺伝物質に関わっているかどうかに依存する
蛍光スペクトルを発光する。背景における理論的な信号
はゼロであるはずだが、実際は、分裂中期染色体からの
散乱があるため、そして、さらに核酸物質が残留してい
るため、背景からも低い信号が測定される。
【０１４８】直線的な仮定によれば、各ピクセルのスペ
クトルは、そのピクセルに存在するすべての発蛍光団の
蛍光スペクトルの和である。
クトルは、そのピクセルに存在するすべての発蛍光団の
蛍光スペクトルの和である。
【０１４９】発蛍光団「ｊ」に関わる励起及び発光フィ
ルタを介して測定される、染色体の、すなわち単一の発
蛍光団「ｉ」で着色した試料のある領域におけるピクセ
ルの蛍光信号Ｒij を、方程式（３３）に示す。
ルタを介して測定される、染色体の、すなわち単一の発
蛍光団「ｉ」で着色した試料のある領域におけるピクセ
ルの蛍光信号Ｒij を、方程式（３３）に示す。
【０１５０】
【数３】
【０１５１】ここで、Ｎi は、染料番号「ｉ」のみで彩
色した染色体のピクセルに存在する蛍光分子の数であ
り、μ及びλは、各々、励起及び発光の波長域であり、
Si は、染料番号「ｊ」の励起スペクトルであり、この
スペクトルには、光源それ自体からのスペクトルの寄
与、そして「ｊ」にマッチする励起フィルタのスペクト
ル透過が含まれる。またＯj は、顕微鏡の、そして発蛍
光団ｊに対する発光フィルタのスペクトル透過度、ＣＣ
Ｄ検出器のスペクトル感度、そして発光路上の他の光学
素子のスペクトル透過度の積である。Ｑi （λ、μ）
は、波長μにおける励起輝度による波長λにおける発蛍
光団ｉの量子効率であり、関数Ｑi （λ、μ）は、通
常、二つの個々の関数、励起スペクトルＱi x （μ）及
び発光スペクトルＱi e （λ）の積とみなされる。この
場合、λ及びμは、各々の範囲で変化する。
色した染色体のピクセルに存在する蛍光分子の数であ
り、μ及びλは、各々、励起及び発光の波長域であり、
Si は、染料番号「ｊ」の励起スペクトルであり、この
スペクトルには、光源それ自体からのスペクトルの寄
与、そして「ｊ」にマッチする励起フィルタのスペクト
ル透過が含まれる。またＯj は、顕微鏡の、そして発蛍
光団ｊに対する発光フィルタのスペクトル透過度、ＣＣ
Ｄ検出器のスペクトル感度、そして発光路上の他の光学
素子のスペクトル透過度の積である。Ｑi （λ、μ）
は、波長μにおける励起輝度による波長λにおける発蛍
光団ｉの量子効率であり、関数Ｑi （λ、μ）は、通
常、二つの個々の関数、励起スペクトルＱi x （μ）及
び発光スペクトルＱi e （λ）の積とみなされる。この
場合、λ及びμは、各々の範囲で変化する。
【０１５２】すべて、フィルタに対する透過光のスペク
トル幅及び波長依存についての、そして／あるいは組合
せ彩色に用いる異なる染料の信号間における重なり合い
の量についての仮定は、全く行われていないことに注意
して下さい。
トル幅及び波長依存についての、そして／あるいは組合
せ彩色に用いる異なる染料の信号間における重なり合い
の量についての仮定は、全く行われていないことに注意
して下さい。
【０１５３】一般に、方程式３に類似する表現を、ｎ個
の染料で彩色した染色体あるいは試料領域に属するどの
ピクセルに対しても当てはめることができるため、染料
番号「ｊ」にマッチする励起及び発光フィルタを介して
そのピクセルで測定される全蛍光スペクトル Fp を、直
線的な仮定の下で、各々が対象となるピクセルの各染料
に存在する分子の相対数、ｎi ／Ｎi によって加重され
た、染料すべてからの寄与の和として書き表すことがで
きる。１からｎまでの一つ以上の染料で彩色した染色体
上の一つのピクセルｐに対しては、励起及び発光フィル
タの対「ｊ」を介して測定されるＦpj 信号を次のよう
に書き表すことができる（方程式４）。
の染料で彩色した染色体あるいは試料領域に属するどの
ピクセルに対しても当てはめることができるため、染料
番号「ｊ」にマッチする励起及び発光フィルタを介して
そのピクセルで測定される全蛍光スペクトル Fp を、直
線的な仮定の下で、各々が対象となるピクセルの各染料
に存在する分子の相対数、ｎi ／Ｎi によって加重され
た、染料すべてからの寄与の和として書き表すことがで
きる。１からｎまでの一つ以上の染料で彩色した染色体
上の一つのピクセルｐに対しては、励起及び発光フィル
タの対「ｊ」を介して測定されるＦpj 信号を次のよう
に書き表すことができる（方程式４）。
【０１５４】
【数４】
【０１５５】ここで、ｎは、標識化に用いた染料の数
（この実施例では、ｎは５に等しい）であり、表現Ｒij
は、上記方程式３から得られるものである。
（この実施例では、ｎは５に等しい）であり、表現Ｒij
は、上記方程式３から得られるものである。
【０１５６】したがって、分裂中期にある、単に一つの
染料で彩色した染色体が既知であれば、これらの染色体
の信号Ｒij は、方程式４によって表される一次方程式
のセットの既知の係数である。Ｆpj は測定から知るこ
とができるため、このセットでは、ｎi ／Ｎi が未知数
である。もし係数Ｒij のセットが独立しているなら、
方程式４の一次方程式のセットからｎi ／Ｎi を解くこ
とができる。
染料で彩色した染色体が既知であれば、これらの染色体
の信号Ｒij は、方程式４によって表される一次方程式
のセットの既知の係数である。Ｆpj は測定から知るこ
とができるため、このセットでは、ｎi ／Ｎi が未知数
である。もし係数Ｒij のセットが独立しているなら、
方程式４の一次方程式のセットからｎi ／Ｎi を解くこ
とができる。
【０１５７】他の実施例においては、基準スペクトルＲ
ij は、以前の測定から既知であり、コンピュータ・ラ
イブラリに保存されている。例えば、これは、個別に一
つの染色体のみを一つの染料で交雑する測定をセットと
して行うことによって達成することができる。この場合
は、基準スペクトルに不要な染色体の非特定的な交雑を
避けることができるため、良い結果が得られる。
ij は、以前の測定から既知であり、コンピュータ・ラ
イブラリに保存されている。例えば、これは、個別に一
つの染色体のみを一つの染料で交雑する測定をセットと
して行うことによって達成することができる。この場合
は、基準スペクトルに不要な染色体の非特定的な交雑を
避けることができるため、良い結果が得られる。
【０１５８】パラメータ ｎi 及びＮi （ｉ＝１、・・
・ｎ）が、均一に彩色された染色体の各部分で一定であ
ることが理想的であるが、実際は、これらの値は、生物
学的ばらつき、測定ノイズや他の制御不可能な要素があ
るために、ピクセル毎に幾分変化する。次の説明を単純
にするために、それらが一定であると仮定し、偏差を測
定ノイズとして処理する。
・ｎ）が、均一に彩色された染色体の各部分で一定であ
ることが理想的であるが、実際は、これらの値は、生物
学的ばらつき、測定ノイズや他の制御不可能な要素があ
るために、ピクセル毎に幾分変化する。次の説明を単純
にするために、それらが一定であると仮定し、偏差を測
定ノイズとして処理する。
【０１５９】さらに、ｊ≠ｉに対してはＮi ＝ ０であ
るが、理想的に、単一の染料、例えば染料番号ｉで彩色
した染色体のピクセルにおいては、Ｎi はゼロではない
ことを既に指摘している。二つの染料、例えばｋ及びｍ
の組合せで彩色した染色体のピクセルにおいては、すべ
ての他の係数が理想的にはゼロであるが、ｎk 及びｎm
はゼロではない。同様の状況が三つあるいは四つの染料
の組合せに存在する。
るが、理想的に、単一の染料、例えば染料番号ｉで彩色
した染色体のピクセルにおいては、Ｎi はゼロではない
ことを既に指摘している。二つの染料、例えばｋ及びｍ
の組合せで彩色した染色体のピクセルにおいては、すべ
ての他の係数が理想的にはゼロであるが、ｎk 及びｎm
はゼロではない。同様の状況が三つあるいは四つの染料
の組合せに存在する。
【０１６０】このことは、本発明において、ピクセルを
ピクセルのグループに分類するための基礎となってい
る。
ピクセルのグループに分類するための基礎となってい
る。
【０１６１】上記方程式４によって表される一次方程式
のセットを特定なピクセルに対して解いた後、種々の染
料に対して得られた比率ｎi ／Ｎi を調べる。各染色体
に対する彩色計画が既知であるため、どのｎi ／Ｎi の
組合せがゼロでないかに応じて、一つの、あるいは他の
染色体に属するものとしてピクセルを分類することがで
きる。したがって、比率ｎi ／Ｎi のセットはピクセル
の分級器である。
のセットを特定なピクセルに対して解いた後、種々の染
料に対して得られた比率ｎi ／Ｎi を調べる。各染色体
に対する彩色計画が既知であるため、どのｎi ／Ｎi の
組合せがゼロでないかに応じて、一つの、あるいは他の
染色体に属するものとしてピクセルを分類することがで
きる。したがって、比率ｎi ／Ｎi のセットはピクセル
の分級器である。
【０１６２】もちろん、実際は、理論的にゼロであるべ
き係数は、測定ノイズ、生物学的ばらつき、近くの染色
体からの散乱、背景発光、非特定的な交雑等のために、
正確にはゼロではない。これらの外乱は不可避であり、
各特定用途において個別に処理されるべきである。
き係数は、測定ノイズ、生物学的ばらつき、近くの染色
体からの散乱、背景発光、非特定的な交雑等のために、
正確にはゼロではない。これらの外乱は不可避であり、
各特定用途において個別に処理されるべきである。
【０１６３】例えば、分裂中期における分析の場合に
は、本発明による方法及び装置によって調べようとする
転座及び挿入等の染色体異常の形状についての事前の知
識があれば、たいていのノイズから生じる曖昧さを十分
に排除することができる。例えば、染色体のすべて特徴
は長手方向の軸に直角に染色体を横切るため、その周囲
の領域とは異なって分類されるが、この判定基準を満た
さない染色体は、染色体異常として捨てることができ、
また、測定ノイズとすることもできる。
は、本発明による方法及び装置によって調べようとする
転座及び挿入等の染色体異常の形状についての事前の知
識があれば、たいていのノイズから生じる曖昧さを十分
に排除することができる。例えば、染色体のすべて特徴
は長手方向の軸に直角に染色体を横切るため、その周囲
の領域とは異なって分類されるが、この判定基準を満た
さない染色体は、染色体異常として捨てることができ、
また、測定ノイズとすることもできる。
【０１６４】染色体分類の場合には、第一のステップと
して、例えば上記例１で説明した既知の染料組合せ計画
を用いて、分析すべき分裂中期の染色体を交雑し標識す
ることである。
して、例えば上記例１で説明した既知の染料組合せ計画
を用いて、分析すべき分裂中期の染色体を交雑し標識す
ることである。
【０１６５】第二のステップとして、分裂中期染色体す
なわち試料を、連続的に各対のフィルタ（励起のための
フィルタ及び発光のためのフィルタ）を介してデジタル
ビデオカメラによって映像化して記録することである。
フィルタは、各染料の特性に調和するスペクトル透過カ
ーブすなわち透過分布にデザインされて製造されてい
る。したがって、一つの測定は、用いた各染料に対して
一つずつｎ個の画像の積み重ねからなり、各ピクセルに
対するデータは、ｎ次元のベクトルである。
なわち試料を、連続的に各対のフィルタ（励起のための
フィルタ及び発光のためのフィルタ）を介してデジタル
ビデオカメラによって映像化して記録することである。
フィルタは、各染料の特性に調和するスペクトル透過カ
ーブすなわち透過分布にデザインされて製造されてい
る。したがって、一つの測定は、用いた各染料に対して
一つずつｎ個の画像の積み重ねからなり、各ピクセルに
対するデータは、ｎ次元のベクトルである。
【０１６６】第三のステップとしては、データを分析
し、画像の各ピクセルを染色体あるいは背景に分類す
る。単一の染料で彩色した染色体からの信号、すなわ
ち、以前から保存されている単一染料スペクトルは、上
記方程式４によって表された方程式のセットの係数Ｒij
である。なぜなら、「ｉ」で着色した染色体に対して
は、ｎi ／Ｎi ＝ １であり、そうでなければゼロに等
しいためである。
し、画像の各ピクセルを染色体あるいは背景に分類す
る。単一の染料で彩色した染色体からの信号、すなわ
ち、以前から保存されている単一染料スペクトルは、上
記方程式４によって表された方程式のセットの係数Ｒij
である。なぜなら、「ｉ」で着色した染色体に対して
は、ｎi ／Ｎi ＝ １であり、そうでなければゼロに等
しいためである。
【０１６７】択一的に、基準データの定義における非特
定染色の影響を減らすために、単一染料による染色体を
個別に交雑して測定することもできる。その後、それら
の各々のｎ ベクトルを、同じ係数による方程式４にお
ける基準ベクトルとして用いることもできる。この方法
によって、もっと良い結果が得られる。
定染色の影響を減らすために、単一染料による染色体を
個別に交雑して測定することもできる。その後、それら
の各々のｎ ベクトルを、同じ係数による方程式４にお
ける基準ベクトルとして用いることもできる。この方法
によって、もっと良い結果が得られる。
【０１６８】したがって、本発明によれば、各ピクセル
ｐに対して、フィルタの各セット毎に一つずつｎ個の信
号が記録され、そのｎ次元ベクトルが測定される。方程
式４の総和にはｎ個の要素があるため、各ピクセルに対
して、ｎ個の未知数があるｎ個の方程式のセットが得ら
れる。すなわち比率ｎi ／Ｎi （ｉ＝１、・・・ｎ）で
ある。これらの方程式を解くことによって、比率ｎi ／
Ｎi を見いだすことができる。
ｐに対して、フィルタの各セット毎に一つずつｎ個の信
号が記録され、そのｎ次元ベクトルが測定される。方程
式４の総和にはｎ個の要素があるため、各ピクセルに対
して、ｎ個の未知数があるｎ個の方程式のセットが得ら
れる。すなわち比率ｎi ／Ｎi （ｉ＝１、・・・ｎ）で
ある。これらの方程式を解くことによって、比率ｎi ／
Ｎi を見いだすことができる。
【０１６９】さて、比率ｎi ／Ｎi のセットは各染色体
の標識化計画から既知であるため、各ピクセルを識別す
ることが可能である。したがって、単一の染料で彩色し
た染色体は、対応する比率ｎi ／Ｎi が１に等しく、他
のものはゼロに等しい。二つの染料の組合せで彩色した
染色体は、二つの比率が約２分の１に等しく、他のもの
はゼロに等しい。三つの染料の組合せで彩色した染色体
は、三つの比率が約３分の１に等しく、他のものはおよ
そゼロに等しい。
の標識化計画から既知であるため、各ピクセルを識別す
ることが可能である。したがって、単一の染料で彩色し
た染色体は、対応する比率ｎi ／Ｎi が１に等しく、他
のものはゼロに等しい。二つの染料の組合せで彩色した
染色体は、二つの比率が約２分の１に等しく、他のもの
はゼロに等しい。三つの染料の組合せで彩色した染色体
は、三つの比率が約３分の１に等しく、他のものはおよ
そゼロに等しい。
【０１７０】標識化計画を知ることによって、そのピク
セルに対して得られた比率の値から、いずれの染色体に
ピクセルが属するかを立証することができる。それによ
って、ピクセルの各々がどんな特定の染色体の遺伝物質
でも表すように割り当てることができる。
セルに対して得られた比率の値から、いずれの染色体に
ピクセルが属するかを立証することができる。それによ
って、ピクセルの各々がどんな特定の染色体の遺伝物質
でも表すように割り当てることができる。
【０１７１】本発明の方法を実行する上での仮定を次に
要約する。（ｉ）信号の直線性、（ｉｉ）各染色体にお
ける彩色の均一性、（ｉｉｉ）単一の染料で彩色した染
色体のスペクトルについての事前の知識、（ｉｖ）すべ
ての染色体に対する彩色組合せ計画の知識、そして
（ｖ）方程式４のセットの方程式の独立性。本発明の方
法は、他の用途においても、（ｉｉ）及び（ｉｖ）が染
色体にではなく、分類すべきピクセルの領域に言及する
場合を除き、上記の仮定が維持される。
要約する。（ｉ）信号の直線性、（ｉｉ）各染色体にお
ける彩色の均一性、（ｉｉｉ）単一の染料で彩色した染
色体のスペクトルについての事前の知識、（ｉｖ）すべ
ての染色体に対する彩色組合せ計画の知識、そして
（ｖ）方程式４のセットの方程式の独立性。本発明の方
法は、他の用途においても、（ｉｉ）及び（ｉｖ）が染
色体にではなく、分類すべきピクセルの領域に言及する
場合を除き、上記の仮定が維持される。
【０１７２】本発明による方法をシミュレートして得ら
れる染色体分類の一例を次に示す。
れる染色体分類の一例を次に示す。
【０１７３】この例は、組合せ交雑によって標識した分
裂中期の染色体を、イスラエルのアプライド・スペクト
ルイメージング社 が製造したＳＤ２００モデル・スペ
クトル映像装置で測定したスペクトル・キューブから得
たスペクトル・データに基づくシミュレーションである
（このスペクトル映像装置の構成及び作動については上
記例２を参照）。
裂中期の染色体を、イスラエルのアプライド・スペクト
ルイメージング社 が製造したＳＤ２００モデル・スペ
クトル映像装置で測定したスペクトル・キューブから得
たスペクトル・データに基づくシミュレーションである
（このスペクトル映像装置の構成及び作動については上
記例２を参照）。
【０１７４】スペクトル・キューブは、４７０から８０
０ｎｍまでの範囲にある蛍光スペクトルを完全に含むも
のである。本発明による広帯域発光フィルタを用いて得
られるであろうこれらのスペクトル測定を下記に、数学
的な、すなわちアルゴリズムによるフィルタによってシ
ミュレートした。したがって、これらのフィルタは発光
フィルタを代表するが、励起フィルタの使用をシミュレ
ートするものではない。
０ｎｍまでの範囲にある蛍光スペクトルを完全に含むも
のである。本発明による広帯域発光フィルタを用いて得
られるであろうこれらのスペクトル測定を下記に、数学
的な、すなわちアルゴリズムによるフィルタによってシ
ミュレートした。したがって、これらのフィルタは発光
フィルタを代表するが、励起フィルタの使用をシミュレ
ートするものではない。
【０１７５】本例においては、数学的フィルタは、放射
スペクトルを巻き込む矩形窓として選択されるため、フ
ィルタを介した各ピクセル測定は、単に、フィルタの透
過範囲におけるピクセルのスペクトルの積分としてシミ
ュレートされる。このタイプの数学的フィルタは、その
周波数帯内において１００％に等しい一定の透過率を持
ち、そしてその周波数帯外においては透過率がゼロに等
しい広帯域フィルタと同等である。実際、製造業者から
市販のものとして、このようなフィルタを入手すること
は可能であり、この技術に熟練した者には、フィルタの
正確なスペクトル形状（矩形であるか否か）は、本発明
のオペラビリティに対して全く重要でないことが明白で
ある。
スペクトルを巻き込む矩形窓として選択されるため、フ
ィルタを介した各ピクセル測定は、単に、フィルタの透
過範囲におけるピクセルのスペクトルの積分としてシミ
ュレートされる。このタイプの数学的フィルタは、その
周波数帯内において１００％に等しい一定の透過率を持
ち、そしてその周波数帯外においては透過率がゼロに等
しい広帯域フィルタと同等である。実際、製造業者から
市販のものとして、このようなフィルタを入手すること
は可能であり、この技術に熟練した者には、フィルタの
正確なスペクトル形状（矩形であるか否か）は、本発明
のオペラビリティに対して全く重要でないことが明白で
ある。
【０１７６】図４ａ及び４ｂは、この例で用いた五つの
染料（スペクトラム・グリーン、スペクトラム・オレン
ジ、テキサス・レッド、Ｃｙ５及びＣｙ５.５）の励起
及び発光スペクトルを示す。最も良い結果が得られるよ
うに、正確なフィルタ範囲を実験的に最適化するべきで
ある。私たちのシミュレーションにおいては、対応する
スペクトルのほぼ中央に合わせて、光子の５０から８０
％を捕らえるようにした。本発明の便利な利点の一つ
は、原理的に測定結果はフィルタの正確なスペクトル形
状に対して敏感ではないため、フィルタの製造を単純化
することができることである。
染料（スペクトラム・グリーン、スペクトラム・オレン
ジ、テキサス・レッド、Ｃｙ５及びＣｙ５.５）の励起
及び発光スペクトルを示す。最も良い結果が得られるよ
うに、正確なフィルタ範囲を実験的に最適化するべきで
ある。私たちのシミュレーションにおいては、対応する
スペクトルのほぼ中央に合わせて、光子の５０から８０
％を捕らえるようにした。本発明の便利な利点の一つ
は、原理的に測定結果はフィルタの正確なスペクトル形
状に対して敏感ではないため、フィルタの製造を単純化
することができることである。
【０１７７】本発明の方法を行うために用いることがで
きる広帯域励起及び発光フィルタの例を表４に提供す
る。また、これらのフィルタの範囲を、用いた染料の励
起及び発光スペクトルと共に図４ａ及び図４ｂに示す。
表４にリストした発光フィルタを本発明の方法のシミュ
レーションに用いた。
きる広帯域励起及び発光フィルタの例を表４に提供す
る。また、これらのフィルタの範囲を、用いた染料の励
起及び発光スペクトルと共に図４ａ及び図４ｂに示す。
表４にリストした発光フィルタを本発明の方法のシミュ
レーションに用いた。
【０１７８】
【表４】
【０１７９】図５ａ及び図５ｂに、次の五つの染料を用
いて、上記例１で説明した分析を行うために準備した、
部分的な分裂中期染色体を示す。スペクトラム・グリー
ン、スペクトラム・オレンジ、テキサス・レッド、Ｃｙ
５及びＣｙ５.５。
いて、上記例１で説明した分析を行うために準備した、
部分的な分裂中期染色体を示す。スペクトラム・グリー
ン、スペクトラム・オレンジ、テキサス・レッド、Ｃｙ
５及びＣｙ５.５。
【０１８０】図５ａに示す正常な女性の部分的な分裂中
期染色体においては、各染料によって一つずつ五つの染
色体が単彩色され、五つの染色体が二重に彩色され、そ
して一つの染色体が四重に彩色されている。図５ａに示
した各染色体に対する標識化計画を表５に提供する。
期染色体においては、各染料によって一つずつ五つの染
色体が単彩色され、五つの染色体が二重に彩色され、そ
して一つの染色体が四重に彩色されている。図５ａに示
した各染色体に対する標識化計画を表５に提供する。
【０１８１】
【表５】
【０１８２】図５ｂに示す、１６−９の転座を持つ男性
の部分的な分裂中期染色体においては、各染料によって
一つずつ五つの染色体が単彩色され、九つの染色体が二
重に彩色され、六つの染色体が三重に彩色され、そして
一つの染色体が四重に彩色されている。図５ｂに示した
各染色体に対する標識化計画を表６に提供する。
の部分的な分裂中期染色体においては、各染料によって
一つずつ五つの染色体が単彩色され、九つの染色体が二
重に彩色され、六つの染色体が三重に彩色され、そして
一つの染色体が四重に彩色されている。図５ｂに示した
各染色体に対する標識化計画を表６に提供する。
【０１８３】
【表６】
【０１８４】本発明の方法によるシミュレーションの前
に行われた分裂中期染色体の実際の測定は、本発明の範
囲内でここに説明した染料に関わる励起そして／あるい
は発光フィルタを用いることなく行われたことに注意す
べきである。
に行われた分裂中期染色体の実際の測定は、本発明の範
囲内でここに説明した染料に関わる励起そして／あるい
は発光フィルタを用いることなく行われたことに注意す
べきである。
【０１８５】（励起及び発光のために）実際に用いたフ
ィルタは、例えば、Ｅ．シュロエク氏らの文献（「ヒト
染色体の多色スペクトル核型分析」 E. Schroeck et a
l. (1996) Multicolor spectral karyotyping of human
chromosomes. Science, 273, 494-497）に説明された
従来の３枚重ね二色フィルタ・キューブであった。これ
が直接的な原因で、広励起フィルタの存在をシミュレー
トすることはできなかった。
ィルタは、例えば、Ｅ．シュロエク氏らの文献（「ヒト
染色体の多色スペクトル核型分析」 E. Schroeck et a
l. (1996) Multicolor spectral karyotyping of human
chromosomes. Science, 273, 494-497）に説明された
従来の３枚重ね二色フィルタ・キューブであった。これ
が直接的な原因で、広励起フィルタの存在をシミュレー
トすることはできなかった。
【０１８６】この事実は、シミュレーションの結果に対
して二つの影響を与える。
して二つの影響を与える。
【０１８７】第一に、このようなフィルタを用いると、
各染料の励起スペクトルが他のものに対して幾分移行す
るため、励起フィルタを加えることで、もしそれが正し
い選択なら、各染料から得られる信号の特定性のみが改
善されることは明らかであり、予想するような最適な結
果を得ることはできない。
各染料の励起スペクトルが他のものに対して幾分移行す
るため、励起フィルタを加えることで、もしそれが正し
い選択なら、各染料から得られる信号の特定性のみが改
善されることは明らかであり、予想するような最適な結
果を得ることはできない。
【０１８８】第二に、測定染色体のいくつか（ここに図
示せず）には、上記の理由から、シミュレーション後、
正確に識別することが不可能な多くのピクセルがあっ
た。
示せず）には、上記の理由から、シミュレーション後、
正確に識別することが不可能な多くのピクセルがあっ
た。
【０１８９】しかし、例えば、照射光路に染料に対応す
る励起フィルタを加えることで、染料からの信号の比較
的に小さな増加をもたらすことによって、この影響を補
正できたであろうことは同業者には明らかである。
る励起フィルタを加えることで、染料からの信号の比較
的に小さな増加をもたらすことによって、この影響を補
正できたであろうことは同業者には明らかである。
【０１９０】ここに説明した本発明による染色体分類の
アプローチは、種々の用途に適用が可能である。下記に
そのいくつかを詳細に説明する。下記に分子細胞遺伝学
の分野における本発明の分類アプローチの用途を短く要
約する。本発明の分類アプローチが診断の用途において
重要な影響をもたらす細胞遺伝学の二つの主要な分野と
しては、（ｉ）臨床細胞遺伝学及び（ｉｉ）腫瘍細胞遺
伝学がある。
アプローチは、種々の用途に適用が可能である。下記に
そのいくつかを詳細に説明する。下記に分子細胞遺伝学
の分野における本発明の分類アプローチの用途を短く要
約する。本発明の分類アプローチが診断の用途において
重要な影響をもたらす細胞遺伝学の二つの主要な分野と
しては、（ｉ）臨床細胞遺伝学及び（ｉｉ）腫瘍細胞遺
伝学がある。
【０１９１】第一に、本発明の分類アプローチを、米国
特許出願第０８／６３５,８２０号で説明されたよう
に、例えば、ガン細胞、胎児細胞等における染色体異常
を検出する診断目的のために用いることができる。臨床
臨床細胞遺伝学及び腫瘍細胞遺伝学においては、アメリ
カ合衆国だけでも、従来の染色体バンディング分析を用
いておよそ４００,０００ケースの分析が毎年行われて
いる。従来のバンディング分析に加えて、本発明の分類
アプローチを用いる染色体彩色を行うこともできる。こ
れは、従来のバンディングを用いるだけでは特徴づける
ことができないマーカー染色体を識別する手助けとなる
ものである。後天性染色体異常は、主に悪性変質に関係
する。およそ、（ｉ）血液性腫瘍と（ｉｉ）固形腫瘍と
の二つの悪性腫瘍が識別可能である。血液性悪性腫瘍か
らの細胞は人工的に容易に培養が可能であるため、それ
ら腫瘍の染色体バンディング分析は、細胞遺伝学的な、
そして遺伝学的な腫瘍研究における成功例の一つであ
る。二つのよく知られた例として、慢性リンパ性白血病
（CLL）におけるフィラデルフィア染色体及びバーキッ
ト・リンパ腫における特定染色体異常の識別がある。過
去１０年間で、血液性悪性腫瘍に関するこの他多くの腫
瘍に特定な染色体異常が識別され、診断及び研究のツー
ルとして用いられている。多くの場合、再発性染色体異
常の記述から、分子レベルで悪性変質のメカニズムを識
別することが可能である。残念なことに、固形腫瘍（乳
房、結腸、脳、肺及びその他の腫瘍）の分野では、分か
っていないことが多い。固形腫瘍の方が血液性悪性腫瘍
よりもかなり罹患率が高いため、この矛盾は憂慮すべき
ことである。この矛盾は、主に、固形腫瘍細胞遺伝学に
共通する技術的な困難が原因となっている。固形腫瘍細
胞は、培養が難しく、染色体試料が低品質になり、高解
像度の細胞遺伝学的な分析を妨げるため、腫瘍の発現及
び発育に必ずしも関係がないこれら腫瘍の一般的な二次
的な染色体異常の特徴が現れるためである。交雑に基づ
く染色体スクリーニング試験（すなわち、染色体彩色）
は、測定方法におけるギャップを埋めることができるた
め、上記に説明したように必要性が高い。この点に関し
て、比較ゲノム交雑が部分的に助けとなるが、常に細胞
混合物内の染色体異常の平均が表示されるため、構造的
な染色体異常を検出することはできない。おそらく、交
雑に基づく核型分析は、基礎研究においても、また診断
試験においても、固形腫瘍における再発性染色体異常を
描写するための方法として広範囲に用いられるようにな
るであろう。
特許出願第０８／６３５,８２０号で説明されたよう
に、例えば、ガン細胞、胎児細胞等における染色体異常
を検出する診断目的のために用いることができる。臨床
臨床細胞遺伝学及び腫瘍細胞遺伝学においては、アメリ
カ合衆国だけでも、従来の染色体バンディング分析を用
いておよそ４００,０００ケースの分析が毎年行われて
いる。従来のバンディング分析に加えて、本発明の分類
アプローチを用いる染色体彩色を行うこともできる。こ
れは、従来のバンディングを用いるだけでは特徴づける
ことができないマーカー染色体を識別する手助けとなる
ものである。後天性染色体異常は、主に悪性変質に関係
する。およそ、（ｉ）血液性腫瘍と（ｉｉ）固形腫瘍と
の二つの悪性腫瘍が識別可能である。血液性悪性腫瘍か
らの細胞は人工的に容易に培養が可能であるため、それ
ら腫瘍の染色体バンディング分析は、細胞遺伝学的な、
そして遺伝学的な腫瘍研究における成功例の一つであ
る。二つのよく知られた例として、慢性リンパ性白血病
（CLL）におけるフィラデルフィア染色体及びバーキッ
ト・リンパ腫における特定染色体異常の識別がある。過
去１０年間で、血液性悪性腫瘍に関するこの他多くの腫
瘍に特定な染色体異常が識別され、診断及び研究のツー
ルとして用いられている。多くの場合、再発性染色体異
常の記述から、分子レベルで悪性変質のメカニズムを識
別することが可能である。残念なことに、固形腫瘍（乳
房、結腸、脳、肺及びその他の腫瘍）の分野では、分か
っていないことが多い。固形腫瘍の方が血液性悪性腫瘍
よりもかなり罹患率が高いため、この矛盾は憂慮すべき
ことである。この矛盾は、主に、固形腫瘍細胞遺伝学に
共通する技術的な困難が原因となっている。固形腫瘍細
胞は、培養が難しく、染色体試料が低品質になり、高解
像度の細胞遺伝学的な分析を妨げるため、腫瘍の発現及
び発育に必ずしも関係がないこれら腫瘍の一般的な二次
的な染色体異常の特徴が現れるためである。交雑に基づ
く染色体スクリーニング試験（すなわち、染色体彩色）
は、測定方法におけるギャップを埋めることができるた
め、上記に説明したように必要性が高い。この点に関し
て、比較ゲノム交雑が部分的に助けとなるが、常に細胞
混合物内の染色体異常の平均が表示されるため、構造的
な染色体異常を検出することはできない。おそらく、交
雑に基づく核型分析は、基礎研究においても、また診断
試験においても、固形腫瘍における再発性染色体異常を
描写するための方法として広範囲に用いられるようにな
るであろう。
【０１９２】第二に、本発明の分類アプローチを、米国
特許出願第０８／６３５,８２０号で説明されたよう
に、進化中に染色体の形態を変えた染色体の転位を検出
し視覚化するために比較細胞遺伝学に用いることができ
る（「遺伝学における現在の意見と発達」 J. Weinberg
and R. Stanyon (1995) Current opinion in genetics
and development 5, 792-797 参照）。進化論的に関連
のある種の研究及びモデル・システム（例えば、ヒトに
対するモデル・システムとしてのネズミ）の研究におい
ては、多くの場合、二つ以上の種の染色体が連鎖相似性
に従って整列されて染色体を媒介とする遺伝子情報が見
い出される比較ゲノム・マップを得ることが要求され
る。本発明の分類アプローチを用いることは、このよう
な比較マップを得ることを容易にする。例えば、ヒトと
ネズミ、あるいはヒトとサルとの染色体比較マップを構
築することを考察する。このためには、一つの種の染色
体ペイントの完全なセット（例えば、ヒトのもの）を他
の種の（この例ではネズミあるいはサルの）染色体スプ
レッドに同時に交雑し、上記に説明したように分類す
る。その結果、ヒト染色体ペイントで彩色したネズミの
核型の画像が得られる。したがって、この二つの種の核
型間での位置合わせが可能になる。
特許出願第０８／６３５,８２０号で説明されたよう
に、進化中に染色体の形態を変えた染色体の転位を検出
し視覚化するために比較細胞遺伝学に用いることができ
る（「遺伝学における現在の意見と発達」 J. Weinberg
and R. Stanyon (1995) Current opinion in genetics
and development 5, 792-797 参照）。進化論的に関連
のある種の研究及びモデル・システム（例えば、ヒトに
対するモデル・システムとしてのネズミ）の研究におい
ては、多くの場合、二つ以上の種の染色体が連鎖相似性
に従って整列されて染色体を媒介とする遺伝子情報が見
い出される比較ゲノム・マップを得ることが要求され
る。本発明の分類アプローチを用いることは、このよう
な比較マップを得ることを容易にする。例えば、ヒトと
ネズミ、あるいはヒトとサルとの染色体比較マップを構
築することを考察する。このためには、一つの種の染色
体ペイントの完全なセット（例えば、ヒトのもの）を他
の種の（この例ではネズミあるいはサルの）染色体スプ
レッドに同時に交雑し、上記に説明したように分類す
る。その結果、ヒト染色体ペイントで彩色したネズミの
核型の画像が得られる。したがって、この二つの種の核
型間での位置合わせが可能になる。
【０１９３】第三に、本発明の分類アプローチを、細胞
分裂間期の、有糸分裂あるいは減数分裂中の細胞に適用
することができる。例えば、この分類アプローチを、細
胞分裂間期染色体の三次元構成を検出するために用いて
もよい。細胞分裂間期中にある染色体組織については、
未だに分からないことが多いが、悪性細胞においては、
細胞分裂間期中に染色体組織に変化が起こるのではない
かと推測できる。したがって、本発明の分類アプローチ
は、種々の悪性腫瘍の早期発見を行う、悪性の病気の段
階を定義する、また、それゆえに、診察患者等への治療
をより適切に行えるという点で、大変価値が高いもので
ある。三次元再構築手段（例えば、共焦点顕微鏡）に組
み合わせて本発明の分類方法を用いることで、細胞分裂
間期中の、有糸分裂あるいは減数分裂中の染色体組織の
三次元情報を引き出すことが可能であることが分かる。
分裂間期の、有糸分裂あるいは減数分裂中の細胞に適用
することができる。例えば、この分類アプローチを、細
胞分裂間期染色体の三次元構成を検出するために用いて
もよい。細胞分裂間期中にある染色体組織については、
未だに分からないことが多いが、悪性細胞においては、
細胞分裂間期中に染色体組織に変化が起こるのではない
かと推測できる。したがって、本発明の分類アプローチ
は、種々の悪性腫瘍の早期発見を行う、悪性の病気の段
階を定義する、また、それゆえに、診察患者等への治療
をより適切に行えるという点で、大変価値が高いもので
ある。三次元再構築手段（例えば、共焦点顕微鏡）に組
み合わせて本発明の分類方法を用いることで、細胞分裂
間期中の、有糸分裂あるいは減数分裂中の染色体組織の
三次元情報を引き出すことが可能であることが分かる。
【０１９４】第四に、多くの癌及び遺伝子障害は、染色
体欠失、転座、他の転位及び大きな異常（例えば、遺伝
子増幅）から起こる。本発明の分類アプローチを用いる
ことによって、このような異常を検出する能力を向上で
きる。
体欠失、転座、他の転位及び大きな異常（例えば、遺伝
子増幅）から起こる。本発明の分類アプローチを用いる
ことによって、このような異常を検出する能力を向上で
きる。
【０１９５】第五に、一般的な染色体異常の一つがダウ
ン症候群に結び付いており、ダウン症が染色体２１の三
染色体性が原因で生じるという説は、かなり以前に確立
されている。注意深い観察によって、染色体２１（２１
ｑ２２）の特定の領域が、この一般的な徴候に常に関連
している（すなわち、三染色体として現われる）ことが
明らかになった。しかし、従来のＧあるいはＲバンディ
ングによる核型作成技術によって測定したダウン症のヒ
ト核型は、見かけ上正常である場合がある。この現象の
説明として、これらの場合の三染色体性は、２１ｑ２２
染色体領域からの分裂片に見られるが、この分裂片は、
従来のバンディング技術の解像度よりも小さなものであ
るため、とするものが広く受け入れられている。しか
し、本発明の分類方法を用いることによって、これまで
検出不可能であった（例えば、絨毛膜絨毛を介しての試
料採取で得た）胚芽細胞内の染色体２１の三染色体が検
出可能であり、この危険性が高い女性たちへの、知識に
基づいた遺伝子カウンセリングが可能になる。染色体１
３及び染色体１８あるいはその分裂片が、極めて異常な
子供の出生を引き起こす三染色体を生じるという報告も
あるが、本発明の分類方法は、これらの破壊的な染色体
１３あるいは１８の三染色体性の胎児期の診断のために
も同様に適用が可能である。
ン症候群に結び付いており、ダウン症が染色体２１の三
染色体性が原因で生じるという説は、かなり以前に確立
されている。注意深い観察によって、染色体２１（２１
ｑ２２）の特定の領域が、この一般的な徴候に常に関連
している（すなわち、三染色体として現われる）ことが
明らかになった。しかし、従来のＧあるいはＲバンディ
ングによる核型作成技術によって測定したダウン症のヒ
ト核型は、見かけ上正常である場合がある。この現象の
説明として、これらの場合の三染色体性は、２１ｑ２２
染色体領域からの分裂片に見られるが、この分裂片は、
従来のバンディング技術の解像度よりも小さなものであ
るため、とするものが広く受け入れられている。しか
し、本発明の分類方法を用いることによって、これまで
検出不可能であった（例えば、絨毛膜絨毛を介しての試
料採取で得た）胚芽細胞内の染色体２１の三染色体が検
出可能であり、この危険性が高い女性たちへの、知識に
基づいた遺伝子カウンセリングが可能になる。染色体１
３及び染色体１８あるいはその分裂片が、極めて異常な
子供の出生を引き起こす三染色体を生じるという報告も
あるが、本発明の分類方法は、これらの破壊的な染色体
１３あるいは１８の三染色体性の胎児期の診断のために
も同様に適用が可能である。
【０１９６】第六に、本発明の分類方法は、急速に発展
している、妊娠女性の血液から胚芽細胞を分離する技術
と組み合わせて、染色体２１の三染色体性及び他の頻度
の少ない染色体異常を検出するのに危険性が少ない、胎
児期の核型作成に対して非常に価値が高いものである。
している、妊娠女性の血液から胚芽細胞を分離する技術
と組み合わせて、染色体２１の三染色体性及び他の頻度
の少ない染色体異常を検出するのに危険性が少ない、胎
児期の核型作成に対して非常に価値が高いものである。
【０１９７】第七に、本発明の分類方法を、染色体の多
色バンディング・パターンの生成（すなわち、バー・コ
ード化、多色バンディング核型の作成）に用いることが
できる。染色体のバー・コード化に関する詳細について
は、Ｃ・ランゴア氏らの文献（C. Lengauer et al. (19
93) Hum. Molec. Genet. 5, 505-512）を参照のこと。
ヒューマン・ゲノム・プロジェクト（HGP）の最初の目
標がもうすぐ達成されようとしている。この目標は、ヒ
トのゲノムの物理的なマップを作成することである。こ
の用語、物理的なマップとは、 YAC クローンあるいは
BAC クローン等の大きなインサートを媒介としてゲノム
全体をクローン化すること、そして遺伝学的な、細胞遺
伝学的な、そして物理的なマッピングによって、これら
クローンのマッピングを行うことを示している。この目
的のために、ヒトの DNA の二つの主要源として、ヒト
染色体のすべてに対して重複するクローンを含む放射線
ハイブリッド細胞ライン及び YAC コンティグズが用い
られた。このマップの完成によって、腫瘍を含む遺伝性
あるいは後天性遺伝病に関する遺伝子を識別するのに必
要な、ゲノム特定クローンにおけるほとんど全ての領域
が検索可能になる。多数の YAC あるいは BAC クローン
あるいは放射線ハイブリッドとスペクトル結像とを FIS
H に組み合わせることによって、全ヒト染色体に対する
多色バンディング・パターンを生成することができ、究
極的に遺伝学的なマップと細胞遺伝学的なマップとをつ
なぐことが可能である。例として、放射線ハイブリッド
・パネル（スタンフォード・パネル）を用いることを考
察する（「放射線ハイブリッドに基づく遺伝学的なマッ
ピング」 [Barret J.H. (1992) Genetic mapping base
d on radiation hybrids. Genomics 13, 95-103] を参
照）。スタンフォード・パネルの個々のパネルは、約
５,０００Ｋｂｐの平均分裂片サイズで DNA 分裂片のセ
ットを含んでおり、各パネルはヒトのゲノムの約２０％
をカバーする。このような五つのパネルから得られる蛍
光プローブのコハイブリダイゼーション（cohybridizat
ion）によって、ゲノムの大部分をカバーし、ヒト染色
体の全ての標識化を行うことができる。しかしながら、
分裂片は個々のパネルにランダムに分布しているため、
ヒトのゲノムを完全にカバーするためには、もっと多く
のパネルが必要である（例えば、６から１０個のパネ
ル）。次の説明では、五個のパネルが用いられることを
想定している。ヒトのシーケンスだけを排他的に増幅し
標識化することを保証する、本技術において Alu-PCR等
の IRS-PCR アプローチとして知られる方法で、分散型
反復シーケンス（IRS 、例えば Alu シーケンス）から
得られたプライマーを用いて、例えば、 dUTP によって
共役された発蛍光団を直接的に含ませることによって、
各パネルの染色体分裂片に、異なる発蛍光団（あるいは
発蛍光団の異なる組合せ、例えば、組合せ標識あるいは
ハイブリダイゼーション戦略）で標識する。したがっ
て、ヒト以外の核種からの DNA が増幅された、そして
／あるいは標識された場合は、その核種のゲノムを特徴
づける核種特定分散型反復シーケンス（IRS）を、適当
な PCR プライマーを得るために用いる。個々のパネル
の一つを個別に交雑することによって、ゲノムのおよそ
２０％の範囲及び５,０００Ｋｂｐの平均帯域サイズ
で、染色体スプレッドのバンディング・パターンが単一
色で得られる。五つのハイブリッド・パネルにおける個
々の染色体分裂片のランダムな重複があるため、分裂片
の五つの異なるラベルが付けられたグループ（各グルー
プが単一のパネルによって代表される）のコハイブリダ
イゼーションは、純粋色を持つ周波数帯、各々が二つ、
三つ、四つ、そして五つの色の組合せを含む周波数帯を
含むバンディング・パターンを生じる。全体として、３
１通りの色の組合せが可能であり、これらの組合せは、
スペクトル結像を用いて識別可能である。このため、こ
の例では、３１色の組合せの各々に対して３１のｎ次元
のベクトルを得るために、分類の前処理を、上記に説明
したと同様に行うべきである。その後、本質的に上記の
説明のように、新しい試料の分類を行うことができる。
３１色の組合せの説明は、単に説明の目的のためであ
り、他の適当な数の組合せも本発明の範囲に含まれるこ
とは明らかである。染色体の多色高解像度バンディング
・パターンの生成には、染色体彩色プローブ（すなわ
ち、染色体ペイント）の使用に比べ、次の二つの明確な
利点がある。染色体彩色は、転座等の染色体間の異常、
あるいは均一染色領域、そしてマーカー染色体等の追加
染色体物質あるいは二重の微細な染色体を検出するのに
適したツールである。重度の異常が染色体の全長に影響
を及ぼす場合は、欠失と重複等の染色体内の異常は検出
可能であるが、この方法では、染色体の転位（逆位）に
ついては全く検出が不可能である。しかし、多色バンデ
ィング・パターンを用いれば、染色体間の、そして染色
体内の異常が診断可能である。その理由は、それらの異
常の影響が染色体バンドのシーケンスに現れるためであ
る。予めマッピングされた DNA 分裂片（例えば、 YAC
クローンや放射線ハイブリッド細胞ライン）を用いる多
色高解像度バンディング・パターンの一つの大きな利点
は、遺伝学的なマップと細胞遺伝学的なマップとを統合
できる可能性があるということである。各多色バンド
は、シーケンスが標識された部位の特定のセットに特徴
がある。それらの部位は、ゲノムにただ一度生じる PCR
生成物からなる。統合された細胞遺伝学的な、そして
遺伝学的なマップの有用性を次に説明する。例えば、腫
瘍細胞から得た染色体における特定色バンドの欠如は、
癌抑制遺伝子の損失を表す微小欠失を示す。このバンド
に特定されるシーケンス目標部位（STS）の知識があれ
ば、どんな大きなインサート・クローン・コレクション
をもスクリーニングが可能になり、この例においては、
削除された遺伝子を含む可能性がかなり高い複数の特定
クローンを検索することができる。さて、大規模なシー
ケンス付けが進行中であり、これと発現標識部位（遺伝
子を含むと知られる座位）とを統合することによって、
交雑に基づく多色バンディング・パターンの価値は、さ
らに増加することが明らかである。このような多色バン
ディング・パターンは、容易に自動化が可能である。従
来の染色体バンドに基づく細胞遺伝学的な診断の自動化
は、相当な努力にも関わらず、これまでのところ成功し
ていない。上記のアプローチは、ヒト染色体の交雑に基
づくバンディング・パターンの生成のためだけではな
く、他の哺乳類（例えば、ネズミ）及び非哺乳類の核種
に対しても適用可能である。このことは、腫瘍を含む人
間の病気の、動物モデルでの分析に特に有用である。放
射線ハイブリッド・パネルの説明に類似するが、 YAC
クローン、 P1 クローン、 BAC クローン等の個々の大
きなインサート・クローンのセットのコハイブリダイゼ
ーションによって、あるいは、所望の解像度に応じて、
これらの源からのコンティグ（重複クローン）を用いる
ことによって、ヒト染色体の全てに対して多色バンディ
ング・パターンを得ることができる。さらに、放射線ハ
イブリッド・パネルの使用に類似するが、異なる発蛍光
団で故意に重複クローンすなわちコンティグを標識する
ことによって、多色バンディング・パターンを導入する
ことができる。交雑に基づく染色体バンディングによる
利点のすべては、染色体ペイントの使用、あるいは上記
に説明した従来の染色体バンディングに比べ、大きなイ
ンサート・クローンを用いることができる点にある。同
業者には明らかであるが、染色体ブレークポイントすな
わち染色体遺伝子欠失に関与するクローンの検索は、放
射線ハイブリッド・パネルを用いるものよりも簡単で単
純である。染色体多色バンディングの用途に適当な、染
色体分裂片のもう一つの源は、染色体の顕微解剖によっ
て得られる分裂片である。顕微解剖染色体分裂片は、本
技術分野でよく知られる染色体スプレッドのマニュアル
あるいはレーザ顕微操作によって生成できる。このよう
に生成した分裂片は、通常、本技術で DOP - PCRとして
知られる方法で、例えば、変性オリゴヌクレオチド・プ
ライマー（DOP）を用いる、あるいは本技術で IRS - PC
R として知られる方法で分散型反復シーケンス（IRS 、
例えば、 Alu シーケンス）から得たプライマーを用い
る重合酵素連鎖反応によって増殖できる。さらに、染色
体多色バンディングに用いるに適当な染色体分裂片のも
う一つの源は、大きな DNA 分裂片を生成する DNA 制限
法、そして大きな DNA 分裂片を分離可能な電気泳動法
によって生成された分裂片である。DNA 制限によって大
きな DNA 分裂片を生成することに関しては、二つのア
プローチが考えられる。第一のアプローチによれば、エ
ンドヌクレアーゼ（例えば、頻繁に、あるいは稀に用い
られるカッター）による部分消化が用いられるが、第二
のアプローチによれば、稀なカッターであるエンドヌク
レアーゼ（例えば、 NotI）による完全消化が用いられ
る。完全消化は、独立した試験で全く同一の結果を得る
ために繰り返すことができるが、部分消化は性質的にラ
ンダムであるため、現在は後者が好まれる。大きな DNA
分裂片が分離可能な電気泳動法は、本技術でよく知ら
れており、これにはパルス・フィールド・ゲル電気泳動
（PFGE）が含まれる。したがって、例えば、 PFGE 航路
に沿った連続した領域から DNA を抽出し、各領域から
抽出した DNA に、異なる発蛍光団を用いて標識し、こ
のように形成したプローブを染色体にコハイブリダイゼ
ーション化することで、上記に説明したような染色体の
多色バンディング・パターンが得られる。本技術分野で
よく知られるショ糖あるいはセシウム塩化物グラジエン
ト等のグラジエント遠心分離によって、さらに、大きな
DNA 分裂片が得られる。しかし、これらのアプローチ
を用いることが、上記に説明したように遺伝学的なマッ
プと細胞遺伝学的なマップとを統合する可能性を提供す
るものではないため、現在、これらのアプローチはあま
り好まれない。蛍光 DNA ハイブリダイゼーションと本
発明の分類アプローチとに基づく染色体多色バンディン
グ・パターンの生成（すなわち、多色バンディング核
型）は、種々の実用的な用途に用いられる。これらの用
途には、例えば、（ｉ）例えば、特注のクローンセット
を用いる染色体異常をスクリーニングすること、（ｉ
ｉ）さもなければ検出が難しい 末端小粒欠失をスクリ
ーニングすること、（ｉｉｉ）出生前診断における染色
体異数体をスクリーニングすること、（ｉｖ）再発性染
色体ブレークポイントをスクリーニングすること、
（ｖ）多色比較ゲノム交雑を行うこと、（ｖｉｉ）腫瘍
細胞の多パラメータ分析のために多色 FISH を、細胞学
的な、そして免疫組織化学的な染色の他の測定と組み合
わせること、（ｖｉｉｉ）多色バンディング・パターン
を従来のＲあるいはＧバンドと組み合わせること、（ｉ
ｘ）細胞分裂間期細胞における遺伝学的な異常を直接的
に分析すること、そして（ｘ）放射線あるいは変異誘発
物質にさらされた住民の染色体異常をスクリーニングす
ることが含まれる。
色バンディング・パターンの生成（すなわち、バー・コ
ード化、多色バンディング核型の作成）に用いることが
できる。染色体のバー・コード化に関する詳細について
は、Ｃ・ランゴア氏らの文献（C. Lengauer et al. (19
93) Hum. Molec. Genet. 5, 505-512）を参照のこと。
ヒューマン・ゲノム・プロジェクト（HGP）の最初の目
標がもうすぐ達成されようとしている。この目標は、ヒ
トのゲノムの物理的なマップを作成することである。こ
の用語、物理的なマップとは、 YAC クローンあるいは
BAC クローン等の大きなインサートを媒介としてゲノム
全体をクローン化すること、そして遺伝学的な、細胞遺
伝学的な、そして物理的なマッピングによって、これら
クローンのマッピングを行うことを示している。この目
的のために、ヒトの DNA の二つの主要源として、ヒト
染色体のすべてに対して重複するクローンを含む放射線
ハイブリッド細胞ライン及び YAC コンティグズが用い
られた。このマップの完成によって、腫瘍を含む遺伝性
あるいは後天性遺伝病に関する遺伝子を識別するのに必
要な、ゲノム特定クローンにおけるほとんど全ての領域
が検索可能になる。多数の YAC あるいは BAC クローン
あるいは放射線ハイブリッドとスペクトル結像とを FIS
H に組み合わせることによって、全ヒト染色体に対する
多色バンディング・パターンを生成することができ、究
極的に遺伝学的なマップと細胞遺伝学的なマップとをつ
なぐことが可能である。例として、放射線ハイブリッド
・パネル（スタンフォード・パネル）を用いることを考
察する（「放射線ハイブリッドに基づく遺伝学的なマッ
ピング」 [Barret J.H. (1992) Genetic mapping base
d on radiation hybrids. Genomics 13, 95-103] を参
照）。スタンフォード・パネルの個々のパネルは、約
５,０００Ｋｂｐの平均分裂片サイズで DNA 分裂片のセ
ットを含んでおり、各パネルはヒトのゲノムの約２０％
をカバーする。このような五つのパネルから得られる蛍
光プローブのコハイブリダイゼーション（cohybridizat
ion）によって、ゲノムの大部分をカバーし、ヒト染色
体の全ての標識化を行うことができる。しかしながら、
分裂片は個々のパネルにランダムに分布しているため、
ヒトのゲノムを完全にカバーするためには、もっと多く
のパネルが必要である（例えば、６から１０個のパネ
ル）。次の説明では、五個のパネルが用いられることを
想定している。ヒトのシーケンスだけを排他的に増幅し
標識化することを保証する、本技術において Alu-PCR等
の IRS-PCR アプローチとして知られる方法で、分散型
反復シーケンス（IRS 、例えば Alu シーケンス）から
得られたプライマーを用いて、例えば、 dUTP によって
共役された発蛍光団を直接的に含ませることによって、
各パネルの染色体分裂片に、異なる発蛍光団（あるいは
発蛍光団の異なる組合せ、例えば、組合せ標識あるいは
ハイブリダイゼーション戦略）で標識する。したがっ
て、ヒト以外の核種からの DNA が増幅された、そして
／あるいは標識された場合は、その核種のゲノムを特徴
づける核種特定分散型反復シーケンス（IRS）を、適当
な PCR プライマーを得るために用いる。個々のパネル
の一つを個別に交雑することによって、ゲノムのおよそ
２０％の範囲及び５,０００Ｋｂｐの平均帯域サイズ
で、染色体スプレッドのバンディング・パターンが単一
色で得られる。五つのハイブリッド・パネルにおける個
々の染色体分裂片のランダムな重複があるため、分裂片
の五つの異なるラベルが付けられたグループ（各グルー
プが単一のパネルによって代表される）のコハイブリダ
イゼーションは、純粋色を持つ周波数帯、各々が二つ、
三つ、四つ、そして五つの色の組合せを含む周波数帯を
含むバンディング・パターンを生じる。全体として、３
１通りの色の組合せが可能であり、これらの組合せは、
スペクトル結像を用いて識別可能である。このため、こ
の例では、３１色の組合せの各々に対して３１のｎ次元
のベクトルを得るために、分類の前処理を、上記に説明
したと同様に行うべきである。その後、本質的に上記の
説明のように、新しい試料の分類を行うことができる。
３１色の組合せの説明は、単に説明の目的のためであ
り、他の適当な数の組合せも本発明の範囲に含まれるこ
とは明らかである。染色体の多色高解像度バンディング
・パターンの生成には、染色体彩色プローブ（すなわ
ち、染色体ペイント）の使用に比べ、次の二つの明確な
利点がある。染色体彩色は、転座等の染色体間の異常、
あるいは均一染色領域、そしてマーカー染色体等の追加
染色体物質あるいは二重の微細な染色体を検出するのに
適したツールである。重度の異常が染色体の全長に影響
を及ぼす場合は、欠失と重複等の染色体内の異常は検出
可能であるが、この方法では、染色体の転位（逆位）に
ついては全く検出が不可能である。しかし、多色バンデ
ィング・パターンを用いれば、染色体間の、そして染色
体内の異常が診断可能である。その理由は、それらの異
常の影響が染色体バンドのシーケンスに現れるためであ
る。予めマッピングされた DNA 分裂片（例えば、 YAC
クローンや放射線ハイブリッド細胞ライン）を用いる多
色高解像度バンディング・パターンの一つの大きな利点
は、遺伝学的なマップと細胞遺伝学的なマップとを統合
できる可能性があるということである。各多色バンド
は、シーケンスが標識された部位の特定のセットに特徴
がある。それらの部位は、ゲノムにただ一度生じる PCR
生成物からなる。統合された細胞遺伝学的な、そして
遺伝学的なマップの有用性を次に説明する。例えば、腫
瘍細胞から得た染色体における特定色バンドの欠如は、
癌抑制遺伝子の損失を表す微小欠失を示す。このバンド
に特定されるシーケンス目標部位（STS）の知識があれ
ば、どんな大きなインサート・クローン・コレクション
をもスクリーニングが可能になり、この例においては、
削除された遺伝子を含む可能性がかなり高い複数の特定
クローンを検索することができる。さて、大規模なシー
ケンス付けが進行中であり、これと発現標識部位（遺伝
子を含むと知られる座位）とを統合することによって、
交雑に基づく多色バンディング・パターンの価値は、さ
らに増加することが明らかである。このような多色バン
ディング・パターンは、容易に自動化が可能である。従
来の染色体バンドに基づく細胞遺伝学的な診断の自動化
は、相当な努力にも関わらず、これまでのところ成功し
ていない。上記のアプローチは、ヒト染色体の交雑に基
づくバンディング・パターンの生成のためだけではな
く、他の哺乳類（例えば、ネズミ）及び非哺乳類の核種
に対しても適用可能である。このことは、腫瘍を含む人
間の病気の、動物モデルでの分析に特に有用である。放
射線ハイブリッド・パネルの説明に類似するが、 YAC
クローン、 P1 クローン、 BAC クローン等の個々の大
きなインサート・クローンのセットのコハイブリダイゼ
ーションによって、あるいは、所望の解像度に応じて、
これらの源からのコンティグ（重複クローン）を用いる
ことによって、ヒト染色体の全てに対して多色バンディ
ング・パターンを得ることができる。さらに、放射線ハ
イブリッド・パネルの使用に類似するが、異なる発蛍光
団で故意に重複クローンすなわちコンティグを標識する
ことによって、多色バンディング・パターンを導入する
ことができる。交雑に基づく染色体バンディングによる
利点のすべては、染色体ペイントの使用、あるいは上記
に説明した従来の染色体バンディングに比べ、大きなイ
ンサート・クローンを用いることができる点にある。同
業者には明らかであるが、染色体ブレークポイントすな
わち染色体遺伝子欠失に関与するクローンの検索は、放
射線ハイブリッド・パネルを用いるものよりも簡単で単
純である。染色体多色バンディングの用途に適当な、染
色体分裂片のもう一つの源は、染色体の顕微解剖によっ
て得られる分裂片である。顕微解剖染色体分裂片は、本
技術分野でよく知られる染色体スプレッドのマニュアル
あるいはレーザ顕微操作によって生成できる。このよう
に生成した分裂片は、通常、本技術で DOP - PCRとして
知られる方法で、例えば、変性オリゴヌクレオチド・プ
ライマー（DOP）を用いる、あるいは本技術で IRS - PC
R として知られる方法で分散型反復シーケンス（IRS 、
例えば、 Alu シーケンス）から得たプライマーを用い
る重合酵素連鎖反応によって増殖できる。さらに、染色
体多色バンディングに用いるに適当な染色体分裂片のも
う一つの源は、大きな DNA 分裂片を生成する DNA 制限
法、そして大きな DNA 分裂片を分離可能な電気泳動法
によって生成された分裂片である。DNA 制限によって大
きな DNA 分裂片を生成することに関しては、二つのア
プローチが考えられる。第一のアプローチによれば、エ
ンドヌクレアーゼ（例えば、頻繁に、あるいは稀に用い
られるカッター）による部分消化が用いられるが、第二
のアプローチによれば、稀なカッターであるエンドヌク
レアーゼ（例えば、 NotI）による完全消化が用いられ
る。完全消化は、独立した試験で全く同一の結果を得る
ために繰り返すことができるが、部分消化は性質的にラ
ンダムであるため、現在は後者が好まれる。大きな DNA
分裂片が分離可能な電気泳動法は、本技術でよく知ら
れており、これにはパルス・フィールド・ゲル電気泳動
（PFGE）が含まれる。したがって、例えば、 PFGE 航路
に沿った連続した領域から DNA を抽出し、各領域から
抽出した DNA に、異なる発蛍光団を用いて標識し、こ
のように形成したプローブを染色体にコハイブリダイゼ
ーション化することで、上記に説明したような染色体の
多色バンディング・パターンが得られる。本技術分野で
よく知られるショ糖あるいはセシウム塩化物グラジエン
ト等のグラジエント遠心分離によって、さらに、大きな
DNA 分裂片が得られる。しかし、これらのアプローチ
を用いることが、上記に説明したように遺伝学的なマッ
プと細胞遺伝学的なマップとを統合する可能性を提供す
るものではないため、現在、これらのアプローチはあま
り好まれない。蛍光 DNA ハイブリダイゼーションと本
発明の分類アプローチとに基づく染色体多色バンディン
グ・パターンの生成（すなわち、多色バンディング核
型）は、種々の実用的な用途に用いられる。これらの用
途には、例えば、（ｉ）例えば、特注のクローンセット
を用いる染色体異常をスクリーニングすること、（ｉ
ｉ）さもなければ検出が難しい 末端小粒欠失をスクリ
ーニングすること、（ｉｉｉ）出生前診断における染色
体異数体をスクリーニングすること、（ｉｖ）再発性染
色体ブレークポイントをスクリーニングすること、
（ｖ）多色比較ゲノム交雑を行うこと、（ｖｉｉ）腫瘍
細胞の多パラメータ分析のために多色 FISH を、細胞学
的な、そして免疫組織化学的な染色の他の測定と組み合
わせること、（ｖｉｉｉ）多色バンディング・パターン
を従来のＲあるいはＧバンドと組み合わせること、（ｉ
ｘ）細胞分裂間期細胞における遺伝学的な異常を直接的
に分析すること、そして（ｘ）放射線あるいは変異誘発
物質にさらされた住民の染色体異常をスクリーニングす
ることが含まれる。
【０１９８】第八に、さらに良い結果を達成するため
に、本発明の分類アプローチを、自動核型分析の技術分
野でよく知られている形態学的アルゴリズムを含むよう
に拡張することができる。
に、本発明の分類アプローチを、自動核型分析の技術分
野でよく知られている形態学的アルゴリズムを含むよう
に拡張することができる。
【０１９９】図５ａ及び図５ｂに、本発明の方法によっ
て分析した部分的な分裂中期の二つの例を示す。図５ａ
及び図５ｂに示す結果を得るために、測定結果の質を改
善するいくつかの形態学的なステップを加えて、この例
において説明した分析の基本的なステップをすべて用い
た。
て分析した部分的な分裂中期の二つの例を示す。図５ａ
及び図５ｂに示す結果を得るために、測定結果の質を改
善するいくつかの形態学的なステップを加えて、この例
において説明した分析の基本的なステップをすべて用い
た。
【０２００】次に、分析ステップについて、測定のシミ
ュレーションから結果のディスプレイまでをより詳細に
示す。
ュレーションから結果のディスプレイまでをより詳細に
示す。
【０２０１】１．例１に従って準備した分裂中期のキュ
ーブＡについて、例２で説明した装置によって測定した
スペクトルの積分を用いて測定をシミュレートする。交
雑に用いる染料は、表１に示したものであり、染料組合
せは表２に示したものである。表４にリストした五つの
発光フィルタの範囲について、各ピクセルに対して五つ
のスペクトル積分を計算し、各ピクセルに対して５次元
のベクトルを形成する。
ーブＡについて、例２で説明した装置によって測定した
スペクトルの積分を用いて測定をシミュレートする。交
雑に用いる染料は、表１に示したものであり、染料組合
せは表２に示したものである。表４にリストした五つの
発光フィルタの範囲について、各ピクセルに対して五つ
のスペクトル積分を計算し、各ピクセルに対して５次元
のベクトルを形成する。
【０２０２】２．既知の単一染色された染色体に属する
スペクトルの積分の平均をライブラリに保存し、方程式
１及び２の既知の係数Ｒij として用いる。
スペクトルの積分の平均をライブラリに保存し、方程式
１及び２の既知の係数Ｒij として用いる。
【０２０３】３．例えば、データの３ｘ３ピクセル空間
フィルタリング（空間ノイズを減らすこと）によって、
キューブＡの立体的解像度を減少させ、新しいキューブ
Ｂをもたらす。
フィルタリング（空間ノイズを減らすこと）によって、
キューブＡの立体的解像度を減少させ、新しいキューブ
Ｂをもたらす。
【０２０４】４．例えば、キューブＡの３０ｘ３０ピク
セル空間フィルタリングによって局所的な「背景」キュ
ーブＣを計算し、キューブＢから減算して、新しいキュ
ーブＤを形成する。これは、散乱や、他の不要な放射光
源から生じる局所的な輝度変化を考慮するためのもので
ある。
セル空間フィルタリングによって局所的な「背景」キュ
ーブＣを計算し、キューブＢから減算して、新しいキュ
ーブＤを形成する。これは、散乱や、他の不要な放射光
源から生じる局所的な輝度変化を考慮するためのもので
ある。
【０２０５】５．負のデータは物理的なものではないた
め、キューブＤのすべてのデータに対して閾値をゼロと
し、単に正の成分値を持つ五つの ベクトルからなる新
しいキューブＥをもたらす。
め、キューブＤのすべてのデータに対して閾値をゼロと
し、単に正の成分値を持つ五つの ベクトルからなる新
しいキューブＥをもたらす。
【０２０６】６．このようにすべてのピクセルに対して
得られたキューブＥの新しい５次元ベクトルと、単一染
色されたピクセルのＲij データとを、上記に説明した
方程式１及び２に用いて、各ピクセルに対して五つのベ
クトルｎi ／Ｎi （ｉ ＝ １、・・・５) を見いだす。
得られたキューブＥの新しい５次元ベクトルと、単一染
色されたピクセルのＲij データとを、上記に説明した
方程式１及び２に用いて、各ピクセルに対して五つのベ
クトルｎi ／Ｎi （ｉ ＝ １、・・・５) を見いだす。
【０２０７】７．各ピクセルにおけるｎi ／Ｎi の値に
対して、各々、０.１３、０.２、０.２、０.３及び０.
３を閾値とし、ゼロとゼロでない要素の組合せから形成
される新しい五つのベクトルを得る。この新しいキュー
ブをＧと呼ぶ。
対して、各々、０.１３、０.２、０.２、０.３及び０.
３を閾値とし、ゼロとゼロでない要素の組合せから形成
される新しい五つのベクトルを得る。この新しいキュー
ブをＧと呼ぶ。
【０２０８】８．次のルールに従って、表２にリストし
た染料の組合せにキューブＧの各ピクセルを比較する。
（ｉ）一つのピクセルにおける染料ａ、ｂ、ｃ、ｄ及び
ｅの存在あるいは欠如を、各々、Ｇの五つのベクトルの
第一、第二、第三、第四、そして第五成分によって示
す。（ｉｉ）もし成分がゼロに等しいなら、その対応す
る染料は欠如している。（ｉｉｉ）もし成分がゼロでな
いなら、その対応する染料は存在する。（ｉｖ）表２に
よって、一つのピクセルに対する存在あるいは欠如ベク
トルを、それが属する正しい染色体番号へと置き換え
る。
た染料の組合せにキューブＧの各ピクセルを比較する。
（ｉ）一つのピクセルにおける染料ａ、ｂ、ｃ、ｄ及び
ｅの存在あるいは欠如を、各々、Ｇの五つのベクトルの
第一、第二、第三、第四、そして第五成分によって示
す。（ｉｉ）もし成分がゼロに等しいなら、その対応す
る染料は欠如している。（ｉｉｉ）もし成分がゼロでな
いなら、その対応する染料は存在する。（ｉｖ）表２に
よって、一つのピクセルに対する存在あるいは欠如ベク
トルを、それが属する正しい染色体番号へと置き換え
る。
【０２０９】９．このように得た画像を、図５ａ及び図
５ｂに例証するように、各染色体番号を所定色で示しな
がらコンピュータ・スクリーン上に表示する。その後、
本技術分野でよく知られるように、染色体を対に配置替
えして核型（図示せず）を形成してもよい。
５ｂに例証するように、各染色体番号を所定色で示しな
がらコンピュータ・スクリーン上に表示する。その後、
本技術分野でよく知られるように、染色体を対に配置替
えして核型（図示せず）を形成してもよい。
【０２１０】例４ AOTF 及び LCTF
【０２１１】超音波光学チューナブル・フィルタ（AOT
F）等のチューナブル・フィルタ（TF）及び液晶チュー
ナブル・フィルタ（LCTF）は、本技術分野でよく知られ
るように、特定の波長に電子的に調整可能な可動部分を
持たない、固体状態の電子的にチューン可能なスペクト
ル帯域セレクタである。ゆえに、チューナブル・フィル
タは、その範囲内のどの波長にでも電子的に調整が可能
な可変帯域フィルタと考えることができる。
F）等のチューナブル・フィルタ（TF）及び液晶チュー
ナブル・フィルタ（LCTF）は、本技術分野でよく知られ
るように、特定の波長に電子的に調整可能な可動部分を
持たない、固体状態の電子的にチューン可能なスペクト
ル帯域セレクタである。ゆえに、チューナブル・フィル
タは、その範囲内のどの波長にでも電子的に調整が可能
な可変帯域フィルタと考えることができる。
【０２１２】液晶チューナブル・フィルタ（LCTF）は、
通常、双極子を持つ高分子量の有機物から形成される固
体状態の電子的にチューン可能なスペクトル帯域フィル
タであり、液晶への電圧を変えることによって、チュー
ニングが可能である。 LCTFは、建設的な、そして破壊
的な干渉をもたらすためにフェーズ遅延を用いる複屈折
フィルタである。直列に複数のステージを積み重ねるこ
とによって、多空洞干渉フィルタに似た様式で単一帯域
が得られる。 LCTF 技術は、１９９２年にケンブリッジ
・リサーチ・インスツルメンテーション（CRI）社によ
って導入されたものである。最初に製造された LCTF に
は、帯域幅及び形状、そして偏光、特にランダムな偏光
の透過に関する種々の限界があった。しかしながら、第
二世代のLCTF は、偏光のおよそ１００パーセント、ラ
ンダムな偏光のほぼ５０パーセント以上の透過、そして
４００ｎｍから７２０ｎｍのスペクトル範囲における多
様な形状からなる広範な帯域（頂部と底部）を可能に
し、これらの問題を解消した。 LCTF の開発について
は、クリフォード・ホイト氏の「液晶チューナブル・フ
ィルタがマルチプローブ蛍光を映像化するための道を開
く」（Clifford Hoyt (1996) Liquid crystals tunable
filters clear the way for imaging multiprobe fluo
rescence. Biomotonics International, 3(4), 49-5
1）を参照。さらに、 LCTF に関する情報については、
例えばホイト氏及びベンソン氏による「分光分析法とデ
ィジタル結像との統合が細胞研究を促進する」、コップ
氏による「液晶可変リターダを用いるチューン可能な複
屈折フィルタ」、ミラー氏及びホイト氏による「液晶チ
ューナブル・フィルタによる多スペクトル結像」及びコ
エニグ氏らによる「にきび、虫歯及び扁平上皮細胞癌の
診断のための、人間の皮膚及び口腔内においてポルフィ
リンを生成するバクテリアの生体内蛍光検出及び結像」
（Hoyt and Benson. (1992) Merging spectroscopy and
digital imaging enhances cell research. Photonics
Spectra 26(11), 92-97; Kopp (1994) Tunablebirefri
ngent filters using liquid crystal variable retard
ers. Proc, SPIE2265, 192-201; Miller and Hoyt (199
5) Multispectral imaging with a liquid crystal tun
able filter. Proc. SPIE 2345, 354-365; and Koenig
et al. (1994) Invivo fluorescence detection and im
aging of porphyrin-producing bacteria in the human
skin and in the oral cavity for diagnosis of acn
e,caries, and squamous cell carcinoma. Proc. SPIE
2135, 129-138）を参照のこと。
通常、双極子を持つ高分子量の有機物から形成される固
体状態の電子的にチューン可能なスペクトル帯域フィル
タであり、液晶への電圧を変えることによって、チュー
ニングが可能である。 LCTFは、建設的な、そして破壊
的な干渉をもたらすためにフェーズ遅延を用いる複屈折
フィルタである。直列に複数のステージを積み重ねるこ
とによって、多空洞干渉フィルタに似た様式で単一帯域
が得られる。 LCTF 技術は、１９９２年にケンブリッジ
・リサーチ・インスツルメンテーション（CRI）社によ
って導入されたものである。最初に製造された LCTF に
は、帯域幅及び形状、そして偏光、特にランダムな偏光
の透過に関する種々の限界があった。しかしながら、第
二世代のLCTF は、偏光のおよそ１００パーセント、ラ
ンダムな偏光のほぼ５０パーセント以上の透過、そして
４００ｎｍから７２０ｎｍのスペクトル範囲における多
様な形状からなる広範な帯域（頂部と底部）を可能に
し、これらの問題を解消した。 LCTF の開発について
は、クリフォード・ホイト氏の「液晶チューナブル・フ
ィルタがマルチプローブ蛍光を映像化するための道を開
く」（Clifford Hoyt (1996) Liquid crystals tunable
filters clear the way for imaging multiprobe fluo
rescence. Biomotonics International, 3(4), 49-5
1）を参照。さらに、 LCTF に関する情報については、
例えばホイト氏及びベンソン氏による「分光分析法とデ
ィジタル結像との統合が細胞研究を促進する」、コップ
氏による「液晶可変リターダを用いるチューン可能な複
屈折フィルタ」、ミラー氏及びホイト氏による「液晶チ
ューナブル・フィルタによる多スペクトル結像」及びコ
エニグ氏らによる「にきび、虫歯及び扁平上皮細胞癌の
診断のための、人間の皮膚及び口腔内においてポルフィ
リンを生成するバクテリアの生体内蛍光検出及び結像」
（Hoyt and Benson. (1992) Merging spectroscopy and
digital imaging enhances cell research. Photonics
Spectra 26(11), 92-97; Kopp (1994) Tunablebirefri
ngent filters using liquid crystal variable retard
ers. Proc, SPIE2265, 192-201; Miller and Hoyt (199
5) Multispectral imaging with a liquid crystal tun
able filter. Proc. SPIE 2345, 354-365; and Koenig
et al. (1994) Invivo fluorescence detection and im
aging of porphyrin-producing bacteria in the human
skin and in the oral cavity for diagnosis of acn
e,caries, and squamous cell carcinoma. Proc. SPIE
2135, 129-138）を参照のこと。
【０２１３】超音波光学チューナブル・フィルタ（AOT
F）は、光学スペクトルの紫外線から可視光線そして赤
外線の領域において作動する固体状態の電子的にチュー
ン可能なスペクトル帯域フィルタである。 AOTF は異方
性の媒体において音響光学相互作用の原理に従って作動
する。言い換えれば、 AOTF は、弾性光学作用による屈
折率の周期的な変調を生じる媒体を介して進む音波及び
光の相互作用によって機能する。この変調は、結晶への
入射光に対して三次元正弦位相格子として作用し、特定
の波長を、入射光線からある角度で回折する。このた
め、音響変換器、通常、圧電モータを結晶の一面に結合
させ、音響吸収体を反対側の面に結合させる。この変換
器は、高周波ｒｆ（無線周波数）信号を、結晶を介して
横方向に伝播する正弦圧力波に換える。その結果、媒体
は、入射光がそのスペクトル波長に回折される格子と同
様に作動し、媒体から種々の波長の光が入射光線に対し
て異なる角で出力される。結晶の反対側の端部にある音
響吸収体は、直接音波の形状を乱すであろう音響反射を
排除する。入射及び回折光子波ベクトルと音波ベクトル
との間の運動量保存の法則から、任意の角度において媒
体を通過する回折光の波長が決定する。したがって、 A
OTF を移動させることなく、選択角度において、媒体を
通過する光の波長を制御することができる。光学的チュ
ーニング、すなわち、予め選択した角度で媒体を通過す
る光の波長を、ｒｆ周波数信号を選択することによって
決めることが可能である。
F）は、光学スペクトルの紫外線から可視光線そして赤
外線の領域において作動する固体状態の電子的にチュー
ン可能なスペクトル帯域フィルタである。 AOTF は異方
性の媒体において音響光学相互作用の原理に従って作動
する。言い換えれば、 AOTF は、弾性光学作用による屈
折率の周期的な変調を生じる媒体を介して進む音波及び
光の相互作用によって機能する。この変調は、結晶への
入射光に対して三次元正弦位相格子として作用し、特定
の波長を、入射光線からある角度で回折する。このた
め、音響変換器、通常、圧電モータを結晶の一面に結合
させ、音響吸収体を反対側の面に結合させる。この変換
器は、高周波ｒｆ（無線周波数）信号を、結晶を介して
横方向に伝播する正弦圧力波に換える。その結果、媒体
は、入射光がそのスペクトル波長に回折される格子と同
様に作動し、媒体から種々の波長の光が入射光線に対し
て異なる角で出力される。結晶の反対側の端部にある音
響吸収体は、直接音波の形状を乱すであろう音響反射を
排除する。入射及び回折光子波ベクトルと音波ベクトル
との間の運動量保存の法則から、任意の角度において媒
体を通過する回折光の波長が決定する。したがって、 A
OTF を移動させることなく、選択角度において、媒体を
通過する光の波長を制御することができる。光学的チュ
ーニング、すなわち、予め選択した角度で媒体を通過す
る光の波長を、ｒｆ周波数信号を選択することによって
決めることが可能である。
【０２１４】分光学的な用途及びスペクトル結像用途に
おける AOTF の使用は新しいことではない。例えば、チ
ャオ（Chao）氏らの米国特許第５,２１６,４８４号及び
ルイス（Lewis）氏らの米国特許第５,３７７,００３号
を参照。さらに、 AOTF の作動に関する情報について
は、例えば、ワン氏及びルイス氏の「蛍光結像分光分析
法と顕微鏡検査法：超音波光学チューナブル・フィルタ
と、分光学的結像及び顕微鏡検査法での用途」、ハリス
氏らの「超音波光学チューナブル・フィルタ」、チャン
氏の「大きな開口角を持つ非共直線超音波光学フィル
タ」、エリオット氏らの「０.３５マイクロメータの空
間解像度を持つ結像超音波光学チューナブル・フィル
タ」（Wang and Lewis (1996) Acousto-optic tunable
filters and their application in spectroscopic ima
ging and microscopy, In, "Fluorescence Imaging Spe
ctroscopy and Microscopy". Feng, Wang and Brian, E
ds. JohnWiley and Sons Inc.; Harris et al. (1969)
Acousto-optic tunable filters. Journal of the opt
ical society of America, 59, 744-747; Chang (1977)
Noncolinear acousto-optic filter with large angula
r aperture. Applied Physics Letters, 25, 370-372;
Eliot et al., (1996) Imaging acousto-optic tunable
filter with 0.35-micrometer spatial resolution.
Applied Optics,35, 5220-5226）及び米国特許第３,６
７９,２８８号、第３,９４４,３３４号、第３,９４４,
３３５号、第３,９５３,１０７号、第４,０５２,１２１
号、第４,３４２,５０２号及び第５,０３９,８５５号を
参照のこと。
おける AOTF の使用は新しいことではない。例えば、チ
ャオ（Chao）氏らの米国特許第５,２１６,４８４号及び
ルイス（Lewis）氏らの米国特許第５,３７７,００３号
を参照。さらに、 AOTF の作動に関する情報について
は、例えば、ワン氏及びルイス氏の「蛍光結像分光分析
法と顕微鏡検査法：超音波光学チューナブル・フィルタ
と、分光学的結像及び顕微鏡検査法での用途」、ハリス
氏らの「超音波光学チューナブル・フィルタ」、チャン
氏の「大きな開口角を持つ非共直線超音波光学フィル
タ」、エリオット氏らの「０.３５マイクロメータの空
間解像度を持つ結像超音波光学チューナブル・フィル
タ」（Wang and Lewis (1996) Acousto-optic tunable
filters and their application in spectroscopic ima
ging and microscopy, In, "Fluorescence Imaging Spe
ctroscopy and Microscopy". Feng, Wang and Brian, E
ds. JohnWiley and Sons Inc.; Harris et al. (1969)
Acousto-optic tunable filters. Journal of the opt
ical society of America, 59, 744-747; Chang (1977)
Noncolinear acousto-optic filter with large angula
r aperture. Applied Physics Letters, 25, 370-372;
Eliot et al., (1996) Imaging acousto-optic tunable
filter with 0.35-micrometer spatial resolution.
Applied Optics,35, 5220-5226）及び米国特許第３,６
７９,２８８号、第３,９４４,３３４号、第３,９４４,
３３５号、第３,９５３,１０７号、第４,０５２,１２１
号、第４,３４２,５０２号及び第５,０３９,８５５号を
参照のこと。
【０２１５】伝統的に、 AOTF は種々の狭帯域をもたら
すために用いられていたが、例えば、異なる波長の音波
の重なり（例えば、一次結合）によって音響パラメータ
を、例えば、一つ以上の変換器を用いることによって、
異なる振幅を電子的に制御することで、所望の波形の選
択が可能となり、予め選択した角度で、波長を変えて輝
度の異なる光を通過させることができる。さらに、音響
吸収体を除くことにより、結晶の端面からの反射を許し
波の重なりを可能にすることで、予め選択した角度で波
長を変化させて、異なる輝度の光の通過を制御すること
ができる。したがって、 AOTF は、多数の接近した間隔
の rf で駆動されるとき、電子的に可変な帯域及び形状
制御を提供する。この効果については、エリオット氏ら
の「０.３５マイクロメータの空間解像度を持つ結像超
音波光学チューナブル・フィルタ」（Eliot et al. (19
96) Imaging acousto-optic tunable filter with 0.35
micrometer spatial resolution. Applied Optics, 3
5, 5220-5226）を参照。
すために用いられていたが、例えば、異なる波長の音波
の重なり（例えば、一次結合）によって音響パラメータ
を、例えば、一つ以上の変換器を用いることによって、
異なる振幅を電子的に制御することで、所望の波形の選
択が可能となり、予め選択した角度で、波長を変えて輝
度の異なる光を通過させることができる。さらに、音響
吸収体を除くことにより、結晶の端面からの反射を許し
波の重なりを可能にすることで、予め選択した角度で波
長を変化させて、異なる輝度の光の通過を制御すること
ができる。したがって、 AOTF は、多数の接近した間隔
の rf で駆動されるとき、電子的に可変な帯域及び形状
制御を提供する。この効果については、エリオット氏ら
の「０.３５マイクロメータの空間解像度を持つ結像超
音波光学チューナブル・フィルタ」（Eliot et al. (19
96) Imaging acousto-optic tunable filter with 0.35
micrometer spatial resolution. Applied Optics, 3
5, 5220-5226）を参照。
【０２１６】したがって、本発明の方法を行うために必
要な広帯域励起及び発光フィルタは、単一のチューナブ
ル・フィルタによって、あるいは択一的に、連続的に測
定に適用すると、全体的としてほぼ全く同一の結果をも
たらす幾つかのフィルタのサブセットによって代表して
もよい。フィルタのこのような組合せを、連続的に必要
なフィルタを具現するために、異なる帯域に調整が可能
な単一チューナブル・フィルタ（LCTF あるいは AOTF）
によって構成してもよい。
要な広帯域励起及び発光フィルタは、単一のチューナブ
ル・フィルタによって、あるいは択一的に、連続的に測
定に適用すると、全体的としてほぼ全く同一の結果をも
たらす幾つかのフィルタのサブセットによって代表して
もよい。フィルタのこのような組合せを、連続的に必要
なフィルタを具現するために、異なる帯域に調整が可能
な単一チューナブル・フィルタ（LCTF あるいは AOTF）
によって構成してもよい。
【０２１７】AOTF や LCTF 等のチューナブル・フィル
タを用いれば、測定には一つのフィルタだけがあればよ
い。チューナブル・フィルタは、連続的に所望の特性を
得るために、スペクトル特性を変えるように調整され
る。したがって、本来の位置で交雑した染色体の測定に
関して、チューナブル・フィルタが連続的に広帯域励起
及び発光フィルタを具現するようにチューニング情報が
選択される。しかし、これは、電子的に制御されるの
で、測定には可動部分が伴わないことになる。
タを用いれば、測定には一つのフィルタだけがあればよ
い。チューナブル・フィルタは、連続的に所望の特性を
得るために、スペクトル特性を変えるように調整され
る。したがって、本来の位置で交雑した染色体の測定に
関して、チューナブル・フィルタが連続的に広帯域励起
及び発光フィルタを具現するようにチューニング情報が
選択される。しかし、これは、電子的に制御されるの
で、測定には可動部分が伴わないことになる。
【０２１８】例５ 広帯域励起及び発光フィルタ装置
【０２１９】上記に説明したように、ピクセルをグルー
プに分類するために、スループットのゲインによって特
定性の損失を補正する、あるいは特定性のゲインによっ
てスループットの損失を補正する広帯域励起及び発光フ
ィルタを用いてもよい。
プに分類するために、スループットのゲインによって特
定性の損失を補正する、あるいは特定性のゲインによっ
てスループットの損失を補正する広帯域励起及び発光フ
ィルタを用いてもよい。
【０２２０】さて、図６を参照する。測定を容易にする
ために、励起及び発光フィルタの対を装置に配置する。
なお、この装置を下記に装置１００と言及する。この装
置１００は、複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍光
団あるいは発蛍光団の組合せに関連させて、ピクセルを
ピクセルのグループに分類するもので、各発蛍光団に
は、特徴的な励起及び発光スペクトル及び特定な励起及
び発光ピークがある。
ために、励起及び発光フィルタの対を装置に配置する。
なお、この装置を下記に装置１００と言及する。この装
置１００は、複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍光
団あるいは発蛍光団の組合せに関連させて、ピクセルを
ピクセルのグループに分類するもので、各発蛍光団に
は、特徴的な励起及び発光スペクトル及び特定な励起及
び発光ピークがある。
【０２２１】分類のために、試料、例えば、上記の説明
を裏付ける本来の位置で彩色された染色体１０４を、装
置１００の対物レンズ１０１の下、支持板１０６の上に
置く。
を裏付ける本来の位置で彩色された染色体１０４を、装
置１００の対物レンズ１０１の下、支持板１０６の上に
置く。
【０２２２】装置１００は、光線１１２を提供する光源
１１０を含み、光線１１２は、選択した発蛍光団を励起
するに適当な波長範囲にある光を含む。
１１０を含み、光線１１２は、選択した発蛍光団を励起
するに適当な波長範囲にある光を含む。
【０２２３】さらに、装置１００は、広帯域励起フィル
タ１１４及び広帯域発光フィルタ１１６の複数の対を含
む。五つの対が示されている。これらのフィルタには上
記の特徴がある。フィルタ１１４は、光線１１２による
照射を、上記に説明したように、励起スループットと特
定性との間で補正を行う特定な励起波長に制限する。フ
ィルタ１１６は、試料１０４から発光を、上記に説明し
たように、発光スループットと特定性との間で補正を行
う特定な波長に制限する。
タ１１４及び広帯域発光フィルタ１１６の複数の対を含
む。五つの対が示されている。これらのフィルタには上
記の特徴がある。フィルタ１１４は、光線１１２による
照射を、上記に説明したように、励起スループットと特
定性との間で補正を行う特定な励起波長に制限する。フ
ィルタ１１６は、試料１０４から発光を、上記に説明し
たように、発光スループットと特定性との間で補正を行
う特定な波長に制限する。
【０２２４】さらに、装置１００は、自動、手動、ある
いは半自動の制御装置１２０を含む。装置１２０は、一
対のフィルタ１１４と１１６を選択し、広帯域励起フィ
ルタ１１４の一つを介した光源１１０からの光で各ピク
セルの発蛍光団を励起し、すべてのフィルタの対に対し
てこの手順を繰り返す。
いは半自動の制御装置１２０を含む。装置１２０は、一
対のフィルタ１１４と１１６を選択し、広帯域励起フィ
ルタ１１４の一つを介した光源１１０からの光で各ピク
セルの発蛍光団を励起し、すべてのフィルタの対に対し
てこの手順を繰り返す。
【０２２５】さらに、装置１００は、発光フィルタ１１
６を通過した後の発光輝度を記録するための光輝度記録
装置１２２（例えば、ＣＣＤ）を含む。
６を通過した後の発光輝度を記録するための光輝度記録
装置１２２（例えば、ＣＣＤ）を含む。
【０２２６】したがって、ピクセルの各々は、複数のフ
ィルタ１１４及び１１６の対の数に等しい次元数を持つ
ベクトルによって表すことができる。
ィルタ１１４及び１１６の対の数に等しい次元数を持つ
ベクトルによって表すことができる。
【０２２７】さらに、装置１００は演算装置１２４を含
み、この演算装置１２４は、各ピクセルの複数の発蛍光
団の各々の存在を評価するアルゴリズムを含む。
み、この演算装置１２４は、各ピクセルの複数の発蛍光
団の各々の存在を評価するアルゴリズムを含む。
【０２２８】これによって、演算装置１２４は、単一の
発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させて各ピク
セルをピクセルのグループに分類する。
発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させて各ピク
セルをピクセルのグループに分類する。
【０２２９】好適実施例においては、演算装置１２４
は、ピクセルの各グループに属するピクセルに独特な人
工色を与えるため、各グループに属するピクセルは互い
に区別可能である。
は、ピクセルの各グループに属するピクセルに独特な人
工色を与えるため、各グループに属するピクセルは互い
に区別可能である。
【０２３０】さらに、装置１００は、人工色で分類結果
を示すためのディスプレイ１２６（例えば、コンピュー
タ・スクリーン）を含むことが好ましい。
を示すためのディスプレイ１２６（例えば、コンピュー
タ・スクリーン）を含むことが好ましい。
【０２３１】好適実施例においては、さらに、装置１０
０は、記録装置１２２に到達する前に光の照準を完全に
合わせるための照準レンズ１１９を含む。
０は、記録装置１２２に到達する前に光の照準を完全に
合わせるための照準レンズ１１９を含む。
【０２３２】好適実施例においては、さらに、装置１０
０は、記録装置１２２に到達する光を集束させるための
集束レンズ１２１を含む。
０は、記録装置１２２に到達する光を集束させるための
集束レンズ１２１を含む。
【０２３３】本発明による装置１００を用いることは、
上記例３に示すように、本発明の分類アプローチに基づ
くすべての細胞遺伝学的な用途、特に染色体バンディン
グ分析に有益であることは同業者には明らかである。
上記例３に示すように、本発明の分類アプローチに基づ
くすべての細胞遺伝学的な用途、特に染色体バンディン
グ分析に有益であることは同業者には明らかである。
【０２３４】例６ 広帯域励起及び発光 AOTF 及び L
CTF フィルタ装置
CTF フィルタ装置
【０２３５】上記に説明したように、スループットのゲ
インによって特定性の損失を補正する、あるいは特定性
のゲインによってスループットの損失を補正する広帯域
励起及び発光フィルタを、チューナブルフィルタで置き
換えてもよい。
インによって特定性の損失を補正する、あるいは特定性
のゲインによってスループットの損失を補正する広帯域
励起及び発光フィルタを、チューナブルフィルタで置き
換えてもよい。
【０２３６】さて、図７を参照する。測定を容易にする
ために、励起及び発光チューナブルフィルタの対を装置
に配置する。なお、この装置を下記に装置１００’と言
及する。先と同様、この装置１００’は、複数の発蛍光
団から選択した単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合
せに関連させて、ピクセルをピクセルのグループに分類
するもので、各発蛍光団には、特徴的な励起及び発光ス
ペクトル及び特定な励起及び発光ピークがある。分類の
ために、試料、例えば、上記の説明を裏付ける本来の位
置で彩色された染色体１０４’を、装置１００’の対物
レンズ１０１’の下、支持板１０６’の上に置く。
ために、励起及び発光チューナブルフィルタの対を装置
に配置する。なお、この装置を下記に装置１００’と言
及する。先と同様、この装置１００’は、複数の発蛍光
団から選択した単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合
せに関連させて、ピクセルをピクセルのグループに分類
するもので、各発蛍光団には、特徴的な励起及び発光ス
ペクトル及び特定な励起及び発光ピークがある。分類の
ために、試料、例えば、上記の説明を裏付ける本来の位
置で彩色された染色体１０４’を、装置１００’の対物
レンズ１０１’の下、支持板１０６’の上に置く。
【０２３７】装置１００’は、光線１１２’を提供する
光源１１０’を含み、 光線１１２’は、選択した発蛍
光団を励起するに適当な波長範囲にある光を含む。
光源１１０’を含み、 光線１１２’は、選択した発蛍
光団を励起するに適当な波長範囲にある光を含む。
【０２３８】さらに、装置１００’は、広帯域チューナ
ブル励起フィルタ１１４’及び広帯域発光フィルタ１１
６’を含むフィルタの対を含む。これらのフィルタはチ
ューナブルであるため、例５（図６）の装置１００に用
いた従来の帯域フィルタの対を表すように連続的に調整
が可能である。従って、フィルタ１１４’は、光線１１
２’による照射を、上記に説明したように、励起スルー
プットと特定性との間で補正を行う特定な励起波長に制
限する。フィルタ１１６’は、試料１０４’から発光
を、上記に説明したように、発光スループットと特定性
との間で補正を行う特定な波長に制限する。
ブル励起フィルタ１１４’及び広帯域発光フィルタ１１
６’を含むフィルタの対を含む。これらのフィルタはチ
ューナブルであるため、例５（図６）の装置１００に用
いた従来の帯域フィルタの対を表すように連続的に調整
が可能である。従って、フィルタ１１４’は、光線１１
２’による照射を、上記に説明したように、励起スルー
プットと特定性との間で補正を行う特定な励起波長に制
限する。フィルタ１１６’は、試料１０４’から発光
を、上記に説明したように、発光スループットと特定性
との間で補正を行う特定な波長に制限する。
【０２３９】さらに、装置１００’は制御装置１２０’
を含む。この装置１２０’は、フィルタ１１４’及び１
１６’を調整し、励起フィルタ１１４’を介した光源１
１０’からの光で各ピクセルの発蛍光団を励起し、最初
に戻った後、この手順を繰り返す。
を含む。この装置１２０’は、フィルタ１１４’及び１
１６’を調整し、励起フィルタ１１４’を介した光源１
１０’からの光で各ピクセルの発蛍光団を励起し、最初
に戻った後、この手順を繰り返す。
【０２４０】さらに、装置１００’は、発光フィルタ１
１６’を通過した後の発光輝度を記録するための光輝度
記録装置１２２’（例えば、ＣＣＤ）を含む。
１６’を通過した後の発光輝度を記録するための光輝度
記録装置１２２’（例えば、ＣＣＤ）を含む。
【０２４１】したがって、ピクセルの各々は、フィルタ
１１４’及び１１６’によって課された調整状態の数に
等しい次元数を持つベクトルによって表すことができ
る。
１１４’及び１１６’によって課された調整状態の数に
等しい次元数を持つベクトルによって表すことができ
る。
【０２４２】さらに、装置１００’は演算装置１２４’
を含み、 この演算装置１２４’は、各ピクセルの複数
の発蛍光団の各々の存在を評価するアルゴリズムを含
む。これによって、演算装置１２４’は、単一の発蛍光
団あるいは発蛍光団の組合せに関連させて各ピクセルを
ピクセルのグループに分類する。
を含み、 この演算装置１２４’は、各ピクセルの複数
の発蛍光団の各々の存在を評価するアルゴリズムを含
む。これによって、演算装置１２４’は、単一の発蛍光
団あるいは発蛍光団の組合せに関連させて各ピクセルを
ピクセルのグループに分類する。
【０２４３】好適実施例においては、 演算装置１２
４’は、ピクセルの各グループに属するピクセルに独特
な人工色を与えるため、各グループに属するピクセルは
互いに区別可能である。
４’は、ピクセルの各グループに属するピクセルに独特
な人工色を与えるため、各グループに属するピクセルは
互いに区別可能である。
【０２４４】さらに、装置１００’は、人工色で分類結
果を示すためのディスプレイ１２６’（例えば、コンピ
ュータ・スクリーン）を含むことが好ましい。
果を示すためのディスプレイ１２６’（例えば、コンピ
ュータ・スクリーン）を含むことが好ましい。
【０２４５】好適実施例においては、さらに、装置１０
０’は、記録装置１２２’に到達する前に光の照準を完
全に合わせるための照準レンズ１１９’を含む。
０’は、記録装置１２２’に到達する前に光の照準を完
全に合わせるための照準レンズ１１９’を含む。
【０２４６】好適実施例においては、さらに、装置１０
０’は、記録装置１２２’に到達する光を集束させるた
めの集束レンズ１２１’を含む。
０’は、記録装置１２２’に到達する光を集束させるた
めの集束レンズ１２１’を含む。
【０２４７】本発明による装置１００’を用いること
は、上記例３に示すように、本発明の分類アプローチに
基づくすべての細胞遺伝学的な用途、特に染色体バンデ
ィング分析に有益であることは同業者には明らかであ
る。
は、上記例３に示すように、本発明の分類アプローチに
基づくすべての細胞遺伝学的な用途、特に染色体バンデ
ィング分析に有益であることは同業者には明らかであ
る。
【０２４８】本発明は、限られた数の実施例に関して説
明されたが、本発明について多くの変形、改良及び他の
適用が行なわれ得ることは明らかである。
明されたが、本発明について多くの変形、改良及び他の
適用が行なわれ得ることは明らかである。
【図１】米国特許第５,５３９,５１７号（従来の技術）
に従って製作した結像分光計の主構成要素を示すブロッ
ク図である。
に従って製作した結像分光計の主構成要素を示すブロッ
ク図である。
【図２】米国特許第５,５３９,５１７号（従来の技術）
に従って結像分光計に用いられるサグナック干渉計を示
す。
に従って結像分光計に用いられるサグナック干渉計を示
す。
【図３】二つの発蛍光団の励起及び発光スペクトルを示
す。これらは、重なり合う励起及び発光スペクトル（例
えば、テキサス・レッド及びスペクトラム・オレンジの
対、あるいはＣｙ５及びＣｙ５.５の対）を持つ。これ
らの染料を用い、従来の技術による光子処理能力が低い
システム（ LPTS ）の原理に従って、対応する狭識別励
起及び発光フィルタを用いた。
す。これらは、重なり合う励起及び発光スペクトル（例
えば、テキサス・レッド及びスペクトラム・オレンジの
対、あるいはＣｙ５及びＣｙ５.５の対）を持つ。これ
らの染料を用い、従来の技術による光子処理能力が低い
システム（ LPTS ）の原理に従って、対応する狭識別励
起及び発光フィルタを用いた。
【図４ａ】本発明を実証するために用いられる発蛍光団
（スペクトラム・グリーン、スペクトラム・オレンジ、
テキサス・レッド、Ｃｙ５及びＣｙ５.５）の励起スペ
クトル、そしてこれらの発蛍光団に対応する励起フィル
タを示す。
（スペクトラム・グリーン、スペクトラム・オレンジ、
テキサス・レッド、Ｃｙ５及びＣｙ５.５）の励起スペ
クトル、そしてこれらの発蛍光団に対応する励起フィル
タを示す。
【図４ｂ】本発明を実証するために用いられる発蛍光団
（スペクトラム・グリーン、スペクトラム・オレンジ、
テキサス・レッド、Ｃｙ５及びＣｙ５.５）の発光スペ
クトル、そしてこれらの発蛍光団に対応する発光フィル
タを示す。
（スペクトラム・グリーン、スペクトラム・オレンジ、
テキサス・レッド、Ｃｙ５及びＣｙ５.５）の発光スペ
クトル、そしてこれらの発蛍光団に対応する発光フィル
タを示す。
【図５ａ】シミュレート測定を行った後に本発明の方法
に従ってピクセルの分類を行った結果を示し、正常な女
性の組合せ彩色染色体を分類するために行った結果であ
る。
に従ってピクセルの分類を行った結果を示し、正常な女
性の組合せ彩色染色体を分類するために行った結果であ
る。
【図５ｂ】シミュレ−ト測定を行った後に本発明の方法
に従ってピクセルの分類を行った結果を示し、染色体１
６及び９に伴う転座を持つ男性の組み合わせ彩色染色体
を分類するために行った結果である。
に従ってピクセルの分類を行った結果を示し、染色体１
６及び９に伴う転座を持つ男性の組み合わせ彩色染色体
を分類するために行った結果である。
【図６】本発明の方法を実行するのに適した従来のフィ
ルタを含む装置の概要図である。
ルタを含む装置の概要図である。
【図７】本発明の方法を実行するのに適したチューナブ
ル・フィルタを含む装置の概要図である。
ル・フィルタを含む装置の概要図である。
フロントページの続き (72)発明者 ユバル ガリニ イスラエル国、ミツペコラニト 20126 (72)発明者 ダリオ カビブ イスラエル国、ティムラト 23840、ハブ ロシュ ７
Claims (49)
- 【請求項１】複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍光
団あるいは発蛍光団の組合せに関連させてピクセルをピ
クセルのグループに分類するための方法であって、各発
蛍光団は特徴的な発光スペクトル及び特定的な発光ピー
クを持ち、（ａ）複数の広帯域発光フィルタを提供する
ステップと、（ｂ）前記ピクセルの各々を、前記複数の
広帯域発光フィルタの数に等しい複数の次元からなるベ
クトルによって表すことができるように、前記ピクセル
の各々について、前記複数の発光フィルタの各々を通過
した後の発光輝度を記録するステップと、（ｃ）各ピク
セルにおける前記複数の発蛍光団の各々の存在を評価す
るためにアルゴリズムを用いることによって、単一の発
蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させて前記ピク
セルの各々をピクセルのグループに分類するステップと
からなる前記方法。 - 【請求項２】前記複数の広帯域発光フィルタの少なくと
も二つが重なり合う帯域を持つ請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】ピクセルの前記グループの各々に属するピ
クセルには、前記グループの各々に属するピクセルが互
いに区別可能なように、独特な人工色が与えられる請求
項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記アルゴリズムが線形分解アルゴリズム
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記発蛍光団が分裂中期の染色体の遺伝物
質に結び付き、前記分裂中期の染色体の各々の遺伝物質
が、異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに結び付
く請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】前記複数の発蛍光団の数が５である請求項
５に記載の方法。 - 【請求項７】前記複数の広帯域発光フィルタの数が５で
ある請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】前記複数の発蛍光団の数が前記複数の広帯
域発光フィルタの数に等しい請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】前記複数の広帯域フィルタの各々を、前記
複数の発蛍光団における一つの発蛍光団の発光スペクト
ルに対応する帯域を持つように選ぶことによって、前記
一つの発蛍光団からの発光のスループットを高く保つ請
求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】前記複数の広帯域フィルタの少なくとも
一つの前記帯域が、その対応する発蛍光団の前記発光ピ
ークに重なり合うように選ばれる請求項９に記載の方
法。 - 【請求項１１】前記複数の広帯域フィルタが単一のチュ
ーナブル・フィルタによって代表される請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１２】前記チューナブル・フィルタが、超音波
光学チューナブル・フィルタ及び液晶チューナブル・フ
ィルタからなるグループから選択される請求項１１に記
載の方法。 - 【請求項１３】複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍
光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させてピクセルを
ピクセルのグループに分類する方法であって、各発蛍光
団は特徴的な励起及び発光スペクトル及び特定的な励起
及び発光ピークを持ち、（ａ）複数の対の広帯域励起フ
ィルタ及び広帯域発光フィルタを提供するステップと、
（ｂ）前記広帯域励起フィルタの一つを介した光で前記
ピクセルの各々の発蛍光団を励起し、その対の発光フィ
ルタを通過させた後の発光輝度を記録するステップと、
（ｃ）前記ピクセルの各々を、前記複数のフィルタの対
の数に等しい複数の次元からなるベクトルによって表す
ことができるように、全ての前記複数対のフィルタに対
してステップ（ｂ）を繰り返すステップと、（ｄ）前記
ピクセルの各々に関わる前記複数の発蛍光団の各々の存
在を評価するためにアルゴリズムを用いることによっ
て、単一の発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに関連さ
せて前記ピクセルの各々をピクセルのグループに分類す
るステップとからなる前記方法。 - 【請求項１４】前記広帯域発光フィルタの少なくとも二
つが、重なり合う帯域を持つ請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】前記広帯域励起フィルタの少なくとも二
つが、重なり合う帯域を持つ請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１６】前記広帯域励起フィルタの少なくとも二
つが、重なり合う帯域を持つ請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１７】前記グループの各々に属するピクセルが
互いに区別可能なように、ピクセルの前記グループの各
々に属するピクセルに、独特な人工色が与えられる請求
項１３に記載の方法。 - 【請求項１８】前記アルゴリズムが線形分解アルゴリズ
ムである請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１９】前記発蛍光団が分裂中期の染色体の遺伝
物質に結び付き、前記分裂中期の染色体の各々の遺伝物
質が、異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せに結び
付く請求項１３に記載の方法。 - 【請求項２０】前記複数の発蛍光団の数が５である請求
項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】前記複数のフィルタの対の数が５である
請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】前記複数の発蛍光団の数が前記複数のフ
ィルタの対の数に等しい請求項１３に記載の方法。 - 【請求項２３】前記広帯域発光フィルタの各々が、前記
複数の発蛍光団の一つの発蛍光団の前記発光スペクトル
に対応する帯域を持つように選ばれるため、前記一つの
発蛍光団からの発光のスループットが高くなる請求項１
３に記載の方法。 - 【請求項２４】前記広帯域励起フィルタの各々が、前記
複数の発蛍光団の一つの発蛍光団の前記励起スペクトル
に対応する帯域を持つよう選ばれるため、励起光のスル
ープットが高くなる請求項１３に記載の方法。 - 【請求項２５】前記広帯域発光フィルタの少なくとも一
つの帯域が、その対応する発蛍光団の前記発光ピークに
重なり合うように選ばれる請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２６】前記広帯域励起フィルタの少なくとも一
つの帯域が、その対応する発蛍光団の前記励起ピークに
重なり合うように選ばれる請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２７】前記広帯域発光フィルタが単一のチュー
ナブル・フィルタによって代表される請求項１３に記載
の方法。 - 【請求項２８】前記チューナブル・フィルタが超音波光
学チューナブル・フィルタ及び液晶チューナブル・フィ
ルタからなるグループから選択される請求項２７に記載
の方法。 - 【請求項２９】前記広帯域励起フィルタが単一のチュー
ナブル・フィルタによって代表される請求項１３に記載
の方法。 - 【請求項３０】前記チューナブル・フィルタが超音波光
学チューナブル・フィルタ及び液晶チューナブル・フィ
ルタからなるグループから選択される請求項２９に記載
の方法。 - 【請求項３１】複数の発蛍光団から選択した単一の発蛍
光団あるいは発蛍光団の組合せに関連させてピクセルを
ピクセルのグループに分類するための装置であって、各
発蛍光団は特徴的な励起及び発光スペクトル及び特定的
な励起及び発光ピークを持ち、（ａ）光源と、（ｂ）複
数の対の広帯域励起フィルタ及び広帯域発光フィルタ
と、（ｃ）制御装置と、なお、この装置は、 （ｉ）前記複数の対の一対を選択し、 （ｉｉ）前記広帯域励起フィルタの一つを介した前記光
源からの光で前記ピクセルの各々の発蛍光団を励起し、 （ｉｉｉ）全ての前記複数対のフィルタに対して（ｉ）
−（ｉｉ）のステップを繰り返すことによって、前記ピ
クセルの各々を、前記複数のフィルタの対の数に等しい
複数の次元からなるベクトルによって表すためのもので
あり、（ｄ）発光フィルタを通した後に回収される発光
の輝度を記録するための光輝度記録装置と、（ｅ）前記
ピクセルの各々に関する前記複数の発蛍光団の各々の存
在を評価するためのアルゴリズムを含み、単一の発蛍光
団あるいは発蛍光団の組合せに関連させて前記ピクセル
の各々をピクセルのグループに分類する演算装置とから
なる前記装置。 - 【請求項３２】前記広帯域発光フィルタの少なくとも二
つが、重なり合う帯域を持つ請求項３１に記載の装置。 - 【請求項３３】前記広帯域励起フィルタの少なくとも二
つが、重なり合う帯域を持つ請求項３１に記載の装置。 - 【請求項３４】前記広帯域励起フィルタの少なくとも二
つが、重なり合う帯域を持つ請求項３２に記載の装置。 - 【請求項３５】前記グループの各々に属するピクセルが
互いに区別可能なように、前記演算装置が、ピクセルの
前記グループの各々に属するピクセルに独特な人工色を
与える請求項３１に記載の装置。 - 【請求項３６】前記アルゴリズムが線形分解アルゴリズ
ムである請求項３１に記載の装置。 - 【請求項３７】前記複数のフィルタの対の数が５である
請求項３１に記載の装置。 - 【請求項３８】前記複数の発蛍光団の数が前記複数のフ
ィルタの対の数に等しい請求項３１に記載の装置。 - 【請求項３９】前記広帯域発光フィルタの各々が、前記
複数の発蛍光団の一つの発蛍光団の前記発光スペクトル
に対応する帯域を持つように選ばれるため、前記一つの
発蛍光団からの発光スループットが高くなる請求項３１
に記載の装置。 - 【請求項４０】前記広帯域励起フィルタの各々が、前記
複数の発蛍光団の一つの発蛍光団の前記励起スペクトル
に対応する帯域を持つように選ばれるため、励起光のス
ループットが高くなる請求項３１に記載の装置。 - 【請求項４１】前記広帯域発光フィルタの少なくとも一
つの帯域が、その対応する発蛍光団の前記発光ピークに
重なり合うように選ばれる請求項３９に記載の装置。 - 【請求項４２】前記広帯域励起フィルタの少なくとも一
つの帯域が、その対応する発蛍光団の前記励起ピークに
重なり合うように選ばれる請求項４０に記載の装置。 - 【請求項４３】前記広帯域発光フィルタが単一のチュー
ナブル・フィルタによって代表される請求項３１に記載
の装置。 - 【請求項４４】前記チューナブル・フィルタが超音波光
学チューナブル・フィルタ及び液晶チューナブル・フィ
ルタからなるグループから選択される請求項４３に記載
の装置。 - 【請求項４５】前記広帯域励起フィルタが単一のチュー
ナブル・フィルタによって代表される請求項３１に記載
の装置。 - 【請求項４６】前記チューナブル・フィルタが超音波光
学チューナブル・フィルタ及び液晶チューナブル・フィ
ルタからなるグループから選択される請求項４５に記載
の装置。 - 【請求項４７】ピクセルに関わる複数の発蛍光団から選
択した単一の発蛍光団の、あるいは組合せの発蛍光団の
量を測定するための方法であって、各発蛍光団は特徴的
な発光スペクトル及び特定的な発光ピークを持ち、
（ａ）複数の広帯域発光フィルタを提供するステップ
と、（ｂ）前記複数の発光フィルタの各々を通過した発
光の輝度を記録し、前記ピクセルを、前記複数の広帯域
発光フィルタの数に等しい複数の次元からなるベクトル
によって表すステップと、（ｃ）前記ピクセルに関わる
前記複数の発蛍光団の各々の量を評価するアルゴリズム
を用いるステップとからなる前記方法。 - 【請求項４８】ピクセルに関わる複数の発蛍光団から選
択した単一の発蛍光団あるいは組合せの発蛍光団の量を
測定するための装置であって、前記発蛍光団の各々は特
徴的な励起及び発光スペクトル、そして特定的な励起及
び発光ピークを持ち、（ａ）光源と、（ｂ）複数対の広
帯域励起フィルタ及び広帯域発光フィルタと、（ｃ）制
御装置と、なお、この制御装置は、 （ｉ）前記複数の対の一対を選択し、 （ｉｉ）前記広帯域励起フィルタの一つを介した前記光
源からの光で前記ピクセルの発蛍光団を励起し、そし
て、 （ｉｉｉ）前記複数対のフィルタの全てに対して、ステ
ップ（ｉ）−（ｉｉ）を繰り返すことによって、前記ピ
クセルを、前記複数のフィルタの対の数に等しい複数の
次元からなるベクトルによって表すためのものであり、
（ｄ）前記発光フィルタを通過した後の発光の輝度を記
録するための光輝度記録装置と、（ｅ）前記ピクセルに
関わる前記複数の発蛍光団の各々の量を評価するための
アルゴリズムを含む演算装置とからなる前記装置。 - 【請求項４９】ピクセルに関わる複数の発蛍光団から選
択した単一の発蛍光団あるいは組合せの発蛍光団の量を
測定するための装置であって、前記発蛍光団の各々は特
徴的な励起及び発光スペクトルと特定的な励起及び発光
ピークを持ち、（ａ）光源と、（ｂ）複数対の広帯域励
起フィルタ及び広帯域発光フィルタと、（ｃ）制御装置
と、なお、この制御装置は、 （ｉ）前記複数の対の一対を選択し、 （ｉｉ）前記広帯域励起フィルタの一つを介した前記光
源からの光で前記ピクセルの発蛍光団を励起し、 （ｉｉｉ）前記複数対のフィルタ全てに対してステップ
（ｉ）−（ｉｉ）を繰り返すことによって、ピクセル
を、前記複数のフィルタの対の数に等しい複数の次元か
らなるベクトルによって表すためのものであり、（ｄ）
前記発光フィルタを通過させた発光輝度を記録するため
の光輝度記録装置と、（ｅ）前記ピクセルにおける前記
複数の発蛍光団の各々の量を評価するためのアルゴリズ
ムを含む演算装置とからなる前記装置。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/917213 | 1997-08-25 | ||
| US08/917,213 US5834203A (en) | 1997-08-25 | 1997-08-25 | Method for classification of pixels into groups according to their spectra using a plurality of wide band filters and hardwire therefore |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11166893A true JPH11166893A (ja) | 1999-06-22 |
| JP3130508B2 JP3130508B2 (ja) | 2001-01-31 |
Family
ID=25438492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10279276A Expired - Fee Related JP3130508B2 (ja) | 1997-08-25 | 1998-08-25 | 複数の広帯域フィルタと、そのためのハードウェアとを用いて、ピクセルのスペクトルに応じてピクセルをグループに分類するための方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5834203A (ja) |
| EP (2) | EP0899558B1 (ja) |
| JP (1) | JP3130508B2 (ja) |
| DE (2) | DE29824467U1 (ja) |
| ES (1) | ES2186097T3 (ja) |
| IL (1) | IL125915A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012047462A (ja) * | 2010-08-24 | 2012-03-08 | Sony Corp | 蛍光強度補正方法、蛍光強度算出方法及び蛍光強度算出装置並びに蛍光強度補正プログラム |
| WO2020009197A1 (ja) * | 2018-07-05 | 2020-01-09 | 株式会社Ｉｄｄｋ | 顕微観察装置、蛍光検出器及び顕微観察方法 |
| EP4078151A4 (en) * | 2019-12-17 | 2024-01-03 | Applied Materials Inc | SYSTEM AND METHOD FOR CAPTURE AND PROCESSING MULTIPLEXED FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION IMAGES |
Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6018587A (en) * | 1991-02-21 | 2000-01-25 | Applied Spectral Imaging Ltd. | Method for remote sensing analysis be decorrelation statistical analysis and hardware therefor |
| US5936731A (en) * | 1991-02-22 | 1999-08-10 | Applied Spectral Imaging Ltd. | Method for simultaneous detection of multiple fluorophores for in situ hybridization and chromosome painting |
| US6690817B1 (en) * | 1993-08-18 | 2004-02-10 | Applied Spectral Imaging Ltd. | Spectral bio-imaging data for cell classification using internal reference |
| US6165734A (en) * | 1995-12-12 | 2000-12-26 | Applied Spectral Imaging Ltd. | In-situ method of analyzing cells |
| US6818437B1 (en) * | 1998-05-16 | 2004-11-16 | Applera Corporation | Instrument for monitoring polymerase chain reaction of DNA |
| EP3093649B1 (en) | 1998-05-16 | 2019-05-08 | Life Technologies Corporation | A combination of a reaction apparatus and an optical instrument monitoring dna polymerase chain reactions |
| US7498164B2 (en) | 1998-05-16 | 2009-03-03 | Applied Biosystems, Llc | Instrument for monitoring nucleic acid sequence amplification reaction |
| US6642062B2 (en) | 1998-09-03 | 2003-11-04 | Trellis Bioinformatics, Inc. | Multihued labels |
| US6453060B1 (en) * | 1999-06-29 | 2002-09-17 | Tri Path Imaging, Inc. | Method and apparatus for deriving separate images from multiple chromogens in a branched image analysis system |
| US6566143B2 (en) * | 2000-02-25 | 2003-05-20 | Cambridge Research & Instrumentation, Inc. | Multiple label fluorescence polarization assay system and method |
| CA2421582A1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof |
| US6627748B1 (en) | 2000-09-11 | 2003-09-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Combinatorial fluorescence energy transfer tags and their applications for multiplex genetic analyses |
| US20060057565A1 (en) * | 2000-09-11 | 2006-03-16 | Jingyue Ju | Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof |
| US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
| WO2002029003A2 (en) | 2000-10-06 | 2002-04-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding dna and rna |
| US20100279341A1 (en) * | 2000-10-24 | 2010-11-04 | Tissuegnostics Gmbh | Methods and system for analyzing cells |
| AT411066B (de) * | 2000-10-24 | 2003-09-25 | Steiner Georg E | Verfahren und anordnung zur untersuchung von zellen |
| DE10151217B4 (de) * | 2001-10-16 | 2012-05-16 | Carl Zeiss Microlmaging Gmbh | Verfahren zum Betrieb eines Laser-Scanning-Mikroskops |
| DE10206979A1 (de) * | 2002-02-20 | 2003-08-21 | Leica Microsystems | Verfahren zum Benutzertraining für ein Scanmikroskop, Scanmikroskop und Software zum Benutzertraining für ein Scanmikroskop |
| US7074597B2 (en) * | 2002-07-12 | 2006-07-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Multiplex genotyping using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry |
| WO2004031746A1 (en) * | 2002-10-02 | 2004-04-15 | Lumen Health Innovations, Inc. | Apparatus and methods relating to high speed spectroscopy and excitation-emission matrices |
| WO2004055160A2 (en) * | 2002-12-13 | 2004-07-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry |
| US7321791B2 (en) * | 2003-09-23 | 2008-01-22 | Cambridge Research And Instrumentation, Inc. | Spectral imaging of deep tissue |
| US8634607B2 (en) | 2003-09-23 | 2014-01-21 | Cambridge Research & Instrumentation, Inc. | Spectral imaging of biological samples |
| US7315371B2 (en) * | 2004-01-23 | 2008-01-01 | P&P Optica Inc. | Multi-channel spectrum analyzer |
| WO2005084367A2 (en) | 2004-03-03 | 2005-09-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry |
| CN101916359B (zh) | 2005-01-27 | 2012-06-20 | 剑桥研究和仪器设备股份有限公司 | 把样本的不同区域分类到相应类别的方法和设备 |
| DE102005022880B4 (de) * | 2005-05-18 | 2010-12-30 | Olympus Soft Imaging Solutions Gmbh | Trennung spektral oder farblich überlagerter Bildbeiträge in einem Mehrfarbbild, insbesondere in transmissionsmikroskopischen Mehrfarbbildern |
| WO2007002204A2 (en) | 2005-06-21 | 2007-01-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Pyrosequencing methods and related compostions |
| JP2007010340A (ja) | 2005-06-28 | 2007-01-18 | Olympus Corp | カメラ装置 |
| DE102006052542B4 (de) * | 2006-11-06 | 2008-08-14 | Hochschule für angewandte Wissenschaft und Kunst (HAWK) Hildesheim | Bilderfassungseinrichtung |
| US7883869B2 (en) | 2006-12-01 | 2011-02-08 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
| DE102007014413B4 (de) * | 2007-03-17 | 2016-02-04 | DüRR DENTAL AG | Verfahren zum Auswerten von Fluoreszenzbildsätzen und Vorrichtung zu seiner Durchführung |
| US8330087B2 (en) * | 2007-10-16 | 2012-12-11 | Cambridge Research & Instrumentation, Inc. | Spectral imaging system with dynamic optical correction |
| EP2207900B1 (en) | 2007-10-19 | 2015-04-29 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis |
| EP3431615A3 (en) | 2007-10-19 | 2019-02-20 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators cleavable label modified nucleotide terminators |
| DE102008034008B4 (de) | 2008-07-21 | 2010-07-01 | Carl Zeiss Surgical Gmbh | Filtersatz zur Beobachtung von Fluoreszenzstrahlung in biologischem Gewebe |
| US7969568B2 (en) * | 2008-10-24 | 2011-06-28 | Applied Materials, Inc. | Spectrographic metrology of patterned wafers |
| US8774488B2 (en) | 2010-03-11 | 2014-07-08 | Cellscape Corporation | Method and device for identification of nucleated red blood cells from a maternal blood sample |
| WO2012162429A2 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection |
| US8682047B2 (en) * | 2011-12-05 | 2014-03-25 | Illinois Tool Works Inc. | Method and apparatus for machine vision counting and annotation |
| KR102145677B1 (ko) | 2012-02-03 | 2020-08-18 | 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 다중화된 생화학적 분석에서의 시그널 인코딩 및 디코딩 |
| US9791372B2 (en) * | 2012-08-03 | 2017-10-17 | California Institute Of Technology | Multiplexing and quantification in PCR with reduced hardware and requirements |
| US10648026B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Raman cluster tagged molecules for biological imaging |
| KR102049373B1 (ko) | 2015-07-30 | 2019-11-27 | 테크놀로지 이노베이션 모멘텀 펀드 (이스라엘) 리미티드 파트너쉽 | 스펙트럼 영상처리 방법, 스펙트럼 영상처리 시스템 및 제어 유닛 |
| EP3251578A1 (en) * | 2016-05-30 | 2017-12-06 | Leica Instruments (Singapore) Pte. Ltd. | Medical device for the observation of a partly fluorescent object, using a filter system with a transmission window |
| US10724958B2 (en) | 2017-11-06 | 2020-07-28 | Senors Unlimited, Inc. | Imaging devices, imaging arrangements, and imaging methods |
| DE102019101773B9 (de) * | 2019-01-24 | 2021-11-25 | Carl Zeiss Meditec Ag | Mikroskopiesystem und Verfahren zum Betreiben eines Mikroskopiesystems |
| CN113039428A (zh) * | 2019-04-02 | 2021-06-25 | 贝克顿·迪金森公司 | 补偿编辑器 |
| JP2022062821A (ja) * | 2020-10-09 | 2022-04-21 | セイコーエプソン株式会社 | 画像解析装置、画像解析方法、及び画像解析プログラム |
| JP2024519860A (ja) * | 2021-05-19 | 2024-05-21 | ライカ マイクロシステムズ シーエムエス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 生体試料を分析する方法およびデバイス |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0691064A1 (en) * | 1992-07-08 | 1996-01-10 | Oncor, Inc. | Low light color imaging system with cooled integrating camera |
| US5556764A (en) * | 1993-02-17 | 1996-09-17 | Biometric Imaging, Inc. | Method and apparatus for cell counting and cell classification |
| US5863504A (en) * | 1995-03-16 | 1999-01-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Fluorescence imaging instrument utilizing fish |
| EP0879297A4 (en) * | 1995-12-22 | 2003-04-16 | Biorad Lab Inc | METHOD AND DEVICE FOR CARRYING OUT FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION MEASURING A VARIETY OF PARAMETERS |
-
1997
- 1997-08-25 US US08/917,213 patent/US5834203A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-08-24 EP EP98306743A patent/EP0899558B1/en not_active Revoked
- 1998-08-24 DE DE29824467U patent/DE29824467U1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-24 DE DE69809161T patent/DE69809161T2/de not_active Revoked
- 1998-08-24 EP EP02001413A patent/EP1207376A1/en not_active Withdrawn
- 1998-08-24 ES ES98306743T patent/ES2186097T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 JP JP10279276A patent/JP3130508B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-25 IL IL12591598A patent/IL125915A/en not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012047462A (ja) * | 2010-08-24 | 2012-03-08 | Sony Corp | 蛍光強度補正方法、蛍光強度算出方法及び蛍光強度算出装置並びに蛍光強度補正プログラム |
| WO2020009197A1 (ja) * | 2018-07-05 | 2020-01-09 | 株式会社Ｉｄｄｋ | 顕微観察装置、蛍光検出器及び顕微観察方法 |
| JP2020008667A (ja) * | 2018-07-05 | 2020-01-16 | 株式会社Ｉｄｄｋ | 顕微観察装置、蛍光検出器及び顕微観察方法 |
| EP4078151A4 (en) * | 2019-12-17 | 2024-01-03 | Applied Materials Inc | SYSTEM AND METHOD FOR CAPTURE AND PROCESSING MULTIPLEXED FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION IMAGES |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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