DE69809161T2

DE69809161T2 - Verfahren und Vorrichtung zum Klassifizieren von Bildpunkten in Gruppen nach deren Spektren mittels einer Mehrzahl von Breitband-Filtern

Info

Publication number: DE69809161T2
Application number: DE69809161T
Authority: DE
Inventors: Dario Cabib; Yuval Garini; Nir Katzir; David Wine
Original assignee: Applied Spectral Imaging Ltd
Current assignee: Applied Spectral Imaging Ltd
Priority date: 1997-08-25
Filing date: 1998-08-24
Publication date: 2003-03-20
Anticipated expiration: 2018-08-25
Also published as: ES2186097T3; EP1207376A1; DE29824467U1; EP0899558A3; IL125915A; IL125915A0; DE69809161D1; EP0899558B1; US5834203A; EP0899558A2; JP3130508B2; JPH11166893A

Description

Die Erfindung betrifft die Einordnung von Pixeln in Pixelgruppen gemäß ihrer Spektren, wenn sie durch eine Anzahl Breitbandfilter gefiltert werden. Sie betrifft insbesondere die Bestimmung der Menge an in einem Pixel vorhandenen Fluorophoren, und ganz besonders ein Verfahren und eine Vorrichtung (i) zum Einordnen von Pixeln, die in situ fluoreszenzgefärbte Chromosomen darstellen, in Pixelgruppen, wobei jede Gruppe mit genetischem Material von einem anderen Chromosom zusammenhängt, und (ii) zum Bestimmen der Menge Fluorophore, die in einem Pixel jeweils zugegen ist.
Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen (bspw. fluoreszierende Sonden, Fluorophore, Fluorochrome, werden alle austauschbar in diesem Dokument verwendet) ist eines der leistungsfähigsten und allgemeinen Hilfsmittel zur Analyse von Geweben und Zellen. Die Fluoreszenzmikroskopie ist daher eines der wichtigsten in der Lichtmikroskopie verwendeten experimentellen Verfahren [Lakowicz (1983) Principles of fluorescence spectroscopy, Plenum Press, New York, London].
Die Leistung fluoreszierender Sonden beruht hauptsächlich auf der großen Vielfalt biologischer Strukturen, an die sich spezifische Farbstoffe binden lassen [Waggoner (1986) Application of fluorescence in the biomedical sciences Hrsg. Taylor et al., New York: Alan R. Liss, Inc. S. 3-28]. Für eine eingehende Übersicht über fluoreszierende Sonden siehe Mason, Hrsg. (1993) Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, Biotechnical Techniques Series, hrsg. von Sattelle, Academic Press Limited, London; und Ploem und Tanke (1987) Introduction to Fluorescence Microscopy, Oxford University Press, Royal Microscopical Society.
Die rasche Entwicklung neuer und verfeinerter mehrfarbiger Fluoreszenzfarbstoffmoleküle erzeugt weiterhin einen Bedarf an fortschrittlicheren Bilderzeugungstechniken, die das ganze Potential dieser Farbstoffe ausnutzen können. Für eine Diskussion der revolutionären Auswirkun gen der Fluoreszenzfarbstoffe in der Vergangenheit und in der Zukunft auf den Verlauf der heutigen Forschung siehe Taylor et al., (1992) The New Vision of Light Microscopy, American Scientist, Bd. 80, S. 322-335.
Ein wichtiges Beispiel für den signifikanten Vorteil der Erfassung multipler Fluoreszenzsonden ist FISH (Fluoreszenz- in-situ-Hybridisierung) [Emanuel (1993) Growth Genetics and Hormones 9, S. 6-12], welche zur Analyse von Genen auf Chromosomen-Ebene verwendet wird und mit der man mögliche Gendefekte aufspüren kann, bspw. eine Gen-/Chromosomen- Amplifikation, Deletion, Translokation, Umlagerung und andere Anomalien.
Bestimmte Erkrankungen und Störungen, einschließlich vieler Krebserkrankungen und Geburtsdefekte sind genetische Störungen, die durch Defekte (d. h. Mutationen) in einem oder mehreren Genen verursacht werden. Viele andere Erkrankungen haben bekanntlich oder vermutlich eine oder mehrere Komponenten, d. h. es gibt einen oder mehrere Gendefekte, die nicht allein die Erkrankung verursachen, jedoch zu ihrer Entwicklung beitragen oder die Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung der Erkrankung in einem späteren Lebensabschnitt steigern. Diese Phänomene sind im Fachgebiet als multifaktorielle Erkrankungen und genetische Prädispositionen bekannt.
Die Korrelation sichtbarer Gendefekte mit bekannten Erkrankungen ermöglicht den Ärzten, definitive Diagnosen zu stellen. Sie ermöglicht die frühe Erfassung und Behandlung vieler Erkrankungen. Eine genetische Beratung könnte zukünftige Eltern und gefährdete Personen über die Möglichkeit in Kenntnis setzen, dass sie in Zukunft mit schwerwiegenden medizinischen Problemen zu kämpfen haben, die ein geeignetes Eingreifen erfordern.
Es wurden mehr als 8000 genetische Störungen identifiziert, von denen viele mit Multi-Gendefekten zusammenhängen. Nach der Entdeckung, dass die Chromosomen die Träger der Erbinformationen sind, schlössen Wissenschaftler, dass man sichtbare Chromosomendefekte dokumentieren könnte, welche für spezifische. Störungen verantwortlich sind.
In den 60er-Jahren wurden Färbetechniken für eine Klassifizierung von auf. Objektträgern ausgebreiteten Metaphase-Chromosomen auf Mikroskopie-Basis entwickelt. Für einige Jahrzehnte wurde die optische Analyse von Chromosomen-Bandenmustern zur Korrelation menschlicher Genstörungen mit den beobachteten Strukturanomalien bei Metaphase-Chromosomen verwendet. Chromosomen werden gewöhnlich durch Hellfeld-Mikroskopie nach Giemsa-Färbung (G-Bandenfärbung) untersucht oder durch Fluoreszenzmikroskopie nach Fluoreszenz-Färbung (R-Bandenfärbung), so dass man charakteristische helle und dunkle Banden über ihre Länge sichtbar macht. Ein sorgfältiger Vergleich des Bandenmusters eines Patienten mit denen normaler Chromosomen kann Anomalien, wie Translokationen (Austausch genetischen Materials zwischen oder innerhalb von Chromosomen), Deletionen (ein oder mehrere fehlende Chromosomen oder ein oder mehrere Fragmente davon), Additionen, Inversionen und andere Defekte offen legen, die Verformungen und genetische Erkrankungen verursachen. Jedoch haben die herkömmlichen Chromosomenbandenfärbungstechniken eine eingeschränkte Auflösung.
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist über die letzten 25 Jahre durch Verbesserung einer Anzahl komplementärer Verfahren entstanden. Ihre Entstehung wurde vom Bestreben der Cytogenetiker angetrieben, bessere Werkzeuge zur Kartierung der genauen Position der Gene auf den Chromosomen zu entwickeln, und zur Erfassung sehr kleiner Gendefekte, welche beim allgemeinen Färben der Chromosomen nicht sichtbar sind.
Das Human-Genomprojekt (HGP), eine große Initiative zur Identifizierung und Kartierung sämtlicher menschlicher Gene, bekundete Interesse an FISH und hat die Entwicklung häufig benötigter DNA-Sonden beschleunigt. Die gängigen FISH-Techniken ermöglichten ebenfalls durch gleichzeitige Entwicklung leistungsfähiger immunologischer Sonden eine wachsende Vielzahl hervorragender Fluoreszenzfarbstoffe für Mikroskopie und Spektroskopie und enorme Verbesserungen bei den Objektiven, Lichtquellen und Filtern, die für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden.
Die Leistung und der Nutzen von FISH beruht auf vielen Faktoren: (i) FISH lässt sich nicht nur auf isolierte Chromosomen und Kerne anwenden, sondern auch auf vollständige Zellen in fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten; (ii) sie kann relativ kleine Defekte erfassen (die Fähigkeit zur Erfassung kleinerer Defekte steigt stetig); (iii) sie kann relativ schnell Ergebnisse bereitstellen; (iv) aufgrund ihrer mäßigen Kosten kann sie in den meisten Diagnose- und Forschungslabors verwendet werden; (v) es kann eine Anpassung an verschiedene Sonden- und Probentypen entwickelt werden; und (vi) lässt sich innerhalb einer kurzen Zeit, gewöhnlich im Bereich von 2 Std., eine hohe Spezifität und Sensitivität erzielen.
Bei vielen FISH-Anwendungen braucht der Cytogenetiker nur durch die Okulare eines Mikroskops oder auf das Bild auf dem Monitor zu schauen und bestimmen, ob eine Fluoreszenzmarkierung vorhanden ist oder fehlt. Bei etwas komplexeren Proben kann ein einfaches Auszählen von einem oder zwei Farbmarkierungen erfolgen. Die Möglichkeit zur Verarbeitung von Digitalbildern und der Auszug numerischer Daten daraus bietet den FISH-Techniken einen umfangreichen neuen Satz an Möglichkeiten.
Ein geeignetes Bilderzeugungsverfahren kann sehr schwache FISH-Bilder so verstärken, dass sich die markierten Chromosomen und Loci eindeutig identifizieren lassen. Unter leicht erzielbaren Experimentalbedingungen kann die Anzahl markierter Stellen automatisch gezählt werden. Die Intensität an jeder markierten Stelle lässt sich ausmessen und die Menge DNA berechnen, so dass man bspw. die Anzahl der von einem bestimmten Gen vorhandenen Kopien erhält.
FISH kann wie vorstehend beschrieben Informationen über die Stelle der markierten Sonde, die Anzahl der markierten Stellen auf jedem Chromosom und die Stärke der Markierung (die Menge an genetischem Material) an jeder Stelle bereitstellen. Centromer-(repetitive DNA)-Sonden und Chromosomenfarbstoffe werden zum Markieren und Zählen der Anzahl Kopien, die auf jedem angezielten Chromosom zugegen sind, verwendet. Locus-spezifische Sonden werden zur Markierung der Stellung kleiner Bereiche genetischen Materials verwendet. Diese Sondentypen lassen sich auf intakten Interphase-Kernen sowie mit gespreiteten Metaphase-Chromosomen verwenden, und sie können optisch oder automatisch mit einem geeigneten Algorithmus gezählt werden. Sie werden routinemäßig zur Identifizierung genetischer Erkrankungen verwendet, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie zu viele oder zu wenige Kopien eines bestimmten Chromosoms, Chromosomenfragmentes oder Gens aufweisen.
In sehr frühen Stadien einiger Krebserkrankungen, und zwar lange bevor die Zellen als anomal erkannt werden, steigt die Anzahl spezifischer Gene. Dieses Phänomen ist im Stand der Technik als Genamplifikation bekannt. Sie lassen sich mit locusspezifischen Sonden als homogen gefärbte Bereiche (HSR) und/oder Minimalchromosomen nachweisen. Die Verwendung von FISH zur Erfassung von Chromosomenanomalien in krebsbefallenen Zellen kann das Entwicklungsstadium aufzeigen, welche die Erkrankung erreicht hat. Damit lassen sich die geeignetsten Behandlungen, von denen viele bezüglich ihrer Effektivität stadienspezifisch sind, auswählen. Dadurch wird kostbare Zeit gespart und das Leiden des Patienten minimiert, indem die wirksamste stadienspezifische Behandlung ausgewählt wird.
Man kann die gesamte Oberfläche eines spezifischen Chromosoms durch Isolation des Chromosoms (bspw. mittels Durchflusscytometrie) physikalisch (durch Ultraschallbehandlung) oder enzymatische Aufspaltung (bspw. durch zufällig spaltende oder sequenzspezifisch spaltende Endonukleasen) gleichmäßig markieren und einen Satz Sonden gegen sämtliche Fragmente erzeugen. Ganze Chromosomensonden, nämlich Chromosomenfarben, fluoreszenzmarkieren sämtliche Kopien auf ihrem Zielchromosom. Eine wichtige Anwendung der Chromosomenfärbung ist die Erfassung von Translokationen und Insertionen von genetischem Material zwischen zwei Chromosomen, wie sie charakteristischerweise in frühen Stadien bestimmter Krebserkrankungen auftreten, aber es sind auch andere Chromosomenaberrationen nachweisbar.
Wird bspw. Chromosom A mit einer grünen Farbe spezifisch markiert und Chromosom B mit einer roten Farbe, erscheint jede Translokation genetischen Materials von A nach B als grüner Bereich auf einem roten Chromosom (und umgekehrt). Chromosomenfarben, die von normalen Chromosomen hervorgerufen werden, werden gewöhnlich zur Erfassung von Deletionen oder Translokationen anomaler Chromosomen (d. h. von Patienten) verwendet, umgekehrtes Chromosomenfärben nutzt Sonden, die von einem anomalen Chromosom hervorgerufen werden, zur Identifizierung von DNA aus verschiedenen normalen Chromosomen, welche Material zu einem anomalen Chromosomen beitragen.
Das erfindungsgemäße Verfahren, wie es nachstehend durch den Beispiel-Abschnitt veranschaulicht wird, ermöglicht das Anfärben von 24 verschiedenen Chromosomen, die den menschlichen Karyotyp (d. h. das Genom) umfassen, und zwar jeweils in einer anderen Farbe. Es identifiziert und zeigt bedeutungsvoll einen farbigen menschlichen Karyotyp mit einer einzigen Hybridisierung und einer danach erfolgenden einzigen kurzen Messung.
Es ist leicht ersichtlich, dass diese Erfindung in vielen anderen Situationen und Anwendungen verwendet werden kann, die nicht mit der Chromosomenanalyse zusammenhängen. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich bei einer Multisonden-Immunhistochemie verwenden, wo viele fluoreszenzmarkierte DNA- und/oder Protein- (Antikörper) Sonden in Zellen eingebracht werden, damit man Gene und Proteine erfasst und kartiert, die mit dem Beginn und dem Verlauf von Krebs und anderen Erkrankungen zusammenhängen.
Eine bemerkenswerte Verbesserung der Mehrfarb- Fluoreszenzfarbstoffe, die zur Markierung von Chromosomenfarbstoffen verwendet werden, ist die Einführung kombinatorischer Fluorezenzstrategien (bspw. kombinatorisches Markieren und kombinatorische Hybridisierung), die ver schiedene Kombinationen einiger fluoreszierender Basisfarbstoffe einsetzen. Weitere Einzelheiten über kombinatorisches Markieren finden sich in Ried et al. (1992) Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy. Proc. Natl. Acad. Bei. USA 89 1388-1392; und Ried (Jan. 1994) Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung in der genetischen Diagnostik, Fakultät der theoretischen Medizin, Ruprecht-Karls Universität Heidelberg, die jeweils als vollständig offenbart durch Bezugnahme hier aufgenommen sind. Weitere Einzelheiten über kombinatorische Hybridisierung sind ersichtlich aus du- Manoir et al. (1993) Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization. Hum. Genet. 90, 590-610, das als vollständig offenbart durch Bezugnahme hier aufgenommen ist.
Da das Spektrum der Mischung aus zwei verschiedenen Farbstoffen anders ist als das Spektrum beider Einzelfarbstoffe, ermöglichen kombinatorische Fluoreszenzstrategien die Erzielung einer hohen Spektralvielfalt in einer Probe durch Verwendung von nur einer sehr kleinen Anzahl Farbstoffe. Bei einer normalen Metaphase beim Mann, lassen sich 24 verschiedene Chromosomen mit 24 unterschiedlichen Spektren fluoreszenzmarkieren, indem Kombinationen von nur 5 verschiedenen Farbstoffen verwendet werden.
Es gibt zahlreiche Verfahren zur Markierung von DNA- Sonden zur Verwendung in FISH-Assays, einschließlich indirekter Verfahren, wodurch ein Hapten, wie Biotin oder Digoxigenin, mit Enzymreaktionen in DNA eingebaut wird. Nach der Hybridisierung an ein gespreitetes Metaphase- Chromosom oder einen Interphase-Kern, wird das Hybrid durch Einsatz immunologischer Verfahren fluoreszenzmarkiert. Vor kurzem wurden Fluoreszenzfarbstoffe direkt in Sonden eingebracht und ohne Zwischenschritt erfasst. Standard-FISH-Farbstoffe umfassen Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot, und Cascade-Blau. Multisonden-FISH-Analyse erfolgt durch Markierung unterschiedlicher Sonden mit verschiedenen Haptenen oder fluoreszierenden Farbstoffen und Kombinationen davon, das man im Stand der Technik als kombinatorisches Markieren kennt [siehe Ried et al. (1992) Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy. Proc. Natl. Acad. Bei. USA 89, 1388-1392 und Ried (Jan. 1994) Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung in der genetischen Diagnostik, Fakultät der theoretischen Medizin, Ruprecht-Karls Universität Heidelberg, die als vollständig offenbart durch Bezugnahme hier aufgenommen sind]. Alternativ kann ein Pool einer gegebenen Sonde in Unter-Pools unterteilt werden, die jeweils mit verschiedenen Fluorophoren markiert werden, wonach die Unter-Pools erneut gruppiert werden, so dass man ansonsten ähnliche Hybridisierungsergebnisse erhält. Dieses Verfahren ist im Fachgebiet als kombinatorische Hybridisierung bekannt [du-Manoir et al. (1993) Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization. Hum. Genet. 90, 590-610, das als vollständig offenbart durch Bezugnahme hier aufgenommen ist]. Gemäß beiden Markierungsstrategien werden kombinatorische Sonden erhalten. Wird in diesem Dokument einer der Begriffe "Kombination der Fluorophore" oder "kombinatorische Fluoreszenzstrategie" und insbesondere in den nachfolgenden Patentansprüchen verwendet, betrifft dieser sowohl kombinatorisches Markieren als auch kombinatorische Hybridisierung, wie vorstehend genannt.
Die Verwendung kombinatorischer Fluorophore zur Chromosomenfärbung und Karyotyp-Bestimmung, Mehrfarbenchromosomen-Bandenfärbung und vergleichende Genomhybridisierung ist eingehend in US-Patentanmeldung 08/635 820, eingereicht am 22. April 1996, und im Science-Magazin [E. Schroeck et al., (1996) Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science 273, 494-497] beschrieben, die jeweils als vollständig offenbart durch Bezugnahme hier aufgenommen sind.
Der in Science beschriebene Hauptfortschritt ist, dass ein Vollgenom-Scanning durch Spektralbilderzeugung definierte Emissionsspektren für jedes menschliche Chromo som nach der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) sofort sichtbar macht. Mittels Computertrennung (Klassifizierung) der Spektren werden chromosomenspezifische DNA- Sonden, deren Spektren überlappen, aufgelöst und sämtliche Chromosomen werden zeitgleich identifiziert.
Dieser Ansatz der spektralen Bilderzeugung kombiniert eine Fourier-Spektroskopie, Bilderzeugung mittels ladungsgekoppelter Vorrichtung (CCD) und Lichtmikroskopie zur gleichzeitigen Messung von Emissionsspektren im sichtbaren und nahen Infrarot-Spektralbereich an sämtlichen Punkten der Probe. Dies ermöglicht die Verwendung mehrfacher Sonden mit überlappenden Spektren. Der Ansatz beruht auf der Messung eines einzelnen Spektrums (das aus einer Sequenz von Intensitäten in jedem Pixel, gemessen bei vielen verschiedenen. Wellenlängen, identifiziert wurde), welches die Unterscheidung mehrerer Fluorophore erleichtert. Im Gegensatz zur herkömmlichen Epifluoreszenz-Mikroskopie, bei der eine Fluorochrom- Unterscheidung auf der Messung einer einzelnen Intensität beruht, durch einen fluorochromspezifischen optischen Filter (Schmalbandfilter), [siehe Speicher et al. (1996) Nature Genetics. 12: 368-375; und Speicher et al. (1996) Bioimaging 4: 52-64] ermöglicht der Einsatz der spektralen Karyotyp-Bestimmung, dass sämtliche Information innerhalb des Spektrums emittierten Lichts zur Analyse verwendet -Verfahren zur Unterscheidung von Fluorophoren, deren Spektren überlappen, (Klassifizierung) lässt sich leicht auf eine große Zahl Fluorophore ausdehnen, vorausgesetzt, es gibt messbare und übereinstimmende Unterschiede bei den Emissionsspektren der jeweiligen Fluorochrome.
Es wird eine gleichzeitige Identifizierung jedes menschlichen Chromosoms bei Metaphase-Präparaten beschrieben. Dieser Ansatz wird als spektrale Karyotyp-Bestimmung bezeichnet. Zu diesem Zweck werden durch Polymerasekettenreaktion (PCR) aus durchflusssortierten menschlichen Chromosomen erzeugte chromosomenspezifische Verbundbanken direkt mit Nukleotiden markiert, die mit 5 verschiedenen Fluorophoren oder Kombinationen davon konjugiert sind. Ein Verbundsondensatz mit sämtlichen 24 Chromosomen wird dann an Metaphase-Chromosomen hybridisiert. Chromosomenspezifische Markierung wird durch Suppressions-Hybridisierung erzielt. Speziell werden repetitive Sequenzen in den Verbundbanken durch Zugabe eines Überschusses unmarkierter menschlicher Cot-1-DNA blockiert.
Die Hybridisierung wird sowohl in RGB-Display- und Klassifizierungsfarben gezeigt. Display-Farben ermöglichen, dass sämtliche menschliche Chromosomen leicht nach der spektralen Bilderzeugung sichtbar werden, und auf der Basis von Spektralmessungen in jedem Pixel wird ein Chromosmen-Klassifizierungs-Algorithmus zur spektralen. Karyotyp-Bestimmung sämtlicher menschlicher Chromosomen eingesetzt. Einer der wichtigsten Analyse-Algorithmen ist der Klassifizierungs-Algorithmus auf Spektralbasis, der ermöglicht, dass viele verschiedene Spektren im Bild identifiziert und in Klassifizierungsfarben hervorgehoben werden können. Dadurch lassen sich alle menschlichen Chromosomen auf der Grundlage ihrer Spektren einer spezifischen Klassifizierungsfarbe zuordnen. Dieser Algorithmus setzt voraus, dass das (Bezugs-)Spektrum jedes Chromosoms gemessen wurde und in einer Bezugsbank im Computer gespeichert ist. Jedem Pixel in dem Bild wird eine Klassifizierungsfarbe zugeordnet, und zwar gemäß der Klassifizierungsfarbe, die dem Bezugsspektrum zugeordnet wurde, das dem Spektrum eines gegebenen Pixels am stärksten ähnelt. Ein Algorithmus des kleinsten Fehlerquadrates ist in Gleichung 1 angegeben:
wird für jeden Pixel errechnet, wobei Ix,y(λ) das normalisierte Spektrum an den Pixelkoordinaten x, y und In(λ) das normalisierte Bezugsspektrum für jedes der Chromosomen n = 1, 2, . . ., 23, 24 ist. Nach dem Berechnen des Wertes von Sx,y,n für alle Bezugsspektren wird der kleinste Wert gewählt, und eine künstliche Klassifizierungsfarbe wird diesem Pixel gemäß der Bezugsfarbe zugeordnet, die dem ähnlichsten Bezugsspektrum zugeordnet wurde.
Das Potential der spektralen Karyotypbestimmung als Screening-Verfahren für Chromosomenaberrationen wurde weiter untersucht durch Analyse klinischer Proben mehrerer Labors, wo vorher herkömmliche Bandenfärbungsverfahren oder FISH mit Chromosomen-Färbesonden durchgeführt wurden. In allen Fällen ergaben G-Bandenfärbung und spektrale Karyotypbestimmung übereinstimmende Ergebnisse. In einigen Fällen reichte eine Giemsa-Färbung für eine vollständige Interpretation chromosomaler Aberrationen nicht aus. In diesen Fällen wurde die Diagnose der Chromosomenaberrationen durch spektrale Karyotypbestimmung durch herkömmliche Doppelfarben-FISH-Analyse bestätigt. Die kleinste erkennbare Aberration, die für diesen Bericht analysiert wurde, war eine Translokation t(1; 11)(q44; p15,3), in der sich eine reziproke Translokation durch herkömmliche Bandenfärbungsanalyse nicht erkennen ließ. Der Ursprung des Chromosomenmaterials, der zu der reziproken Translokation beitrug, wurde korrekt klassifiziert. Die translozierten Segmente auf den Chromosomen 1 und 11 wurden durch subtelomerspezifische Cosmidsonden für die Chromosomen 1q und 11p bestätigt. Auf der Basis der Stelle der verwendeten Sonden wurde die Größe der Veränderung auf > 1500 kbp geschätzt. In einem zweiten Fall ergab die Bandenfärbungsanalyse eine Translokation eines Segmentes von Chromosom 4 zu Chromosom 12. Die spektrale Karyotypbestimmung identifizierte und klassifizierte zweifellos, dass das zusätzliche Chromosomenmaterial ursprünglich von Chromosom 4 stammte. Zur Bestimmung der Grenze der Empfindlichkeit der spektralen Karyotypbestimmung wurde ein Fall mit einer submikroskopischen Translokation (die in Metaphase- und Prometaphase-Chromosomen jeweils nicht erkennbar war) zwischen Chromosom 16 und 17 untersucht. Dieses t(16; 17) wurde vor kurzem durch FISH mit; Cosmid-Sonden aufgezeigt, und der reziproke Austausch von Chromatin wurde auf etwa 500 kbp geschätzt. Bei einer spektralen Karyotypbestimmung mit Metaphase-Chromosomen aus diesem Patient konnte die bekannte t(16; 17) nicht nachgewiesen werden, was darauf schließen lässt, dass die Empfindlichkeitsgrenze für die Metaphase-Chromosomenanalyse mit den momentan verfügbaren Färbesonden zwischen 500 und 1500 kbp lag.
Die spektrale Karyotypbestimmung ist ein Ansatz, der sich zur Komplementierung herkömmlicher Bandenfärbungstechniken einsetzen lässt. Dies wurde bewiesen, indem ebenfalls eine Hybridisierung an Chromosomen durchgeführt wurde, die vorher G-bandengefärbt wurden. Die Signalintensität war wahrscheinlich wegen der für die G-Bandenfärbung erforderlichen Trypsin-Spaltung etwas niedriger als bei Metaphasen, die vorher nicht G-gefärbt wurden. Der Verlust von Signalintensität war etwa 10% und konnte leicht durch längere Expositionszeiten kompensiert werden. Es wurde auch ein etwas höheres Hintergrundrauschen an den Rändern der vorher G-gefärbten Chromosomen als bei nicht G- gefärbten Chromosomen beobachtet. Die Metaphase konnte leicht klassifiziert werden.
Das im Science-Magazin offenbarte und oben beschriebene Verfahren hat dennoch Grenzen. Ein Spektralbild aus 300 · 300 Pixeln und 50 Wellenlängen für jedes Spektrum ist eine Datei mit ca. 4,5 Megabyte. In dem in Science beschriebenen System hat das Interferogramm für jeden Pixel mindestens doppelt so viele Daten, d. h. ca. 9,0 Megabyte für jede Messung, bevor die Fourier- Transformation errechnet wird. Dies ist eine große Menge Daten, die eine lange Zeit zur Erfassung benötigt und sehr viel Speicherplatz einnimmt.
Die Epifluoreszenz-Mikroskopie, bei der die Fluorochrom-Unterscheidung auf der Anregung durch einen schmalen Anregungsfilter und der Messung der Fluoreszenzemission durch einen fluorochromspezifischen optischen Filter (ein zweiter Schmalbandfilter) beruht, wie beschrieben von Speicher et al. (1996) Nature Genetics 12: 368-375, und Speicher et al. (1996) Bioimaging 4: 52-64, lässt sich ebenfalls zur Chromosomenklassifizierung verwenden, jedoch leidet dieses Verfahren wie folgt an inneren Grenzen.
Die zur Gewinnung der Daten eingesetzten Filter sind fluorochromspezifisch. Da die Anregungs- und Emissionsspektren der meisten zur Chromosomenfärbung verfügbaren Fluorophore in großem Maße überlappen, werden diese Filter ausgewählt, und zwar (i) sehr schmal (bspw. jeweils etwa 5-10 nm) und (ii) je nach den genauen eingesetzten Fluorophoren und dem Ausmaß, in dem ihre Anregungs- und Emissionsspektren überlappen, werden die Filter in vielen Fällen so ausgewählt, dass sie peripheres Licht (Licht von den Schultern und nicht vom Peak der Anregung oder Emission) filtern.
Diese Filter lassen einen Großteil der in den untersuchten Proben vorhandenen Daten ausgefiltert oder, anders ausgedrückt, angesammelt, was zu einer niedrigeren Empfindlichkeit und Spezifität der endgültigen Pixelklassifikation führt. Der. Photonenverlust in diesem Verfahren ist so groß (weil dieser in den Anregungs- und Emissionskanälen erfolgt), dass das Signal verglichen mit einer Messung der ungefilterten Emission um 2 Größenordnungen abnimmt.
Die Epifluoreszenzmikroskopie hat jedoch gegenüber der Interferometrie-Bilderzeugung einen Vorteil. Die Epifluoreszenzmikroskopie, die wenige Filter einsetzt, kann bei erfindungsgemäßer Entwicklung die Messzeit verkürzen, ohne Signal-Rauschen-Verhältnis einzubüßen, indem weniger Bilder gesammelt werden müssen als bei der Interferometrie-Bilderzeugung, die die gesamte Spektralinformation erfasst.
Man möchte ein Verfahren bereitstellen, das sowohl den Vorteil einer Epifluoreszenzmikroskopie auf Filterbasis und das hohe Signal-Rauschen-Verhältnis der Interferometrie-Bilderzeugung hat.
EP-A-0732582 offenbart eine Bilderzeugungstechnik, in der Fluoreszenz einer Probe durch einen Emissionsfilter geleitet und die durch den Emissionsfilter geleitete emittierte Lichtintensität aufgezeichnet ist.
Die in EP-A-0732582 offenbarte Technik ermöglicht, dass der Nutzer Wellenlänge und Bandbreite der zu erfassenden Fluoreszenz selektiert. Dieses Merkmal ermöglicht, dass der Nutzer zwischen mehreren Fluorezenzsignalen unterscheidet, sowie Rauschen unterdrückt, das von einer Anzahl Quellen stammt, wie der Hintergrund-Beleuchtung und Streustrahlung von der Anregungsquelle.
Bei einer Ausführungsform der in EP-A-0732582 offenbarten Technik (siehe Spalte 9, Zeilen 38 bis 49 und Fig. 12 dieses Dokumentes) wird eine Anordnung aus einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) als Detektor verwendet. Bei dieser Ausführungsform wird Probe 1 durch Quelle 20 bestrahlt, wobei die Strahlenquelle zuerst durch die Optik 25 fokussiert. Die Emissionen von Probe 1 werden durch Optik 109 gesammelt und auf die Detektoranordnung 105 fokussiert. In dieser Ausführungsform gibt es eine 1 : 1- Korrespondenz zwischen der Probe und dem durch Detektor 105 erfassten Bild. Somit wird ein erster Abschnitt der Probe 1 auf einen ersten Pixel abgebildet; ein zweiter Abschnitt von Probe 1 wird auf einen zweiten Pixel abgebildet usw.
Für die FISH-(Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung)- Analyse lassen sich die mit den vorstehenden Techniken identifizierten Sonden entweder einzeln oder in einer Anzahl von Kombinationen betrachten, was auch das simultane Zeigen sämtlicher identifizierter Sonden umfasst. Werden somit mindestens fünf verschiedene Farbstoffe verwendet, kann man mit jedem einzeln identifizierten Chromosom eine FISH-Karyotypbestimmung durchführen.
Da viele Proben mehrere Farbstoffe enthalten (d. h. Farbstoffkombinationen in einer einzelnen Sonde) lässt sich eine Pseudofärbung zur Vereinfachung des gegebenen Bildes verwenden. In diesem Schema wird jeder Sonde eine leicht unterscheidbare Farbe zugeordnet. Werden drei Farbstoffe zur Bildung von sieben Sonden verwendet, werden vier Sonden durch eine Kombination der Farbstoffe gebildet. Ordnet man jeder Sonde, einschließlich denen mit mehreren Farben, eine einzelne Farbe zu, ist das dem Forscher gebotene Bild recht einfach und unkompliziert. Der Computer lässt sich auch zur Verstärkung des Bildes sowie zur Bereitstellung von Intensitätsprofilen verwenden (bspw. durch verschiedene Farben, die verschiedenen gemessenen Intensitäten zugeordnet werden).
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Einordnen von Pixeln in Pixelgruppen gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von aus einer Anzahl Fluorophore ausgewählten Fluorophoren bereitgestellt, wobei die Fluorophore jeweils ein charakteristisches Emissionsspektrum und einen spezifischen Emissions-Peak aufweisen, und das Verfahren die Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen einer Anzahl Emissionsfilter mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm;
(b) für jeden Pixel Aufzeichnen der ausgestrahlten Lichtintensität, die nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter erhalten wird, so dass sich jeder Pixel durch einen Vektor mit einer Anzahl Abmessungen darstellen lässt, wobei die Zahl der Abmessungen gleich der Zahl der Emissionsfilter ist; und
(c) Verwenden eines Algorithmus zur Bestimmung einer Menge jedes der Anzahl Fluorophore in jedem Pixel und Einordnen der Pixel jeweils in eine Pixelgruppe gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren, wobei der Algorithmus mathematisch die für jeden Pixel nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter aufgezeichnete Intensität als Summe der von jeder der Anzahl Fluorophore erhaltenen Intensitäten ausdrückt.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung bereitgestellt zum Einordnen der Pixel in Pixelgruppen gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von aus einer Anzahl Fluorophore ausgewählten Fluorophoren, die jeweils ein charakteristisches Emissionsspektrum und einen spezifischen Emissionspeak besitzen, wobei die Vorrichtung umfasst:
(a) eine Lichtquelle;
(b) eine Anzahl Paare von Anregungsfiltern mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm und Emissionsfiltern mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm;
(c) eine Steuerungsvorrichtung zum:
(i) Auswählen eines Paars der Anzahl Paare;
(ii) Anregen der Fluorophore jedes Pixels mit Licht, das aus der Lichtquelle stammt und durch einen der Anregungsfilter gefiltert wird; und
(iii) Wiederholen der Schritte (i) bis; ii) für jede Anzahl Filterpaare, so dass sich die Pixel jeweils durch eine Anzahl Abmessungen darstellen lassen, deren Zahl gleich der Anzahl Filterpaare ist;
(d) einen Lichtintensitätsschreiber zum Aufzeichnen der ausgestrahlten Lichtintensität, die nach dem Durchtritt durch die Emissionsfilter erhalten wird; und
(e) einen Rechner, umfassend einen Algorithmus zum Bestimmen einer Menge jeder Anzahl Fluorophore in jedem der Pixel und zum Einordnen der Pixel jeweils in eine Pixelgruppe gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren, wobei der Algorithmus mathematisch die für jeden Pixel nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter aufgezeichnete Intensität als Summe der von jedem der Anzahl Fluorophore erhaltenen Intensitäten ausdrückt.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen gibt der Rechner den jeweils den Pixelgruppen zugehörigen Pixeln eine einzige künstliche Farbe zuzuordnen, so dass sich die jeweils den Pixelgruppen zugehörigen Pixel voneinander unterscheiden lassen.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen haben mindestens zwei der Breitbandemissionsfilter überlappende Bandpässe.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen haben mindestens zwei der Breitbandanregungsfilter überlappende Bandpässe.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen erhalten die jeweils den Pixelgruppen zugehörigen Pixel eine einzige künstliche Farbe, so dass sich die jeweils den Pixelgruppen zugehörigen Pixel voneinander unterscheiden lassen.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist der Algorithmus ein linearer Zerlegungsalgorithmus.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen sind die Fluorophore an genetisches Material der Metaphase-Chromosomen gebunden, so dass das genetische Material jedes der Metaphase-Chromosomen an einen anderen Fluorophor oder eine Kombination von Fluorophoren gebunden ist.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist die Zahl der Anzahl Fluorophore fünf.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist die Zahl der Anzahl Filterpaare fünf.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist die Zahl der Anzahl Fluorophore gleich der Zahl der Anzahl Filterpaare.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist jeder der Breitband- Emissionsfilter so ausgewählt, dass sein Bandpass dem Emissionsspektrum eines Fluorophors der Anzahl Fluorophore einerseits entspricht und er einen hohen Durchsatz an Licht, das von dem einen Fluorophor andererseits ausgesendet wird, ermöglicht.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist jeder der Breitband- Anregungsfilter so ausgewählt, dass sein Bandpass dem Anregungsspektrum eines Fluorophors der Anzahl Fluorophore auf einerseits entspricht, und einen hohen Durchsatz an Anregungslicht andererseits ermöglicht.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen ist der Bandpass von mindestens einem der Breitband-Emissionsfilter so ausgewählt, dass er mit dem Emissionspeak seines entsprechenden Fluorophors überlappt.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Bandpass von mindestens einem der Breitband-Anregungsfilter so ausgewählt, dass er mit dem Anregungspeak seines entsprechenden Fluorophors überlappt.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen werden die Breitband- Emissionsfilter durch einen einzelnen abstimmbaren Filter dargestellt.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen werden die Breitband- Anregungsfilter durch einen einzelnen abstimmbaren Filter dargestellt.
Gemäß weiteren Merkmalen in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen sind die abstimmbaren Filter ausgewählt aus AOTF und LCTF.
Das vorstehende Verfahren und die Vorrichtung lassen sich ebenfalls zum Bestimmen der (relativen oder absoluten) Menge Fluorophore in einem Pixel einsetzen.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen der Menge eines einzelnen Fluorophors oder einer Kombination von aus einer Anzahl Fluorophore ausgewählten Fluorophoren bereitgestellt, die zu einem Pixel gehören, wobei die Fluorophore jeweils ein charakteristisches Emissionsspektrum und einen spezifischen Emissionspeak besitzen, und das Verfahren die Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen einer Anzahl Emissionsfilter mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm;
(b) Aufzeichnen der ausgestrahlten Lichtintensität, die nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter erhalten wird, so dass sich der Pixel durch einen Vektor mit einer Anzahl Abmessungen darstellen lässt, wobei die Zahl der Abmessungen gleich der Zahl der Emissionsfilter ist; und
(c) Verwenden eines Algorithmus zur Bestimmung einer Menge jedes der Anzahl Fluorophore in dem Pixel, wobei der Algorithmus mathematisch die für jedem Pixel nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter aufgezeichnete Intensität als Summe der von jeder der Anzahl Fluorophore erhaltenen Intensitäten ausdrückt.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Bestimmen der Menge eines einzelnen Fluorophors oder einer Kombination von aus einer Anzahl Fluorophore ausgewählten Fluorophoren bereitgestellt, die zu einem Pixel gehören, wobei die Fluorophore jeweils ein charakteristisches Emissionsspektrum und einen spezifischen Emissionspeak besitzen, und die Vorrichtung umfasst:
(a) eine Lichtquelle;
(b) eine Anzahl Filterpaare, umfassend jeweils einen Anregungsfilter mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm und einen Emissionsfilter mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm;
(c) eine Steuerungsvorrichtung zum:
(i) Auswählen eines Paars der Anzahl Paare;
(ii) Anregen der Fluorophore des Pixels mit Licht, das aus einer Lichtquelle stammt und durch einen der Anregungsfilter gefiltert wird; und
(iii) Wiederholen "der Schritte (i) bis (ii) für jede Anzahl Filterpaare, so dass sich die Pixel jeweils durch eine Anzahl Abmessungen darstellen lassen, deren Zahl gleich der Zahl der Filterpaare ist;
(d) einen. Lichtintensitätsschreiber zum Aufzeichnen der ausgestrahlten Lichtintensität, die nach dem Durchtritt durch die Emissionsfilter erhalten wird; und
(e) einen Rechner, umfassend einen Algorithmus zum Bestimmen einer Menge jeder Anzahl Fluorophore in dem Pixel, wobei der Algorithmus mathematisch die für jeden Pixel nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter aufgezeichnete Intensität als Summe der von jedem der Anzahl Fluorophore erhaltenen Intensitäten ausdrückt.
Die Erfindung bewältigt die Nachteile der zur Zeit bekannten Konfigurationen, indem ein System zur Klassifizierung von Pixeln gemäß ihrer Spektren bereitgestellt wird und die Menge Fluorophore in einem Pixel bestimmt wird. Dabei werden sowohl Spezifität als auch Durchsatz berücksichtigt, so dass die Messung zu einem optimalen Signal-Rauschen-Verhältnis führt.
Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und eines Systems zur Analyse von Chromosomen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und eines Systems zur raschen Erfassung von Chromosomenaberrationen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und eines Systems zur Bereitstellung eines farbigen Karyotyps.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und eines Systems das die vorstehenden Aufgaben der Erfindung mit einem hohen Signal- Rauschen-Verhältnis und in kurzer Zeit bewältigen kann, indem Breitbandfilter zur Datenerfassung eingesetzt werden.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden nachstehend eingehend beschrieben.
Die hier beschriebene Erfindung wird lediglich beispielhaft anhand der beigefügten Abbildungen beschrieben. Es zeigt:
Fig. 1 ein Blockdiagramm, das die Hauptkomponenten eines Bilderzeugungsspektrometers veranschaulicht, das gemäß US-Patent 5 539 517 (Stand der Technik) konstruiert wurde;
Fig. 2 ein Sagnac-Interferometer, das in einem Bilderzeugungsspektrometer gemäß US-Patent 5 539 517 (Stand der Technik) verwendet wird;
Fig. 3 die Anregungs- und Emissionsspektren von zwei Fluorophoren mit überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren (wie die Paare TEXAS-ROT und SPEKTRUM-ORANGE oder Cy5 und Cy5,5) und entsprechende schmale differenzierende Anregungs- und Emissionsfilter, die gemäß den Prinzipien des Niederphotonen-Durchsatzsystems (LPTS) des Standes der Technik mit diesen Farbstoffen verwendet werden;
Fig. 4a die Anregungsspektren der Fluorophore (SPECTRUM-GRÜN, SPECTRUM-ORANGE; TEXAS-ROT, Cy5 und Cy-5.5), welche zur Veranschaulichung der Erfindung eingesetzt wurden und bevorzugte Anregungsfilter, die diesen Fluorophoren entsprechen.
Fig. 4b die Emissionsspektren der Fluorophore (SPECTRÜM-GRÜN, SPECTRUM-ORANGE; TEXAS-ROT, Cy5 und Cy-5.5), welche zur Veranschaulichung der Erfindung eingesetzt wurden und bevorzugte Emissionsfilter, die diesen Fluorophoren entsprechen.
Fig. 5a und 5b die Ergebnisse der simulierten Messung nach der Klassifizierung der Pixel gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, mit dem die kombinatorisch gefärbten Chromosomen einer normalen weiblichen Person (5a) und einer männlichen Person mit einer Translokation zwischen Chromosom 16 und 9 (5b) klassifiziert wurden.
Fig. 6 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung mit herkömmlichen Filtern, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen; und
Fig. 7 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung mit abstimmbaren Filtern, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Einordnen von Pixeln in Pixelgruppen gemäß ihrer Fluoreszenzspektren, nach Filtern durch eine Anzahl Breitband-Anregungs- und/oder Emissions filter, und zur Bestimmung der relativen oder absoluten Menge des oder der Fluorophore in einem Pixel. Die Erfindung lässt sich zum Einordnen der Pixel, die in situ fluoreszenzgefärbte Chromosomen darstellen, in Pixelgruppen verwenden, wobei jeder Gruppe genetisches Material angehört, das von einem anderen Chromosom stammt, und zur Bestimmung der Menge Fluorophore, die in jedem der Pixel zugegen sind. Die Erfindung lässt sich speziell zur Chromosomenklassifizierung verwenden, so dass farbige (Spektral)-Karyotypen bereitgestellt werden und dadurch Chromosomenaberrationen erfasst werden.
Die Prinzipien und der Betrieb des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt sich besser anhand der Zeichnungen und beigefügten Beschreibungen besser verstehen.
Spektrale Bilderzeugung ist die Technologie, die die Messung des an jedem Punkt (Pixel) eines Objekts emittierten Lichtspektrums ermöglicht. Ein Spektralbilderzeuger (der hier als Bilderzeugerspektrometer bezeichnet wird) ist eine Vorrichtung, die das von jedem Punkt des untersuchten Objekts emittierte Lichtspektrum misst und für ein späteres Aufrufen und Analyse im Speicher bewahrt. Ein Spektralbild ist eine Sammlung von Spektren des Objekts, das von einem Spektralbilderzeuger gemessen wird. Es ist gewöhnlich als Intensitätsfunktion organisiert, das in einem dreidimensionalen Raum definiert ist, bei dem zwei Dimensionen von einem Bild stammen (x und y) und eine von der Spektralachse stammt (λ). Ein Spektralbild als solches wird gewöhnlich als Daten-"Würfel" oder "Spektralwürfel" bezeichnet.
Der Stand der Technik lehrt verschiedene Verfahren zur Messung von Spektralbildern (d. h. Spektralwürfeln). Die entsprechend diesen Verfähren entwickelten Vorrichtungen umfassen Lichtsammeloptiken, ein Dispersionselement (bspw. ein Gitter), einen oder mehrere Filter (bspw. Schmalinterferenzfilter, AOTF oder LCTF) oder ein Interferometer; Fokussieroptiken, sowie eine zweidimensionale Detektoranordnung (gewöhnlich eine CCD im sichtbaren Bereich und andere Detektorarten im Infrarotbereich).
Jedes Verfahren hat Vorteile und Nachteile, wie jedoch in US-Patent 5 539 517 und im Journal of Microscopy [Bd. 182, S. 133-140, 1996] beschrieben wurde, die jeweils als vollständig offenbart durch Bezugnahme hier aufgenommen sind, hat ein Spektralbilderzeuger auf der Basis eines speziellen Typs eines Dreieck-Interferometers die Vorteile Kompaktheit und Stabilität, die die meisten herkömmlichen Spektralbilderzeuger nicht haben. Ein in US-Patent 5 539 517 offenbarter erfindungsgemäßer Spektralbilderzeuger wurde von Applied Spectral Imaging Ltd., Industriell Park, Migdal Haemek, Israel entwickelt und wird nachstehend als SPECTRACUBE beschrieben.
Das SPECTRACUBE -System, das nachstehend eingehender beschrieben ist, diente der Gewinnung von Spektren der Pixel, die gefärbte Chromosomen darstellen, wobei die Spektren nachstehend zur Klassifizierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden.
Die Bedeutung der Spektralbildmessung beruht auf der Tatsache, dass das Lichtspektrum Information über die fragliche Zusammensetzung trägt, aus der das Objekt besteht. Daher lässt sie sich zur Kartierung und Visualisierung von Phänomenen verwenden, die ansonsten nicht sichtbar sind (bspw. durch regelmäßige Bilderzeugung in Schwarz-Weiß oder Farbe). Da ein Farbbild der nächste Schritt nach einem Schwarz-Weiß-Bild ist, ist ein Spektralbild der nächste Schritt nach dem Farbbild. Entsprechend dem Unterschied grüner Farben zwischen den Blättern zweier unterschiedlicher Baumarten oder zwischen einem jungen und einem alten Blatt erscheinen zwei fluoreszierende Farbstoffe, wie Texas-Rot und Rhodamin, dem menschlichen Auge als gleichfarbig, jedoch lassen sie sich gut durch einen Spektrographen mit 10 nm Auflösung unterscheiden. Ein komplexes biologisches System, wie eine weiße Blutzelle, die mit Giemsa gefärbt wurde, erscheint dem Auge durch das Mikroskop im weißen Durchlicht, als Gegenstand mit Strukturen, die aus Bereichen mit purpurner, blauer und rötlicher Farbe in unterschiedlichen Intensitäten bestehen. Da Farben vom menschlichen Auge als Kombinationen von nur drei Farben wahrgenommen werden, tionen von nur drei Farben wahrgenommen werden, nämlich Rot, Grün und Blau (RGB), ist die Anzahl verschiedener Bereiche in der Zelle, die sich farblich klassifizieren lässt, sehr beschränkt. Für jeden Punkt der gleichen Zelle misst ein Spektralbilderzeuger ein Spektrum, das von den chemischen Materialien an diesem Punkt abhängt, und dies ist eine Funktion der Wellenlänge, die etwa 50 bis 200 Daten (je nach Material und der Spektralauflösung der Messung) statt nur drei, wie beim Farbbild, aufweist. Demzufolge lassen sich kleine Spektralunterschiede oder Abweichungen zwischen Pixeln durch einen Spektralbilderzeuger erfassen, die das Auge nur als gleichfarbig erkennt. Daher lassen sich viel mehr Klassen biologischer Strukturen oder Komponenten in der Zelle mit einem Spektralbilderzeuger als mit dem menschlichen Auge oder einem Äquivalent unterscheiden (bspw. herkömmliches RGB- Farbbild).
In Fluorescence Imaging Spectroscopy and Microscopy, hrsg. von X. F. Wang und B. Herman, Bd. 137, S. 87-124, 1996, John Wiley & Sons bspw. wird in einem Spektralbild eine Kernwand scharf vom Rest des Kerns abgegrenzt gezeigt, und zwar im Vergleich zu einem einfachen Farbbild, wo die Wand als Teil des Kerns wahrgenommen wird (siehe dort, Fig. 4.10d auf Seite 115).
In E. Schroeck et al. (1996) Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science 273, 494-497 ist gezeigt, wie der in US-Patent 5 539 517 offenbarte Spektralbilderzeuger in Kombination mit Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierungs(FISH)-Techniken zur Analyse kombinatorisch gefärbter Chromosomen (aus Mensch und Tieren) verwendet wird, so dass sich Karyotyp, Chromosomenzahl und Chromosomenaberrationen leicht und verlässlich entdecken und charakterisieren lassen.
Gemäß dieser Technik wird jedes Chromosom mit komplementärem DNA-Material hybridisiert, das eine andere Kombination fluoreszierender Farbstoffe eines größeren Satzes Farbstoffen enthält, so dass jedes Chromosom einer Metaphasenspreitung gleichmäßig über die gesamte Oberfläche ein anderes Fluoreszenzspektrum emittiert. Gewöhnlich wird jedes Chromosom mit einer anderen Kombination von bis zu drei Farben (bspw. eine, zwei oder drei Farben), ausgewählt aus einem Satz von 5 Farben, markiert, so dass 24 verschiedene Fluoreszenzspektren, d. h. eins für jedes Chromosom, erhalten werden. Dies erfolgt mit Chromosomen aus Mensch (was 24 verschiedene Spektren oder 24 Farbkombinationen erfordert), Maus und Affe (für die die Zahl ungleich 24 ist), und gesunden und erkrankten (bspw. mit Krebs befallene) Zellen. Der Nachweis und die Identifizierung von Translokationen unter Verwendung dieses Verfahrens erfolgt schnell und verlässlich, da sich das unterschiedliche Spektrum einer Translokation klar vom umgebenden Chromosom abhebt, wohingegen die Information der weithin verwendeten G-Bandenfärbungstechnik für diesen Zweck viel weniger offensichtlich ist.
Ein Spektralbild aus 300 · 300 Pixeln und 50 Wellenlängen für jedes Spektrum umfasst eine Datei mit ca. 4,5 Megabyte. In dem in US-Patent 5 539 517 beschriebenen System enthält das Interferogramm für jeden Pixel mindestens doppelt so viele Daten, d. h. ca. 9,0 Megabyte für jede Messung, bevor die Fourier-Transformation berechnet wird. Dies ist eine große Datenmenge, deren Erfassung lang dauert und die viel Speicherplatz einnimmt.
Die Epifluoreszenzmikroskopie, bei der die Fluorochrom-Unterscheidung auf der Messung einer einzelnen Intensität durch einen fluorochromspezifischen optischen Filter (Schmalbandfilter) beruht, wie beschrieben von Speicher et al. (1996) Nature Genetics. 12: 368-375; und Speicher et al. (1996) Bioimaging 4: 52-64, lässt sich ebenfalls zur Chromosomen-Klassifizierung verwenden, jedoch hat dieses Verfahren, wie im vorstehenden Hintergrund-Abschnitt beschrieben, interne Beschränkungen, da die zur Gewinnung der Daten eingesetzten Filter fluorochromspezifisch sind. Die Emissionsspektren der meisten Fluorophore, die für eine Chromosomenanfärbung verfügbar sind, überlappen sehr stark. Diese Filter werden ausgewählt, und zwar (i) sehr schmal (bspw. jeweils etwa 5-10 nm) und (ii) je nach den eingesetzten genauen Fluorophoren und dem Ausmaß, mit dem ihre Emissionsspektren überlappen, werden die Filter in vielen Fällen so ausgesucht, dass sie peripheres Licht (Licht von den Schultern und nicht vom Emissions-Peak) herausfiltern. Diese Filter als solche lassen einen Großteil der in den untersuchten Proben vorhandenen Information aus, was zu einem kleineren Signal-Rauschen-Verhältnis und einer höheren Ungewissheit für Klassifizierungszwecke führt. Eine Diagnose auf der Basis dieser Analyse ist darum weniger empfindlich und weniger spezifisch.
Nachstehendes betrifft die Einschränkungen des Epifluoreszenzmikroskopie-Ansatzes zur Klassifizierung verglichen mit dem Interferometrieansatz und hebt die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens hervor.
In den US-Patentanmeldungen Nr. 08/575 191; 08/635 820; 08718831 und 08/759 342 sind Verfahren und Vorrichtungen zur Chromosomen-Klassifizierung beschrieben. Diesen Verfahren ist der Schritt Färben der Chromosomen mit Voll- Chromosomenfarben gemeinsam. Danach weichen die eingesetzte Analyse und die verwendete Vorrichtung je nach dem Verfahren der Wahl voneinander ab.
Gemäß einem Verfahren wird ein Spektralbilderzeuger auf Interferometerbasis eingesetzt, damit man ein vollständiges Fluoreszenzspektrum von jedem Pixel der analysierten Probe aufnimmt, das danach mit einer Bezugsmatrize analysiert wird.
Gemäß einem weiteren Verfahren wird eine Anzahl zweckbestimmter Breitband-Fitter mit Dekorellationsanpassung (bspw. Interferenz, AOTF, LCTF, elektronisch angetrieben mit breiten Wellenlängenbändern oder andere), die auf der Basis einer statistischen Dekorrelationsanalyse, wie Haupt komponentenanalyse (PCA), der gemessenen Spektren entwickelt wurden, zur Erfassung dekorrelierter Spektraldaten aus der analysierten Probe verwendet.
Diese Messvorrichtungen sind durch ein hohes Signal- Rauschen-Verhältnis gekennzeichnet, da die Photonenausschussrate sehr niedrig ist; das Interferometerverfahren ist nicht durch Schmalbandfilter zur Wellenlängentrennung eingeschränkt und die Filter mit Dekorrelationsanpassung (obwohl nicht vollständig durchlässig) lassen den gesamten Spektralbereich der Fluoreszenzemission durch. Diese Verfahren werden daher als "Hochphotonen-Durchlass- Systeme" oder HPTS bezeichnet.
In Speicher et al. (1996) Nature Genetics. 12: 368- 375 und in Speicher et al. (1996) Bioimaging 4: 52-64, ist ein Verfahren zur Chromosomenklassifizierung mit einem Satz unterscheidender Schmalbandfilter beschrieben, das nachstehend als "Niederphotonen-Durchsatzsystem" oder LPTS bezeichnet wird. Bei den LPTS-differenzierenden Filtern sind die Anregungsfilter schmal, jedoch so ausgewählt, dass sie Wellenlängen durchlassen, bei denen im Wesentlichen nur 1 Farbstoff auf einmal angeregt wird, und entsprechend sind die entsprechenden Emissionsfilter schmal und in schmalen Wellenlängenbereichen ausgewählt, wo nur 1 Farbstoff auf einmal emittiert.
Das LPTS-Konzenpt kann eine gute Farbentrennung ergeben (selbst bei einem niedrigen Signal-Rauschenverhältnis), und zwar nur wenn jeder Farbstoff, der beim kombinatorischen Anfärben verwendet wird, angeregt werden kann und in Wellenlängenbereichen gemessen werden kann, die untereinander nicht überlappen. Leider überlappen alle gängigen und praktisch verwendeten Farbstoffe im großen Maße, und zwar sowohl hinsichtlich der Anregungs- als auch der Emissionsbanden, und daher können die gemessenen Signale nicht vollständig farbstoffspezifisch sein. Dieses Phänomen ist aus Fig. 3 weiter ersichtlich.
Die Fig. 3 zeigt die Anregungs- (X) und Emissionsspektren (M) der ersten (T) und zweiten (S) Fluorophore mit überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren, bspw. TEXAS-ROT und SPECTRUM-ORANGE oder Cy5 und Cy5.5. Die entsprechenden schmälen (in diesem Fall 10 nm) Anregungs- und Emissionsfilter (F), die bei einer LPTS des Standes der Technik mit diesen Farben verwendet werden, sind durch Pfeile angezeigt. Es ist ersichtlich, dass das resultierende niedrige Signal-Rauschen-Verhältnis auf zwei Faktoren beruht: (i) hohes Photonenausschussverhältnis der Schmalbandfilter, und (ii) die Durchlasswellenlängen der Filter sind weit von den Peaks der Anregungs- und Emissionsspektren entfernt.
Die Filter müssen, damit sie für jeden Farbstoff gesondert spezifisch sind und man eine Überlappung weitgehend umgeht (was niemals ganz vermieden werden kann), sehr schmal sein. Je schmaler, desto besser. Als direkte Folge ist sowohl die Anzahl der auf einer Probe einfallenden Photonen im Anregungsweg, und die Anzahl Photonen, die schließlich im Emissionsweg gemessen werden, sehr schmal. Demnach ist das Signal-Rauschen-Verhältnis der Messung sehr niedrig, und zwar etwa zwei Größenordnungen kleiner als bei einer Messung ohne Filter oder einer HPTS-Messung gemäß den bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen.
Breitband-Anregungs- und -Emissionsfilter werden erfindungsgemäß zur Klassifikation eingesetzt, und der interne hohe Photonendurchsatz dieser Filter resultiert in einem höheren Signal-Rauschen-Verhältnis, einer höheren Messverlässlichkeit und demzufolge in einer höheren Empfindlichkeit und Spezifität der resultierenden Diagnose.
Wie im nachstehenden Beispiele-Abschnitt eingehend beschrieben, wird die Spektrenüberlappung der Anregungs- und Emissionsspektren der eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe unter bestimmten Annahmen der Linearität der Signale durch zweckorientiert mathematische lineare Zerlegungsalgorithmen berücksichtigt.
Es seien kurz folgende Punkte vermerkt:
Erstens wird erfindungsgemäß, gegenüber LPTS des Standes der Technik die niedrigere Spezifität der Signale aufgrund der größeren Bandbreite der Anregungs- und Emissionsfilter durch ein höheres Signal-Rauschen-Verhältnis und durch einen linearen Zerlegungsalgorithmus kompensiert.
Zweitens, obwohl das nachstehend gezeigte Beispiel eine kombinatorische Markierung und die Klassifizierung menschlicher Chromosomen betrifft, erkennt der Durchschnittsfachmann leicht, dass die Erfindung auf einen beliebigen Probentyp zutrifft, der viele Bereiche enthält, die mit verschiedenen Fluorophoren oder Kombinationen davon gefärbt oder markiert sind.
Die Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens, das sowohl die potentiell kurze Messdauer weniger Bilder durch, eine kleine Zahl Filter zusammen mit der Epifluoreszenzmikroskopie und dem hohen Signal- Rauschen-Verhältnis der, Interferometrie- Spektralbilderzeugung mit Breitbandfiltern zur Datenerfassung vereint.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren bereitgestellt zum Einordnen von Pixeln in Pixelgruppen gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren (bspw. zwei, drei oder vier verschiedenen Fluorophore). Die Fluorophore sind ausgewählt aus einer Anzahl Fluorophore (bspw. vier oder mehreren verschiedenen Fluorophoren). Die Fluorophore haben, da sie verschieden sind, jeweils charakteristische Anregungs- und Emissionsspektren und einen oder mehrere spezifische Anregungs- und Emissions-Peaks, siehe bspw. Fig. 4b.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden aus den charakteristischen Emissionsspektren und Peaks der Fluorophore Vorteile gezogen. Zu diesem Zweck wird eine Anzahl Breitband-Emissionsfilter bereitgestellt, die nacheinander zur Erfassung von Daten von jedem der einzuordnenden Pixel verwendet werden. Somit wird für jeden der Pixel die emittierte Lichtintensität, wie sie nach dem Durchtritt durch jede der Anzahl Emissionsfilter (auf einmal) erhalten, wird, aufgezeichnet. Demzufolge wird jeder der Pixel durch einen Vektor einer Anzahl von Abmessungen dargestellt, die gleich der Anzahl der eingesetzten Breitbandemissionsfilter ist. Danach wird ein geeigneter Algorithmus zur Bewertung des Vorhandenseins von jedem der Anzahl der Fluorophore in jedem der Pixel eingesetzt. Dadurch wird jeder der Pixel gemäß seiner Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer gegebenen Kombination von Fluorophoren in eine Pixelgruppe eingeordnet.
Gemäß einer weiteren und z. Zt. bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden aus den charakteristischen Emissions- und Anregungsspektren und Peaks der Fluorophore Vorteile gezogen. Zu diesem Zweck wird eine Anzahl Breitband-Anregungsfilter- und Breitband- Emissionsfilter-Paare bereitgestellt, die nacheinander als Paare zur Erfassung der Daten von jedem der einzuordnenden Pixel verwendet werden. Die Fluorophore jedes Pixels werden mit Licht angeregt, das durch einen der Breitband- Anregungsfilter gefiltert wurde, und die emittierte Lichtintensität, wie sie nach dem Durchtritt durch die paarigen Emissionsfilter erhalten wird, wird aufgezeichnet. Dieses Verfahren wird für sämtliche Filterpaare wiederholt, so dass die Pixel sich jeweils durch einen Vektor einer Anzahl Abmessungen darstellen lässt, die gleich der Anzahl Filterpaare ist. Wie zuvor wird schließlich ein geeigneter Algorithmus zur Berechnung des Vorhandenseins jedes der Anzahl Fluorophore in jedem der Pixel verwendet. Demnach werden die Pixel jeweils gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren einer Pixelgruppe zugeordnet.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Anzahl Breitband-Anregungs- und -Emissionsfilter-Paare bereitgestellt, wobei deren Transmissionsspektrum keinen weiteren Anforderungen genügen muss als dass es breit sein muss (bspw. in der Größenordnung eines Zehntels der Breite des Spektralbereichs, bspw. 20 bis 70 nm, vorzugsweise 30 bis 50 nm), die nacheinander als Paare verwendet werden, damit man die Daten von jedem der einzuordnenden Pixel erhält.
Die Fluorophore jedes Pixels werden mit Licht angeregt, das durch einen der Breitband-Anregungsfilter gefiltert wurde, und die emittierte Lichtintensität, wie sie nach dem Durchtritt durch die paarigen Emissionsfilter erhalten wird, wird aufgezeichnet. Dieses Verfahren wird für sämtliche Filterpaare wiederholt, so dass jeder Pixel durch einen Vektor einer Anzahl Abmessungen dargestellt wird, die jeweils gleich der Anzahl Filterpaare ist. Wie zuvor wird schließlich ein geeigneter Algorithmus zur Berechnung des Vorhandenseins jedes der Anzahl Fluorophore in jedem der Pixel verwendet. Demnach werden die Pixel jeweils gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren einer Pixelgruppe zugeordnet.
Es gibt viele Aspekte, bei denen sich die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Breitbandfilter von den im Stand der Technik eingesetzten Filtern unterscheiden, wie sie bspw. von Speicher et al., (1996) Nature Genetics 12: 368-375; und Speicher et al. (1996) Bioimaging 4: 52-64 beschrieben wurden. Vor der Beschreibung der physikalischen Beschaffenheit der Filter erfolgt eine kurze Erörterung der Überlegungen bezüglich der Auswahl der Filter. Es gibt zwei hauptsächliche Überlegungen: Durchsatz und Farbstoffspezifität, (wobei der Durchsatz wichtiger ist, da sich das Fehlen von Farbstoffspezifität durch die nachstehend beschriebenen Algorithmen kompensieren lässt).
Bei unabhängiger Auswahl von Farbstoffspezifität und Durchsatz, werden diese so ausgewählt, dass beide maximal sind, da maximale Spezifität und alternativ maximaler Durchsatz unabhängig zu einem höheren Signal-Rauschenverhältnis führen. Da Durchsatz und Farbstoffspezifität jedoch konkurrierende Parameter sind, werden sie am besten optimiert.
Hohe Spezifität erfordert Schmalbandfilter. Ist somit Farbstoffspezifität die einzige Überlegung, wird jeder Anregungsfilter im Wesentlichen spezifisch für die Anregung eines spezifischen Fluorophors ausgewählt und jeder Emissionsfilter wird im Wesentlichen spezifisch zur Transmission von Licht, das von einem spezifischen Fluorophor emittiert wird, ausgewählt. Ist dagegen Durchsatz die einzige Überlegung, werden Anregungs- und Emissionsfilter sehr breit gewählt, so dass der Durchsatz maximiert wird. Farbstoffspezifität und Durchsatz sind jedoch nie alleinige unabhängige Überlegungen. Spezifität und Durchsatz müssen jeweils kompensiert werden, so dass das Endergebnis ein maximales Signal-Rauschen-Verhältnis aufweist. Die Bandbreiten der Anregungs- und Emissionsfilter werden erfindungsgemäß daher vorzugsweise als optimale Kompensation ausgewählt, die sich für die gewählten Fluorophore am besten eignet. Eine gewisse Optimierung lässt sich auch mit der spektralen Abhängigkeit der Filterdurchlässigkeit erzielen. Ein hoher Durchsatz wird bspw. gewöhnlich unter dem mittleren Drittel der Anregungs- und Emissionsspektren eines spezifischen Fluorophors erzielt, da diese Spektren gewöhnlich im mittleren Drittelbereich einen Peak aufweisen. Spezifität wird dagegen in Bereichen erzielt, die entweder vollständig nicht überlappen oder nur in einem geringen Maße (bspw. bei einem Wellenlängenbereich, bei dem ein Fluorophor sehr stark emittiert, wohingegen der andere schwach emittiert). Erfindungsgemäß wählt man die am besten geeigneten Anregungs- und Emissionsfilter aufgrund dieser gegensätzlichen Überlegungen. Die am besten geeigneten Filter haben einen breiten Bandpass zwischen 30 und 70 nm oder mehr (siehe Tabelle 4 unten). Die für die jeweiligen Breitbandfilter ausgewählte Bandpassbreite hängt im großen Maße von den gewählten Fluorophoren ab, und insbesondere davon, wie stark Anregungs- und Emissionsspektren der ausgewählten Fluorophore überlappen.
Die einzige, bei dem Verfahren des Standes der Technik berücksichtigte Überlegung, beschrieben von Speicher et al., (1996) Nature Genetics 12: 368-375; und Speicher et al., (1996) Bioimaging 4: 52-64, war Spezifität. Der Durchsatz war hier lediglich von sekundärem Interesse, und zwar nur wenn er ohne Einschränkung der Spezifität anwendbar war. Die dabei eingesetzten Filter, Anregungs- und Emissionsfilter, wurden als solche sehr schmal gewählt (bspw. etwa 10 nm) und waren nicht überlappende, gewöhnlich über das Spektrum verteilte Filter, damit Teile der Schultern (der äußeren Drittel) der Anregungs- oder Emissionsspektren der dort eingesetzten Fluorophore abgedeckt waren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung haben mindestens zwei, vorzugsweise mehr, d. h. drei, vier oder mehr Breitband-Emissionsfilter überlappende Bandpässe. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung haben entsprechend mindestens zwei, vorzugsweise mehr, d. h. drei, vier oder mehr. Breitband-Anregungsfilter überlappende Bandpässe. Zwei oder mehr (Anregungs- oder Emissions-)Filter regen somit emittiertes Licht von zwei oder mehreren Fluorophoren an oder lassen dieses hindurch.
Vorzugsweise wird jeder der Breitband-Emissionsfilter so ausgewählt, dass sein Bandpass dem Emissionsspektrum eines Fluorophors der Anzahl Fluorophore einerseits entspricht, und dass er andererseits einen hohen Durchsatz an Licht ermöglicht, das von diesem Fluorophor emittiert wird. Der Bandpass von mindestens einem (vorzugsweise mehr als einem, d. h., zwei, drei oder vier usw.) der Breitband- Emissionsfilter ist so ausgewählt, dass er mit dem Emissionspeak des entsprechenden Fluorophors überlappt.
Entsprechend wird jeder Breitband-Anregungsfilter so ausgewählt, dass sein Bandpass dem Anregungsspektrum eines Fluorophors der Anzahl Fluorophore einerseits entspricht, und dass er andererseits einen hohen Durchsatz an Anregungslicht ermöglicht. Der Bandpass von mindestens einem (vorzugsweise mehr als einem, d. h. drei oder vier usw.) der Breitband-Anregungsfilter ist so ausgewählt, dass er mit dem Anregungspeak des entsprechenden Fluorophors überlappt.
Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Algorithmus ist wie nachstehend eingehender beschrieben ein linearer Zerlegungsalgorithmus. Dieser Algorithmus arbeitet folgendermaßen. Zuerst wird angenommen, dass sich die Fluoreszenzspektren der verschiedenen Moleküle addieren, so dass das Spektrum eines Pixels die Gesamtsumme der Spektren sämtlicher darin vorhandener Moleküle ist. Zweitens wird angenommen, dass die Spektren der zur Hybridisierung ausgewählten n Fluoreszenzfarbstoffe unabhängig voneinander sind, was bedeutet, dass keiner davon als lineare Kombination von einem der anderen erhalten werden kann. Drittens drückt er mathematisch das Signal von einem Pixel, das durch jedes der n Paare Anregungs-Emissionsfilter gemessen wird, als Summe der Signale aus, die von jedem der n Farbstoffe erhalten werden, wie gemessen durch die gleichen Filter und gewichtet mit der relativen Anzahl Moleküle (den n Unbekannten), die in dem Pixel des jeweiligen Farbstoffs vorhanden sind. Dadurch wird ein Satz n linearer Gleichungen mit n Unbekannten aufgebaut. Viertens löst er die n linearen Gleichungen mit n Unbekannten für jeden Pixel, wodurch die relative Menge jedes Farbstoffs in jedem Pixel erfasst wird. Fünftens verwendet er das bekannte Färbeschema für jedes Chromosom (d. h. die Kombination von Farbstoffen, mit der jedes Chromosom hybridisiert wurde), so dass jedem Pixel eins Chromosomenzahl zugeordnet wird. Sechstens zeigt er jeden Pixel mit einer künstlichen Farbe, die der zugeordneten Chromosomenzahl entspricht, so dass sich Pixel, die den jeweiligen Gruppen angehören, voneinander unterscheiden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform und wie in dem nachstehenden Beispiel-Abschnitt beschrieben, dient das hier beschriebene Verfahren der Metaphase-Chromosom- Klassifizierung, und der Erfassung von Chromosomenanomalien. Zu diesem Zweck werden die Fluorophore an genetisches Material der Metaphase-Chromosomen gebunden (durch Hybridisierung), so dass genetisches Material der Metaphase-Chromosomen jeweils an einen anderen Fluorophor oder eine Kombination von Fluorophore gebunden wird. Werden wie beschrieben den Pixelgruppen künstliche Farben zugeordnet, wird genetischem Material der jeweiligen Chromosomen eine andere Farbe zugeordnet, so das sie sich daher unterschieden lassen.
Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Anzahl der Emissions- und/oder Anregungsfilter je nach Anwendung gleich der Anzahl der eingesetzten Fluorophore. Dies ist jedoch nicht notwendigerweise der Fall, da sich weniger oder mehr Filter einsetzen lassen. Dies ergibt Vektoren, die sich noch durch geeignete Zerlegungsalgorithmen oder andere analysieren lassen.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform lassen sich die Breitband-Anregungs- und/oder Emissionsfilter durch einen einzigen abstimmbaren Filter darstellen. Der abstimmbare Filter ist vorzugsweise AOTF oder LCTF. Erhält der abstimmbare Filter einen Satz Informationen, so dass er erfolgreich eingestellt wird, damit er den Breitbandfilter darstellt, brauchen vorteilhafterweise keine Teile bewegt werden.
Gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren und zudem erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens bereitgestellt. Die Vorrichtung dient der Einordnung von Pixeln in Pixelgruppen entsprechend ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von aus einer Anzahl Fluorophore ausgewählten Fluorophoren. Jeder der Fluorophore hat charakteristische Anregungs- und Emissionsspektren und spezifische Anregungs- und Emissionspeaks. Die Vorrichtung umfasst eine Lichtquelle, die einen Lichtstrahl aussendet, und zwar in einem Wellenlängenbereich, der sich zur Anregung der gewählten Fluorophore eignet. Die Vorrichtung umfasst zudem eine Anzahl Paare Breitband-Anregungsfilter und Breitband-Emissionsfilter. Der Filter hat die vorstehend beschriebenen Eigenschaften. Die Vorrichtung umfasst zudem eine automatische manuelle oder semimanuelle Kontrollvorrichtung (wie einen Computer). Die Kontrollvorrichtung selektiert ein Paar der Anzahl Paare zum Anregen der Fluorophore jedes Pixels mit Licht, das aus der Lichtquelle stammt und durch einen der Breitband-Anregungsfilter gefiltert wird, und zum Wiederholen des vorstehenden Verfahrens für sämtliche Filterpaare. Die Vorrichtung umfasst zudem eine Vorrichtung zum Aufzeichnen der Lichtintensität, die die emittierte Lichtintensität aufzeichnet, wie sie nach dem Durchtritt durch die Emissionsfilter erhalten wird. Demzufolge lässt sich jeder Pixel durch eine Anzahl von Abmessungen darstellen, deren Anzahl gleich der Anzahl der Filterpaare ist. Die Vorrichtung umfasst zudem einen Rechner, der einen Algorithmus zum Berechnen des Vorhandenseins jeder der Anzahl Fluorophore in jedem Pixel umfasst. Der Rechner dient daher der Einordnung jedes Pixels in eine Gruppe von Pixeln gemäß seiner Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer beliebigen Kombination von Fluorophoren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform, gibt der Rechner den Pixeln, die jeweils zu den Pixelgruppen gehören, eine einzelne künstliche Farbe, so dass sich Pixel, die den jeweiligen Gruppen angehören, voneinander unterscheiden lassen.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung beruhen auf einer kleinen Anzahl Filter und hohem Durchsatz, und daher müssen nur wenige Bilder gesammelt werden, so dass die Messdauer verglichen mit dem Interferometrie-System des Standes der Technik kurz ist [E. Schroeck et al., (1996) Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science 273, 494-497]. Dies erfordert die Aufnahme vieler, CCD-Bilder für eine hohe spektrale Auflösung und eine längere Messdauer, und stellen dennoch einen höheren Durchsatz verglichen mit anderen Filtern auf der Basis von Systemen des Standes der Technik bereit [Speicher et al. (1996) Nature Genetics. 12, 368- 375; und Speicher et al (1996) Bioimaging 4: 52-64].
Der Fachmann weiß, dass sich der Einsatz ähnlicher Verfahrensschritte und Vorrichtungs-Komponenten weiterhin zur Bestimmung der relativen oder absoluten Menge Fluorophore in einem Pixel einer untersuchten Probe verwenden lässt. Dies hat Vorteile für viele Gebiete in der biologischen Forschung und Diagnostik.
Nachstehend werden die Beispiele beschrieben, die zusammen mit den vorstehenden Erläuterungen die Erfindung in einer nicht-einschränkenden Weise veranschaulichen.

BEISPIEL 1

Chromosomen-Präparat zur Messung

Die Entwicklung der Mehrfarb-FISH hat die Anwendungen der molekularen Cytogenetic in der Grundlagenforschung und der Gendiagnose erweitert. Bei sämtlichen gängigen Mehrfarb-FISH-Techniken müssen fluoreszierende Sonden verwendet werden, deren Emissionsspektren sich mit optischen Filtern auflösen lassen [Ried et al., (1992) Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy. Proc. Natl. Acad. Bei. USA 89, 1388-1392; und Ried (Jan. 1994) Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung in der genetischen Diagnostik, Fakultät der theoretischen Medizin, Rupprechts-Karls-Universität Heidelberg, die jeweils als vollständig offenbart durch Bezugnahme hier aufgenommen sind].
Ein neuer Ansatz für FISH, der das SPECTRACUBE - System zur Messung und Analyse mehrerer spektral überlappender Sonden (einzeln und kombinatorisch) einsetzt, zur Klassifizierung von Chromosomen und daher zur Erfassung von Chromosomenaberrationen einsetzt, wurde vor kurzem vorgestellt [E. Schroeck et al. (1996) Multicolor spectral karyotyping of human Chromosomes. Science, 273, 494-497].
Gemäß diesem neuen Ansatz wird spektrale Bio- Bilderzeugung, eine Kombination aus Fourier-Spektroskopie, CCD-Bilderzeugung und Lichtmikroskopie, die die Messung genauer Spektraldaten simultan an sämtlichen Punkten einer biologichen Probe ermöglicht, zur Hybridisierung auf der Basis von Mehrfarben-Erscheinung sämtlicher (d. h. 24) Arten menschlicher Chromosomen und zur Erzeugung einer Farbkarte des menschlichen Karyotyps verwendet.
Der Durchschnittsfachmann weiß, dass sich viele verschiedene Sätze Fluorophore und Kombinationen davon zur spezifischen Markierung jedes der 24 Chromosomen des Menschen oder jeder Chromosomen einer anderen Tierart verwenden lassen. In diesem Beispiel wird ein Satz von fünf verschiedenen Farbstoffen verwendet, von denen Kombinationen von bis zu vier Farbstoffen zur jeweils unterschiedlichen Färbung der 24 menschlichen Chromosomen verwendet werden. Die Verwendung dieser Farbstoffe oder Kombinationen dient lediglich Veranschaulichungszwecken, und es ist nicht beabsichtigt, den Rahmen der Erfindung auf die Verwendung spezifischer Farbstoff und/oder Kombinationen davon einzuschränken.
Es folgt eine Beschreibung der z. Zt. verwendeten Farbstoffe und ihrer Kombinationen.
Somit wurden 24 Chromosomenfarben (1 bis 22, X und Y, Tabelle 1), jeweils mit einer anderen Kombination von vier oder weniger verschiedenen Fluorophoren, ausgewählt aus einem Satz von fünf Fluorophoren, gemäß dem kombinatorischen Hybridisierungs-Ansatz (a bis e, Tabelle 1) (siehe Tabelle 1 für die unterschiedlichen Fluorophore und ihre spektralen Eigenschaften und Tabelle 2 für die Zuordnung der in Tabelle 1 auf gelisteten Fluorophore, so dass man 24 Chromosomen färben erhält), zeitgleich mit menschlichen mitotischen Chromosomen-Spreitungen aus einigen nichtverwandten Männchen mit Blutzellen, hybridisiert, die zur Hybridisierung hergestellt wurden, und zwar im Wesentlichen wie beschrieben in Ried et al [Ried et al., (1992) Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy. Proc. Natl. Acad. Bei. USA 89, 1388-1392].
Die hybridisierten Chromosomen wurden durch ein Fluoreszenzumkehrmikroskop betrachtet, das mit dem SPECTRACUBE -System verbunden war, und das Emissionsspektrum für jeden Pixel wurde gemessen.
Der Durchschnittsfachmann weiß, dass andere Fluorophore, andere Fluorophorkombinationen und verschiedene Markierungsansätze (bspw. kombinatorisches Markieren) entsprechend verwendet werden können. Die Menge an Informationen in den Tabellen 1 und 2 dient lediglich der Veranschaulichung, und es ist nicht beabsichtigt, den Rahmen der Erfindung auf die aufgeführten Fluorophore, Fluorophor-Kombinationen und/oder Markierungstechniken einzuschränken.

TABELLE 1

Fluorophor Symbol
Spectrum-Orange a
Texas-Rot b
Cy5 ¹ c
Spektrum-Grün d
Cy5.5 ¹ e
1 von Amersham TABELLE 2

BEISPIEL 2

Vorrichtung zur Erfassung von den Pixeln zugehöriger Spektren

Fig. 1 ist ein Blockdiagramm, das die Hauptkomponenten eines Abbildungs-Spektrometers, offenbart in US-Patent 5 539 517, veranschaulicht, das als vollständig offenbart durch Bezugnahme hier aufgenommen ist. Das Bilderzeugungs- Spektrometer hat eine hohe spektrale (ca. 4-14 nm je nach Wellenlänge) und räumliche Auflösung (ca. 30/M um, wobei M die effektive Mikroskop- oder Objektiv-Vergrößerung ist).
Das Bilderzeugungs-Spektrometer des Standes der Technik von Fig. 1 umfasst: ein Sammeloptik-System, gewöhnlich als 20 bezeichnet; einen eindimensionalen Scanner, angegeben durch Block 22; einen OPD-Generator oder ein OPD-Interferometer (OPD = Lichtwegsdifferenz), angegeben durch Block 24; eine eindimensionale oder vorzugsweise zweidimensionale Detektoranordnung, angegeben durch Block 26; und einen Signalprozessor und Display, angegeben durch Block 28.
Ein entscheidendes Element in System 20 ist OPD- Generator oder -Interferometer 24, der oder das entsprechend einem vorbestimmten Satz linearer Kombinationen der Spektralintensität des von jedem Pixel emittierten Lichts der zu analysierenden Szenerie moduliertes Licht aussendet. Der Ausgang des Interferometers wird auf die Detektoranordnung 26 fokussiert. Somit werden sämtliche erforderlichen optischen Phasendifferenzen sämtlicher Pixel aus dem Sichtfeld gleichzeitig gescannt, damit sämtliche Informationen zur Rekonstruktion des Spektrums erhalten werden. Die Spektren sämtlicher Pixel in der Szenerie werden somit gleichzeitig mit der Bildinformation gesammelt, wodurch sich das Bild in Echtzeit analysieren lässt.
Die Vorrichtung gemäß US-Patent 5 539 517 lässt sich in einer großen Reihe von Konfigurationen handhaben. Das verwendete Interferometer lässt sich mit anderen Spiegeln, wie in den entsprechenden Figuren von US-Patent 5 539 517 beschrieben, kombinieren.
Gemäß US-Patent 5 539 517 lassen sich alternative Interferometertypen einsetzen. Diese umfassen (1) ein bewegliches Interferometer, bei dem die OPD derart variiert wird, dass das Licht moduliert wird, nämlich ein Fabry Perot-Interferometer mit gescannter Dicke; (2) ein Michelson-Interferometer, mit Strahlzerleger, der den Strahl von einen optischen Sammelsystem und einem Scanner erhält, und den Strahl in zwei Lichtwege zerlegt; (3) ein Sagnac-Interferometer, das gegebenenfalls mit anderen optischen Vorrichtungen kombiniert ist, worin die OPD mit dem Einfallswinkel der einfallenden Strahlung variiert, wie das Interferometer mit vier Spiegeln und Strahlzerleger, wie weiter beschrieben in der zitierten US-Patent- Anmeldung (siehe Fig. 14 dort).
Fig. 2 veranschaulicht ein gemäß US-Patent 5 539 517 konstruiertes Bildgebungs-Spektrometer mit einem Interferometer, bei dem die OPD mit dem Einfallswinkel der einfallenden Strahlung variiert. Ein in das Interferometer mit kleinem Winkel zur optischen Achse einfallender Strahl erfährt eine OPD, die sich im Wesentlichen linear mit diesem Winkel ändert.
Bei dem Interferometer von Fig. 2 wird sämtliche Strahlung aus Quelle 30 in sälmtlichen Pixeln nach der Kollimation durch ein optisches Sammelsystem 31 durch einen mechanischen Scanner 32 gescannt. Das Licht wird dann durch einen Strahlzerleger 33 zu einem ersten Reflektor 34 und dann zu einem zweiten Reflektor 35 geschickt, der das Licht zurück durch den Strahlzerleger 33 und dann durch eine Fokussierlinse 36 zu einer Anordnung von Detektoren 37 (bspw. eine CCD) reflektiert. Dieser Strahl interferiert mit dem Strahl, der von 33, dann von einem zweiten Reflektor 35 und schließlich vom ersten Reflektor 34 reflektiert wird.
Am Ende eines Scanvorgangs wurde jeder Pixels durch sämtliche OPD gemessen, und daher lässt sich das Spektrum jedes Pixels der Szenerie durch Fourier-Transformation rekonstruieren. Ein Strahl parallel zur optischen Achse wird kompensiert, und ein Strahl mit einem Winkel (θ) zur optischen Achse erfährt eine OPD, die eine Funktion der Dicke des Strahlzerlegers 33, seines Brechungsindexes und des Winkels θ ist. Die OPD ist für kleine Winkel proportional zu θ. Durch Anwenden einer geeigneten Inversion und durch sorgfältige Dokumentation lässt sich das Spektrum jedes Pixels berechnen.
In der Konfiguration von Fig. 2 geht der auf den Strahlzerleger in einem Winkel β (β = 45º in Fig. 2) einfallende Strahl durch das Interferometer mit einer OPD = 0, wohingegen ein in einem allgemeinen Winkel β - θ einfallender Strahl eine durch Gleichung 2 angegebene OPD erfährt.
(2) OPD(β, θ, t, n) = t[(n² - sin²(β + θ))0.5 - (n² - sin²(β - θ))0.5 + 2sinβsinθ]
wobei β der Einfallswinkel des Strahls am Strahlzerleger ist, θ die Winkelentfernung eines Strahls von der optischen Achse oder der Interferometer-Rotationswinkel bezüglich der Zentralposition ist; t die Dicke des Strahlzerlegers ist, und n der Brechungsindex des Strahlzerlegers ist.
Aus Gleichung 2 geht hervor, dass man durch Scannen positiver und negativer Winkel bezüglich der Zentralposition für jeden Pixel ein doppelseitiges Interferogramm erhält, das Phasenfehler eliminiert, wodurch man genauere Ergebnisse bei der Fourier-Transformation erhält. Die Scan-Amplitude bestimmt die maximale erreichte OPD, die mit der Spektralauflösung der Messung gekoppelt ist. Die Größe der Winkelschritte bestimmt den OPD-Schritt, der wiederum durch die kürzeste Wellenlänge bestimmt wird, für die das System empfindlich ist. Gemäß dem Probennahme- Theorem [siehe Chamberlain (1979) The principles of interferometric spectroscopy, John Wiley and Sons, S. 53-55] muss dieser OPD-Schritt kleiner als die halbe kürzeste Wellenlänge sein, für die das System empfindlich ist.
Ein weiterer Parameter, der berücksichtigt werden muss, ist die endliche Größe eines Detektorelementes in der Matrix. Über die Fokussieroptiken begrenzt das Element eine endliche OPD im Interferometer, das das Interferogramm mit einer rechtwinkligen Funktion faltet. Dies reduziert folglich die Systemempfindlichkeit bei kurzen Wellenlängen, die für Wellenlängen gleich oder unter der von dem Element begrenzten OPD auf Null sinkt. Aus diesem Grund muss man sicherstellen, dass die Bedingung der Modulations-Transfer-Funktion (MTF) erfüllt ist, d. h. dass die von einem Detektorelement im Interferometer begrenzte OPD kleiner als die kürzeste Wellenlänge sein muss, bei der das Gerät empfindlich ist.
Bilderzeugungsspektrometer, die gemäß der Erfindung von US-Patent 5 539 517 konstruiert wurden, messen nicht bloß die Lichtintensität, die aus jedem Pixel in dem Sichtfeld stammt, sondern messen auch das Spektrum jedes Pixels in einem vordefinierten Wellenlängenbereich. Sie nutzen zudem sämtliche Strahlung, die von jedem Pixel im Sichtfeld zu einem bestimmten Zeitpunkt emittiert wird, besser und ermöglichen somit, wie vorstehend erläutert, eine signifikante Abnahme der Bildaufnahmezeit und/oder einen signifikanten Anstieg der Empfindlichkeit des Spektrometers. Diese Bilderzeugungsspektrometer umfassen verschiedene Arten Interferometer und optische Sammel- und Fokussiersysteme, und sie können daher bei einer Reihe von Anwendungen verwendet werden, einschließlich medizinischer Diagnose- und Therapie- und Bioforschungs-Anwendungen, sowie als Fernerfassung für geologische und landwirtschaftliche Untersuchungen, und dergleichen.
Ein Bilderzeugungsspektrometer gemäß der Erfindung in US 5 539 517 wurde von Applied Spectral Imaging Ltd. Industrial Park, Migdal Haemek, Israel entwickelt, und wird hier als SPECTRACUBE bezeichnet.
Das optisch mit einem Fluoreszenzmikroskop verbundene SPECTRACUBE -System, wurde zur Sammlung von Spektraldaten aus gefärbten Chromosomenproben verwendet, wobei die Daten hier erfindungsgemäß analysiert wurden, was die Anwendbarkeit und die Einsatzfähigkeit des Verfahrens aufzeigt. Der spezifische Spektralbilderzeuger ist das SPECTRACUBE - System, das die in Tabelle 3 nachstehend aufgeführten Eigenschaften besitzt:

TABELLE 3

Eigenschaft Leistung
räumliche Auflösung 30/M um (M = effektive Mikroskop- oder Objektiv-Vergrößerung)
Sichtfeld 8/M Millimeter
Empfindlichkeit 20 milliLux (für 100 msec Integrationszeit, steigt bei längeren Intergrationszeiten linear mit T)
Spektralbereich 400 bis 1000 nm
Spektralauflösung 4 nm bei 400 nm (16 nm bei 800 nm)
Aufnahmezeit 5 bis 50 sec, gew. 25 sec
FFT-Verarbeitungszeit 20 bis 180 sec, gew. 60 sec
Das SPECTRACUBE -System des Standes der Technik wurde somit zur Erfassung von Spektraldaten jedes Pixels der in situ gefärbten Metaphase-Chromosomen wie vorstehend beschrieben verwendet. Diese Daten testeten die Betriebsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Simulation von Emissionsfiltern, wie nachstehend beschrieben.

BEISPIEL 3

Simulation des erfindungsgemäßen Verfahrens mit mathematischen Breitbandfiltern zur Chromosomen-Klassifizierung

Beim kombinatorischen Färben wird das genetische Material jedes Chromosoms mit komplementären DNA-Strängen hybridisiert, die mit einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren markiert wurden, die für dieses bestimmte Chromosom spezifisch sind. Zur Erfassung und Identifizierung der 24 verschiedenen Chromosomen des menschlichen Genoms wurde ein Schema (siehe Beispiel 1 oben), bei dem die Kombinationen von 1 bis 4 von 5 speziell ausgewählten Fluorophoren stammen. Es ist jedoch ersichtlich, dass sich im Prinzip andere ähnliche Schemata verwenden lassen.
Folglich emittiert ein Pixel einer Metaphase ein Fluoreszenzspektrum, das davon abhängt, ob dieser Pixel mit dem Hintergrund zusammenhängt (ein beliebiger Bereich zwischen den Chromosomen) oder mit genetischem Material von einem spezifischen Chromosom. Das theoretische Hintergrundsignal sollte Null sein. In der Praxis wird man aufgrund der Streuung der Metaphase-Chromosomen und zudem aufgrund des restlichen Nukleinsäurematerials, ein niedriges Signal auch vom Hintergrund messen.
Zur Ermöglichung der Pixel-Einordnung wird hier Linearität angenommen. Gemäß der linearen Voraussetzung ist das Spektrum jedes Pixels die Summe der Spektren aller Fluorophore in diesem Pixel.
Das Fluoreszenzsignal Rij eines Pixels in einem Chromosom oder in einem Bereich der Probe, die mit einem einzelnen Fluorophor "i" gefärbt wurde, wie sie durch die Anregungs- und Emissionsfilter gemessen wurden, die mit dem Fluorophor "j" assoziiert sind, ist durch Gleichung 3 angegeben:
wobei Ni die Anzahl der Fluoreszenzmoleküle ist, die in einem Pixel eines Chromosoms zugegen sind, das nur mit Farbstoff-Nummer i gefärbt wurde, u und λ, die Wellenlängen-Domänen der Anregung bzw. Emission sind, Si das Anregungsspektrum des Farbstoff Nr. "j" ist: dieses Spektrum umfasst die Beiträge des Spektrums der Quelle selbst und die Spektraltransmission des Anregungsfilters, der zu "j" passt, Oi das Produkt der Spektraltransmission des Mikroskops, des Emissionsfilters für Fluorophor "j", der Spektralreaktion des CCD-Detektors und von einer beliebigen anderen Optik im Emissionsweg ist, Qi (λ, u) die Quantenaus beute von Fluorophor i bei der Wellenlänge λ aufgrund der Anregungsintensität bei Wellenlänge u ist. Die Funktion Qi (λ, u) wird gewöhnlich als Produkt von zwei gesonderten Funktionen angenommen: eines Anregungsspektrums Qix(u) und eines Emissionsspektrums Qie(λ), wobei λ und u in ihrem jeweiligen Bereich variieren.
Man beachte, dass keine. Annahmen bezüglich der Spektralbreite und Wellenlängenabhängigkeit der Transmission von einem der Filter und/oder bezüglich der Überlappung zwischen den Signalen unterschiedlicher Farbstoffe, die beim kombinatorischen Färben verwendet wurden, gemacht wurden.
Ein Ausdruck analog zu Gleichung 3 lässt sich im Allgemeinen für jeden Pixel schreiben, der zu einem Chromosom oder Probenbereich gehört, der mit n Farbstoffen gefärbt wurde, und das Gesamt-Fluoreszenzspektrum Fp, gemessen in diesem Pixel durch Anregungs- und Emissionsfilter, die zu Farbstoff Nummer "j" passen, lässt sich unter der Annahme von Linearität schreiben als Summe aller Beiträge sämtlicher vorhandener Farbstoffe, die jeweils gewichtet werden durch ni/Ni, der relativen Anzahl Moleküle, die von jedem Farbstoff im fraglichen Pixel zugegen sind. Für ein Pixel p auf einem Chromosom, das mit mehr als einem Farbstoff 1 bis n gefärbt wurde, lässt sich das Signal Fpj, gemessen durch das Anregungs-Emissions- Filterpaar "j", folgendermaßen ausdrücken (Gleichung 4)
wobei n die Anzahl der bei der Markierung verwendeten Farben ist (n gleich 5 im vorliegenden Beispiel) und der Ausdruck Rij aus Gleichung 3 oben verwendet wird.
Sind Chromosomen, die nur mit einem Farbstoff gefärbt werden, in der Metaphase bekannt, dann sind die Signale Rij dieser Chromosomen die bekannten Koeffizienten des linearen Satzes Gleichungen, die durch Gleichung 4 ausgedrückt werden. Fpj sind aus der Messung bekannt, daher sind in diesem Satz ni/Ni die Unbekannten. Ist der Satz der Koeffizienten Rij unabhängig, lässt sich der Satz der linearen Gleichungen von Gleichung 4 für ni/Ni lösen.
Bei einer anderen Ausführungsform sind die Bezugsspektren Rij aus früheren Messungen bekannt und werden in einer Computerbank gespeichert. Dies lässt sich bspw. erzielen durch einen Satz Messungen, in denen nur einzelne Chromosomen mit nur einem Farbstoff auf einmal hybridisiert werden. In diesem Fall werden bessere Ergebnisse erhalten, da die nicht-spezifische Hybridisierung ungewünschter Chromosomen in den Bezugsspektren vermieden wird.
Im Idealfall sind die Parameter ni und Ni (i = 1, . . . n) in jedem Teil des Chromosoms, der gleichmäßig gefärbt ist, konstant. In der Praxis ändert sich ihr Wert etwas aufgrund der biologischen Variabilität, Messungsrauschen und anderen unkontrollierbaren Faktoren von Pixel zu Pixel. Sie werden der Einfachheit halber für die nachstehende Beschreibung als konstant angenommen. Abweichungen von der Gleichmäßigkeit werden als solche als Messrauschen behandelt.
Es wurde überdies hervorgehoben, dass idealerweise in einem Pixel eines mit einem einzelnen Farbstoff, bspw. Farbstoff i, gefärbten Chromosoms, Ni nicht Null ist, wohingegen Ni = 0 für j ≠ i. In einem Pixel eines Chromosoms, das mit einer Kombination von zwei Farbstoffen, bspw. k und m, gefärbt wurde, sind nk und nm nicht Null, wohingegen sämtliche anderen Koeffizienten idealerweise Null sind. Eine ähnliche Situation existiert für die Kombination von drei oder vier Farbstoffen. Dies ist die Grundlage für die erfindungsgemäße Einordnung der Pixel in Pixelgruppen.
Nach dem Lösen des linearen Gleichungssatzes, dargestellt durch Gleichung 4 oben, für einen bestimmten Pixel, werden die für verschiedene Farbstoffe erhaltenen Verhältnisse ni/Ni untersucht. Da das Färbeschema für jedes beliebige Chromosom bekannt ist, wird der Pixel dem einen oder anderen Chromosom zugeordnet, und zwar je nachdem welche der Kombinationen ni/Ni nicht Null sind. Der Satz der Verhältnisse ni/Ni ist daher der Pixel-Klassifizierer.
In der Praxis sind natürlich die Koeffizienten, die theoretisch Null sein sollten, nicht genau Null, und zwar wegen des Messrauschens, der biologischen Variabilität, Streuung nahegelegener Chromosomen, Hintergrundemission, nichtspezifischen Hybridisierung, usw. Diese Störungen lassen sich nicht vermeiden und sollten in jeder spezifischen Anwendung gesondert behandelt werden.
Im Fall der Metaphasen-Analyse reicht bspw. ein bestimmtes Vorwissen über die Form der Chromosomenanomalien, wie Translokationen und Insertionen, wie es durch das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung gefunden wird, aus, damit man die meisten Falschauslegungen aufgrund von Rauschen ausschließt. All diese Eigenschaften kreuzen das Chromosom rechtwinklig zur Längsachse. Somit wird ein Chromosomenmerkmal, das anders als sein umgebender Bereich klassifiziert wurde, jedoch nicht dieses Kriterium erfüllt, als Chromosomenanomalie verworfen und auf Messrauschen zurückgeführt.
Im Falle der Chromosomenklassifizierung ist der erste Schritt die Hybridisierung und Markierung der analysierten Metaphase mit einem bekannten Farbkombinationsschema, wie bspw. unter Beispiel 1 oben beschrieben.
Der zweite Schritt ist die nacheinander erfolgende Abbildung und Aufzeichnung der Metaphase oder der Probe mit einer Digitalvideokamera durch jedes der Filterpaare (eines für Anregung und eines für Emission). Die Filter sind so ausgelegt und hergestellt, dass ihr Spektral-transmissionskurvenverlauf bzw. -profil den Eigenschaften der Farbstoffe jeweils entspricht. Daher besteht eine Messung aus einem Stapel von n Bildern, und zwar eines für jeden Verwendeten Farbstoff, und die Daten für jeden Pixel sind ein Vektor mit n Abmessungen.
Der dritte Schritt ist die Analyse der Daten und die Zuordnung jedes Pixels des Bildes zu einem Chromosom oder Hintergrund. Die Signale der Chromosomen, die mit einem einzelnen Farbstoff gefärbt werden, oder die vorher gespeicherten einzelnen Farbspektren sind die Koeffizienten Rij des Satzes Gleichungen, die durch Gleichung 4 oben dargestellt werden, da für die Chromosomen, die mit "i" gefärbt wurden, ni/Ni = 1 gilt, und ansonsten gleich Null ist.
Zur Minderung der Wirkung unspezifischer Färbung bei der Definition der Bezugsdaten, lassen sich die Einzelfarbstoff-Chromosomen gesondert hybridisieren und messen. Anschließend lassen sich ihre jeweiligen n-Vektoren auch als Bezugsvektoren in Gleichung 4 mit den gleichen Koeffizienten verwenden: dieses Verfahren ergibt bessere Ergebnisse.
Somit werden erfindungsgemäß für jeden Pixel p n Signale gemessen, und zwar einen für jeden Satz Filter, und sein n-dimensionaler Vektor wird bestimmt. Da es n Elemente in der Summe von Gleichung 4 gibt, werden für jeden Pixel ein Satz von n Gleichungen mit n Unbekannten erhalten, nämlich die Verhältnisse ni/Ni (i = 1, . . . n). Diese Gleichungen lassen sich lösen und die Verhältnisse ni/Ni können dann gefunden werden.
Jeder Pixel kann nun identifiziert werden, da der Satz der Verhältnisse ni/Ni aus dem Markierungsschema für jedes Chromosom bekannt ist. Somit hat ein Chromosom, das mit einem einzigen Farbstoff gefärbt wurde, ein Verhältnis ni/Ni gleich 1, und die anderen sind gleich Null. Bei einem Chromosom, das mit einer Kombination aus zwei Farbstoffen gefärbt wurde, sind zwei Verhältnisse ungefähr gleich ¹/&sub2; und die anderen sind gleich Null. Ein Chromosom, das mit einer Kombination aus drei Farbstoffen gefärbt wurde, sind drei Verhältnisse etwa gleich 1/3, und die anderen sind gleich Null usw.
Mit bekanntem Markierungsschema kann man bestimmen, zu welchem Chromosom ein Pixel gehört, und zwar aus den Werten der Verhältnisse, die für diesen Pixel erhalten werden. Daher stellt jeder Pixel genetisches Material eines bestimmten Chromosoms dar.
Es folgt eine Zusammenfassung der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemachten Vorraussetzungen: (i) Linearität der Signale; (ii) Gleichmäßigkeit der Färbung in jedem Chromosom; (iii) Vorwissen über das Spektrum der Chromosomen, die nur mit einem Farbstoff gefärbt werden; (iv) Wissen über das Farbkombinationsschema für sämtliche Chromosomen; und (v) Unabhängigkeit der Gleichungen des Satzes der Gleichung 4. Bei jeder anderen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gelten die obigen Annahmen, außer, dass (ii) und (iv) keine Chromosomen betreffen, sondern zu klassifizierende Pixelbereiche.
Es folgt ein Beispiel für eine Chromosomenklassifizierung, die durch Simulation des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde.
Dieses Beispiel ist als Simulation auf der Basis der Spektraldaten gegeben, die aus einem Spektralwürfel einer kombinatorisch hybridisierten und markierten Metaphase erhalten wurde, gemessen mit dem Spectral Imager Modell SD 200, hergestellt von Applied Spectral Imaging Ltd. Migdal Haemek, Israel (siehe Beispiel 2 oben für die Beschreibung und den Betrieb des eingesetzten Spektralbilderzeugers).
Der Spektralwürfel enthält vollständige Fluoreszenzspektren im Bereich von 470 bis 800 nm. Die Messung dieser Spektren, die mit den erfindungsgemäßen Breitbandemissionsfiltern erhalten würden, wird nachstehend durch mathematische oder algorithmische Filter simuliert. Diese Filter stellen daher Emissionsfilter dar, wohingegen die Verwendung von Anregungsfiltern nicht simuliert wird.
Beim vorliegenden Beispiel wurden die mathematischen Filter als quadratische Fenster selektiert, mit denen die emittierten Spektren gefaltet werden, so dass die Messung jedes Pixels durch einen Filter einfach als Integral des Pixelspektrums im Filtertransmissionsbereich simuliert wird. Diese Art mathematischer Filter ist äquivalent zu einem Breitbandpassfilter mit konstanter Transmission, dessen Band gleich 100% ist und außerhalb des Bandes gleich Null ist. In der Praxis lässt sich ein solcher Filter von kommerziellen Herstellern erhalten, und der Fachmann weiß, dass der genaue Spektralbereich der. Filter (quadratisch oder nicht) für die Betriebsfähigkeit der Erfindung überhaupt nicht wichtig ist.
Die Fig. 4a-b zeigen die Anregungs- und Emissionsspektren der fünf Farbstoffe (SPECTRUM-GRÜN, SPECTRUM- ORANGE, Texas Rot, Cy5 und Cy5.5), die in diesem Beispiel verwenden werden. Die genauen Filterbereiche sollten für die besten Ergebnisse experimentell optimiert werden. In dieser Simulation wurden sie so ausgewählt, dass sie mit den entsprechenden Spektren etwa übereinstimmten und 50- 80% der Photonen einfingen. Einer der geeigneten Vorteile der Erfindung ist, dass die Ergebnisse im Prinzip nicht empfindlich für die genaue Spektralform der Filter sind. Dadurch wird ihre Herstellung vereinfacht.
Die Tabelle 4 stellt ein Beispiel für Breitband- Anregungs- und Emissions-Filter bereit, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwenden lassen. Die Bereiche dieser Filter sind ebenfalls in den Fig. 4a und 4b gezeigt, zusammen mit den Anregungs- und Emissionsspektren der eingesetzten Farbstoffe. Die in Tabelle 4 aufgeführten Emissionsfilter wurden zur Simulation des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet. TABELLE 4
* Anregungsfilter wurden nicht in der Simulation eingesetzt.
Die Fig. 5a-b zeigen partielle Metaphasen, die zur Analyse hergestellt wurden, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, wobei die nachstehenden fünf Farbstoffe verwen det wurden: SPEKTRUM-GRÜN, SPEKTRUM-ORANGE, Texas Rot, Cy5 und Cy5.5.
In der partiellen Metaphase von Fig. 5a, die von einer normalen weiblichen Person stammt, sind 5 Chromosomen einfach gefärbt, und zwar je eins mit einem Farbstoff, 5 Chromosomen sind doppelt gefärbt und ein Chromosomen ist vierfach gefärbt. Die Tabelle 5 bietet ein Markierungsschema für jedes der in Fig. 5a gezeigten Chromosomen. TABELLE 5
In der partiellen Metaphase von Fig. 5b, die von einer männlichen Person mit einer 16-9-Translokation stammt, sind 5 Chromosomen einfach gefärbt, und zwar je eins mit einem Farbstoff, 9 Chromosomen sind doppelt gefärbt, 6 Chromosomen sind dreifach gefärbt und 1 Chromosom ist vierfach gefärbt. Die Tabelle 6 zeigt das Markierungsschema für jedes der in Fig. 5b gezeigten Chromosomen. TABELLE 6
Man beachte, dass die tatsächliche Metaphasenmessung die der Simulation gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vorangeht, ohne Verwendung von Anregungs- und/oder Emissionsfiltern durchgeführt wurde, welche mit einem der Farbstoffe, wie im erfindungsgemäßen Zusammenhang beschrieben, assoziiert sind.
Der tatsächlich eingesetzte Filter war ein herkömmlicher Dreifach-dichroitischer Filterwürfel (zur Anregung und Emission) wie beschrieben bspw. in E. Schroeck et al. (1996) Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science 273, 494-497. Als direktes Ergebnis konnte das Vorliegen von Breitband-Anregungsfiltern nicht simuliert werden.
Diese Tatsache hat zwei Auswirkungen auf die Ergebnisse der Simulation.
Erstens konnten die erwarteten optimalen Ergebnisse nicht erhalten werden, da die Zugabe von Anregungsfiltern, wenn sie korrekt ausgewählt werden, nur die Spezifität der Signale verbessern kann, die von jedem Farbstoff erhalten werden, da das Anregungsspektrum jedes Farbstoffs bei der Verwendung dieser Filter gegenüber den anderen etwas verschoben ist.
Zweitens hatten einige der gemessenen Chromosomen, die hier nicht gezeigt sind, viele Pixel, die nach der Simulation wegen des vorstehend genannten Grundes nicht korrekt identifiziert werden konnten.
Der Fachmann geht jedoch davon aus, dass ein relativ kleiner Anstieg des Signals eines Farbstoffs, bspw. aufgrund der Zugabe seines entsprechenden Anregungsfilters im Lichtweg diesen Effekt korrigiert.
Der Chromosomen-Klassifikationsansatz der Erfindung wie er hier beschrieben wird, kann für eine Reihe von Anwendungen eingesetzt werden, von denen einige nachstehend erläutert werden. Es folgt eine kurze Zusammenfassung wahrscheinlicher Anwendungen des erfindungsgemäßen Klassifikationsansatzes auf dem Gebiet der molekularen Cytogenetik. Zwei Hauptgebiete der Cytogenetik, in denen der erfindungsgemäße Klassifikationsansatz eine vergleichbare Auswirkung mit besonderer Hervorhebung auf diagnostische Anwendungen hat, sind; (i) klinische Cytogenetik und (ii) Tumor-Cytogenetik.
Erstens kann der erfindungsgemäße Klassifikationsansatz für Diagnosezwecke verwendet werden, damit man Chromosomenaberrationen bspw. in krebsbefallenen Zellen, fötalen Zellen, usw. auf ähnliche Weise, wie in der US- Patentanmeldung 08/635820 beschrieben, nachweist. Etwa 400000 Fälle sowohl bei der klinischen als auch der Krebs- Zytogenetik werden jedes Jahr allein in den Vereinigten Staaten analysiert, wobei eine herkömmliche Chromosomen- Bandenfärbungstechnik verwendet wird. Die Chromosomenfärbung mit dem erfindungsgemäßen Klassifizierungsansatz lässt sich zusätzlich zur herkömmlichen Bandenfärbungsanalyse durchführen und hilft bei der Identifikation von Marker-Chromosomen, die nicht mit einer herkömmlichen Bandenfärbung allein charakterisiert werden können. Erworbene Chromosomenaberrationen sind vorwiegend mit malignen Transformationen assoziiert. Es lassen sich grob zwei Malignitäten erkennen: (i) hämatologische Malignitäten und (ii) feste Tumore. Da sich die Zellen aus hämatologischen Malignitäten leicht in vitro züchten lassen, ist die Chromosomen-Bandenfärbungsanalyse dieser Tumore eine der Erfolgsgeschichten in der cytogenetischen und genetischen Krebsforschung. Zwei gut bekannte Beispiele umfassen die Identifizierung des Philadelphia-Chromosoms bei der chronischen lymphatischen Leukämie (CHL) und eine spezifische Chromosomenaberration in Burkitt-Lymphomen. Viele weitere tumorspezifische Chromosomenaberrationen wurden in hämatologischen Malignitäten im letzten Jahrzehnt beschrieben und werden als Diagnose- und Forschungswerkzeug verwendet. In vielen Fällen ermöglichte die Beschreibung einer rezidivierenden Chromosomenaberration die Identifikation der Mechanik maligner Transformation auf molekularer Ebene. Leider ist wenig bekannt auf dem Gebiet fester Tumore (wie Brust, Kolon-, Lungen- und anderen Tumoren). Diese Diskrepanz ist um so störender, als feste Tumore eine viel höhere Rolle bei der menschlichen Morbidität als hämatologische Malignitäten spielen. Die Diskrepanz beruht wahrscheinlich auf technischen Schwierigkeiten, die bei der Cytogenetik fester Tumore üblich sind. Feste Tumorzellen lassen sich oft schwierig züchten, die Chromosomen- Präparate sind qualitativ schlecht, verhindern eine Hochauflösungs-Cytogenetik-Analyse, und sekundäre Chromosomenaberrationen, nicht nötigerweise mit Tumorbeginn und -fortschritt verwandt, sind ein gemeinsames Merkmal dieser Tumore. Die Verfügbarkeit eines Chromosomen-Screeningtests auf Hybridisierungsbasis (d. h. Chromosomen-Färbung) füllt eine methodische Lücke, und wird wie vorstehend beschrie ben verzweifelt gesucht. Hierbei hilft teilweise eine vergleichende genomische Hybridisierung. Eine strukturelle Chromosomenaberration kann jedoch nicht erfasst werden und zeigt immer einen Durchschnitt der Chromosomenaberrationen in einem Zellgemisch. Sehr wahrscheinlich lässt sich vorhersagen, dass eine Karyotyp-Bestimmung auf Hybridisierungs-Basis ein weitverbreitetes Verfahren zur Bestimmung rezidivierender Chromosomenaberrationen bei festen Tumoren wird, und zwar sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Labordiagnostik.
Zweitens lässt sich der erfindungsgemäße Klassifikationsansatz für eine vergleichende Cytogenetik verwenden [siehe J. Weinberg und R. Stanyon (1995) Current Opinion in genetics and development 5, 792-797], und zwar ähnlich wie in US-Patent-Anmeldung Nr. 08/635 820 beschrieben, so dass man Chromosomen-Umlagerungen erfasst und sichtbar macht, die die Chromosomen-Morphologie in der Entwicklung änderten. Bei der Untersuchung entwicklungsgeschichtlich verwandter Arten und bei der Untersuchung von Modellsystemen (bspw. Maus als Modellsystem für Mensch) muss man in vielen Fällen vergleichende Genomkarten gewinnen, in denen die Chromosomen von zwei oder mehr Arten gemäß ihrer Sequenzähnlichkeiten und somit ihrer aus dem Chromosom stammenden genetischen Information untereinander aufgelistet sind. Der Einsatz des erfindungsgemäßen Klassifikationsansatzes erleichtert die Gewinnung dieser vergleichenden Karten. Man berücksichtige bspw. die Herstellung einer Vergleichskarte zwischen Mensch-Maus oder Mensch-Affe. Für diesen Zweck muss ein kompletter Satz angefärbter Chromosomen einer Art (bspw. Mensch) gleichzeitig mit Chromosomenspreitungen der anderen Art hybridisiert werden (Maus oder Affe in dem gegebenen Beispiel) und wie vorstehend beschrieben klassifiziert werden. Das Ergebnis ist ein Bild des Maus-Karyotyps, der mit den menschlichen Chromosomenfarben gefärbt wurde. Somit lassen sich die Karyotypen der beiden Arten einem Alignment unterwerfen.
Drittens lässt sich der erfindungsgemäße Klassifizierungsansatz auf Zellen in der Interphase, Mitose oder Meiose anwenden. Dieser Klassifizierungsansatz lässt sich zur Erfassung dreidimensionaler Interphase-Chromosomenanordnungen verwenden. Bisher ist wenig bekannt über die Chromosomenanordnung in der Interphase, jedoch lässt sich sehr wahrscheinlich schließen, dass Änderungen in der Chromosomenorganisation während der Interphase in malignen Zellen auftreten. Der erfindungsgemäße Klassifizierungsansatz kann somit für die frühe Erfassung verschiedener Malignitäten sehr wertvoll sein, und die Stufe einer malignen Erkrankung definieren, und somit eine Behandlung untersuchter Patienten besser einstellen, usw. Man beachte, dass das erfindungsgemäße Klassifizierungsverfahren in Kombination mit einer dreidimensionalen Rekonstruktionsvorrichtung (bspw. einem konfokalen Mikroskop) verwendet werden kann, zur Gewinnung von Information über den dreidimensionalen Aufbau der Chromosomen-Organisation in der Interphase, Mitose oder Meiose.
Viertens werden viele Krebserkrankungen und genetische Störungen durch Chromosomendeletionen, Translokationen und andere Umlagerungen und umfassende Anomalien (bspw. Genamplifikation) charakterisiert. Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Klassifizierungsansatzes lassen sich diese Anomalien im verstärkten Maße erfassen.
Fünftens geht eine der allgemeinen Chromosomenaberrationen mit Down-Syndrom einher. Man weiß seit langem, dass das Down-Syndrom mit einer Trisomie des Chromosoms 21 einhergeht. Eine genauere Untersuchung ergab, dass ein bestimmter Bereich von Chromosom 21 (21q22) immer mit diesem allgemeinen Syndrom einhergeht (d. h. in Trisomie erscheint). In einigen Fällen ist der Karyotyp von Individuen mit Down-Syndrom anscheinend normal, wie durch herkömmliche G- oder R-Bandenfärbungstechniken bestimmt wurde. Die weithin akzeptierte Erklärung für dieses Phänomen ist, dass in diesen Fällen die Trisomie ein Fragment betrifft, das von der 21q22-Region stammt. Dieses Fragment ist klein und unter der Auflösung herkömmlicher Bandenfärbungstechniken. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Klassifizierungsverfahrens ermöglicht die Erfassung dieser bisher nicht nachweisbaren Chromosom-21-Trisomien in Embryozellen, die bspw. über eine Chorionzottenanalyse erhalten wurden, und ermöglicht, dass Hochrisiko-Frauen besser genetisch beraten werden. Chromosom 13 und Chromosom 18 oder deren Fragmente können ebenfalls von einer Trisomie betroffen sein, was zur Geburt absolut anormaler Kinder führt. Das erfindungsgemäße Klassifizierungsverfahren lässt sich entsprechend zur Pränataldiagnose dieser verheerenden Trisomien von Chromosom 13 oder 18 verwenden.
Sechstens ist das erfindungsgemäße Klassifizierungsverfahren kombiniert mit der sich schnell entwickelnden Technik zur Trennung von Embryozellen aus peripherem Blut schwangerer Frauen sehr wertvoll für risikoarme Pränatal- Karyotypbestimmung zur Erfassung von Trisomien des Chromosoms 21 und anderen weniger häufigen Chromosomenanomalien.
Siebtens lässt sich das erfindungsgemäße Klassifizierungsverfahren zur Erzeugung eines Mehrfarb-Bandenfärbungsmusters von Chromosomen verwenden (d. h. Strichcode, Mehrfarb-Banden-Karyotyp). Einzelheiten bezüglich Chromosomen-Strichcodierung sind beschrieben von C. Lengauer et al. (1993) Hum. Molec. Genet. 5, 505-512. Das erste Ziel des Humangenom-Projekts (HGP) ist fast erreicht. Dieses Ziel ist die Erzeugung einer physikalischen Karte des menschlichen Genoms. Der Begriff physikalische Karte betrifft die Klonierung des gesamten Genoms in große Einsatz-Vektoren, wie YAC-Klone oder BAC-Klone, und die Kartierung dieser Klone mittels genetischer, cytogenetischer und physikalischer Kartierung. Zwei Hauptquellen menschlicher DNA wurden für dieses Unterfangen verwendet, und zwar Strahlungs-Hybridzelllinien und YAC-Contigs, die überlappende Klone für sämtliche menschlichen Chromosomen enthalten. Die Fertigstellung dieser Karte ermöglicht für nahezu jeden Bereich im Genom die Gewinnung spezifischer Klone, die zur Identifizierung von Genen erforderlich sind, welche an vererbten oder erworbenen genetischen Erkrankungen einschließlich Krebs ursächlich beteiligt sind. Durch Kombination von FISH mit multiplen YAC- oder BAC-Klonen oder Strahlungs-Hybriden und Spektralbilderzeu gung lässt sich ein Mehrfarb-Bandenfärbungsmuster für sämtliche menschlichen Chromosomen erzeugen, die die genetische und die cytogenetische Karte schließlich verknüpfen. Hier sei bspw. die Verwendung einer Stahlungs- Hybrid-Gruppe genannt (Stanford-Gruppe) [siehe Barret, J. H. (1992) Genetic mapping based on Radiation Hybrids. Genomics 13, 95-103] Jede Einzelgruppe der Stanfordgruppe enthält einen Satz DNA-Fragmente mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von ca. 5000 kbp. Jede Einzelgruppe deckt ca. 20% des menschlichen Genoms ab. Die Cohybridisierung fluoreszierender Sonden, die von 5 dieser Gruppen stammen, ergeben somit eine Abdeckung eines Großteils des Genoms und somit die Markierung sämtlicher menschlicher Chromosomen. Die Fragmente sind jedoch zufällig in den Einzelgruppen verteilt. Die Anzahl der Gruppen, die für eine vollständige Abdeckung des menschlichen Genoms nötig sind, ist höher (bspw. 6-10 Gruppen). In der nachstehenden Beschreibung wird angenommen, dass 5 Einzelgruppen verwendet werden. Die Chromosomenfragmente jeder Gruppe werden markiert mit einem anderen Fluorophor (oder einer anderen Kombination von Fluorophoren, bspw. kombinatorische Markierungs- oder Hybridisierungs-Strategien) bspw. durch direktes Einbringen von dUTP-konjugierten Fluorophoren mit Primern, die von eingestreuten repetitiven Sequenzen stammen (IRS, bspw. Alu-Sequenzen) in einem Verfahren des Standes der Technik, wie IRS-PCR-Ansatz, bspw. Alu-PCR, welche eine ausschließliche Amplifizierung und Markierung von nur menschlichen Sequenzen garantiert. Soll die DMA einer anderen Art als Mensch amplifiziert und/oder markiert werden, muss eine artenspezifische eingestreute repetitive Sequenz (IRS), die das Genom dieser Art charakterisiert, zur Herleitung geeigneter PCR-Primer verwendet werden. Eine einzelne gesonderte Hybridisierung eines der Einzelpanele ergibt ein Bandenmuster einer Chromosomenspreitung in einer Farbe, wobei etwa 20% des Genoms abgedeckt werden, mit einer durchschnittlichen Bandengröße von 5000 kbp. Aufgrund der zufälligen Überlappung einzelner Chromosomenfragmente in den 5 Hybridgruppen ergibt die Cohybridisierung von 5 unterschiedlich markierten Gruppen (jede Gruppe ist durch eine einzelne Gruppe dargestellt) von Fragmenten, ein Bandenmuster, bei dem es Banden mit reinen Farben gibt und Banden mit einer Kombination aus jeweils zwei, drei, vier sowie fünf Farben. Dies ergibt zusammen 31 mögliche Farbkombinationen, die sich durch Spektralbilderzeugung voneinander unterscheiden lassen. Zu diesem Zweck sollte ein Klassifizierungsvorverfahren ähnlich wie oben beschrieben durchgeführt werden, damit man in dem gegebenen Beispiel 31 unterschiedliche Vektoren mit N Abmessungen erhält, und zwar jeweils einen für die 31 Farbkombinationen. Die Klassifizierung neuer Proben lässt sich dann im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben durchführen. Die Beschreibung von 31 Farbkombinationen dient auf jeden Fall lediglich Veranschaulichungszwecken. Es ist klar, dass sich jede andere Zahl von Kombinationen im Rahmen der Erfindung verwirklichen lässt. Die Erzeugung eines Mehrfarb-Hochauflösungs-Bandenmusters von Chromosomen hat folgende zwei eindeutige Vorteile gegenüber der Verwendung von Chromosomen-Färbesonden (d. h. Chromosomenfarben). Das Chromosomenfärben ist ein geeignetes Hilfsmittel zur Erfassung interschromosomaler Aberrationen, wie Translokation, oder homogen färbender Bereiche, sowie zusätzlichen Chromosomenmaterials, wie Markerchromosomen oder Minimal-Chromosomen. Intrachromosomale Aberrationen, wie Deletionen und Duplikationen werden nur dann erfasst, wenn die Größe der Aberrationen die Länge der Chromosomen beeinflusst, wohingegen Chromosomen-Inversionen durch dieses Verfahren überhaupt nicht nachweisbar sind. Durch Verwendung eines Mehrfarb-Bandenmusters, lassen sich inter- sowie intrachromosomale Aberrationen diagnostizieren, weil sie die Sequenz der Chromosomenbanden beeinflussen. Ein Hauptvorteil der Mehrfarb-Hochauflösungs- Bandenmuster mit vorkartierten DNA-Fragmenten (bspw. YAC- Klonen und Strahlungshybrid-Zelllinien) ist die Möglichkeit zur Integration der genetischen und cytogenetischen Karte. Jede Mehrfarb-Bande ist durch einen spezifischen Satz von sequenz-markierten Stellen gekennzeichnet. Dies sind PCR-Produkte, die nur einmal im Genom vorkommen. Es folgt eine Beschreibung des Nutzens der integrierten cytogenetischen und genetischen Karte. Das Fehlen einer spezifischen Farbbande auf einem Chromosom von einer Tumorzelle zeigt eine Mikrodeletion, die oft den Verlust eines Tumorsuppressorgens wiederspiegelt. Das Wissen über Sequenz-Ziel-Zellen (STS's), die für diese Bande spezifisch sind, ermöglicht das Screening jeder großen Einsatzklon-Sammlung und die Gewinnung einer Anzahl spezifischer Klone, die höchstwahrscheinlich das in dem beschriebenen Beispiel deletierte Gen enthalten. Es sollte erwähnt werden, dass mit den momentan unternommenen Sequenzierungsansätzen im großen Maßstab und mit der Integration exprimierter Tagged-Stellen (Loci, die bekanntermaßen ein Gen enthalten) der Wert eines Mehrfarb-Bandenmusters auf Hybridisierungsbasis noch mehr steigt. Es ist ebenfalls denkbar, dass sich ein solches Mehrfarb- Bandenfärbungsmuster leicht automatisieren lässt. Trotz erheblicher Anstrengungen war die Automatisierung der Cytogenetik-Diagnose auf der Basis herkömmlicher Chromosomenbanden bisher nicht erfolgreich. Der vorstehend beschriebene Ansatz lässt sich nicht nur auf die Erzeugung eines Bandenmusters menschlicher Chromosomen sondern auch für andere Säugetier- (bspw. Maus) und Nichtsäuger-Arten anwenden. Dies ist besonders geeignet zur Analyse von menschlichen Erkrankungen, einschließlich Krebs, anhand von Tiermodellen. In Analogie zu dem für die Strahlungshybridgruppen beschriebenen Szenario kann ein Mehrfarb- Bandenmuster für alle menschlichen Chromosomen erzielt werden durch Cohybridisierung eines Satzes einzelner .großer Einsatzklone, wie YAC-Klone, P1-Klone, BAC-Klone oder je nach der gewünschten Auflösung, durch die Verwendung von Contigs (überlappende Klone) aus diesen Quellen. In weiterer Analogie zur Verwendung von Strahlungshybridgruppen lässt sich ein Mehrfarb-Bandenmuster einbringen, indem überlappende Klone oder Contigs mit verschiedenen Fluorophoren überlegt markiert werden. Sämtliche Vorteile des Chromosomenbandenfärbungsansatzes auf Hybridisierungs basis lassen sich verglichen mit der vorstehend beschriebenen Verwendung von Chromosomenfarben oder mit der herkömmlichen Chromosomenbandenfärbung zur Verwendung großer Einsatzklone genauso verwenden. Der Fachmann weiß, dass die Gewinnung von Klonen, die an Chromosomenbruchpunkten oder bei Chromosomen-Deletion beteiligt sind, unkomplizierter als bei der Verwendung von Strahlungs- Hypridgruppen ist. Eine weitere Quelle für Chromosomenfragmente, die sich zur Verwendung für Mehrfarb- Chromosomenbandenfärbung eignet, sind Fragmente, die durch Mikrosezierung von Chromosomen eignen. Mikrosezierte Chromosomenfragmente werden erzeugt durch manuelle oder lasergesteuerte Mikromanipulation von Chromosomenspreitungen, die im Stand der Technik ebenfalls bekannt sind. Die so erzeugten Fragmente werden gewöhnlich durch Polymerasekettenreaktion vermehrt, indem bspw. degenerierte Oligonukleotid-Primer (DOP) in einem Verfahren des Standes der Technik, nämlich DOP-PCR, verwendet werden oder indem Primer, die von eingestreuten repetitiven Sequenzen (IRS, bspw. Alu-Sequenzen) stammen, in einem Verfahren des Stand der Technik, nämlich IRS-PCR, verwendet werden. Eine weitere Quelle für Chromosomenfragmente, die sich zur Verwendung für Mehrfarb-Chromosomenbandenfärbung eignen, sind Fragmente, die durch DNA-Restriktionsansätze, die große DNA-Fragmente hervorbringen, und Elektrophoreseansätze erzeugt werden, die große DNA-Fragmente nach der Größe auftrennen können. Zur Erzeugung großer DNA- Fragmente durch DNA-Restriktion lassen sich zwei Ansätze in Erwägung ziehen. Gemäß einem ersten Ansatz erfolgt eine Partialspaltung mit einer Endonuklease (bspw. ein Häufig- oder Seltenspalter), wohingegen gemäß dem zweiten Ansatz eine Vollspaltung mit einer seltenspaltenden Endonuklease (bspw. NotI) erfolgt. Der letzte Ansatz ist zurzeit bevorzugt, da sich eine vollständige Spaltung wiederholen lässt damit in unabhängigen Versuchen identische Ergebnisse erhalten werden, wohingegen eine Partialspaltung zufällig erfolgt. Elektrophoreseansätze, die große DNA-Fragmente entsprechend der Größe auftrennen können, gibt es im Stand der Technik und umfassen Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE). Somit ergibt bspw. die Extraktion von DNA aus konsekutiven Bereichen längs einer PFGE-Spur, die Markierung der DNA aus jedem dieser Bereiche mit unterschiedlichen Fluorophoren und Cohybridisieren der so erhaltenen Sonden an Chromosomen, ein Mehrfarb-Bandenmuster der Chromosomen ähnlich wie oben beschrieben. Große DNA-Fragmente können zusätzlich über Gradientenzentrifugation, wie Saccharose- oder Cäsiumchlorid-Gradienten, die ebenfalls im Stand der Technik bekannt sind, erhalten werden. Man nimmt trotzdem an, dass die Verwendung dieser Ansätze keine Möglichkeit bietet, die genetische und cytogenetische Karte wie vorstehend beschrieben zu integrieren, und sie ist daher z. Zt. weniger bevorzugt. Die Erzeugung eines Mehrfarb- Bandenmusters der Chromosomen (d. h. Mehrfarb-Banden- Karyotyp) auf der Basis der Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung und des erfindungsgemäßen Klassifizierungsansatzes lassen sich für verschiedene praktische Anwendungen verwenden. Diese umfassen bspw. (i) die Erfassung von Chromosomenaberrationen bspw. mit spezifischen maßgerechten Klon-Sätzen; (ii) die Erfassung telomerer Deletionen, die sich ansonsten schwer nachweisen lassen; (iii) die Erfassung von Chromosomen-Aneuploidien bei der Pränataldiagnose; (iv) die Erfassung rezidivierender Chromosomenbruchpunkte; (v) vergleichende Mehrfarb- Genomhybridisierung; (vii) Kombination von Mehrfarb-FISH mit anderen Messungen cytologischer und immunhistochemischer Färbungen für eine Multiparameteranalyse von Tumorzellen; (viii) die Kombination von Mehrfarb-Bandenmustern mit herkömmlichen R- oder G-Banden; (ix) die Analyse genetischer Aberrationen direkt in Interphasezellen; und (x) Screening auf Chromosomenaberrationen in Populationen, die Strahlung oder Mutagenen ausgesetzt waren.
Achtens lässt sich der erfindungsgemäße Klassifizierungsansatz so ausdehnen, dass er einen morphologischen Algorithmus beinhaltet, der ebenfalls im Stand der Technik der automatischen Karyotyp-Bestimmung bekannt ist, damit noch bessere Ergebnisse erhalten werden.
Die Fig. 5a und 5b bieten zwei Beispiele für partielle Metaphasen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert wurden. Die grundlegenden Schritte der in diesem Beispiel beschriebenen Analyse wurden insgesamt eingesetzt, so dass man die in den Fig. 5a-b gezeigten Ergebnisse erhielt, und zwar mit einigen zusätzlichen Schritten morphologischer Natur, die die Qualität der Ergebnisse verbessern.
Es folgt eine eingehende Aufzählung der Analyseschritte, ausgehend von der Simulation der Messungen bis zur Veranschaulichung der Ergebnisse.
1. Die Messung wird simuliert mit den Integralen der Spektren, die mit einer in Beispiel 2 beschriebenen Vorrichtung auf einem Würfel A einer gemäß Beispiel 1 präparierten Metaphase gemessen wurden. Die in dieser Hybridisierung verwendeten Farbstoffe sind in Tabelle l auf gelistet, die Farbstoffkombinationen sind in Tabelle 2 aufgeführt, und 5 Spektralintegrale, für jeden Pixel werden über die Bereiche der in Tabelle 4 aufgelisteten 5 Emissionsfilter berechnet, wobei man einen 5-dimensionalen Vektor für jeden Pixel bildet.
2. Die durchschnittlichen Integrale für die Spektren, die zu den vorher bekannten einzeln gefärbten Chromosomen gehören, sind in einer Bank gespeichert und werden als bekannte Koeffizienten Rij der Gleichungen l und 2 verwendet.
3. Die räumliche Auflösung des Würfels A wird bspw. durch ein 3 · 3 Pixel-Raumfiltern der Daten reduziert (wodurch das räumliche Rauschen reduziert wird), was einen neuen Würfel B ergibt.
4. Ein lokaler "Hintergrund"-Würfel C wird bspw. für ein 30 · 30 Pixel-Raumfiltern von. Würfel A berechnet, und dann von Würfel B subtrahiert, wodurch ein neuer Würfel D erhalten wird, der örtliche Intensitätsabweichungen aufgrund von Streuung und anderen Quellen ungewünschter Strahlung berücksichtigt.
5. Da negative Daten nicht physikalisch sind, werden sämtliche Daten von Würfel D bei Null gekappt, was einen neuen Würfel E mit 5 Vektoren mit nur positiven Komponentewerten ergibt.
6. Die neuen 5-dimensionalen Vektoren des so erhaltenen Würfels E für sämtliche Pixel, und die Rij-Daten der einzeln gefärbten Pixel werden in den Gleichungen 1 und 2 wie vorstehend erläutert verwendet, so dass die 5-Vektoren ni/Ni (i = 1, . . . 5) für jeden Pixel gefunden werden.
7. Für jeden Pixel werden die Werte ni/Nj jeweils gekappt bei 0,13, 0,2, 0,2, 0,3 und 0,3, so dass man neue 5- Vektoren erhält, die aus Kombinationen von Null- und Nicht-Nullelementen hergestellt werden, und dieser neue Würfel wird G genannt.
8. Jeder Pixel des Würfels G wird mit den Farbstoffkombinationen verglichen, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, wobei folgende Regeln gelten: (i) die Anwesenheit oder Abwesenheit der Farbstoffe a, b, c, d und e in einem Pixel sind jeweils durch die ersten, zweiten, dritten, vierten und fünften Komponenten der 5- Vektoren von G angegeben; (ii) ist eine Komponente gleich Null, fehlt ihr entsprechender Farbstoff; (iii) ist eine Komponente nicht Null, ist ihr entsprechender Farbstoff zugegen; (iv) Tabelle 2 gibt die Translation des Anwesend-Fehlen-Vektors eines Pixels zur korrekten Chromosomennummer, zu der er gehört.
9. Das so erhaltene Bild wird auf dem Computerbildschirm gezeigt, wobei jede Chromosomennummer in einer festgelegten Farbe gezeigt ist, wie in den Fig. 5a und 5b veranschaulicht. Die Chromosomen lassen sich danach zu Paaren umordnen, so dass man einen im Stand der Technik bekannten Karyotyp (nicht gezeigt) erhält.

BEISPIEL 4

AOTFs und LCTFs

Abstimmbare Filter (TFs), wie akustisch-optische abstimmbare Filter (AOTFs) und Flüssigkristall-abstimmbare Filter (LCTFs) sind feste elektronisch abstimmbare Spektralbandpass-Selektoren ohne bewegliche Teile, die ralbandpass-Selektoren ohne bewegliche Teile, die sich auf jede bestimmte Wellenlänge elektronisch abstimmen lassen, wie im Fachgebiet bekannt ist. Einen abstimmbaren Filter kann man sich als Filter mit variablem Bandpass vorstellen, der sich über seinen Bereich auf jede beliebige Wellenlänge einstellen lässt.
Ein Flüssigkristall-einstellbarer Filter ist ein fester elektronisch abstimmbarer Spektralbandpass-Filter, der aus hochmolekularen organischen Substanzen mit einem Dipol besteht. Die Abstimmung der LCTF erfolgt, indem der Flüssigkristall verschiedenen elektrischen Spannungen ausgesetzt wird. LCTF ist ein doppelbrechender Filter, der eine Phasenverzögerung zur Erzeugung einer konstruktiven und destruktiven Interferenz verwendet. Durch Stapeln einer Anzahl von Stufen in Reihen, wird ein einzelner Bandpass erhalten, und zwar auf eine Weise ähnlich zu der eines Mehrkammer-Interferenzfilters. Die LCTF-Technologie wurde von der Cambridge Research & Instrumentation (CRI) Inc. 1992 eingeführt. Die erste Generation der produzierten LCTFs litt an verschiedenen Einschränkungen bezüglich Bandpassbreite und Form und Durchlass von polarisiertem und besonders zufällig polarisiertem Licht. Die zweite Generation LCTFs bewältigte jedoch diese Probleme und ermöglichte den Durchlass von etwa 100% polarisiertem Licht, was viel größer ist als 50% von zufällig polarisiertem Licht, einen breiten Bandpass (oben und unten) einer Reihe von Formen im Spektralbereich von 400 bis 720 nm. Die Entwicklung der LCTFs ist beschrieben in Clifford Hoyt (1996) Liquid crystals tunable filters clear the way for imaging multiprobe fluorescence. Biomotonics International 3(4), 49-51. Eine weitere Information bezüglich LCTF befindet sich bspw. in Hoyt und Benson (1992) Merging spectroscopy and digital imaging enhances cell research. Photonics Spectra 26(11), 92-97; Kopp (1994) Tunable birefringent filters using Liquid crystal variable retarders. Proc. SPIE 2265, 192-201; Miller und Hoyt (1995) Multispectral imaging with a liquid crystal tunable filter. Proc. SPIE 2345, 354-365; und Koenig et al. (1994) In vivo fluorescence detection and imaging of porphyrinproducing baeteria in the human skin and in the oral cavity for diagnosis of acne, caries and squamous cell carcinoma. Proc. SPIE 2135, 129-138, die als vollständig offenbart durch Bezugnahme hier aufgenommen sind.
Ein akustisch-optischer abstimmbarer Filter (AOTF) ist ein fester elektronisch abstimmbarer Spektralbandpass- Filter, der vom Ultraviolett- über den sichtbaren bis in die Infrarot-Bereiche des Lichtspektrums arbeitet. Der AOTF arbeitet auf dem Prinzip der akustisch-optischen Wechselwirkung in einem anisotropen Medium. Mit anderen Worten, der AOTF arbeitet durch Wechselwirkung von Licht mit wandernden akustischen Wellen durch das Medium, was eine periodische Modulation seines Brechungsindexes aufgrund des elastooptischen Effektes bewirkt. Diese Modulation wirkt als dreidimensionales sinusförmiges Phasengitter für auf den Kristall fallendes Licht. Dadurch werden bestimmte Wellenlängen in einem Winkel zum einfallenden Strahl gebrochen. Zu diesem Zweck wird ein Akustikwandler, üblicherweise ein piezoelektrischer Motor, an eine Kristallfläche angeschlossen, und ein Akustikabsorber wird gewöhnlich an die gegenüberliegende Seite angeschlossen. Der Wandler wandelt ein Hochfrequenz-rf-(Radiofrequenz)- Signal in eine sinusförmige Druckwelle um, die sich seitlich durch den Kristall fortpflanzt. Das Medium arbeitet somit ähnlich wie ein Gitter, wobei einfallendes Licht in seine Spektralwellelängen gebeugt wird. Licht verschiedener Wellenlängen erhält verschiedene Winkel in Bezug auf den einfallenden Lichtstrahl, wenn er das Medium als Durchsatz verlässt. Der Akustikabsorber am gegenüberliegenden Ende des Kristalls eliminiert Akustikreflektionen, die die primäre Akustikwellenform stören könnten. Die Impulserhaltung zwischen einfallenden und gebeugten Photonenwellenvektoren und dem Akustikwellenvektor bestimmt die Wellenlänge des gebeugten Lichts, das das Medium in einem bestimmten Winkel passiert. Ohne Bewegung des AOTF kann man somit die Wellenlänge des Lichts steuern, das das Medium in einem ausgewählten Winkel passiert. Optische Abstimmung, oder mit anderen Worten die Wellenlänge des Lichts, das das Medium in einem vorher bestimmten Winkel passiert, wird durch Auswahl des rf-Frequenzsignals erzielt.
Die Verwendung von AOTFs für spektroskopische Anwendungen und für Spektralbilderzeugungsanwendungen ist nicht neu, siehe bspw. US-Patent 5 216 484 an Chao et al., 5 377 003 an Lewis et al. Weitere Informationen bezüglich des Betriebs der AOTFs sind beschrieben von Wang und Lewis (1996) Acousto-optic tunable filters and their application in spectroscopic imaging and microscopy. In "Fluorescence Imaging Spectroscopy and Microscopy". Feng, Wang und Brian, Hrsg. John Wiley and Sons Inc.; Harris et al., (1969) Acousto-optic tunable filters. Journal of the optical society of America, 59, 744-747; Chang (1977) Noncolinear acousto-optic filter with large angular aperture. Applied Physics Letters 25, 370-372; Elliot et al. (1996) Imaging acousto-optic tunable filter with 0.35 micrometer spatial resolution. Applied Optics 35, 5220- 5226; und in den US-Patenten 3 679 288; 3 944 334; 3 944 335; 3 953 107; 4 052 121; 4 342 502 und 5 039 855, die jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Traditionell wurden AOTFs verwendet zur Erzeugung eines variierenden Schmalbandpasses. Trotzdem ermöglicht die elektronische Steuerung der Akustikwellenparameter durch bspw. Überlagerung (bspw. lineare Kombination) akustischer Wellen verschiedener Wellenlängen und/oder verschiedener Amplituden durch bspw. Einsatz von mehr als einem Wandler, die Auswahl jedes gewünschten Wellenmusters, das zum Durchlass verschiedener Lichtintensitäten bei variablen Wellenlängen in einem vorgewählten Winkel führt. Durch Weglassen des Akustikabsorbers zur Ermöglichung des Vorhandenseins und somit Überlagerung von Wellen, die vom Ende des Kristalls reflektiert werden, kann man den Durchtritt verschiedener Lichtintensitäten verschiedener Wellenlängen im vorgewählten Winkel steuern. Der AOTF stellt - wenn er mit mehreren eng beieinander liegenden rfs betrieben wird, ebenfalls einen elektronisch variablen Bandpass und Formkontrolle bereit. Diese Wirkung wird beschrieben in Elliot et al (1996) Imaging acoustooptic filter with 0,35 micrometer spatial resolution. Applied Optics 35, 5220-5226.
Somit lässt sich ein beliebiger Bandpass-Anregungs- und Emissionsfilter, der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich ist, durch einen einzelnen abstimmbaren Filter darstellen, alternativ durch ein Subset einiger Filter, die gemeinsam, wenn sie nacheinander zur Messung verwendet werden, ansonsten im Wesentlichen identische Ergebnisse liefern. Eine solche Kombination von Filtern lässt sich durch einen einzigen abstimmbaren Filter (LCTF oder AOTF) einsetzen, der bei einem anderen Bandpass eingestellt werden kann, so dass er nacheinander jeden der erforderlichen Filter realisiert.
Man erkennt, dass durch Verwendung abstimmbarer Filter, wie AOTF und LCTF, ein einzelner Filter zur Messung erforderlich ist. Der abstimmbare Filter wird so eingestellt, dass sich seine Spektraleigenschaften ändern und nacheinander jede gewünschte Eigenschaft erhalten .wird. Zur Messung von in-situ-hybridisierten Chromosomen, wird die Abstimminformation so ausgewählt, dass der stimmbare Filter nacheinander die Breitband-Anregungs- und -Emissionsfilter realisiert. Daher benötigt die Messung keine beweglichen Teile mehr, weil sie elektronisch gesteuert wird.

BEISPIEL 5

Vorrichtung aus Breitband-Anregungs- und -Emissionsfiltern

Durch Einsatz von Breitband-Anregungs- und -Emissionsfiltern, die den Spezifitätsverlust durch eine Durchsatz-Zunahme kompensieren, oder die einen Durchsatzverlust durch eine Zunahme von Spezifität kompensieren, lassen sich die Pixel in Gruppen einordnen.
Der Fig. 6 zufolge sind die Anregungs- und Emissionsfilterpaare für eine einfache Messung in einer Vorrichtung untergebracht, die nachstehend als Vorrichtung 100 bezeichnet wird. Vorrichtung 100 dient der Einordnung von Pixeln in Pixelgruppen gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von aus einer Anzahl von Flurorophoren ausgewählten Fluorophoren. Jeder der Fluorophore hat charakteristische Anregungs- und Emissionsspektren und spezifische Anregungs- und Emissions-Peaks. Zur Klassifikation wird eine Probe aus bspw. in-situ-gefärbten Chromosomen 104, was mit der vorstehenden Beschreibung übereinstimmt, unter einem Objektiv 101 der Vorrichtung 100 auf einem Objekttisch 106 untergebracht.
Die Vorrichtung 100 umfasst eine Lichtquelle 110, die einen Lichtstrahl 112 aussendet. Der Strahl 112 umfasst Licht im Wellenlängenbereich, der sich zur Anregung der gewählten Fluorophore eignet.
Die Vorrichtung 100 umfasst zudem eine Anzahl Breitband-Anregungsfilter- 114 und Breitband-Emissionsfilter- Paare 116. Es sind 5 Paare gezeigt. Die Filter haben die vorstehend beschriebenen Eigenschaften. Die Filter 114 beschränken die Bestrahlung durch den Lichtstrahl 112 auf bestimmte Anregungs-Wellenlängen, die wie vorstehend beschrieben zwischen Anregungs-Durchsatz und Spezifität kompensieren. Die Filter 116 beschränken das aus Probe 104 abgestrahlte Licht auf bestimmte Wellenlängen, die wie vorstehend beschrieben zwischen Emissions-Durchsatz und Spezifität kompensieren.
Die Kontrollvorrichtung 100 umfasst zudem eine automatische, manuelle oder semimanuelle Kontrollvorrichtung 120. Die Vorrichtung 120 selektiert ein Paar Filter 114 und 116 zum Anregen der Fluorophore jedes Pixels mit Licht, das aus Lichtquelle 110 stammt und durch einen der Breitband-Anregungsfilter 114 gefiltert wird, und zum Wiederholen des obigen Verfahrens für alle Filterpaare.
Die Vorrichtung 100 umfasst zudem eine Vorrichtung zum Aufzeichnen der Lichtintensität 122 (bspw. eine CCD), die die emittierte Lichtintensität wie sie nach dem Durchtritt durch die Emissionsfilter 116 erhalten wird, aufzeichnet.
Demzufolge lässt sich jeder der Pixel durch einen Vektor einer Anzahl Abmessungen darstellen, die gleich der Zahl der Anzahl Filterpaare 114 und 116 ist.
Die Vorrichtung 100 umfasst zudem einen Rechner 124 mit einem Algorithmus zum Feststellen des Vorhandenseins jedes der Anzahl Fluorophore in jedem der Pixel.
Der Rechner 124 ordnet jeden der Pixel einer Pixelgruppe zu, gemäß seiner Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform gibt der Rechner 124 den Pixeln, die jeweils einer Pixelgruppe angehören, eine einzelne künstliche Farbe, so dass sich Pixel, die jeweils den Gruppen angehören, voneinander unterscheiden lassen.
Die Vorrichtung 100 umfasst vorzugsweise weiter ein Display 126 (bspw. einen Computerbildschirm), womit sich die Ergebnisse der Klassifikation durch künstliche Farben darstellen lassen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung 100 zudem eine Kollimatorlinse 119, die eine vollständige Kollimation des Lichts gewährleistet, bevor es die Aufzeichnungsvorrichtung 122 erreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung 100 zudem eine Fokussierlinse 121, die das Licht, welches die Aufzeichnungsvorrichtung 122 erreicht, fokussiert.
Der Durchschnittsfachmann erkennt, dass die erfindungsgemäße Verwendung von Vorrichtung 100 für sämtliche cytogenetische Anwendungen, die auf dem erfindungsgemäßen Klassifizierungsansatz beruhen, wie unter Beispiel 6 oben beschrieben wurde, insbesondere für Chromosomenbandenanalyse vorteilhaft ist.

BEISPIEL 6

Vorrichtung aus Breitband-Anregungs- und Emissions-AOTF- und LCTF-Filtern

Die Breitband-Anregungs- und -Emissionsfilter, die den Spezifitätsverlust durch Durchsatzzunahme kompensieren oder die einen Durchsatzverlust durch Spezifitätszunahme kompensieren, lassen sich, wie vorstehend beschrieben durch abstimmbare Filter ersetzen.
Der Fig. 7 zufolge ist ein Paar aus abstimmbaren Anregungs- und Emissionsfiltern für eine einfache Messung in einer Vorrichtung untergebracht, die nachstehend als Vorrichtung 100' bezeichnet wird. Vorrichtung 100' dient wie zuvor der Einordnung von Pixeln in Pixelgruppen gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von aus einer Anzahl von Flurorophoren ausgewählten Fluorophoren. Jeder der Fluorophore hat charakterisitische Anregungs- und Emissionsspektren und bestimmte Anregungs- und Emissions-Peaks. Zur Klassifikation wird eine Probe aus bspw. in-situ-gefärbten Chromosomen 104', was mit der vorstehenden Beschreibung übereinstimmt, unter einem Objektiv 101' der Vorrichtung 100' auf einem Objekttisch 106' untergebracht.
Die Vorrichtung 100' umfasst eine Lichtquelle 110', die einen Lichtstrahl 112' aussendet. Der Strahl 112' umfasst Licht im Wellenlängenbereich, der sich zur Anregung der gewählten Fluorophore eignet.
Die Vorrichtung 100' umfasst zudem ein Paar Filter aus einem abstimmbaren Breitband-Anregungsfilter 114' und einem Breitband-Emissionsfilter 116'. Die Filter sind abstimmbar und können daher so eingestellt werden, dass sie nacheinander die in Vorrichtung 100 von Beispiel 5 (Fig. 6) verwendeten herkömmlichen Bandpassfilter repräsentieren. Filter 114' beschränkt die Bestrahlung durch den Lichtstrahl 112' auf bestimmte Anregungs-Wellenlängen, die wie vorstehend beschrieben zwischen Anregungs- Durchsatz und Spezifität kompensieren. Filter 116' beschränkt das aus Probe 104' abgestrahlte Licht auf bestimmte Wellenlängen, die wie vorstehend beschrieben zwischen Emissions-Durchsatz und Spezifität kompensieren.
Die Kontrollvorrichtung 100' umfasst zudem eine Kontrollvorrichtung 120'. Die Vorrichtung 120' stellt die Filter 114' und 116' ein zum Anregen der Fluorophore jedes Pixels mit Licht, das aus Lichtquelle 110' stammt und durch einen der Anregungsfilter 114' gefiltert wird, und zum Wiederholen des obigen Verfahrens für alle Filterpaare.
Die Vorrichtung 100' umfasst zudem eine Vorrichtung zum Aufzeichnen der Lichtintensität 122' (bspw. eine CCD), die die emittierte Lichtintensität wie sie nach dem Durchtritt durch den Emissionsfilter 116' erhalten wird, aufzeichnet.
Demzufolge lässt sich jeder der Pixel durch einen Vektor einer Anzahl Abmessungen darstellen, die gleich der Anzahl Einstell-Situationen ist, die von den Filtern 114' und 116' eingenommen werden.
Die Vorrichtung 100' umfasst zudem einen Rechner 124' mit einem Algorithmus zum 'Feststellen des Vorhandenseins jedes der Anzahl Fluorophore in jedem der Pixel.
Der Rechner 124' ordnet jeden der Pixel einer Pixelgruppe zu, gemäß seiner Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform gibt der Rechner 124' den Pixeln, die jeweils einer Pixelgruppe angehören, eine einzelne künstliche Farbe, so dass sich Pixel, die jeweils den Gruppen angehören, voneinander unterscheiden lassen.
Die Vorrichtung 100' umfasst vorzugsweise weiter ein Display 126' (bspw. einen Computerbildschirm), womit sich die Ergebnisse der Klassifikation durch künstliche Farben darstellen lassen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung 100' zudem eine Kollimatorlinse 119', die eine vollständige Kollimation des Lichts gewährleistet, bevor es die Aufzeichnungsvorrichtung 122' erreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung 100' zudem eine Fokussierlinse 121', die das Licht, welches die Aufzeichnungsvorrichtung 122' erreicht, fokussiert.
Der Durchschnittsfachmann erkennt, dass die erfindungsgemäße Verwendung von Vorrichtung 100' für sämtliche cytogenetische Anwendungen, die auf dem erfindungsgemäßen Klassifizierungsansatz beruhen, wie unter Beispiel 3 oben beschrieben wurde, insbesondere für Chromosomenbandenanalyse vorteilhaft ist.
Die Erfindung wurde zwar in Bezug auf eine beschränkte Zahl Ausführungsformen beschrieben, man erkennt aber, dass sich viele Variationen, Modifikationen und andere Anwendungen vornehmen lassen.

Claims

1. Verfahren zum Einordnen von Pixeln in Pixelgruppen gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von aus einer Anzahl Fluorophore ausgewählten Fluorophoren, die jeweils ein charakteristisches Emissionsspektrum und einen spezifischen Emissionspeak besitzen, umfassend:

(a) Bereitstellen einer Anzahl Emissionsfilter mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm;

(b) für jeden Pixel Aufzeichnen der ausgestrahlten Lichtintensität, die nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter erhalten wird, so dass sich jeder Pixel durch einen Vektor mit einer Anzahl Abmessungen darstellen lässt, wobei die Zahl der Abmessungen gleich der Zahl der Emissionsfilter ist; und

(c) Verwenden eines Algorithmus zur Bestimmung einer Menge jedes der Anzahl Fluorophore in jedem Pixel und Einordnen der Pixel jeweils in eine Pixelgruppe gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren, wobei der Algorithmus mathematisch die für jeden Pixel nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter aufgezeichnete Intensität als Summe der von jeder der Anzahl Fluorophore erhaltenen Intensitäten ausdrückt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die bestimmte Menge von jedem der Anzahl Fluorophore eine relative Menge ist, und zwar relativ zu den anderen der Anzahl Fluorophore.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens zwei der Anzahl Emissionsfilter überlappende Bandpässe besitzen.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zu den Pixelgruppen jeweils gehörenden Pixel eine einzelne künstliche Farbe erhalten, so dass sich die zu den Gruppen jeweils gehörenden Pixel voneinander unterscheiden lassen.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Algorithmus ein linearer Zerlegungsalgorithmus ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fluorophore an genetisches Material von Metaphase-Chromosomen gebunden sind, so dass das genetische Material der Metaphasechromosomen jeweils an einen anderen Fluorophor oder eine Kombination der Fluorophore gebunden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Anzahl der Fluorophore fünf ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Anzahl der Emissionsfilter fünf ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Anzahl der Fluorophore gleich der Anzahl der Emissionsfilter ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jeder der Anzahl Emissionsfilter so ausgewählt ist, dass sein Bandpass dem Emissionsspektrum eines Fluorophors der Anzahl Fluorophore entspricht.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Bandpass von mindestens einem der Anzahl Emissionsfilter so ausgewählt ist, dass er mit dem Emissionspeak seines entsprechenden Fluorophors überlappt.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Anzahl Emissionsfilter durch einen einzelnen abstimmbaren Filter dargestellt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der abstimmbare Filter ausgewählt ist aus AOTF und LCTF.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fluorophore jeweils charakteristische Anregungs- und Emissionsspektren sowie spezifische Anregungs- und Emissionspeaks aufweisen und worin:

in Schritt (a) eine Anzahl Filterpaare bereitgestellt wird, die jeweils einen Anregungsfilter mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm sowie einen Emissionsfilter mit einer Bandbreite zwischen 20 und 70 nm umfassen, und

in Schritt (b) für die Anzahl Filterpaare jeweils die Fluorophore von jedem der Pixel mit Licht angeregt werden, das durch einen der Anregungsfilter gefiltert wird, und die ausgestrahlte Lichtintensität, die nach dem Durchtritt durch den paarigen Emissionsfilter erhalten wird, aufgezeichnet wird, so dass sich jeder Pixel durch einen Vektor einer Anzahl Abmessungen darstellen lässt, wobei die Zahl der Abmessungen gleich der Zahl der Filterpaare ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei mindestens zwei der Emissionsfilter überlappende Bandpässe haben.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei mindestens zwei der Anregungsfilter überlappende Bandpässe haben.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die zu den Pixelgruppen jeweils gehörenden Pixel eine einzelne künstliche Farbe erhalten, so dass sich die zu den Gruppen jeweils gehörenden Pixel voneinander unterscheiden lassen.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei der Algorithmus ein linearer Zerlegungsalgorithmus ist.

19. Verfähren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die Fluorophore an genetisches Material von Metaphase-Chromosomen gebunden sind, so dass das genetische Material der Metaphasechromosomen jeweils an einen anderen Fluorophor oder eine Kombination der Fluorophore gebunden ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Anzahl der Fluorophore fünf ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Anzahl der Emissionsfilterpaare fünf ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wobei die Anzahl der Fluorophore gleich der Anzahl der Emissionsfilterpaare ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, wobei die Emissionsfilter jeweils so ausgewählt sind, dass sie einen Bandpass besitzen, der dem Emissionsspektrum eines Fluorophors der Anzahl Fluorophore entspricht, und die einen hohen Durchsatz an Licht ermöglichen, das von einem Fluorophor ausgestrahlt wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 23, wobei die Anregungsfilter jeweils so ausgewählt sind, dass sie einen Bandpass besitzen, der dem Anregungsspektrum eines Fluorophors der Anzahl Fluorophore entspricht, und die einen hohen Anregungslichtdurchsatz gestatten.

25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Bandpass von mindestens einem der Emissionsfilter so ausgewählt ist, dass er mit dem Emissionspeak seines entsprechenden Fluorophors überlappt.

26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Bandpass von mindestens einem der Anregungsfilter so ausgewählt ist, dass er mit dem Anregungspeak seines entsprechenden Fluorophors überlappt.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 26, wobei die Emissionsfilter durch einen einzelnen abstimmbaren Filter dargestellt werden.

28. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der abstimmbare Filter ausgewählt ist aus AOTF und LCTF.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 28, wobei die Anregungsfilter durch einen einzelnen abstimmbaren Filter dargestellt werden.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei der abstimmbare Filter ausgewählt ist aus AOTF und LCTF.

31. Gerät (100) zur Einordnung von Pixeln in Pixelgruppen gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von aus einer Anzahl Fluorophore ausgewählten Fluorophoren, die jeweils charakteristische Anregungs- und Emissionsspektren und spezifische Anregungs- und Emissionspeaks aufweisen, umfassend:

(a) eine Lichtquelle (110);

(b) eine Anzahl Paare von Anregungsfiltern (114) mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm und Emissionsfiltern (116) mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm;

(c) eine Steuerungsvorrichtung (120) zum:

(i) Auswählen eines Paars der Anzahl Paare;

(ii) Anregen der Fluorophore jedes Pixels mit Licht, das aus der Lichtquelle stammt und durch einen der Anregungsfilter gefiltert wird; und

(iii) Wiederholen der Schritte (i) bis (ii) für jede Anzahl Filterpaare, so dass sich die Pixel jeweils durch eine Anzahl Abmessungen darstellen lassen, deren Zahl gleich, der Zahl der Filterpaare ist;

(d) einen Lichtintensitätsschreiber (122) zum Aufzeichnen der ausgestrahlten Lichtintensität, die nach dem Durchtritt durch die Emissionsfilter erhalten wird; und

(e) einen Rechner (124), umfassend einen Algorithmus zum Bestimmen einer Menge jeder Anzahl Fluorophore in jedem der Pixel und zum Einordnen der Pixel jeweils in eine Pixelgruppe gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einem einzelnen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren, wobei der Algorithmus mathematisch die für jeden Pixel nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter aufgezeichnete Intensität als Summe der von jedem der Anzahl Fluorophore erhaltenen Intensitäten ausdrückt.

32. Gerät nach Anspruch 31, wobei die bestimmte Menge von jedem der Anzahl Fluorophore eine relative Menge ist, und zwar relativ zu den anderen der Anzahl Fluorophore.

33. Gerät nach Anspruch 31 oder 32, wobei mindestens zwei der Emissionsfilter (116) überlappende Bandpässe aufweisen.

34. Gerät nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei mindestens zwei der Anregungsfilter (114) überlappende Bandpässe aufweisen.

35. Gerät nach einem der Ansprüche 31 bis 34, wobei der Rechner (124) den Pixeln, die jeweils den Pixelgruppen angehören, eine einzelne künstliche Farbe zuteilt, so dass sich die jeweils zu den Gruppen gehörenden Pixel voneinander unterscheiden lassen.

36. Gerät nach einem der Ansprüche 31 bis 35, wobei der Algorithmus ein linearer Zerlegungsalgorithmus ist.

37. Gerät nach einem der Ansprüche 31 bis 36, wobei die Anzahl Filterpaare fünf ist.

38. Gerät nach einem der Ansprüche 31 bis 37, wobei die Anzahl der Fluorophore gleich der Anzahl der Filterpaare ist.

39. Gerät nach einem der Ansprüche 31 bis 38, wobei die Emissionsfilter (116) jeweils so ausgewählt sind, dass sie einen Bandpass besitzen, der dem Emissionsspektrum eines Fluorophors der Anzahl Fluorophore entspricht, und die einen hohen Durchsatz an Licht ermöglichen, das von einem Fluorophor emittiert wird.

40. Gerät nach einem der Ansprüche 31 bis 39, wobei die Anregungsfilter (114) jeweils so ausgewählt sind, dass sie einen Bandpass besitzen, der dem Anregungsspektrum eines Fluorophors der Anzahl Fluorophore entspricht, und einen hohen Anregungslichtdurchsatz gestatten.

41. Gerät nach Anspruch 39, wobei der Bandpass von mindestens einem der Emissionsfilter (116) so ausgewählt ist, dass er mit dem Emissionspeak seines entsprechenden Fluorophors überlappt.

42. Gerät nach Anspruch 40, wobei der Bandpass von mindestens einem der Anregungsfilter (114) so ausgewählt ist, dass er mit dem Anregungspeak seines entsprechenden Fluorophors überlappt.

43. Gerät nach einem der Ansprüche 31 bis 42, wobei die Emissionsfilter durch einen einzelnen abstimmbaren Filter dargestellt werden.

44. Gerät nach Anspruch 43, wobei der abstimmbare Filter ausgewählt ist aus AOTF und LCTF.

45. Gerät nach einem der Ansprüche 31 bis 44, wobei die Anregungsfilter (114) durch einen einzelnen abstimmbaren Filter dargestellt werden.

46. Gerät nach Anspruch 45, wobei der abstimmbare Filter ausgewählt ist aus AOTF und LCTF.

47. Verfahren zur Bestimmung der Menge eines einzelnen Fluorophors oder einer Kombination von Fluorophoren, die aus einer Anzahl einem Pixel zugehöriger Fluorophore ausgewählt sind, welche jeweils ein charakteristisches Emissionsspektrum und einen spezifischen Emissionspeak besitzen, umfassend:

(b) Aufzeichnen der ausgestrahlten Lichtintensität, die nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter erhalten wird, so dass sich der Pixel durch einen Vektor mit einer Anzahl Abmessungen darstellen lässt, wobei die Zahl der Abmessungen gleich der Zahl der Emissionsfilter ist; und

(c) Verwenden eines Algorithmus zur Bestimmung einer Menge jedes der Anzahl Fluorophore in dem Pixel, wobei der Algorithmus mathematisch die für jeden Pixel nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissions filter aufgezeichnete Intensität als Summe der von jeder der Anzahl Fluorophore erhaltenen Intensitäten ausdrückte.

48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei die Fluorophore jeweils charakteristische Anregungs- und Emissionsspektren sowie spezifische Anregungs- und Emissionspeaks aufweisen und worin:

in Schritt (b) für die Anzahl Filterpaare jeweils die Fluorophore des Pixels mit Licht angeregt werden, das durch einen der Anregungsfilter gefiltert wird, und die ausgestrahlte Lichtintensität, die nach dem Durchtritt durch den paarigen Emissionsfilter erhalten wird, aufgezeichnet wird, so dass sich der Pixel durch einen Vektor einer Anzahl Abmessungen darstellen lässt, wobei die Zahl der Abmessungen gleich der Zahl der Filterpaare ist.

49. Gerät (100) zur Bestimmung der Menge eines einzelnen Fluorophors oder einer Kombination von Fluorophoren, die aus einer Anzahl einem Pixel zugehöriger Fluorophore ausgewählt sind, welche jeweils ein charakteristisches Emissionsspektrum und einen spezifischen Emissionspeak besitzen, umfassend:

(a) eine Lichtquelle (110);

(b) eine Anzahl Filterpaare, umfassend jeweils einen Anregungsfilter (114) mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm und einen Emissionsfilter (116) mit einer Bandbreite zwischen 20 nm und 70 nm;

(c) eine Steuerungsvorrichtung (120) zum:

(i) Auswählen eines Paars der Anzahl Paare;

(ii) Anregen der Fluorophore des Pixels mit Licht, das aus einer Lichtquelle stammt und durch einen der Anregungsfilter gefiltert wird; und

(iii) Wiederholen der Schritte (i) bis (ii) für jede Anzahl Filterpaare, so dass sich die Pixel jeweils durch eine Anzahl Abmessungen darstellen lassen, deren Zahl gleich der Zahl der Filterpaare ist;

(e) einen Rechner (124), umfassend einen Algorithmus zum Bestimmen einer Menge jeder Anzahl Fluorophore in dem Pixel, wobei der Algorithmus mathematisch die für jeden Pixel nach dem Durchtritt durch jeden der Anzahl Emissionsfilter aufgezeichnete Intensität als Summe der von jedem der Anzahl Fluorophore erhaltenen Intensitäten ausdrückt.