DE29724412U1 - Vorrichtung zum gleichzeitgen Nachweis mehrerer Fluorophore für die in situ Hybridisierung - Google Patents
Vorrichtung zum gleichzeitgen Nachweis mehrerer Fluorophore für die in situ HybridisierungInfo
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Description
• t
24.1.2001
Anmelder: Applied Spectral Imaging Ltd.
Unser Zeichen: 50412 DE
Vorrichtung zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer
Fluorophore für in situ Hybridisierung
Fluorophore für in situ Hybridisierung
Gebiet und Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen eine Vorrichtung zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren Fluorophoren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine spektrale Abbildungsvorrichtung, die auf den Nachweis und die Analyse von fluoreszierenden in situ Hybridisierungen ausgerichtet ist, bei denen zahlreiche Chromosomenanfarbungsmittel und/oder Loci spezifische Sonden eingesetzt werden, wobei jede mit einem unterschiedlichen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren markiert ist. Weiterhin betrifft die Erfindung insbesondere eine Vorrichtung zur mehrfarbigen Chromosomenbandenfärbung (d.h. mit einem Strich-/Banden-Code versehen), wobei jedes Chromosom ein spezifisches Bandenfärbungsmuster erlangt, dessen Muster durch Verwendung von Gruppen von mit einem Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren markierten Chromosomenfragmenten erhalten wird, wobei auf diese Vorrichtung hier nachstehend ebenfalls als auf Chromosomen basierender mehrfarbiger Chromosomenbandenfärbung Bezug genommen wird. Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren Fluorophoren ist sowohl bei räumlicher als auch bei spektraler Auflösung hochempfindlich und zum gleichzeitigen Nachweis von Dutzenden von Fluorophoren und/oder Kombinationen aus Fluorophoren fähig. Daher kann die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung für den Nachweis von fluoreszierend angefärbten, vollständigen Chromosomensätzen, mehreren Loci und/oder Chromosomenspezifischen Bandenfarbungsmuster einer Art, wie der menschlichen, und zur Bereitstellung eines vollständigen mehrfarbigen Karyotyps verwendet werden, wobei jedes Chromosom aufgrund einer spezifischen Farbe und eines vollständigen mehrfarbigen Chromosomenbandenfärbungsmusters identifiziert wird, wobei jedes Chromosom gemäß eines spezifischen mehrfarbigen Bandenfärbungsmuster identifiziert wird.
Ein Spektrometer ist ein Gerät, das dazu vorgesehen ist, Licht aufzunehmen, es in seine Wellenlängenkomponenten zu trennen (streuen) und das Lichtspektrum, d.h. die Lichtintensität, als Funktion seiner Wellenlänge, zu erfassen. Ein Abbildungsspektrometer sammelt einfallendes Licht von einer Szene/einer Abbildung und erfasst die Spektren von jedem Pixel (d.h. Bildelement) davon.
Spektroskopie ist ein wohlbekanntes, analytisches Instrument, das seit Jahrzehnten in Wissenschaft und Industrie verwendet wird, um Materialien und Verfahren basierend auf den spektralen Signaturen der chemischen Bestandteilen zu charakterisieren. Die physikalische
Grundlage der Spektroskopie ist die Wechselwirkung von Licht mit Materie. Spektroskopie ist herkömmlicherweise die Erfassung von Lichtintensität, die aus einer Probe als eine Funktion der Wellenlänge bei hoher spektraler Auflösung, jedoch ohne räumliche Information, emittiert, übertragen, gestreut oder reflektiert wird.
Spektrales Abbilden, das andererseits eine Kombination aus hochauflösender Spektroskopie und hochauflösender Abbildung (d.h. räumlicher Information) ist, wurde bisher nicht zum Analysieren von biologischen Proben verwendet. Die am nächsten liegende, bisher beschriebene Arbeit betrifft entweder das Erhalten von räumlich hochaufgelöster Information einer biologischen Probe, wenn beispielsweise eine räumlich hochauflösende Abbildung mit einem oder mehreren diskreten Bandpaß filtern durchgeführt wird, was jedoch nur begrenzte spektrale Information bereitstellt [siehe Andersson-Engels et al, Proceedings of SPIE-Bioimaging and Two-Dimensional Spectroscopy, 1205 (1990), 179-189] oder alternativ das Erhalten von hoher spektraler Auflösung (beispielsweise ein vollständiges Spektrum), die bislang bei der räumlichen Auflösung auf eine kleine Anzahl von Punkten der Probe begrenzt ist oder bei der über die ganze Probe der Durchschnitt genommen wird [siehe beispielsweise US-P-4,930,516, an Alfano et al.].
Wie nachstehend sehr detailliert beschrieben wird, ist das Kombinieren von Spektroskopie
und Abbildung für verschiedene biologische Forschungsanwendungen und medizinische Anwendungen nützlich und nachstehend wird hierauf als spektrales Bio-Abbilden Bezug genommen. Ein Beispiel für die Nützlichkeit von spektralem Bio-Abbilden betrifft den Nachweis von spezifischen zellulären Bestandteilen (beispielsweise Proteinen, Nucleinsäurequenzen, etc.), nachdem sie mit fluoreszierenden Sonden markiert wurden (d.h. mit einem Zeichen versehen). In dieser Richtung kann spektrales Abbilden verwendet werden, um mehrere Fluorophore gleichzeitig in einer Erfassung zu identifizieren und zuzuordnen. Die inhärent hohe, spektrale Auflösung der spektralen Abbildung der vorliegenden Erfindung ist tatsächlich zum „Aussortieren" (sorting out) fluoreszierender Sonden (oder anderer, chemischer Bestandteile) mit überlappenden Spektren ideal geeignet.
Begrifflich besteht ein spektrales Bio-Abbildungssystem aus (1) einem Erfassungssystem und (2) einer Analysesoftware. Das Erfassungssystem schließt alle optischen und elektronischen Bestandteile und die Art, in der die Probe beleuchtet wird (beispielsweise Auswahl der Lichtquelle), die Weise der Erfassung (beispielsweise Fluoreszenz) ebenso auch die am besten zum Herausziehen der gewünschten Ergebnisse aus der Erfassung geeignete Kalibrierung ein. Die Analysesofrware schließt die ganze Software und mathematische Algorithmen ein, die nötig sind, um die wichtigen Ergebnisse auf sinnvolle Weise zu analysieren und anzuzeigen.
Spektrale Abbildung wurde seit Jahrzehnten in dem Bereich der Fernerkundung verwendet, um wichtige Einblicke bei der Erkundung der Erde und anderer Planeten durch Identifizieren kennzeichnender, spektraler Absorptionseigenschaften bereitzustellen. Die hohen Kosten, die Größe und die Gestaltung von spektralen Fernerkundungsabbildungssystemen (beispielsweise
Landsat, AVIRIS) haben jedoch deren Verwendung auf Luft und Satelliten getragene Anwendungen beschränkt [siehe, Maymon and Neeck, Proceedings of SPIE - Recent Advances in Sensors, Radiometry and Data Processing for Remote Sensing, 924 (1988), 10-22; Dozier, Proceedings of SPIE - Recent Advances in Sensors, Radiometry and Data Processing for Remote Sensing, 924 (1988), 23-30].
Es gibt drei Grundtypen von spektralen Streuverfahren, die für ein spektrales Bio-Abbildungssystem in Erwägung gezogen werden können: (i) spektrales Gitter, (ii) spektrale Filter und (iii) interferometrische Spektroskopie. Wie nachstehend beschrieben wird, ist die Letztere die am besten geeignete, um die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zu bilden, bislang können auf Gittern und Filtern basierende spektrale Bio-Abbildungssysteme ebenfalls bei einigen Anwendungen als nützlich empfunden werden, wie für den Fachmann klar ist.
Bei einem auf einem Gitter (d.h. Monochromator) basierenden System, das ebenfalls als Abbildungsspektrometer des Spalttyps bekannt ist, wie beispielsweise das DILOR-System: [siehe Valisa et al, presentation at the SPIE Conference European Medical Optics Week, BiOS Europe'95, Barcelona, Spanien (Sep. 1995)] stellt nur eine Achse einer CCD-(charge coupled device, Ladungstransferspeicher)-Detektoranordnung (die räumliche Achse) reale, abbildende Daten bereit, während eine zweite (spektrale) Achse zur Erfassung der Intensität des durch das Gitter als Funktion der Wellenlänge gestreuten Lichts verwendet wird. Das System weist zudem in einer ersten, im Brennpunkt stehenden Ebene einen Spalt auf, der das Sichtfeld zu einem bestimmten Zeitpunkt auf eine Linie von Pixeln beschränkt. Daher kann eine vollständige Abbildung nur nach dem Scannen des Gitters oder des eintreffenden Strahl in einer zu der spektralen Achse der CCD parallelen Richtung in einem Verfahren erhalten werden, das in der Literatur als Linienscannen bekannt ist. Die Unfähigkeit, die zweidimensionale Abbildung sichtbar zu machen, bevor die ganze Erfassung abgeschlossen ist, macht es unmöglich, vor dem Ausführen einer Erfassung, einen gewünschten Bereich von Interesse innerhalb des Sichtfelds zu wählen und/oder den Systembrennpunkt, die Belichtungsdauer, etc. zu optimieren. Auf Gittern basierende, spektrale Abbildungsvorrichtungen sind für Fernerkundungsanwendungen in Gebrauch, weil ein über der Erdoberfläche fliegendes Flugzeug (oder Satellit) dem System einen natürlichen Linienscannen-Mechanismus bereitstellt.
Es ist ferner festzuhalten, dass Abbildungsspektrometer des Spalttyps einen bedeutenden Nachteil aufweisen, da die meisten der Pixel eines Rahmens zu einem bestimmten Zeitpunkt nicht erfasst werden, selbst wenn die nach vorne gerichteten, optischen Bestandteile des Instruments einfallendes Licht tatsächlich von all denen gleichzeitig sammeln. Das Ergebnis ist, dass entweder eine relativ große Erfassungszeit erforderlich ist, um die nötige Information mit einem bestimmten Signal/Rausch-Verhältnis zu erhalten oder dass das Signal/Rausch-Verhältnis (Empfindlichkeit) bei einer bestimmten Erfassungsdauer wesentlich verringert ist. Weiterhin erfordern die spektralen Abbildungsvorrichtungen des Spalttyps Linienscannen, um die nötige
Information für die ganze Szene zu sammeln, was Ungenauigkeiten in die somit erhaltenen Ergebnisse einführen kann.
Auf Filtern basierende, spektrale Streuverfahren können weiter in diskrete und abstimmbare Filter eingeteilt werden. Bei diesen Typen von Abbildungsspektrometern wird die spektrale Abbildung durch Filtern der Strahlung für alle Pixels der Szene gleichzeitig bei einer unterschiedlichen Wellenlänge zu einem Zeitpunkt durch aufeinander folgendes Einfügen von Schmalbandfiltern in den optischen Weg oder durch elektronisches Scannen der Bänder unter Verwendung von akusto-optischen, abstimmbaren Filtern (AOTF) oder flüssigkristallinen, abstimmbaren Filter (LCTF) gebildet, siehe nachstehend. Ähnlich zu den Abbildungsspektrometern des Spalttyps, die, wie vorstehend beschrieben, mit einem Gitter ausgestattet sind, wird während der Verwendung von auf Filtern basierenden, spektralen Streuverfahren der größte Teil der Strahlung zu einer bestimmten Zeit zurückgeworfen. Tatsächlich ist die Erfassung der vollständigen Abbildung bei einer bestimmten Wellenlänge möglich, weil alle Photonen außerhalb der augenblicklichen, gemessenen Wellenlänge zurückgeworfen werden und die CCD nicht erreichen. Der Empfindlichkeitsvorteil, den interferometrische Spektroskopie gegenüber Filter- und Gitterverfahren aufweist, ist im Stand der Technik als multiplexer Vorteil oder Fellgett-Vorteil bekannt [siehe, Chamberlain, The principles of interferometrie spectroscopy, John Wiley and Sons (1979) 16-18 und 263].
Abstimmbare Filter, wie beispielsweise AOTFs und LCTFs, weisen keine sich bewegenden Teile auf und können auf jede einzelne Wellenlänge in dem spektralen Bereich der Vorrichtung abgestimmt werden, bei der sie durchgeführt werden. Ein Vorteil der Verwendung von abstimmbaren Filtern als ein Streuverfahren für spektrale Abbildung ist deren beliebiger Wellenlängenzugriff, d.h. die Fähigkeit, die Intensität einer Abbildung bei einer Anzahl von Wellenlängen in jeder gewünschten Sequenz ohne die Verwendung von Filterrädern zu erfassen.
AOTFs und LCTFs weisen jedoch die Nachteile auf von (i) einem begrenzten spektralen Bereich (gewöhnlich \aX = 2X01Jn), während die gesamte andere Strahlung, die aus diesem spektralen Bereichs fällt, abgeblockt werden muß, (ii) Temperaturempfindlichkeit, (iii) schlechter Durchlässigkeit, (iv) Polarisationsempfindlichkeit und (v) einem Verschiebungseffekt der Abbildung während des Wellenlängenscannens im Fall von AOTFs.
Alle diese Typen von auf Filtern oder abstimmbaren Filtern basierenden Systemen wurden über die Jahre aufgrund deren Beschränkungen bei spektraler Auflösung, geringer Empfindlichkeit, Fehlen von leicht anwendbaren und hochentwickelten Soflwarealgorithmen zur Interpretation und Anzeige der Daten bei der spektralen Abbildung bei keiner Anwendung erfolgreich und ausgiebig verwendet.
Ein Verfahren und ein Gerät zur spektralen Analyse von Abbildungen, die Vorteile bei den vorstehenden Gesichtspunkten aufweisen, wurde in der US-P-08/392,019 von Cabib et al. offenbart, die am 21. Februar 1995 eingereicht wurde und die hier unter Bezugnahme mit-
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aufgenommen wird, als wäre sie hier vollständig offenbart, und die zum Gegenstand hat, ein Gerät für spektrale Analyse von Abbildungen bereitzustellen, das, verglichen mit dem herkömmlichen Abbildungsspektrometer des Spalt- oder Filtertyps all die Information besser nutzt, die von dem gesammelten, einfallenden Licht der Abbildung zugänglich ist, um im Wesentlichen die erforderlichen Rahmenzeit zu verringern und/oder das Signal/Rausch-Verhältnis zu erhöhen und das kein Linien-Scannen einschließt. Gemäß dieser Erfindung wird ein Verfahren zum Analysieren einer optischen Abbildung einer Szene bereitgestellt, um die spektrale Intensität jedes Pixels davon zu bestimmen, durch Sammeln einfallenden Lichts von der Szene, Durchleiten des Licht durch ein Interferometer, das moduliertes Licht emittiert, das einem bestimmten Satz von Linearkombinationen der spektralen Intensität des vom jedem Pixel emittierten Licht entspricht, Fokussieren des von dem Interferometer emittierten Lichts auf einer Detektoranordnung, Scannen der optischen Wegdifferenz (optical path difference, OPD), die in dem Interferometer für alle Pixels unabhängig und gleichzeitig erzeugt wird und Verarbeiten des Outputs der Detektoranordnung (der Interferogramme von allen Pixels getrennt), um die spektrale Intensität jedes Pixels davon zu bestimmen. Dieses Verfahren kann durch die Nutzung verschiedener Typen von Interferometern betrieben werden, wobei die OPD variiert wird, um die Interferogramme durch Bewegen des ganzen Interferometers, eines Elements innerhalb des Interferometers oder des Einfallswinkels der eintreffenden Strahlung aufzubauen. In all diesen Fällen werden die Interferogramme für alle Pixels der Szene vervollständigt, wenn der Scanner einen Scan des Interferometers vervollständigt. In Übereinstimmung mit den vorstehenden Eigenschaften stehende Geräte unterscheiden sich von herkömmlichen Abbildungsspektrometem des Spalt- und Filtertyps durch Nutzen eines wie vorstehend beschriebenen Interferometers, wodurch die gesammelte Energie nicht mit einer Öffnung oder einem Spalt beschränkt oder die ankommende Wellenlänge mit Schmalbandinterferenz oder abstimmbaren Filtern begrenzt wird, wobei der Gesamtdurchsatz des Systems wesentlich erhöht wird. Damit nutzen auf Interferometern basierende Geräte die gesamte, durch das einfallende Licht der zu analysierenden Szene verfügbare Information besser und verringern dabei im Wesentlichen die Erfassungsdauer und/oder erhöhen das Signal/Rausch-Verhältnis (d.h. die Empfindlichkeit).
Man ziehe beispielsweise das in John B. Wellman, Imaging Spectrometers for Terrestrial and Planetary Remote Sensing, SPEE Proceedings, Vol.750 (1987), 140 beschriebene "Wischer-Besen"-Design ("whisk-broom") in Erwägung. Man lasse &eegr; die Anzahl der Detektoren in der linearen Anordnung, mxm die Anzahl der Pixel in einem Rahmen und T die Rahmenzeit sein. Die auf jedem Pixel verbrachte Gesamtzeit in einem Rahmen, die über alle Detektoren der Anordnung summiert wird, beträgt nT/m2. Durch Verwenden der gleichen Anordnungsgröße und dem gleichen Rahmenverhältnis bei einem Verfahren gemäß der in der US-P-08/392,019 beschriebenen Erfindung beträgt die verbrauchte, über alle Detektoren auf einem besonderen Pixel summierte Zeit ebenfalls nT/m2. Während jedoch bei dem herkömmlichen Gitterverfahren
1Si.
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die Energie, die durch jeden Detektor zu jedem Zeitpunkt erfasst wird, in der Größenordnung von Hn des Gesamten liegt, da die Auflösung der Wellenlänge Vn des Bereichs beträgt, liegt bei einem Verfahren gemäß der US-P-08/392,019 beschriebenen Erfindung die Energie in der Größenordnung von 1, da die modulierende Funktion eine oszillierende Funktion (beispielsweise sinusförmig (Michelson) oder eine ähnliche Funktion wie eine kleine Finesse aufweisende Airy-Funktion mit Fabry-Perot (low finesse function with Fabry-Perot)) ist, deren Durchschnitt über einen langen OPD-Bereich 50% beträgt. Basierend auf der Standardbehandlung des Fellgett-Vorteils (oder multiplexen Vorteils), der in interferometrischen Lehrbüchern beschrieben wird [siehe beispielsweise, Chamberlain, The principles of interferometrie Spektroscopy, John Wiley and Sons (1979) 16-18 und 263], ist es möglich zu zeigen, dass erfindungsgemäße Vorrichtungen bei Erfassungen Signal/Rausch-Verhältnisse aufweisen, die in den Fällen der Rauschbegrenzungen, bei denen das Rauschniveau unabhängig von dem Signal ist (System- oder Hintergrundrauschen begrenzte Situationen) um den Faktor «0>5 verbessert sind und in den Fällen, bei denen die Begrenzung auf Photonen-Signalrauschen zurückgeht, um die Quadratwurzel des Verhältnisses des Signals bei einer einzelnen Wellenlänge zu dem durchschnittlichen Signal bei Wellenlängen mit schmalen Peak in dem Spektralbereich verbessert sind. Damit werden bei der gemäß der US-P-08/392,019 beschriebenen Erfindung alle erforderlichen OPDs gleichzeitig für alle die Pixel der Szene gescannt, um die gesamte, zum Rekonstruieren des Spektrums erforderliche Information zu erhalten, so dass die spektrale Information gleichzeitig mit der Abbildungsinformation gesammelt wird. Die Erfindung kann mit vielen, unterschiedlichen optischen Konfigurationen verwendet werden, wie beispielsweise einem Teleskop zur Fernerkundung, einem Mikroskop für Laboranalysen, Faseroptiken für industrielle Überwachungen und medizinische Abbildung, Diagnose, Therapie und anderen.
In einer weiterführenden Anmeldung (US-P-08/571,047 von Cabib et al, eingereicht am
12. Dezember 1995, die unter Bezugnahme mitaufgenommen wird, als wäre sie hier vollständig offenbart) war die Aufgabe, spektrale Abbildungsverfahren für biologische Forschung, medizinische Diagnostik und Therapie bereitzustellen, wobei die Verfahren dazu verwendet werden können, um räumliche Organisation (beispielsweise Verteilung) nachzuweisen und natürliche zelluläre und gewebsspezifische Bestandteile, Strukturen, Organelle und verabreichte Komponenten, wie angehängte Sonden (beispielsweise fluoreszierende Sonden) und Arzneimittel unter Verwendung von Lichttransmission, -reflektion und -streuung und Fluoreszenzemissionstrategien mit hoher räumlicher und spektraler Auflösung zu quantifizieren. In der US-P-08/571,047 wurde die Verwendung des spektralen Abbildunggerätes, das in der U.S.-P-08/392,019 zur fluoreszierenden in situ Hybridisierung der Interphase bei so vielen wie sechs Locus-spezifischen Sonden (jeder Locus ist auf einem anderem Chromosom angeordnet) beschrieben wird, als auch zusätzliche biologische und medizinische Anwendungen gezeigt.
In einer weiterführenden Anmeldung (US-P-08/571,047 von Cabib et al, eingereicht am
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12. Dezember 1995, die unter Bezugnahme mitaufgenommen wird, als wäre sie hier vollständig offenbart) war die Aufgabe, ein Verfahren für den gleichzeitigen Nachweis von mehreren Fluorophoren zum Nachweisen und Analysieren fluoreszierender in situ Hybridisierungen bereitzustellen, bei dem zahlreiche Chromosomenanfarbungsmittel und/oder Loci-spezifische Sonden eingesetzt werden, wobei jede mit einem unterschiedlichen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren markiert ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sowohl bei räumlicher als auch bei spektraler Auflösung hochempfindlich und zum gleichzeitigen Nachweis von Dutzenden von Fluorophoren und/oder Kombinationen aus Fluorophoren fähig. Daher kann es für den Nachweis von fluoreszierend angefärbten, vollständigen Chromosomensätzen und/oder mehreren Loci einer Art, wie der menschlichen, und zum Bereitstellen eines vollständigen farbigen Karyotyps verwendet werden,
Spektrale Bio-Abbildungssysteme sind bei all den Anwendungen potentiell nützlich, bei denen feine, spektrale Differenzen zwischen chemischen Bestandteilen bestehen, deren räumliche Anordnung und Organisation innerhalb einer Abbildung von Interesse sind. Die Erfassung kann unter Verwendung jedes theoretischen, optischen Systems, das an dem in der US-P-08/392,019 beschrieben System befestigt ist, ausgeführt werden, beispielsweise mit einem Fluoreszenz-Mikroskop kombiniert mit verabreichten, fluoreszierenden Fluorophoren oder Kombinationen von Fluorophoren.
Fluoreszenzmessungen können mit jedem Standardfilterwürfel (bestehend aus einer Filterbarriere, einem Erregerfilter und einem dichroitischen Spiegel), jedem gebräuchlichen Filterwürfel oder Kombinationen von Filterwürfeln für spezielle Anwendungen gemacht werden, vorausgesetzt, dass die Emissionsspektren innerhalb des spektralen Bereich der Systemempfindlichkeit fallen.
Einer der größten Verdienste des menschlichen Genomprojects (HGP) war die Isolation einer großen Anzahl an Nukleinsäuresonden für Krankheitsgene und andere Chromosombereiche und -Strukturen. Dieses hat das Interesse nach DNA-Diagnosen stimuliert, nachdem die Anzahl und Typen der Tests, die entwickelt werden können, von diesen Sonden abhängt. Kürzlich gab es ein besonders Interesse an fluoreszierender in situ Hybridisierung (FISH), die das Verfahren zum Markieren mit einer fluoreszierenden Gruppe, die mit einem spezifischen Nukleinsäuremolekül konjugiert ist (hier allgemein als Sonde bezeichnet), das zu einem untersuchten Chromosomenbereich komplementär ist, darstellt, gefolgt von der Visualisierung der fluoreszierenden Komponente durch Fluoreszenzmikroskopie.
Es gibt einen klaren Trend zum Einsetzen von FISH-Technologie im klinischen Bereich parallel zu ihrem traditionellen Einsatz in Labors der Grundlagenforschung. FISH kann als ein fortgeschrittener Ansatz für die Cytogenetik betrachtet werden und es ist klar, dass die Menge an Informations über Chromosomen, die durch FISH gewonnen werden kann, diejenige weit hinter sich läßt, die von Standard-Karyotypisierung durch die gegenwärtig verwendeten DNA-Banden-
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färbungsverfahren (beispielsweise G- und R- Bandenfärbung) erhalten wird. Zusätzlich kann DiagnoseA-Information unter Verwendung derartiger Techniken, wie Interphase-Cytogenetik, viel schneller gewonnen werden, verglichen mit klassischer (Metaphase) Cytogenetik, da das Anlegen von Zellkulturen und Synchronisierung ausgelassen werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine FISH-Abbildungsvorrichtung bereitgestellt, die zum gleichzeitigen Erstellen von Fluoreszenzspektren von allen Pixels aus einem Sichtfeld eines Fluoreszenzmikroskops und zum gleichzeitigen Nachweisen der Anordnung von Dutzenden von Sonden in einer Messung befähigt ist. In Verbindung mit der Verfügbarkeit von Chromosomen-spezifischen Sonden (d.h. Chromosomenanfarbungsmitteln) und Chromosomenfragmente spezifischen Sonden (beispielsweise YAC-Contigs, BAC-Contigs und bestrahlten Hybridzelllinien) und neuen Markierungsstrategien ist die Vorrichtung in der Lage, einen FISH-Karyotypen zu erzeugen, wobei jedes Chromosom mit einer unterschiedlichen Farbe (beispielsweise 24 unterschiedliche Farben für einen menschlichen, männlichen Karyotypen, 23 für einen weiblichen) angefärbt ist und/oder einem mehrfarbigen Chromosomenbandenfärbungs-Karyotyp erzeugen, wobei jedes Chromosomen ein mehrfarbiges spezifisches Bandenfarbungsmuster erlangt, wobei das Muster unter der Verwendung von mit einem Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren markierten Chromosomenfragmenten festgelegt wird. Dieses Verfahren führt zu einem extrem hohen Probendurchsatz und erlaubt die Analyse einer äußerst hohen Anzahl von unterschiedlich markierten Sonden.
Damit gibt es einen weithin anerkannten Bedarf nach einer spektralen Abbildungsvorrichtung, deren Besitz sehr vorteilhaft wäre, zum Nachweisen und Analysieren fluoreszierender in situ Hybridisierungen, bei denen zahlreiche Chromosomenanfärbungsmittel, Loci spezifische Sonden und/oder Chromosomenfragment-Sonden eingesetzt werden, die mit einem verschiedenen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren markiert sind, um einen vollständigen mehrfarbigen Karyotyp zu erhalten, wobei jedes Chromosom aufgrund einer spezifischen Farbe, eines vollständigen mehrfarbigen Chromosomenanfarbungsmusters identifiziert wird, wobei jedes Chromosom aufgrund eines mehrfarbigen Anfärbungsmusters und/oder gleichzeitiger Kartierung mehrerer Loci identifiziert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt eine spektrale
Abbildungsvorrichtung zum Nachweisen und Analysieren von in situ Hybridisierungen,
umfassend:
(a) eine Einrichtung zum Bereitstellen eines Zellkerns mit Chromosomen, wobei die
Abbildungsvorrichtung zum Nachweisen und Analysieren von in situ Hybridisierungen,
umfassend:
(a) eine Einrichtung zum Bereitstellen eines Zellkerns mit Chromosomen, wobei die
Chromosomen mit wenigstens einer Nucleinsäurensonde hybridisiert sind, die mit
wenigstens einem Fluorophor markiert ist,
(b) ein Fluoreszenzmikroskop zum Betrachten des Zellkerns, wobei das Fluoreszenzmikroskop mit einem Abbildungsspektrometer optisch verbunden ist, wobei das Fluoreszenzmikroskop und das Abbildungsspektrometer zum Erhalten eines Spektrums jedes Pixels der Zelle dienen, wobei das Erlangen des Spektrums jedes Pixels des Zellkerns erreicht wird mit:
(i) einer Einrichtung zum Sammeln von einfallendem Licht gleichzeitig von allen Pixeln des Zellkerns unter Verwendung parallel ausrichtender optischer Einrichtungen,
(ii) einem Merferometersystem zum Durchleiten des einfallenden, parallel ausgerichteten Lichts , mit einer Anzahl an Elementen, so dass das Licht zuerst in
(ii) einem Merferometersystem zum Durchleiten des einfallenden, parallel ausgerichteten Lichts , mit einer Anzahl an Elementen, so dass das Licht zuerst in
zwei kohärente Strahlen geteilt wird, die sich in unterschiedliche Richtungen innerhalb des Interferometers bewegen, worauf sich die Strahlen erneut vereinigen, um miteinander zu interferieren, um einen austretenden Lichtstrahl zu bilden,
(iii) einem fokussierenden, optischen System zum Durchleiten des austretenden Lichtstrahls, das den austretenden Lichtstrahl auf einen Detektor mit einer zweidimensionalen Anordnung von Detektorelementen fokussiert, so dass zu jedem Zeitpunkt jedes der Detektorelemente die Abbildung eines und immer des gleichen Pixels des Zellkerns während der ganzen Dauer der Erfassung bewirkt, so dass die reale Abbildung des Zellkerns stationär auf der Ebene der
Detektoranordnung ist, und dass die Abbildung zu jedem Zeitpunkt während der Erfassung sichtbar und erkennbar ist, und so dass jedes der Detektorelemente ein Signal erzeugt, das eine besondere Linearkombination der durch das Pixel bei unterschiedlichen Wellenlängen emittierten Lichtintensität ist, wobei die Linearkombination eine Funktion der momentanen optischen Wegdifferenz ist,
(iv) einer Einrichtung zum Drehen oder Verschieben eines oder mehrerer Elemente des Interferometersystems, so dass die optische Wegdifferenz zwischen den zwei kohärenten, durch das Interferometersystem erzeugten Strahlen für alle Pixel des Zellkerns gleichzeitig abgetastet wird, und
(v) einer Einrichtung zum Aufnehmen der Signale von jedem der Detektorelemente
als Funktion der Zeit unter Verwendung einer Aufnahmevorrichtung, um einen ersten spektralen Datenblock zu bilden, und
(c) eine Einrichtung zum Auswerten des ersten, spektralen Datenblocks unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus.
Ferner wird erfindungsgemäß angegeben eine spektrale Abbildungsvorrichtung zum Nachweisen und Analysieren von Hybridisierungen, umfassend :
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(a) eine Einrichtung zum Bereitstellen eines Zellkerns einer ersten Art mit einem Genom und Chromosomen, wobei die Chromosomen mit wenigstens einer Gruppe von Chromosmenfragmenten hybridisiert sind, die wenigstens eine Fraktion des Genoms der ersten Art abdecken, wobei jede der wenigstens einen Gruppe von Chromosomenfragmenten mit wenigstens einem Fluorophor markiert ist,
(b) ein Fluoreszenzmikroskop zum Betrachten des Zellkerns, wobei das Fluoreszenzmikroskop mit einem Abbildungsspektrometer optisch verbunden ist, wobei das Fluoreszenzmikroskop und das Abbildungsspektrometer zum Erhalten eines Spektrums jedes Pixels der Zelle dienen, wobei das Erlangen des Spektrums jedes Pixels des Zellkerns erfolgt mit:
(i) einer Einrichtung zum Sammeln von einfallendem Licht gleichzeitig von allen Pixeln des Zellkerns unter Verwendung parallel ausrichtender optischer Bestandteile,
(ii) einem Interferometersystem zum Durchleiten des einfallenden, parallel ausgerichteten Lichts, mit einer Anzahl von Elementen, so dass das Licht zuerst in
(ii) einem Interferometersystem zum Durchleiten des einfallenden, parallel ausgerichteten Lichts, mit einer Anzahl von Elementen, so dass das Licht zuerst in
zwei kohärente Strahlen geteilt wird, die sich in unterschiedliche Richtungen innerhalb des Interferometers bewegen, worauf sich die Strahlen erneut vereinigen, um miteinander zu interferieren, um einen austretenden Lichtstrahl zu bilden,
(iii) einem fokussierenden, optischen System zum Durchleiten des austretenden
Lichtstrahls, das den austretenden Lichtstrahl auf einen Detektor mit einer zweidimensionalen Anordnung von Detektorelementen fokussiert, so dass zu jedem Zeitpunkt jedes der Detektorelemente die Abbildung eines und immer des gleichen Pixels des Zellkerns während der ganzen Dauer der Erfassung ist, so dass die reale Abbildung des Zellkerns stationär auf der Ebene der Detektoranordnung
ist und dass die Abbildung zu jedem Zeitpunkt der Erfassung sichtbar und erkennbar ist, und so dass jedes der Detektorelemente ein Signal erzeugt, das eine besondere Linearkombination der, durch das Pixel bei unterschiedlichen Wellenlängen emittierten Lichtintensität ist, wobei die Linearkombination eine Funktion der momentanen optischen Wegdifferenz ist,
(iv) eine Einrichtung zum Drehen oder Verschieben eines oder mehrerer Elemente des Interferometersystems, so dass die optische Wegdifferenz zwischen den zwei, kohärenten, durch das Interferometersystem erzeugten Strahlen für alle Pixel des Zellkerns gleichzeitig abgetastet wird, und
(v) eine Einrichtung zum Aufnehmen der Signale von jedem der Detektorelemente als
Funktion der Zeit unter Verwendung einer Aufnahmevorrichtung, um einen ersten spektralen Datenblock zu bilden, und
(c) eine Einrichtung zum Auswerten des ersten, spektralen Datenblocks unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus.
Bevorzugte Ausfuhrungsformen der Vorrichtung sind Gegenstand der Unteransprüche.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ferner eine spektrale Abbildungsvorrichtung bereitgestellt, die auf das Nachweisen und Analysieren von fluoreszierenden in situ Hybridisierungen ausgerichtet ist, wobei zahlreiche Chromosomenanfärbungsmittel und/oder Loci spezifische Sonden eingesetzt werden, die jeweils mit einem unterschiedlichen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren markiert sind und auf eine mehrfarbige Chromosomenanfärbung ausgerichtet ist (d.h. mit Strich-/Banden-Code versehen), wobei jedes Chromosom ein spezifisches Bandenfärbungsmuster erlangt, das unter Verwendung von Gruppen von mit einem Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren markierten Chromosomenfragmenten erhalten wird.
Gemäß weiterer Merkmale in den bevorzugen Ausfuhrungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung umfasst die Vorrichtung die Merkmale : (a) zur Mehrfarben-Chromosomenanfarbung: Bereitstellen eines Zellkerns mit Chromosomen, wobei die Chromosomen mit wenigstens einer Nucleinsäuresonde hybridisiert sind, die mit wenigstens einem Flourophor markiert ist, oder (a') zur Mehrfarben-Chromosomenbändenfärbung: Bereitstellen eines Zellkerns einer ersten Art mit einem Genom und Chromosomen, wobei die Chromosomen mit wenigstens einer Gruppe von Chromosomenfragmenten hybridisiert sind, die wenigstens einen Anteil des Genoms der ersten Art abdecken, wobei jede der Gruppen der Fragmente mit wenigstens einem Fluorophor markiert ist, (b) Betrachten des Zellkerns durch ein Fluoreszenzmikroskop, wobei das Fluoreszenzmikroskop mit einem Abbildungsspektrometer optisch verbunden ist, wobei das Fluoreszenzmikroskop und das Abbildungsspektrometer zum Erhalten eines Spektrums eines jeden Pixels der Zelle dienen, wobei das Erlangen des Spektrums jedes Pixels des Zellkerns erreicht wird durch, (i) Sammeln von einfallendem Licht gleichzeitig von allen Pixeln des Zellkerns unter Verwendung parallel ausrichtender optischer Bestandteile, (ii) Durchleiten des einfallenden, parallel ausgerichteten Lichts durch ein Interferometersystem mit einer Anzahl von Elementen, so dass das Licht zuerst in zwei kohärente Strahlen geteilt wird, die sich in unterschiedliche Richtungen innerhalb des Interferometers bewegen, worauf sich die Strahlen erneut vereinigen, um miteinander zu interferieren, um einen austretenden Lichtstrahl zu bilden, (iii) Durchleiten des austretenden Lichtstrahls durch ein fokussierendes, optisches System, das den austretenden Lichtstrahl auf einen Detektor mit einer zweidimensionalen Anordnung von Detektorelementen fokussiert, so dass zu jedem Zeitpunkt jedes der Detektorelemente die Abbildung eines und immer des gleichen Pixels des Zellkerns während der ganzen Dauer der Erfassung ist, so dass die reale Abbildung des Zellkerns stationär auf der Ebene der Detektoranordnung ist und dass die Abbbildung zu jedem Zeitpunkt der Erfassung immer noch sichtbar
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und erkennbar ist und so dass jedes der Detektorelemente ein Signal erzeugt, das eine besondere Linearkombination der, durch das Pixel bei unterschiedlichen Wellenlängen emittierten Lichtintensität ist, wobei die Linearkombination eine Funktion der momentanen optischen Wegdifferenz ist, (iv) Drehen oder Verschieben eines oder mehrerer Elemente des Interferometersystems, so dass die optische Wegdifferenz zwischen den zwei kohärenten, durch das Interferometersystem erzeugten Strahlen für alle Pixel des Zellkerns gleichzeitig gescannt wird, und (v) Aufnehmen der Signale jedes der Detektorelemente als Funktion der Zeit unter Verwendung einer Aufnahmevorrichtung, um einen ersten spektralen Datenwürfel zu bilden und (c) Auswerten des ersten, spektralen Datenwürfels unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist das Fluoreszenzmikroskop mit einem Filtern ergänzt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem dichroitischen Zweibandfilter und einem dichroitischen Dreibandfilter.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist die wenigstens eine Nucleinsäuresonde ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus wenigstens einem Locus, wenigstens einem fragmentierten Chromosom, wenigstens einem künstlichen Hefechromosom einschließlich eines Inserts, wenigstens eines Plasmids einschließlich eines Insters, wenigstens eines Cosmids einschließlich eines Inserts, wenigstens einem viralen Vektor einschließlich eines Inserts, einem vollständigen Genom einer Art oder eines Krebsgewebes und Kombinationen davon.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen wird das Markieren der Nucleinsäuresonden und der Chromosomenfragmente durch kombinatorische Markierungs- oder Hybridisierungsstrategien erreicht.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausfuhrungsformen wird die Vorrichtung zur vergleichenden Genomhybridisierung verwendet.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Zellkern ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Zellkern während der Interphase, einem Zellkern während der Mitose und einem Zellkern während der Meiose.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist die Anzahl der Nucleinsäuresonden ausgewählt aus der Gruppe von Anzahlen, bestehend aus eins, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn, siebzehn, achtzehn, neunzehn, zwanzig, einundzwanzig, zweiundzwanzig, dreiundzwanzig, vierundzwanzig und größer als vierundzwanzig, wobei jede der Sonden ein unterschiedliches Fluorophor oder eine unterschiedliche Kombination der Fluorophore umfaßt.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen sind die Chromosomen Interphasenchromosome, Chromosome während der Mitose und Chromosome während der Meiose.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist
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der mathematische Algorithmus eine Punktoperationssanalyse des Spektrums von jedem Pixel in dem Zellkern.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen schließt die Punktoperationsanalyse Zuordnen des Spektrums von jedem Pixel in dem Zellkern zu einen Skalar gemäß einer Transformationsfunktion ein.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen schließt die Punktoperationsanalyse Zuordnen des Spektrums von jedem Pixel in dem Zellkern zu einem anderen Spektrum gemäß einer Transformationsfunktion ein.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist der mathematische Algorithmus eine morphologische Analyse, wobei die morphologische Analyse die relative Größe der Chromosomen in dem Zellkern bestimmt.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist der mathematische Algorithmus eine Einteilungs-Zuordnungsanalyse die eine spektrale Differenz von wenigstens einem Referenzspektrum für das Spektrum jedes Pixels berechnet.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen führt die Einteilungs-Zuordnungsanalyse zur Erzeugung einer mehrfarbigen Abbildung, bei der Gruppen mit einer bestimmten, maximalen, spektralen Differenz von einem der mehreren Referenzspektren mit einer bestimmten, künstlichen Farbe angefärbt sind.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen führt die Einteilungs-Zuordnungsanalyse zur Erzeugung einer mehrfarbigen Abbildung, bei der Gruppen mit einer bestimmten, maximalen, spektralen Differenz von einem der mehreren Referenzspektren mit einer bestimmten, künstlichen Farbe angefärbt sind.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist die spektrale Differenz ein Skalar, der als das Integral über einem bestimmten Wellenlängenbereich des absoluten Werts der Differenz zwischen dem Spektrum von jedem Pixel und einem der mehreren Referenzspektren definiert ist.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist der mathematische Algorithmus eine Hauptkomponentenanalyse.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen schließt die Hauptkomponentenanalyse ein, (a) Aufbauen einer kovarianten Matrix für alle Pixel und Wellenlängen der Erfassung, einschließlich Wellenlängen der anregenden Quellen, wenn mehrere Wellenlängen verwendet werden, (b) Diagonalisieren der kovarianten Matrix und Auffinden aller unabhängiger, orthogonaler Basiselemente, (c) Herausfinden, welche der Basiselemente oder eine Kombination davon gewisse Eigenschaften in dem Zellkern markieren.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist der mathematische Algorithmus eine Linearkombinationsanalyse.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient die Linearkombinationsanalyse zur spektralen Normierung.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen schließt die Linearkombinationsanalyse Anlegen eines bestimmten Skalars an jede Wellenlänge der Spektren jedes Pixels durch eine arithmetische Funktion ein, wobei die Funktion ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus Addition, Subtraktion, Multiplikation, Division und/oder Kombinationen davon.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient die Linearkombinationsanalyse zur Hintergrundsubtraktion, bei der ein Spektrum eines in einem Hintergrundbereich des Zellkerns angeordneten Pixels von den Spektren der Pixel des Zellkerns subtrahiert wird.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausfuhrungsformen dient die Linearkombinationsanalsye dem Kalibrierungsverfahren, bei dem ein vor dem Betrachten des Zellkerns erfaßtes Spektrum zum Dividieren der Spektren der Pixel des Zellkerns dient.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen berechnet der mathematische Algorithmus eine Rot-Grüh-Blau-Farbabbildung unter der Verwendung bestimmter Wellenlängenbereiche.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen berechnet der mathematische Algorithmus eine Rot-Grüh-Blau-Farbabbildung unter der Verwendung bestimmter Wellenlängenbereiche.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist die Rot-Grün-Blau-Farbabbildung durch einen Kontrast-streckenden Algorithmus modifiziert.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsforrnen berechnet der mathematische Algorithmus ein Verhältnis zwischen Intensitäten bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen für jedes der Spektren der Pixel.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsforrnen berechnet der mathematische Algorithmus ein Verhältnis zwischen Intensitäten bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen für jedes der Spektren der Pixel.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen berechnet der mathematische Algorithmus ein Verhältnis zwischen Intensitäten bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen für jedes der Spektren der Pixel und färbt jedes der Pixels in einer helleren oder dunkleren künstlichen Farbe gemäß des berechneten Verhältnisses an.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen
dient die Vorrichtung für eine Anwendung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bereitstellen eines farbigen Karyotyps embryonaler Zellen, Bereitstellen eines farbigen Karyotyps von Leukozyten, Bereitstellen eines farbigen Karyotyps bösartiger Zellen und Bereitstellen eines farbigen Karyotyps von auf Bösartigkeit untersuchten Zellen.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient das Bereitstellen des farbigen Karyotyps der auf Bösartigkeit untersuchten Zellen zum Erhalten einer farbigen Translokationszuordnung.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient das Bereitstellen des farbigen Karyotyps bösartigen Zelle zum Erhalten einer farbigen Translokationszuordnung.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen sind die Chromosomen weiterhin mit einem herkömmlichen Chromosomenbandenfärbungsfarbstoffes angefärbt, wobei die Vorrichtung weiterhin das Erhalten einer Grauwert-Bandenfärbungsabbildung der Chromosomen umfasst.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist
der herkömmliche Bandenfärbungsfarbstoff DAPI.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausfuhrungsformen sind die Chromosomenfragmente aus einer Quelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus bestrahlten Hybridzelllinien, YAC-Klonen, BAC-Klonen, nach Größe getrennten Endonuclease-Spaltprodukten des Genoms der Art und mikro-zerlegten Chromosomenfragmenten.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen besteht die Markierung der Fragmente durch eingestreute, sich wiederholende Sequenzen -PCR.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausfuhrungsformen ist die eingestreute, sich wiederholende Sequenz Alu.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen sind die Fluorophore mit einem Nucleotid oder einem Nucleotidanalogon konjugiert.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen wird die Fraktion ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 10-20%, 21-30%, 31-40%, 41-50%, 51-60%, 61-70%, 71-80%, 81-90% und 91-100%.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen ist die erste Art ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mensch und Maus.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen sind die Chromosomenfragmente von einer zweiten Art.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen sind die Chromosomenfragmente in Gruppen gruppiert, wobei jede der Gruppen mit einem unterschiedlichen Fluorophor oder Kombination von Fluorophoren markiert ist.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient die Vorrichtung für eine Anwendung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bereitstellen eines farbigen Bandenfarbung-Karyotyps embryonaler Zellen, Bereitstellen eines farbigen Bandenfarbung-Karyotyps von Leukozyten, Bereitstellen eines farbigen Bandenfarbung-Karyotyps bösartiger Zellen und Bereitstellen eines farbigen Bandenfarbung-Karyotyps von auf Bösartigkeit untersuchten Zellen.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen sind die embryonalen Zellen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chorionzotten-Zellen und Zellen, die aus dem peripheren Blut einer schwangeren Frau isoliert sind.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient die Vorrichtung zum Nachweisen einer Trisomie genetischen Materials, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus menschlichem Chromosom 21, menschlicher Chromosomenbande 21q22, einem Fragment der menschlichen Chromosomenbande 21q22, menschlichem Chromosom 18, einem Fragment des menschlichen Chromosoms 18, menschlichem Chromosom 13 und einem Fragment des menschlichen Chromosoms 13.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen
dient das Bereitstellen des farbigen Bandenfärbung-Karyotyps der auf Bösartigkeit untersuchten Zellen zum Erhalten einer farbigen Translokationszuordnung.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient das Bereitstellen des farbigen Bandenfärbung-Karyotyps der bösartigen Zellen zum Erhalten einer farbigen Translokationszuordnung.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient die Vorrichtung zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen sind die chromosomalen Abweichungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Deletionen, Inversionen, Translokationen und Amplifikationen.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient die Vorrichtung zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus wiederkehrenden, chromosomalen Abweichungen und sekundären, chromosomalen Abweichungen.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient die Vorrichtung zum Nachweisen des Stadiums einer Bösartigkeit.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient das Nachweisen des Stadiums der Bösartigkeit zum Auswählen einer Behandlung der Bösartigkeit.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient die Vorrichtung zum Verfolgen einer Antikrebsbehandlung.
Gemäß noch weiterer Merkmale in den beschriebenen, bevorzugten Ausführungsformen dient die Vorrichtung zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen nach dem Aussetzen gegenüber mitogenen Agenzien.
Die vorliegende Erfindung wendet sich erfolgreich gegen die Unzulänglichkeiten der vorliegend bekannten Konfigurationen durch Bereitstellen einer Vorrichtung für in situ Hybridisierung, die empfindlich genug ist, um gleichzeitig Dutzende von spektral ähnlichen, dennoch ein wenig unterschiedlichen fluoreszierenden Sonden nachzuweisen, wobei die Vorrichtung einen farbigen Karyotyp bereitstellen kann, in dem jedes Chromosomenpaar in einer unterschiedlichen RGB-Farbe oder künstlichen Farbe erscheint, gleichzeitig Dutzende von Loci Kartieren kann und eine Kombination von farbiger Karyotypisierung und Kartierung mehrerer Loci und Mehrfarben-Chromosornenbandenanfärbung bereitstellen kann.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird hier lediglich beispielhaft unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen beschrieben, worin:
Figur 1 ein herkömmliches (Stand der Technik) Abbildungsspektrometer des Spalttyps zeigt;
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Figur 2 ein Blockdiagramm ist, das die Hauptbestandteile eines Abbildungspektrometers zeigt, das in Übereinstimmung mit der US-P-08/392,019 (Stand der Technik) aufgebaut ist;
Figur 3 ein Interferometer vom unbeweglichen Typs zeigt, nämlich ein Sagnac-Interferometer, wie in einem Abbildungsspektrometer in Übereinstimmung mit der US-P-08/392,019 (Stand der Technik) verwendet wird;
Figur 4 eine Definition von Pseudo-RGB-(rot, grün, blau)-Farben zum Hervorheben ausgewählter Spektralbereiche zeigt; Die Intensität für jede Pseudo-Farbe wird durch Integrieren des Bereichs unter der Kurve berechnet, nachdem er mit einer der Kurven multipliziert wurde;
Die Figuren 5a, 5b und 5c Interphase-FISH zeigen, die mit zwei unterschiedlichen, an Texas-Rot und Rhodamin angebrachten Sonden durchgeführt wurde, wobei (a) eine ursprüngliche Abbildung ist, so wie sie durch ein Mikroskop aussieht, (b) die gleiche Probe nach dem Erfassen und Verarbeiten durch die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist, und (c) die Fluoreszenzspektren der Texas-Rot- und Rhodamin-Fluorophore sind;
Die Figuren 5a, 5b und 5c Interphase-FISH zeigen, die mit zwei unterschiedlichen, an Texas-Rot und Rhodamin angebrachten Sonden durchgeführt wurde, wobei (a) eine ursprüngliche Abbildung ist, so wie sie durch ein Mikroskop aussieht, (b) die gleiche Probe nach dem Erfassen und Verarbeiten durch die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist, und (c) die Fluoreszenzspektren der Texas-Rot- und Rhodamin-Fluorophore sind;
Die Figuren 6a, 6b und 6c Interphase-FISH zeigen, die mit sechs unterschiedlichen Sonden durchgeführt wird, die jede mit einem unterschiedlichen Fluorophor markiert sind, wobei (a) eine ursprüngliche Abbildung ist, so wie sie durch ein Mikroskop aussieht, wobei die Zellen mit DAPI Kontrast-angefärbt wurden, (b) die gleiche Probe nach dem Erfassen und Verarbeiten durch die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist, und (c) die Fluoreszenzspektren der sechs Chromophore darstellt;
Die Figuren 7a, 7b, 7c, 7d und 7e gemeinsam 24 normierte Spektren von 24 Pixeln der Abbildung der Figuren 8a und 9a zeigen, wobei jedes der Pixel von einen unterschiedlichen, menschlichen Chromosom (1-22, X und Y) abgeleitet wird und wobei jedes Chromosom unter Verwendung eines unterschiedlichen Chromosomen-anfärbungsmittels angefärbt wird, wie in den nachstehenden Tabellen 3 und 4 detailliert ausgeführt wird;
Die Figuren 8a und 8b eine unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhaltene RGB-Abbildung bzw. ein davon abgeleiteter farbiger Karyotyp (dargestellt in Schwarz/Weiß) der 24 menschlichen, männlichen Chromosomen (1-22, X und Y) zeigen, wobei jedes Chromosom unter Verwendung eines unterschiedlichen Chromosomenanfärbungsmittels angefärbt ist, wie in den nachstehenden Tabellen 3 und 4 detailliert ausgeführt wird;
Die Figuren 9a und 9b farbige Darstelllungen der entsprechenden Figuren 8a und 8b sind;
Die Figuren 10a, 10b, 10c und 1Od eine unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhaltene (a) RGB-Abbildung, (b) ein davon abgeleiteter farbiger Karyotyp, (c) eine Einteilungskartierung der Abbildung unter a, und (d) ein entsprechend von c abgeleiteter farbiger Karyotyp eines der 24 menschlichen, männlichen Chromosomen (1-22, X, Y) zeigen, wobei jedes der Chromosomen unter Verwendung eines unterschiedlichen, Chromosomenanfärbungsmittels angefärbt ist, wie in den nachstehenden Tabellen 3 und 4 detailliert beschrieben wird, wobei alle Abbildungen in Schwarz/Weiß dargestellt werden;
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Die Figuren lla, 11b, lic und Hd die entsprechenden farbigen Darstellungen der Figuren 10a-d sind;
Die Figuren 12a, 12b, 12c, 12d und 12e sind (a) eine mit DAPI R-Banden angefärbte
Fotografie einer ersten Chromosomenspreizung der Brustkrebszelllinie SKBR3 mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop, (b) einen farbigen RGB-Karyotyp der ersten Spreizung, der unter Verwendung der Chromosomenanfärbungsmittel, wie in den Figuren 9a-b und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung (dargestellt in Schwarz/Weiß) erhalten wird, (c) eine mit DAPI R-bandenfarbende Fotografie, die von einer zweiten Chromosomenspreizung mit dem SpectraCube™-System erhalten wird, (d) ein farbiger RGB-Karyotyp der ersten Spreizung, der unter Verwendung der Chromosomenanfärbungsmittel wie in den Figuren 9a-b und (e) eine RGB farbvergleichende Genomhybridisierung (comparative genomic hybridization, CGH) von zwei Markierungschromosomen der in den Figuren 12 und 12d mit Pfeilen markierten SKBR3-Zelllinie unter Verwendung von aus einer Zelllinie extrahierte DNA (oberer Teil von e) und von einer Dualfarb-FISH-Analyse mit einer Chromosomen-angefärbenden Sonde für Chromosom 8 (in blau) und einer Kosmidsonde für das c-myc Onkogen (in rot) (unterer Teil von e);
Die Figuren 13a und 13b ursprüngliche, deutlichere Darstellungen und Farbdarstellungen der Figuren 12a-e sind;
Figur 14 eine vergleichende Darstellung der mit DAPI R-bandenangefarbten und einer interpretierten Darstellung der angefärbten, umgelagerten Chromosomen, dargestellt in den Figuren 13a (links) beziehnungsweise 13b (rechts) ist, wie aus Figur 13b abgeleitet und unter Verwendung des in Figur 9b gezeigten farbigen Karyotyps interpretiert wird;
Figur 15 eine Farbdarstellung von Figur 14 ist;
Figur 15 eine Farbdarstellung von Figur 14 ist;
Die Figuren 16a und 16b (a) eine RGB-Abbildung einer Chromosomenspreizung mit einer Translokation t(l;ll)(q44;pl5.3) sind, wobei das Insert eine spektralbasierende Einteilung der umgelagerten Chromosomen, bei dem Material des Chromosoms 1 künstlich in gelb und Material des Chromosms 11 künstlich in blau angefärbt ist, (b) eine RGB-Abbildung eines Chromosoms mit Translokation (Translokation eines Segments von Chromosom 4 zu Chromosom 12) aus einer Metaphasenspreizung nach spektralen Karyotypisieren gemäß der erfindungsgemäßen Vorrichtung (rechte obere Reihe) und die resultierende künstliche Farbabbildung nach Anlegen eines Einteilungs-Zuordnungsalgorithmus (linke obere Reihe) und (c) einer G-Bandenfärbungsanalyse und herkömmlicher zweifarbiger FISH mit anfärbenden Sonden für Chromosom 4 (grün) und 12 (rot);
Die Figuren 17a und 17b die entsprechenden Farbdarstellungen der Figuren 16a-b sind;
Figur 18 ein spektraler mehrfarbiger Karyotyp der Gibbonart Hylobates concolor nach der Hybridisierung mit Anfärbesonden menschlicher Chromosome ist;
Figur 19 eine Farbdarstellung von Figur 18 ist;
Figur 20 RGB-Abbildungen weniger Chromosomen mit Strich-Codes zeigt, die entlang
Figur 18 ein spektraler mehrfarbiger Karyotyp der Gibbonart Hylobates concolor nach der Hybridisierung mit Anfärbesonden menschlicher Chromosome ist;
Figur 19 eine Farbdarstellung von Figur 18 ist;
Figur 20 RGB-Abbildungen weniger Chromosomen mit Strich-Codes zeigt, die entlang
ihrer Längsachse angeordnet sind, wie sie unter Verwendung der mehrfarbigen, erfindungsgemäßen Chromosombandenfärbungsvorrichtung erhalten werden;
Figur 21 eine Farbabbildung von Figur 20 ist;
Figur 21 eine Farbabbildung von Figur 20 ist;
Die Figuren 22a, 22b und 22c (a) eine R-bandenangefärbte Abbildung, die DAPI zum Färben der Chromosomen verwendet, (b) eine G-bandenangefärbte Abbildung, die durch Darstellen der negativen Abbildung von Figur 22a erhalten wird und (c) eine RGB-Abbildung eines farbigen-Karyotyps sind, die menschliche Chromosornenanfärbungsmittel einer einzigen Chromosomenspreizung einer Maus verwendet, wobei alles unter Verwendung des SpectraCube™-Systems erhalten wird;
Die Figuren 23a, 23b und 23c die entsprechenden, ursprünglichen und Farbdarstellungen der Figuren 22a, 22b und 22c sind.
Die vorliegende Erfindung ist eine spektrale Abbildungsvorrichtung zum Nachweisen und Analysieren fluoreszierender in situ Hybridisierungen, bei der zahlreiche Chromosomenanfärbungsmittel, Chromosomenfragmente und Locus-spezifische Sonden eingesetzt werden, die mit einem unterschiedlichen Fluorophor oder einer Kombination aus Fluorophoren markiert sind, wobei die Vorrichtung sowohl in räumlicher als auch in spektraler Auflösung hochempfindlich ist und zum gleichzeitigen Nachweis von Dutzenden von Fluorophoren und/oder Kombinationen von Fluorophoren befähigt ist. Deshalb kann die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Nachweis von fluoreszierend angefärbten, vollständigen Chromosomensätzen, mehreren Loci und/oder chromosomenspezifischer mehrfarbiger Bandenfärbungsmuster (d.h mit einem Strich-/Bandencode versehen) einer Art wie dem Menschen und zum Bereitstellen eines farbigen Karyotyps verwendet werden, wobei jedes Chromosom aufgrund einer spezifischen Farbe und eines vollständigen mehrfarbigen Chromosomenbandenlarbungsmusters identifiziert ist und wobei jedes Chromosom gemäß eines spezifischen mehrfarbigen Bandenfärbungsmuster identifiziert ist.
Zu Zwecken des besseren Verständnisses der vorliegenden, wie in den Figuren 4-23 der Zeichnungen erläuterten Erfindung wird zuerst auf den Aufbau und die Betriebsweise eines herkömmlichen (d.h. Stand der Technik) Abbildungsspektrometers des Spalttyps Bezug genommen, bei dem eine zweidimensionale, wie in Figur 1 gezeigte Detektorenanordnung eingesetzt wird.
Damit umfasst das in Figur 1 erläuterte Abbildungsspektrometer des Spalttyps des Standes der Technik ein wie bei 2 angezeigtes optisches Sammelsystem zum Sammeln des einfallenden Lichts einer Szene, das bei 4 schematisch angedeutet wird und das im Wesentlichen paralleles Licht der Szene 4 auf eine erste in der Brennebene liegende Platte fokussiert, die von einem Spalt 6 in Anspruch genommen wird, um das Sichtfeld zu bestimmen. Das von Spalt 6 austretende Licht wird in einer Kollimatorlinse 8 parallel gerichtet und durch ein spektrales
Streuelement 10 (beispielsweise ein Gitter) durchgeleitet, um verschiedene Wellenlängen zu trennen. Die Ausgabe des spektralen Streuelements 10 wird durch eine fokussierende Linse 12 auf eine zweidimensionale Detektoranordnung 14 in einer zweiten Brennebene fokussiert. Der Output der Detektoranordnung 14 wird einer Signalverarbeitungsvorrichtung 16 zugeführt.
In der zweidimensionalen Detektoranordnung 14, die den Stand der Technik des Abbildungsspektrometer der Figur 1 erläutert, bewirkt die Bewegung des Systems (beispielsweise eine Rasterbewegung oder durch Pfeil 13 angezeigtes Linienscannen) das Scannen entlang einer Dimension. Das Scannen entlang der zweiten Dimension wird durch den Spalt 6 beeinflußt, der senkrecht zu der Bewegungsrichtung des Systems orientiert ist. Der Spalt 6 stellt damit sicher, dass jeder Detektor innerhalb der Anordnung 14 nur die Verteilung eines Pixels bei einer einzelnen Wellenlänge zu jedem Zeitpunkt sieht. Dies ist notwendig, um die Spektren jedes Pixels zu trennen.
In der zweidimensionalen Detektoranordnung 14, die den Stand der Technik des Abbildungsspektrometer der Figur 1 erläutert, bewirkt die Bewegung des Systems (beispielsweise eine Rasterbewegung oder durch Pfeil 13 angezeigtes Linienscannen) das Scannen entlang einer Dimension. Das Scannen entlang der zweiten Dimension wird durch den Spalt 6 beeinflußt, der senkrecht zu der Bewegungsrichtung des Systems orientiert ist. Der Spalt 6 stellt damit sicher, dass jeder Detektor innerhalb der Anordnung 14 nur die Verteilung eines Pixels bei einer einzelnen Wellenlänge zu jedem Zeitpunkt sieht. Dies ist notwendig, um die Spektren jedes Pixels zu trennen.
Wie bei der Erläuterung des Standes der Technik und vorstehend hier erwähnt, ist der Nachteil des in Figur 1 erläuterten Verfahrens gemäß des Standes der Technik, daß die meisten Pixel von einem Rahmen nicht zu jeden bestimmten Zeitpunkt gemessen werden, obwohl das optische System 2 eigentlich sogar Energie von allen von ihnen gleichzeitig sammelt. Als Ergebnis wird in Bezug auf ein System, das keinen derartigen Spalt benötigt, die erforderliche Rahmenzeit deutlich erhöht und/oder das Signal/Rausch-Verhältnis (Empfindlichkeit) wesentlich erniedrigt. Einem Fachmann ist klar, dass immer noch Abbildungsspektrometer des Spalttyps aus dem Stand der Technik, wie beispielsweise das in Figur 1 gezeigte, und auf Filtern basierende Abbildungsspektrometer (nicht gezeigt) aus dem Stand der Technik ebenfalls für einige Anwendungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung von Nutzen sein können, wie hier nachstehend beschrieben wird.
Figur 2 ist ein Blockdiagramm, das die Hauptbestandteile eines verbesserten Abbildungsspektrometers aus dem Stand der Technik erläutert, das in der US-P-08/392,019, von Cabib et al., eingereicht am 21. Februar, 1995, die hier unter Bezugnahme mitaufgenommen wird, als wäre sie hier vollständig offenbart, gezeigt ist. Dieses Abbildungsspektrometer wurde für den Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung sehr geeignet entworfen.
Das Abbildungsspektrometer von Figur 2 nach dem Stand der Technik umfasst damit: ein optisches Sammelsystem, das im Allgemeinen mit 20 bezeichnet wird, einen eindimensionalen Scanner, durch Block 22 angezeigt, einen Erzeuger für Unterschiede der optischen Weglänge (optical path difference, OPD) oder ein Interferometer, als Block 24 gezeigt, eine eindimensionale oder zweidimensionale Detektoranordnung, als Block 26 angezeigt, und eine Signal Verarbeitungsvorrichtung und -anzeige, als Block 28 gekennzeichnet.
Ein problembehaftetes Element in System 20 ist der OPD-Erzeuger oder das Interferometer 24, der/das moduliertes Licht abgibt, das einem bestimmten Satz von Linearkombinationen der spektralen Intensität des emittierten Lichts entspricht, das von jedem Pixel
der zu analysieren Szene emittiert wird. Die Ausgabe des Interferometers ist auf eine Detektoranordnung 26 fokussiert. Damit werden alle erforderlichen, optischen Phasendifferenzen für alle Pixel des Sichtfeld gleichzeitig gescannt, um die vollständige Information zu erhalten, die erforderlich ist, um das Spektrum zu rekonstruieren. Die Spektren aller Pixel in der Szene werden damit gleichzeitig mit der Abbildungsinformation gesammelt und erlauben somit die Analyse der Abbildung in Echtzeit.
Das Gerät gemäß der US-P-08/392,019 kann bei mehreren Konfigurationen eingesetzt werden. So kann das verwendete Interferometer insbesondere mit anderen Spiegeln kombiniert werden, wie in den entsprechenden Figuren der US-P-08/392,019 beschrieben wird.
Damit können gemäß US-P-08/392,019 alternative Interferometertypen oder Interferometer eingesetzt werden. Diese umfassen (1) einen bewegbaren Interferometertyp, in dem die OPD variiert wird, um das Licht zu modulieren, d.h. ein Fabry-Perot-Interferometer mit gescannter Dicke, (2) einen Interferometertyp nach Michelson, der einen Strahlteiler, der den Strahl von einem optischen Sammelsystems erhält, und einen Scanner einschließt und den Strahl in zwei Wege spaltet, (3) ein Sagnac-Interferometer, das optisch mit anderen optischen Mitteln kombiniert ist, in denen die OPD mit dem Einfallswinkel der ankommenden Strahlung variiert, wie beispielsweise das Interferometer mit vier Spiegeln plus Strahlteiler, das weiterin in der zitierten US-Patentanmeldung beschrieben wird (siehe dort Figur 14).
Figur 3 erläutert ein Abbildungsspektrometer, das in Übereinstimmung mit der US-P-08/392,019 gebaut wird und ein Interferometer nutzt, bei dem die OPD mit dem Einfallswinkel der eintretenden Strahlung variiert. Ein Strahl, der in das Interferometer mit einem schmalen Winkel zu der optischen Achse eintritt, unterliegt einer OPD, die im Wesentlichen linear mit diesem Winkel variiert.
In dem Interferometer von Figur 3 wird die ganze Strahlung von Quelle 30 in allen Pixeln, nach dem sie parallel durch ein optisches System 31 gerichtet ist, durch einen mechanischen Scanner 32 gescannt. Das Licht wird dann durch einen Strahlteiler 33 zu einem ersten Reflektor 34 und dann zu einem zweiten Reflektor 35 geleitet, der das Licht zurück durch den Strahlteiler 33 und dann durch eine fokussierende Linse 36 auf eine Detektoranordnung 37 (beispielsweise einen CCD) reflektiert. Dieser Strahl interferiert mit dem Strahl, der durch 33, dann durch den zweiten Reflektor 35 und schließlich durch den ersten Reflektor 34 reflektiert wurde.
Am Ende des Scans wurde jeder Pixel durch alle der OPD's erfasst und deshalb kann das Spektrum jedes Pixels der Szene durch Fourier-Transformation rekonstruiert werden. Ein zu der optischen Achse paralleler Strahl wird kompensiert und ein Strahl mit einem Winkel (0) zu der optischen Achse unterliegt einer OPD, die eine Funktion der Dicke des Strahlteilers 33, seinem Brechungsindexes und dem Winkel &thgr; ist. Die OPD ist für kleine Winkel proportional zu &THgr;. Beim Anlegen der passenden Inversion und durch sorgfältiges Berechnen wird das Spektrum jedes
Pixels berechnet.
In der Konfiguration von Figur 3 geht der Strahl, der auf den Strahlteiler bei einem Winkel &bgr; (&bgr; = 45° in Figur 3) einfällt, durch das Interferometer mit einer OPD = O, wohingegen ein Strahl, der bei einem allgemeinen Winkel &bgr;-&thgr; einfällt, einer OPD unterliegt, die wie folgt bestimmt ist:
OPD(ß &THgr;, t, n) = t[(n2-sm\ß+e))°'s-(n2-sm2 (&bgr;-&thgr;))0'5 + 2sin/3sin0]
wobei &bgr; der Einfallswinkel des Strahls auf dem Strahlteiler, &thgr; die Winkeldistanz eines Strahls von der optischen Achse oder der hiterferometerdrehwinkel in Bezug auf die zentrale Stellung, t die Dicke des Strahlteilers und &eegr; der Brechungsindex des Strahlteilers ist.
Es folgt aus Gleichung 1, dass durch Scannen sowohl positiver als auch negativer Winkel in Bezug auf die zentrale Stellung ein doppelseitiges Interferogram für jedes Pixel erhalten werden kann, das dazu beiträgt, Phasenfehler zu eleminieren, was genauere Ergebnisse in der Fourier-Transformationsberechnung ergibt. Die Amplitude beim Scannen bestimmt die maximal zu erreichende OPD, die sich auf die spektralen Auflösung der Erfassung bezieht. Die Größe des Winkelschritts bestimmt den OPD-Schritt, der wiederum durch die kürzeste Wellenlänge vorgeschrieben wird, bei der das System empfindlich ist. Genau gesagt muß gemäß des Probentheorems [siehe Chamberlain, The principles of interferometic spectroscopy, John Wiley and Sons (1979), 53-55] dieser OPD-Schritt kleiner als die Hälfte der Wellenlänge sein, bei der das System empfindlich ist.
Ein anderer Parameter, der berücksichtigt werden muß, ist die endliche Größe eines Detektorelements in der Matrix. Durch die fokussierenden optischen Bestandteile begrenzt das Element eine endliche OPD in dem Interferometer, was den Überlagerungseffekt des Interferogramms mit einer rechteckigen Funktion aufweist. Dieses bewirkt als Konsequenz eine Verringerung der Systemempfindlichkeit bei kurzen Wellenlängen, die bis auf Null für Wellenlängen fällt, die gleich oder unter der durch das Element begrenzten OPD sind. Aus diesem Grund muß sichergestellt sein, dass die Bedingung für die Modulationstransferfunktion (MTF) erfüllt ist, d.h., dass die OPD, die durch ein Detektorelement in dem Interferometer begrenzt ist, kleiner als die kürzeste Wellenlänge sein muß, bei der das Instrument empfindlich ist.
Damit erfassen die in Übereinstimmung mit der in der US-P-08/392019 offenbarten Erfindung gebauten Abbildungsspektrometer nicht nur die von jedem Pixel in dem Sichtfeld kommende Lichtintensität, sondern erfassen ebenfalls das Spektrum jedes Pixels in einem bestimmten Wellenlängenbereich. Sie nutzen ebenfalls die ganze Strahlung besser, die durch jedes Pixels in dem Sichtfeld zu einem bestimmten Zeitpunkt emittiert wird, und ermöglichen somit, wie vorstehend erklärt, eine deutliche Abnahme bei der Rahmenzeit und/oder eine deutliche Erhöhung bei der Empfindlichkeit des Spektrometers Derartige Abbildungs-
spektrometer können verschiedene Interferometertypen und optische Sammelsysteme und fokussierenden Systeme umfassen und können deshalb bei mehreren Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich medizinischer Diagnostik und Therapie und biologischer Forschungsanwendungen, als auch Fernerkundung für geologische und landwirtschaftliche Untersuchungen und ähnliches.
Ein in Übereinstimmung mit der in der US-P-08/392,019 offenbarten Erfindung stehendes Abbildungsspektrometer wurde durch Spectral Diagnostics (SD) Ltd., Industrial Park, Migdal Haemek, Israel entwickelt und wird hier als SpectraCube™ bezeichnet. Das mit meheren optischen Vorrichtungen verbundene SpectraCube™-System wurde verwendet, um die erfindungsgemäße Vorrichtung einzusetzen. Das SpectraCube™-System weist folgende Eigenschaften auf, die hier nachstehend in Tabelle 1 aufgelistet sind.
Tabelle 1:
Tabelle 1:
Räumliche Auflösung: 30/M &mgr;&idiagr;&eegr; (M= wirksame Mikroskop- oder fore-optics-Vergrößerung (effective
microscope or fore optics magnification))
Sichtfeld: 15/M Millimeter
Sichtfeld: 15/M Millimeter
Empfindlichkeit: 20 MilliLux (bei 100 msec Integrationszeit, nimmt bei längeren Integrationszeiten
linear mit VT zu)
Spektralbereich: 400-1000 nm
Spektrale Auflösung: 4 nm bei 400 nm (16 nm bei 800 nm)
Erfassungszeit: 5-50 see, typisch 25 see
Erfassungszeit: 5-50 see, typisch 25 see
FFT Bearbeitungszeit: 20-180 see, typisch 60 see
Anzeige und Analyse von spektralen Abbildungen
a. Allgemeines
a. Allgemeines
Wie vorstehend erwähnt ist die spektrale Abbildung eine dreidimensionale Datenanordnung I (x, y, &lgr;), die die spektrale Information mit räumlicher Organisation der Abbildung kombiniert. Damit ist eine spektrale Abbildung aufgrund ihrer Anzahl von Dimensionen ein als spektraler Würfel bezeichneter Datensatz, der das Herausziehen von Eigenschaften und die Auswertung von Mengen ermöglicht, die anders schwer, und in einigen Fällen unmöglich, zu erhalten sind. Da sowohl Spektroskopie als auch digitale Abbildungsanalyse wohlbekannte Gebiete sind, die durch eine riesige Literaturmenge abgedeckt sind [siehe, beispielsweise, Jain, Fundamentals of Digital Processing, Prentice-Hall International (1989)] wird sich die nachstehende Diskussion hauptsächlich auf den Vorteil des Kombinieren spektroskopischer Information und Abbildungsinformation in einem einzigen Datensatz, d.h. einem sprektralen Würfel fokussieren.
Ein möglicher Analysetyp eines spektralen Würfels ist es, die spektralen und räumlichen Daten getrennt zu verwenden, d.h., spektrale Algorithmen an die spektralen Daten und zweidimensional abbildungsverarbeitende Algorithmen an die räumlichen Daten anzulegen.
Als ein Beispiel eines spektralen Algorithmus wird ein Algorithmus in Betracht gezogen, der die Ähnlichkeit zwischen einem Referenzspektrum und den Spektren aller Pixel (d.h. Ähnlichkeitszuordnen) errechnet und zu einer Grauwert-(oder einer anderer Farbe)-Abbildung (d.h. einer Ähnlichkeitszuordnung) führt, bei der die Intensität bei jedem Pixel proportional zu dem Grad der "Ähnlichkeit" ist. Diese Grauwert-Abbildung kann dann durch Verwendung von abbildungsverarbeitenden und Computerabbildungs-Techniken (beispielsweise Abbildungsvergrößerungen, Mustererkennung etc.) weiter analysiert werden, um die gewünschten Eigenschaften und Parameter herauszuziehen. Mit anderen Worten Ähnlichkeitszuordnen umfasst das Berechnen des Integrals des Absolutwertes der Differenz zwischen dem Spektrum jedes Pixels der spektralen Abbildung in Bezug auf ein Referenzspektrum (entweder vorher in einer Bibliothek gespeichert oder zu einem Pixel der gleichen oder anderen spektralen Abbildung gehörend) und Anzeigen einer Grauwert- oder Pseudofarbabbildung (Schwarz/Weiß oder Farbe), bei der die hellen Pixel einer kleinen spektralen Differenz entsprechen und die dunklen Pixel einer großen spektralen Differenz entsprechen, oder umgekehrt.
Auf ähnliche Weise führt Einteilungs-Zuordnen die gleiche, wie für das Ähnlichkeits-Zuordnen beschriebene Berechnung durch und nimmt mehrere Spektren als Referenzspektren und färbt jeden Pixel der angezeigten Abbildung gemäß seiner Einteilung als das am ähnlichsten zu einem der mehreren Referenzspektren liegende Pixel mit einer unterschiedlichen Pseudofarbe.
Es ist ebenfalls möglich, spektrale Abbildungsalgorithmen anzulegen, die auf nicht trennbaren Operationen basieren, d.h Algorithmen, die sowohl lokale, spektrale Information und räumliche Korrelation zwischen angrenzenden Pixeln umfassen (einer dieser Algorithmen ist eine Hauptkomponentenanalyse, wie nachstehend ersichtlich).
Eines der grundlegenden Erfordernisse, das natürlicherweise auftritt, wenn mit irgeneiner dreidimensionalen (3D) Datenstruktur, wie einem spektralen Würfel (d.h. I(x, y, z), gearbeitet wird, ist die Visulasierung jener Datenstruktur auf eine sinnvolle Weise. Anders als bei anderen 3D-Daten, wie bei tomographischen Daten D(x, y, z), die beispielweise durch ein konfokales Mikroskop erhalten werden, bei dem jeder Punkt im Allgemeinen die Intensität an einem unterschiedlichen Ort (x, y, z) in einem dreidimensionalen Raum darstellt, ist eine spektrale Abbildung eine Sequenz von Abbildungen, die die Intensität der gleichen zweidimensionalen Ebene (d.h. der Probe) bei unterschiedlichen Wellenlängen darstellen. Aus diesem Grund sind die zwei intuitivsten Arten, einen spektralen Würfel zu betrachten, entweder das Betrachten der Abbildungsebene (räumliche Daten) oder der Intensität eines Pixels oder eines Satzes von Pixeln als Wellenlängenfunktion in einer dreiminsionalen Berg und Tal Anzeige. Im allgemeinen kann die Abbildungsebene verwendet werden um entweder die Intensität, die bei jeder einzelnen Wellenlänge erfasst wurde oder die Grauwert-Abbildung anzuzeigen, die nach dem Anlegen eines spektralen Algorithmus an jeden Pixel über einen gewünschten spektralen Bereich resultiert. Die spektrale Achse kann im Allgemeinen verwendet werden, um das resultierende
Spektrum einiger räumlicher Operationen darzustellen, die in der Nähe von jedem gewünschten Pixel durchgeführt werden (beispielsweise den Durchschnitt des Spektrums ermitteln).
Es ist beispielsweise möglich, die spektrale Abbildung als eine Grauwert-Abbildung
anzuzeigen, die ähnlich zu der Abbildung ist, die von einer einfachen monochromen Kamera oder einer mehrfarbigen Abbildung erhalten werden kann, die eine oder mehrere künstliche Farben nutzt, um wichtige Eigenschaften hervorzuheben und zuzuordnen. Da eine derartige Kamera einfach das optische Signal über den spektralen Bereich (beispielsweise 400 nm bis 760 mn) der CCD-Anordnung integriert, kann die ,equivalente' monochrome CCD-Kameraabbildung aus der spektralen 3D- Abbildungsdatenbank durch Integrieren entlang der spektralen Achse, wie nachstehend berechnet werden:
Grauwert(x, y) = J w(A) · I(x, y, &lgr;)&aacgr;&lgr; (2)
In Gleichung 2 ist w(ty eine allgemein wichtende Antwortsfunktion, die die größte Flexibilität beim Berechnen mehrerer Grauwert-Abbildungen bereitstellt, die alle auf der Integration einer entsrpechend gewichteten spektralen Abbildung über irgendeinen spektralen Bereich beruhen. Beispielsweise durch Berechnen der Gleichung (2) mit drei gewichtenden Funktionen {wr(ty, wg(ty, wyty}, die der Tristimulus-Antwortfunktionen für rot (r), grün (g) und blau (b) entsprechen, ist es möglich, eine entsprechende herkömmliche farbige RGB-Abbildung anzuzeigen. Es ist ebenfalls möglich, sinnvolle, nicht herkömmliche (Pseudo) Farbabbildungen anzuzeigen. Figur 4 zeigt ein Beispiel der Wirksamkeit dieses einfachen Algorithmuses. Unter der Annahme, dass {wn wg, Wb} derart ausgewählt sind, dass sie innerhalb eines Spektrums von Interesse verteilte Gauss-Funktionen bilden, hebt die resultierende Pseudo-Farbabbildung, die in diesem Fall angezeigt wird, nur Daten in den spektralen Bereichen hervor, die den wichtenden Funktionen entsprechen, und ermöglicht damit den deutlicheren Nachweis der spektralen Differenzen in diesen drei Bereichen.
b Punktoperationen
Punktoperationen sind als die Operationen definiert, die an einzelnen Pixels durchgeführt werden (d.h. nicht mehr als einen Pixel zu einer Zeit einschließen). Beispielsweise kann bei einer Grauwert-Abbildung eine Punktoperation eine Operation sein, die die Intensität jedes Pixels (Intensitätsfunktion) einer anderen Intensität gemäß einer bestimmten Transformationsfunktion zuordnet. Ein besonderer Fall dieses Transformationstyps ist die Multiplikation der Intensität jedes Pixels mit einer Konstante. Zusätzliche Beispiele schließen Ähnlichkeits- und Einteilungszuordnen ein, wie hier vorstehend beschrieben.
Das Konzept von Punktoperationen kann ebenfalls auf spektrale Abbildungen ausgedehnt werden: hier weist jeder Pixel seine eigene Intensitätsfunktion (Spektrum) auf, d.h. einen n-
dimensionalen Vektor F, (A): Ae[A,, AJ. Eine auf eine spektrale Abbildung angelegte Punktoperation kann als eine Operation definiert werden, die dem Spektrum jedes Pixels einen Skalar (d.h. einen Intensitätswert) gemäß einer Transformationsfunktion zuordnet:
V2=S(F1(A))JAe[AnAJ (3)
Bilden einer Grauwert-Abbildung gemäß Gleichung 3 ist ein Beispiel dieses Typs der Punktoperation. In einem allgemeineren Fall ordnet eine Punktoperation dem Spektrum (Vektor) jedes Pixels einen anderen Vektor gemäß einer Transformationsfunktion zu:
V2(I) = S(K1(A));/ e [1,&Ngr;],&lgr; e [XnXn] (4), wobei N<n.
hi diesem Fall wird eine spektrale Abbildung in eine andere spektrale Abbildung transformiert.
Nun kann die Definition von Punktoperationen ausgedehnt werden, um Operationen zwischen entsprechenden Pixeln unterschiedlicher, spektraler Abbildungen einzuschließen. Ein wichtiges Beispiel dieses Algorhitmustyps ist die optische Dichteanalsye. Die optische Dichte wird dazu eingesetzt, um Bereiche eines untersuchten Objekts hervorzuheben und graphischmit einem höherem dynamischen Bereich als beim Transmissionspektrum darzustellen. Die optische Dichte steht durch eine logarithmische Operation mit der Transmission in Bezug und ist deshalb immer eine positive Funktion. Die Beziehung zwischen der optischen Dichte und den erfaßten Spektren ist durch das Lambert Beer'sche Gesetz bestimmt:
OD(X) = -log10 -%&- = -log10 T(A) (5)
wobei OD(h) die optische Dichte als eine Funktion der Wellenlänge, I(l·) das erfaßte Spektrum, I0(h) ein erfaßtes Referenzspektrum und rfty der spektrale Transmisssionsfaktor der Probe ist. Gleichung 5 wird für jeden Pixel fur jede Wellenlänge berechnet, wobei I0(ty ausgesucht ist aus (1) einem Pixel in dem gleichen spektralen Würfel, für den die OD berechnet ist, (2) einem entsprechenden Pixel in einem zweiten Würfel und (3) einem Spektrum aus der Bibliothek.
Es ist festzustellen, dass die optische Dichte weder von der spektralen Antwort des Erfassungssystems noch von der Uneinheitlichkeit des CCD-Detektors abhängt. Dieser Algorithmus ist nützlich, um die relative Konzentration und in manchen Fällen die absolute Konzentration eines Absorptionsmittel in einer Probe festzustellen, falls deren Absorptionskoeffizienten und die Probendicke bekannt sind.
Zusätzliche Beispiele schließen verschiedene Linearkombinationsanalysen ein, wie beispielsweise: (1) Anlegen eines bestimmten Spektrums an das Spektrum von jedem der Pixel in einer spektralen Abbildung durch eine arithmetische Funktion, wie Addition, Subtraktion, Multiplikation, Division und Kombinationen davon, um einen neuen spektralen Würfel zu erhalten, bei dem das resultierende Spektrum jedes Pixels die Summe, die Differenz, das Produktverhältnis oder die Kombination zwischen jedem Spektrum des ersten Würfels und dem ausgewählten Spektrum ist, und (2) Anlegen eines bestimmten Skalars an die Spektren von jedem der Pixel der spektralen Abbildung durch eine wie vorstehend beschriebene, arithmetische Funktion.
Derartige Linearkombinationen können beispielsweise verwendet werden für die Subtraktion des Hintergrunds, wobei ein Spektrum eines sich im Hintergrundsbereich befindenden Pixels von dem Spektrum jedes der Pixel subtrahiert wird und für ein Kalibrierungsverfahren, bei dem ein vor der Probenanalyse erfaßtes Spektrum verwendet wird, um das Spektrum jedes der Pixels in der spektralen Abbildung zu dividieren.
Ein anderes Beispiel schließt ein Abbildungsberechnungsverhältnis und Anzeigen einer Grauwert-Abbildung ein. Dieser Algorithmus berechnet das Verhältnis zwischen den Intensitäten bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen für jedes Pixel der spektralen Abbildung und färbt jedes der Pixel entsprechend mit einer helleren oder dunkleren künstlichen Farbe. Beispielsweise färbt es die Pixel hell für ein hohes Verhältnis und dunkel für ein niedriges Verhältnis (oder umgekehrt), um die Verteilung spektral empfindlicher Materialien anzuzeigen.
c. Räumlich spektral kombinierte Operationen
In allen der vorstehend erwähnten spektralen Abbildunganalyseverfahren werden Algorithmen an die spektralen Daten angelegt. Die Wichtigkeit des Anzeigens der spektral verarbeiteten Daten als Abbildung ist meistens qualitativ und stellt dem Benutzer eine nützliche Abbildung bereit. Es ist jedoch ebenfalls möglich, abhängig von der Anwendung, die vorhandenen Abbildungsdaten in noch sinnvolleren Weisen durch Anlegen von Algorithmen zu verwenden, die die räumlich-spektrale Korrelation nutzen, die bei einer spektralen Abbildung inhärent ist. Räumlich spektrale Operationen stellen die wirkungsvollsten Typen von spektralen Abbildungsanalysealgorithmen dar. Als Beispiel kann die nachstehende Situation in Betracht gezogen werden:
Eine Probe enthält k Zelltypen, die mit k unterschiedlichen Fluorophoren angefärbt sind (der Ausdruck „Zelle" wird hierbei sowohl für eine biologische Zelle als auch für „einen Bereich in dem Sichtfeld des Instruments" verwendet). Jedes Fluorophor weist ein unterschiedliches Fluoreszenzemissionsspektrum auf und verbindet sich nur mit einem der k Zelltypen. Es ist wichtig, die durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Zelle für jeden einzelnen der k Zelltypen zu finden. Um diese Aufgabe zu bewältigen kann das folgende Verfahren verwendet werden: (1)
Einteilen jedes Pixels in der Abbildung gemäß seines Spektrums zu einer von k + 1 Klassen (&- Zelltypen plus Hintergrund), (2) Segmentieren der Abbildung in die verschiedenen Zelltypen und Zählen der Anzahl der Zellen von jedem Typ und (3) Summieren der durch jede Klasse beigetragenen Fluoreszenzenergie und Dividieren dieser durch die Gesamtanzahl der Zellen der entsprechenden Klasse.
Dieses Verfahren macht sowohl von spektralen als auch von räumlichen Daten Gebrauch. Die relevanten, spektralen Daten nehmen die Form von kennzeichnenden Zellspektren an (d.h. spektraler „Signaturen"), während die räumlichen Daten aus Daten über verschiedene Zelltypen (d.h. Zellklumpen) bestehen, von denen einige dem Auge ähnlich erscheinen. In der vorstehenden Situation können Zellen durch ihre kennzeichnende spektrale Signatur unterschieden werden. Somit wird eine geeignete Punktoperation durchgeführt, um eine synthetische Abbildung zu erzeugen, bei der jedem Pixel einer von k +1 Werten zugewiesen wird. Unter der Voraussetzung, dass die Fluoreszenzemissionspektren der unterschiedlichen Zelltypen als S1(A)-J = 1,2, ,k,Äe[Ä,,Än] bekannt sind und dass das erfaßte Spektrum bei
jedem Pixel (x, y) sxy(&lgr;), Äe[&lgr;,,An] beträgt, ist dann der nachstehende Algorithmus ein mögliches Einteilungsverfahren (vorstehender Schritt 1):
Man lasse e2j die Ableitung des erfaßten Spektrums von einem bekannten Spektrum des am dem Zelltyp i angebrachten Fluorophors sein. Dann kann bei Anpassung einer „Distanz"-Definition mit der Methode der kleinsten Quadrate geschrieben werden:
20
20
f &Sgr;>2 (6)
wobei, R\ der spektrale Bereich von Interesse ist. Jeder Punkt [Pixel (x,y)] in der Abbildung kann unter Verwendung des nachstehenden Kriteriums in eine der k + 1 Klassen eingeteilt werden:
Punkt (x,y)e Klasse k+l, wenn e2i >Schwellwert für alle ie [\,k],
Punkt (x,y)e Klasse k+l, wenn e2i >Schwellwert für alle ie [\,k],
während (7)
Punkt (x,y)e Klasse/?, wenn e2j<Schwellwert und/? derart ist, das mm[e2j]=e2p
Die vorstehenden Schritte 2 und 3 (Abbildungssegmentierung und Berechnung von durchschnittlicher, fluoreszierender Intensität) sind nun unter Verwendung von Standard-Computerabbildungsoperationen auf der synthetischen Abbildung, die in Übereinstimmung mit dem in den Gleichungen 6 und 7 beschriebenen Algorithmus erzeugt wird, klar.
Ein anderer Ansatz ist es, das erfaßte Spektrum sx>y(X) bei jedem Pixel als eine Linearkombination der k bekannten Fluoreszenzspektren Sj(X); i= 1, 2, ...k auszudrücken. In diesem Fall wird der Koeffizienzvektor C=[c\, ei, ,c*] gefunden, der löst
29
F =min ]T(s(A) -s(Ä))2 (8)
F =min ]T(s(A) -s(Ä))2 (8)
Ae/?A
wobei s(Ä) =
I=?
JF
Lösen nach — = 0 für i = 1, 2, , k (d.h. finden der Werte von q, die F minimieren, de,
ergibt die Matrixgleichung C=A4B (9), wobei A eine Quadratmatrix von Dimension k mit den Elementen amn =[^sm(A)-^n(A)] (10) und B ein als bm = [^sm (A)·5(A)], m, &eegr; = 1, 2, , k
(11) definierter Vektor ist.
Arithmetische Operationen können ähnlich an zwei oder mehr spektrale Würfel und/oder Spektren von bestimmten Pixel oder von Spektren einer Bibliothek anlegt werden. Beispielsweise kann das Anlegen einer arithmetischen Operation zwischen entsprechenden Wellenlängen von entsprechenden Paaren von Pixeln in Erwägung gezogen werden, die zu einem ersten und einem zweiten spektralen Datenwürfel gehören, um einen dritten spektralen Datenwürfel zum Zweck von beispielsweise, Durchschnittsbildung von zwei spektralen Datenwürfeln, Nachverfolgen zeitlicher Änderungen, spektraler Normierung etc., zu erhalten.
In einigen Fällen unterscheiden sich in einer spektralen Abbildung vorliegende Objekte (beispielsweise Zellen) bei den chemischen Bestandteilen und/oder der Struktur zu einem gewissen Grad von einander. Die Verwendung einer Hauptkomponentenanalyse durch Erzeugen von Kovarianz oder einer Korrelationsmatrix vergrößert diese kleinen Differenzen. Eine kurze Beschreibung der Hauptkomponentenanalyse, die eine Kovarianzmatrix verwendet, wird nachstehend gegeben. Für weitere, detaillierte Betrachtungen der Hauptkomponentenanalyse wird der Leser auf Martens und Naes, Multivariate Calibration John Wiley & Sons, Great Britain (1989) und auf Esbensen et al., Multi variance analysis- in practise, Computer-aided modeling as CAMO, and the Unscrambler's guide, Trondheim, Norway, Eds.(1994) verwiesen.
Damit werden die Pixelintensitäten der Abbildung bei der Wellenlänge &lgr;, (i= 1,..,.N) als ein Vektor betrachtet, dessen Länge gleich der Anzahl der Pixel q beträgt. Da es N dieser Vektoren gibt, einen für jede Wellenlänge der Erfassung, können diese Vektoren in einer Matrix B' mit q Reihen und N Spalten angeordnet werden:
Anzahl der Wellenlängen
Bu · · Bin
Bu · · Bin
B' = Anzahl der Pixel .... (12)
Bq] * * BqN
Für jede der Spalten der Matrix B' ist ein Durchschnitt definiert:
M1 =-f,B" J1U = I N
(13)
und eine zweite normalisierte Matrix D wird definiert als:
Anzahl der Wellenlängen
'
V
1 /Mn
B' = ■ Anzahl der Pixel .... (14)
· V
1 /Mn
Eine Kovarianzmatrix C ist für die Matrix B definiert: C-B7B mit den Abmessungen NxN. C wird diagonalisiert und Eigenvektoren und Eigenwerte sind verknüpft durch: C- K,=/v V,, wobei F, und N orthogonale Einheitsvektoren und &mgr;, die Eigenwerte sind, die die Varianz in die Richtung des i-ten Einheitsvektor Vj darstellen. Im Allgemeinen stellen die niedrigsten Komponenten die höchste Veränderlichkeit als eine Funktion der Pixel dar.
Die Produkte BV1 (i= 1, N) sind die Projektionen der spektralen Abbildung auf die Elemente der orthogonalen Basis. Sie sind Vektoren mit q Elementen (q = Anzahl der Pixels) und können getrennt als Schwarz/Weiß-Abbildungen angezeigt werden. Diese Abbildungen können Eigenschaften aufdecken, die für eine normale Schwarz/Weiß-Abbildung bei einer bestimmten Wellenlänge oder einem bestimmten Wellenlängenbereich nicht offensichtlich sind.
a. allgemeines
Die Verwendung fluoreszierender Farbstoffe (d.h. Fluorophore) [siehe Jain, Fundamentals of Digital Image Processing, Prentice-Hall International, (1989)] ist eines der wirksamsten und allgemeinsten Instrumente zum Analysieren von Gewebe und Zellen. Die Fluoreszenz-Mikroskopie ist deshalb eines der wichtigsten, in der Lichtmikroskopie verwendeten experimentellen Verfahren [Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy, Plenum Press, New York, London (1983)]. Die Wirkung der fluoreszierenden Sonden beruht hauptsächlich auf der großen Vielfalt an biologischen Strukturen, an die bestimmte Farbstoffe gebunden werden können [Waggoner, Applications of fluorescence in the biomedical sciences, Taylor et al.
(Hrsgb.), New York: Alan Liss, Inc., (1986) 3-28]. Für eine ausführliche Zusammenfassung über fluoreszierende Sonden, siehe Mason (Hrsgb.) Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, Biological Techniques Series, herausgegeben von Sattelle, Academic Press Limited, London (1993), und Ploem und Tanke, Introduction to Fluorescence Microscopy, Oxford University Press, Royal Microscopical Society (1987).
Die rasche Entwicklung neuer und höher entwickelter, mehrfarbig fluoreszierender
Farbstoffmoleküle erzeugt weiterhin einen Bedarf nach fortgeschritteneren Fluoreszenz-Abbildungstechniken, die das ganze Potential dieser Farbstoffe nutzen können. Für eine Diskussion der revolutionären Auswirkung, die fluoreszierende Farbstoffe hatten und weiterhin auf dem heute eingeschlagenen Weg der Forschung haben werden, wird auf Taylor et al., The New Vision of Light Microscopy, American Scientist, Vol. 80 (1992) 322-335 verwiesen.
Die Einführung kombinatorischer Fluoreszenz-Strategien (beispielsweise kombinatorisches Markieren und kombinatorische Hybridisierung), die verschiedene Kombinationen weniger Basis-Fluoreszenzfarbstoffe (d.h. Fluorophoren) einsetzen, ist eine merkliche Verbesserung bei mehrfarbigen fluoreszierenden Farbstoffen. Für kombinatorisches Markieren, siehe Ried et al., Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 1388-1392; und Ried, Fluoreszenz in situ Hybridsierung in der genetischen Diagnostik, Fakultät für Theoretische Medizin, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg (Jan. 1994) die beide hier unter Bezugnahme mitaufgenommen werden, als wären sie hier vollständig offenbart. Für kombinatorische Hybridisierung, siehe du-Manoir, Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization, Hum.Genet. 90 (1993), 590-610, die unter Bezugnahme mitaufgenommen wird, als wäre sie hier vollständig offenbart.
Bio-Abbildungen, bei denen die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet wird, stellen mehrere wichtige Vorteile für Fluoreszenzabbildungsanwendungen gegenüber auf Filtern und Gittern basierenden Ansätzen bereit. Diese Vorteile schließen die nachstehenden ein: (1) Erfassung des vollständigen Spektrums, das viel bessere quantitative Einsicht in das eigentliche Verhalten von Farbstoffmolekülen in der betrachteten Probe bereitstellt, (2) Fähigkeit, einige der herkömmlichen von der unerwünschten Hintergrundlumineszenz ausgehende Probleme zu überwinden, (3) unerwünschte oder unvorhersehbare spektrale Verschiebungen, die in dem Emissionsspektrum einer fluoreszierenden Sonde aufgrund ihrer Mikro-Umgebung (beispielsweise Temperatur) auftreten, können beim Bestimmen der Sondenkonzentration in Betracht gezogen werden, wobei derartige spektrale Verschiebungen nicht nur nachgewiesen, sondern vielleicht bedeutende Fehler beim Analysieren der Sondenkonzentration verursachen würden, wenn die Fluoreszenzintensität nur mit einem Bandpassfilter erfaßt wird und (4) Vereinfachung von Fluoreszenzabbildungsbeschaffung, wie nachstehend in Detail gezeigt wird, falls sie in Verbindung mit geeigneten Analysealgorithmen verwendet wird, so dass es möglich ist, in einer einzigen Erfassung einige spektral überlappende Fluoreszenzfarbstoffe zu trennen und zuzuordnen. Tatsächlich ist es möglich, einige spektral verknüpfte Parameter durch das Anlegen fortgeschrittener -Datenanalysealgorithmen, wie multivarianter Analyse, Hauptkomponentenregression und anderer Einteilungsalgorithmen gleichzeitig zu analysieren [siehe, Martens und Naes, Multivariate Calibration, John Wiley & Sons , Great Britain (1989)].
Erfindungsgemäßes, spektrales Bio-Abbilden stellt Mittel zum Beseitigen der mit der unerwünschten Hintergrundluminiszenz assoziierten Probleme wie folgt bereit. Fluoreszenzabbildungsmikroskopie wird gewöhnlich durch Verwendung eines Fluoreszenzfilterwürfels durchgeführt, der sicherstellt, dass die Probe durch die gewünschten kurzen Wellenlängen angeregt ist und dass nur jene Wellenlängen in einem begrenzten spektralen Band entsprechend der Fluoreszenzemission der Sonde den Detektor (beispielsweise Auge, Kamera, etc.) erreichen [Mason (Editor) Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, Biological Techniques Series, edited by Satelle, Academic Press Limited, London (1993)]. Da Fluoreszenzintensitäten gewöhnlich einige Größenordungen unter der Intensität der Anregungsquelle liegen, kann Hintergrundluminiszenz nie ganz beseitigt werden [Benson et al, Cellbiol. 100 (1985) 1309-1323]. Die drei hauptsächlichen Quellen für unerwünschte Hintegrundsluminiszenz sind: (1) Strahlung von der Anregungsquelle, die nicht vollständig durch den dichroitischen Spiegel und/oder die Filter abgeblockt wird, (2) Eigenfluoreszenz der Probe und manchmal von den optischen Elementen und (3) Auswahl einer ungeeigneten (oder nicht optimalen) Kombination der Anregungsfilter, dichroitischen Spiegel und Sperrfilter. Diese Quellen können deutlich zu der Hintergrundlumiszenz beitragen. Die Effekte der Eigenfluoreszenz der Probe kann gewöhnlich durch Auswählen fluoreszierender Sonden verringert werden, deren Absorptions- und Emissionsbanden nicht mit denen der zu erfassenden Probe überlappen. Durch Auswählen der optischen Elemente, die passend bedeckt sind, um die Eigenfluoreszenz zu verringern, können auf ähnliche Weise die Effekte dieses Typs der Eigenfluoreszenz ebenfalls auf das Mindestmaß verringert werden.
Trotz der besten vorhandenen Filterverfahren macht es die unerwünschte Hintergrundluminiszenz häufig schwer und manchmal unmöglich, das relevante Fluoreszenzsignal von seinen Hintergrund (Geräusch) abzuheben. Die erfindungsgemäße, spektrale Bio-Abbildungsvorrichtung ist andererseits fähig, spektrale Differenzen zwischen (i) der spektralen Form und dem spektralen Bereich des Fluoreszenzfarbstoffes und (ii) der spektralen Form und dem spektralen Bereich der Hintergrundluminiszenz (einschließlich Eigenfluoreszenz) zu verwenden, um die Effekte der unerwünschten Hintergrundluminiszenz zu beseitigen.
Somit ist es durch Anlegen des passenden, spektralen Abbildungsanalyseverfahrens an die Emissionsspektren von Fluoreszenzsonden möglich, das Signal/Rausch-Verhältnis und damit die Genauigkeit von Fluoreszenzabbildungserfassungen zu verbessern. Dieser Vorteil des spektralen Bio-Abbildungsansatzes ist von besonderer Wichtigkeit für eine Abbildung des Verhältnisses, wenn Mengenangaben des Ergebnisses gewünscht werden. Zusätzlich kann das spektrale, erfindungsgemäße Bio-Abbildungssystem Zeit und Anstrengung sparen, die andernfalls mit dem Auswählen der optimalen Filter bei auf Filtern basierenden Erfassungen verbracht wird.
Die Beschaffung von mehrfarbigen Fluoreszenzabbildungen kann enorm vereinfacht werden, wenn die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen, spektralen Bio-Abbildungsvorrichtung
mit geeigneten Fluoreszenzmarkierungen kombiniert wird. Um die durch das spektrale Bio-Abbilden gebotenen Vorteile vollständig zu erfassen, wird der Leser aufgefordert, die typischen Schritte in Erwägung zu ziehen, die bei der Verwendung eines auf Filter basierenden Abbildungsverfahren eingeschlossen sind, um die Fluoreszenz von einer mehrere Sonden enthaltenden Probe zu erfassen. Zuerst müssen Sonden mit ausreichend unterschiedlichem Absorptions- und Emissionsspektren ausgewählt werden. Bei der heutigen Praxis beschränkt diese Anforderung die Anzahl der fluoreszierenden Markierungen bei einem Muster auf zwischen drei und fünf Sonden. Fluoreszenzabbildungen, eine Abbildung für jeden Farbstoff werden dann durch passendendes Drehen der zwei Filterräder errreicht, wobei eines zum Auswählen der Anregungswellenlänge und ein anderes zum Erlangen des Emissionsspektrums dient oder alternativ zum Drehen eines Filterrades, das zum Auswählen einer Wellenlänge ausgerichtet ist, während das Emissionsspektrum durch einen dreifach dichroitischen Filter erlangt wird. Ansätze, bei denen abstimmbare Filter (ohne bewegbare Teile) verwendet werden, um die Anregungs- und/oder Emissionswellenlänge zu steuern, wurden ebenfalls vorgeschlagen.
Vor kurzem wurden ebenfalls mehrere spektrale Interferenzfilter verwendet, um das Abbilden mehrerer Fluorophore zu ermöglichen. Ein Mittel zum Ändern des dichroitischen Spiegels (beispielsweise durch Ändern der Filterwürfel) wird ebenfalls verlangt. Es ist ebenfalls häufig notwendig, den Brennpunkt der Abbildung bei jeder Wellenlänge neu einzustellen und manchmal muß sogar die CCD-Kamerabelichtungszeit geändert werden, um höhere Signal/Rausch-Verhältnisse zu erreichen. Gemeinsam erzeugen diese Einschränkungen ein Registrierungsproblem. Die resultierenden, monochromen Abbildungen, wobei jede einer Emission eines unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffes entspricht, werden dann pseudoangefärbt und übereinander geschichtet (unter der Verwendung eines digitalen Computers mit einfach erhältlicher Standard-Software). Die resultierende Abbildung zeigt die Anordnung von mehreren, fluoreszierenden, jede mit einer unterschiedlichen Pseudo-Farbe angefärbten Markierungen. Da leichte Änderungen bei der Lage des dichroitischen Spiegels versetzende Verschiebungen bei den digitalisierten Abbildungen verursachen, ist es notwendig, dichroitische Spiegel mit mehreren Wellenlängen zu verwenden [für die Verwendung eines dichroitischen Spiegels mit Durchlässigkeitseigenschaften für quadropole Wellenlängen, siehe Hiraoka et al, Seminars in Cell Biology, Vol.2 (1992), 153-164] oder die Abbildungen vor ihrer Aufschichtung zu registrieren. Der Ansatz der Abbildungsregistrierung wird trotz der Tatsache häufiger angewendet, dass Abbildungsregistrierung ein schweres Problems ist, da sie zeitaufwendig ist und häufig nur geringfügig zufriedenstellende Ergebnisse erzeugt. Dieses sind technische Herausforderungen, denen sich ebenfalls zugewendet werden muß, wenn mehrfarbige Fluoreszenzabbildungen erhalten werden sollen [Waggoner et al. Methods in Cell Biology (1989), Part B, Vol. 30, Kapitel 17, 449-478, herausgegeben durch Taylor und Wang, Academic Press Inc.].
Somit überwindet die Bio-Abbildungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung eine der grundlegenden Beschränkungen, die der Fluoreszenzabbildung durch auf Filtern basierende Ansätze auferlegt sind. Durch Ermöglichen der gleichzeitigen Erfassung des Emissionsspektrums einer nicht begrenzten Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen (einschließlich Farbstoffen, deren Emissionsspektren zu einem großen Ausmaß überlappen, wie hier nachstehend in dem Beispielsabschnitt fur die Texas-Rot- und Rhodamin-Fluorophore gezeigt wird), beseitigt das Bio-Abbilden das Erfordernis Abbildungen der Emissionen mehrerer fluoreszierender Sonden nacheinander zu erhalten. Der Vorteil der Verwendung eines spektralen Bio-Abbildungssystems ist dann am größten, wenn die verwendeten fluoreszierenden Sonden durch eine gemeinsame Anregungsquelle angeregt werden können. In diesem Fall kann eine einzige spektrale Abbildungsbeschaffung die Fluoreszenzemission von einer nahezu unbegrenzten Anzahl von Farbstoffen einfangen und das Erfordernis, (1) nicht überlappende Farbstoffe auszuwählen, (2) Filterwürfel zu ändern, (3) Anregungs- und Emissionsfilter zu ändern, (4) den Brennpunkt und die Belichtungszeit zu optimieren oder (5) die Abbildungen zu registrieren wird beseitigt. Die Herausforderung ist natürlich, geeignete Farbstoffe auszuwählen, die mit einer gemeinsamen Quelle angeregt werden können. Farbstoffe, die durch Fluoreszenzenergie angeregt werden, die von/zueinander transferiert wird, sind somit für mehrfarbige Fluoreszenzabbildung ideal geeignet, bei der ein spektrales Bio-Abbildungssystem verwendet wird. Natürlich erschwert die Verwendung von Farbstoffen mit ähnlichen Emissionseigenschaften den visuellen Nachweis (beispielsweise unter dem Mikroskop). Dieser Nachteil kann jedoch durch Verwendung der spektralen Bio-Abbildungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung überwunden werden.
Nach der spezifischen Erfassung des Spektrums mit dem SpectraCube™-System ist es möglich, zwischen einigen unterschiedlichen Spektren zu unterscheiden, selbst wenn es nur geringe spektrale Differenzen zwischen ihnen gibt.
Im Prinzip ist es besser, einen so breiten spektralen Bereich wie möglich zu verwenden, da dann der Bereich, in dem spektrale Änderungen beobachtet werden können, größer ist und das Ergebnis genauer wird. Falls andererseits wenige Fluorophore, die alle eine unterschiedliche Farbemission aufweisen, gleichzeitig verwendet werden müssen, muß sicher gestellt werden, dass jeder dieser Fluorophore in dem richtigen spektralen Bereich angeregt wird und dass dessen Emission in dem richtigen spektralen Bereich nachgewiesen wird. Die Verwendung eines Dreibandfilters ermöglicht eine gleichzeitige Anregung bei drei unterschiedlichen Anregungsbanden und zudem den nachweis der Emisssion bei drei unterschiedlichen Banden. Das Dividieren des spektralen Bereichs in sechs Banden resultiert andererseits in sehr schmalen Banden. Ein schmales Band bedeutet, dass nur sehr wenige Erfassungspunkte in das Band fallen, wenn es durch das System erfaßt wird. Bei der Verwendung eines Zweibands wird das Spektrum anderseits nur in vier geteilt und deshalb ist die Breite jedes Bandes größer. Das bedeutet, dass fur jedes erfaßtes Fluorophor mehr Erfassungspunkte aufgefunden werden, wodurch die
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Fähigkeit, zwischen den ähnlichen Fluorophoren zu unterscheiden, steigt. Deshalb ist es gegenwärtig bevorzugt, einen auf einem Fluoreszenzmikroskop montierten Zweibandfilter zur Durchführung der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des SpectraCube™ einzusetzen.
b.
Spektrale Identifizierung mehrerer Fluorophore
Die Verwendung der erfindungsgemäßen, spektralen Bio-Abbildungsvorrichtung ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer Farbstoffe (d.h. Fluorophore, fluoreszierender Komponenten) in einer Erfassung. Es gibt keine Beschränkung auf einen Farbstofftyp, selbst spektral überlappende Farbstoffe (beispielsweise Rhodamin und Texas-Rot) können durch das Anlegen geeigneter Algorithmen (beispielsweise Linearkombination für Hintergrundsubtraktion, etc.) identifiziert und ihr Vorkommen in einer Abbildung zugeordnet werden, wie nachstehend durch Beispiele erläutert werden wird (siehe Beispiele 1 und 2). Falls jedoch mehrere Farbstoffe gleichzeitig verwendet werden sollen, sollten deren Anregungswellenlängen, Fluoreszenzintensitäten und Emissionsspektren sorgfaltig abgeklärt werden. Wenn dies rieht erfolgte, dann können die Ergebnisse ebenfalls quantitativ analysiert werden. Beispielsweise kann die relative Konzentration mehrerer Proteine bei einer einzigen Erfassung erfasst werden, wobei geeignete, fluoreszierend markierte, spezifisch an diese Proteine bindenden Antikörper verwendet werden. Unter Verwendung von standardmäßig kalibrierten Farbstoffen können ebenfalls die absoluten Konzentrationen bestimmt werden.
Ein wichtiges Beispiel, bei dem der Nachweis mehrerer, fluoreszierender Sonden einen signifikanten Vorteil darstellen kann, ist FISH (fluoreszierende-zH-sziM-Hybridisierung) [Emanuel, Growth Genetics and Hormones 9 (1993) 6-12], die zum Analysieren von Genen auf Chromosomenebene und zum Auffinden möglicher derartiger genetischer Schädigungen, wie Gen/Chromosomen Amplifikation, Deletion, Translokation, Umlagerung und anderer Anormalitäten verwendet wird.
Bestimmte Erkrankungen und Störungen, einschließlich vieler Krebsarten und angeborener Schädigungen, sind genetische Störungen, die von Schädigungen an einem oder mehreren Genen verursacht werden. Bei vielen anderen Erkrankungen ist bekannt oder wird angenommen, daß eine (mehrere) genetische Komponente(n) vorliegen, d.h., daß eine (mehrere) genetische Schädigung(en) existiert (existieren), welche die Erkrankung alleine nicht verursacht (verursachen), aber zu ihr beiträgt (beitragen) oder die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung der Erkrankung zu einem späteren Zeitpunkt im Leben erhöht (erhöhen), wobei die Phänomene in der Technik als multifaktorielle Erkrankungen und genetische Veranlagungen bekannt sind. Die Korrelation sichtbarer genetischer Schädigung mit bekannten Erkrankungen würde Ärzten das Stellen definitiver Diagnosen ermöglichen, und eine frühzeitige Erfassung und Behandlung vieler Erkrankungen erlauben. Genetische Beratungen können zukünftige Eltern und gefährdete Personen auf die Möglichkeit potentiell ernsthafter medizinischer Probleme in der Zukunft
aufmerksam machen, wobei geeignete Intervention ermöglicht wird.
Mehr als 5000 genetische Störungen wurden nunmehr identifiziert, wobei viele mit mehreren genetischen Schädigungen assoziiert sind. Nach der Entdeckung, daß Chromosomen die Träger der Erbinformation sind, folgerten Wissenschaftler, daß es möglich sein sollte, sichtbare Schädigungen in Chromosomen zu dokumentieren, die für bestimmte Erkrankungen verantwortlich sind. In den 1960er Jahren wurden auf Mikroskopie basierende Anfärbe-Techniken zur Klassifizierung von Metaphase-Chromosomenspreizungen auf Objektträgern entwickelt. Während mehrerer Jahrzehnte wurde eine visuelle Analyse der Chromosomen-Bandenmuster zum Korrelieren menschlicher, genetischer Störungen mit beobachteten, strukturellen Anormalitäten in Metaphase-Chromosomen verwendet. Um kennzeichnende helle und dunkle Banden entlang ihrer Länge aufzuzeigen, werden Chromosomen gewöhnlich nach Giemsa-Anfärbung (G-Bandenfärbung) mit Hellfeld-Mikroskopie oder nach Fluoreszenz-Anfärbung (R-Bandenfärbung) mit Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Ein sorgfältiger Vergleich eines Bandenmusters von einem Patienten mit demjenigen normaler Chromosomen kann Anormalitäten, wie Translokationen (Austausch genetischen Materials zwischen oder innerhalb von Chromosomen), Deletionen (fehlende Chromosomen oder fehlende Fragmente von Chromosomen), Additionen, Inversionen und andere Mißbildungen, die Schädigungen und genetische Erkrankungen verursachen, aufzeigen.
Viele ernsthafte genetische Erkrankungen, wie beispielsweise zystische Fibröse (CF) und viele andere werden durch Mutationen verursacht, die Addition, Deletion oder Substitution nur eines Nucleotids oder einiger Nucleotide umfassen. Derart kleine Fehler sind durch die vorstehend beschriebenen, chromosomalen Bandenfärbungstechniken nicht nachweisbar und für viele Jahre haben Zytogenetiker daran gearbeitet, Techniken zum Ermitteln des Orts rad zum Quantifizieren winziger Fehler zu entwickeln.
Die fluoreszierende in situ Hybridisierung (FISH) hat sich während der letzten 25 Jahre durch die Verbesserung einer Anzahl ergänzender Techniken entwickelt. Ihre Entstehung wurde vom Wunsch der Zellgenetiker bessere Werkzeuge zur Kartierung des genauen Ortes der Gene auf den Chromosomen zu entwickeln und sehr kleine, bei einer großflächigen Anfärbung der Chromosomen nicht sichtbare genetische Schädigungen nachzuweisen, angetrieben. Das Menschliche Genom Projekt (HGP), eine breite Initiative zur Identifizierung und Zuordnung aller menschlichen Gene, zeigte Interesse an FISH und beschleunigte die Entwicklung der dringend erforderlichen Sonden. Gängige FISH-Techniken wurden ebenfalls durch die konkurrierende Entwicklung wirkungsvoller, immunologischer Sonden, einer wachsenden Vielzahl an exzellenten Fluoreszenz-Farbstoffen für Mikroskopie und Spektroskopie und dramatischen Verbesserungen an den, für Fluoreszenzmikroskopie verwendeten Objektiven, Illuminatoren und Filtern möglich gemacht.
Die Wirksamkeit und Nützlichkeit von FISH wird durch viele Faktoren bedingt: (1) FISH
kann nicht nur bei isolierten Chromosomen und Kernen, sondern auch bei ganzen Zellen, in fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten verwendet werden, (2) sie weist vergleichsweise kleine Schädigungen nach (die Fähigkeit des Nachweisens kleinerer Schädigungen nimmt konstant zu), (3) sie stellt vergleichsweise schnell Ergebnisse zur Verfügung, (4) ihre moderaten Kosten erlauben die Verwendung in den meisten diagnostischen Laboratorien und Forschungslaboratorien, (5) Anpassung an verschiedene Sonden und Typen von Untersuchungsmaterial kann entwickelt werden, und (6) hohe Spezifität und Empfindlichkeit kann erreicht werden (7) innerhalb kurzer Zeit, gewöhnlich im Bereich von zwei Stunden.
Viele FISH Anwendungen erfordern von dem Zellgenetiker lediglich, durch das Okular eines Mikroskops oder auf die Abbildung am Monitor zu schauen und zu bestimmen, ob eine fluoreszierende Markierung vorliegt oder fehlt. Bei ein wenig komplexeren Untersuchungsmaterialien kann eine einfache Zählung von einer oder zwei farbigen Markierungen erfolgen. Die Fähigkeit zum Bearbeiten digitaler Abbildungen und aus ihnen numerische Daten herauszuziehen, fügt den FISH-Techniken jedoch einen umfangreichen, neuen Satz von Möglichkeiten hinzu. Eine geeignete Abbildungsvorrichtung, wie die erfindungsgemäße Vorrichtung, kann sehr schwache FISH-Abbildungen verstärken, so daß die markierten Chromosomen und Loci klar identifizierbar sind. Unter einfach erreichbaren Versuchsbedingungen kann die Anzahl an markierten Stellen automatisch gezählt werden. Zusätzlich kann die Intensität an jeder markierten Stelle erfaßt und die Menge an DNA errechnet werden, um beispielsweise die von einem bestimmten Gen vorliegende Anzahl an Kopien aufzuzeigen. Daraus hervorgehende Techniken, wie mehrfarbige FISH, setzen Farbabbildungsanalysen ein, um mehrere (3, 4, 5 und mehr) fluoreszierende Sonden nachzuweisen und zu quantifizieren.
Wie vorstehend diskutiert, kann FISH Information über den Ort der markierten Sonde, die Anzahl markierter Stellen auf jedem Chromosom und die Intensität der Markierung (die Menge an genetischem Material) an jeder Stelle zur Verfügung stellen. Zentromerische (repetitve DNA) Sonden und Chromosomenanfärbungsmittel werden zum Markieren und Zählen der vorliegenden Anzahl an Kopien von jedem als Ziel gewählten Chromosom verwendet. Locus-spezifische Sonden werden zum Kartieren der Stelle kleiner Regionen genetischen Materials verwendet.
Diese Sondentypen können bei intakten Interphasenkernen, ebenso wie an Metaphase-Chromosomenspreizungen verwendet werden und können durch einen geeigneten Algorithmus visuell oder automatisch gezählt werden. Sie werden zum Identifizieren genetischer Erkrankungen routinemäßig verwendet, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie zu viele oder zu wenige Kopien eines bestimmten Chromosoms, Chromosomenfragments oder Gens aufweisen.
In sehr frühen Stadien einiger Krebsarten, lange bevor die Zellen als anormal erkannt werden, kann ein zahlenmäßiges Anwachsen bestimmter Gene auftreten, ein im Stand der
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Technik als Gen-Amplifikation bekanntes Phänomen, die unter Verwendung Locus-spezifischer Sonden als homogen angefärbte Bereiche (homogeneously stained regions, HSR) nachweisbar sind. Bei Verwendung von FISH zum Nachweisen von Chromosomenanormalitäten in Krebszellen können Hinweise über das Entwicklungsstadium der Erkrankung erhalten werden und ermöglichen deshalb das Auswählen der geeignetste(n) Behandlung(en), wobei viele der Behandlungen stadienspezifisch wirksam sind. Durch Auswählen der stadiumspezifischen Behandlung wird wertvolle Zeit gespart und das Leiden des Patienten auf ein Minimum reduziert.
Es ist möglich die gesamte Oberfläche eines bestimmten Chromosoms einheitlich bzw. gleichförmig zu markieren, indem das Chromosom isoliert wird (beispielsweise unter Verwendung von Durchflußzytometrie), indem es körperlich (beispielsweise durch Ultraschallbehandlung) oder enzymatischem (beispielsweise durch Endonukleasen) zerkleinert wird, und indem ein Satz an Sonden gegen alle Fragmente erzeugt wird. Vollständige Chromosomensonden, auch als Chromosomenanfärbungsmittel bekannt, markieren in fluoreszierender Weise alle Kopien ihres Zielchromosoms. Eine wichtige Anwendung der Chromosomen-Anfärbung ist der Nachweis von Deletionen und Translokationen zwischen zwei Chromosomen, die in kennzeichnender Weise in den früheren Stadien bestimmter Krebsarten auftreten. Nun sind ebenfalls andere Chromosomenabweichungen nachweisbar.
Falls beispielsweise Chromosom A spezifisch mit einem grünen Anfärbungsmittel und Chromosom B spezifisch mit einem roten Anfärbungsmittel markiert wird, so wird eine Translokation genetischen Materials von A nach B als ein grüner Bereich, der neben einem roten Bereich angeordnet ist, erscheinen (und umgekehrt). Gewöhnlich werden von normalen Chromosomen erzeugte Chromosomenanfärbungsmittel zum Nachweisen von Deletionen oder Translokationen an anormalen (Patienten) Chromosomen verwendet. Die umgekehrte Chromosomen-Anfarbung verwendet Sonden, die von einem anormalen Chromosom erzeugt wurden, um DNA von verschiedenen normalen Chromosomen zu identifizieren, die Material zu dem anormalen Chromosom beitrugen. Die, wie nachstehend im Beispielsabschnitt als Beispiel ausgeführte, erfindungsgemäße Vorrichtung, ermöglicht die 24 unterschiedlichen, den menschlichen Karyotyp (d.h. das Genom) umfassenden Chromosomen in jeweils einer unterschiedlichen Farbe anzufärben und gleichzeitig einen farbigen menschlichen Karyotyp unter Verwendung eines einzelnen Hybridisierungsverfahrens, gefolgt von einer einzelnen kurzen Erfassung, nachzuweisen, zu identifizieren und sinnvoll anzuzeigen.
Vergleichende Gen-Hybridisierung (comparative genmoic hybridization, CGH), ist eine Variation der umgekehrten Chromosomen-Anfärbung, bei der zwei Cocktails von DNA-Sonden aus ganzen Sätzen von Chromosomen erzeugt werden. Ein Cocktail wird aus einem Satz von normalen Chromosomen erzeugt und ein anderer aus einem Satz von anormalen (beispielsweise Tumor) Chromosomen. Die zwei Sätze werden unter Verwendung verschiedener
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Markierungsmoleküle erzeugt, so dass beispielsweise die normale DNA rote Fluoreszenz und die anormale DNA grüne Fluoreszenz zeigen wird. Eine normale Metaphasespreizung wird gleichzeitig mit beiden Cocktails hybridisiert und fortwährend unter Verwendung von Farbabbildungsanalyse ausgewertet. Bereiche normaler Chromosomen, die intensiver grün als rot fluoreszieren, zeigen an, dass DNA-Amplifikation (mehrere Genkopien) bei dem Gen in den anormalen Zellen des Patienten stattgefunden hat. Bereiche mit mehr roter als grüner Fluoreszenz (verringertes Grün/Rot-Verhältnis) zeigen Stellen genetischer Deletionen in den Chromosomen des Patienten an und Bereiche mit gleicher grüner und roter Fluoreszenz zeigen an, dass an dieser Stelle keine wesentlichen DNA-Veränderungen stattgefunden haben. Für weitere Details bezüglich CGH, siehe du-Manoir et al., Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization, Hum. Genet.90 (1993), 590-610. CGH und verwandte Techniken sind komplexer als vorhergehende Markierungstechniken, wobei sie bislang die Fähigkeit bieten, feinere und ausgedehntere genetische Veränderungen nachzuweisen und zu quantifizieren, als es früher möglich war. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist für diese Typen der Analyse sehr geeignet.
Aus dem, was vorstehend gesagt wurde, folgt, dass Karyotypisieren, Erfassung von Translokation/Umlagerung, Chromosomen-Deletion/Amplifikation und Genkartierung aus der Verwendung der erfindungsgemäßen, empfindlichen, quantitativen, spektralen Abbildungsvorrichtung sehr großen Nutzen ziehen, das eine vollständige, spektrale Abbildung bei relativ hoher spektraler Auflösung anstelle einer einfachen Farbfluoreszenzabbildung bildet. Dies gründet auf der Tatsache, weil ein derartiges Verfahren die Probenvorbereitungszeit verringert und dazu in der Lage ist, zwischen einer hybridisierten Fluoreszenzsonde und einer Sonde zu unterscheiden, die im Hintergrund (durch schmale spektrale Verschiebungen) verblieben ist, und dazu befähigt ist, eine große Sondenanzahl gleichzeitig zu erfassen, deren große Anzahl das erste Mal erreicht wird.
Damit ist es eine der Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine FISH-Abbildungsvorrichtung bereitzustellen, die dazu bestimmt ist, die Vorteile der Sondentechnologie auszunützen. Erfindungsgemäß gibt es eine Möglichkeit zum enormen Erhöhen der Sondenanzahl, die bei einer gegebenen Chromosomenanalyse analysiert werden kann als auch ein dramatisches Erhöhen der Geschwindigkeit und des Automatisierungsgrades, bei dem diese Information im Vergleich zu Verfahren des Standes der Technik erlangt werden kann.
Die erfindungsgemäße FISH-Abbildungsvorrichtung nützt die Vorteile des SpectraCube™-Systems aus, das in der Lage ist, Fluoreszenzspektren von allen Pixeln des mikroskopischen Sichtfelds gleichzeitig zu erlangen und den Ort mehrerer Fluoreszenzsonden in einem einzigen Experiment nachzuweisen. In Verbindung mit dem Vorhandensein von Chromsomen spezifischen Sonden und neuen Markierungsstrategien, wie in den nachstehenden Beispielen
erläutert wird, ist die Vorrichtung zum Erzeugen eines FISH-Karyotypen befähigt, wobei jedes Chromosom mit einer verschieden Farbe (d.h. 24 verschiedene Farben für einen menschlichen Karyotypen) angefärbt ist. Dieses Verfahren führt zu einem extrem hohen Probendurchsatz und erlaubt die Analyse einer im Wesentlichen unbegrenzten Sondenanzahl.
Wie vorstehend geschildert ist das Schlüsselkonzept der vorliegenden Erfindung die Verwendung mehrerer, fluoreszierender Sonden bei FISH-Assays. Zum Markieren von DNA-Sonden bei FISH-Assays sind zahlreiche Verfahren vorhanden, welche indirekte Verfahren einschließen, wobei unter Verwendung enzymatischer Reaktionen ein Hapten, wie Biotin oder Digoxigenin, in die DNA eingeführt wird. Nach der Hybridisierung an eine Metaphasen-Chromosomenspreizung oder einen Interphasenkern wird eine fluoreszierende Markierung an dem Hybrid durch die Verwendung immunologischer Verfahren angebracht. Erst vor sehr kurzem wurden fluoreszierende Farbstoffe direkt in Sonden eingebracht und ohne Verwendung eines Zwischenschritts nachgewiesen. Standard-FISH-Farbstoffe umfassen Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot und Kaskadenblau, und eine FISH-Analyse mit mehreren Sonden kann durch das Markieren verschiedener Sonden mit verschieden Haptenen oder fluoreszierenden Farbstoffen und Kombinationen davon vervollständigt werden, die in der Technik als kombinatorische Sonden bekannt sind [siehe, Ried et al, Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992), 1388-1392 und Ried, Fluoreszenz in situ Hybridizierung in der genetischen Diagnostik, Fakultät für theoretische Medizin, Karl Ruprechts Universität Heidelberg (Jan. 1994), beide werden unter Bezugnahme mitaufgenommen, als wären sie hier vollständig offenbart]. Alternativ kann ein Pool einer bestimmten Sonde in Unterpools, von denen jeder mit einem unterschiedlichen Flurophor markierte ist, dividiert werden, wobei danach die Unterpools umgruppiert werden, um andererseits ähnliche Hybridisierungsergebnisse zu erzielen, wobei dieses Verfahren in der Technik als kombinatorische Hybridisierung bekannt ist [siehe du-Manoir et al., Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridzation, Hum.Genet 90 (1993), 590-610, die hier unter Bezugnahme mitaufgenommen wird, als wäre sie hier vollständig offenbart]. Gemäß beider Markierungsstrategien werden kombinatorische Sonden erhalten. Damit bezieht sich der Term „Kombination von Fluorophoren", wenn er hier in diesem Dokument verwendet wird, sowohl auf kombinatorisches Markieren als auch auf kombinatorische Hybridisierung, wie vorstehend beschrieben wird.
Fluoreszenz ist eine Form der Lumineszenz, die stattfindet, nachdem Lichtphotonen von einem Molekül absorbiert wurden, das als ein Fluorophor in dem elektronischen Grundzustand bekannt ist. Das Molekül wird als Ergebnis des Elektrontransfers auf ein höheres Energieniveau in einen angeregten Zustand angehoben. Diese überschüssige Energie wird abgestrahlt, wenn das Elektron in seinen ursprünglichen Grundzustand zurückkehrt und setzt ein Lichtquant frei. Die
Wellenlänge des Fluoreszenzlichts ist länger als die des absorbierten Lichts. Diese Verschiebung ist begrenzt und verursacht, dass die Emissions- und Anregungswellenlängen dicht beieinander liegen. Aus diesem Grund emittieren die Fluorophore, die in einem spektralen Bereich angeregt werden können, in einem ähnlichen spektralen Bereich. Wenn beispielsweise die Anregung im Blaubereich liegt, wird die Emission im Grünbereich erwartet. Also wenn viele verschiedene Sonden verwendet werden sollen, die verschiedene Spektren emittieren, ist es einleuchtend, dass deren Wellenlängen dicht beieinander liegen müssen und ebenfalls häufig überlappen. Als Konsequenz ist es für die spektrale Auflösung von enormer Wichtigkeit, zwischen den verschiedenen Sonden unterscheiden zu können.
Gemäß der erfmdungsgemäßen Vorrichtung wird einzelnden Sonden (eine Sonde, auf die in diesem Dokument Bezug genommen wird, bezieht sich ebenfalls auf eine kombinatorische Sonde) eine Pseudofarbe (d.h. durch einen RGB-Algorithmus) oder eine künstliche Farbe (d.h. eine bestimmte Farbe gemäß eines Einteilungsalgorithmus, wie Einteilungszuordnung oder Hauptkomponenteanalyse, wie vorstehend beschrieben) zugeteilt und die Information wird auf einem Computerbildschirm angezeigt. Die Verwendung mehrfarbiger Fluoreszenz eröffnet eine Möglichkeit zum Ausdehnen von FISH in wichtige klinische Anwendungen, die von mehreren Sonden Vorteile erlangen können. Beispiele schließen Aneuplodie- und strukturelle Chromosomenstudien, Nachweis von Markierungschromosomen und vollständige FISH-Karyotypen und mehrfarbiger Chromosomenanfärbung ein. Da mehr Information von einer einzigen Hybridiziemng erhalten werden kann, wird der Durchsatz erhöht und interne Standards können verwendet werden, um die Gendosierungseffekte zu prüfen oder das Deletionsausimaß zu bestimmen.
Eine andere Aufgabe der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Erzeugung eines mehrfarbigen Bandenfarbungsmusters von Chromosomen (d.h. mit Strich-Code versehen, mehrfarbigen Bandenfärbung-Karyotyp), die auf FISH und spektraler Abbildung basieren. Für Details bezüglich des Anbringen von Strich-Code bei Chromosomen wird der Leser auf Lengauer et al., Hum. Molec. Genet. 5 (1993) 505-512 verwiesen.
Das erste Ziel des Human Genome Project (HGP) ist fast erreicht. Dieses Ziel ist die Erzeugung einer körperlichen Zuordnung des menschlichen Genoms. Der Term körperliche Zuordnung bezieht sich auf das Klonen des ganzen Genoms bei großen Insertvektoren, wie YAC-Klonen oder BAC-Klonen und die Zuordnung dieser Klone mittels Genetik, Zytogenetik und körperlicher Zuordnung. Zwei hauptsächliche Quellen menschlicher DNA werden für dieses Bemühen verwendet: bestrahlte Hybridzelllinien und YAC-Contigs, die überlappende Klone für alle menschlichen Chromosomen enthalten. Die Vervollständigung dieser Zuordnung erlaubt, für theoretisch jeden Bereich im Genom spezifische Klone zu bekommen, von denen gefordert wird, Gene zu identifizieren, die ursächlich bei vererbten oder erlangten genetischen Krankheiten, einschließlich Krebs, beteiligt sind. Durch das Kombinieren von FISH mit mehreren YAC- oder
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BAC-Klonen oder bestrahlten Hybriden und spektraler Abbildung ist es möglich, ein mehrfarbiges Bandenfärbungsmuster für alle menschlichen Chromosomen zu erzeugen, das schließlich die genetische und cytogenetische Zuordnung verbindet.
Als ein Beispiel wird die Verwendung eines bestrahlten Hybridfelds (Stanford Panel) in Erwägung gezogen [siehe J. H. Barett, Genetic mapping based on radiation hybrids, Genomic 13 (1992), 95-103]. Jedes einzelne Feld des Stanford Panels enthält einen Satz von. DNA-Fragmenten mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von etwa 5000 KBP. Jedes einzelne Feld bedeckt etwa 20% des menschlichen Genoms. Die Cohybridisierung fluoreszierender, von fünf derartiger Felder abgeleiteter Sonden würde deshalb zu der Abdeckung des Großteils des Genoms und damit der Markierung aller menschlicher Chromosomen führen. Die Fragmente sind jedoch zufällig in den einzelnen Feldern verteilt .Deshalb ist die Anzahl der erforderlichen Felder für eine vollständige Abdeckung des menschlichen Genoms höher (beispielsweise 6-10 Felder).
In der folgenden Beschreibung wird vorausgesetzt, dass fünf einzelne Felder verwendet werden. Die Chromosomen von jedem der Felder sind mit unterschiedlichen Fluorophoren m (oder einer unterschiedlichen Kombination von Fluorophore, beispielsweise kombinatorischer Markierungs- oder Hybridisierungsstrategien) durch beispielsweise direkt verbindende dUTP-konjugierte Fluorophore markiert, die von eingestreuten, wiederholenden Sequenzen (IRS, beispielsweise Alu-Sequenzen) abgeleitete Primer in einem in der Technik als ERS-PCR-Ansatz bekannten Ansatz, wie AIu-PCR Verfahren verwenden, das eine exklusive Amplifikation und Markierung nur menschlicher Sequenzen garantiert. Falls damit DNA von einer anderen Art als der des Menschen mit Amplifikation versehen oder markiert wird, ist eine artspezifische eingestreute, wiederholende Sequenz (interspersed repitive sequence, IRS), die das Genom jener Art kennzeichnet zu verwenden, um auf diese Weise geeignete PCR-Primer abzuleiten. Eine einzelne Hybridisierung eines der einzelnen Felder würde ein Bandenfärbungsmuster einer Chromosomenspreizung in einer Farbe mit einer Abdeckung von etwa 20% des Genoms und einer durchschnittlichen Bandgröße von 5000Kbp ergeben. Aufgrund der zufälligen Überlappung der einzelnen Chromosomenfragmente in den fünf Hybridfeldern würde die Kohybridi sierung der fünf unterschiedlich markierten Gruppen (jede Gruppe wird durch eine einzelnes Feld dargestellt) der Fragmente zu einem Bandenfärbungsmuster führen, das Banden, die reine Farben aufweisen, und Banden, die jede eine Kombination von zwei, drei, vier als auch fünf Farben umfassen, umfasst die gemeinsam in 31 möglichen Farbkombinationen ausmachen, wobei die Kombinationen unter Verwendung spektraler Abbildung unterschieden werden können.
Die Erzeugung eines mehrfarbigen Bandenfärbungsmusters von Chromosomen mit hoher Auflösung hat wie folgt zwei unterschiedliche Vorteile verglichen mit der Verwendung von Chromosomenanfärbungssonden (d.h. Chromosomenanfärbungsmittel).
Chromosomenanfärbung ist ein gut geeignetes Instrument, um interchromosomale
Abweichungen, wie Translokationen, oder homogen angefärbte Bereiche wie auch zusätzliches Chromosomenmaterial, wie Marker-Chromosomen oder Double-Minute-Chromosomen,
- nachzuweisen. Interchromosomale Abweichungen, wie Deletionen und Duplikationen, würden nur nachgewiesen werden, falls die Größe der Abweichung die Chromosomenlänge beeinträchtigt, wobei chromosomale Inversionen von all diesen Verfahren nicht nachgewiesen werden können. Durch Nutzen eines mehrfarbigen Bandenfärbungsmusters könnten jedoch sowohl inter- als auch intrachromosomale Abweichungen diagnostiziert werden, da sie die Sequenz der chromosomalen Banden beeinträchtigen würden.
Ein großer Vorteil von mehrfarbigen Bandenfärbungsmuster mit hoher Auflösung, die prezugeordnete DNA-Fragmente (beispielsweise YAC-Klone und bestrahlte Hybridzelllinien) verwendet, ist die Möglichkeit, die genetische und zytogenetische Zuordnung zu integrieren. Jede mehrfarbige Bande ist durch einen spezifischen Satz Sequenz-versehener Stellen gekennzeichnet. Diese sind PCR-Produkte, die nur in einem Genom auftreten.
Nachstehend ist eine Beschreibung der Nützlichkeit der integrierten zytogenetischen und genetischen Zuordnung. Beispielsweise zeigt das Fehlen einer spezifischen Farbbande auf einem von einer Tumorzelle abgeleiteten Chromosom eine Mikrodeletion an, die oft den Verlust eines Tumor unterdrückenden Gens wiederspiegelt. Das Wissen von der Stelle der Zielsequenz (sequence target sites, STS's), die für das Band spezifisch sind, würde das Überprüfen irgendeiner großen Klonansammlung mit Inserts und das Wiederfinden von spezifischen Klonen erlauben, die sehr wahrscheinlich das in dem beschriebenen Beispiel der Deletion unterworfene Gen enthalten.
Es sollte erwähnt werden, dass mit nun betriebenen Sequenzierungsanstrengungen großen Maßstabs und der Integrierung von deutlich versehenen Stellen (Loci, von denen bekanni: ist, das sie eine Gen enthalten) der Wert eines mehrfarbigen Bandenanfärbungsmusters auf Hybridisierngsbasis noch mehr steigen würde.
Es ist ebenfalls denkbar, dass derartige mehrfarbige Bandenanfarbungsmuster leicht automatisiert werden könnten. Trotz beträchtlicher Anstrengungen war die Automatisierung von zytogenetischer, auf herkömmlichen Banden basierender Diagnose bisher nicht erfolgreich. Der hier vorstehend beschriebene Ansatz wird für die Erzeugung eines Bandenanfarbungsmuster menschlicher Chromosomen auf Hybridisierungsbasis nicht anwendbar sein, aber dafür für andere Säugetiere (beispielsweise Maus) und Nichtsäugetierarten. Dies wird besonders nützlich für die Analyse bei Tiermodellen von menschlichen Krankheiten, einschließlich Krebs, sein.
In Analogie zu dem für die bestrahlte Hybridfelder beschriebenen Szenario könnte ein mehrfarbiges Bandenanfarbungsmuster für alle menschlichen Chromosomen durch Kohybridisierung eines Satzes an einzelnen Klonen mit großen Insert, wie YAC-Klonen, Pl-Klonen, BAC-Klonen oder abhängig von der gewünschten Auflösung die Verwendung von Contigs (überlappenden Klonen) dieser Quellen erreicht werden. In weiterer Analogie zur
Verendung der bestrahlte Hybridfelder, könnte ein mehrfarbiges Bandenanfärbungsmuster durch absichtliches Markieren der überlappenden Klone oder Contigs mit unterschiedlichen Sonden eingeführt werden. Alle Vorteile der Chromosombandenanfarbungansastzei; auf Hybridisierungsbasis weisen, verglichen mit der Verwendung von Chromosomenanfärbungsmitteln oder mit vorstehend beschriebener herkömmlicher Bandenfärbung, Anwendungen zur Verwendung von Klonen auch mit großen Einschlüssen auf. Es dem Fachmann klar, dass das Zurückerhalten der an der Bruchgrenze oder an chromosomaler Deletion beteiligten Klonen noch direkter wäre als mit der Verwendung von bestrahlten Hybridfeldem.
Eine andere Quelle für Chromosomenfragmente, die für den Gebrauch für mehrfarbige Chromosomenanfärbung geeignet sind, sind durch die Mikrozerlegung von Chromosomen erhaltene Fragmente. Mikrozerlgte Chromosomenfragmente werden durch manuelle oder Laser-Mikromanipulation von Chromosomenspreizungen erzeugt, wie in der Technik bekannt ist. Die auf diese Weise erzeugten Fragmente werden gewöhnlich durch Plymerasenkettenireaktion vervielfacht, beispielsweise unter Verwendung von degenerierten Oligonucleotidprimern (degenerated oligonucleotides primer, DOP) in einem in der Technik als DOP-PCR bekannten Verfahren oder unter Verwendung von Primern, die von eingestreuten, wiederholenden Sequenzen (IRS, beispielsweise Alu-Sequenzen in einem in der Technik als IRS-PCR beikannten Verfahren abgeleitet werden.
Eine zusätzliche Quelle für Chromosomenfragmente, die bislang für den Gebrauch für mehrfarbige Chromosomenanfärbung geeignet sind, sind durch DNA-Einschränkungsansätze erzeugte Fragmente, die große DNA-Fragmente und Elektrophoreseansätze, die zum Trennen der Größe von großen DNA-Fragmenten fähig sind, erzeugen. Soweit das Erzeugen von großen DNA-Fragmenten durch DNA-Einschränkung betroffen wird, können zwei Ansätze in Erwägung gezogen werden. Gemäß des ersten wird eine teilweise Spaltung durch eine Endonuclease (beispielsweise häufig oder selten schneidende Endonucleasen) verwendet, während bei der zweiten eine vollständige Spaltung durch eine selten schneidende Endonulease (beispielsweise Notl)verwendet wird. Der Letztere ist gegenwärtig bevorzugt, da eine vollständigere Spaltung wiederholt werden kann, um in unabhängigen Versuchen identische Ergebnisse zu erhalten, während die teilweise Spaltung von Natur aus zufällig ist. Elektrophoreseansätze, die zum Trennen der Größe von großen DNA-Fragmenten fähig sind, sind in der Technik gut bekannt und schließen Impulsfeld-Gelelektrophorese (pulse field gel electrophorese, PFGE) ein. Damit würde, ähnlich wie vorstehend beschrieben, beispielsweise Herausziehen von DNA aus aufeinanderfolgenden Bereichen entlang des PFGE-Streifens, Markieren der aus jedem dieser Bereiche herausgezogenen DNA unter Verendung eines unterschiedlichen Fluorophors und Kohybridisieren der damit gebildeten Sonden mit Chromosomen in einem mehrfarbigen Bandenanfärbungsmuster der Chromosomen resultieren. Große DNA-Fragmente können
zusätzlich über Gradientenzentrifugation, wie Saccharose- oder Cäsiumchloridgradienten erhalten werden, wie aus der Technik bekannt ist. Trotzdem ist es klar, dass die Verwendung dieser Ansätze keine Möglichkeit bereitstellt, die wie vorstehend beschriebene genetische und zytogenetische Zuordnung zu integrieren und deshalb gegenwärtig weniger vorteilhaft ist.
Die Erzeugung eines auf in situ Hybridisierung und spektraler Abbildung basierenden mehrfarbigen Bandenanfärbungsmuster von Chromosomen (d.h. mehrfarbigen Bandenfärbungs-Karyotyp) kann für verschiedene praktische Anwendungen verwendet werden. Diese schließen beispielsweise ein (i) Überprüfen auf chromosomale Abweichungen unter Verwendung spezifisch geschneiderter Klonensätze, (ii) Überprüfen auf telomerische Deletionen, die auf andere Weise schwer nachzuweisen sind, (iii) Überprüfen auf chromosomale Aneuploiden während pränataler Diagnose (iv) Überprüfen auf periodisch auftretende chromosomale Bruchstellen (v) vergleichende, genomische mehrfarbige Hybridisierung, (vii) Kombinieren von mehrfarbigen FISH mit andern Erfassungen zytologischer und Immunohistochemischer Anfärbungen zur Multiparameteranalyse von Tumorzellen, (viii) Kombinieren der mehrfarbigen Bandenanfärbungsmuster mit herkömmlichen R- oder G-Bandenfärbungen (iX) Analyse der genetischen Abweichungen direkt in Interphase-Zellen und (x) Überprüfen auf chromosomale Abweichungen bei Strahlung oder Mutagen-ausgesetzten Populationen.
Die Erzeugung eines auf in situ Hybridisierung und spektraler Abbildung basierenden mehrfarbigen Bandenanfärbungsmuster von Chromosomen (d.h. mehrfarbigen Bandenfärbungs-Karyotyp) kann für verschiedene praktische Anwendungen verwendet werden. Diese schließen beispielsweise ein (i) Überprüfen auf chromosomale Abweichungen unter Verwendung spezifisch geschneiderter Klonensätze, (ii) Überprüfen auf telomerische Deletionen, die auf andere Weise schwer nachzuweisen sind, (iii) Überprüfen auf chromosomale Aneuploiden während pränataler Diagnose (iv) Überprüfen auf periodisch auftretende chromosomale Bruchstellen (v) vergleichende, genomische mehrfarbige Hybridisierung, (vii) Kombinieren von mehrfarbigen FISH mit andern Erfassungen zytologischer und Immunohistochemischer Anfärbungen zur Multiparameteranalyse von Tumorzellen, (viii) Kombinieren der mehrfarbigen Bandenanfärbungsmuster mit herkömmlichen R- oder G-Bandenfärbungen (iX) Analyse der genetischen Abweichungen direkt in Interphase-Zellen und (x) Überprüfen auf chromosomale Abweichungen bei Strahlung oder Mutagen-ausgesetzten Populationen.
Folgend ist eine kurze Zusammenfassung wahrscheinicher Anwendungen spektraler Bio-Abbildung in dem Gebiet der molekularen Zytogenetik. Zwei Hauptfelder der Zytogenetik, in denen die spektrale Bio-Abbildung einen erwähnenswerten Einfluß mit besonderer Betonung auf diagnostische Anwendungen aufweisen wird, sind: (i) klinische Zytogenetik und (ii) Tumorzytogenetik.
Ungefähr 400 000 Fälle sowohl in klinischer Zytogenetik als auch in Krebszytogenetik werden jedes allein in den US unter der Verwendung von Chromosomenbandenanfärbungsanalyse analysiert. Chromosomenanfärbung könnte zusätzlich zu herkömmlichen Bandenfärbungsanalysen durchgeführt werden und würden helfen, die Marker-Chromosomen , die nicht durch Bandenfärbung allein gekennzeichnet werden können, zu identifizieren.
Herkömmliche Chromosomenbandenfärbungsanalyse (herkömmliche Karyotypisierung) ist immer noch das am häufigsten verwendete Diagnoseverfahren zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen in prä- und postnataler Diagnose. Dies schließt die Diagnose numerischer Abweichungen wie Trisomie für Chromosom 21 (und seltener Chromosomen 13, 18, X, Y) ein. Herkömmliche Chromosomenbandenfärbungsanalyse wird verwendet, weil sie bis jetzt die einzige Überprüfung (oder Genomscannenverfahren) ist, das zum Nachweis hromosomaler Abweichungen erhältlich ist. Das bedeutet, dass die gesamte Chromosomen menge, d.h. Genom, in einer einzigen Erfassung beurteilt werden kann. Dies erklärt ebenfalls, warum zielgerichtete FISH-Verfahren, dies sind Untersuchungen mit Sonden, die beispielsweise auf Chromosom 21
spezifisch sind, nur als komplementäre Verfahren verwendet werden. Bei der Verwendung von zielgerichteten FISH-Verfahren entwischen chromosomale Abweichungen auf anderen Chromosomen als dem, auf das die Sonde ausgerichtet ist, dem Nachweis. Andererseits würde die gleichzeitige Anfarbung aller Chromosomen gemäß der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung und die Möglichkeit, alle Chromosomen mittels unterschiedlicher Spektren zu unterscheiden diese Begrenzungen der FISH-Analyse umgehen. Es ist denkbar, dass Genomanfärbung ein wichtiges, wenn nicht obligatorisches, Diagnoseverfahren in pränataler Diagnose wird. Dies ist sogar noch wahrscheinlicher, weil die Bio-Abbildungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung, wenn sie unter der Verwendung passender Filter angewendet wird, sowohl FISH-Fluorophore als auch DAPI-Kontrastfärbung in einer einzigen Erfassung nachweisen und damit eine mehrfarbige FISH-Abbildung und eine DAPI-Bandenfärbungsabbildung der gleichen Chromosomenspreizung in einer einzigen Erfassung bereitstellen kann. Damit wird das gut eingeführte Rückgrat der zytogenetischen Information erhalten und kann zusammen mit den Anfärbungsmustern angezeigt werden. In dieser Beziehung ist es bemerkenswert, zu erwähnen, dass eine automatisierte Identifizierung der Chromosomen möglich werden wird. Dieses Ziel könnte nicht allein mit herkömmlichen Bandefärbungsverfahren zufriedenstellend erreicht werden.
In den Gebiet postnataler tytogenetischer Diagnose wird auf Chromosomenan färbung basierende, spektrale Bio-Abbildung beim Identifizieren enorm hilfreich werden. Das diagnostische Hindernis ist zu bestimmen, ob diskrete, kleine chromosomale Fragmente, die verschoben sind und ein abweichendes Chromosom verursachen, ausgewogen sind (d.h. keine Kopieanzahländerung) oder unausgewogen, was zu teilweisen Trisomien oder Monosomien führt, die die Hauptursache menschliche Fehlinformation und Symptome menschlicher Zurückgebliebenheit sind, von denen einige im Ursprung rätselhaft bleiben werden.
All die vorstehend erwähnten Ansätze nutzen Chromosomenanfärbungssonden. !Eine auf Chromosomenanfärbung basierende Hybridisierung ist mit spezifischen Sondensätzen in Kombination mit spektraler Abbildung möglich. Jene Sonden können mit noch nie dagewesener Auflösung gewählt werden oder können geschneidert werden um sich an spezifische diagnostische Probleme, wie die Mikrodeletionen oder telomerische Sequenzen zu wenden, die zur Zeit aufgrund von genetisch verursachten Krankheiten unterschätzt werden.
Sonden, die bei den Versuchen nützlich sind, ein mehrfarbiges Bandennfärbungsmuster der ganzen Chromosomenmenge (d.h. Genom) zu erzeugen, sind entweder Mikroaufgliederungsbibliotheken, die Chromosomenband-spezifische Sequenzen enthalten, YAC (oder andere) Contigs oder Strahlungs-induzierte Hybridzelllinien mit einer spezifischen und bekannten Darstellung menschlicher Sequenzen von großen Chromosomenfragmenten, die durch Endonuleaseaufschluß gefolgt von PFGE-Größentrennung erzeugt werden, die ein bestimmtes mehrfarbiges Bandennfärbungsmuster entlang aller Chromosomen erzeugen. Die
Änderung des Farbmusters würde mit hoher Auslösung die Anwesenheit chromosomaler Abweichung(en) anzeigen. Es ist klar, dass ein derartiger Ansatz in seiner Gestaltung sehr flexibel ist und leicht automatisiert werden könnte.
Erworbene chromosomale Abwichungen sind vorrangig mit bösartigen Transformationen assoziiert. Grob gesehen, können zwei bösartige Veränderungen unterschieden werden: (i) hämatologische bösartige Veränderungen und (ii) feste Tumoren. Da die Zellen der hämatologischen, bösartigen Veränderungen einfach in vitro kultiviert werden können., ist die Chromosomenbandenanfarbungsanalyse dieser Tumoren eine der mit Erfolg gekrönten Geschichten der Zellgenetik und der genetischen Krebsforschung. Zwei wohlbekannte Beispiele schließen die Identifizierung des Philadelphia Chromosoms bei chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und einer spezifischen, chromosomalen Abweichung bei Burkitt's Lymphoma. Viele weitere tumor-spezifische, chromosomale Abweichungen wurden bei hämatologischen bösartigen Veränderungen im letzten Jahrzehnt beschrieben und werden als ein diagnostisches Instrument und als ein Forschungsinstrument verwendet. In vielen Fällen ermöglichte die Aufzeichnung einer wiederkehrenden chromosomalen Abweichung auf molekularer Basis die Identifizierung des Mechanismus der bösartigen Veränderung. Beunruhigenderweise ist wenig auf dem Gebiet der festen Tumore (derart wie Brust-, Darm-, Gehirn-, Lungen- und andere Tumore) bekannt. Diese Diskrepanz ist umso beunruhigender, da feste Tumore eine höhere Rolle bei der menschlichen Krankheitshäufigkeit spielen als hämatologische, bösartige Veränderungen.
Die Diskrepanz wird hauptsächlich durch technische Schwierigkeiten bedingt, die bei Zellgenetik fester Tumore geläufig sind. Die häufig schwierige Kultivierung fester Tumorzellen und die schlechte Qualität der Chromosomenpräparationen verhindern eine hochauflösende zellgenetische Analyse und sekundäre chromosomale Abweichungen, die nicht unbedingt mit Tumor-Initiation oder Progression verbunden ist, bilden ein gemeinsames Merkmal dieser Tumore. Die Verfügbarkeit einer auf Hybridisierung basierenden chromosomalen Überprüfung (d. h. Chromosomenanfärbung) schließt eine methodische Lücke und ist wie vorstehend beschrieben dringend erforderlich. Teilweise hilft in dieser Hinsicht vergleichende genomische Hybridisierung. Eine strukturelle, chromosomale Abweichung kann jedoch nicht nachgewiesen werden und zeigt stets einenDurchschnitt der chromosomalen Abweichung in einem Zellgemisch auf. Es kann sehr wahrscheinlich vorhergesagt werden, daß die auf Karyotypisierung basierende Hybridisierung ein weitverbreitetes Verfahren zur Aufzeichnung wiederkehrender, chromosomaler Abweichungen bei festen Tumoren werden könnte, sowohl in der Grundlagenforschung als auch im diagnostischen Labor. Erneut werden Verbesserungen der Technik, die Bereich- oder Banden-spezifische Sonden einsetzt, die Auflösung dramatisch erhöhen.
Die Erzeugung eines mehrfarbigen Bandenfärbungsmusters von Chromosomen (d.h mehrfarbigen Bandenfärbungs-Karyotyps) und auf FISH basierender und spektraler Abbildung
Chromosomenanfarbung können für verschiedene zusätzliche Anwendungen verwendet werden. Diese umfassen beispielsweise (i) biologische Dosimetrie, wobei Überprüfung von Metaphase-Platten von Strahlung oder Chemikalien, die bekannt sind chromosomale Abweichungen zu induzieren, gegenüber ausgesetzten Individuen durchgeführt wird, um Schäden einzubringen, (ii) Chromosomenweiterentwicklung, wobei FISH verwendet wird, um chromosomaler Neuanordnungen zu rekonstruieren, die während der Weiterentwicklung aufgetreten sind, (iii) die Analyse chromosamaler Abweichungen bei Tiermodellen von menschlichen Kranldieiten, besonders Krebs, würde durch die Verwendung von auf Hybridisierung basierendem Karyotypinng enorm vereinfacht werden, (iv) Interphasen-Zytogenetik, wobei die gleiclizeitige Aufzählung der Chromosomenkopieanzahl in intakten Interphasezellen eine Anwendung für den Nachweis für Aneuploidie in pränataler Diagnose, in der Krebsforschung und in der Diagnose für minimal, zurüchgebliebener Krankheiten, wobei dies in Kombination mit konfokaler LASER-Scannenmikroskopie ein ausgezeichnetes Forschungsinstrument für die Analyse des Aufbaus des Interphasen-Chromatins werden würde und (v) zytologische Diagnose, wobei die Vervollständigung histochemischer Diagnose durch Verwendung von Mehrsonden-FISH unmittelbar auf den Gewebeschnitt und den Kern in Kombination mit konfokaler LASER-Scannenmikroskopie oder Dekonvolutionsalgorithmen möglich wird.
Damit wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine fluoreszierende in situ Hybridisierungsvorrichtung bereitgestellt, wobei die Vorrichtung die Merkmale einschließt von
(a) Bereitstellen eines Zellkerns mit Chromosomen, wobei die Chromosomen mit wenigstens einer Nucleinsäuresonde hybridisiert sind, die mit wenigstens einem Fluorophor markiert ist und (b) Betrachten des Zellkerns durch ein Fluoreszenzmikroskop, wobei das Fluoreszenzmikroskop mit einem Abbildungsspektrometer optisch verbunden ist und wobei das Fluoreszenzmikroskop und das Abbildungsspektrometer zum Erhalten eines Spektrums von jedem Pixel des Zellkerns dienen.
Weiterhin wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung für auf Hybridisierung basierender mehrfarbiger Chromosomenanfarbung bereitgestellt, wobei die Vorrichtung die Merkmale einschließt von (a) Bereitstellen eines Zellkerns einer ersten Art mit einem Genom und Chromosomen, wobei die Chromosomen mit wenigstens einer Gruppe von Chromosomenfragmenten hybridisiert sind, die wenigstens eine Fraktion des Genom der ersten Art abdecken und wobei die Fragmente mit wenigstens einem Fluorophor markiert sind und (b) Betrachten des Zellkerns durch ein Fluoreszenzmikroskop, wobei das Fluoreszenzmikroskop mit einem Abbildungsspektrometer optisch verbunden ist und wobei das Fluoreszenzmikroskop und das Abbildungsspektrometer zum Erhalten eines Spektrums von jedem Pixel des Zellkerns dienen.
Es ist für einen Fachmann klar, dass jedes Abbildungsspektrometer geeignet sein kann, die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zu bilden. Diese schließt auf Gittern und Filtern
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basierende, wie in dem vorstehenden Hintergrundsbereich beschriebene Spektrometer ein. Es wird jedoch aufgrund der vorstehenden Gründe gegenwärtig bevorzugt, dass ein auf Interferometrie basierendes Abbildungsspektrometer eingesetzt wird.
Damit wird ein Spektrum jedes Pixels des Zellkerns bevorzugt erhalten durch (i) Sammeln des einfallenden Lichts gleichzeitig von allen Pixeln des Zellkerns unter Verwendung parallel ausrichtender optischen Bestandteilen (ii) Durchleiten des einfallenden, parallel ausgerichteten Lichts durch ein Interferometersystem mit einer Anzahl von Elementen, so dass das Licht zuerst in zwei kohärente Strahlen geteilt wird, die sich in unterschiedliche Richtungen innerhalb des Interferometers bewegen und dann vereinigen sich die Strahlen erneut, um miteinander zu interferieren, um einen austretenden Lichtstrahl zu bilden, (iii) Durchleiten des austretenden Lichtstrahls durch ein fokussierendes, optisches System, das den austretenden Lichtstrahl auf einen Detektor mit einer zweidimensionalen Anordnung von Detektorelementen fokussiert, so dass zu jedem Zeitpunktt jedes der Detektorelemente die Abbildung eines und immer des gleichen Pixels des Zellkerns während der ganzen Dauer der Erfassung ist, so dass die reale Abbildung des Zellkerns stationär auf der Ebene der Detektoranordnung ist und die Abbildung zu jedem Zeitpunkt der Erfassung immer noch sichtbar und erkennbar ist und so dass jedes der Detektorelemente ein Signal erzeugt, das eine besondere Linearkombination der, durch das Pixel bei unterschiedlichen Wellenlängen emittierten Lichtintensität ist, wobei die Linearkombination eine Funktion der momentanen optischen Wegdifferenz ist, (iv) Drehen oder Verschieben eines oder mehrerer Elemente des Interferometersystems, so dass die optische Wegdifferenz zwischen den zwei, kohärenten, durch das Interferometersystem erzeugten Strahlen für alle Pixel des Zellkerns gleichzeitig gescannt wird und (v) Aufnehmen der Signale jedes der Detektorelemente als Funktion der Zeit unter Verwendung einer Aufnahmevorrichtung, um einen ersten spektralen Datenwürfel zu bilden und (c) Auswerten des ersten, spektralen Datenwürfels unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus.
Die Nucleinsäurensonde kann einschließen Loci, fragmentierte Chromosomen, künstliche Hefechromosomen, wobei alle einen Insert einschließen, Plasmide, Insertes, Kosmide, Phagemide oder virale Vektoren, wobei jedes einen Insert einschließt, vollständige (d.h. ganze) Genome einer Art oder ein kanzerösen Gewebe und Kombinationen davon. Der Zellkern kann ein Zellkern während der Interphase, ein Zellkern während der Mitose und Zellkern während der Meiose sein und folglich könnendie Chromosomen Interphasenchromosomen, Chromosomen während der Mitose und Chromosomen während der Meiose sein. Die Anzahl der Nucleinsäuresonden kann eins, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechszehn, siebzehn, achtzehn, neunzehn, 2:wanzig, einundzwanzig, zewiundzwanzig, dreiundzwanzig, vierundzwanzig oder größer als vierundzwanzig sein, wobei jede der Sonden einen unterschiedlichen Fluorophor oder eine unterschiedliche Kombination von Fluorophoren (d.h. eine kombinatorische Sonde, die entweder
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durch kombinatorisches Markieren oder Hybridisierungsstrategien erhalten wird, wie vorstehend beschrieben ist). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Fluorophore mit einem Nucleotid oder einem Nucleotidanalogon konjugiert.
Der mathematische Algorithmus kann sein: (a) eine farbige Rot-Grün-Blau-Abbilungsberechnung, die bestimmte Wellenlängenbereiche verwendet, (b) eine Einteilungs-Zuordnugsanalyse, die für das Spektrum von jedem der Pixel eine spektrale Differenz von wenigstens einem Referenzspektrum berechnet, (c) eine Linearkombinationsanalyse, wobei die Analyse zur Hintergrundsubstraktion kombiniert mit der Einteilungs-Zuordnungsanlyse di ent, (d) eine Hauptkomponentenanalyse und (e) jeder andere Algorithmus, der für Pixeleinteilung gemäß ihrer assozierten Spektren geeignet ist.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann für verschiedene Forschungsanwendungen und medizinische Anwendungen verwendet werden. Damit kann die Vorrichtung beispielsweise verwendet werden für (i) Nachweis von telomeren Deletionen mit hoher Auflösung, die vorher nicht nachweisbar waren, (ii) zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen, wie wiederkehrende, chromsomale Abweichungen und/oder sekundäre, chromosomale Abweichungen, die verschiedene Abweichungen kennzeichnen, (iii) zum Nachweisen des Stadium der Bösartigkeit gemäß der Gegenwart von wiederkehrenden, chromosmalen Abweichungen und/oder sekundären chromsomalen Abweichungen, (iv) der Nachweis des Stadiums der Bösartigkeit kann für das Auswählen einer Behandlung der Bösartigkeit verwendet werden (v) zum Verfolgen der Wirksamkeit einer Antikrebsbehandlung, wie Bestrahlungstherapie und Chemotherpie und (vi) zum Nachweisen chomosomaler Abweichungen, die auf die Aussetzung gegenüber mitogenetischer Agenzien folgen, die aber nicht auf Strahlung und mitogenen Chemikalien, wie beruflich bedingter Chemikalien wie beispielsweise Mineralölerzeugnisseund Asbest, begrenzt sind.
Gemäß dem Verfahren für auf Hybridsierung basierender mehrfarbiger Chromosomenanfärbung können die Chromosomenfragente aus jeder geeigneten Quelle stammen. Vorzugsweise werden die Fragmente abgeleitet von bestahlten Hybridzelllinien, wie bestahlte Hybridzelllinien von Mensch/Hamster, YAC-Klonen (beispielsweise Contigs)., BAC-Klonen, nach Größe getrennte Endonuclease-Spaltprodukte eines vollständigen Genoms einer ausgewählten Art oder mikrozerlegten Chromosomenfragmente von jener Art. Bislang können andere Quellen von Chromosomenfragmenten, wie diejenigen, die druch Gradientenzentrifugation erhalten werden, eingesetzt werden, um die Vorrichtung der vorliegenden Erfidung zu bilden. Die Fragmente können vereint jeden Bereich des Genoms abdecken. Beispiele schließen 10-20%, 21-30%, 31-40%, 41-50%, 51-60%, 61-70%, 71-80%, 81-90% und 91-100% Abdeckung ein. Das Verfahren wird vorzugsweise bei der menschlichen Art angewendet, wobei jede gewünschte Art (beispielsweise Maus) der Analysegegenstand gemäß des Verfahrens sein kann. Weiterhin kann das Verfahren in einer artenübergreifenden
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Weise angewendet werden, wobei die Chromosomen von einer ersten Art (beispielsweise: Maus, Affe, etc.) und die Chromosomenfragmente von einer zweiten Art (beispielsweise Mensch) stammen. Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform sind die Chromosmenfragmente in Gruppen gruppiert, wobei jede der Gruppen mit einem unterschiedlichen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophorenmarkiert ist. Markiern der Chromosomenfragmente kann beispielsweise durch IRS-PCR, wie AIu-PCR, erreicht werden, wenn die Fragmente vom Menschen stammen.
Während die Erfindung mit Bezug einer begrenzten Anahl von Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es klar, dass viele Veränderungen, Modifikationen und andere Anwendungen der Erfindung gemacht werden können.
Nun wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele zusammen mit den vorstehnden Beschreibungen die Erfindung erläutert.
Kurze Beschreibung des experimentellen Protokolls
Eingestreute, wiederholte Elemente-(IRS)-PCR (beispielsweise AIu-PCR) ist ein schnelles und verläßliches Verfahren, um Sondensequenzen für FISH aus YAC-Klonen oder Hybridzellinien etc. zu erzeugen. Unter Verwendung dieses Ansatzes ist die fluoreszierende Hintergrundfärbung geringer im Vergleich zu der Verwendung von vollständigen YAC oder Hybridzelllinien der DNA, die beispielsweise durch Nick-Translation oder zufälliges Priming markiert sind.
Weiterhinhin kann in Agarosestopfen, Hefekolonien auf Agarplatten als auch in gereinigter YAC-DNA eingebettete YAC-DNA erweitert werden. Das hier dargestellte Protokoll folgt demjenigen, das durch Lengauer et al., Cancer Res. (192) 2590-2596 beschrieben wird, das hier unter Bezugnahme mitaufgenommen wird, als wäre es hier vollständig offenbart.
Lösungen: 10 &khgr; PCR-Puffer (Perkin-Elmer &Pgr;), jeweils 25 raM dATP, dCTP, dGTP, dTTP (gemeinsam dNTP), 50 &mgr;&Mgr; Alu-Primer CLl (5' TCC CAA AGT GCT GGG ATT ACA G3'), 50 &mgr;&Mgr; Alu-Primer (5' CTG CAC TCC AGC CTG GG3')
Vorgehensweise: 100 ng DNA (oder equivalente Menge von DNA in Agarosestopfen oder Hefekolonien), 10 &mgr;&idiagr; 10 &khgr; PCR-Puffer (Perkin-Elmer &Pgr;), 10 &mgr;&idiagr; 15mM MgCl2, 1 &mgr;\ 25mM dNTP, 0,5 &mgr;\ 50 &mgr;&Mgr; Primer CL I, 5 &mgr;&idiagr; 15 mM MgCl2, 0,5 &mgr;\ TAQ DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, 2,5 U) und ddH2O, um das Reaktionsvolumen auf 100 &mgr;\ zu vervollständigen, werden gemischt und 30 PCR-Zyklen für 1 min bei 96°C, 0,5 min bei 37°C und 6 min bei 720C unterworfen. Die PCR-Ergebnisse werden unter UV-Belichtung durch Ethidiumbromid angefärbtes 1,2% Agarosegel betrachtet. Die PCR-Produkte werden mit Ethanol präzipitiert, erneut in 50 &mgr;&idiagr; ddH2O gelöst und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
Die sequenzunabhängige Amplifikation von DNA, d.h. degenerierter Oligonucleotidpromer (DOP)-PCR, wurde zuerst durch Telenius et al., Genes Chromosomes Cancer 4 (1992), 257-263 beschrieben, die hier unter Bezugnahme mitaufgenommen wird, als wäre sie hier vollständig offenbart. Mittlerweile sind mehrere Modifikatonen veröffentlicht worden (Bohlander et al, Genomics 13 (1992) 1322-1324, Milan et al., Cytogenet. CeI Genet. 62 (1993), 139-141 und Guan et al., Genomics 22 (1994), 101-107).
Das für die Amplifikation von winzigen DNA-Mengen aus wenigen Tumorzellen verwendete Protokol folgt im Wesentlichen dem von Telenius et al. beschriebenen Protokoll. Geringe Modifikationen werden durch Speicher et al., Hum. Mol. Genet. 2 (1993) 1907-1924 beschrieben, die hier unter Bezugnahme mitaufgenommen wird, als wäre sie hier vollständig offenbart. Unter Verwendung dieses Protokolls wurde eine erfolgreiche Amplifikation von so wenig wie 30 pg Template-DNA erreicht.
Lösungen: 10 &khgr; PCR-Puffer (Perkin-Elmer &Pgr;), 25 mM MgCl2, jeweils 5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP (gemeinsam dNTP), 17 &mgr;&Mgr; 6-MW-Primer (5' CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G3')
Vorgehensweise: 100 ng DNA (oder weniger), 5 &mgr;&idiagr; 10 &khgr; PCR-Puffer, 4 &mgr;&idiagr; 25mM MgCl2, 2 &mgr;&idiagr; 5mM dNTP, 5 &mgr;&idiagr; 6-MW-Primer 17 &mgr;&Mgr; (endgültige Konzentration 1,7 &mgr;&Mgr;, 0,5 &mgr;&idiagr; TACJ DNA-Polymerase (2,5 Einheiten) und ddH2O, um das Reaktionsvolumen auf 50 &mgr;&idiagr; zu vervollständigen, werden gemischt und PCR-Zyklen wie folgt unterworfen: 10 min bei 93°C, gefolgt von fünf Zyklen von einer Minute bei 940C, und 1,5 min bei 3O0C, 3 min- Übergang von 32-700C und 3min-Verlängerung bei 72°C, gefolgt von 35 Zyklen von einer Minunte bei 94°C, 1min bie 62°C und 3 min bei 720C, mit einem Zusatz von 1 sec/Zyklus beim Verlänegerungsschritt und einer abschließneden Verlängerung von 10 Minunten. Die PCR-Ergebnisse werden unter UV-Belichtung durch Ethidiumbromid angefärbtes 1,2% Agarosegel betrachtet. Die PCR-Produkte werden mit Ethanol präzipitiert, erneut in 50 &mgr;&idiagr; ddH2O gelöst und bis zur Verwendung bei 40C gelagert.
Markieren von Sonden unter Verwendung von DOP-PCR oder IRS-PCR
Lösungen: 10 &khgr; PCR-Puffer (Perkin-Elmer &Pgr;), 25 mM MgCl2, jeweils 2 mM dATP, dCTP, dGTP, und 1,5 mM dTTP (gemeinsam dNTP), geeignete Menge(n) an dem/n relevanten Primer/n, beispiels weise 100 &mgr;&Mgr; 6-MW-Primer für DOP-PCR und ImM markierte dUTP.
Vorgehensweise: 400- 600 ng DNA, 10 &mgr;&idiagr; 10 &khgr; PCR-Puffer, 8 &mgr;&idiagr; 25 mM MgCl2, 2&mgr;1 dNTP, 2-4 &mgr;&idiagr; Primer abhängig von dem/den verwendeten Primer(N), 2 &mgr;&idiagr; TAQ DNA-Polymerase (10 Einheiten), 5 &mgr;&idiagr; ImM markierter dUTP und ddH2O, um das Reaktionsvolumen auf 100 &mgr;&idiagr; zu vervollständigen, werden gemischt und 25 und ddH2O, um das Reaktionsvolumen auf 50 &mgr;&idiagr; zu vervollständigen, werden gemischt und PCR-Zyklen von einer Minute bei !940C, 1 min bei 56°C und 4 min bei 72°C und abschließender Verlängerung von 20 min unterworfen.
Die markierten PCR-Produkte werden mit Ethanol präzipitiert, erneut in 50 &mgr;&idiagr; ddtkO gelöst und bis zur Verwendung bei -2O0C gelagert.
Denaturierung der Sonde: verschiedene Mengen an Sonden-DNA werden abhängig vom Typ der Sonde verwendet. Die unten gegebenen Mengen werden für einen Hybridisierungsbereich von 18x18 mm2 verwendet. Vor der Denaturierung werden die Sonden in 10 &mgr;&idiagr; Hybridisierungslösung (siehe nachstehend) in den folgenden Konzentrationen erneut supendiert:
Zentromer-spezifische DNA-Sonden: 1-2 ng/&mgr;&idiagr;
Chromosomenanfärbungssonden: 20-40 ng/&mgr;&idiagr;
Locus-spezifische Sonden: Plasmid lOng/&mgr;&Igr;
Phage 20 ng/&mgr;&idiagr;
Kosmid 5-8 ng/&mgr;&idiagr;
YAC oder Zellhybride (Alu- 10 ng/&mgr;&idiagr;
PCR-Podukte
PCR-Podukte
Einfachkopie cDNA-Sonde lOng/&mgr;&Igr;
Genomes (CGH) 20-50 ng/&mgr;&idiagr;
Genomes (CGH) 20-50 ng/&mgr;&idiagr;
Die Sonden-DNA wurde in der Gegenwart der Träger-DNA und ebenfalls der Konkurrenz-DNA (beispielsweise menschlicher genomischer DNA), ills komplexe Sonden, wie Chromosomenanfarbungsmittel, verwendet werden. Die bevorzugte Träger-DNA war Lachssamenzellen-DNA bei einer endgültigen Konzentration (in der Hybridisierungslösung) von 100 ng/&mgr;&idiagr;. Die Sonden-DNA wurde in einer Geschwindigkeitsvakuumvorrichtung getrockent und erneut in 5 &mgr;&idiagr; Formamid bei Raumtemperatur auf einer Wirbelvorrichtung mit einem rohrträger suspendiert. Nach ungefähr 30 Minuten im Wirbelstrom werden 5 &mgr;&idiagr; 20 %igen Dextransulfats in 2 &khgr; SSC zugegeben. Die Sonden-DNA wurde nach 5 min bei 760C denaturiert und auf Eis abgeschreckt. Falls komplex Sonden(beispielsweise Chromosomenanfärbungssonden) hybridsiert werden, wird eine vorhergehender selbst härtnder Schritt bei 37°C für 30 Minuten eingeschlossen. Die DNA-Sonden bei CGH-Experimenten werden für 2 Stunden gehärtet.
Denatierung des Musters: Bei den meisten Anwendungen können Metaphasechromosomen für die Hybridisierung ohne jede zusätzliche Vorbehandlung verwendet werden. Bei manche Anwendungen und falls die Hintergrundsfluoreszenz hoch zu sein scheint, könnte ein Vorbehandlungsschritt helfen. Hier nachstehend wird ein Vorbehandlungsprotokoll beschrieben, das häufig verwendet wird, wenn die Hintergrundfluoreszenz hoch zu sein scheint.
Lösungen: 20 mg/&mgr;&idiagr; DNase freie RNase-A in ddH2O, 10% Pepsin in ddH2O und 50 ml IM MgCl2+950 ml Ix PBS (Ix PBS/ MgCl2)
Lösungen: 20 mg/&mgr;&idiagr; DNase freie RNase-A in ddH2O, 10% Pepsin in ddH2O und 50 ml IM MgCl2+950 ml Ix PBS (Ix PBS/ MgCl2)
Vorgehensweise: Die Objektträger werden in 2 &khgr; SSC bei Raumtemperatur ins
Gleichgewicht gebracht und wie folgt einer RNase-Behandlung gefolgt von Pepsin-Behandlung unterworfen. RNase wurde 1:200 verdünnt und 200 &mgr;&idiagr; werden auf die Objektträger aufgetragen, die danach mit 24 &khgr; 60 mm2 Bedeckungsabschnitten abgedeckt werden. Die Inkubation fand bei 37°C für 45-60 Minuten statt, nachdem die Abdeckungsabschnitte entfernt wurden und die 5 Objektträger für dreimal 5 Minuten in 2 &khgr; SSC bei Raumtemperatur gewaschen wurden. 50 &mgr;&idiagr; Pepsin werden zu 100ml auf 37°C vorgewärmter 0,01 M HCl (in einem Coplin-Gefäß) zugegeben. RNase behandelte Objektträger werden in der vorstehenden Pepsin-HCl-Lösung in dem Coplin-Gefäß für 5-10 Minuten bei 37°C inkubiert und danach werden die Objektträger für zweimal 5 Minuten in 1 &khgr; PBS bei Raumtemperatur mit Bewegung und einmal in Ix PBS/MgCl2 für 5 Minuten gewaschen. Auf die Pepsin-Behandlung folgend werden die Objektträger wie folgt in der Gegenwart von Formaldehyd fixiert. Eine frische Lösung von l%igen Formaldehyd in 1 &khgr; PBS/MgCl2 wurde durch Zugeben von 2,7 ml von 37%igen Formaldehyd zu 100ml PBS/MgCl2 vorbereitet. Die Objektträger werden in der Formaldehydlösung für zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Objektträger einemal 5Minuten in PBS bei Raumtemperatur unter Bewegung gewaschen. Die Objektträger werden jeweils in 70, 90 und 100% Ethanol für drei Minuten entwässert und luftgetrocknet.
Die Denaturierung des Musters ist kritischer als die Denaturierung der Sonden-DNA. Es müssen zwei Ziele erreicht werden: (1) die Sondendurchdringung sollte optimal mit einem minimalen Verlust an Mustermorphologie sein und (ii) einem minimalen Zeilsequenzverlust. Die optimale Denaturierung variiert zwischen unterschiedlichen Mustern, beispielsweise Metaphasechromosomen und Gewebeschnitten, und von Vorbereitung zu Vorbereitung. Tür eine optimale Leistung sollten die Bedingungen deshalb für jede Mustergruppe erforscht werden. Bei der nachstehenden Vorgehensweise sind die Durchschnittszeiten für Metaphasenchromosomen gegeben:
Lösungen: Denaturierungslösung: 70% Formamid, 2 &khgr; SSC ( bei -2O0C gelagert), Ethanolreihe (70%, 90% und 100%) in ddH2O.
Vorgehensweise: 120 &mgr;&idiagr; der Denaturierungslösung werden auf die Objektträger aufgebracht und sie werden mit 24 &khgr; 60 mm2 Bedeckungsabschnitten abgedeclrt. Die Objektträger werden danach für 2 Minuten (oder mehr abhängig von dem Muster) auf einer im Ofen auf 800C vorerhitzten Glassplatte angeordnet. Die Abdeckeckungsabschnitte werden Entfernt und die Objektträger werden durch eine Ethanolreihe (70%, 90%, und 100%) dehydriert und luftgetrocknet.
Die Hybridisierung findet bei 37°C statt. Gewisse Sonden erfordern jedoch höhere Hybridisierungstemperaturen. Dies trifft insbesondere auf wiederholende DNA-Sonden zu, um deren Chromosmenspezifität sicherzustellen (alternativ, kann die Schärfe durch Erniedrigen der Salzkonzentrationin den Hybridisierungslösung, beispielweise auf endgültigO,5 &khgr; SSC erhöht
• ·
werden). Da während der Hybridisierung die Abdeckungsabschnitte mit Kunststoffzement abgedichtet sind, ist eine Feuchtigkeitskammer nicht erforderlich. Eine Hybridisierungsdauer von 12 bis 16 Stunden ist für alle Loci-spezifischen Sonden, d. h. Kosmidsonden oder Phagen-Klone ausreichend. Die Chromosomenanfärbung wird ebenfals über Macht gemacht. Falls jedoch die Chromosomen unterschiedlicher Arten mit den menschlichen Sonden anzufärben sind, werden längere Hybridisierungszeiten ( und höhere Konzentrationen der Sonde) bevorzugt. Falls ganze Genome hybridisiert werden (beispielsweise CGH) wird die Hybridisierungszeit auf 2 bis 4 Tage verlängert.
Der Nachweis von Fluoreszenzsonden kann entweder unmittelbar oder mittelbar sein. Bei dem unmittelbaren Format werden die Sonden mit dUTP's markiert, die mit Fluorochromen (d.h. Fluorophoren) verbunden sind. Diese Sonden erfordern keine immunologischen Amplifikationsschritte. Die Signale können jedoch mit Fluorochrome-konjugierten Antikörpern unmittelbar gegen das Fluorochrom, das mit der dUTP, beispielsweise FITC-konjugierte Hasenanti-FITC, verbunden ist, verstärkt werden. Allgemein resultieren unmittelbar markierte in leicht verringerter Signalintensität, es ist jedoch ebenfalls die Hintergrungfluoreszenz niedriger. Viele Anfärbungssonden sind in dem unmittelbaren Fromat erhältlich und arbeiten sehr gut. Der unmittelbare Ansatz wird in Wiegant et al., Nucl. Acids Res. 19 (1991), 3237-3241 und Wiegant et al., Cytogenet. Cell genet. 63 (1993) 73-76 detailliert beschrieben, die beide unter Bezugnahme mitaufgenommen werden, als wären sie hier vollständig offenbart.
Das mittelbare Fromat setzt dUTP's ein, die mit Haptenen, wie Biotin, Digoxigenin, Dinitrophenol und ähnlichen verbunden sind. Die Sondensequenzen werden entweder durch an Fluorophore konjugiertes Avidin oder gegen Digoxigenin und Dinitrophenol gerichtete Antikörper sichtbar gemacht. Das Biotin- und Digoxigeninsystem sowohl in Bezug auf Empfindlichkeit und Flexibilitätsarbeiten hervorragend und sind die Verfahren der Wahl für viele Anwendungen. Ein routinemäßiger Doppelmarkierungsnachweis wird nachstehend beschrieben. Eine große Vielfalt an unterschiedlichen fluoreszierenden Nachweisformaten ist zum sichtbar machen der Biotin und Digoxigenin markierten Sonden erhältlich. Biotin und Digoxigenin markierte Sonden weisen den klaren Vorteil auf, das ein Amplifikationsschri tt leicht durchgeführt werden kann. Biotin markierte Sonden können unter Verwendung der Sandwichtechnik verstärkt werden, die durch Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 2934-2938 beschreiben wird, die hier unter Bezugnahme mitaufgenommen wird, als wäre sie hier vollständig offenbart. Digoxigenin markierte Sonden können entweder durch die Verwendung von mit an Fluorochrome gekoppelte Antikörpern gegen Digoxigenin oder über einen Mausantikörper gegen Digoxigenin, der darauffolgend unter Verwendung der Antikörper gegen Maus sichtbar gemacht wird, nachgewiesen werden. Avidin- (oder Streptavidin) Konjugate sind mit folgenden Fluorochromen im Handel erhältlich: AMCA, Kaskaden-Blau,
FITC, Texas-Rot, Rhodamin, TRITC, Cy3 und Cy5. Antiköper gegen Digoxigenin sind mit folgenden Fluorochromen im Handel erhältlich: Anti-dig-FITC (Fab-Fragmente), Anti-dig-Rhodamin (Fab-Fragmente), Maus-Anti-dig-IgG, Ziege-(Schaf)-Anti-Maus-FITC, Ziege-(Schaf) Anti-Maus-TRITC, Ziege-(Schaf)-Anti-Maus-Cy3 und Ziege-(Schaf)-Anti-Maus-Cy5.
Nachweis der Sonde und Siganlamplifkation: IM folgenden wird eine gechnliche Nachweis und Amplikationvorgehensweise für zwei, mit Biotin und Digoxigenin markierten Sonden beschrieben.
Nachweis der Sonde und Siganlamplifkation: IM folgenden wird eine gechnliche Nachweis und Amplikationvorgehensweise für zwei, mit Biotin und Digoxigenin markierten Sonden beschrieben.
Lösungen: Waschlösung I: 50% Formamid, 2 &khgr; SSC, pH 7,0, vorgewärmt auf 45°C, Waschlösung &Pgr;: 0,1 &khgr; SSC, auf 600C vorgewärmt, Waschlösung &Igr;&Pgr;: 4 &khgr; SSC, 0,05% Tween, auf 37°C vorgewärmt, Waschlösung IV. 2 &khgr; SSC, 0,025% Tween, auf 37°C vorgewärmt, Puffer I: 4 &khgr; SSC, 3% BSA, auf 37°C vorgewärmt, Pufer &Pgr;: 4 X SSC, 1% BSA, auf 37°C vorgewärmt, DAPI-Farbe: 50 ng/ml in 2 &khgr; SSC (für bis zu drei Wochen bei 4°C gelagert ) vor der Verwendung auf Raumtemperatur vorgewärmt. Antiausbleichlösung: 2,3% DABCO (w/v) (Sigma D2522) gelöst in einer Lösung, die aus 9:1 glycerin und 0,2 M Tris-Cl, pH 8,0 beim Erwärmen auf 7O0C besteht.
Vorgehensweise: Nach der Hybridsierung werden die Objektträger wie nachstehend beschrieben bearbeitet. Da es am wichtigsten ist, das die Objektträger zu keinen Zeitpunkt während des Nachweis und der Waschschritte trocknen, werden die Objektträger in einem Fließgefäß aufbewahrt, das eine Schicht an feuchten Papiertüchern in einem bedeckten Wasserbad enthält.Der Kunststoffzement wurde vorsichtig entfernt. Die Bedeckungsabschnitte wurde durch Bewegen der Objektträger in Waschlösung I entfernt. Die Objektträger wurden dreimal fünf Minuten in der Waschlösung I und dann dreimal fünf Mintuten in der Waschlösung &Pgr; under leichter Bewegung gewaschen. Danach werden die Objektträger in der Wasschlösung HI für eine Minunte und dann in Puffer I für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach werden die Objektträger kurz in Waschlösung &Igr;&Pgr; gewaschen.
Alle Nachweisschritte werden bei 37°C in (relativer) Dunkelheit durchgeführt. Eine Verdünnung von Avidin-FITC (1:400) in Puffer &Pgr; wurde vorbereitet und 120 &mgr;&idiagr; werden zu den Objektträgern zugegeben, die danach mit den 24 &khgr; 60 mm2 Bedeckungsabschnitten bedeckt werden. Die Objektträger werden bei 37°C für 30 Minuten in dunkler Umgebung und in einer feuchten Kammer inkubiert. Zur Entfernung der Abdeckungsabschnitte werden die Objektträger in ein Gefäß mit Puffer &Pgr; getaucht und danach dreimal fünf Minuten bei 37°C in Puffer &Igr;&Pgr; gewaschen. Währenddessen werden eine Verdünnung von biotinoliertem Anti-Avidin-Antikörper (l:200)und Maus-Anti-dig (1:500) in Puffer &Pgr; vorbereitet und 120 &mgr;\ von jedem werden zu den Objektträgern zugegeben, die mit dem Bedeckungsabschnitten wie beschrieben abgedeckt wurden. Die Objektträger wurden für 30 Minuten bei 37°Cin der Dunkelheit ii±ubiert und dann dreimal fünf Minuten bei 370C in Waschlöung &Igr;&Pgr; gewaschen. Unterdessen wurden eine Verdünnung von Avidin-FITC (1:400) und Ziege-Antimaus-Cy3 (1:400) vorbereitet und jeweils
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120 &mgr;&idiagr; werden zu den Objekträger gegeben, nachdem die Objektträger wie vorstehend behandelt werden. Wenn notwendig kann ebenfalls das Cy3-Signal durch Inkubieren der Objektträger mit einem an Cy3 konjugierten Antiziege-Antikörper verstärkt werden
Kontrastfärbung mit DAPI wurde für 5 Minunten in 2 &khgr; SSC durchgeführt. Propidiumiodid kann ein alternativer oder zusätzlicher DNA-Kontrastfärber sein, wenn das Signal nur mit FITC nachgewiesen wird, um gleichzeitg die Chromosomen und das Signal unter Verwendung eines unspezifischen FITC-Filters oder eines Doppelbandpassfilers für FITC und Rhodamin sichtbar zu machen.. Bei jeden Doppelmarkierungsexperiment, das Rhodamin, TRITC oder Cy3 verwendet, würde die Kontrastfärbung mit Propidiumiodid negativ mit dem Siganlnachweis aufgrnd der überlappenden Spektren interferieren.
Nach DAPI-Kontrastanfärbung werden die Objektträger einmal in 2 &khgr; SSC (2 Minuten, Raumtemperatur) gewaschen, es werden 35 /aI der Antiausbleichlösung aufgetragen und die Objektträger werden mit sauberen 24 &khgr; 60 mm2Abdeckungsabschnitt bedeckt, um die Bildung von Luftbalsen zu verhindern. Die Objektträger werden in der Dunkelheit bei 4°C gelagert, bis sie der spektralen Abbildung unterworfen werden.
Verbesserte fluoreszierende
in situ
Hvbridisierung CFISH) unter der Verwendimg von SpectraCube™, eines Linearkombinationalgorithmuses und eines Einteilungs-
Zuordnungsalgorithmuses
Spektrale Bio-Abbildung, die das SpectraCube™-System kombiniert mit der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet, vergrößert die Brauchbarkeit von FISH dadurch, dass der gleichzeitige Nachweis einer großen Anzahl von Sonden in einer einzigen Erfassung mit hoher Genauigkeit ermöglicht wird. Als Konsequenz werden die Wirksamkeit und die Verläßlichkeit des Nachweises von genetischen Anormalitäten durch FISH außerordentlich erhöht.
Wie vorstehend detailliert, beschrieben spielt fluoreszierende in situ Hybridisierung (FISH) eine zunehmend wichtige Rolle in machen Forschungs- und Diagnosebereichen. Seit ihrer ersten Einführung in den 70ern hat die FISH-Technik deutliche Fortschritte gemacht, wobei sie den Nachweis und die Identifizierung einzelner Gensequenzen, Chromosomensequenzenbereichen und sogar ganzer Chromosome (d.h Chromosomenanfärbung) ermöglicht. Die vielen Anwendungen von FISH erstrecken sich von der Früherkennung zu prenataler Diagnose, Aneusomie und andern, um genetische Krankheiten und Anormalitäten zu entdecken und danach zu behandeln.
Aufgrund der hohen Empfindlichkeit und Selektivität von FISH, die auf Hvbridisierung homologer Nucleinsäuresequenzen basiert, können sogar so kurze wie 1 kilobasen (kb) Sequenzen beobachtet werden (und dies wird sich wahrscheinlich mit der Zeit verbessern, um der Nachweis von so kurzen Sequenzen wie 15- 30 Basenpaaren zu ermöglichen und als
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Konsequenz von Punktmutationen). FISH kann sowohl bei Interphasen- als auch bei Metaphasenzellen und sogar bei ganzen Geweben angewendet werden, wobei ein breiter !Bereich von Anwendungen sowohl in dem Gebiet der Zytogenetik als auch in der Pathologie ermöglicht wird. FISH verbessert sich gemeinsam mit den Verbesserungen von DNA-Sonden, fluoreszierenden Farbstoffen (besonders durch die Einfrührung kombinatorischer Sonden), Fluoreszenzmikroskopie, Hochleistungs-CCD-Kameras und Abbildungstechniken.
Die Fähigkeit, mehrere Sonden gleichzeitig nachzuweisen, wurde schon in der Literatur gezeigt, um FISH zu einem effizienten diagnostischen Werkzeug zu machen. Die bestehenden Verfahren sind jedoch hinderlich und schwer zu verwenden. Wie hier nachstehend in Beispielen erläutert wird, wird der Nachweis von vielen Sonden durch das SpectraCube™-Sysitem in Kombination mit passenden Algorithmen aufgrund seiner spektraler Auflösung und Empfindlichkeit außerordentlich verbessert. Um diese Fähigkeit zu veranschaulichen, wird der Leser auf die Figuren 5a-c verwiesen, die ein Beispiel einer Interphasen-FISH-Erfassung einschließen, die mit Chromosom 1 und Chromosom 17 spezifischen DNA-Sonden durchgeführt wird, die mit den entsprechenden Fluorophoren Texas-Rot und Rhodamin markiert sind, deren Fluoreszenzspektren sich sehr ähneln. Die Chromosom-1-Sonde war eine Mittelsatellit-Sonde für den subtelomerischen Bereich des Chromosoms und war mit Texas-Rot markiert, das mit der DNA-Sonde über Posthybridisierung mit Biotin verbunden ist. Die Chromosom-17-Sonde war eine a-Satellit-Sonde für den zentromerischen Chromosomenbereich und war mit Rhodamin markiert, das über Posthybridisierung mit Digoxigenin mit einer zweiten DNA-Sonde verbunden ist.Figur 5a zeigt die ursprüngliche Abbildung, wie sie durch das Mikroskop für das Auge aussieht, Figur 5b zeigt die gleiche Probe, nach dem sie durch das SpectraCube™-System erfasst und verarbeitet wurde und Figur 5 c zeigt die Fluoreszenzspektren des Texas-Rot-Fluorophors (mit T gekennzeichnet) und des Rhodaminfluorophors (mit R gekennzeichnet).
Wie in Figure 5c gesehen wird unterscheiden sich die Peaks von Texas-Rot und Rhodamin nur um 15 nm und deshalb wäre es sehr schwierig, zwischen ihnen bei der Verwendung eines auf Filtern basierenden System zu unterscheiden.
Durch ein Mikroskop, wie in Figur 5 a gezeigt, auf eine farbige FISH-Abbildung schauend ist das Konfidenzniveau zum Erkennen der genauen Anzahl an Punkten (gekennzeichnet 1-4) und der in der Abbildung erscheinenden Sondentypen nicht besonders hoch. Wie in Figur 5b gezeigt, ist andererseits das SpectraCube™-System, das den Vorteil des von jeden Pixel erfaßten Spektrum nutzt, fähig, aufgrund der kleinen spektralen Differenz zwischen ihnen sowohl das Vorhandensein der Punkte zu bestätigen, sie exakt zu zählen als auch zwischen Paaren mit einem hohen Konfidenzniveau zu unterscheiden. Durch wie in Figur 5c gezeigtes, künstliches Färben mit Texas-Rot- und Rhodaminfiuoreszenz kann die Lokation der Sonden spezifischen Fluoreszenz mit hoher Genauigkeit bestimmt werden, wobei die Punkte 1 und 2 von Texas-Rot und die Punkte 3 und 4 von Rhodamin stammen.
Die Figuren 6a-b sind ein Beispiel von FISH-Erfassung nach Hybridisierung einer Kern-DNA in der Interphase mit sechs verschiedenen Sonden. Figur 6a zeigt die ursprüngliche Abbildung. Figur 6b zeigt die SpectraCube™-Erfassung, spektrale Verarbeitung und künstliches, farbiges Anzeigen von allen der nachgewiesenen Paare und Figur 6c zeigt die Spektren der sechs Chromophore nach der Hybridisierung (gemäß der Chromosomen gekennzeichnet, wobei jedes davon die Markierung trägt: 1, 8, 10, 11, 17 und X), wie sie durch einen dichroitischen Dreifachfilter unter Verwendung des SpectraCube™-Systems nachgewiesen werden. (Für Details bezüglich der Fluorophoren, Sonden und Chromosomen wird der Leser auf die folgende Beschreibung, die nachstehende Tabelle 2 und auf Chroma Corp. Cat. No. 61502 verwiesen).
Es ist aus Figur 6a, die die ursprüngliche RGB-Abbildung des Interphasenzellkems zeigt, ersichtlich, dass es schwer ist, die Farben untereinander durch das Auge oder sogar durch die Verwendung einer einfachen farbigen RGB-Erfassung zu unterscheiden. Ein erfahrener Betrachter kann im besten Fall drei der sechs Farben nachweisen. Figur 6b zeigt jedoch die gleiche wie in Figur 6a gezeigte Probe nach der Verarbeitung der spektralen Daten mit Eigen-Einteilungsalgorithmen für Hintergrundsubtraktion und Einteilung (siehe vorstehende Details) und die resultierenden Punkte wurden mit künstlichen Farben wie folgt hervorgehoben: braun-Bl, cyan-C, blau-B2, gelb (yellow)-Y, grün-G und rot-R, während dem Hintergrund eine künstliche Farbe scharz (black)-B3 zugeordnet wurde. Wie beobachtet, ist es möglich, alle sechs Fluorophorenpaare zu sehen und die Paare leicht zu unterscheiden.
Es wird weiter festgestellt, dass ein Paar, das in blau (B2) hervorgehoben ist, kaum von Auge oder durch die Verwendung einer Farbkamera erkannt werden kann. Es wird jedoch nach Anlegen eines Hintergrundsubstraktionsalgorithmus an den spektralen Würfel nachgewiesen (vergleiche Figur 6a mit 6b).
Die verwendeten Sonden waren fünf oSatellit-Sonden für die zentromerischen Chromosomenbereiche 8, 10, 11, 17 und X und eine Mittelsatellit-Sonde :Eür den subtlomerischen Chromosomenbereich 1. Die Fluorophore, die verwendet werden, um jedes der vorstehenden Chromosomezu markieren, und den DAPI-Kontrastfärber (Hintergrund), ihre Emissionspeaks und künstliche angezeigten Farbeinteilungen werden in Talbelle 2 zusammengefaßt.
Von den normierten, spektralen Signaturen von jedem der sechs in Figur 6c gezeigten Fluorophore ist es klar, dass ein auf Filtern basierendes System, das bei wenigen, relativ weiten Spektralbereichen erfaßt, nicht in der Lage ist, wegen der großen Überlappung der Spectren zuverläßlich zwischen den verschiedenen Sondenarten zu unterscheiden. Ein derartiges System ist von einer absoluten Intensitätserfassung jeder Sonde abhängiger und wird deshalb durch Hintergrundsignale und Rauschen mehr betroffen. Es sollte weiter festgestellt werden, dass spektrales Überlappen manchmal ebenfalls mit von der Zelle selbst stammenden Auto fluoreszenz auftritt. Auch in diesem Fall ermöglicht die Zugänglichkeit der spektralen
Information für jedes Pixel das Beseitigen des Autofluoreszenzbeitrages und bringt genauere Ergebnisse.
| Chromosom | Fluorophor | Emissionspeak | angezeigte Farbe |
| 8 | SpektrumOrange TMl |
588nm | braun (Bl) |
| 10 | SpektrumGreenT Ml |
538nm | cyan (C) |
| X | Aqua1 | 480nm | blau (B2) |
| 1 | Texas-Rot2 | 615nm | gelb (yellow,Y) |
| 17 | FITC3 | 525nm | grün (G) |
| 11 | Texas- Rot2+FITC3 |
615, 525nm | rot (Rl) |
| Hintergrund | DAPI4 | schwarz (Black, B3) |
erhalten als markierte Deoxynuleotide von Vysis, Downers Grove, EL, U.S.,
2 verbunden über Anti-Digoxigeninantikörper an vorhybridisiertes, Sonden enthaltendes Digoxigenin,
Fluorescein-5-isothiocyanat, verbunden über Anti-Biotinantikörper an vorhybridisiertes, Sonden enthaltendes Biotin,
4',6- Diamino-2-phenylindol, das zur Kontrastfärbung verwendet wird.
Das volle Spektrum jedes Punkts auf der Abbildung erfaßt zu haben, kann ebenfalls helfen, die spezifischen Sondenprobleme zu überwinden. In einigen Fällen weist eine Sonde, die zu einer gewissen DNA-Sequenz paßt, tatsächlich eine geringe Spezifizität zu einer anderen (gewöhnlich ähnlichen) Sequenz auf und hybridisiert mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit ebenfalls mit der zweiten Sequenz. Dies führt zu der falschen Erscheinung von zu vielen Sonden eines gewissen Typs. Das Fluoreszenzspektrum ist jedoch in dem zweiten Fall sehr leicht in Bezug aus das erste aufgrund einer kleinen Änderung in der chemischen Umgebung der Sonde verschoben. Das SpectraCube™-System kann dank seiner spektralen Auflösung und Empfindlichkeit dieses Artefakt beseitigen. Ein ähnliches Artefakt besteht für Sonden, die während der Probenvorbereitung nicht ausgewaschen werden und zur falschen positiven Diagnose beitragen. Das SpectraCube™-System kombiniert mit der Vorrichtung der vorliehenden Erfindung hilft deshalb bei der Veringerung des Risikos von falschen Diagnosen.
Auf eine große Anzahl oder ähnliche Farbstoffe verallgemeinernd zeigen die Beispiele der Figuren 5a-b und 6a-c, dass es möglich ist, eine große Anzahl von Sonden nachzuweisen und zu unterscheiden und vorausgesetzt, dass es kleine spektrale Differenzen zwischen ihnen gibt, wird das SpectraCube™-System sie in einer Erfassung nachweisen und identifizieren. Für den Fachmann ist es klar, dass andere und/oder zusätzliche bekannt und bislang noch zu entdeckende oder zu entwickelnde Fluorophore und Fluorophorkombinationen bei unterschiedlichen, wie vorstehend detailliert geschilderten FISH-Anwendungen verwenden werden können, um eine große Anzahl von Loci gleichzeitig nachzuweisen, jedes Chromosom eines Karyotypen in einer unterscheidbaren Farbe anzufärben etc. Eine Liste von in der Zeil- und Molekularbiologie als Stand der Technik verwendeten Fluorophoren kann bei Kasten, Introduction to fluorescent probes: Properties history and applcations, in Fluorescent and luminescent probes for biological research, Mason Ed. Academic Press Limited, London (1993), 24-31 gefunden werden. Für den Fachmann ist es ebenfalls klar, dass andere Markierungstechniken, wie beispielsweise Biolumineszenz und Chemolumineszenz und ebenfalls nicht fluoreszierende Markierungsstrategien ähnlich angewendet werden können.
Damit erfreut sich die Verwendung des SpectraCube™-Systems für FISH-Analysen eines großen Vorteil, wie folgt. Das SpectraCube™-System ermöglicht aufgrund seiner hohen, spektralen Auflösung den gleichzeitigen Nachweis von zahlreichen Sonden, während die Verwendung herkömmlicher Mittel, um FISH durchzuführen (beispielsweise die Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops) die Anzahl der Sonden, die in einer einzigen Hybridisierung verwendet werden sollte, auf zwei bis vier Sonden begrenzt. Deshalb spart das Einsetzten des SpectraCube™-Systems für FISH-Analysen Aufwand und Zeit. Weiterhin wird bei dem Einsetzen des SpectraCube™-Systems für FISH-Analysen eine kleinere Zellenanzahl für eine vollständige Analyse erfordert, was eine wichtige Eigenschaft bei den Fällen ist, bei denen die Anzahl der zu untersuchenden Zellen begrenzt ist.
Gleichzeitige Visualisierung aller menschlicher Chromosomen in verschiedenen Farben unter der Verwendung von fluoreszierender in situ Hvbridisierung und spektralen Bio-Abbilden Die Entstehung der mehrfarbigen FISH hat die Anwendungen der molekularen Zellgenetik in Grundlagenforschung und genetischer Diagnose erweitert. Alle existierenden mehrfarbigen FISH-Techniken erfordern die Verwendung fluoreszierender Sonden, deren Emissionspektren mit optischen Filtern getrennt werden können. [Ried et al., Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging spectroscopy, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 1388-1392; und Ried, Fluoreszenz m-sziw-Hybridsierung in der genetischen Diagnostik, Fakultät für theoretische Medizin, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg (Jan. 1994), beide werden hier unter Bezugnahme
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mitaufgenommen, als wären sie hier vollständig offenbart]. Diese Anforderung beschränkt die Anzahl an Farbstoffen, die in einer gegebenen Probe unterschieden werden können. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Ansatz für FISH bereitgestellt,der das SpectraCube ™ und das Verahren der vorliegenden Erfindung zum Erfassen und Analysieren mehrerer, spektral überlappender, markierter Sonden (einfach und kombinatorisch) einsetzt. Bei diesem !Beispiel wird spektrale Bio-Abbildung, die, wie vorstehend gezeigt, eine Kombination der Fourier-Spektroskopie, der CCD-Abbildung und optischer Mikroskopie ist, die die Erfassung von definitiven, spektralen Daten gleichzeitig bei allen Punkten einer biologischen Probe ermöglicht, verwendet, um auf Hybridisierung basierende, mehrfarbige Banden aller (d.h. 24) Typen menschlicher Chromosomen sichtbar zu machen und eine Farbzuordnung des menschlichen Karyotyps zu erzeugen.
Folglich wurden 24 Chromosomenanfärbungsmittel (1 bis 22, X und Y, Tabelle 4), wobei jeder mit einer unterschiedlichen Kombination von fünf oder weniger unterschiedlichen Fluorophoren gemäß des kombinatorischen Hybridisierungsansatzes markiert ist (a bis e, Tabelle 3), (siehe Tabelle 3 für die unterschiedlichen Fluorophore und ihre spekralen Kennzeichen und Tabelle 4 für die Zuweisung der, in Tafel 3 aufgeführten Fluorophore zum Erzielen der 24 Chromosomenanfärbungsmittel) gleichzeitig mit menschlichen mitotischen Chromosomenspreizungen von zwei, nicht verwandten,männlichen, Erythrozyten hybridisiert, die im Wesentlichen wie in Ried et al. beschrieben [Ried et al., Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging spectroscopy, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 1388-1392] für eine Hybridisierung vorbereitet waren. Hybridisierte Chromosomen wurden durch ein invertiertes, mit dem SpectraCube™ System verbundenes Fluoreszenz-Mikroskop betrachtet und wurden analysiert.
| Fluorophor | Symbol | Anregung (mn) |
| FITC | a | 475-495 |
| Cy2™l | b | 475-495 |
| Cy3™l | C | 540-570 |
| Texas-Rot | d | 540-570 |
| Cy5™l | e | 630-670 |
1 von Amersham
| Chromosom | Chromosomenanfärbungs | Fluorophore |
| mittel | 1 | b, c, d | Menschliches Chromosom 6 |
6 | a,b,d, | Menschliches Chromosom 11 |
11 | c,d | Menschliches Chromosom 16 |
16 | a,d | |
| Menschliches Chromosom 1 |
2 | a,d,e | Menschliches Chromosom 7 |
7 | b,c, e | Menschliches Chromosom 12 |
12 | be | ||||
| Menschliches Chromosom 2 |
3 | a, c, e, | Menschliches Chromosom 8 |
8 | a,b, c | Menschliches Chromosom 13 |
13 | b,d | ||||
| Menschliches Chromosom 3 |
4 | a,c, d | Menschliches Chromosom 9 |
9 | d,e | Menschliches Chromosom 14 |
14 | b,c | ||||
| Menschliches Chromosom 4 |
5 | a, b, e | Menschliches Chromosom 10 |
10 | c,e | Menschliches Chromosom 15 |
15 | a, e | ||||
| Menschliches Chromosom 5 |
| Menschliches Chromosom 17 |
17 | a,c | Menschliches Chromosom 21 |
21 | C |
| Menschliches Chromosom 18 |
18 | a,b | Menschliches Chromosom 22 |
22 | b |
| Menschliches Chromosom 19 |
19 | e | Menschliches Chromosom X |
X | c, d, e |
| Menschliches Chromosom 20 |
20 | d | Menschliches Chromosom Y |
Y | a |
Nun mit Bezug auf die Figuren 7a-e, 8a-b und 9a-b zeigen die Figuren 7a-e normierte Spektren von 24 einzelnen Pixeln, wobei jeder einem unterschiedlichen Typ eines menschlichen Chromosoms (1-22, X und Y) entspricht. Die Zahlen 1 bis 22 und die Buchstaben X und Y beziehen sich auf den Chromosomentyp, von dem jedes der dargestellten Spektren abgeleitet wird. Es ist zu festzustellen, dass das von jedem der 24 menschlichen Chromsomen erhaltene, wie in den Figuren 7a-e gezeigte Spektrum sich von allen andern Spektren unterscheidet. Diese Differnz kann groß (vergleiche beispielsweise den Ca. 530 nm-Emissionspeak von Chromosom 15 und 11 in Figur 7c) oder klein (vergleiche beispielsweise den Ca. 530 nm-Emissionspeak von Chromosom 22 und Y in Figur 7e) sein und kann in einigen spektralen Bereichen sogar verschwinden (vergleiche beispielsweise den Ca. 680 nm-Emissionspeak von Chromosom 22 und Y in Figur 7e). Trotzdem kann, wie in den Figuren 7a-e weiterhin gezeigt wird, selbst eine winzige Differenz zwischen sehr ähnlichen Spektren unter der Verwendung des SpectraCube™-Systems und der erfindungsgemäßen Vorrichtung nachgewiesen werden. Es ist jedoch aus der Beschreibung klar, dass die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung, Differenzen :swischen Spektren nachzuweisen, bislang zu einem großen Ausmaß von passenden Fluorophoren und ausgewählten Fluorophorkombinationen abhängt, wie für den Fachmann und selbst den Experten klar ist, wobei die hier nachgewiesene Fähigkeit weit über den Stand der Technik der zytogenetischen Technik hinausgeht.
Figur 8a zeigt eine RGB-Abbildung von damit beschrieben, angefärbten menschlichen
• *
Chromosomen, während Figur 8b einen farbigen, menschlichen, von den angefärbten Chromosomen in Figur 8a abgeleiteten Karyotypen zeigt. Da es nicht möglich ist, 24 verschiedene Farben mit Worten zu beschreiben, werden ebenfalls die farbigen Figuren 9a und 9b beigelegt, die ansonsten zu den entsprechenden Schwarz/Weiß-Figuren 8a und 8b identisch sind. Es ist festzustellen, dass jedes der Chromosomenpaare in einer andern Farbe angefärbt ist und dass der farbige Karyotyp (Figur 9b) direkt von der Farbabbilung (9a) abgeleitet ist.
Der verwendete Algorithmus, um die Abbildung von Figur 8a und 9a zu erhalten, war ein wie vorstehend beschriebener und in Figur 4 mit Beispielen erläuterter RGB-Algorithmus, bei dem R = 640-740 nm, G = 550-640 nm und B = 530-550 nm gilt. Um jedoch eine einheitlichere Abbildung in Bezug auf Intensitäten zu erhalten, wird eine spezielle Modifikation der erhaltenen RGB-Werte durchgeführt. Diese Modifikation, die in der Farbabbildungs-Technik als „IContast-Strecken" bekannt ist [siehe beispielsweise ENVI™ User's guide, The enviroment for visualizing images, BSC limited Liability Company, Version 1(1. July 1994), schließt ein (a) Bestimmen der Verteilung von jedem der RGB-Werte, (b) Definieren einer Nachschlagetabelle zum Maximieren der Differenzen zwischen den Intensitäten innerhalb der bestimmten Verteilung und (c) Anzeigen der modifizierten RGB-Abbildung, die nun eine maximale Farbvielfalt für jedes ursprüngliche, unterschiedliche Spektrum aufweist. Diese einfache Modifikation der ursprünglichen RGB-Abbildung ist eigentlich eine begrenzte Version eines wie vorstehend beschriebenen Einteilungsalgorithmuses.
Nun mit Bezug auf die Figuren 10a-d und lla-d zeigt die Figur 10a eine RGB-Abbildung von angefärbten menschlichen Chromosomen eines andern Individuums, wohingegen Figur 10b einen farbigen, menschlichen Karyotyp zeigt, der von dem angefärbten Chromosom von Figur 10a abgeleitet wird. Die Figuren 10c und 1Od zeigen einen Einteilungszuordnung der angefärbten menschlichen Chromosomen und des jeweiligen, abgeleiteten Karyotyps der Figuren 10a und 10b. Da es sehr schwierig ist, 48 unterschiedliche Farben und Schattierungen mit Worten zu beschreiben, werden ebenfalls die farbigen Figuren lla-d, die ansonsten mit den entsprechenden Schwarz/Weiß-Figuren 10a-d identisch sind, beiglegt. Es ist festzustellen, dass jedes der Chromosomenpaare in einer unterschedlichen Farbe angefärbt ist und dass die farbigen Karyotypen leicht von den Farbabbildung, sowohl für RGB- als auch für Einteilungungszuordnungsalgorithmen abgeleitet werden.
Bei diesem Beispiel wird die Verwendung von 24 unterschiedlichen einzelnen und kombinatorischen Sonden, die aus fünf, unterschiedlichen, gemäß dem kombinatorischen Hybridisierungsansatz vorbereiteten Basis-Fluorophoren (a bis e, Tabelle 3) kombiniert sind, für eine menschliche, farbige Chromosomenkaryotypisierung gezeigt. Trotzdem weisen andere Arten eine größere Chromosomenanzahl auf, die vielleicht die Verwendung von komplizierteren, kombinatorischen Sonden erfordern, die aus mehr Basis-Fluorphoren kombiniert sind. Es sollte festgestellt werden, dass Chromosomen, einschließlich menschlicher Chromosomen, bislang
ebenfalls in Größengruppen eingeteilt werden können, die bei manchen Anwendungen den Bedarf nach so vielen unterschiedlichen Farben minimieren, da zu einer Größengruppe gehörende Chromosomen, die ähnlich angefärbt sein können, nun leicht gemäß ihrer relativen Größe erkannt werden können. Für den Fachmann ist es jedoch klar, dass andere Algorithmen gleichwertig oder besser zu dem Zweck des Anzeigens ähnlicher Abbildungen paasen können.
Wie hier vorstehend detailliert erklärt und erläutert kann ebenfalls eine Hauptkomponentenanalyse als passend befunden werden, wobei jeder sinnvollen Komponente oder Kombination davon eine unterschiedliche, bestimmte, künstlliche Farbe zugesclirieben wird. Bislang könnnen zusätzliche Algorithmen, die zum Unterscheiden ähnlicher Spektien und zum Zuschreiben einer bestimmten, künstlichen Farbe (oder Pseudofarbe) zu Pixeln mit einem unterschiedlichen Spektrum fähig sind, ebenfalls als passend für farbige Karyotypisierung gemäß der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung befunden werden.
Nachweis mehrerer Chromosomentranslokationen in Brustkrebszellen
Wie vorgeführt, kann die erfindungsgemäße Vorrichtung einen vollständigen farbigen Karyotypen normaler Blutzellen bereitstellen. In vielen Fällen wird herkömmliches Karyotypisieren (beispielsweise unter Verwendung von G-Bandenfärbungs- oder R-Bandenfärbungstechniken) verwendet, um chromosomale Abweichungen, wie mit genetischen Fehlern assoziierte Translokationen (beispielsweise 21q22-Trisomie beim Down-Syndrom, Trisomie des Chromosomes 18 (oder eines Fragments davon) und Trisomie des Chromosoms 13 (oder eines Fragments davon)) oder Bösartigkeiten (beispielsweise eine Translokation zwischen den distalen Enden der Chromosomen 9 und 22 in Leukozyten von Patienten mit chronischer, myeloische Leukämie und eine Translokation der Chromosomen 8 und 14 in Lymphozyten bei Patienten mit Burkitt's Lymphknotenschwellung). Bei diesem Beispiel werden die Fähigkeiten des SpectraCube™-Systems kombiniert mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgeführt, um mehrere Chromosomentranslokationen in Brustkrebszellen nachzuweisen.
Nun werden mit Bezug auf die Figuren 12a-e, 13a-e, 14 und 15 Chromosomenspreizungen von Brustkrebszellen mit den 24 Chromosomen-Anfärbungsmitteln (1 bis 22, X und Y) hybridisiert, wie in den Figuren 3 und 4 detailliert beschrieben ist, und spektral abgebildet, wie unter dem vorstehenden Beispiel 2 detailliert beschrieben ist. Die Figuren 12a, 13 a, 12c und 12 dzeigen DAPI-R-B andenfärbung von zwei Chromosomenspreizungen, wie sie unter Verwendung eines herkömmlichen Fluoreszenzmikroskops (12a und 13a) photographiert und wie sie unter Verwendung des SpectraCube™-Systems mit einem DAPI-Filter (d.h. DAPI-Bandpassfilterwürfel) (12c 13c) abgebildet werden. Es ist klar, dass, obwohl der resultierende Karyotyp, wie in diesen Figuren
veranschaulicht, zu einem großen Ausmaß anormal ist und es unmöglich ist, spezifische Chromosomentranslokationen zu identifizieren. Die Figuren 12, 13b, 12d und 13d zeigen (entsprechend in Schwarz/Weiß und Farbe) RGB-Abbildungen der gleichen Spreizungen wie sie unter Verwendung des SpectraCube™-Systems und der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhalten werden. Beim Vergleich mit den Figuren 9a-b, die einen normalen menschlichen Karyotypen zeigen, der anderseits unter identischen experimentellen Bedingungen abgeleitet wird, ist es offensichtlich, dass viele der in den Figuren 12b und 13b gezeigten Chromosomen enthaltende Abweichungen Teile von verschiedenen normalen, menschlichen Chromosomen enthalten. Die umgelagerten Chromosomen (rechts) der Figuren 12b und 13b werden entlang der R-Bandenangefärbten Chromosomen (links in den Figuren 14 und 15 gezeigt. Es ist festzustellen, dass manche der umgelagerten, in den Figuren 14 und 15 gezeigten Chromosomen Fragmente einschließen, die von zwei, drei und sogar vier verschiedenen Chromosomen stammen. Es ist weiterhin festzustellen, dass große Flächen chromosomalen Materials mit dem Chromosom-8-Färber angefärbt sind, was eine erhöhte Kopienanzahl dieses Chromosoms nahelegt.
Nun mit Bezug auf die Figuren 12e und 13e werden erhöhte Kopiennzahlen für Chromosom 8q unter der Verwendung der vergleichenden, genomischen Hybridisierung (CGH) mit aus dieser Zelllinie (oberer Teil der Figuren) extrahierterDNA bestätigt [siehe, A. Kallioniemi et al., Science 258 (1992), 818 und du-Manoir et al., Detection of complete and partial chromosme gains and losses by comparative genomic in situ hybridization, Hum. Genet.
90 (1993) 590-610]. ZweifarbigeFISH mit einer anfärbenden Sonde für Chromosom 8 ( in blau) und einer Kosmidsonde für das c-myc-Onkogen (in rot) bestätigt ebenfalls die Struktur des Marker-Chromosomoms (unterer Teil der Figuren). Es ist bitte die diskrete Exkursion des Profil bei Chromosomenband 8q24 der Zuordnungsstellung des c-myc-Onkogenes festzustellen.
Da spezifische Chromosomentranslokationen und andere chromosomale Abweichungen (beispeilsweise Gen-Amplifikation) bis vor kurzem mit frühen oder zustandsspezifischen Bösartigkeiten assoziiert wurden und da die erfindungsgemäße Vorrichtung die Fähigkeit, derartige Translokationen und Abweichungen nachzuweisen und zu kennzeichnen, enorm steigert, wird die Fähigkeit der Früherkennung und der Stadieneinteilung von Bösartigkeiten bei Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung profitieren. Weiterhin wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermöglichen, bislang neue chromosomenspezifische Abweichungen (beispielsweise Translokationen) festzustellen, die wiederkehrend mit spezifischen Bösartigkeiten assoziiert werden und möglicherweise einen umfassenden Umgang für derartige Translokationen bereitzustellen. Zusätzlich können derartige wiederkehrende Abweichungen zu der Isolation von Genen führen, die durch aktiviert oder inaktiviert sein mit den bösartigen Prozessen assoziiert werden.
In diesem Zusammenhang ist es wichtig festzustellen, dass die bei diesem und in dem vorherigen Beispiel 2 (wie in Tabelle 3 aufgelistet und in den Figuren 7a-c) eingesetzten
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Fluorophore gemeinsam in dem 480-730 nm-Bereich emittieren. Damit kann DAPI gleichzeitig für Kontrastfärbung verwendet werden, da ihre Emission im blauen, deutlich unterhalb dieses Spektralbereichs, ist. Damit ist es möglich, wie in den Figuren 12a-b, 13a-b, 14 und 15 gezeigt, die genau gleichen Chromosomenausbreitungen unter Verwendung des herkömmlichen, monochromatischen R-Bandenfärbung-Ansatzes und des erfindungsgemäßen Mehrfarben-Ansatzes gleichzeitig zu beobachten. Es ist klar, dass das SpectraCube™-System dazu fähig ist, eine herkömmliche DAPI-R-Bandenfärbungsabbildung durch Begrenzen des untersuchten spektralen Bereich auf blau bereitzustellen. Damit kann, zu Vergleichszwecken, eine einzelne Chromosmenspreizungen unter Verwendung des SpectraCube™-Systems und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung sowohl als DAPI R-Banden-angefärbten Karyotyps als auch als farbiger Karyotyp betrachtet werden. Somit kann der DAPI R-Banden-angefarbten Karyotyp zusätzliche Information bereitstellen und sehr genau die Region(en) (d.h. Banden) jedes spezifischen, in einem spezifisches Translokationereignis eingeschlossenen Chromosoms aufzeigen, wenn Chromosomentranslokationsereignisse mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung untersucht werden.
Das Potential von spektralen Karyotpyping als ein Überprüfungsverfahren für chromosomale Abweichungen
Das Potential der spektralen Karyotypisierung als Überprüfungsverfahren für chromosomale Abweichungen wurde durch Analysieren fünf klinischer, durch unterschiedliche Laboratorien bereitgestellte Proben erforscht. Alle Proben wurden vorher durch herkömmliche Bandenfärbungsverfahren und/oder herkömmliche FISH mit einer oder weinigen individuellen Chromosomenanfärbungssonde/n untersucht. Spektrales Karyotypisieren wurde ohne vorheriges Wissen chromosomaler Abweichungen durchgeführt. In allen Fällen zeigten G-Bandenfärbung und spektrale Karyotypisierung übereinstimmende Ergebnisse. Beispiele werden in den Figuren 16a-b (Schwarz/Weiß) und 17a-b (Farbe) dargstellt. In manchen Fällen war Giemsa-Bandenfärbung nicht ausreichend, um chromosomale Abweichungen vollständig zu interpretieren. In diesen Fällen wurde die Diagnose chromosomaler Abweichungen durch spektrales Karyotying unter Verwendung herkömmlicher zweifarbiger FISH-Analyse bestätigt.
Nun mit Bezug auf die Figuren 16a und 17a war die kleinste, analysierte Abweichung eine Translokation t(l;ll)(q44;pl5.3). Die Chromosomen wurden aus dem peripheren Blutlymphozyten eines Vaters eines Kindes mit geistiger Zurückgenbliebenheit vorbereitet. Das Fragment, das zu Chromosom 1 umgelagert wurde, konnte als Chromosom-11 -Material identifiziert werden (wie durch einen Pfeil angezeigt). Diese Translokation war wechselseitig, weil ein kleines Fragment, das Chromosoml entspricht, am dem kurzen Arm von Chromosom 11 nachgewiesen wurde. Der Insert zeigt das Ergebnis einer Einteilung auf spektraler Basis des
umgelagerten Chromosoms, wobei Chromosom-1-Material in gelb und Chromosom-11-Material in blau künstlich angefärbt ist. Die Translokationssegmente auf den Chromosomen 1 und 11 werden unter Verwendung Sub-Telomerer-spezifischer Kosmidsonden für die Chromosomen Iq und 1 Ip (nicht gezeigt) bestätigt.
Nun mit Bezug auf die Figuren 16b und 17b legte in einem anderen Fall G-Bandenfärbunganalyse eine Translokation eines Segments von Chromosom 4 zu Chromosom 12. Spektrale Karyotypisierung identifizierte unzweideutig den Ursprung des zusätzlichen Chromosomenmaterial als abgeleitet von Chromosm 4. Die oberen Reihen von Figur 16b und 17b zeigen eine RGB-Abbildung der Translokationschromosomen von einer Metaphasespreizung nach erfindungsgemäßer spektraler Karyotypisierung (rechts) und die resultierende, künstliche Farbabbildung nach dem Anlegen eines Einteilungs-Zuordnungsalgorithmus (links). Die unteren Reihen der Figuren 16b und 17b zeigen eine G-Bandenfärbungsanalyse (Insert) und herkömmliche zweifarbiger FISH mit anfäbenden Sonden für Chromosom 4 (grün) und 12 (rot), die die aus dem Gleichgewicht gebrachte, durch die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung gezeigte Translokation bestätigen.
Andere nicht illustriert dargestellte Fälle schließen ein (i) die Diagnose einer Translokation (t(8;13)(q244.1;q34), die Diagnose eines Klinefelter-Syndroms (Karyotyp 47, XXY) und (iii) die Identifizierung von zusätzlichen Material, das auf einem vorher unidentifizierten Marker-Chromosom vorhanden war, wobei gezeigt wird, dass Xp+ von dem X-Chromosom nach spektralen Karyotypisieren herzuleiten ist.
Die Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung für vergleichende Zytogenetik
Zusätzlich zu diagnostischen Anwendungen in klinischer Zytogenetik und Krebszytogenetik, wie in den vorstehenden Beispielen 3 und 4 beschrieben, ist spektrales Karyotyping gemäß der Vorrichtung der vorliegenden Verbindung ein vielseitiges Forschungswerkzeug für vergleichende Zytogenetik [siehe, J. Weinberg und R. Stanyon, Current opinion in genetics and development 5 (1995), 792-797]. Umlagerungen, die Chroosomenmorphologie während der Evolution änderten, können leicht sichtbar gemacht werden. Beispielsweise nun mit Bezug auf die Figuren 18 und 19 ist es möglich unter Verwendung der menschlichen Chromosomenanfärbungssonden von Beispiel 2, den sehr stark umgelagerten Karyotypen einer Gibbonart in einer einzigen Hybridisierung zu rekonstruieren. Somit stellen die Figuren 18 und 19 einen spektralen Karyotyp der Gibbonart Hylobates concolor nach Hybridisierang mit menschlichen Anfarbungssonden dar. Es sit festzustellen, dass das X-Chromosom des Gibbons vollständig mit dem menschlichen X-Chromosom angefärbt ist. Ein Großteil der Autosome, beispielsweise Chromosom 19, zeigen ein Bandenfarbungsmuster, das mehrere,
evolutionsbedingte, chromosomale Umlagerungen zeigt.
Spektrale Karyotypisierung der durch die Evolution bedingten umgelagerten
Chromosomen war mit den Ergebnissen von früher durchgeführten herkömmlichen FISH-Experimenten und Bandenfärbungsanalyse übereinstimmend [siehe, u. Koehler, F. Bigoni, J.
Weinberg und R. Stanyon, Genomics 30 (1995), 287 und P. Van Tuinen und D.H. Ledbetter, Am. J. Phys. Anthropol. 61 (1983), 453].
Aufgrund der vorstehenden Beschreibungen ist es klar, dass (1) mehrere Sondentypen für FISH verwendet werden können, wobei diese Loci-spezifische Sonden, Gruppen von Chromosomenfragmenten, Chromosomenanfärbungsmittel und ganze Genome einschließen, (2) die analysierten Chromosomen aus der Interphase, Mitose oder Meiose sein können und (3) Dutzende von Sonden aller Typen zu den Chromosomen gleichzeitig hybridisiert werden können und dass unter der Voraussetzung, dass jede der Sonden ein ein wenig unterschiedliches Spektrum aufweist, das SpectraCube™-System, wie es in der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, jede der Sonden spektral nachweisen und ihre räumliche Anordnung durch Zuschreiben der Pixel darstellen kann, die jedes der Spektren mit einer RGB-Farbe (d.h Pseudo-Farbe) oder einer bestimmten, künstlichen Farbe unter Verwendung jedes geeigneten Einteilugsalgorithmuses (beispielsweise Einteilungs-Zuordnung oder Hauptkomponentenanalyse) darstellt.
Damit kann beispielsweise eine einzige Durchführung eingesetzt werden, um das/die Gen/e zu ihren chromosomalen Banden zuzuordnen, falls die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zum Zuordnen eines neu isolierten Gens oder neu isolierter Gene (oder anderer DNA-Sequenzen) verwendet wird. Beispielhaft für zwei neue Gene können aus diesem Grund 26 unterschiedliche Sonden wie folgt vorbereitet werden: 24 Chromosomenanfärbungsmittel und zwei Loci-spezifische Sonden (d.h. die neu isolierten, fluoreszierend markierten Gene). Die Sonden werden dann vermischt und vorzugsweise mit einem mitotischen Chromosom gleichzeitig hybridisiert, die ebenfalls DAPI-kontrastangefärbt sind. Das Ergebnis ist ein, zu dem in Figur 9b dargestellten ähnlicher 24 (für einen männlichen oder 23 für einen weiblichen) farbiger Karyotyp, auf dem zwei Loci-spezifische Signale (Punkte, die den Loci-spezifischen Sonden zugeschrieben werden) in nun zwei unterschiedlichen Farben die Chromosomenlokationen der neu isolierten Gene hervorheben, die dann mit einer spezifischen chromosomalen Bande durch Erzeugen einer R-Banden-angefärbten, wie vorstehend erklärten, Abbildung assoziert werden.
In vielen Fällen werden wenige Loci-spezifische Sonden einer einzigen chromosomalen Bande zu geordnet, die bislang distal und die nicht proximal eingerichtet ist. Unter Veiwendung
der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, um jede der wenigen Sonden gleichzeitig nachzuweisen, während jede in einer unterschiedlichen RGB- oder künstlichen Farbe erscheint wird in vielen Fällen ermöglicht, die relative Anordnung von dicht zugeordneten Sequenzen zu bestimmen.
Das SpectraCube™-System und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung können ebenfalls dazu verwendet werden, um dreidimensionale Anordnungen von Interphasenchromosomen nachzuweisen. Der Leser wird erneut auf die Figuren 8a und 9a verwiesen. In der oberen rechten Ecke werden mit dem in der vorstehenden Tabelle 4 aufgelisteten Chromosomenanfärbungsmittel hybridisierte Zellkerne während der Interphase (mit NI gekennzeichnet) dargestellt. Die Untersuchung des Farbmusters dieser Zellkerne enthüllt eine einzigartige Eigenschaft. Es ist beispielsweise festzustellen, dass die beiden Chromosom 2-Paare (in rot) in dem unteren Teil der Zellkerne angeordnet sind und dass die Chromosom 6-Paare (in purpur) beide an entgegengesetzten Pol angeordnet sind. Bis jetzt ist über die Chromosomenorganisation während der Interphase wenig bekannt. Nun ist es vernünftig zu vermuten, dass während der Interphase in bösartigen Zellen Änderungen bei der Chromosomenorganisation auftreten. Damit kann die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung von außerordentlichem Wert zur Früherkennung von verschiedenen bösartigen Krankheiten, Bestimmen des Stadiums einer Bösartigkeit und somit einer besseren Behandlungsanpassung für untersuchte Patienten etc. sein. Es sollte festgestellt werden, dass die Verwendung des SpectraCube™-Systems kombiniert mit der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung und einem Mittel zur dreidimensionalen Rekonstruktion (beispielsweise einem konfokalen Mikroskop) verwendet werden kann, um dreidimensionale Information der Chromosomenorganisation während der Interphase herauszuziehen.
Viele Krebsarten und genetische Fehler werden durch Chromosomendeletion, Translokationen und andere Umordnungen und grobe Anormalitäten (beispielsweise Genamplifikation) gekennzeichnet. Wie im vorstehenden Beispiel 3 vorgeführt, wird die Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit vergrößern, derartige Abnormalitäten nachzuweisen. Weiterhin ist es klar, dass die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung für vergleichende genomische Hybridisierung (comparative genomic hybridization, CGH) und für umgekehrte Chromosomenanfärbung sehr geeignet ist, wie vorstehend beschrieben wird.
Eine der allgemeinen, chromosomalen Abweichungen wird mit dem Down-Syndrom assoziiert. Vor langer Zeit wurde festgestellt, dass das Down-Syndrom mit der Trisomie des Chromosoms 21 assoziiert ist. Eine sorgfältigere Untersuchung enthüllte, dass ein spezifischer Bereich des Chromosoms 21 (21q22) immer mit diesem allgemeinen Syndrom asssoziiert wird (d.h. bei Trisomie auftritt). Bei einigen Fällen ist jedoch der Karyotyp des mit dem Down-Symdrom betroffenen Individuums offensichtlich normal, wenn er durch herkömmliche: G- oder
R-Bandenfärbungstechniken für Karyotypisieren bestimmt wird. Die weithin anerkannte Erklärung für dieses Phänomen liegt darin, dass in diesen Fällen die Trisomie von einem Fragment stammt, das von dem 21q22-Chromosomenbereich abgeleitet wird, dessen Fragment klein und unter der Auflösung der herkömmlichen Bandenfärbungstechniken liegt. Die Verwendung des SpectraCube™-Systems kombiniert mit der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird ermöglichen, diese bis dahin nicht nachweisbaren Chromosom 21 Trisomien in embryonischen, beispielsweise über Probenvorbereitung von Chorionzotten-Zellen, nachzuweisen und eine fundiertere genetische Beratung für Frauen mit hohem Riiäiko zu ermöglichen. Es sollte festgestellt werden, dass ebenfalls über die Chromosomen 13 und 18 oder Fragmenten davon berichtet wird, bei Trisomien zu erscheinen, die in der Geburt von auffallend anormalen Kindern resultieren und dass dieVorrichtung der vorliegenden Erfindung ähnlich zur pränatalen Diagnose dieser vernichtenden Trisomien der Chromosomen 13 oder 18 angewendet werden kann.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kombiniert mit den sich schnell entwickelnden Techniken zum Abtrennen embryonischer Zellen aus dem peripheren Blut einer schwangeren Frau wird von großem Wert für das pränatale Karyotypisieren mit niedrigem Risiko zum Nachweis von Chromosom 21 Trisomien und anderen weniger häufigeren Chromosomenanormalitäten sein.
Die Verwendung des SpectraCube™-Systems und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kombiniert mit Telomer-spezifischen Chromosomensonden, wobei jedes Telomer (48 bei männchlichen Menschen, 46 bei weiblichen) in einer unterschiedlichen Farbe erscheint, wird eine vergleichende Studie aller Telomere in einer untersuchten Art ermöglichen.
In der Studie der entwicklungsverwandten Arten und in der Studie für Modelsysteme (beispielsweise Maus als Modelsystem für Mensch) ist es bei vielen Fällen erforderlich, vergleichende Genomzuordnungen zu erhalten, bei denen Chromosomen von zwei oder mehr Arten gemäß ihrer Sequenzähnlichkeiten und damit ihrer Chromosomen getragenen, genetischen Information ausgerichtet sind. Die Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird das Erlangen derartiger vergleichender Zuordnungen erleichtern. Man ziehe beispielsweise die Vorbereitung einer vergleichenden Zuordnung von Mensch-Maus-Chromosom in Erwägung.
Zu diesem Zweck soll ein vollständiger Satz von Chromosomenanfärbungsmitteln einer der Arten (beispielsweise Mensch) mit Chromosomenspreizung der anderen Art (Maus, in dem bestimmten Beispiel), wie vorstehend beschrieben, hybridisiert und analysiert werden. Das Ergebnis ist eine Abbildung eines Maus-Karyotyps, der mit den menschlichen Chromosomenanfärbungsmitteln angefärbt ist. Damit kann eine Ausrichtung zwischen den Karyotypen der zwei Arten gemacht werden
Viele andere Anwendungen für FISH wurden in der Fachliteratur beschrieben. Ein Beispiel ist die Studie der Genexpression, wobei man durch die Verwendung Loci-spezifischer
Sonden, die mit bei Intervallen von einer synchronisierten Zellkultur erhaltenen Interphasen-Zellkernen hybridisiert sind, ihre Verdoppelungsordnung (d.h. verdoppelte Gene erscheinen als vier Punkten und nicht verdoppelte Gene erscheinen als zwei Punkte) feststellen kann, wobei, als Daumenregel, früh verdoppelnde Gene in der untersuchten Zelle ausgedrückt werden und spät verdoppelnde nicht. Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist für diesen Analysetyp sehr gut geeignet, da Dutzende, jede ein wenig unterschiedliches Spektrum aufweisende Sonden in einer einzigen Hybridisierung, gefolgt von einem einzigen Abbildungsschritt gleichzeitig analysiert werden können, um sie alle nachzuweisen. Tatsächlich kann die Vorrichtutng der vorliegenden Erfindung für jede bisher beschriebene oder noch zu beschreibende FSIH-Anwendung verwendet werden.
Mehrfarbige-Chromosomenbandenanfärbung- Chromosomen mit Strichcode versehen
Nun mit Bezug auf die Figuren 20 und 21 werden RGB-Abbildungen weniger Chromosomen mit farbigem, entlang ihrer Längsachsen angeordnetem Strichcode dargestellt, wie sie durch die Verwendung des SpectraCube™-System und die mehrfarbige Chromosomenbandenanfärbungsvorrichtung der vorliegen Erfindung erhalten werden.
Die bei den menschlichen Chromosomen 5, 2, 10, 13, 16 und 7 gezeigten Strichcodes wurden unter der Verwendung von fluoreszierend markierten, bestrahlten Hybridchromosomenfragmenten (für 5, 2, 10, 13 und 16) oder von YAC-Klonen (für 7) als eine Quelle für mehrfarbige Chromsomenfragrnente erzeugt.
In allenFällen werden zwei Fluorophore mit deutlich unterschiedlichen Farben, FITC (mit einer grünen Fluoreszenz) und TRITC (Tetramethylrhodamin-5-Isothiocyanat mit roter Fluoreszenz) verwendet, um die Chromosomenfragmente gemäß des kombinatorischen Hybridisierungsansatzes zu markieren.
Für die Chromsomen 5, 2, 10, 13 und 16 werden die FITC- und TRITC-Fluorophore verwendet, um zwei zufällige Fragmentgruppen zu markieren, die von einem vollständigen Satz von bestrahlten Hybridchromosomenfragmente abgetrennt wurden (d.h. gemeinsam das ganze menschliche Genom bedeckend). Es ist klar, dass in einem derartigen Fall, der Strichcode, der erzeugt wird, zufalliger Natur ist und nicht vorhergesagt werden kann. Wenn die für die Hybridisierung verwendete Chromosomenfragmentquelle jedoch erst einmal besteht und erfaßt wird, sollte das gleiche farbige Strichcodemuster (d.h. Bandenfärbung) für jedes andere normale Chromosom, das mit der gleichen Fragmentquelle hybridisiert und ähnlich verfaßt wird, folgen.
Die dargestellten Farben werden unter Verwendung einer RGB-Nachschlagetabelle ausgesucht, die die Differenz bei den Farben vergrößert, so dass Sreifen mit unterschiedlichen Farben betont werden.
Der farbige Strichcode entlang des kurzen Arns von Chromsom 7 wurden durch die
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Verwendung sechs unterschiedlicher YAC-Klone erzeugt, die vorher dicht zueinander bekannten Stellen auf den kurzen Arm menschlichen Chromosoms 7 zugeordet werden. Diese sechs; YAC-Klone werden mit den vorstehend erwähnten grünen und roten Fluorophoren auf abwechselnde Art und Weise gemäß ihrer beannten chromosomalen Stellungen markiert. Die Farben, die in der erhaltenen RGB-Abbildung gezeigt werden, werden unter Verwendung einer geeigneten RGB-Nachschlagetabelle zum Verbessern des Ergebnisses ähnlich ausgewählt. Es sind bitte sechs unterschiedliche Streifenentlang des Chromosoms festzustellen, wobei jeder die Hybridisierung eines unterschiedlichen Klones darstellt. Im Gegensatz zu der vorstehenden, die Chromosmen 5, 2, 10, 13 und 16 betreffenden Beschreibung kann man in diesem Fall (d.h. Chromosom 7) das mit dem bestimmten Chromosom assoziierte Bandenfärbungsmuster durch Auswählen von Hybridisierungssonden bekanten, chromosomalen Ursprungs voraussagen.
Dieses Beispiel kann durch die Verwendung von vielen YAC-Klonen, die das ganze Chromosom abdecken, und durch die Verwendungen mehrerer Fluoreszenztypen ausgedehnt werden, wobei jeder durch eine unterschiedliche Fluoreszenz gekennzeichnet ist, um einen vollständigen, mehrfarbigen Bandenfärbungskaryotyp des Menschen oder jeder anderen Art zu erhalten.
Die Erfassungen werden unter der Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops gemacht, das mit einem dreifach Bandfilter nach Kundenentwurf von Chroma Technology (Anregungen: 455-485, 555-575 und 630-650 ran, Emission 500-550, 580-620 und 660-740 mn), der mit dem SpectrCube™-System verbunden ist, wie es vorstehend beschrieben wird, ergänzt wird. Für die Anregung der Fluorophore wird eine Xenon-Lichtquelle verwendet.
Chromosomenanfärbung und/oder mehrfarbiger Chromosomenbandenanfärbimg und
herkömm-liche Chromosomenbandenanfärbung
Wie erwähnt ist herkömmliche Chromsomenbandeanfärbung (entweder G-Bandenanfärbung oder R-Bandenanfärbung) gegenwärtig das vorwiegende Verfahren, das heutzutage in der Zytogenetik für verschiedene Zwecke, wie beispielsweise zum Nachweisen von Chromosomenabweichungen, verwendet wird.
Herkömmliche Chromosomenanfärbung ist augenblicklich die „Sprache der Zytogentiker", die quer durch die Gemeinschaft der Zytogentiker gut bekannt ist.
Einer der wichtigsten Vorteile der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist ihre
Fähigkeit, sowohl herkömmliche Chromosomenbandenanfärbung (beispielsweise R-Bandenanfärbung unter Verwendung von beispielsweise DAPI-Anfärbung) als auch spektrale Karyotypisierung (d.h. Chromosomenanfärbung oder mehrfarbige Chromosomenanfärbung) der gleichen Chromosomenspreizungen zu erfassen.
Die Koanalyse der zwei damit erhaltenen Abbildungen kann zu einer Einteilung aller
Chromosomen zusammen mit der Identifikation von sowohl struktureller als auch numerischer Abweichungen führen und kann deshalb Zytogenetikern dabei helfen, die neue zytogenetische Sprache zu erlernen, die mit Chromosomenanfärbung und mehrfarbiger Chromosomenanfärbung assoziiert wird.
Nun mit Bezug auf die Figuren 22a-c und 23a-c werden eine R-Bandenanfärbungabbildung (Figuren 22a und 23a) unter der Verwendung von DAPI zum Färben der Chromosomen, eine G-Bandenanfärbungabbildung (Figuren 22b und 23b), die durch Darstellen der negativen Abbildung der Figuren 22a und 23a erhalten werden, und eine RGB-Abbildung eines farbigen Karyotyps (Figuren 22c und 23c) einer einzigen Chromosomenspreizung, die alle unter verwendung des SpectraCube™-Systems erhalten werden.
Für G-oder R-Bandenanfärbung werden Mauschromsomen mit DAPI angefärbt. Zum farbigen Karyotypisieren werden die mit DAPI angefärbten Chromosomen danach mit einem vollständigen Satz menschlicher Chromosomenanfärbungsmittel hybridisiert, wie unter den Tabellen 2 und 3 vorstehend detailliert erläutert wird. Um optimale räumliche Auflösung zu erreichen, vergrößerte das zum Erhalten der DAPI-Abbildungen verwendete Objektiv hundertfach und der normalerweise für farbiges Karyotyping verwendete, dreifache Filterwürfel wurde durch einen speziellen Bandpassfilterwürfel für DAPI ersetzt (Anregung 350 nm Emission 400-450 nm). Ein solcher Filtertyp ist sehr gewöhnlich und besteht für jeden Mikroskoptyp und Hersteller. Dann wurde die Abbildung durch schnelles, fortwährendes Hin- und Herbewegen des Scanners in einer Belichtungszeit von ungefähr 5 bis 15 Sekunden erfasst. Der Grund den Scanner wie beschrieben zu bewegen, war die Einfassungen zu beseitigen und klare Abbildungen zu erhalten. Die relativ lange Belichtungszeit ist erforderlich, weil die Intensität des DAPI-Farbstoffs gewöhnlich viel geringer ist als die anderer Fluoreszenzfarbstoffe. Andererseits ist DAPI ein stabiler Fluorophor und bleicht während der Zeit nicht zu dem Ausmaß wie andere Fluorophore aus, wie die für farbiges Karyotyping. Es wird eine Grauwert-Abbildung der R-Bandenanfärbung mit DAPI erhalten (Figuren 22a und 23a). Um das meiste der Infromation aus der R-Bandenanfärbungsabbildung mit DAPI herauszuziehen, wurde die negeatie Abbildung berechnet, die das G-Bandenanfarbungsmuster ergibt, das für die Zytogenetiker vertrauter ist (Figuren 22b und 23b). Dies wird durch die Verwendung einer inversen Funktion der algemeinen Form I'Xy = N-jxy getan, wobei Nder maximale dynamische Bereich der Kamera (in diesem Fall N = 4,095), /die positive Intensitaät bei jeder ^-Stellung und /'die berechnete negative Intensität bei jeder &khgr;,^-Stellung ist. Das Ergebnis kann weiter durch Vergrößern der Grrauwert-Nachschlagetabelle verbessert werden.
Die farbige Karyotypabbildung der gleichen Chromosomenspreizung wurde ebenfalls erfasstund in den Figuren 22c und 23c dargestellt. Es kann deutlich beobachtet werden, dass die Korrelation dieser Abbildungen zu einer hohen Genauigkeitder Chromosomenidentifizierung
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führen kann. Es ist klar, dass es viel schwerer ist, Mauschromosomen im Vergleich zu menschlichen Chromosomen zu identifizieren, da sie bei der Größe einheitlicher sind und unter der Verwendung herkömmlicher Chromosomenbandenanfärbungstechniken nicht so spezifisch Banden-angefärbt werden. Folglich sind wenige Wissenschaftler zum Identifizieren von Mauschromosomen fähig. Trotzdem wird das Identifizieren der Chromosome unter Verwendung des farbigen Karyotyping und/oder des mehrfarbigen Bandenanfärbungsverfahren der vorliegenden Erfindung eine leichte Aufgabe.
Es ist weiterhin klar, dass die Verwendung von DAPI in Kombination mit den in Tabelle 2 vorstehend aufgelisteten Fluorophoren geeignet ist, da die DAPI-Anregung und -Emission durch Wellenlängen in dem blauen Bereich gekennzeichnet sind, während die anderen Fluorophore durch längere Anregungs- und Emissionswellenlängen gekennzeichnet sind. Damit kann jede andere Färbung (d.h. herkömmlicher Chromosomenbandenanfärbungsfarbstoff) mit ähnlicher Qualität zum Erhalten von G- oder R- Bandenfarbung von Chromosomen, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt werden.
Chromosömenanfärbung und/oder mehrfarbige Chromosömenanfärbung und automatische Chromosomenbestimmmung
Wenn einmal ein bestimmter Satz mehrfarbiger Sonden unter identischen Bedindungen für entweder Chromosomenbandenanfärbung oder Chromosömenanfärbung, wie hier vorstehend beschrieben wird, wiederholt verwendet wird, kann ein einfacher Chromosomeneinteilungsalgorithmus, der Pixel mit bestimmten spektralen Eigenschaften zu Chromosomen zuordnet, zum automatischen Karyotyping verwendet werden. Ausdehnen dieses Chromosomeneinteilungsalgorithmus, um ebenfalls einen morphlogischen Algorithmus einzuschließen, wie in der Technik des automatischen Karyotyping gur bekannt ist, kann sogar noch bessere Ergebnisse erreichen.
Damit werden Referenzergebnisse für Hybridisierungen von normalen Chromosomenspreizungen gespeichert und für spektrale (und morphologische ) Vergleiche mit analysierten Chromosomenerweiterungen, die unter andererseits identischen Bedingungenhybridisiert werden, verwendet.
Claims (85)
1. Spektrale Abbildungsvorrichtung zum Nachweisen und Analysieren von in situ Hybridisierungen, umfassend:
a) eine Einrichtung zum Bereitstellen eines Zellkerns mit Chromosomen, wobei die Chromosomen mit wenigstens einer Nucleinsäurensonde hybridisiert sind, die mit wenigstens einem Fluorophor markiert ist,
b) ein Fluoreszenzmikroskop zum Betrachten des Zellkerns, wobei das Fluoreszenzmikroskop mit einem Abbildungsspektrometer optisch verbunden ist, wobei das Fluoreszenzmikroskop und das Abbildungsspektrometer zum Erhalten eines Spektrums jedes Pixels der Zelle dienen, wobei das Erlangen des Spektrums jedes Pixels des Zellkerns erreicht wird mit:
a) einer Einrichtung zum Sammeln von einfallendem Licht gleichzeitig von allen Pixeln des Zellkerns unter Verwendung parallel ausrichtender optischer Einrichtungen,
b) einem linterferometersystem zum Durchleiten des einfallenden, parallel ausgerichteten Lichts, mit einer Anzahl an Elementen, so dass das Licht zuerst in zwei kohärente Strahlen geteilt wird, die sich in unterschiedliche Richtungen innerhalb des Interferometers bewegen, worauf sich die Strahlen erneut vereinigen, um miteinander zu interferieren, um einen austretenden Lichtstrahl zu bilden,
c) einem fokussierenden, optischen System zum Durchleiten des austretenden Lichtstrahls, das den austretenden Lichtstrahl auf einen Detektor mit einer zweidimensionalen Anordnung von Detektorelementen fokussiert, so dass zu jedem Zeitpunkt jedes der Detektorelemente die Abbildung eines und immer des gleichen Pixels des Zellkerns während der ganzen Dauer der Erfassung bewirkt, so dass die reale Abbildung des Zellkerns stationär auf der Ebene der Detektoranordnung ist, und dass die Abbildung zu jedem Zeitpunkt während der Erfassung sichtbar und erkennbar ist, und so dass jedes der Detektorelemente ein Signal erzeugt, das eine besondere Linearkombination der durch das Pixel bei unterschiedlichen Wellenlängen emittierten Lichtintensität ist, wobei die Linearkombination eine Funktion der momentanen optischen Wegdifferenz ist,
d) einer Einrichtung zum Drehen oder Verschieben eines oder mehrerer Elemente des Interferometersystems, so dass die optische Wegdifferenz zwischen den zwei kohärenten, durch das Interferometersystem erzeugten Strahlen für alle Pixel des Zellkerns gleichzeitig abgetastet wird, und
e) einer Einrichtung zum Aufnehmen der Signale von jedem der Detektorelemente als Funktion der Zeit unter Verwendung einer Aufnahmevorrichtung, um einen ersten spektralen Datenblock zu bilden, und
c) eine Einrichtung zum Auswerten des ersten, spektralen Datenblocks unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus.
2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der das Fluoreszenzmikroskop mit einem Filter ergänzt wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem dichroitischen Zweibandfilter und einem dichroitischen Dreibandfilter.
3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die wenigstens eine Nucleinsäurensonde ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus wenigstens einem Locus, wenigstens einem fragmentierten Chromosom, wenigstens einem künstlichen Hefechromosom einschließlich eines Inserts, wenigstens einem Plasmid einschließlich eines Inserts, wenigstens einem Kosmid einschließlich eines Inserts, wenigstens einem viralen Vektor einschließlich eines Inserts, einem vollständigen Genom einer Art oder einem kanzerösen Gewebe und Kombinationen davon.
4. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der das Markieren der Nucleinsäuresonden erreicht wird durch kombinatorische Markierung und/oder kombinatorische Hybridisierung.
5. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der Zellkern ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Zellkern während der Interphase, einem Zellkern während der Mitose und einem Zellkern während der Meiose.
6. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Anzahl der Nucleinsäuresonden ausgewählt ist aus der Gruppe von Zahlen, bestehend aus eins, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn, siebzehn, achtzehn, neunzehn, zwanzig, einundzwanzig, zweiundzwanzig, dreiundzwanzig, vierundzwanzig und größer als vierundzwanzig, wobei jede der Sonden ein unterschiedliches Fluorophor oder eine unterschiedliche Kombination von Fluorophoren einschließt.
7. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Chromosomen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Interphasenchromosomen, Chromosomen während der Mitose und Chromosomen während der Meiose.
8. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der mathematische Algorithmus eine Punktoperationssanalyse des Spektrums von jedem Pixel in dem Zellkern durchführt.
9. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, bei der die Punktoperationsanalyse ein Zuordnen des Spektrums von jedem Pixel in dem Zellkern zu einem Skalar gemäß einer Transformationsfunktion einschließt.
10. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, bei der die Punktoperationsanalyse ein Zuordnen des Spektrums von j edem Pixel des Zellkerns zu einem anderen Spektrum gemäß einer Transformationsfunktion einschließt.
11. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der mathematische Algorithmus eine morphologische Analyse ist, wobei die morphologische Analyse die relative Größe der Chromosomen in dem Zellkern bestimmt.
12. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der mathematische Algorithmus eine Einteilungs-Zuordnungsanalyse ist, die eine spektrale Differenz von wenigstens einem Referenzspektrum für das Spektrum jedes Pixels berechnet.
13. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, bei der die Einteilungs-Zuordnungsanalyse zur Erzeugung einer mehrfarbigen Abbildung führt, bei der Pixelgruppen mit einer bestimmten, maximalen, spektralen Differenz von einem der mehreren Referenzspektren mit einer bestimmten, künstlichen Farbe angefärbt sind.
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, bei der die spektrale Differenz ein Skalar ist, der als das Integral über einen bestimmten Wellenlängenbereich des absoluten Wertes der Differenz zwischen dem Spektrum von jedem Pixel und einem der mehreren Referenzspektren definiert ist.
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der mathematische Algorithmus eine Hauptkomponentenanalyse ist.
16. Vorrichtung gemäß Anspruch 15, bei der die Hauptkomponentenanalyse einschließt:
a) Aufbauen einer kovarianten Matrix für alle Pixel und Wellenlängen der Erfassung, einschließlich Wellenlängen der anregenden Quellen, wenn mehrere Wellenlängen verwendet werden,
b) Diagonalisieren der kovarianten Matrix und Auffinden aller unabhängiger, orthogonaler Basiselemente und
c) Herausfinden, welche der Basiselemente oder eine Kombination davon gewisse Eigenschaften in dem Zellkern markieren.
17. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der mathematische Algorithmus eine Linearkombinationsanalyse ist.
18. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, bei der die Linearkombinationsanalyse zur spektralen Normierung dient.
19. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, bei der die Linearkombinationsanalyse eine Verknüpfung eines bestimmten Skalars mit jeder Wellenlänge der Spektren jedes Pixels durch eine arithmetische Funktion einschließt, wobei die Funktion ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Addition, Subtraktion, Multiplikation, Division und/oder Kombinationen davon.
20. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, bei der die Linearkombinationsanalyse zur Hintergrundsubtraktion dient, bei der ein Spektrum eines in einem Hintergrundbereich des Zellkerns angeordneten Pixels von den Spektren der Pixel des Zellkerns subtrahiert wird.
21. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, bei der die Linearkombinationsanalsye der Kalibrierung dient, bei der ein vor dem Betrachten des Zellkerns erfaßtes Spektrum zum Dividieren der Spektren der Pixel des Zellkerns dient.
22. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der mathematische Algorithmus eine Rot-Grün- Blau-Farbabbildung unter Verwendung bestimmter Wellenlängenbereiche berechnet.
23. Vorrichtung gemäß Anspruch 22, bei der die Rot-Grün-Blau-Farbabbildung durch einen Kontrast-streckenden Algorithmus modifiziert ist.
24. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der mathematische Algorithmus ein Verhältnis zwischen Intensitäten bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen für jedes der Spektren der Pixel berechnet.
25. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der mathematische Algorithmus ein Verhältnis zwischen Intensitäten bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen für jedes der Spektren der Pixel berechnet und jedes Pixel in einer helleren oder dunkleren, künstlichen Farbe gemäß des berechneten Verhältnisses anfärbt.
26. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Vorrichtung für eine Anwendung dient, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bereitstellen eines farbigen Karyotyps embryonaler Zellen, Bereitstellen eines farbigen Karyotyps von Leukozyten, Bereitstellen eines farbigen Karyotyps bösartiger Zellen und Bereitstellen eines farbigen Karyotyps von auf Bösartigkeit untersuchten Zellen.
27. Vorrichtung gemäß Anspruch 26, bei der die embryonalen Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Chorionzottenzellen und Zellen, die aus dem peripheren Blut einer schwangeren Frau isoliert sind.
28. Vorrichtung gemäß Anspruch 27, bei der die Vorrichtung zum Nachweisen einer Trisomie eines genetischen Material dient, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus menschlichem Chromosom 21, menschlicher chromosomaler Bande 21q22, einem Fragment der menschlichen chromosomalen Bande 21q22, menschlichem Chromosom 18, einem Fragment des menschlichen Chromosoms 18, menschlichem Chromosom 13 und einem Fragment des menschlichen Chromosoms 13.
29. Vorrichtung gemäß Anspruch 26, bei der das Bereitstellen des farbigen Karyotyps der auf Bösartigkeit untersuchten Zellen zum Erhalten einer farbigen Translokationszuordnung dient.
30. Vorrichtung gemäß Anspruch 26, bei der das Bereitstellen des farbigen Karyotyps bösartiger Zellen zum Erhalten einer farbigen Translokationszuordnung dient.
31. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Vorrichtung zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen dient.
32. Vorrichtung gemäß Anspruch 31, bei der die chromosomalen Abweichungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Deletionen, Translokationen und Amplifikationen.
33. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Vorrichtung zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen dient, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus wiederkehrenden, chromosomalen Abweichungen und sekundären, chromosornalen Abweichungen.
34. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, beider die Vorrichtung zum Nachweisen des Stadiums einer Bösartigkeit dient.
35. Vorrichtung gemäß Anspruch 34, bei der der Nachweis des Stadiums der Bösartigkeit zum Auswählen einer Behandlung dieser Bösartigkeit dient.
36. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Vorrichtung zum Verfolgen der Wirksamkeit einer Antikrebsbehandlung dient.
37. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Vorrichtung zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen dient, die auf Aussetzung gegenüber mitogenen Agenzien folgen.
38. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Chromosomen mit einem herkömmlichen Chromosomenbandenfärbungsfarbstoff angefärbt sind, wobei die Vorrichtung weiterhin das Erhalten einer Grauwert-Bandenfärbungsabbildung der Chromosomen umfasst.
39. Vorrichtung gemäß Anspruch 38, bei der der herkömmlicher Bandenfärbungsfarbstoff DAPI ist.
40. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Vorrichtung zur vergleichenden Genomhybridisierung verwendet wird.
41. Spektrale Abbildungsvorrichtung zum Nachweisen und Analysieren von Hybridisierungen, umfassend:
a) eine Einrichtung zum Bereitstellen eines Zellkerns einer ersten Art mit einem Genom und Chromosomen, wobei die Chromosomen mit wenigstens einer Gruppe von Chromosmenfragmenten hybridisiert sind, die wenigstens eine Fraktion des Genoms der ersten Art abdecken, wobei jede der wenigstens einen Gruppe von Chromosomenfragmenten mit wenigstens einem Fluorophor markiert ist,
b) ein Fluoreszenzmikroskop zum Betrachten des Zellkerns, wobei das Fluoreszenzmikroskop mit einem Abbildungsspektrometer optisch verbunden ist, wobei das Fluoreszenzmikroskop und das Abbildungsspektrometer zum Erhalten eines Spektrums jedes Pixels der Zelle dienen, wobei das Erlangen des Spektrums jedes Pixels des Zellkerns erfolgt mit:
a) einer Einrichtung zum Sammeln von einfallendem Licht gleichzeitig von allen Pixeln des Zellkerns unter Verwendung parallel ausrichtender optischer Bestandteile,
b) einem Interferometersystem zum Durchleiten des einfallenden, parallel ausgerichteten Lichts, mit einer Anzahl von Elementen, so dass das Licht zuerst in zwei kohärente Strahlen geteilt wird, die sich in unterschiedliche Richtungen innerhalb des Interferometers bewegen, worauf sich die Strahlen erneut vereinigen, um miteinander zu interferieren, um einen austretenden Lichtstrahl zu bilden,
c) einem fokussierenden, optischen System zum Durchleiten des austretenden Lichtstrahls, das den austretenden Lichtstrahl auf einen Detektor mit einer zweidimensionalen Anordnung von Detektorelementen fokussiert, so dass zu jedem Zeitpunkt jedes der Detektorelemente die Abbildung eines und immer des gleichen Pixels des Zellkerns während der ganzen Dauer der Erfassung ist, so dass die reale Abbildung des Zellkerns stationär auf der Ebene der Detektoranordnung ist und dass die Abbildung zu jedem Zeitpunkt der Erfassung sichtbar und erkennbar ist, und so dass jedes der Detektorelemente ein Signal erzeugt, das eine besondere Linearkombination der, durch das Pixel bei unterschiedlichen Wellenlängen emittierten Lichtintensität ist, wobei die Linearkombination eine Funktion der momentanen optischen Wegdifferenz ist,
d) eine Einrichtung zum Drehen oder Verschieben eines oder mehrerer Elemente des Interferometersystems, so dass die optische Wegdifferenz zwischen den zwei, kohärenten, durch das Interferometersystem erzeugten Strahlen für alle Pixel des Zellkerns gleichzeitig abgetastet wird, und
e) eine Einrichtung zum Aufnehmen der Signale von jedem der Detektorelemente als Funktion der Zeit unter Verwendung einer Aufnahmevorrichtung, um einen ersten spektralen Datenblock zu bilden, und
c) eine Einrichtung zum Auswerten des ersten, spektralen Datenblocks unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus.
42. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der das Fluoreszenzmikroskop mit einem Filter ergänzt wird ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem dichroitischen Zweibandfilter und einem dichroitischen Dreibandfilter.
43. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Chromosomenfragmente aus einer Quelle stammen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus bestrahlten Hybridzelllinien, YAC-Klonen, BAC-Klonen, nach Größe getrennten Endonuclease-Spaltprodukten des Genoms der Art und mikrozerlegten Chromosomenfragmenten.
44. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der das Markieren der Chromosomenfragmente erreicht wird durch eine Strategie, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus kombinatorischer Markierung und kombinatorischer Hybridisierung.
45. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der das Markieren der Fragmente durch eingestreute, sich wiederholende Sequenz-PCR eingeführt wird.
46. Vorrichtung gemäß Anspruch 45, bei der die eingestreute, sich wiederholende Sequenz Alu ist.
47. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Fluorophore mit einem Nucleotid oder einem Nucleotidanalogon konjugiert sind.
48. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Fraktion ausgewählt ist aus der Gmppe, bestehend aus 10-20%, 21-30%, 31-40%, 41-50%, 51-60%, 61-70%, 71-80%, 81-90% und 91-100%.
49. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die erste Art ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Mensch und Maus.
50. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Chromosomenfragmente von einer zweiten Art stammen.
51. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Chromosomenfragmente in Gruppen gruppiert sind, wobei jede der Gruppen mit einem unterschiedlichen Fluorophor oder einer Kombination von Fluorophoren markiert ist.
52. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der der Zellkern ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Zellkern während der Interphase, einem Zellkern während der Mitose und einem Zellkern während der Meiose.
53. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Chromosomen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Interphasenchromosomen, Chromosomen während der Mitose und Chromosomen während der Meiose.
54. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der der mathematische Algorithmus eine Punktoperationssanalyse des Spektrums von jedem Pixel in dem Zellkern ist.
55. Vorrichtung gemäß Anspruch 54, bei der die Punktoperationsanalyse ein Zuordnen des Spektrums von jedem Pixel in dem Zellkern zu einem Skalar gemäß einer Transformationsfunktion einschließt.
56. Vorrichtung gemäß Anspruch 54, bei der die Punktoperationsanalyse ein Zuordnen des Spektrums von jedem Pixel des Zellkerns zu einem anderen Spektrum gemäß einer Transformationsfunktion einschließt.
57. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der der mathematische Algorithmus eine morphologische Analyse ist, wobei die morphologische Analyse die relative Größe der Chromosomen in dem Zellkern bestimmt.
58. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der der mathematische Algorithmus eine Einteilungs-Zuordnungsanalyse ist, die eine spektrale Differenz von wenigstens einem Referenzspektrum für das Spektrum jedes Pixels berechnet.
59. Vorrichtung gemäß Anspruch 58, bei der die Einteilungs-Zuordnungsanalyse zur Erzeugung einer mehrfarbigen Abbildung führt, bei der Pixelgruppen mit einer bestimmten, maximalen, spektralen Differenz von einem der mehreren Referenzspektren mit einer bestimmten, künstlichen Farbe angefärbt sind.
60. Vorrichtung gemäß Anspruch 59, bei der die spektrale Differenz ein Skalar ist, der als das Integral über einen bestimmten Wellenlängenbereich des absoluten Wertes der Differenz zwischen dem Spektrum von jedem Pixel und einem der mehreren Referenzspektren definiert ist.
61. Vorrichtung gemäß Anspruch 60, bei der der mathematische Algorithmus eine Hauptkomponentenanalyse ist.
62. Vorrichtung gemäß Anspruch 61, bei der die Hauptkomponentenanalyse einschließt:
a) Aufbauen einer kovarianten Matrix für alle Pixel und Wellenlängen der Erfassung, einschließlich Wellenlängen der anregenden Quellen, wenn mehrere Wellenlängen verwendet werden,
b) Diagonalisieren der kovarianten Matrix und Auffinden aller unabhängiger, orthogonaler Basiselemente und
c) Herausfinden, welche der Basiselemente oder eine Kombination davon gewisse Eigenschaften in dem Zellkern markieren.
63. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der der mathematische Algorithmus eine Linearkombinationsanalyse ist.
64. Vorrichtung gemäß Anspruch 63, bei der die Linearkombinationsanalyse zur spektralen Normierung dient.
65. Vorrichtung gemäß Anspruch 63, bei der die Linearkombinationsanalyse die Verknüpfung eines bestimmten Skalars mit jeder Wellenlänge der Spektren jedes Pixels durch eine arithmetische Funktion einschließt, wobei die Funktion ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Addition, Subtraktion, Multiplikation, Division und/oder Kombinationen davon.
66. Vorrichtung gemäß Anspruch 63, bei der die Linearkombinationsanalyse zur Hintergrundsubtraktion dient, bei der ein Spektrum eines in einem Hintergrundbereich des Zellkerns angeordneten Pixels von den Spektren der Pixel des Zellkerns subtrahiert wird.
67. Vorrichtung gemäß Anspruch 63, bei der die Linearkombinationsanalsye der Kalibrierung dient, bei der ein vor dem Betrachten des Zellkerns erfaßtes Spektrum zum Dividieren der Spektren der Pixel des Zellkerns dient.
68. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der der mathematische Algorithmus eine Rot- Grün-Blau-Farbabbildung unter Verwendung bestimmter Wellenlängenbereiche berechnet.
69. Vorrichtung gemäß Anspruch 68, bei der die Rot-Grün-Blau-Farbabbildung durch einen Kontrast-streckenden Algorithmus modifiziert ist.
70. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der der mathematische Algorithmus ein Verhältnis zwischen Intensitäten bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen für jedes der Spektren der Pixel berechnet.
71. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der der mathematische Algorithmus ein Verhältnis zwischen Intensitäten bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen für jedes der Spektren der Pixel berechnet und jedes Pixel in einer helleren oder dunkleren, künstlichen Farbe gemäß des berechneten Verhältnisses anfärbt.
72. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Vorrichtung für eine Anwendung dient, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bereitstellen eines farbigen Bandenanfärbungskaryotyps embryonaler Zellen, Bereitstellen eines farbigen Bandenanfärbungskaryotyps von Leukozyten, Bereitstellen eines farbigen Bandenanfärbungskaryotyps bösartiger Zellen und Bereitstellen eines farbigen Bandenanfärbungskaryotyps von auf Bösartigkeit untersuchten Zellen.
73. Vorrichtung gemäß Anspruch 72, bei der die embryonalen Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Chorionzottenzellen und Zellen, die aus dem peripheren Blut einer schwangeren Frau isoliert sind.
74. Vorrichtung gemäß Anspruch 73, bei der die Vorrichtung zum Nachweisen einer Trisomie eines genetischen Material dient, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus menschlichem Chromosom 21, menschlicher chromosomaler Bande 21q22, einem Fragment der menschlichen chromosomalen Bande 21q22, menschlichem Chromosom 18, einem Fragment des menschlichen Chromosoms 18, menschlichem Chromosom 13 und einem Fragment des menschlichen Chromosoms 13.
75. Vorrichtung gemäß Anspruch 73, bei der das Bereitstellen des Farbbandkaryotyps von auf Bösartigkeit untersuchten Zellen zum Erhalten einer farbigen Translokationszuordnung dient.
76. Vorrichtung gemäß Anspruch 73, bei der das Bereitstellen des Farb-Karyotyps bösartiger Zellen zum Erhalten einer Farb-Translokationszuordnung dient.
77. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Vorrichtung zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen dient.
78. Vorrichtung gemäß Anspruch 77, bei der die chromosomalen Abweichungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Deletionen, Translokationen und Amplifikationen.
79. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Vorrichtung zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen dient, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus wiederkehrenden, chromosomalen Abweichungen und sekundären, chromosornalen Abweichungen.
80. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Vorrichtung zum Nachweisen des Stadiums einer Bösartigkeit dient.
81. Vorrichtung gemäß Anspruch 80, bei der der Nachweis des Stadiums der Bösartigkeit zum Auswählen einer Behandlung dieser Bösartigkeit dient.
82. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Vorrichtung zum Verfolgen der Wirksamkeit einer Antikrebsbehandlung dient.
83. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Vorrichtung zum Nachweisen chromosomaler Abweichungen dient, die auf Aussetzung gegenüber mitogenenen Agenzien folgen.
84. Vorrichtung gemäß Anspruch 41, bei der die Chromosomen mit einem herkömmlichen Chromosomenbandenfärbungsfarbstoff angefärbt sind, wobei die Vorrichtung weiterhin das Erhalten einer Grauwert-Bandenfärbungsabbildung der Chromosomen umfasst.
85. Vorrichtung gemäß Anspruch 84, bei der der herkömmlicher Bandenfärbungsfarbstoff DAPI ist.
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