JP3474579B2 - スペクトル生体結像方法および蛍光ｄｎａハイブリダイゼーション方法 - Google Patents

スペクトル生体結像方法および蛍光ｄｎａハイブリダイゼーション方法

Info

Publication number
JP3474579B2
JP3474579B2 JP52295097A JP52295097A JP3474579B2 JP 3474579 B2 JP3474579 B2 JP 3474579B2 JP 52295097 A JP52295097 A JP 52295097A JP 52295097 A JP52295097 A JP 52295097A JP 3474579 B2 JP3474579 B2 JP 3474579B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
spectral
spectrum
chromosomes
pixels
cell nucleus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP52295097A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH11503239A (ja
Inventor
ガリニ ユバル
カビブ ダリオ
エー バックワルド ロバート
ジー ソエンクセン ダーク
カチール ニル
ワイン デービッド
ラビ モーシェ
Original Assignee
アプライド スペクトラル イメージング リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アプライド スペクトラル イメージング リミテッド filed Critical アプライド スペクトラル イメージング リミテッド
Publication of JPH11503239A publication Critical patent/JPH11503239A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3474579B2 publication Critical patent/JP3474579B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B3/00—Apparatus for testing the eyes; Instruments for examining the eyes
    • A61B3/10—Objective types, i.e. instruments for examining the eyes independent of the patients' perceptions or reactions
    • A61B3/12—Objective types, i.e. instruments for examining the eyes independent of the patients' perceptions or reactions for looking at the eye fundus, e.g. ophthalmoscopes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01B—MEASURING LENGTH, THICKNESS OR SIMILAR LINEAR DIMENSIONS; MEASURING ANGLES; MEASURING AREAS; MEASURING IRREGULARITIES OF SURFACES OR CONTOURS
    • G01B11/00—Measuring arrangements characterised by the use of optical techniques
    • G01B11/02—Measuring arrangements characterised by the use of optical techniques for measuring length, width or thickness
    • G01B11/06—Measuring arrangements characterised by the use of optical techniques for measuring length, width or thickness for measuring thickness ; e.g. of sheet material
    • G01B11/0616—Measuring arrangements characterised by the use of optical techniques for measuring length, width or thickness for measuring thickness ; e.g. of sheet material of coating
    • G01B11/0675—Measuring arrangements characterised by the use of optical techniques for measuring length, width or thickness for measuring thickness ; e.g. of sheet material of coating using interferometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/12—Generating the spectrum; Monochromators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/12—Generating the spectrum; Monochromators
    • G01J3/1256—Generating the spectrum; Monochromators using acousto-optic tunable filter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/12—Generating the spectrum; Monochromators
    • G01J3/26—Generating the spectrum; Monochromators using multiple reflection, e.g. Fabry-Perot interferometer, variable interference filters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/2823—Imaging spectrometer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/44—Raman spectrometry; Scattering spectrometry ; Fluorescence spectrometry
    • G01J3/4406—Fluorescence spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/45—Interferometric spectrometry
    • G01J3/453—Interferometric spectrometry by correlation of the amplitudes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/45—Interferometric spectrometry
    • G01J3/453—Interferometric spectrometry by correlation of the amplitudes
    • G01J3/4535—Devices with moving mirror
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V10/00—Arrangements for image or video recognition or understanding
    • G06V10/88—Image or video recognition using optical means, e.g. reference filters, holographic masks, frequency domain filters or spatial domain filters
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
    • G06V20/60—Type of objects
    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B3/00—Apparatus for testing the eyes; Instruments for examining the eyes
    • A61B3/10—Objective types, i.e. instruments for examining the eyes independent of the patients' perceptions or reactions
    • A61B3/12—Objective types, i.e. instruments for examining the eyes independent of the patients' perceptions or reactions for looking at the eye fundus, e.g. ophthalmoscopes
    • A61B3/1241—Objective types, i.e. instruments for examining the eyes independent of the patients' perceptions or reactions for looking at the eye fundus, e.g. ophthalmoscopes specially adapted for observation of ocular blood flow, e.g. by fluorescein angiography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J2003/2866—Markers; Calibrating of scan
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/02—Details
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Surgery (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野及び背景 本発明は、一般に、多数の発蛍光団を同時に検出する
ための方法に関する。本発明は、特に、各々が異なる発
蛍光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされた多
数の染色体ペイント及び／あるいは遺伝子座特定プロー
ブを用いて、蛍光DNAハイブリダイゼーションを検出し
分析することを目的とするスペクトル結像方法に関す
る。この方法は、立体解像度及びスペクトル解像度が高
感度であり、多数の発蛍光団及び／あるいは発蛍光団の
組合せを同時に検出することが可能である。このため、
本発明の方法は、人間等の生物学的種から、蛍光彩色さ
れた染色体の全セット及び／あるいは多数の遺伝子座を
検出するために用いられ、完全なカラー核型を提供する
ことができる。
分光計は、光を受け入れ、構成波長に分離（分散）
し、波長の関数としての光の輝度であるところの光のス
ペクトルを測定するようにデザインされた装置である。
結像分光計は、情景からの入射光を集め、各ピクセル
（すなわち、画素）のスペクトルを測定するものの一つ
である。
分光分析法は、化学物質構成要素のスペクトルの特徴
に基づいて、材料や処理を特徴づけるために科学及び産
業において何十年間もに渡って用いられている既知の分
析用の手法である。分光分析法の物理的基礎は光と物質
との相互作用にある。もともと、分光分析法は、波長の
関数として、試料から発せられ、送られ、散乱せられ、
あるいは反射される光の輝度を高スペクトル解像度で測
定するものであり、立体的な情報は全く得られない。
一方、高解像度分光分析法及び高解像度結像の組合せ
であるスペクトル結像（すなわち、立体的な情報）は、
生物学の試料分析には未だ用いられていない。これまで
のところ最も近いものとしては、生物学的試料から高解
像度の立体的な情報を得ることに関するものがあるが、
例えば、高解像度立体結像が一つあるいはいくつかの異
なる帯域フィルターで行われるとき、これは、僅かに限
られたスペクトル情報を提供するものであり（「SPIE会
報−生体結像及び二次元的分光分析法」［Andersson−E
ngels et al.（1990）Proceedings of SPIE−Bioimagin
g and Two−Dimensional Spectroscopy,1205,pp.179−1
89］を参照）、また、高スペクトル解像度（例えば、全
スペクトル）を得ることに関するものもあるが、立体解
像において試料の小数の箇所に限定される、あるいは試
料全体について平均化されるものである（例えば、アル
ファノ（Alfano）氏他の米国特許第4,930,516号を参
照）。
下記に詳しく述べられるが、分光分析法と結像とを結
びつけることは、種々の生物学研究及び医学的応用に役
立つものであり、スペクトル生体結像として下記に言及
される。スペクトル生体結像の有用性の一つの例として
は、蛍光プローブによって判別した（すなわち、タグを
付けた）後に特定の細胞構成要素（例えば、タンパク
質、核酸連鎖等）を検出するものがある。この用途にお
いては、一回の測定でいくつかの発蛍光団を同時に識別
して図に表わすためにスペクトル結像が用いられる。事
実、本発明のスペクトル結像特有の高いスペクトル解像
度は、スペクトルが重なる蛍光プローブ（あるいは他の
化学物質構成要素）の分類に理想的である。
概念的に、スペクトル生体結像システムは、（１）測
定システム及び（２）分析ソフトウェアから成る。この
測定システムには、全ての光学機器、エレクトロニク
ス、また、その測定から所望の結果を抽出するに最適な
試料照射（例えば、光源選択）、測定モード（例えば、
蛍光）及び較正の方法が含まれる。分析ソフトウェアに
は、有意義な方法で重要な結果を分析し表示するために
必要な全てのソフトウェア及び数学的アルゴリズムが含
まれる。
スペクトル結像は、地球及び他の惑星についての研究
において、スペクトル吸収特質を識別することによって
重要な洞察を得るために遠隔測定の分野で何十年間も用
いられている。しかし、遠隔測定スペクトル結像システ
ム（例えば、ランドサット、AVIRIS）は、高いコスト、
大きさ及び構成のため、大気中での使用及び人工衛星に
よる使用に限定されている。（「SPIE会報−遠隔測定の
ためのセンサ、放射測定及びデータ処理における最近の
進歩」［Maymon and Neeck（1988）Recent Advances in
Sensors,Radiometry and Data Processing for Remote
Sensing,924,pp.10−22;Dozier（1988）Proceedings o
f SPIE−Recent Advances in Sensors,Rediometry and
Data Processing for Remote Sensing,924,pp.23−30］
を参照） スペクトル生体結像システムに関して考慮すべき基本
的な３種類のスペクトル分散方法がある。（ｉ）スペク
トル格子、（ii）スペクトル・フィルター及び（iii）
干渉分光分析法。下記に説明されるが、干渉分光分析法
が本発明の方法を実行するに最適である。
スリット・タイプ結像分光計としても知られる、回折
格子（すなわち、モノクロメータ）に基礎を置くシステ
ム、例えばDILORシステム等（「ヨーロッパ医学的光学
週報、SPIE会議での発表」［Valisa et al.（Sep.199
5）presentation at the SPIE Conference European Me
dical Optics Week,BiOS Europe '95,Barcelona,Spai
n］を参照）においては、CCD（電荷結合素子）配列検出
器の僅かに一つの軸（空間軸）が実像データを提供し、
第二の（スペクトル）軸が、波長の関数として、格子に
よって分散される光の輝度を測るために用いられる。こ
のシステムは、また、第一の焦点面にスリットを有し、
一時点での視野を１ラインのピクセルに制限している。
したがって、文献でライン走査として知られる方法でCC
Dのスペクトル軸に平行な方向に格子あるいは入射光線
を走査した後にのみ全画像が得られる。測定全体が完了
するまで二次元画像を視覚化できないことは、測定を行
う前に、視野内における所望の領域を選択すること及び
／あるいはシステムの焦点及び露出時間等を最適化する
ことを不可能にする。地面上を航行する飛行機（あるい
は人工衛星）は、システムに自然発生的なライン走査メ
カニズムを提供するため、格子に基づくスペクトル映像
装置が遠隔測定の用途に用いられている。
さらに、一つのフレームのピクセルの大部分は、計測
器の前段光学素子によって実際に入射光が同時に集めら
れるけれども、いかなる時点においても測定されていな
いため、スリット・タイプ結像分光計には大きな欠点が
あることに注意すべきである。その結果は、ある一定の
SN比で必要な情報を得るためには比較的大きな測定時間
が要求されるか、あるいはある測定時間に対してSN比
（感度）はかなり減らされるかのどちらかである。さら
に、スリット・タイプのスペクトル映像装置は、情景全
体に対する必要な情報を集めるのにライン走査を必要と
するため、得られた結果には誤差が含まれる。
フィルターに基づくスペクトル分散方法は、さらに、
分離フィルター及びチューナブルフィルターに分類され
る。これらのタイプの結像分光計では、スペクトル画像
は、光路に連続的に狭帯域フィルターを差し込むことに
よって、あるいは超音波光学チューブナルフィルター
（AOTF）あるいは液晶チューナブルフィルター（LCTF）
を用いて電子的に周波数帯を走査することによって、情
景のすべてのピクセルに対する光を同時に異なる波長で
一度にろ過することによって構築される。下記を参照。
上記に説明された格子が備えられたスリット・タイプ結
像分光計と同様に、フィルターに基づくスペクトル分散
方法が用いられる場合は、光の大部分は、いつも拒絶さ
れている。事実、特定波長での画像全体の測定は、測定
される瞬間波長外のすべての光子は阻まれCCDに到達し
ないゆえに可能である。干渉分光分析法がフィルター及
び格子による方法に勝る感度をもつことの利点は、この
技術において、マルチプレックスあるいはフェルゲット
（Fellgett）利点として知られている。
AOTFs及びLCTFs等のチューナブルフィルターは、可動
部品がなく、用いられる装置のスペクトル範囲における
特定の波長に調整可能である。チューナブルフィルター
をスペクトル結像のための分散方法として用いる一つの
利点は、任意の波長アクセス、すなわち、いかなる所望
の順序においても、フィルター・ホイールを用いること
なく複数の波長において画像の輝度が測れる能力にあ
る。しかし、AOTFs及びLCTFsには次の不利な点がある。
（ｉ）制限されたスペクトル範囲（通常、λmax＝２λm
in）、このスペクトル範囲外の他の光全てが遮られなけ
ればならない、（ii）感温性、（iii）低い透過度、（i
v）感偏光性及び（ｖ）AOTFsの場合、波長走査中に画像
がずれる影響。
すべてのタイプのフィルター及びチューナブルフィル
ターに基づくシステムは、スペクトル解像度の制限、低
い感度、そしてデータを解釈し表示するための使用が容
易で精巧なソフトウェア・アルゴリズムがないという理
由で、何年もの間いかなる用途に対してもスペクトル結
像に、うまく広範囲に利用されてはいない。
上記の点で有利な、画像のスペクトル分析のための方
法及び装置は、1995年２月21日に出願されたカビブ（Ca
bib）氏他の米国特許出願第08/392,019号、現在の1996
年７月23日に発行された米国特許第5,539,517号に開示
されている。その内容は、従来のスリットあるいはフィ
ルター・タイプの結像分光計と比較し、必要フレーム時
間をかなり減少させSN比をかなり増し、ライン走査を必
要とせずに、画像の、集められた入射光から利用可能な
すべての情報を利用する画像スペクトル分析の方法及び
装置を提供するという目的において、参照として、ここ
に完全に明らかにされたものとして含まれる。本発明に
よれば、情景からの入射光を集めることによって情景の
各ピクセルのスペクトル輝度を測る、情景の光学的イメ
ージを分析する方法が提供される。これは、各ピクセル
から発散される光のスペクトル輝度の一次結合の所定セ
ットに対応する被変調光を出力する干渉計を介して光を
通過させ、検出アレイ上に干渉計から出力された光を集
束させ、全てのピクセルに対して独立且つ同時に干渉計
内に生成される光路差（OPD）を走査し、その各ピクセ
ルのスペクトル輝度を測るために検出アレイの出力を処
理する（個別にすべてのピクセルの干渉写真を作る）も
のである。この方法は、全干渉計、干渉計内の要素、あ
るいは入ってくる光の入射角を移動することによって干
渉写真を作るためにOPDが変えられる種々のタイプの干
渉計を利用することによって実践される。これら全ての
ケースにおいては、スキャナーが干渉計の一走査を完了
すると、情景すべてのピクセルに対する干渉写真が完成
する。上記の特徴をもつ装置は、上記に説明されたよう
に干渉計を利用する点で、従来のスリット及びフィルタ
ー・タイプの結像分光計とは異なるため、集められるエ
ネルギーがアパーチャあるいはスリットで制限されるこ
とはなく、また、入ってくる波長が狭帯域の干渉あるい
はチューナブルフィルターで制限されることもなく、シ
ステムの処理能力はかなり増す。したがって、干渉計に
基づく装置は、分析されるべき情景の入射光から利用可
能なすべての情報を利用するものであり、これによっ
て、測定時間をかなり減少させSN比（すなわち、感度）
をかなり増やす。例えば、「地球及び惑星の遠隔測定の
ための結像分光計」［John B.Wellman（1987）Imaging
Spectrometers for Terrestrial and Planetary Remote
Sensing,SPIE Proceedings,Vol.750,p.140］に説明さ
れた「ほうき」デザインを考察してみる。ｎを直線アレ
ー内における検出器の数、m x mをフレーム内における
ピクセル数及びＴをフレーム時間とする。アレーのすべ
ての検出器について合計される、一つのフレーム内の各
ピクセルに使われる合計時間は、nT/m2である。米国特
許出願第08/392,019号に説明された発明の方法において
同じサイズのアレー及び同じフレーム・レートを用いる
と、ある特定のピクセル上のすべての検出器について合
計された合計時間は同じnT/m2である。しかし、従来の
格子による方法においては、波長解像度がその範囲の1/
nであるため、いつも各検出器に検出されるエネルギー
は合計の1/n程度であるのに対して、米国特許出願第08/
392,019号に説明された発明の方法においては、変調関
数は、大きなOPD範囲の平均が50％の（例えば、ファブ
リ−ペロがある低フィネス・エアリー関数等のシヌソイ
ド（マイケルソン）あるいは類似の周期関数）振動関数
であるため、エネルギーは単一性のあるものである。干
渉法のテキスト（例えば、「干渉分光分析法の原理」
［Chamberlain（1979）The Principles of interferome
tric spectroscopy,John Wiley and Sons,pp.16−18 an
d p.263］を参照）に述べられているフェルゲット利点
（あるいはマルチプレックス利点）の基準処置に基づけ
ば、本発明による装置の測定SN比が、ノイズ制限の場合
には、ノイズ・レベルが信号から独立した状態で（シス
テムあるいは背景のノイズが制限された状況）n0.5の因
子によって、また、その制限が信号光子ノイズによる場
合には、狭いピークの波長の、スペクトル範囲内の、あ
る特定の波長にある信号の平均信号への比の平方根によ
って改善されることを示すことが可能である。したがっ
て、米国特許出願第08/392,019号に説明された発明によ
れば、すべての必要なOPDsは、スペクトルを再構築する
のに必要なすべての情報を得るために、情景のすべての
ピクセルに対して同時に走査される。このため、スペク
トル情報は結像情報と同時に集められる。本発明は、遠
隔測定のための望遠鏡、実験室での分析のための顕微
鏡、工場監視及び医学用画像診断や治療、その他のファ
イバー・オプティックス等、多くの異なる光学的構成に
用いられ得る。
継続出願（参照として含まれる、カビブ（Cabib）氏
他の1995年12月12日に出願された米国特許出願第08/57
1,047号）においては、その目的は、生物学的研究、医
学的診断及び治療のためのスペクトル結像方法を提供す
ることであった。この方法は、高い立体的なスペクトル
解像度で、立体的組織（すなわち、分布）を検出するた
めに、また、細胞及び組織の元来の構成要素、構造、小
器官、そしてタグを付けるプローブ（例えば、蛍光プロ
ーブ）や光の伝達、反射、散乱及び蛍光放射を行うのに
用いる薬等の投与された構成要素を数量化するために用
いられる。米国特許出願第08/571,047号には、DNAハイ
ブリダイゼーションにおける六つの遺伝子座特定プロー
ブ（各遺伝子座は異なる染色体上に位置する）による細
胞分裂間期の蛍光において、米国特許出願第08/392,019
号に述べられたスペクトル結像装置を使用することが、
他の生物学的及び医学的用途と共に述べられている。
スペクトル生体結像システムは、潜在的に、画像内の
立体的分布及び構成を調べようとする化学物質構成要素
間に微妙なスペクトル差が存在するすべての用途に有用
である。測定は、全く、米国特許出願第08/392,019号に
説明されたシステムに付けられたいかなる光学系を用い
ても実行可能である。例えば、投与された蛍光発蛍光団
あるいは発蛍光団の組合せと併せて蛍光顕微鏡を用いて
もよい。
蛍光測定は、発光スペクトルがシステム感度のスペク
トル範囲内にあるという条件の下で、特殊な用途に対し
て、（障壁フィルター、励起フィルター及び二色性ミラ
ーからなる）いかなる基準フィルター・キューブ、カス
タマイズされたいかなるフィルター・キューブあるいは
フィルター・キューブの組合せで行ってもよい。
ヒューマン・ゲノム・プロジェクト（Human Genome P
roject:HGP）の主要な利益の一つは、病んだ遺伝子や他
の染色体領域及び構造に対する多数の核酸プローブの分
離がある。このことは、DNA診断に対する興味を刺激し
た。これは、開発される試験の数及び種類がこれらのプ
ローブに依存しているためである。近年は、蛍光DNAハ
イブリダイゼーション（FISH）に対する興味が盛んであ
る。この蛍光ハイブリダイゼーションは、調べられる染
色体領域を補足する特定の核酸分子に共役反応された蛍
光部分（本文中プローブと呼ぶ）でマークし、続いて蛍
光顕微鏡検査法によって蛍光部分を視覚化する処理であ
る。
基礎科学研究所での従来の用途と共に、医療現場でFI
SH技術を用いる明らかな傾向がある。FISHは細胞遺伝学
への高度なアプローチであると見られる。FISHから得ら
れる染色体についての情報量は、DNAバンディング法に
よる基準核型から得られる情報量を遥かに上回ることは
明らかである。さらに、典型的な（分裂中期）細胞遺伝
学と比較すると、細胞分裂間期細胞遺伝学等の技術を用
いることによって診断情報がより速やかに得られる。
本発明によれば、蛍光顕微鏡の視野内のすべてのピク
セルから同時に蛍光スペクトルを獲得可能な、また、一
回の測定で多数のプローブの位置を同時に検出可能なFI
SH結像方法が提供される。染色体特性プローブ（すなわ
ち、染色体ペイント）及び奇抜なラベル付け戦略を用い
ることによって、この方法は、各染色体が異なる色（す
なわち、人間の男性の核型のために異なる24色、女性の
ために23色）で彩色された状態でのFISH核型を生成する
ことが可能である。この方法は、非常に高い試料処理能
力をもたらし、本質的に無制限のプローブ数の分析を可
能にする。
したがって、人間等の種からの、蛍光彩色された染色
体の完全なセット及び／あるいは多数の遺伝子座を検出
するために、多数の染色体ペイント及び／あるいは各々
が異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付
けされた遺伝子座特定プローブを用いて、蛍光DNAハイ
ブリダイゼーションを検出し分析するスペクトル結像方
法に対する広い必要性が認められるため、この方法を獲
得することは非常に有利である。
本発明の概要 本発明によれば、各々が異なる発蛍光団あるいは発蛍
光団の組合せでラベル付けされた多数の染色体ペイント
及び／あるいは遺伝子座特定プローブを用いる蛍光DNA
ハイブリダイゼーション（以下、「ハイブリダイゼーシ
ョン」と同じ意味で「交雑」という用語を用いることが
ある。）を検出し分析することを目的とするスペクトル
結像方法が提供される。この方法は、立体解像度及びス
ペクトル解像度が高感度であり、多数の発蛍光団及び／
あるいは発蛍光団の組合せを同時検出可能であるため、
人間等の核種からの染色体が蛍光彩色された完全なセッ
ト及び／あるいは多数の遺伝子座の検出及びカラー核型
の提供のために用いられる。
さらに、下記に説明される本発明の実施例における特
徴によれば、この方法は、（ａ）スペクトル的に映像化
される試料を準備するステップ、（ｂ）結像分光計に光
学的に繋がれた光学装置を通して試料を視検するステッ
プ及び（ｃ）記録された第一のスペクトル・キューブの
データを数学的アルゴリズムを用いて解釈するステップ
からなる。なお、光学装置及び結像分光計は、次のプロ
セスによって、試料の各ピクセルのスペクトルを測定す
るためのものである。（ｉ）コリメーター光学系を用い
て試料のすべてのピクセルから同時に入射光を集め、
（ii）この平行入射光を複数の要素を持つ干渉計システ
ムを介して通過させることで、まず光を二つのコヒーレ
ント光線へ分割させ、干渉計内の各々異なる方向へ導
き、その後にこれら二つのコヒーレント光線を再び結合
させて互いに干渉させ放射光線を形成し、（iii）検出
器要素の二次元アレイを持つ検出器上にこの射出光線を
集束させる焦点調節光学系を介して射出光線を通過させ
ることで、測定の全持続時間に渡る各瞬間において、検
出器要素の各々が試料の一つの常に同じピクセルの画像
をもたらすため、試料の実像は検出アレイの平面上に動
かず、測定中のいかなる時においても、画像は明確に認
識可能であり、検出器要素の各々は、異なる波長でピク
セルによって発光された光輝度の特定の一次結合である
信号を生成し、なお、この一次結合は瞬間的な光路差の
関数であり、（iv）干渉計システムの要素の一つあるい
はいくつかを回転させる、あるいは移動させる（すなわ
ち、走査）ことで、干渉計システムによって生成された
二つのコヒーレント光線間の光路差が試料のピクセルの
すべてに対して同時に走査され、（ｖ）第一のスペクト
ル・キューブのデータを形成するために、記録装置を用
いて検出器要素の各々の信号を時間の関数として記録す
る。
さらに、下記の好適実施例によれば、この方法は、
（ｄ）解釈されたスペクトル・キューブのデータをマッ
プし表示するステップからなる。
さらに、下記の好適実施例によれば、光学装置は蛍光
顕微鏡である。
さらに、下記の好適実施例によれば、平行光は、試料
から発光される蛍光である。
さらに、下記の好適実施例によれば、試料から発光さ
れた平行光は、投与されたプローブ蛍光である。
さらに、下記の好適実施例によれば、光は、レーザ
ー、白色光、フィルターを介した光、紫外光及び小さな
波長範囲を持つ光等の光源から生じる。
さらに、下記の好適実施例によれば、光は多数の光源
から生じ、これら光源は同時にあるいは連続的に作動す
る。
さらに、下記の好適実施例によれば、二次元アレイ
は、ビデオ・レートCCD、冷却高ダイナミック・レンジC
CD、増感CCD及び時間ゲート増感CCDからなるグループか
ら選択される。
さらに、下記の好適実施例によれば、試料は、分裂間
期の細胞、有糸分裂中の細胞及び減数分裂中の細胞であ
る。
さらに、下記の好適実施例によれば、細胞は人間から
のものである。
さらに、下記の好適実施例によれば、細胞は、がん細
胞、血液細胞、胎児の細胞あるいは悪性腫瘍の細部であ
る。
さらに、下記の好適実施例によれば、試料は細胞であ
り、光はプローブによって誘発され、このプローブは特
定の細胞構成要素に結びつき、この方法は、細胞構成要
素の存在あるいはレベルを検出するためにある。
さらに、下記の好適実施例によれば、プローブは共役
蛍光部分を含み、誘発はこの蛍光部分の蛍光発光であ
る。
さらに、下記の好適実施例によれば、プローブがさら
に核酸分子を含み、方法は、細胞における、この核酸分
子と交雑する核酸の存在あるいはレベルを検出するため
にある。
さらに、下記の好適実施例によれば、細胞の核酸は、
デオキシリボ核酸及びリボ核酸である。
さらに、下記の好適実施例によれば、蛍光部分は、ス
ペクトラム・オレンジ、スペクトラム・グリーン、アク
ア、テキサス・レッド、FITC、ローダミン、フルオレセ
イン、カスケード・ブルー及びそれらの組合せである。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、試料におけるピクセルの各々のスペクトルのポ
イント演算分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、ポイント演算分
析は、試料におけるピクセルの各々のスペクトルを、変
換関数に従ってスカラーへマップすることを含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、ポイント演算分
析は、試料におけるピクセルの各々のスペクトルを、変
換関数に従ってもう一つのスペクトルへマップすること
を含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムが形態学的分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、試料におけるピクセルの各々に対して、基準ス
ペクトルからのスペクトル差を計算する相似性マッピン
グ分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、相似性マッピン
グ分析は、明るいピクセルが小さなスペクトル差に対応
し暗いピクセルが大きなスペクトル差に対応するグレー
スケール画像あるいは擬似色画像を生成する。
さらに、下記の好適実施例によれば、相似性マッピン
グ分析は、明るいピクセルが大きなスペクトル差に対応
し暗いピクセルが小さなスペクトル差に対応するグレー
スケールの画像あるいは擬似色画像を生成する。
さらに、下記の好適実施例によれば、スペクトル差
は、ピクセルの各々のスペクトルと基準スペクトルとの
間の差の絶対値の、予め定められた波長範囲に対する不
定積分として定義されたスカラーである。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、ピクセルの各々のスペクトルに対して、複数の
基準スペクトルからのスペクトル差を計算する分類マッ
ピング分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、分類マッピング
分析は、複数の基準スペクトルの一つに対して所定最大
スペクトル差を持つピクセルのグループが、所定の人工
色で着色された多色画像を生成する。
さらに、下記の好適実施例によれば、スペクトル差
は、ピクセルの各々のスペクトルと複数の基準スペクト
ルの一つとの間の差の絶対値の、予め定められた波長範
囲に対する不定積分として定義されるスカラーである。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムが主要構成要素を分析する。
さらに、下記の好適実施例によれば、主要構成要素分
析は、（ａ）多数の波長が用いられたときには励起源の
波長を含めて、全てのピクセル及び測定の波長に対する
共変マトリクスを構築すること、（ｂ）共変マトリクス
を対角化し、独立直交スペクトル基底要素のすべてを見
いだすこと、（ｃ）基底要素のいずれが試料の特定の特
徴にタグをつけるかを見いだすことを含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムが一次結合分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析
は、第一のスペクトル・キューブのデータ及び第二のス
ペクトル・キューブのデータに属する対応する対のピク
セルの対応する波長の間に算術関数を適用し、その結果
として第三のスペクトル・キューブのデータを得ること
を含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析
は、二つのスペクトル・キューブのデータの平均化、時
間変化のフォローアップ及びスペクトルの正規化等の目
的を満たす。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析
は、算術関数によって、ピクセルの各々のスペクトルの
各波長に任意のスカラーを適用することを含み、この関
数は、加法、減法、乗法、除法及びそれらの組合せであ
る。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析
は、試料の背景領域に位置するピクセルのスペクトル
が、試料のピクセルのスペクトルから引き算される背景
除去を行うものである。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析は
較正方法のためにあり、この較正方法においては、試料
を視検する以前に測定されたスペクトルが、試料のピク
セルのスペクトルを得るために用いられる。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムが光学密度分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、光学密度分析
は、解釈された光学密度マップの画像を得るためにあ
る。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、予め定められた波長範囲を用いて、赤、緑、青
のカラー画像を計算する。
さらに、下記の好適実施例によれば、赤、緑、青のカ
ラー画像がコントラスト延伸アルゴリズムによって修正
される。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、ピクセルのスペクトルの各々について二つの異
なる波長における輝度間の比を計算する。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、ピクセルのスペクトルの各々について二つの異
なる波長における輝度間の比を計算し、この計算された
比に従ってピクセルの各々を、より明るいあるいはより
暗い人工色で彩色する。
さらに、下記の好適実施例によれば、方法は、試料へ
投与された多数の発蛍光団のスペクトルを識別するため
にある。
さらに、下記に説明される好適実施例によれば、この
方法は、蛍光DNAハイブリダイゼーションであって、次
のステップからなる。（ａ）少なくとも一つの核酸プロ
ーブで交雑された染色体を持つ細胞核を提供するステッ
プ、なお、この少なくとも一つの核酸プローブの各々
は、少なくとも一つの核酸分子を含み、この少なくとも
一つの核酸分子の各々は、少なくとも一つの発蛍光団で
ラベル付けされるものであり、（ｂ）蛍光顕微鏡を介し
て細胞核を視検するステップ、なお、この蛍光顕微鏡
は、結像分光計に光学的に繋がれており、これら蛍光顕
微鏡及び結像分光計は、細胞核の各ピクセルのスペクト
ルを得るためのものであり、（ｉ）コリメーター光学系
を用いて細胞核のすべてのピクセルから同時に入射光を
集め、（ii）複数の要素を持つ干渉計システムを介して
平行入射光を通すことによって、光をまず二つのコヒー
レント光線に分け、干渉計内の各々異なる方向へ導いた
後に二つのコヒーレント光線を再び結合させて各々を他
と干渉させ射出光線を形成し、（iii）検出器要素の二
次元アレイを持つ検出器にこの射出光線を集束させる焦
点調節光学系を介して射出光線を通過させることによっ
て、測定の全持続時間に渡る各瞬間において、検出器要
素の各々が細胞核の常に同一ピクセルの画像をもたらす
ため、細胞核の実像は検出アレイの平面上にあって動か
ず、測定中のどの時間においても画像は明確に識別可能
であり、また、検出器要素の各々は、異なる波長でピク
セルによって発光される光輝度の特定の一次結合である
信号を生成するが、この一次結合は瞬間的な光路差の関
数であり、（iv）干渉計システムの要素の一つあるいは
いくつかを回転あるいは移動する（すなわち、走査す
る）ことによって、細胞核のすべてのピクセルに対して
干渉計システムによって生成された二つのコヒーレント
光線の間の光路差が同時に走査され、（ｖ）第一のスペ
クトル・キューブのデータを形成するために記録装置を
用いて、検出器要素の各々の信号を時間の関数として記
録することによって、細胞核の各ピクセルのスペクトル
を得るためのものであり、（ｃ）記録された第一のスペ
クトル・キューブのデータを数学的アルゴリズムを用い
て解釈するステップからなる。
さらに、下記の好適実施例によれば、少なくとも一つ
の核酸分子は、少なくとも一つの遺伝子座、少なくとも
染色体の一つの分裂片、インサートを含む少なくとも一
つの酵母人工染色体、インサートを含む少なくとも一つ
のプラスミド、インサートを含む少なくとも一つのコス
ミド、インサートを含む少なくとも一つのファゲミド、
インサートを含む少なくとも一つのウイルス・ベクタ
ー、一つの核種の完全なゲノム、がん組織の完全なゲノ
ム及びそれらの組合せである。
さらに、下記の好適実施例によれば、少なくとも一つ
の発蛍光団は、少なくとも一つの蛍光性組み合わせ染料
である。
さらに、下記の好適実施例によれば、細胞核は、分裂
間期中の細胞核、有糸分裂中の細胞核及び減数分裂中の
細胞核である。
さらに、下記の好適実施例によれば、核酸プローブの
数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24
あるいは24より大きな数であり、プローブの各々は、異
なる発蛍光団あるいは発蛍光団の異なる組合せを含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、染色体が、細胞
分裂間期の染色体、有糸分裂中の染色体及び減数分裂中
の染色体である。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムが、細胞核におけるピクセルの各々のスペクトルの
ポイント演算分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、ポイント演算分
析は、変換関数に従って、細胞核におけるピクセルの各
々のスペクトルをスカラーへマップすることを含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、ポイント演算分
析は、変換関数に従って、細胞核におけるピクセルの各
々のスペクトルをもう一つのスペクトルへマップするこ
とを含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは形態学的分析であり、形態学的分析は細胞核内の
染色体の相対的な大きさを測定する。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、ピクセルの各々のスペクトルについて少なくと
も一つの基準スペクトルからのスペクトル差を計算する
分類マッピング分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、分類マッピング
分析は、複数の基準スペクトルの一つからの所定最大ス
ペクトル差を持つピクセルのグループが所定人工色で彩
色される多色画像を生成する。
さらに、下記の好適実施例によれば、スペクトル差
は、ピクセルの各々のスペクトルと複数の基準スペクト
ルの一つとの間の差の絶対値の予め定められた波長範囲
に対する不定積分として定義されるスカラーである。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムが主要構成要素分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、主要構成要素分
析は、（ａ）多数の波長が用いられるときは励起源の波
長をも含めて、全てのピクセル及び測定の波長に対する
共変マトリクスを形成すること、（ｂ）共変マトリクス
を対角化し、独立直交スペクトル基底要素のすべてを見
いだすこと、（ｃ）基底要素あるいはそれらの組合せの
いずれが、細胞核における特定の特徴をタグするかを見
いだすことを含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムが一次結合分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析が
スペクトルの正規化のためにある。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析
は、算術関数によって、ピクセルの各々のスペクトルの
すべての波長に任意のスカラーを適用することを含み、
関数は、加法、減法、乗法、除法及びそれらの組合せで
ある。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析
は、細胞核の背景領域に位置するピクセルのスペクトル
が、細胞核のピクセルのスペクトルから引き算される背
景除去のためにある。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析
は、細胞核を視検する前に測定されたスペクトルが、細
胞核のピクセルのスペクトルを割るためにある較正方法
のためのものである。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、予め定められた波長範囲を用いて、赤、緑、青
のカラー画像を計算する。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、ピクセルのスペクトルの各々について、異なる
二つの波長における輝度の間の比を計算する。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、ピクセルのスペクトルの各々について、異なる
二つの波長における輝度の間の比を計算し、この計算さ
れた比に従って、ピクセルの各々をより明るいあるいは
より暗い人工色で彩色する。
さらに、下記の好適実施例によれば、方法は、胎児の
細胞のカラー核型、白血球のカラー核型、悪性細胞のカ
ラー核型及び悪性腫瘍の検査が行われる細胞のカラー核
型を提供すること等の用途のためにある。
さらに、下記の好適実施例によれば、胎児の細胞は、
妊娠女性の末梢血液から単離された絨毛膜絨毛細胞及び
／あるいは胎児細胞である。
さらに、下記の好適実施例によれば、方法は、人間の
染色体21、人間の染色体バンド21q22、人間の染色体バ
ンド21q22の分裂片、人間の染色体18、人間の染色体18
の分裂片、人間の染色体13及び人間の染色体13の分裂片
の三染色体を検出するためにある。
さらに、下記の好適実施例によれば、悪性腫瘍の検査
が行われた細胞のカラー核型を提供することは、カラー
の転座マップを得るためである。
さらに、下記の好適実施例によれば、悪性細胞のカラ
ー核型を提供することは、カラーの転座マップを得るた
めである。
本発明は、スペクトル的に類似したしかし幾分異なる
蛍光プローブの多数を同時に検出するのに十分な感度を
持つDNAハイブリダイゼーションのための方法を提供す
ることによって現時点で既知の構成の欠点を指摘する。
ゆえに、本発明の方法は、各染色体対が、異なるRGBあ
るいは人工色に現われるカラー核型、多数の遺伝子座を
同時にマップする遺伝子座マッピング、カラー核型作成
と多数遺伝子型マッピングとの組合せ及び染色体異常に
対する容易に利用可能な遺伝子検査を提供することが可
能である。
図面の簡単な説明 本発明が、一例として、添付図面を参照してここに説
明される。
図１は従来のスリット・タイプ結像分光計（従来の技
術）を示す。
図２は、米国特許出願第08/392,019号（従来の技術）
に従って構成された結像分光計の主な構成要素のブロッ
ク図である。
図３は、静止型の干渉計、すなわち、米国特許出願第
08/392,019号（従来の技術）による結像分光計に用いら
れたサニャック干渉計を示す。
図４は、選択されたスペクトル範囲を強調するための
疑似RGB（赤、緑及び青）色の鮮明度を示す。各疑似色
の輝度は、一つの曲線に掛け合わせた後に曲線下の面積
を積分することによって計算される。
図5a、5b及び5cは、テキサス・レッド及びローダミン
に付けた二つの異なるプローブで行われた細胞分裂間期
のFISHを示し、（ａ）は顕微鏡から見えるオリジナル画
像である。（ｂ）は、本発明の方法によって測定され処
理された後の同じ試料である。（ｃ）は、テキサス・レ
ッド及びローダミン発蛍光団の蛍光スペクトルである。
図6a、6b及び6cは、異なる発蛍光団で各々がラベル付
けされた六つの異なるプローブを用いて行われた細胞分
裂間期のFISHを示す。（ａ）は顕微鏡から見えるオリジ
ナル画像である。細胞はDAPIで対比染色された。（ｂ）
は、本発明の方法によって測定され処理された後の同じ
試料である。（ｃ）は、六つの発蛍光団の蛍光スペクト
ルである。
図7a、7b、7c、7d及び7eは、まとめて、図8a及び9aの
画像の24ピクセルについて24の正規化されたスペクトル
を示す。24の各々は、人間の異なる染色体から得られた
ものである（１−22、Ｘ及びＹ）。染色体の各々は、下
記表３及び４に詳述される異なる染色体ペイントを用い
て塗られた。
図8a及び8bは、本発明の方法によって、人間の男性の
24の染色体（１−22、Ｘ及びＹ）から得られた（白黒
の）RGB画像及びカラー核型である。染色体の各々は、
下記表３及び４に詳述される異なる染色体ペイントを用
いて塗られた。
図9a及び9bは、各々、図8a及び8bのカラー版である。
図10a及び10bは、各々、女性の乳がん細胞染色体スプ
レッドについての、（白黒の）従来の蛍光顕微鏡で得ら
れるDAPIＲバンディング写真と、図9a及び9bに示された
染色体ペイント及び本発明の方法を用いて得られるRGB
カラー核型である。
図11a及び11bは、各々、図10a及び10bに対するオリジ
ナルのさらにはっきりしたプレゼンテーション及びカラ
ーのプレゼンテーションである。
図12は、各々、図11a及び11bに示されたDAPIＲ−バン
ドと、図11bから決定され図9bに示されたカラー核型を
用いて解釈された転座した染色体の、解釈が施された輪
郭とを比較するプレゼンテーションである。
図13は図12のカラーのプレゼンテーションである。
実施例の説明 本発明は、各々が異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の
組合せでラベル付けされた多数の染色体ペイント及び／
あるいは遺伝子座特定プローブを用いて、蛍光DNAハイ
ブリダイゼーションを検出し分析するためのスペクトル
結像方法に関する。この方法は、立体解像度及びスペク
トル解像度が高感度であり、多数の発蛍光団及び発蛍光
団の組合せを同時に検出することが可能である。このた
め、本発明の方法は、人間等の種から、蛍光彩色された
染色体の全セット及び／あるいは多数の遺伝子座を検出
するために用いられるため、カラー核型を提供すること
ができる。
図４から９に示された本発明をより良く理解するため
に、まず、図１に示される、検出器の二次元アレイを利
用する従来のスリット・タイプ結像分光計の構造及び作
動（すなわち、従来の技術）が参照される。
したがって、図１に示された従来の技術のスリット・
タイプ結像分光計は、４に概略的に示された情景から入
射光を集め、視野を定めるためにスリット６によって占
められた第一の焦点面に情景４からのかなり平行な光を
集束するための、２に示される採光光学系を含む。スリ
ット６から出る光は、コリメータ・レンズ８で一直線に
され、種々の波長を分離するためにスペクトル分散要素
10（例えば、回折格子）を介して通される。スペクトル
分散要素10からの出力は、第二の焦点面にある二次元検
出アレイ14上に集束レンズ12によって集束される。検出
アレイ14の出力はシグナル・プロセッサ16に送られる。
図１の従来の技術の結像分光計に示された検出器14の
二次元アレイにおいては、システム（例えば、矢13によ
って示されたライン走査のラスタ移動）の移動が一次元
に沿った走査をもたらす。第二の次元に沿った走査は、
システムの動きの方向に直角に向けられたスリット６に
よってもたらされる。したがって、スリット６は、アレ
イ14内の各検出器が単一波長で１ピクセルからの入力の
みを受けることを保証する。これは、各ピクセルのスペ
クトルを分離するために必要である。
発明の背景のところで、また上記にも述べたように、
図１に示された従来の技術の方法の欠点は、一つのフレ
ームのピクセル全てからのエネルギーが実際に光学系に
よって同時に集められるけれども、どの時点において
も、それらピクセルの大部分は測定されていないという
ことにある。その結果、このようなスリットを必要とし
ないシステムに比べて、必要とされるフレーム時間がか
なり増し、SN比（感度）はかなり減少する。
図２は、参照として含まれる1995年２月21日に出願さ
れたカビブ（Cabib）氏他の米国特許出願第08/392,019
号に開示された、改善された従来の結像分光計の主な構
成要素を表すブロック図である。この結像分光計は、本
発明の方法を実行するために最適に構成されている。
したがって、図２の従来の結像分光計は、20と符号が
付いた採光光学系、ブロック22で示された１次元スキャ
ナー、ブロック24で示された光路差（OPD）発生器ある
いは干渉計、ブロック26で示された一次元あるいは二次
元検出アレイ及びブロック28で示されたシグナル・プロ
セッサ及びディスプレイを含む。
システム20における重要な要素は、OPD発生器あるい
は干渉計24であり、それは、分析される情景の各ピクセ
ルから放射された光のスペクトル輝度の一次結合の所定
セットに対応する被変調光を出力するものである。干渉
計からの出力は検出アレイに集束される。したがって、
すべての必要な光学的位相差は、スペクトルの再構築に
必要なすべての情報を得るために、視野のすべてのピク
セルに対して同時に走査される。情景内のすべてのピク
セルのスペクトルは、結像情報と共に同時に集められる
ため、リアルタイムでの画像分析を可能にする。
米国特許出願第08/392,019号による装置は多種多様の
構成が可能である。特に、用いられる干渉計は、米国特
許出願第08/392,019号の関連する図面に示されるよう
に、他の鏡と組み合わせてもよい。
したがって、米国特許出願第08/392,019号によれば、
別タイプの干渉計を用いることも可能である。これらに
は、次のものが含まれる。
（１）光を変調するためにOPDが変えられる可動タイプ
干渉計、すなわち、スキャン厚があるファブリ−ペロ干
渉計、（２）採光光学系及びスキャナーから光線を受け
二つの光路に光線を分けるビーム・スプリッタを含むマ
イケルソン型干渉計、（３）オプションとして他の光学
的手段と結合されるサグナック干渉計（この干渉計内で
は、OPDが、入ってくる光の入射角に応じて変化する）
及び（４）米国特許出願に述べられた、四つの鏡とビー
ム・スプリッタがある干渉計。
図３は、OPDが入射角の入射角に応じて変化する干渉
計を利用して米国特許出願第08/392,019号に従って構成
された結像分光計を示す。光軸に対して小さな角度で干
渉計に入る光線は、この角度に対し直線的にかなり変化
するOPDを生じる。
図３の干渉計においては、すべてのピクセルの源30か
らのすべての光は、採光光学系31によって一直線にされ
た後、メカニカルスキャナー32によって走査される。光
は、ビーム・スプリッタ33を介して第一の反射鏡34へ、
そして第二の反射鏡35へ通される。この第二の反射鏡35
への光は、反射してビーム・スプリッタ33そして集束レ
ンズ36を介して検出器37（例えば、CCD）のアレイへ送
られる。この光線は、ビーム・スプリッタ33によって反
射された光線に、次の第二の反射鏡35によって反射され
た光線に、最後に第一の反射鏡34によって反射された光
線に干渉する。
一回の走査の最後には、すべてのピクセルがすべての
OPDを介して測定されてしまうため、情景の各ピクセル
のスペクトルはフーリエ変換によって再構築されること
が可能である。光軸に平行な光線は補正され、光軸に対
して角度（θ）にある光線は、ビーム・スプリッタ33の
厚さ、屈折率及び角度の関数であるOPDを生じる。小さ
な角度においてOPDはθに比例する。適切な逆変換を適
用することによって、また、注意深いブックキーピング
を行うことによって、すべてのピクセルのスペクトルが
計算される。
図３の構成においては、角度β（図３ではβ＝45度）
にあるビーム・スプリッタ上に入射する光線は、干渉計
をOPD＝０で通り抜けるが、一般の角度β−θで入射す
る光線は、次の式で与えられるOPDを生じる。
OPD（β，θ,t,n）＝ｔ［（n2−sin2（β＋θ））0.5 −（n2−sin2（β−θ））0.5＋2sinβsinθ］ （１） この式において、βはビーム・スプリッタ上への光線の
入射角であり、θは、光軸からの光線の角距あるいは中
央位置に対する干渉計の回転角度であり、ｔはビーム・
スプリッタの厚みであり、ｎはビーム・スプリッタの屈
折率である。
方程式１から、中央位置に対する正及び負の両角度を
走査することによって、すべてのピクセルに対する両面
の干渉写真が得られることが明らかであり、このこと
は、位相誤差を消去するに助けとなり、フーリエ変換の
計算により正確な結果が得られることになる。走査振幅
は、達成可能な最大OPDを決めるため、測定されたスペ
クトル解像度に影響を与える。角度ステップの大きさが
OPDステップを決定するが、OPDステップは、逆に、シス
テム感度の良い最も短い波長によって規定される。事
実、試料採取の定理（「干渉分光分析法の原理」［Cham
berlain（1979）The principles of interferometric s
pectroscopy,John Wiley and Sons,pp.53−55］を参
照）によれば、このOPDステップは、システム感度の良
い最も短い波長の半分よりも小さくなければならない。
考慮すべきもう一つのパラメータは、マトリクスにお
ける検出器要素の限られた大きさである。集束光学素子
を介して、この要素は、干渉計内に有限のOPDを生じ、
干渉写真に直角関数を巻き込む効果がある。このこと
は、結果として、短い波長におけるシステム感度の減少
を引き起こし、要素によって生じるOPD以下の波長に対
してはゼロに落ちてしまう。この理由のため、変調伝達
関数（MTF）の条件が満足していることを保証しなくて
はならない。すなわち、干渉計内に検出器要素によって
生じるOPDは、この計測器の感度を満たす最短波長より
も小さくなくてはならない。
したがって、米国特許出願第08/392,019号に開示され
た発明に従って構成された結像分光計は、ただ単に、視
野内のすべてのピクセルから来る光の輝度のみを測るも
のではなく、予め定められた波長範囲内の各ピクセルの
スペクトルをも測るものである。また、どの時点におい
ても、視野内の各ピクセルによって発せられた光が全て
より良く利用されるため、先に説明したように、フレー
ム時間をかなり減少し分光計の感度をかなり増加するも
のである。このような結像分光計は、種々のタイプの干
渉計、採光光学系及び集束システムを含んでもよく、そ
のため、医学的診断及び治療や生物学の研究における用
途、また、地質学や農業における調査等のための遠隔測
定を含む多種多様な用途に用いられ得るものである。
米国特許出願第08/392,019号に開示された発明による
結像分光計は、イスラエル共和国にあるスペクトル診断
社（Spectral Siagnostics Ltd.;Industrial Park,Migd
al Haemek,Israel）によって開発されたもので、下記に
スペクトラキューブ（SpectraCubeTM）として参照され
る。種々の光学的装置に光学的に接続されたスペクトラ
キューブ・システムが本発明の方法を実行するために用
いられた。スペクトラキューブ・システムには、下記の
表１にリストアップされた特徴がある。
a. 概要 上記の説明の通り、スペクトル画像は、スペクトル情
報を画像の立体的構成に結びつける、データの三次元ア
レイ（ｘ、ｙ、λ）である。ゆえに、スペクトル画像
は、その次元数の理由でスペクトル・キューブと呼ばれ
る、データのセットであり、得るに難しい、場合によっ
ては、得ることが不可能な特徴の抽出及び量の評価を可
能にするものである。分光分析法及びデジタル画像分析
は、巨大な量の文献によって著されている、共によく知
られている分野である（例えば、「デジタル画像処理の
基本」［Jain（1989）Fundamentals of Digital Image
Processing, Prentice−Hall International］を参
照）。次の論議は、主に、スペクトル情報と結像情報と
を単一のデータ・セット、すなわち、スペクトル・キュ
ーブに結合することの利点に焦点を 合わせる。
スペクトル・キューブの一つの可能な分析方法として
は、スペクトル・データと立体データとを個別に用いる
やり方がある。すなわち、スペクトル・アルゴリズムを
スペクトル・データに、また、二次元画像処理アルゴリ
ズムを立体データに適用することである。
スペクトル・アルゴリズムの例としては、アルゴリズ
ムが基準スペクトルとすべてのピクセルのスペクトルと
の間の類似性を計算し（すなわち、相似性マッピン
グ）、各ピクセルにおける輝度が「相似性」の程度に比
例するグレースケール（あるいは他のカラー）画像（す
なわち、相似性マップ）とすることを考える。このグレ
ースケール画像は、所望の特徴及びパラメータを引き出
すために、画像処理及びコンピュータビジョン技術（例
えば、画像の向上、パターン認識等）を用いることによ
ってさらに分析可能である。換言すれば、相似性マッピ
ングは、（予めライブラリに記憶された、またはその同
じスペクトル画像あるいは他のスペクトル画像のピクセ
ルに属する）基準スペクトルに対するスペクトル画像の
各ピクセルのスペクトル差の絶対値の不定積分を計算
し、グレースケールあるいは擬似色（白黒あるいはカラ
ー）画像を表示することを伴う。この画像においては、
明るいピクセルは小さなスペクトル差に対応し、黒いピ
クセルは大きなスペクトル差に対応する、あるいはその
逆である。
同様に、分類マッピングにおいても、基準スペクトル
としていくつかのスペクトルが採用されるが、相似性マ
ッピングで述べられたと同じ計算が行われ、そのいくつ
かの基準スペクトルの一つに最も類似しているという分
類に応じて、表示画像の各ピクセルは異なる所定の擬似
色で彩色される。
分離不可能な演算、すなわち、局所的なスペクトル情
報と隣接するピクセル間の立体的相関関係とを共に含む
アルゴリズムに基づくスペクトル画像アルゴリズムを適
用することも可能である（これらのアルゴリズムの一つ
は、下記に述べられるように、分析の主要な要素であ
る）。
スペクトル・キューブ（すなわち、Ｉ（ｘ、ｙ、
λ））等のすべての三次元（3D）データ構造を扱う場合
に当然生ずる根本的なことの一つとして、有意義な方法
でそのデータ構造を視覚化することが必要である。例え
ば共焦点顕微鏡によって得られた断層データ、Ｄ（ｘ、
ｙ、ｚ）等の他のタイプの3Dデータは、一般に、三次元
空間における異なる位置（ｘ、ｙ、ｚ）の輝度を各ポイ
ントが表すが、それとは異なり、スペクトル画像は、同
一二次元平面（すなわち、試料）の輝度を複数の異なる
波長で表す画像シーケンスである。このため、データの
スペクトル・キューブを捉える二つの直観的な方法とし
ては、画像平面（立体データ）を観察するか、あるいは
１ピクセルあるいはピクセルのセットの輝度を波長の関
数として三次元の凹凸表示で観察するかのいずれかであ
る。一般に、画像平面は、どの単一波長で測定された輝
度をも表示するために、あるいは、すべての画像ピクセ
ルにおける所望のスペクトル領域にスペクトル分析アル
ゴリズムを適用した後に結果として生じるグレースケー
ル画像を表示するために用いられることが可能である。
スペクトル軸は、一般に、どの所望のピクセルの近傍で
も行える（例えば、スペクトルを平均する）若干の立体
的な演算から結果として生じるスペクトルを示すために
用いられる。
例えば、スペクトル画像を、単純な単色カメラから得
られるような画像に類似したグレースケール画像とし
て、あるいは、重要な特徴を写像し強調表示するために
一つあるいはいくつかの人工色を利用する多色画像とし
て表示することが可能である。このようなカメラは、単
に、CCDアレイのスペクトル範囲（例えば、400ナノメー
トルから760ナノメートルに）上の光学的信号を統合す
るため、スペクトル軸に沿って次のように積分すること
によって、3Dスペクトル画像データベースから「同等」
の単色CCDカメラ画像を計算することが可能である。
方程式２において、ｗ（λ）は、あるスペクトル範囲
に適切に数学的重みがかけられたスペクトル画像の統合
にすべてが基づいている種々のグレースケール画像を計
算する場合に最大の柔軟性を提供する一般的な加重応答
関数である。例えば、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）及び青（Ｂ）
に対する三刺激値関数に各々対応する三つの異なる加重
関数｛wr（λ）、wg（λ）、wb（λ）｝で方程式（２）
を評価することによって、従来のRGBカラー画像を表示
することが可能である。また、有意義な従来にない（疑
似）カラー画像を表示することも可能である。図４はこ
の単純なアルゴリズムの能力を示す例である。｛wr、w
g、wb｝が、目的の１スペクトル「内に」分配されたガ
ウス関数となるように選べば、この場合に表示される擬
似色画像は、単に、加重関数に対応するスペクトル領域
内のデータだけを強調することになり、これら３領域に
おけるスペクトル差がより明確に検出されることを可能
にする。
b. ポイント演算 ポイント演算は、単一ピクセル（すなわち、一度に１
ピクセルのみ）に実行されるものと定義される。例え
ば、グレースケール画像においては、ポイント演算は、
所定の変換関数に従い各ピクセルの輝度をもう一つの異
なる輝度へマップするもの（輝度関数）である。このタ
イプの変換の特別な場合としては、各ピクセルの輝度を
定数で掛け算することである。
ポイント演算の概念は、スペクトル画像にも拡張され
得るものである。ここでは、各ピクセルはそれ自身の輝
度関数（スペクトル）、すなわち、ｎ次元ベクトルV1
（λ）、λ∈［λ１、λｎ］を有する。スペクトル画像
に適用されるポイント演算は、変換関数に従い各ピクセ
ルのスペクトルをスカラー（すなわち、輝度値）へマッ
プするものと定義されることも可能である。
v2＝ｇ（V1（λ））；λ∈［λ1,λｎ］ （３） 方程式３によってグレースケール画像を作ることは、
このタイプのポイント演算の例である。より一般的な場
合には、ポイント演算は、変換関数によって各ピクセル
のスペクトル（ベクトル）をもう一つの異なるベクトル
へマップするものである。
V2（１）＝ｇ（V1（λ））;1∈［1,N］，λ∈［λ1,λｎ］ （４） ただし、Ｎ≧ｎ この場合、スペクトル画像はもう一つのスペクトル画
像に変換される。
さて、異なるスペクトル画像の対応するピクセル間で
の演算を含むようにポイント演算の定義を拡張する。こ
のタイプのアルゴリズムの重要な例としては光学密度の
分析がある。光学密度は、透過スペクトルよりも高いダ
イナミックレンジで分光分析されるオブジェクトの領域
を強調表示しグラフで表すために用いられる。光学密度
は、対数演算によって透過に関連づけられるため、常に
正の関数である。光学密度と測定されたスペクトルとの
間の関係は、ランベルト・ベールの法則によって与えら
れる。
ここで、OD（λ）は、波長の関数としての光学密度で
あり、Ｉ（λ）は測定されたスペクトルであり、I0
（λ）は測定された基準スペクトルであり、τ（λ）は
試料のスペクトル透過率である。方程式５は、すべての
波長に対し、すべてのピクセルについて計算される。I0
（λ）は（１）ODが計算されるスペクトル・キューブ内
のピクセル、（２）第二のキューブ内の対応するピクセ
ル及び（３）ライブラリからのスペクトルから選択され
る。
光学密度は、測定システムのスペクトル感度あるいは
CCD検出器の不均一性に依存しないことに注意すべきで
ある。このアルゴリズムは、試料内の吸収体の吸収係数
及び試料厚が既知であるなら、その吸収体の相対濃度
を、ある場合には絶対濃度をマップするのに有用であ
る。ここで用いられる用語「レベル」は、用語「量」、
「相対量」、「相対濃度」及び「絶対濃度」としても用
いられることに注意すべきである。
他の例としては、種々の一次結合分析が含まれ、例え
ば、次のようなものがある。（１）新しいスペクトル・
キューブをもたらすために、加法、減法、乗法、除法、
それらの組合せ等の算術関数によって、任意のスペクト
ルをスペクトル画像内の各ピクセルのスペクトルに適用
する。この場合、各ピクセルについて結果として生じる
スペクトルは、第一のキューブの各スペクトルと選択さ
れたスペクトルとの間の和、差、積、比あるいはこれら
の組合せである。（２）上記に説明されたように、算術
関数によって任意のスカラーをスペクトル画像の各ピク
セルのスペクトルに適用する。
このような一次結合は、例えば、背景削除のために用
いられてもよく、この場合、背景領域に位置するピクセ
ルのスペクトルが各ピクセルのスペクトルから引かれ
る。また、較正方法にも用いられてもよく、この場合、
試料分析以前に測定されたスペクトルがスペクトル画像
内の各ピクセルのスペクトルを割るために用いられる。
もう一つの例としては、グレースケール画像として表
示する比画像計算がある。このアルゴリズムは、スペク
トル画像のすべてのピクセルに対して、二つの異なる波
長における輝度の比を計算し、それに応じて、より明る
い、あるいは暗い人工色で各ピクセルを彩色する。例え
ば、スペクトル的に敏感な物質の分配を示すために、高
い比に対してはピクセルを明るく、低い比に対しては暗
く（あるいはその正反対に）彩色する。
c. 空間とスペクトル結合演算 上記に述べられたスペクトル画像分析方法において
は、アルゴリズムはスペクトル・データに適用される。
分光的に処理されたデータを画像として表示することの
重要性は、有用な画像をユーザーに提供することにあ
り、質的なものである。しかし、用途に応じて、スペク
トル画像に特有な、空間とスペクトルとの相関関係を利
用するアルゴリズムを適用することによって、利用可能
な結像データを更にいっそう有意義な方法で用いること
も可能である。空間及びスペクトルの演算は、スペクト
ル画像分析アルゴリズムの最も有効なものである。例と
して、次の状況を考察する。
試料は、ｋの異なる発蛍光団で染色されたｋのセル・
タイプを含んでいる（ここでの用語「セル」は、生物学
の細胞に対しても、また、「計測器の視野内の領域」に
対しても用いられる）。各発蛍光団は、別個の蛍光発光
スペクトルを有し、ｋセル・タイプの一つにのみ結び付
く。ｋセル・タイプの各々に対して、セル毎に平均蛍光
輝度を測ることは重要である。この目的を達成するため
に次の手法を用いることができる。
（１）画像内の各ピクセルを、そのスペクトルに応じ
て、（ｋセル・タイプに背景を加え）ｋ＋１のクラスの
一つに属するものとして分類する。（２）画像を種々の
セル・タイプへセグメント化し、各タイプの細胞数を数
える。（３）各クラスによって寄与された蛍光エネルギ
ーを加算し、対応するクラスのセル合計数によってそれ
を割る。
この手法は、スペクトル・データと立体データと両方
を用いる。立体データは種々のタイプのセル（すなわ
ち、セルの小塊）についてのデータからなり、その多く
は目には同じように見えるのだが、関連のあるスペクト
ル・データは、特徴のあるセル・スペクトルの形（すな
わち、スペクトルの「特徴」）を示す。この種の状況に
対する理想的なタイプの測定がスペクトル画像処理であ
る。上記の状況において、セルは、それらの特有なスペ
クトルの特徴によって区別されることができる。それ
故、各ピクセルにｋ＋１の値の一つを割り当てる適当な
ポイント演算が合成画像を生成するために実行される。
異なるセル・タイプの蛍光発光スペクトルがsi（λ）、
ｉ＝１、２、・・・、ｋ、λ∈［λ１、λｎ］であるこ
とが既知であり、各ピクセル（ｘ、ｙ）における測定ス
ペクトルがｓｘ、ｙ（λ）、λ∈［λ１、λｎ］である
と仮定すると、次のアルゴリズムが、可能な分類方法で
ある（上記のステップ１）。
e2 iを、セル・タイプｉに付けられた発蛍光団の既知
のスペクトルからの測定スペクトルの偏差であるとす
る。このとき、最小二乗「距離」定義を採用して、次の
ように書くことができる。
ここで、Ｒλは、目的とするスペクトルの領域である。
画像における各ポイント［ピクセル（ｘ、ｙ）］は、次
の基準を用いることによって、ｋ＋１クラスの一つに分
類できる。
もし、e2 i＞全てのｉ∈［１、ｋ］に対する閾値な
ら、 ポイント（ｘ、ｙ）∈ｋ＋１クラス （７） もし、e2 i＜閾値なら、ポイント（ｘ、ｙ）∈ρクラ
スであり、ρは、min［e2 i］＝e2 ρである。
上記のステップ２及び３（画像分割及び平均蛍光輝度
の計算）は、方程式６及び７に表されたアルゴリズムに
よって生成された合成画像に、標準コンピュータビジョ
ン演算を用いることによって簡単に行える。
もう一つのアプローチは、各ピクセルにおける測定ス
ペクトルｓｘ、ｙ（λ）をｋの既知の蛍光スペクトルsi
（λ）、ｉ＝１、２、・・・、ｋの一次結合として表す
ことである。この場合、 を解く係数ベクトルＣ＝［c1、c2、・・・ck］がある。
ここで、 であり、 ｉ＝１、２、・・・、ｋに対するdF/dci＝０を求めて解
くと、（すなわち、Ｆを最小にするciの値を見いだす）
マトリクス方程式Ｃ＝A-1B（９）を得る。
但し、Ａは要素 の次元ｋの正方行列、 Ｂは、 として定義されるベクトルである。
算術演算が同様に二つ以上のスペクトル・キューブ
に、あるいは任意のピクセルのスペクトルあるいはライ
ブラリからのスペクトルに適用されされてもよい。例え
ば、二つのスペクトル・キューブのデータを平均する、
時間変化のフォローアップあるいはスペクトルの正規化
を行う等の目的で、第一のスペクトル・キューブのデー
タと第二のスペクトル・キューブのデータとに属する、
対応する対のピクセルの対応する波長の間に算術演算を
適用し、結果として第三のスペクトル・キューブのデー
タを得ることを考察する。
多くの場合、スペクトル画像内に存在するオブジェク
ト（例えば、セル）は、化学物質構成要素においても、
また、構造においても各々異なるため、分散マトリクス
あるいは相関マトリクスを生成することによって主要な
構成要素の分析を行うことは、これらの小さな差異を高
めることになる。次に、分散マトリクスを用いることに
よる主要な構成要素の分析について簡単に説明する。主
要な構成要素の分析に関する詳細については、「多変量
較正」「実践多変量解析」及び「コンピューターエイデ
ッド・モデリングCAMO及び整理好きユーザーのガイド」
［Martens and Naes（1989）Multivariate Calibratio
n,John Wiley ＆ Sons,Great Britain;and to Esbensen
et al.,Eds.（1994）Multi variance analysis−in pr
actice;Computer−aided modeling as CAMO,and the Un
scrambler's User's guide,Trondheim,Norway］を参照
すべきである。
したがって、波長λｉ（ｉ＝１、・・・Ｎ）における
画像のピクセルの輝度は、長さがピクセル数ｑに等しい
ベクトルであると見なされる。測定の各波長に対して一
つずつ、全部でこれらのベクトルがＮあるので、これら
のベクトルは、ｑ行及びＮ列を含むマトリクスB'に整理
できる。
行列B'の列各々について平均 を定義し、第２の標準化行列Ｂを として定義する。
分散マトリクスＣがマトリクスＢに対して定義され
る。次元N x NのＣ＝BT・Ｂ。Ｃは対角化され、固有ベ
クトルと固有値とがＣ・Vi＝μｉ・Viによって関連づけ
られる。ここで、ViはＮ直交ユニットベクトルであり、
μｉはｉ番目のユニットベクトルViの方向に分散を表す
固有値である。一般に、最も低い構成要素が、ピクセル
についての一つの関数として最も高い変動を表わす。
積BVi（ｉ＝１、・・・Ｎ）は、直交基底の要素への
スペクトル画像の投影である。それらは、ｑ要素（ｑ＝
ピクセル数）からなるベクトルであり、白黒画像として
個別に表示される。これらの画像は、ある波長あるいは
波長範囲でフィルターされた通常の白黒画像からは明白
でない特徴を明らかにすることが可能である。
蛍光顕微鏡検査法 a. 概要 多数の染料（すなわち、発蛍光団）を用いること
（「デジタル画像処理の基本」［Jain（1989）Fundamen
tals of Digital Image Processing,Prentice−Hall In
ternational］を参照）は、組織及び及び細胞を分析す
るための最も強力な、そして一般的な道具の一つであ
る。したがって、蛍光顕微鏡検査法は、光学顕微鏡検査
法に用いられる最も重要な実験方法の一つである（「蛍
光分光分析法の原理」［Lakowicz（1983）Principles o
f fluorescence spectroscopy,Plenum Press,New York,
London］を参照）。蛍光プローブの能力は、主に、特性
染料が結び付くことが可能な生物学的構造の素晴らしい
多種多様性によるものである（「生体医学における蛍光
の応用」［Waggoner（1986）Applications of fluoresc
ence in the biomedical sciences,Eds.Taylor et al.,
New York:Alan R.Liss,Inc.pp.3−28］を参照）。蛍光
プローブの詳細な論評については、「生物学の技術シリ
ーズ、生物学的活動に対する蛍光及び発光性プローブ」
［Mason（editor）（1993）Fluorescent and Luminesce
nt Probes for Biological Activity,Biological Techn
iques Series,edited by Sattelle,Academic Press Lim
ited,London］及び「蛍光顕微鏡検査法入門」［Ploem a
nd Tanke（1987）Introduction to Fluorescence Micro
scopy,Oxford University Press,Royal Microscopical
Society］）を参照すべきである。
新しく、より洗練された多色の蛍光染料分子の急速な
開発は、これら染料の可能性をフルに利用可能な、より
進んだ蛍光結像技術を絶えず必要としている。蛍光染料
が今日の研究のやり方に革命的な衝撃をもたらしたこと
への論議については、「光学顕微鏡検査法の新しいビジ
ョン」［Taylor et al.（1992）The New Vision of Lig
ht Microscopy,American Scientist,Vol.80,pp.322−33
5］を参照すべきである。
多色蛍光染料における注意すべき改善は、いくつかの
根本的な蛍光染料を種々に組合せる組み合わせ蛍光染料
の導入にある（「組み合わせ蛍光及びデジタル結像顕微
鏡検査法を用いるDNAハイブリダイゼーションによる七
つの異なるDNAプローブの同時の視覚化」［Ried et a
l.,（1992）Simultaneous visualization of seven dif
ferent DNA probes by in situ hybridization using c
ombinatorial fluorescence and digital imaging micr
oscopy.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,1388−1392;and,Ri
ed（Jan.1994）Fluoreszenz in situ Hybridizierung i
n der genetischen Diagnostik,Faculty of theoretica
l medicine,Ruprecht−Karls University Heidelberg］
を参照）。
本発明の方法を用いるスペクトル生体結像は、蛍光結
像の用途において、フィルターに基づく単純なアプロー
チに勝るいくつかの重要な利点を提供する。これらの利
点には次のことが含まれる。（１）目的の試料における
染料分子の実際の反応へのよりいっそう量的な洞察を提
供する完全なスペクトル測定。（２）望ましくない背景
冷光から生じる従来の問題の多くを克服する能力。
（３）蛍光プローブの発光スペクトルにその微細な環境
（例えば、温度）のゆえに起こる望ましくなく予想でき
ないスペクトルのシフト。これは、プローブ濃度を測る
ときに考慮に入れることが可能である。しかし、蛍光輝
度が単に帯域フィルターのみで測定されるときには、こ
のようなスペクトルのシフトは、単に検出されないだけ
ではなく、プローブ濃度の分析にかなりのエラーを生じ
る可能性がある。（４）下記に詳細に述べられるが、適
切なスペクトル分析アルゴリズムと共に用いるとき、ス
ペクトル的に重なった多くの蛍光染料を一回の測定で分
離しマップすることが可能な、蛍光画像データ収集の簡
略化。事実、多変量分析、主要構成要素の回帰及び分類
等の精巧なデータ分析アルゴリズムを適用することによ
って（「多変量較正」［Martens and Naes（1989）Mult
ivariate Calibration,John Wiley ＆ Sons,Great Brit
ain］を参照）、スペクトル的関連のある多くのパラメ
ータを同時に分析することが可能である。
本発明によるスペクトル生体結像は、次のような望ま
しくない背景冷光に関する問題を解決する手段を提供す
る。蛍光結像顕微鏡検査法は、通常、試料が所望の短い
波長によって励起されることとプローブの蛍光放射に対
応する限られたスペクトルバンドの波長のみが検出器
（例えば、目、カメラ等）に到達することとを保証する
蛍光フィルター・キューブを用いることによって行われ
る（「生物学の技術シリーズ、生物学的活動に対する蛍
光及び発光性プローブ」［Mason（editor）（1993）Flu
orescent and Luminescent Probes for Biological Act
ivity,Biological Techniques Series,edited by Satte
lle,Academic Press Limited,London］を参照）。蛍光
輝度は、通常、励起源の輝度よりも数桁ほど少ないた
め、このような背景冷光を完全に消去することは不可能
である（「細胞生物学」［Benson et al.（1985）Cell
Biol.100,pp.1309−1323］を参照）。望ましくない背景
冷光が発生する三つの主要な原因としては、（１）二色
性ミラー・コーティング及び／あるいはフィルターによ
って完全に塞がれない励起源からの光、（２）試料の、
または、ある場合には光学素子の自己蛍光、そして、
（３）励起フィルター、二色性ミラー及び障壁フィルタ
ーの不適当な（あるいは最適以下の）組合せの選択があ
る。これらの原因は、背景冷光にかなり貢献する可能性
がある。試料自己蛍光効果は、通常、蛍光プローブの吸
収及び発光帯域が、測定される試料のそれと重ならない
ように、蛍光プローブを選択することによって減らすこ
とが可能である。同様に、自己蛍光を減らすために適切
に覆われた光学素子を選ぶことによって、このタイプの
自己蛍光効果も最小にすることが可能である。
最善のフィルター方法が利用可能であるにも関わら
ず、望ましくない背景冷光は、背景（ノイズ）から関連
のある蛍光信号を分離し取り出すことを、しばしば難し
く、あるいは不可能にしてしまう。他方、本発明のスペ
クトル生体結像方法は、望ましくない背景冷光効果を消
去するために、（ｉ）蛍光染料のスペクトル形状及びス
ペクトル範囲と、（ii）（自己蛍光を含む）背景冷光の
スペクトル形状及びスペクトル範囲との間のスペクトル
差を用いることが可能である。
したがって、蛍光プローブの発光スペクトルに適切な
スペクトル画像分析方法を適用することによって、SN比
を改善し、蛍光結像測定の精度を改善することが可能で
ある。測定結果の量子化を望む場合、このスペクトル生
体結像アプローチの利点は、比率結像を行うために特別
に重要である。さらに、本発明のスペクトル生体結像シ
ステムは、フィルターに基づく測定の場合に必要な、最
適なフィルターの選択に費やされる時間及び労力を省く
ことができる。
本発明の方法によるスペクトル生体結像の能力が適切
な蛍光マーカーと共に用いられるとき、多色蛍光画像を
得ることは大いに単純化される。スペクトル生体結像に
よってもたらされる利益を十分に実感するために、多数
のプローブを含む飼料からの蛍光を測定するためのフィ
ルターに基づく結像方法を用いるのに必要な通常のステ
ップを考察すべきである。第一に、十分に異なる吸収及
び発光スペクトルをもつプローブが選択されなくてはな
らない。今日の方法において、この必要条件は、試料内
の蛍光マーカー数を、三つから五つのプローブに制限す
るものである。それから、蛍光画像は、励起波長を選択
するための一つのフィルター・ホイールと蛍光スペクト
ルを取り込むためのもう一つのフィルター・ホイールの
二つのホイールを適切に回転させることによって、各染
料に対して一つの画像が得られる。あるいは代替的に、
３枚重ね二色フィルターによって発光スペクトルを取り
込みながら、励起波長を選択することを目的とした一つ
のフィルター・ホイールを回転させる。励起及び／ある
いは発光波長を制御するために（可動部品のない）チュ
ーナブルフィルターを用いるアプローチも提案されてい
る。近年は、多数の発蛍光団の結像を可能にするために
多スペクトル干渉フィルターも用いられている（「人間
の分子遺伝学２」［Lengauer et al.（1993）Human Mol
ecular Genetics 2,pp.505−512］を参照）。また、
（例えば、フィルター・キューブを変えることによっ
て）二色性ミラーを変える手段が必要とされる。また、
各波長における画像の焦点を合わせる再調整もしばしば
必要である。しかも、CCDカメラの露出時間をさえ、時
々、より高いSN比を達成するために変えなければならな
い。全体として、これらの条件が完全に行われることの
限界がすなわち位置決め問題の原因である。異なる蛍光
染料の発光に対応して生成された単色画像の各々は、
（容易に利用可能な既製のソフトウェアがあるデジタル
コンピュータを用いることにより）疑似色が付けられ重
ねられる。結果として生じた画像は、各々が異なる擬似
色が付いたいくつかの蛍光マーカーの位置を示すもので
ある。二色性ミラーの位置の僅かな変化が、デジタル化
された画像に並進シフトを起こしてしまうので、多波長
二色性ミラーを用いる（４波長帯域通過特性をもつ二色
効果の使用については、［Hiraoka et al.（1992）Semi
nars in Cell Biology,Vol.2,pp.153−164］を参照）あ
るいはそれらを重ね合わせる前に画像の位置を合わせる
必要がある。画像位置決めは、時間がかかること、ま
た、満足な結果が得られないということがしばしば起こ
る難しい問題である事実にもかかわらず、このアプロー
チは、より一般的である。また、これらは、多色蛍光画
像を得るために取り組まなくてはならない専門的な挑戦
である（「細胞生物学における方法、第Ｂ部」［Waggon
er et al.（1989）Par B of Methods in Cell Biology,
Vol.30,Ch.17,pp.449−478,edited by Taylor and Wan
g,Academic Press Inc］を参照）。
したがって、本発明のスペクトル生体結像方法は、蛍
光結像へのフィルターに基づくアプローチに課された重
要な制限の一つを克服することになる。（テキサス・レ
ッド及びローダミン発蛍光団についての例の部分で下記
に実証されるように、発光スペクトルが広範囲に重なる
染料を含み）無限数の蛍光染料の発光スペクトルの同時
測定を可能にすることによって、スペクトル生体結像
は、多数の蛍光プローブの発光画像を連続的に得る必要
をなくす。スペクトル生体結像システムを用いる利点
は、用いられる蛍光プローブが一般的な励起源によって
励起され得るときに最も大きい。この場合、単一のスペ
クトル画像を得ることで、ほぼ無制限の数の染料の蛍光
発光を捕らえることができる。（１）重なり合わない染
料を選択する、（２）フィルター・キューブを変える、
（３）励起あるいは発光フィルターを変える、（４）焦
点を合わせ及び／あるいは露出時間を最適にする、ある
いは（５）画像を位置合わせする必要性はなくなる。課
題は、もちろん、一般的な励起源で励起される適当な染
料を選択することである。次から次へと移る蛍光エネル
ギーによって励起される染料は、したがって、スペクト
ル生体結像システムを用いる多色の蛍光結像に理想的で
ある。明らかに、類似の発光特性がある染料を用いるこ
とは、（例えば、顕微鏡下での）視覚による検出をより
難しくする。しかし、この制限は、本発明のスペクトル
生体結像方法を用いれば解決可能である。
b. 多数の発蛍光団のスペクトル確認 本発明によるスペクトル生体結像方法を用いることに
より、一回の測定で多くの染料（すなわち、発蛍光団あ
るいは蛍光部分）の同時測定が可能になる。染料のタイ
プに制限なく、下記に実証されるように（例１及び２参
照）、適当なアルゴリズム（例えば、背景減法等のため
の一次結合）を適用することによって、スペクトル的に
重なり合う染料（例えば、ローダミン及びテキサス・レ
ッド）さえも識別し、それらの存在を画像にマップ可能
である。しかし、もし多くの染料が同時に用いられるの
なら、それらの励起波長、蛍光輝度及び発光スペクトル
に関して、注意深く考慮すべきである。これを正しく行
なうなら、結果は量的にも分析可能である。例えば、い
くつかのタンパク質の相対濃度は、これらタンパク質に
特に結び付く適当な蛍光標識が施された免疫抗体を用い
て、一回の測定でマップ可能である。また、標準較正さ
れた染料を用いることによって、絶対濃度でも測定可能
である。
多数の蛍光プローブの検出がかなりの利点となること
の一つの例は、染色体レベルで遺伝子を分析し、遺伝子
及び染料体の増幅、欠失、転座、配置替え、その他の起
こり得る遺伝子欠陥を見つけるために用いられるFISH
（fluorescent in situ hybridization:蛍光DNAハイブ
リダイゼーション）である（「成長遺伝学とホルモン
９」［Emanuel（1993）Growth Genetics and Hormones
9,pp.6−12］を参照）。
多くのがん及び先天性異常を含む特定の病気及び疾患
は、いくつかの遺伝子の不良によって起こされる遺伝子
障害である。多くの他の病気も、遺伝子の要素、すなわ
ち、遺伝子欠陥が存在するためであると知られている、
あるいは信じられている。遺伝子欠陥は、単独では病気
を引き起こさないが、病気を起こすのに寄与する、ある
いは、後に病気になる可能性を増すものである。この現
象は、本技術において多因子の病気及び遺伝子的疾病素
質として知られている。明らかな遺伝子欠陥と既知の病
気との相関関係は、医者が決定的な診断を行い、多くの
病気を早期に発見し処置することを可能とする。遺伝カ
ウンセリングは、その可能性がある親や、その危険性が
ある人々が、将来における潜在的に重大な医学的問題の
可能性を示し、それを阻止する注意を喚起することがで
きる。
5,000以上もの遺伝子障害が確認されたが、その多く
のは同義遺伝子障害に関連している。染色体が遺伝情報
のキャリアであることが発見された後、科学者は、特定
の疾患に責任がある染色体にある目に見える欠陥を記録
することが可能であると理論的に考えた。1960年代に、
ガラスのスライドに広げられた分裂中期染色体の顕微鏡
検査法に基づく分類のために着色技術が開発された。過
去数十年間、染色体のバンディング・パターンの視覚的
分析は、人間の遺伝子障害を、分裂中期染色体の観察さ
れた構造的な異常へ関連づけるために用いられている。
染色体は、それらの長さに沿った特有の明暗のバンドを
明らかにするために、通常、ギームザ染色（Ｇ−バンデ
ィング）を施した後に明視野顕微鏡検査法によって、あ
るいは、蛍光染色（Ｒ−バンディング）の後に蛍光顕微
鏡検査法によって調べられる。患者のバンディング・パ
ターンを正常染色体のパターンに注意深く比較すること
によって、奇形及び遺伝病を起こす転座（染色体間ある
いは染色体内における遺伝物質の交換）、欠失（染色体
あるいは染色体の断片が欠けている）、付加、逆位等の
異常が明らかになる。
しかしながら、例えば胞性線維症（CF）等の多くの重
大な遺伝病及び他の多くのものは、僅かに一つあるいは
いくつかのヌクレオチドの付加、欠失あるいは置換を伴
う突然変異によって起こる。このような小さな欠陥は、
上記で述べられた染色体バンディング技術によって探知
可能なものではなく、何年もの間、細胞遺伝学者は、僅
かな欠陥の位置を検出すると共に数量化する技術を開発
するために努力している。
蛍光DNAハイブリダイゼーション（FISH）は、複数の
補足的な技術の改良を受けて、過去25年間に渡って発展
したものである。この技術は、細部遺伝学者の、染色体
上に遺伝子の正確な位置をマップし、染色体の肉眼的染
色によっては目に見えない非常に小さな遺伝子欠陥をも
検出する良い道具を開発したいという願望によって生ま
れたものである。ゲノム・プロジェクト（HGP）、人間
のすべての遺伝子を識別しマップする大胆なイニシアテ
ィブは、FISHに興味を示し、必要なDNAプローブの開発
を早めた。現行のFISH技術は、強力な免疫プローブの同
時の開発、顕微鏡検査法及び分光分析法のための優秀な
蛍光染料の多種多様な増加、そして蛍光顕微鏡検査法に
用いられる対物レンズ、照明装置及びフィルターの劇的
な改良によって可能になった。
FISHの性能及び実用性は、多くの要因による。（１）
FISHは、単に、単離した染色体及び核に用いられるばか
りでなく、固定パラフィンに埋め込まれた組織内におけ
る細胞全体にも用いられる。（２）比較的小さな欠陥を
検出できる（より小さな欠陥を検出するようと、性能は
常に改善されている）。（３）比較的速く結果を提供で
きる。（４）適度なコストは、大部分の臨床検査室や研
究所でそれが用いられることを可能にする。（５）種々
のプローブ及び試料タイプに使用できるように改良が可
能である。（６）高い特異性及び感度が達成可能であ
る。（７）短時間の処理、通常２時間で可能。
多くのFISHの用途において必要となることは、単に、
細胞遺伝学者が、顕微鏡のアイピースを介して、あるい
はモニタ上の画像において、蛍光ラベルが存在するか否
かを測定するだけである。幾分複雑な試料については、
１あるいは２色のラベルを単純にカウントするだけでよ
い。しかしながら、デジタル画像を処理し、それらから
数値データを抽出する能力は、FISH技術に新しい巨大な
機能のセットを加えるものである。本発明の方法等の、
適切な結像方法によって、非常に不明瞭なFISH画像の明
瞭度が向上するため、ラベルが付いた染色体及び遺伝子
座が明確に確認可能となる。容易に達成可能な実験条件
下で、ラベルが貼られたサイト数は自動的に計測可能で
ある。また、ラベルが貼られた各サイトの輝度が測定さ
れ、例えば、特定の遺伝子の存在数を明らかにするDNA
の量が計算される。多色FISH等の新しい技術は、（３、
４、５及びそれ以上の）多数の蛍光プローブを検出し数
量化するためのカラー画像分析を用いる。
上記で論じたように、FISHは、ラベル付けされたプロ
ーブの位置、各染色体上のラベルが貼られたサイト数及
び各サイトにおけるラベルの輝度（遺伝物質の量）につ
いての情報を提供する。動原体（反復DNA）プローブ及
び染色体ペイントは、目標に定められた各染色体にラベ
ル付けを行いコピー数を数えるために用いられる。遺伝
子座特定プローブは、遺伝物質の小さな領域の位置をマ
ップするために用いられる。これらのタイプのプローブ
は、そのままの細胞分裂間期核及び分裂中期の染色体ス
プレッドに用いることが可能で、視覚的にあるいは適当
なアルゴリズムによって自動的に計数可能であり、特定
の染色体、染色体分裂片、あるいは遺伝子があまりに多
いあるいは余りにも少ないために起こる遺伝病を識別す
るために決まって用いられる。
いくつかのがんの非常に早期の段階においては、細胞
が明らかに異常であると確認されるかなり以前に、特定
の遺伝子の数が増加することがある。この現象は、遺伝
子増幅として、この技術分野で知られているが、遺伝子
座特定プローブを用いて探知可能である。がん細胞にお
ける染色体異常を検出するためにFISHを用い、その病気
の発達段階を指摘することによって、段階に応じて有効
度が異なる多くの治療方法から、最も適当な治療を選択
できる可能性もある。最も効率的な段階特性治療を選択
することによって、貴重な時間が節約されると共に、患
者の苦痛も最小になる。
染色体を（例えば、音波破砕によって）物理的に、あ
るいは（例えば、エンドヌクレアーゼによって）酵素的
に切り刻み、（例えば、流動細胞計算法を用いて）単離
し、分裂片全てに対してプローブのセットを生成するこ
とによって、一つの特定な染色体の全面に一様にラベル
付けすることが可能である。染色体ペイントとしても知
られている染色体プローブの全体は、ターゲット染色体
のすべてのコピーに蛍光ラベルを付ける。染色体彩色の
一つの重要な用途は、特徴的に特定のがんの早期に起こ
る欠失及び二つの染色体間の転座の検出にある。
例えば、もし染色体Ａが緑のペイントでラベル付けさ
れ、染色体Ｂが赤のペイントでラベル付けされたなら、
ＡからＢへの物質のいかなる転座も赤色染色体上に緑の
領域として現われる（また、逆も同様である）。通常、
正常な染色体から生成された染色体ペイントが、異常な
（患者の）染色体上の欠失あるいは転座を検出するため
に用いられる。逆方向の染色体彩色は、異常な染色体か
ら生成されたプローブを、その異常な染色体に物質を寄
付した種々の正常な染色体からDNAを識別するために用
いる。本発明の方法は、下記の例に実証されるように、
一回の交雑そして一回の測定によって、人間の核型（す
なわち、ゲノム）を構成する24の異なる染色体を各々が
異なる色に彩色し、同時に検出して識別し有意義にカラ
ーの人間核型を示すことを可能とする。
比較ゲノム・ハイブリダイゼーション（CGH）は、DNA
プローブの二つのカクテルが染色体の全セットから生成
される逆方向の染色体彩色の変型である。一つのカクテ
ルが正常な染色体のセットから、また、もう一つが異常
な染色体（例えば、腫瘍）のセットから生成される。プ
ローブの二つのセットは、例えば、正常なDNAが赤色の
蛍光を示し、異常なDNAが緑色の蛍光を示すように、異
なるリポーター分子を用いて生成される。正常な分裂中
期の広がりは、両方のカクテルで同時に交雑され、その
場でカラー画像分析を用いて評価される。赤よりも強烈
に緑の蛍光を発する正常な染色体の領域は、DNA増幅
（多数の遺伝子コピー）が患者の異常な細胞におけるそ
の遺伝子で起こったことを示すものである。緑の蛍光よ
りも赤が多い（緑／赤の比が少ない）領域は、患者の染
色体内の遺伝子欠失のサイトを示すものであり、緑と赤
の蛍光が平等な領域は、そのサイトにおいてDNAが変化
していないことを示すものである。CGH及び関連する技
術は、先のラベル付け技術よりも複雑であるが、以前に
可能であったものに比べ、より微妙で広範囲の遺伝子の
変化を検出し数量化する能力を提供する。本発明の方法
は、これらのタイプの分析に非常に適している。
上記に述べられたことから、単純なカラー蛍光画像に
代わり、比較的に高いスペクトル解像度でスペクトル画
像全体を作る本発明の感度の良い、量的なスペクトル結
像方法を用いることは、核型の作成、転座あるいは転位
あるいは染色体欠失あるいは増幅の検出及び遺伝子マッ
ピングに、大いなる利益をもたらすものである。その理
由は、このような方法は、試料準備時間を減少させ、交
雑された蛍光プローブを、（小さなスペクトルのシフト
によって）背景に残留するものから区別し、未だに達成
されていない大きな数のプローブを同時に測定すること
を可能にするからである。
したがって、本発明の目的の一つは、プローブ技術に
おける進歩をうまく利用するように設計されたFISH結像
方法を提供することである。本発明によれば、いかなる
任意の染色体分析においても分析可能なプローブ数を大
いに増し、また、従来の技術の方法と比較し、この情報
が得られるスピード及び自動化の割合を劇的に増すこと
が可能である。
本発明のFISH結像方法は、顕微鏡視野のすべてのピク
セルから蛍光スペクトルを同時に得ることが可能で、一
回の実験で多くの蛍光プローブの位置を検出可能なスペ
クトラキューブ・システムの利点を採用する。染色体特
性プローブ及び奇抜なラベル付け戦略を用いることによ
って、下記の例に示されるように、この方法は、各染色
体が異なる色（すなわち、人間の核型に対して24の異な
る色）で彩色された状態でのFISH核型を生成することが
可能である。この方法は、非常に高い試料処理能力をも
たらし、本質的に無制限のプローブ数の分析を可能にす
る。
上記に説明されたように、本発明の鍵となる概念は、
FISH分析への多くの蛍光プローブの利用にある。ビオチ
ンあるいはジゴキシゲニン等のハプテンが酵素反応を用
いてDNAに取り入れられる間接的な方法を含めて、FISH
に用いるためにDNAプローブにラベル付けを行う多数の
方法が利用可能である。分裂中期の染色体スプレッド
へ、あるいは細胞分裂間期の核への交雑後、免疫学的方
法を用いることによってハイブリッドに蛍光ラベルが付
けられる。最近では、蛍光染料は、直接的にプローブに
取り入れられ、中間ステップを用いることなく検出され
る。標準的なFISHの染料には、フルオレセイン、ローダ
ミン、テキサス・レッド及びカスケード・ブルーが含ま
れ、マルチプローブFISH分析は、異なるプローブを、異
なるハプテンあるいは蛍光染料あるいはそれらの組合せ
でラベル付けすることによって達成される。これは、こ
の技術において組み合わせプローブとして知られる
（「組み合わせ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法
を用いるDNAハイブリダイゼーションによって七つの異
なるDNAプローブの同時の視覚化」［Ried et al.,（199
2）Simultaneous visualization of seven different D
NA probes by in situ hybridization using combinato
rial fluorescence and digital imaging microscopy.P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 89,1388−1392;and,Ried（Jan.
1994）Fluoreszenz in situ Hybridizierung in der ge
netischen Diagnostik,Faculty of theoretical medici
ne,Ruprecht−Karls University Heidelberg］を参
照）。
蛍光は、接地電位において発蛍光団として知られる分
子に光の光子が吸収された後に起こる冷光の一つの形で
ある。この分子は、より高いエネルギー軌道へ電子が移
行するために、励起状態に上げられる。この超過エネル
ギーは、電子が元の接地状態に戻るとき、光量を解放し
て発散される。蛍光光は、吸収された光よりも長い波長
にある。この移行には制限があるため、発光は励起波長
に近くなる。これため、ある一つのスペクトル範囲で励
起される発蛍光団は、類似のスペクトル範囲で発光す
る。例えば、もし励起が青色の範囲にあるなら、発光は
緑色と期待される。したがって、もし異なるスペクトル
を放つ多くの異なるプローブを用いることを望むなら、
波長が近くなり、しばしば重なり合うということは明白
であるため、異なるプローブ間を区別することが可能な
スペクトル解像度が非常に重要になる。
本発明の方法によれば、個々のプローブ（この書類の
ここで言及されたプローブは、組み合わせプローブをも
示す）は、（RGBアルゴリズムによって）擬似色（すな
わち、分類アルゴリズムによる所定の色）が割り当てら
れ、その情報はコンピュータ・スクリーン上に表示され
る。多色蛍光を用いることで、多数のプローブからの恩
恵を享受可能な重要な臨床医学の用途にFISHを拡張でき
る可能性が開かれる。例としては、異数体及び染色体の
構造の研究、マーカー染色体及び完全なFISH核型の検出
が含まれる。多数の情報が一回の交雑から得られるかも
しれないので、スループットが増し、遺伝子投与量効果
を算定する、あるいは欠失の程度を測定するために内標
準が用いられてもよい。
本発明の方法は、いくつかの狭いスペクトル・バンド
に白色あるいはコヒーレント単色光源によって励起され
た蛍光の検出を、冷却CCDをもつセンサを利用して行
う。したがって、異なるプローブを表す各々からなる多
数のスペクトルが同時に測定される。このことは、染色
体の多数のスナップ写真を撮り、次に画像を再構築する
という従来のアプローチだが、すべて上記に説明された
ように、このプロセスには時間がかかり、アーティファ
クトという結果が生じる。本発明の方法は、これと比較
して、画像を得るスピード及び精度を増すことになる。
それ故、本発明は、多数のプローブの、より感度が良
く、より速く、より正確な検出を可能にするため、最新
技術の細胞遺伝学の結像方法に勝る非常に意義深い進歩
を示すものである。
したがって、本発明は、蛍光DNAハイブリダイゼーシ
ョン方法を提供するものであり、この方法は、次のステ
ップを含む。（ａ）染色体を持つ細胞核を提供する。こ
の染色体は、少なくとも一つの核酸プローブで交雑され
る。この少なくとも一つの核酸プローブの各々は、少な
くとも一つの核酸分子を含み、この少なくとも一つの核
酸分子の各々は、少なくとも一つの発蛍光団でラベル付
けされる。（ｂ）蛍光顕微鏡を介して細胞核を視検す
る。この蛍光顕微鏡は、結像分光計に光学的に繋がれて
おり、これら蛍光顕微鏡及び結像分光計は、細胞核の各
ピクセルのスペクトルを得るためのものであり、（ｉ）
コリメーター光学系を用いて細胞核のすべてのピクセル
から同時に入射光を集め、（ii）複数の要素を持つ干渉
計システムを介して平行入射光を通すことにより、光が
まず二つのコヒーレント光線に分けられ、干渉計内の各
々異なる方向に移動し、それから二つのコヒーレント光
線は、再び結合し各々他と干渉して射出光線を形成し、
（iii）検出器要素の二次元アレイを持つ検出器に、射
出光線を集束させる焦点調節光学系を介して射出光線を
通過させることにより、測定の全持続時間に渡る各瞬間
において、検出器要素の各々は、細胞核の常に同一ピク
セルの画像となるため、細胞核の実像は検出アレイの平
面上にあって動かず、測定中のどの時間においても画像
は明らかで識別可能であり、また、検出器要素の各々
は、異なる波長でピクセルによって発光される光輝度の
特定の一次結合である信号を生成するが、この一次結合
は瞬間的な光路差の関数であり、（iv）干渉計システム
の要素の一つ以上を回転あるいは移動する（すなわち、
走査する）ことにより、細胞核のすべてのピクセルに対
する、干渉計システムによって生成された二つのコヒー
レント光線の間の光路差が同時に走査され、（ｖ）第一
のスペクトル・キューブのデータを形成するために、記
録装置を用いて検出器要素の各々の信号を時間の関数と
して記録する。そして、（ｃ）数学的アルゴリズムを用
いて第一のスペクトル・キューブのデータを解釈する。
核酸プローブは、各々がインサート、プラスミド、コ
スミド、ファゲミドを含む遺伝子座、分裂片の染色体、
酵母人工染色体を、あるいは、各々がインサート、ある
いはある種のがん組織の完全な（すなわち、全）ゲノム
及びその組合せを含むウィルス・ベクターを含んでもよ
い。発蛍光団は、単一の蛍光染料、あるいは複数の単一
の蛍光染料の種々の組合せである組合せ蛍光染料であっ
てもよい。細胞核は、細胞分裂間期中の核、有糸分裂中
の核あるいは減数分裂中の核であってもよい。したがっ
て、染色体も、細胞分裂間期染色体、有糸分裂中の染色
体あるいは減数分裂中の染色体であってもよい。核酸プ
ローブの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、2
2、23、24、あるいは24より多くてもよく、プローブの
各々は、異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の異なる組み
合わせを含む（すなわち、組み合わせプローブ）。数学
的アルゴリズムは、（ａ）予め定められた波長範囲を用
いる赤緑青色画像計算、（ｂ）ピクセルの各々のスペク
トルに対して少なくとも一つの基準スペクトルからのス
ペクトル差を計算する分類マッピング分析、（ｃ）一次
結合分析、この分析は、分類マッピング分析と組み合わ
された背景減法のためのもの、（ｄ）主要な構成要素の
分析（「主成分分析」と同義である。）及び（ｅ）ピク
セルに関するスペクトルに応じたピクセル分類に適する
いかなる他のアルゴリズムであってもよい。
さて、上記の説明と共に本発明を説明する次の例を参
照する。
例1: スペクトラキューブ、一次結合アルゴリズム及び分類マ
ッピング・アルゴリズムを用いる改善された蛍光DNAハ
イブリダイゼーション（FISH） 本発明の方法をスペクトラキューブ・システムに用い
るスペクトル生体結像は、一回の測定で多数のプローブ
の同時検出を高い精度で可能にすることによって、FISH
有用性を向上させる。その結果、FISHによる遺伝子異常
の検出の効率及び信頼性は、大いに向上する。
上記に詳しく述べたように、蛍光DNAハイブリダイゼ
ーション（FISH）は、多くの研究及び診断分野におい
て、ますます重要な役割を担っている。1970年代に最初
に導入されて以来、FISH技術はかなり進歩し、単一の遺
伝子配列、部分的な染色体配列、さらに染色体全体（す
なわち、染色体彩色）の検出及び識別を可能にしてい
る。FISHの用途の多くは、遺伝病及び遺伝子異常を発見
し治療を行うためであり、また胎児期の診断、アニュー
ソミ（aneusomy）、その他の病気の早期発見にある。
相同核酸連鎖の交雑に基づくFISHの高感度及び選択性
のため、１キロベース（kb）ほどの小さな短い配列さえ
も観察可能である。（もうすぐ、15−30ベース程度の短
い配列をも検出可能なまでに改良されるであろう。その
結果、ポイント突然変異の検出も可能になるだろう。）
FISHは、分裂間期及び分裂中期の細胞に、さらには組織
全体に適用できるため、細胞遺伝学及び病理学の分野で
広範囲の用途に用いられることが可能である。FISHは、
DNAプローブ、蛍光染料（特に、組み合わせプローブの
導入）、蛍光顕微鏡検査法、高性能CCDカメラ及び結像
技術の改良に伴い能力が向上する。
同時に多くのプローブを検出する能力については、FI
SHを効率的な診断の道具にするために、すでに文献に示
されている（Rudkin and Stollar（1977）Nature 55,17
2−173を参照）。しかし、既存の方法は取り扱いが難し
い。下記に実証されるように、多数のプローブの検出
は、適切なアルゴリズムに組み合わされたスペクトラキ
ューブ・システムによって、スペクトル解像度及び感度
が良いため、大いに改善される。この機能を説明するた
めに、染色体１及び染色体17に特定されたDNAプローブ
を用いて行われた細胞分裂間期のFISH測定の例を含む図
5a−ｃを参照する。この測定において、これらDNAプロ
ーブは、蛍光スペクトルが非常に類似した発蛍光団テキ
サス・レッド及びローダミンで各々タグ付けされた。染
色体１のプローブは、染色体のサブテロマー（subtelom
eric）領域に対するミッドサテライト・プローブであ
り、交雑後ビオチンによってDNAプローブにリンクされ
たテキサス・レッドでタグを付けられた。染色体17のプ
ローブは、染色体の動原体領域に対するαサテライト・
プローブであり、ローダミンでタグを付けられて、交雑
後ジゴキシゲニンによって第二のDNAプローブにリンク
された。図5aは、顕微鏡を通して肉眼で見えるようなオ
リジナル画像を示す。図5bは、測定後スペクトラキュー
ブ・システムによって処理された同じ試料を示す。図5c
は、（Ｔと記された）テキサス・レッド及び（Ｒと記さ
れた）ローダミン発蛍光団の蛍光スペクトルを示す。
図5cに明らかなようにテキサス・レッド及びローダミ
ンのスペクトルのピークは、僅かに15ナノメートル異な
るだけであるため、フィルターに基づくシステムを用い
たとしたら、それらを区別することは非常に難しいであ
ろう。
図5aに示されるように、顕微鏡を通してカラーFISH画
像を見ると、画像に現われた（１−４と記された）点及
びプローブ・タイプの正しい数を認識する信頼性は、特
に高くないということが分かる。他方、図5bに示される
ように、各ピクセルに対する測定スペクトルを利用する
スペクトラキューブ・システムは、点の存在を確かめ正
確にそれらを数えると共に、それらの間の小さなスペク
トル差から高い信頼性で異なる対を区別することが可能
である。図5cに示されるように、テキサス・レッド及び
ローダミン蛍光の人工彩色によって、プローブ特性蛍光
の位置は高い精度で測定される。点１及び２がテキサス
・レッドであり、点３及び４がローダミンである。
図6a−ｂは、六つの異なるプローブを用いる、細胞分
裂間期における核DNAの交雑後のFISH測定の例である。
図6aはオリジナル画像を示し、図6bは、スペクトラキュ
ーブ測定におけるすべての検出された対のペクトル処理
及び人工色表示を示す。図6cは、スペクトラキューブ・
システムを用いて３枚重ね二色フィルターを通して検出
され（染色体に応じて各々に次のラベルがある:1、８、
10、11、17及びＸ）交雑後の六つの発色団のスペクトル
を示す。（発蛍光団、プローブ及び染色体に関する詳細
については、次の説明、表２及びカタログ［Chroma Cor
p.Cat.No.61502］を参照。
肉眼によって、あるいは単純なRGBカラー測定を用い
ても、色を一色毎に区別することは難しいということ
が、細胞分裂間期の細胞核のオリジナルRGB画像を示す
図6aから明らかである。経験豊かな観察者は、最も条件
が良い場合に、６色の内、異なる３色を検出できるかも
しれない。しかし、図6bは、背景減法及び分類のために
有標分類アルゴリズムでスペクトル・データを処理した
後（上記詳細を参照）の、図6aに示されたものと同じ試
料を示す。結果として生じた点は次のように人工色で強
調表示された。茶色−B1、青緑色−Ｃ、青色−B2、黄色
−Ｙ、緑色−Ｇ、及び赤色−Ｒ。なお、背景は黒色−B3
の人工色が与えられた。観察されるように、すべての六
つの発蛍光団の対を見つけること、そして容易にそれら
の対を区別することが可能である。
青色（B2）で強調表示された一つの対は、肉眼によっ
て、あるいはカラー・カメラを用いてもほとんど気付く
ことが不可能であるが、スペクトル・キューブに背景減
法アルゴリズムを適用した後では検出可能である（図6a
を図6bに比較）。
プローブは、染色体８、10、11、17及びＸの動原体領
域に対して五つのαサテライト・プローブが、染色体１
のサブテロマー領域に対してミッドサテライト・プロー
ブが用いられた。上記の染色体及びDAPI対比染色（背
景）の各々にラベルをはるために用いられた発蛍光団、
それらの発光ピーク及び人工表示色の分類は、表２に要
約される。
図6cに示される六つの発蛍光団の各々の正規化された
スペクトルの特徴から、いくつかの比較的に広いスペク
トル範囲で測定するフィルターに基づいたシステムは、
スペクトル間の大きな重なり合いのため、異なるプロー
ブ核種を確実に区別することが不可能であることが明ら
かである。このようなシステムは、各プローブの輝度の
絶対測定により依存しているため、背景信号及びノイズ
によってさらに影響を受ける。スペクトルの重なり合い
は、セル自体から発生する自己蛍光という状態でも時々
起こるもので、この場合も、各ピクセルに対するスペク
トル情報の有用性が、自己蛍光の寄与の除去を可能に
し、より正確な結果をもたらす。
画像上の各点の全スペクトルの測定は、プローブの特
異性の問題をも解決するかもしれない。事実、ある場合
には、ある染色体DNA連鎖に合致するプローブは、異な
る（たいてい類似の）連鎖への低い特異性を持ち、第二
の連鎖へも交雑する可能性がより低い。このことは、あ
るタイプのプローブがあまりにも多く出現するかのよう
な見せかけを生じるが、第二のケースにおける蛍光スペ
クトルは、プローブの化学物質環境に小さな変化がある
ため、第一のものに対して非常に僅かにシフトする。ス
ペクトラキューブ・システムは、スペクトル解像度及び
感度によって、このアーチファクトを排除可能である。
試料準備中に洗浄されてないプローブに対して同様のア
ーチファクトは、虚偽の陽性の診断をもたらす。したが
って、本発明の方法によるスペクトラキューブ・システ
ムは、間違った診断の危険性を減少させる助けとなる。
多数の類似の染料へ一般化すると、図5a−ｂ及び6a−
ｃの例は、多数のプローブを検出し区別することが可能
であることを示す。それらの間に小さなスペクトル差が
存在するという条件下で、スペクトラキューブは一回の
測定でそれらを検出し識別する。
他の既知の、また、将来に発見される、あるいは開発
される発蛍光団及び発蛍光団の組合せも、上記に詳しく
述べたように、多数の遺伝子座を同時に検出して核型の
各染色体を識別可能な色等で彩色するために、種々のFI
SHの用途に用いられてもよいことは同業者に明らかであ
る。最先端の細胞分子生物学に用いられる発蛍光団のリ
ストは、「蛍光プローブへの入門、生物学の研究のため
の蛍光及び発光性プローブの特性、歴史及び用途」［Ka
sten（1993）Introduction to fluorescent probes:Pro
perties history and applications,in Fluorescent an
d luminescent probes for biological research,Mason
Ed.Academic Press Limited,London,pp.24−31］に述
べられている。例えば、生体発光、化学発光及び非蛍光
分類法等の他のラベル付け技術も同様に適用されてもよ
いことは同業者には同じく明らかである。
したがって、FISH分析のためのスペクトラキューブ・
システムを用いることで、次のような重要な利点が得ら
れる。（例えば、蛍光顕微鏡を用いて）FISHを行うため
に従来の手段を用いると、一回の交雑で用いられるプロ
ーブ数は、二つから四つに制限されるが、スペクトラキ
ューブ・システムは、その高スペクトル解像度のため
に、多数のプローブの同時検出を可能にする。したがっ
て、FISH分析のためにスペクトラキューブ・システムを
用いることは労力及び時間を省くことになる。さらに、
FISHの分析のためにスペクトラキューブ・システムを用
いることで、完全な分析に必要とされるセル数を減少で
きる。これは、分析すべきセルの数が限られている場合
に重要な特徴である。
例2: 蛍光DNAハイブリダイゼーション及びスペクトル生体結
像を用いる、人間のすべての染色体の異なる色による同
時の視覚化 多色FISHの出現は、基本研究及び遺伝子の診断におけ
る分子細胞遺伝学の応用を広げた。すべての既存の多色
FISH技術は、発光スペクトルが光学フィルターで分離さ
れ得る蛍光プローブを用いることを必要とする（「組み
合わせ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いる
DNAハイブリダイゼーションによる七つの異なるDNAプロ
ーブの同時の視覚化」［Ried et al.,（1992）Simultan
eous visualization of seven different DNA probes b
y in situ hybridization using combinatorial fluore
scence and digital imaging microscopy.Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 89,1388−1392;and,Ried（Jan.1994）Fluor
eszenz in situ Hybridizierung in der genetischen D
iagnostik,Faculty of theoretical medicine,Ruprecht
−Karls University Heidelberg］を参照）。この必要
条件は任意の試料内に識別可能な染料数を制限する。本
発明によれば、スペクトラキューブ・システムを用い
る、FISHに対する奇抜なアプローチと、スペクトル的に
重なり合うラベル付けされた多数のプローブ（単独及び
組み合わせ）を測定し分析する本発明の方法とが提供さ
れる。この例においては、上記に説明されたように、生
物学的試料のすべてのポイントにおいて決定的なスペク
トル・データを同時に測定可能なフーリエ分光分析法、
CCD結像及び光学顕微鏡検査法の組合せであるスペクト
ル生体結像検査法が、人間の染色体のすべてのタイプ
（すなわち、24種）に沿って、交雑に基づく多色帯域を
視覚化し、人間の核型のカラー・マップを生成するため
に用いられた。
この目的のために、各々が５以下の異なる発蛍光団
（ａからｅ、表３）の異なる組合せでラベル付けされた
24の染色体ペイント（１から22、Ｘ及びＹ、表４）（異
なる発蛍光団及びそれらのスペクトルの特徴については
表３を、24の染色体ペイントを得るために、表３にリス
トアップされた発蛍光団を割当てることについては表４
を参照）は、リエド（Ried）氏他の著書（「組み合わせ
蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いるDNAハ
イブリダイゼーションによる七つの異なるDNAプローブ
の同時の視覚化」［Ried et al.,（1992）Simultaneous
visualization of seven different DNA probes by in
situ hybridization using combinatorial fluorescen
ce and digital imaging microscopy.Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 89,1388−1392］を参照）に述べられているよう
に本質的に交雑のために準備された男性の白血球の有糸
分裂染色体スプレッドに、同時に交雑された。交雑され
た染色体は、スペクトラキューブ・システムに接続され
た逆蛍光顕微鏡を通して視検され、分析された。
さて、図7a−ｅ、8a−ｂ及び9a−ｂを参照する。図7a
−ｅは、24の個々のピクセルについて正規化されたスペ
クトル、すなわち、人間の異なるタイプの染色体の各々
（１−22、Ｘ及びＹ）を示す。番号１−22、文字Ｘ及び
Ｙは、スペクトルの各々が引き出された染色体のタイプ
を示す。図7a−ｅに示されるように、人間の24の染色体
の各々から得られたスペクトルは、他のすべてのスペク
トルとは異なる。この差異は、大きい（例えば、図7cの
染色体11と15とのCa.530ナノメートル発光ピークを比
較）かもしれないし、あるいは小さい（例えば、図7eの
染色体22とＹとのCa.530ナノメートル発光ピークを比
較）かもしれないし、あるいはいくつかのスペクトル範
囲では、（例えば、図7eの染色体22とＹとのCa.680ナノ
メートル発光ピークを比較）無くなってしまうかもしれ
ない。しかし、さらに、図7a−ｅに示されるように、ス
ペクトラキューブ・システム及び本発明の方法を用いる
ことで、非常に類似したスペクトル間の僅かな相違さえ
も検出が可能となる。しかし、本発明の方法における、
スペクトル間の差異を検出する能力は、かなりの部分に
おいて、適切な発蛍光団及び発蛍光団の組合せの選択に
依存するが、この技術における同業者あるいは熟練した
者には、ここに示された性能が、いかなる従来の細胞遺
伝学の技術をも超越することが理解されるであろうこと
は、この説明から明らかである。
図8aは、上記に述べられた人間の彩色された染色体の
RGB画像を示し、図8bは、図8aの彩色された染色体から
得られた人間のカラー核型を示す。文字で24の異なる色
を表すことは不可能であるため、白黒の図8a及び8bと、
色が付いていなければまったく同じ図であるところの、
色の付いた図9a及び9bも含まれている。染色体対の各々
は、異なる色で彩色されること、また、カラー核型（図
9b）は、カラー画像（図9a）から容易に得られることに
注意すべきである。
図8a及び9aの画像を生成し表示するアルゴリズムは、
上記に説明され、図４に例証されたように、RGBアルゴ
リズムである。Ｒ＝640−740ナノメートル、Ｇ＝550−6
40及びＢ＝530−550ナノメートル。しかしながら、輝度
に関してより統一された画像を得るために、得られたRG
B値に特別な修正が行われた。この修正は、カラー結像
技術において「コントラスト・ストレッチ」として知ら
れており（例えば、「ENVITMユーザーズ・ガイド、画像
化のための環境」［ENVITM User（IUs guide,The envir
onment for visualizing images Version 1.1 July 199
4 Edition,BSC limited Liability Company］を参
照）、次のことを含む。（ａ）RGB値の各々の分布を測
定する。（ｂ）測定された分布内における輝度間の差異
を最大にするためにルックアップ表を定義する。（ｃ）
修正されたRGB画像を表示する。この画像が、オリジナ
ルの各々のスペクトルの最大の色変化を表す。このオリ
ジナルのRGB画像の単純な修正は、上記に説明されたよ
うに、実際は、分類アルゴリズムの一つの限定版であ
る。しかし、類似の画像を表示するのに、他のアルゴリ
ズムも、同等にあるいはより適当に用いられ得ること
は、同業者には明らかである。上記に詳細に例証された
ように（例えば、例１）、分類マッピングは、染色体の
特有なカラー・パターンをさらに得るために、いかなる
人間の染色体をも所定の人工色で表すことが可能であ
る。さらに、上記に詳述されたように、主要な構成要素
分析においても、有意義な構成要素の各々あるいはそれ
らの組合せに、一つの所定の人工色が当てられることも
適当である。それでも、類似のスペクトルを区別するこ
と、また、異なるスペクトルを持つピクセルへ異なる所
定の人工色（あるいは疑似色）を当てることが可能な追
加のアルゴリズムも、本発明の方法によれば、核型を作
成するのに適当である。
この例では、五つの異なる基本的な発蛍光団（表３の
ａからｅ）から合わされた24の異なる単一及び組み合わ
せプローブは、人間の染色体のカラー核型を作成するた
めに説明された。しかし、いくつかの他の核種は、より
多くの数の染色体を持っているため、多分、より多くの
基本的な発蛍光団から組み合わされたより複雑な組み合
わせプローブを用いる必要がある。しかし、人間の染色
体も含み、染色体は、大きさのグループにも分類が可能
である。このため、いくつかの用途に対しては、異なる
大きさのグループに属している染色体が同じに彩色され
ても、それらの相対的な大きさによって識別が容易であ
るため、色数の必要が最小に抑えられることに注意を払
うべきである。これは、人手による点検によって、ある
いは代替的に、どの形態学的アルゴリズムを用いても達
成可能である。
例3: 乳がん細胞における多数の染色体転座の検出 説明されたように、本発明の方法は、正常な血液細胞
の完全なカラー核型を提供することができる。多く場
合、従来の核型作成技術（例えば、Ｇバンディングある
いはＲバンディングを用いる技術）は、遺伝子障害に関
する転座等の染色体異常（例えば、ダウン症候群の21q2
2三染色体、染色体18（あるいはその分裂片）の三染色
体及び染色体13（あるいはその分裂片）の三染色体）あ
るいは悪性腫瘍（例えば、慢性の骨髄性白血病の患者か
らの白血球内における染色体９及び22の遠心端間での転
座、そしてバーキットリンパ腫の患者のリンパ球内にお
ける染色体８及び14の転座）を検出するために用いられ
る。この例においては、乳がん細胞における多数の染色
体転座を検出する本発明の方法に組み合わされたスペク
トラキューブ・システムの機能が説明される。
さて、図10a−ｂ、11a−ｂ、12及び13を参照する。乳
がん細胞の染色体スプレッドは、上記表３および４に詳
述されたように、24の染色体ペイント（１から22、Ｘ及
びＹ）で交雑され、上記例２のところで詳述されるよう
に、スペクトル的に画像化された。図10a及び11aは、従
来の蛍光顕微鏡を用いて撮られた、染色体スプレッドの
DAPIＲバンディングを示す。この核型はかなり異常であ
るけれども、図10a及び11aで染色体の特定な転座を識別
することは不可能であることが分かる。図10b及び11b
（各々、白黒及びカラー）は、スペクトラキューブ・シ
ステム及び本発明の方法を用いて得られた、同じスプレ
ッドのRGB画像である。他の同一実験条件下で得られた
人間の正常な核型を提示する図9a−ｂと比較すると、図
10b及び11bに示された染色体を含む異常の多くは、人間
の種々の正常な染色体の一部をも含むことが明らかであ
る。図10b及び11bの転座した染色体（右）は、Ｒバンド
の染色体（左）と共に図12及び13に示されている。図12
及び13に示された転座染色体のいくつかは、二つ、三
つ、さらには四つの異なる染色体から発生した分裂片を
含むことが分かる。特定の染色体の転座及び他の染色体
の異常（例えば、遺伝子増幅）は、以前から、悪性腫瘍
の早期あるいは段階特性に結びつけられており、また、
このような転座及び他の異常を検出し描写する能力は、
本発明の方法によってかなり増進されるため、本発明の
方法を用いる悪性腫瘍の早期発見及び分類の能力には大
きな恩恵がある。さらに、本発明の方法を用いること
で、特定の悪性腫瘍と繰り返して関連づけられるさらに
新しい染色体特性の異常（例えば、転座）に関する知識
の確立が可能であり、その結果、このような転座に対す
る包括的なガイドの提供が可能となる。さらに、このよ
うな再発性的な異常に関する知識は、遺伝子を活性化さ
れる、あるいは非活性化されることによって悪性の過程
に関連がある遺伝子の分離につながるかもしれない。
このようなことを考慮すると、この例と前記例２とに
用いられた発蛍光団は、（表３にリストアップされ図7a
−ｃに示されたように）全体として、480−730ナノメー
トルの範囲で発光することに気付くことは重要である。
なぜなら、DAPIは、このスペクトル範囲のかなり下にあ
る青色で発光するため、対比染色にDAPIを同時に用いる
ことが可能であるからである。したがって、図10a−
ｂ、11a−ｂ、12及び13に示されるように、同一の染色
体スプレッドを、従来の単色Ｒバンディング・アプロー
チと、本発明の多色アプローチによって同時に観察可能
である。測定スペクトル範囲を青色に制限することによ
って、スペクトラキューブ・システムにより、従来のDA
PIＲバンディング画像が提供可能であることは明らかで
ある。したがって、比較の目的で、単一染色体スプレッ
ドは、DAPIＲバンドの核型あるいはカラー核型として、
スペクトラキューブ・システム及び本発明の方法を用い
て視検されてもよい。このため、染色体の転座による事
象が本発明の方法によって研究されるとき、DAPIＲバン
ドの核型は、さらなる情報を提供し、正確にどの特定の
染色体のどの領域（すなわち、バンド）が特定の転座事
象に関連しているかを指摘することが可能である。
例4: さらなるFISHの応用 上記の説明から、次のことが明らかである。（１）数
種類のプローブがFISHに使用可能である。これらには、
遺伝子座特定プローブ、染色体ペイント及びゲノム全体
が含まれる。（２）分析される染色体は、細胞分裂、有
糸分裂あるいは減数分裂中であってもよい。（３）すべ
てのタイプのプローブが、多数、染色体に同時に交雑さ
れてもよい。また、プローブの各々が幾分異なるスペク
トルを持つという条件で、本発明の方法に従って用いら
れるスペクトラキューブ・システムは、スペクトル的に
プローブの各々を検出し、スペクトルの各々を表すピク
セルにRGB色（すなわち、擬似色）あるいは所定の人工
色を当てることによってその立体的な構成を明らかにす
ることが可能である。
したがって、例えば、もし本発明の方法が、新たに単
離された遺伝子（あるいは他のDNA連鎖）をマップする
ために用いられるのなら、染色体バンドへ遺伝子をマッ
プするのに単一の手法が用いられ得る。この目的に対し
て、二つの新たな遺伝子に対して例示する。まず、26の
異なるプローブ、24の染色体ペイント及び二つの遺伝子
座特定プローブ（すなわち、蛍光的にラベル付けされた
新たに単離された遺伝子）が準備される。次に、プロー
ブは、混ぜられ、好ましくは、DAPI対比染色された有糸
分裂の染色体に同時に交雑される。その結果は、24（男
性の場合、あるいは女性の場合23）色の核型であり、図
9bで示すものに類似している。さらに異なる二つの色が
着いた二つの遺伝子座特性信号（遺伝子座特定プローブ
に分類された点）は、新たに単離された遺伝子の染色体
の位置を示す。これらは、次に、上記に説明されたよう
に、Ｒバンド画像を生成することによって、特定の染色
体バンドと関連づけられる。
多くの場合、遺伝子座特定プローブが、一つの染色体
バンドにマップされることはほとんどなく、どれが近位
あるいは遠位であるのかは未だに確立されていない。各
々が異なるRGBあるいは人工色として現われるように、
少数のプローブの各々を同時に検出するために本発明の
方法を用いることは、多く場合、密接にマップされた連
鎖の相対的な構成を決定することを可能にする。
スペクトラキューブ・システム及び本発明の方法は、
細胞分裂間期染色体の三次元配置を検出するために用い
られてもよい。図8a及び9aを再び参照する。右上角に示
された（NIと記された）ものは、上記表４にリストアッ
プされた染色体ペイントで交雑された細胞分裂間期中の
核である。この核のカラー・パターンの観察から、独特
な特徴が明らかになる。例えば、（赤色の）染色体２の
対の両方が核の低い部分に位置しており、（紫色の）染
色体６の対は共にその反対側の極に位置していることが
分かる。細胞分裂間期中にある染色体組織については、
未だに分からないことが多いが、悪性細胞においては、
細胞分裂間期中に染色体組織に変化が起こるのではない
かと推測できる。したがって、本発明の方法は、種々の
悪性腫瘍の早期発見を行う、悪性の病気の段階を定義す
る、また、それゆえに、診察患者等への治療をより適切
に行えるという点で、大変価値が高いものである。本発
明の方法に組み合わされたスペクトラキューブ・システ
ム及び三次元再構築手段（例えば、共焦点顕微鏡）は、
細胞分裂間期中の染色体組織の三次元情報を引き出すた
めに用いられることが分かる。
多くのがん及び遺伝子障害は、染色体欠失、転座、他
の転位及び大きな異常（例えば、遺伝子増幅）から起こ
る。上記例３に説明されたように、本発明の方法を用い
ることによって、このような異常を検出する能力が向上
される。さらに、上記に説明されたように、本発明の方
法は、比較ゲノム・ハイブリダイゼーション（CGH）及
び逆染色体彩色に非常に適していることが明らかであ
る。
一般的な染色体異常の一つが、ダウン症候群と結び付
けられる。ダウン症が染色体21の三染色体性が原因で生
じることはかなり以前に確立されている。より注意深く
観察することによって、染色体21（21q22）の特定の領
域が、この一般的な徴候に常に関連づけられる（すなわ
ち、三染色体として現われる）。しかし、従来のＧある
いはＲバンディングによる核型作成技術によって測定さ
れたダウン症の人の核型が見かけ上正常である場合があ
る。この現象への説明として、これらの場合の三染色体
性は、2q22染色体領域からの分裂片に見られるが、この
分裂片は、従来のバンディング技術の解像度以下に小さ
なものであるためとするものが広く受け入れられてい
る。しかし、本発明の方法と組み合わされたスペクトラ
キューブ・システムを用いることによって、これまで検
出不可能であった（例えば、絨毛膜絨毛を介しての試料
採取で得られた）胚芽細胞内の染色体21の三染色体が検
出可能であり、この危険性が高い女性たちへの、知識に
基づいた遺伝子カウンセリングが可能になる。染色体13
及び染色体18あるいはその分裂片が、極めて異常な子供
の出生を引き起こす三染色体を生じるという報告もある
が、本発明の方法は、これらの破壊的な染色体13あるい
は18の三染色体性の胎児期の診断のために同様に適用さ
れ得るということにも注意すべきである。
急速に発展している、妊娠女性の血液から胚芽細胞を
分離する技術と組み合わされた本発明の方法は、染色体
21の三染色体性及び他の頻度の少ない染色体異常を検出
するのに危険性が少ない、胎児期の核型作成に対して非
常に価値が高いものである。
染色体末端小粒特定プローブと組み合わせてスペクト
ラキューブ・システム及び本発明の方法を用いることに
よって、末端小粒（人間の男性に48、女性に46）の各々
は、異なる色に現われるため、調べられる種におけるす
べての末端小粒の比較研究を可能にする。
進化論的に関連のある種の研究及びモデル・システム
（例えば、人間に対するモデル・システムとしてのねず
み）の研究においては、多く場合、二つ以上の種の染色
体が連鎖相似性に従って整列されて染色体を媒介とする
遺伝子情報が見い出される比較ゲノム・マップを得るこ
とが要求される。本発明の方法を用いることは、このよ
うな比較マップを得ることを容易にする。例えば、人間
とねずみとの染色体比較マップを構築することを考察す
る。この目的のために、一つの種の染色体ペイントの完
全なセット（例えば、人間のもの）が他の種の（この例
ではねずみの）染色体スプレッドに同時に交雑され、上
記に説明されたように分析される。結果は、人間の染色
体ペイントで彩色された、ねずみの核型の画像が得られ
る。したがって、この二つの種の核型間での位置合わせ
が可能である。
FISHに対する多くの他の用途がこの技術の文献に述べ
られている。一つの例は、遺伝子表現の研究である。同
期細胞培養から周期的に得られる細胞分裂間期の核で交
雑された遺伝子座特定プローブを用いることによって、
再現の度合いを測定することができ（すなわち、複製さ
れない遺伝子は二つの点として現れるが、複製された遺
伝子は四つの点として現れる）、決まって、早い時期に
複製する遺伝子が、遅く複製する遺伝子よりも測定細胞
内に表現される。本発明の方法は、各々が僅かに異なる
スペクトルを持つ多数のプローブが、一回の交雑で同時
に分析された後に一回の結像ステップによってすべて測
定される、このタイプの分析に非常に適している。事
実、本発明の方法は、これまでに述べられた、あるいは
これから現れるいかなるFISHの用途に対しても使用可能
である。
本発明は、限られた数の実施例に関して説明された
が、本発明について多くの変形、改良及び他の適用が行
なわれ得ることは明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート エー バックワルド イスラエル国、ラマト イシャイ 30095、ハダガンストリート (72)発明者 ダーク ジー ソエンクセン アメリカ合衆国、カリフォルニア 92008、カールスバッド、チェシャイア 3638 (72)発明者 ニル カチール イスラエル国、ギバト エラー 23800、 ハガリル ３ (72)発明者 デービッド ワイン イスラエル国、ティムラート23840、ハ ーロン15 (72)発明者 モーシェ ラビ イスラエル国、キルヤート チャイム 26254、ハキブチム２ (56)参考文献 特開 平１−113637（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−319631（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−249115（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−332922（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−94617（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−300630（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−300631（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−300633（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−301562（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−139237（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−104238（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−242368（ＪＰ，Ａ) ＳＣＩＥＮＣＥ，1996年 ７月26日, ＶＯＬ．273，ｐ494−497 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 21/00 - 21/65 G01J 3/00 - 3/52 実用ファイル（ＰＡＴＯＬＩＳ) 特許ファイル（ＰＡＴＯＬＩＳ)

Claims (29)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）各々が異なる発蛍光団又は異なる発
    蛍光団の組合せによってラベル付けされる少なくとも一
    つの核酸プローブで交雑された複数の染色体又は染色体
    の部分を持つ細胞核を準備し、 （ｂ）結像分光計に光学的に接続された蛍光顕微鏡を使
    用して、前記細胞核を視検して、 （ｉ）コリメーター光学系を用いて前記細胞核のすべて
    のピクセルから同時に入射光を集め、 （ii）複数の要素を持つ干渉計システムを介して前記平
    行入射光を通すことによって前記光を先ず２つのコヒー
    レント光線に分け、前記干渉計内の各々異なる方向に移
    動させ、次いでこれら２つのコヒーレント光線を再び結
    合させ、各々を他と干渉させて射出光線を形成し、 （iii）検出器要素の二次元アレイを持つ検出器上に前
    記射出光を集束させる焦点調節光学系に前記射出光を通
    し、測定の全持続時間にわたる各瞬間において前記検出
    器要素の各々により前記細胞核の同じ一つのピクセルの
    画像を生成し、前記細胞核の実像が前記検出器要素のア
    レイの面上で動かず、測定のどの時点においても該像が
    視認でき識別可能であるようにし、前記検出器要素の各
    々により、異なる波長において、その時々の光路差の関
    数である、前記ピクセルにより出される光の強さの特定
    の一次的な組合せとなる信号を生成し、 （iv）前記干渉計システムの前記要素の一つ或いは幾つ
    かを回転或いは移動させることにより、前記干渉計シス
    テムによって生成された前記２つのコヒーレント光線間
    の前記光路差を、前記細胞核のすべてに対して同時に走
    査し、 （ｖ）前記検出器要素の各々の信号を時間の関数として
    記録装置により記録することによってデータの第１のス
    ペクトル・キューブを生成し、 （ｃ）前記データの第１のスペクトル・キューブを数学
    的アルゴリズムを用いて解釈し、前記複数の染色体又は
    複数の染色体の部分の各々が異なる色の一つに対応する
    ような形態で、前記複数の染色体又は複数の染色体の部
    分を表す像を、異なる色を用いて提示する、 ことを特徴とする蛍光ハイブリダイゼーション方法。
  2. 【請求項２】前記少なくとも一つの核酸プローブは、少
    なくとも一つの遺伝子座、少なくとも染色体の一つの分
    裂片、インサートを含む少なくとも一つの酵母人工染色
    体、インサートを含む少なくとも一つのプラスミド、イ
    ンサートを含む少なくとも一つのコスミド、インサート
    を含む少なくとも一つのファゲミド、インサートを含む
    少なくとも一つのウイルス・ベクター、一つの核種の完
    全なゲノム、がん組織の完全なゲノム及びそれらの組合
    せからなるグループから選択される請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】前記少なくとも一つの発蛍光団は、少なく
    とも一つの蛍光性組合せ染料である請求項１に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】前記細胞核は、分裂期間中の細胞核、有糸
    分裂中の細胞核及び減数分裂中の細胞核からなるグルー
    プから選択される請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】核酸プローブの数は、23、24及び24より大
    きい数からなる数のグループから選択され、前記プロー
    ブの各々は、異なる発蛍光団あるいは前記発蛍光団の異
    なる組合せを含む請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記染色体が、細胞分裂間期の染色体、有
    糸分裂中の染色体及び減数分裂中の染色体からなるグル
    ープから選択される請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記数学的アルゴリズムが、前記細胞核に
    おける前記ピクセルの各々の前記スペクトルのポイント
    演算分析である請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記ポイント演算分析は、変換関数に従っ
    て、前記細胞核における前記ピクセルの各々の前記スペ
    クトルをスカラーへマップすることを含む請求項７に記
    載の方法。
  9. 【請求項９】前記ポイント演算分析は、変換関数に従っ
    て、前記細胞核における前記ピクセルの各々の前記スペ
    クトルをもう一つのスペクトルへマップすることを含む
    請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記数学的アルゴリズムは、前記細胞核
    内の前記染色体の相対的な大きさを求める形態学的分析
    である請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記数学的アルゴリズムは、前記ピクセ
    ルの各々の前記スペクトルについて少なくとも一つの基
    準スペクトルからのスペクトル差を計算する分類マッピ
    ング分析である請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記分類マッピング分析は、前記複数の
    基準スペクトルの一つからの所定の最大スペクトル差を
    持つピクセルのグループが所定人工色で彩色される多色
    画像を生成する請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記スペクトル差は、前記ピクセルの各
    々の前記スペクトルと前記複数の基準スペクトルの一つ
    との間の差の絶対値の予め定められた波長範囲に対する
    不定積分として定義されるスカラーである請求項12に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】前記数学的アルゴリズムが主成分分析で
    ある請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記主成分分析は、 （ａ）多数の波長が用いられるときは励起源の波長をも
    含めて、全ての前記ピクセル及び前記測定の前記波長に
    対する共変マトリクスを形成すること、 （ｂ）前記共変マトリクスを対角化し、独立直交スペク
    トル基底要素のすべてを見いだすこと、 （ｃ）前記基底要素あるいはそれらの組合せのいずれ
    が、前記細胞核における特定の特徴をタグするかを見い
    だすことを含む請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記数学的アルゴリズムが一次結合分析
    である請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記一次結合分析がスペクトルの正規化
    のためにある請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記一次結合分析は、算術関数によっ
    て、前記ピクセルの各々の前記スペクトルのすべての波
    長に任意のスカラーを適用することを含み、前記関数
    は、加法、減法、乗法、除法及びそれらの組合せからな
    るグループから選択される請求項16に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記一次結合分析は、前記細胞核の背景
    領域に位置するピクセルのスペクトルが、前記細胞核の
    前記ピクセルの前記スペクトルから引き算される背景除
    去のためにある請求項16に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記一次結合分析は、前記細胞核を視検
    する前に測定されたスペクトルが、前記細胞核の前記ピ
    クセルの前記スペクトルを割るためにある較正方法のた
    めのものである請求項16に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記数学的アルゴリズムは、予め定めら
    れた波長範囲を用いて、赤、緑、青のカラー画像を計算
    する請求項１に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記赤、緑、青のカラー画像がコントラ
    スト延伸アルゴリズムによって修正される請求項21に記
    載の方法。
  23. 【請求項２３】前記数学的アルゴリズムは、前記ピクセ
    ルの前記スペクトルの各々について、異なる二つの波長
    における輝度の間の比を計算する請求項１に記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】前記数学的アルゴリズムは、前記ピクセ
    ルの前記スペクトルの各々について、異なる二つの波長
    における輝度の間の比を計算し、この計算された比に従
    って、前記ピクセルの各々をより明るいあるいはより暗
    い人工色で彩色する請求項１に記載の方法。
  25. 【請求項２５】前記方法は、胎児の細胞のカラー核型、
    白血球のカラー核型、悪性細胞のカラー核型及び悪性腫
    瘍の検査が行なわれる細胞のカラー核型を提供すること
    からなるグループから選択される用途に適用される請求
    項１に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記胎児の細胞は、妊娠女性の抹消血液
    から単離された繊毛膜繊毛細胞及び胎児細胞からなるグ
    ループから選択される請求項25に記載の方法。
  27. 【請求項２７】前記方法は、人間の染色体21、人間の染
    色体バンド21q22、人間の染色体バンド21q22の分裂片、
    人間の染色体18、人間の染色体18の分裂片、人間の染色
    体13及び人間の染色体13の分裂片からなるグループから
    選択された遺伝物質の三染色体を検出するものである請
    求項26に記載の方法。
  28. 【請求項２８】悪性腫瘍の検査が行なわれた前記細胞の
    前記カラー核型を提供することによりカラーの転座マッ
    プを得る請求項25に記載の方法。
  29. 【請求項２９】前記悪性細胞の前記カラー核型を提供す
    ることによりカラーの転座マップを得る請求項25に記載
    の方法。
JP52295097A 1995-12-20 1996-12-10 スペクトル生体結像方法および蛍光ｄｎａハイブリダイゼーション方法 Expired - Fee Related JP3474579B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/575,191 1995-12-20
US08/575,191 US5936731A (en) 1991-02-22 1995-12-20 Method for simultaneous detection of multiple fluorophores for in situ hybridization and chromosome painting
PCT/US1996/020022 WO1997022848A1 (en) 1995-12-20 1996-12-10 Method for simultaneous detection of multiple fluorophores for in situ hybridization and chromosome painting

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH11503239A JPH11503239A (ja) 1999-03-23
JP3474579B2 true JP3474579B2 (ja) 2003-12-08

Family

ID=24299305

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP52295097A Expired - Fee Related JP3474579B2 (ja) 1995-12-20 1996-12-10 スペクトル生体結像方法および蛍光ｄｎａハイブリダイゼーション方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US5936731A (ja)
EP (2) EP0832417B1 (ja)
JP (1) JP3474579B2 (ja)
DE (1) DE69629374T2 (ja)
IL (1) IL121425A (ja)
WO (1) WO1997022848A1 (ja)

Families Citing this family (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5817462A (en) * 1995-02-21 1998-10-06 Applied Spectral Imaging Method for simultaneous detection of multiple fluorophores for in situ hybridization and multicolor chromosome painting and banding
JP5161052B2 (ja) * 2008-12-04 2013-03-13 オリンパス株式会社 顕微鏡システム、標本観察方法およびプログラム
US6043037A (en) * 1995-02-06 2000-03-28 The Regents Of The University Of California Rapid method for measuring clastogenic fingerprints using fluorescence in situ hybridization
CA2241364A1 (en) * 1995-12-22 1997-07-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting multiparametric fluorescence in situ hybridization
US6007994A (en) 1995-12-22 1999-12-28 Yale University Multiparametric fluorescence in situ hybridization
WO1998017992A2 (en) * 1996-10-25 1998-04-30 Applied Imaging, Inc. Multifluor-fluorescence in situ hybridization (m-fish) imaging techniques using multiple multiband filters with image registration
US6119031A (en) 1996-11-21 2000-09-12 Boston Scientific Corporation Miniature spectrometer
GB9704054D0 (en) 1997-02-27 1997-04-16 Univ Cambridge Tech Assay
US6294331B1 (en) 1997-08-08 2001-09-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for assessing genetic and phenotypic markers by simultaneous multicolor visualization of chromogenic dyes using brightfield microscopy and spectral imaging
US7901887B2 (en) * 1998-05-09 2011-03-08 Ikonisys, Inc. Automated cancer diagnostic methods using fish
US20080241848A1 (en) * 1998-05-09 2008-10-02 Ikonisys, Inc. Methods for prenatal diagnosis of aneuploidy
US20090111101A1 (en) * 1998-05-09 2009-04-30 Ikonisys, Inc. Automated Cancer Diagnostic Methods Using FISH
JP2002514762A (ja) 1998-05-09 2002-05-21 アイコニシス，インコーポレーテッド コンピュータによって制御された、胎児細胞を含む希少細胞に基づく診断のための方法および装置
AT410718B (de) * 1998-10-28 2003-07-25 Schindler Hansgeorg Dr Vorrichtung zur visualisierung von molekülen
GB2361996B (en) * 1998-10-29 2004-05-12 Cell Works Inc Multiple marker characterization of single cells
DE19855180A1 (de) * 1998-11-30 2000-05-31 Metabion Gmbh Ges Fuer Angewan in situ-Hybridisierungsverfahren
US6738502B1 (en) 1999-06-04 2004-05-18 Kairos Scientific, Inc. Multispectral taxonomic identification
US7068829B1 (en) * 1999-06-22 2006-06-27 Lumeniq, Inc. Method and apparatus for imaging samples
JP4849755B2 (ja) * 1999-07-02 2012-01-11 ハイパースペクトラル・イメージング・インコーポレイテツド イメージング装置および試料分析方法
DE19935766A1 (de) * 1999-07-29 2001-02-01 Friedrich Schiller Uni Jena Bu Verfahren zur optischen Anregung von Fluorophor-markierter DNA und RNA
AU1026301A (en) * 1999-10-18 2001-04-30 Michael Speicher Simultaneous visualization of eu- and heterochromatin
US6748259B1 (en) * 2000-06-15 2004-06-08 Spectros Corporation Optical imaging of induced signals in vivo under ambient light conditions
US6947133B2 (en) * 2000-08-08 2005-09-20 Carl Zeiss Jena Gmbh Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors
JP3913972B2 (ja) * 2000-11-20 2007-05-09 富士フイルム株式会社 画像データ生成方法および装置
FR2817986B1 (fr) * 2000-12-07 2003-03-28 Lyon Ecole Centrale Procede de classification d'une image en couleur selon la prise de vue en exterieur ou en interieur
DE10065784C2 (de) * 2000-12-30 2003-12-04 Leica Microsystems Verfahren zum Auffinden von Kontaktstellen zwischen Zellen in einer stimulierbaren mikroskopischen Probe bei einer Kalziummigration und Scanmikroskop zur Durchführung des Verfahrens
AU2002251830A1 (en) * 2001-01-26 2002-08-06 Colorado State University Research Foundation Analysis of gene expression and biological function using optical imaging
AU2002303150A1 (en) * 2001-03-26 2002-10-08 Cellomics, Inc. Methods for determining the organization of a cellular component of interest
US7219016B2 (en) 2001-04-20 2007-05-15 Yale University Systems and methods for automated analysis of cells and tissues
US20020169730A1 (en) * 2001-08-29 2002-11-14 Emmanuel Lazaridis Methods for classifying objects and identifying latent classes
US20050032060A1 (en) * 2001-08-31 2005-02-10 Shishir Shah Arrays comprising pre-labeled biological molecules and methods for making and using these arrays
US7439346B2 (en) * 2001-10-12 2008-10-21 Perkinelmer Las Inc. Nucleic acids arrays and methods of use therefor
JP2003222587A (ja) * 2001-11-20 2003-08-08 Hitachi Ltd 非破壊劣化診断方法およびその診断装置
US7383134B2 (en) * 2002-01-15 2008-06-03 Piper James R Method and/or system for analyzing biological samples using a computer system
US7133547B2 (en) * 2002-01-24 2006-11-07 Tripath Imaging, Inc. Method for quantitative video-microscopy and associated system and computer software program product
US20040115683A1 (en) * 2002-01-28 2004-06-17 Medford June Iris Analysis of gene expression and biological function using optical imaging
US6916621B2 (en) * 2002-03-27 2005-07-12 Spectral Genomics, Inc. Methods for array-based comparitive binding assays
DE10222779A1 (de) * 2002-05-16 2004-03-04 Carl Zeiss Jena Gmbh Verfahren und Anordnung zur Untersuchung von Proben
JPWO2004036162A1 (ja) * 2002-07-26 2006-02-16 オリンパス株式会社 画像処理システム
US7773802B2 (en) * 2002-07-26 2010-08-10 Olympus Corporation Image processing system with multiple imaging modes
WO2005044086A2 (en) * 2003-10-30 2005-05-19 Tufts-New England Medical Center Prenatal diagnosis using cell-free fetal dna in amniotic fluid
JP4088313B2 (ja) * 2004-01-23 2008-05-21 オリンパス株式会社 画像処理システム、院内処理システム
EP1766061B1 (en) * 2004-05-20 2013-07-17 Quest Diagnostics Investments Incorporated Single label comparative hybridization
US8103331B2 (en) 2004-12-06 2012-01-24 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Systems and methods for in-vivo optical imaging and measurement
ATE491941T1 (de) * 2005-01-27 2011-01-15 Quest Diagnostics Invest Inc Schnelle komparative genomhybridisierung
JP2006263044A (ja) * 2005-03-23 2006-10-05 Fuji Photo Film Co Ltd 蛍光検出システム
US20060292576A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Quest Diagnostics Investments Incorporated Non-in situ hybridization method for detecting chromosomal abnormalities
US8968700B2 (en) * 2005-08-11 2015-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Imaging of protease activity in live cells using activity based probes
EP1937849B1 (en) 2005-10-27 2019-05-29 The President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for labeling nucleic acids
US8076074B2 (en) 2005-11-29 2011-12-13 Quest Diagnostics Investments Incorporated Balanced translocation in comparative hybridization
US8217943B2 (en) * 2006-04-21 2012-07-10 Beckman Coulter, Inc. Displaying cellular analysis result data using a template
AU2007248424B2 (en) 2006-05-05 2013-04-18 Historx, Inc. Immunohistochemical methods for determining signal transduction activity in tumors
US20070263941A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-15 Tandent Vision Science, Inc. Method and system for removing path radiance effects from an image
WO2007139927A1 (en) * 2006-05-26 2007-12-06 The Cleveland Clinic Foundation Method for measuring biomechanical properties in an eye
WO2007143141A2 (en) * 2006-06-01 2007-12-13 The General Hospital Corporation In-vivo optical imaging method including analysis of dynamic images
EP2047262A4 (en) 2006-07-13 2011-03-16 Univ Yale PROGNOSTIC METHODS OF CANCER FROM THE SUBCELLULAR LOCATION OF BIOMARKERS
US8203716B2 (en) * 2006-10-30 2012-06-19 Georgia Tech Research Corporation Tandem Fabry-Perot etalon cylindrical beam volume hologram for high resolution/large spectral range diffuse light spectroscopy
US7807359B2 (en) * 2006-12-01 2010-10-05 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods of detecting TPMT mutations
US8244021B2 (en) * 2006-12-20 2012-08-14 Ventana Medical Systems, Inc. Quantitative, multispectral image analysis of tissue specimens stained with quantum dots
CN101622538B (zh) * 2007-02-14 2012-09-26 宝丽化学工业有限公司 支持鉴别角质细胞的方法
US7507539B2 (en) * 2007-07-30 2009-03-24 Quest Diagnostics Investments Incorporated Substractive single label comparative hybridization
US8265360B2 (en) * 2007-08-31 2012-09-11 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and systems for analyzing ratiometric data
US8093063B2 (en) * 2007-11-29 2012-01-10 Quest Diagnostics Investments Incorporated Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids
US9176006B2 (en) * 2008-01-15 2015-11-03 Mobileye Vision Technologies Ltd. Detection and classification of light sources using a diffraction grating
US8143600B2 (en) * 2008-02-18 2012-03-27 Visiongate, Inc. 3D imaging of live cells with ultraviolet radiation
US20110118125A1 (en) * 2008-05-03 2011-05-19 Tufts Medical Center, Inc. Neonatal salivary genomics
US8199999B2 (en) 2008-06-17 2012-06-12 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Image classifier training
JP4612088B2 (ja) * 2008-10-10 2011-01-12 トヨタ自動車株式会社 画像処理方法、塗装検査方法及び装置
DK200801722A (en) * 2008-12-05 2010-06-06 Unisensor As Optical sectioning of a sample and detection of particles in a sample
US8039794B2 (en) * 2008-12-16 2011-10-18 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry assay for thiopurine-S-methyl transferase activity and products generated thereby
AU2010226726B8 (en) 2009-03-16 2014-08-14 Pangu Biopharma Limited Compositions and methods comprising histidyl-tRNA synthetase splice variants having non-canonical biological activities
CN102449143B (zh) 2009-03-31 2017-11-14 Atyr医药公司 包含具有非常规生物活性的天冬氨酰‑tRNA合成酶的组合物和方法
AU2010298000A1 (en) * 2009-09-25 2012-04-05 Signature Genomics Laboratories Llc Multiplex (+/-) stranded arrays and assays for detecting chromosomal abnormalities associated with cancer and other diseases
CN103118692A (zh) 2010-04-26 2013-05-22 Atyr医药公司 与半胱氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
JP6294074B2 (ja) 2010-04-27 2018-03-14 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
US8993723B2 (en) 2010-04-28 2015-03-31 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of alanyl-tRNA synthetases
JP5985140B2 (ja) 2010-04-28 2016-09-06 ソニー株式会社 蛍光強度補正方法、蛍光強度算出方法及び蛍光強度算出装置
US8986680B2 (en) 2010-04-29 2015-03-24 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Asparaginyl tRNA synthetases
AU2011246976B2 (en) 2010-04-29 2016-01-28 Allarity Therapeutics Europe ApS Methods and devices for predicting treatment efficacy
WO2011150279A2 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutaminyl-trna synthetases
CN103118693B (zh) 2010-04-29 2017-05-03 Atyr 医药公司 与缬氨酰‑tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
US8961961B2 (en) 2010-05-03 2015-02-24 a Tyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related protein fragments of arginyl-tRNA synthetases
AU2011248227B2 (en) 2010-05-03 2016-12-01 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-tRNA synthetases
EP2566496B1 (en) 2010-05-03 2018-02-28 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of methionyl-trna synthetases
WO2011140267A2 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of p38 multi-trna synthetase complex
CN103200953B (zh) 2010-05-14 2017-02-15 Atyr 医药公司 与苯丙氨酰‑β‑tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
AU2011256366C1 (en) 2010-05-17 2017-06-15 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of leucyl-tRNA synthetases
EP2575857B1 (en) 2010-06-01 2018-01-24 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-trna synthetases
AU2011289831C1 (en) 2010-07-12 2017-06-15 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases
WO2012027611A2 (en) 2010-08-25 2012-03-01 Atyr Pharma, Inc. INNOVATIVE DISCOVERY OF THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, AND ANTIBODY COMPOSITIONS RELATED TO PROTEIN FRAGMENTS OF TYROSYL-tRNA SYNTHETASES
JP5601098B2 (ja) * 2010-09-03 2014-10-08 ソニー株式会社 蛍光強度補正方法及び蛍光強度算出装置
JP5384453B2 (ja) 2010-09-09 2014-01-08 シャープ株式会社 測定装置、測定システム、測定方法、制御プログラム、および、記録媒体
EP2520923A1 (en) * 2011-05-06 2012-11-07 bioMérieux Bio-imaging method and system
WO2012163541A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Medical Prognosis Institute A/S Methods and devices for prognosis of cancer relapse
US9212381B2 (en) 2011-11-10 2015-12-15 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for labeling polypeptides
WO2013123432A2 (en) 2012-02-16 2013-08-22 Atyr Pharma, Inc. Histidyl-trna synthetases for treating autoimmune and inflammatory diseases
US8755580B2 (en) * 2012-03-17 2014-06-17 Sony Corporation Flourescent dot counting in digital pathology images
JP5576993B2 (ja) 2012-05-30 2014-08-20 パナソニック株式会社 画像計測装置、画像計測方法及び画像計測システム
KR102174578B1 (ko) 2012-11-27 2020-11-06 폰티피씨아 유니베르시다드 까똘리까 데 칠레 갑상선 종양을 진단하기 위한 조성물 및 방법
WO2014195032A1 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Medical Prognosis Institute A/S Methods and devices for predicting treatment efficacy of fulvestrant in cancer patients
WO2016008048A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Ontario Institute For Cancer Research Methods and devices for predicting anthracycline treatment efficacy
US9928403B2 (en) * 2016-02-09 2018-03-27 Molecular Devices, Llc System and method for image analysis of multi-dimensional data
WO2017210322A1 (en) * 2016-05-31 2017-12-07 The Regents Of The University Of Michigan Biomarker ratio imaging microscopy
US10823945B2 (en) * 2017-01-10 2020-11-03 Tsinghua University Method for multi-color fluorescence imaging under single exposure, imaging method and imaging system
NL2020377B1 (en) * 2018-02-05 2019-08-14 Lumicks Tech B V Methods and devices for determining a guest structure on a host structure
WO2020014036A1 (en) * 2018-07-09 2020-01-16 Ultivue, Inc. Methods for multicolor multiplex imaging
AU2019416121A1 (en) * 2018-12-28 2021-05-20 Becton, Dickinson And Company Methods for spectrally resolving fluorophores of a sample and systems for same
US11703454B2 (en) * 2020-01-03 2023-07-18 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Method and apparatus for multiplexed imaging of spectrally-similar fluorophores

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5563033A (en) * 1985-10-22 1996-10-08 The University Of Massachusetts Medical Center Detection of individual gene transcription
US4930516B1 (en) * 1985-11-13 1998-08-04 Laser Diagnostic Instr Inc Method for detecting cancerous tissue using visible native luminescence
US5121436A (en) * 1987-08-14 1992-06-09 International Remote Imaging Systems, Inc. Method and apparatus for generating a plurality of parameters of an object in a field of view
US4976542A (en) * 1988-07-25 1990-12-11 Washington University Digital array scanned interferometer
US5123055A (en) * 1989-08-10 1992-06-16 International Remote Imaging Systems, Inc. Method and an apparatus for differentiating a sample of biological cells
US5719024A (en) * 1993-08-18 1998-02-17 Applied Spectral Imaging Ltd. Method for chromosome classification by decorrelation statistical analysis and hardware therefore
US5784162A (en) * 1993-08-18 1998-07-21 Applied Spectral Imaging Ltd. Spectral bio-imaging methods for biological research, medical diagnostics and therapy
US5817462A (en) * 1995-02-21 1998-10-06 Applied Spectral Imaging Method for simultaneous detection of multiple fluorophores for in situ hybridization and multicolor chromosome painting and banding
US5798262A (en) * 1991-02-22 1998-08-25 Applied Spectral Imaging Ltd. Method for chromosomes classification
US5377003A (en) * 1992-03-06 1994-12-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Spectroscopic imaging device employing imaging quality spectral filters
US5427910A (en) * 1992-12-09 1995-06-27 Compucyte Corporation Method of cytogenetic analysis
WO1994016104A1 (en) * 1993-01-08 1994-07-21 Ctrc Research Foundation Color imaging system for use in molecular biology
EP0767361B1 (en) * 1993-07-22 2000-02-23 Applied Spectral Imaging Ltd. Method and apparatus for spectral imaging
US5440388A (en) * 1993-08-02 1995-08-08 Erickson; Jon W. Chemical analysis and imaging by discrete fourier transform spectroscopy
US5863504A (en) * 1995-03-16 1999-01-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Fluorescence imaging instrument utilizing fish
US6031232A (en) * 1995-11-13 2000-02-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for the detection of malignant and premalignant stages of cervical cancer
US5834203A (en) * 1997-08-25 1998-11-10 Applied Spectral Imaging Method for classification of pixels into groups according to their spectra using a plurality of wide band filters and hardwire therefore

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＳＣＩＥＮＣＥ，１９９６年 ７月２６日，ＶＯＬ．２７３，ｐ４９４−４９７

Also Published As

Publication number Publication date
DE69629374D1 (de) 2003-09-11
DE69629374T2 (de) 2004-06-24
JPH11503239A (ja) 1999-03-23
IL121425A0 (en) 1998-01-04
US6055325A (en) 2000-04-25
EP0832417A4 (en) 1999-11-03
EP0832417B1 (en) 2003-08-06
US5936731A (en) 1999-08-10
WO1997022848A1 (en) 1997-06-26
EP1367384A1 (en) 2003-12-03
IL121425A (en) 2000-08-13
EP0832417A1 (en) 1998-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3474579B2 (ja) スペクトル生体結像方法および蛍光ｄｎａハイブリダイゼーション方法
US5834203A (en) Method for classification of pixels into groups according to their spectra using a plurality of wide band filters and hardwire therefore
JP3535875B2 (ja) Ｄｎａハイブリダイゼーション、染色体多色彩色及びバンディングのための多数の発蛍光団の同時検出方法
JP4121287B2 (ja) 染色体の分類方法
US6690817B1 (en) Spectral bio-imaging data for cell classification using internal reference
US5991028A (en) Spectral bio-imaging methods for cell classification
EP0935679B1 (en) Method for chromosome classification by decorrelation statistical analysis and hardware therefore
US5912165A (en) Method for chromosome classification by decorrelaiton statistical analysis and hardware therefore
WO1998043042A9 (en) Spectral bio-imaging methods for cell classification

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080919

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090919

Year of fee payment: 6

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees