JP3535875B2 - Ｄｎａハイブリダイゼーション、染色体多色彩色及びバンディングのための多数の発蛍光団の同時検出方法 - Google Patents

Ｄｎａハイブリダイゼーション、染色体多色彩色及びバンディングのための多数の発蛍光団の同時検出方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野及び背景 本発明は、一般に、多数の発蛍光団を同時に検出する
ための方法に関する。本発明は、特に、各々が異なる発
蛍光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされた多
数の染色体ペイント及び／あるいは遺伝子座特定プロー
ブを用いて、蛍光DNAハイブリダイゼーションを検出し
分析することを目的とするスペクトル結像方法に関す
る。特に、本発明は、染色体多色バンディング（すなわ
ち、バー・コード化）の方法に関する。この方法におい
ては、各染色体は、発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せ
でラベル付けされた染色体分裂片のグループを用いて確
立される特定バンディング・パターンを得る。また、こ
の方法は、下記において、交雑に基づく染色体多色バン
ディングとも呼ばれるものである。多数の発蛍光団の同
時検出のための本発明の方法は、立体解像度及びスペク
トル解像度が高感度であり、多数の発蛍光団及び／ある
いは発蛍光団の組合せを同時に検出することが可能であ
る。このため、本発明の方法は、ヒト等の生物学的種か
ら、蛍光彩色された染色体、多数の遺伝子座及び／ある
いは染色体特定多色バンディング・パターンの全セット
を検出するために用いられ、各染色体が特定な色によっ
て識別される完全な多色核型及び各染色体が特定多色バ
ンディング・パターンによって識別される完全な染色体
多色バンディングパターンを提供することができる。
分光計は、光を受け入れ、構成波長に分離（分散）
し、波長の関数としての光の輝度であるところの光のス
ペクトルを測定するようにデザインされた装置である。
結像分光計は、情景からの入射光を集め、各ピクセル
（すなわち、画素）のスペクトルを測定するものの一つ
である。
分光分析法は、化学物質構成要素のスペクトルの特徴
に基づいて、材料や処理を特徴づけるために科学及び産
業において何十年間もに渡って用いられている既知の分
析用の手法である。分光分析法の物理的基礎は光と物質
との相互作用にある。もともと、分光分析法は、波長の
関数として、試料から発せられ、送られ、散乱され、あ
るいは反射される光の輝度を高スペクトル解像度で測定
するものであり、立体的な情報は全く得られない。
一方、高解像度分光分析法及び高解像度結像の組合せ
であるスペクトル結像（すなわち、立体的な情報）は、
生物学の試料分析には未だ用いられていない。これまで
のところ最も近いものとしては、生物学的試料から高解
像度の立体的な情報を得ることに関するものがあるが、
例えば、高解像度立体結像が一つあるいはいくつかの異
なる帯域フィルターで行われるとき、これは、僅かに限
られたスペクトル情報を提供するものであり（「SPIE会
報−生体結像及び二次元的分光分析法」［Andersson−E
ngels et al.（1990）Proceedings of SPIE−Bioimagin
g and Two−Dimensional Spectroscopy,1205,pp.179−1
89］を参照）、また、高スペクトル解像度（例えば、全
スペクトル）を得ることに関するものもあるが、立体解
像において試料の小数の箇所に限定される、あるいは試
料全体について平均化されるものである（例えば、アル
ファノ（Alfano）氏他の米国特許第4,930,516号を参
照）。
下記に詳しく述べるが、分光分析法と結像とを結びつ
けることは、種々の生物学研究及び医学的応用に役立つ
ものであり、スペクトル生体結像として下記に言及され
る。スペクトル生体結像の有用性の一つの例としては、
蛍光プローブによって判別した（すなわち、タグを付け
た）後に特定の細胞構成要素（例えば、タンパク質、核
酸連鎖等）を検出するものがある。この用途において
は、一回の測定でいくつかの発蛍光団を同時に識別して
図に表わすためにスペクトル結像が用いられる。事実、
本発明のスペクトル結像特有の高いスペクトル解像度
は、スペクトルが重なる蛍光プローブ（あるいは他の化
学物質構成要素）の分類に理想的である。
概念的に、スペクトル生体結像システムは、（１）測
定システム及び（２）分析ソフトウェアから成る。この
測定システムには、全ての光学機器、エレクトロニク
ス、また、その測定から所望の結果を抽出するに最適な
試料照射（例えば、光源選択）、測定モード（例えば、
蛍光）及び較正の方法が含まれる。分析ソフトウェアに
は、有意義な方法で重要な結果を分析し表示するために
必要な全てのソフトウェア及び数学的アルゴリズムが含
まれる。
スペクトル結像は、地球及び他の惑星についての研究
において、スペクトル吸収特質を識別することによって
重要な洞察を得るために遠隔測定の分野で何十年間も用
いられている。しかし、遠隔測定スペクトル結像システ
ム（例えば、ランドサット、AVIRIS）は、高いコスト、
大きさ及び構成のため、大気中での使用及び人工衛星に
よる使用に限定されている（「SPIE会報−遠隔測定のた
めのセンサ、放射測定及びデータ処理における最近の進
歩」［Maymon and Neeck（1988）Recent Advancesin Se
nsors,Radiometry and Data Processing for Remote Se
nsing,924,pp.10−22;Dozier（1988）Proceedings of S
PIE−Recent Advances in Sensors,Radiometry and Dat
a Processing for Remote Sensing,924,pp.23−30］を
参照）。
スペクトル生体結像システムに関して考慮すべき基本
的な３種類のスペクトル分散方法がある。（ｉ）スペク
トル格子、（ii）スペクトル・フィルター及び（iii）
干渉分光分析法。下記に説明されるが、干渉分光分析法
が本発明の方法を実行するに最適である。しかし、同業
者には明らかであるが、格子及びフィルターに基づくス
ペクトル生体結像システムも、いくつかの応用において
有用である。
スリット・タイプ結像分光計としても知られる、回折
格子（すなわち、モノクロメータ）に基礎を置くシステ
ム、例えばDILORシステム等（「ヨーロッパ医学的光学
週報、SPIE会議での発表」［Valisa et al.（Sep.199
5）presentation at the SPIE Conference European Me
dical Optics Week,BiOS Europe'95,Barcelona,Spain］
を参照）においては、CCD（電荷結合素子）配列検出器
の僅かに一つの軸（空間軸）が実像データを提供し、第
二の（スペクトル）軸が、波長の関数として、格子によ
って分散される光の輝度を測るために用いられる。この
システムは、また、第一の焦点面にスリットを有し、一
時点での視野を１ラインのピクセルに制限している。し
たがって、文献でライン走査として知られる方法でCCD
のスペクトル軸に平行な方向に格子あるいは入射光線を
走査した後にのみ全画像が得られる。測定全体が完了す
るまで二次元画像を視覚化できないことは、測定を行う
前に、視野内における所望の領域を選択すること及び／
あるいはシステムの頂点及び露出時間等を最適化するこ
とを不可能にする。地面上を航行する飛行機（あるいは
人工衛星）は、システムに自然発生的なライン走査メカ
ニズムを提供するため、格子に基づくスペクトル映像装
置が遠隔測定の用途に用いられている。
さらに、一つのフレームのピクセルの大部分は、計測
器の前段光学素子によって実際に入射光が同時に集めら
れるけれども、いかなる時点においても測定されていな
いため、スリット・タイプ結像分光計には大きな欠点が
あることに注意すべきである。その結果は、ある一定の
SN比で必要な情報を得るためには比較的大きな測定時間
が要求されるか、あるいはある測定時間に対してSN比
（感度）はかなり減らされるかのどちらかである。さら
に、スリット・タイプのスペクトル映像装置は、情景全
体に対する必要な情報を集めるのにライン走査を必要と
するため、得た結果には誤差が含まれる。
フィルターに基づくスペクトル分散方法は、さらに、
分離フィルター及びチューナブル・フィルターに分類さ
れる。これらのタイプの結像分光計では、スペクトル画
像は、光路に連続的に狭帯域フィルターを差し込むこと
によって、あるいは超音波光学チューナブル・フィルタ
ー（AOTF）あるいは液晶チューナブル・フィルター（LC
TF）を用いて電子的に周波数帯を走査することによっ
て、情景のすべてのピクセルに対する光を同時に異なる
波長で一度にろ過することによって構築される。下記を
参照。上記に説明した格子を備えたスリット・タイプ結
像分光計と同様に、フィルターに基づくスペクトル分散
方法が用いられる場合は、光の大部分は、いつも拒絶さ
れている。事実、特定波長での画像全体の測定は、測定
される瞬間波長外のすべての光子は阻まれCCDに到達し
ないゆえに可能である。
干渉分光分析法がフィルター及び格子による方法に勝
る感度をもつことの利点は、この技術において、マルチ
プレックスあるいはフェルゲット（Fellgett）利点とし
て知られている（「チェンバリン（1979）干渉分光分析
法の原理」［Chamberlain（1979）The principles of i
nterferometric spectroscopy,John Wiley and Sons,p
p.16−18 and p.263］を参照）。
AOTFs及びLCTFs等のチューナブル・フィルターは、可
動部品がなく、用いられる装置のスペクトル範囲におけ
る特定の波長に調整可能である。チューナブル・フィル
ターをスペクトル結像のための分散方法として用いる一
つの利点は、任意の波長アクセス、すなわち、いかなる
所望の順序においても、フィルター・ホイールを用いる
ことなく複数の波長において画像の輝度が測れる能力に
ある。しかし、AOTFs及びLCTFsには次の不利な点があ
る。（ｉ）制限されたスペクトル範囲（通常、λmax＝
２λmin）、このスペクトル範囲外の他の光全てが遮ら
れなければならない、（ii）感温性、（iii）低い透過
度、（iv）感偏光性及び（ｖ）AOTFsの場合、波長走査
中に画像がずれる影響。
すべてのタイプのフィルター及びチューナブル・フィ
ルターに基づくシステムは、スペクトル解像度の制限、
低い感度、そしてデータを解釈し表示するための使用が
容易で精巧なソフトウェア・アルゴリズムがないという
理由で、何年もの間いかなる用途に対してもスペクトル
結像に、うまく広範囲に利用されてはいない。
上記の点で有利な、画像のスペクトル分析のための方
法及び装置は、1995年２月21日に出願されたカビブ（Ca
bib）氏他の米国特許出願第08/392,019号に開示されて
いる。その内容は、従来のスリットあるいはフィルター
・タイプの結像分光計と比較し、必要フレーム時間をか
なり減少させSN比をかなり増し、ライン走査を必要とせ
ずに、画像の、集められた入射光から利用可能なすべて
の情報を利用する画像スペクトル分析の方法及び装置を
提供するという目的において、参照として、ここに完全
に明らかにされたものとして含まれる。本発明によれ
ば、情景からの入射光を集めることによって情景の各ピ
クセルのスペクトル輝度を測る、情景の光学的イメージ
を分析する方法が提供される。これは、各ピクセルから
発散される光のスペクトル輝度の一次結合の所定セット
に対応する被変調光を出力する干渉計を介して光を透過
させ、検出アレイ上に干渉計から出力された光を集束さ
せ、全てのピクセルに対して独立且つ同時に干渉計内に
生成される光路差（OPD）を走査し、その各ピクセルの
スペクトル輝度を測るために検出アレイの出力を処理す
る（個別にすべてのピクセルの干渉写真を作る）もので
ある。この方法は、全干渉計、干渉計内の要素、あるい
は入ってくる光の入射角を移動することによって干渉写
真を作るためにOPDが変えられる種々のタイプの干渉計
を利用することによって実践される。これら全てのケー
スにおいては、スキャナーが干渉計の一走査を完了する
と、情景すべてのピクセルに対する干渉写真が完成す
る。上記の特徴をもつ装置は、上記に説明されたように
干渉計を利用する点で、従来のスリット及びフィルター
・タイプの結像分光計とは異なるため、集められるエネ
ルギーがアパーチャあるいはスリットで制限されること
はなく、また、入ってくる波長が狭帯域の干渉あるいは
チューナブル・フィルターで制限されることもなく、シ
ステムの処理能力はかなり増す。したがって、干渉計に
基づく装置は、分析されるべき情景の入射光から利用可
能なすべての情報を利用するものであり、これによっ
て、測定時間をかなり減少させSN比（すなわち、感度）
をかなり増やす。
例えば、「地球及び惑星の遠隔測定のための結像分光
計」［John B.Wellman（1987）Imaging Spectrometers
for Terrestrial and Planetary Remote Sensing,SPIE
Proceedings,Vol.750,p.140］に説明された「ほうき」
デザインを考察してみる。ｎを直線アレー内における検
出器の数、m x mをフレーム内におけるピクセル数及び
Ｔをフレーム時間とする。アレーのすべての検出器につ
いて合計される、一つのフレーム内の各ピクセルに使わ
れる合計時間は、nT/m2である。米国特許出願第08/392,
019号に説明された発明の方法において同じサイズのア
レー及びフレーム・レートを用いると、ある特定のピク
セル上のすべての検出器について合計された合計時間は
同じnT/m2である。しかし、従来の格子による方法にお
いては、波長解像度がその範囲の1/nであるため、いつ
も各検出器に検出されるエネルギーは合計の1/n程度で
あるのに対して、米国特許出願第08/392,019号に説明さ
れた発明の方法においては、変調関数は、大きなOPD範
囲の平均が50％の（例えば、ファブリ−ペロがある低フ
ィネス・エアリー関数等のシヌソイド（マイケルソン）
あるいは類似の周期関数）振動関数であるため、エネル
ギーは単一性のあるものである。干渉法のテキスト（例
えば、「干渉分光分析法の原理」［Chamberlain（197
9）The principles of interferometric spectroscopy,
John wiley and Sons,pp.16−18 and p.263］を参照）
に述べられているフェルゲット利点（あるいはマルチプ
レックス利点）の基準処置に基づけば、本発明による装
置の測定SN比が、ノイズ制限の場合には、ノイズ・レベ
ルが信号から独立した状態で（システムあるいは背景の
ノイズが制限された状況）ｎ0.5の因子によって、ま
た、その制限が信号光子ノイズによる場合には、狭いピ
ークの波長の、スペクトル範囲内の、ある特定の波長に
ある信号の平均信号への比の平方根によって改善される
ことを示すことが可能である。したがって、米国特許出
願第08/392,019号に説明された発明によれば、すべての
必要なOPDsは、スペクトルを再構築するのに必要なすべ
ての情報を得るために、情景のすべてのピクセルに対し
て同時に走査される。このため、スペクトル情報は結像
情報と同時に集められる。本発明は、遠隔測定のための
望遠鏡、実験室での分析のための顕微鏡、工場監視及び
医学用画像診断や治療、その他のファイバー・オプティ
ックス等、多くの異なる光学的構成に用いられ得る。
継続出願（参照として含まれる、カビブ（Cabib）氏
他の1995年12月12日に出願された米国特許出願第08/57
1,047号）においては、その目的は、生物学的研究、医
学的診断及び治療のためのスペクトル結像方法を提供す
ることであった。この方法は、高い立体的なスペクトル
解像度で、立体的組織（すなわち、分布）を検出するた
めに、また、細胞及び組織の元来の構成要素、構造、小
器官、そしてタグを付けるプローブ（例えば、蛍光プロ
ーブ）や光の伝達、反射、散乱及び蛍光放射を行うのに
用いる薬等の投与された構成要素を数量化するために用
いられる。米国特許出願第08/571,047号には、DNAハイ
ブリダイゼーションにおける六つの遺伝子座特定プロー
ブ（各遺伝子座は異なる染色体上に位置する）による細
胞分裂間期の蛍光において、米国特許出願第08/392,019
号に述べられたスペクトル結像装置を使用することが、
他の生物学的及び医学的用途と共に述べられている。
もう一つの継続出願（参照として含まれる、カビブ氏
らの1995年12月20日に出願された米国特許出願第08/57
5,191号）においては、その目的は、各々異なる発蛍光
団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされた多数の
染色体ペイントそして／あるいは遺伝子座特定プローブ
を用いる蛍光DNAハイブリダイゼーションを検出し分析
するための、多数の発蛍光団の同時検出方法を提供する
ことであった。本発明によるこの方法は、立体的解像度
及びスペクトル解像度が共に高感度であり、多数の発蛍
光団そして／あるいは発蛍光団の組合せの同時検出が可
能である。したがって、ヒト等の核種から得た染色体そ
して／あるいは多数の遺伝子座の、蛍光彩色された完全
なセットを検出するために用いることが可能であり、完
全なカラー核型を提供する。
スペクトル生体結像システムは、潜在的に、画像内の
立体的分布及び構成を調べようとする化学物質構成要素
間に微妙なスペクトル差が存在するすべての用途に有用
である。測定は、全く、米国特許出願第08/392,019号に
説明されたシステムに付けられたいかなる光学系を用い
ても実行可能である。例えば、投与された蛍光発蛍光団
あるいは発蛍光団の組合せと併せて蛍光顕微鏡を用いて
もよい。
蛍光測定は、発光スペクトルがシステム感度のスペク
トル範囲内にあるという条件の下で、特殊な用途に対し
て、（障壁フィルター、励起フィルター及び二色性ミラ
ーからなる）いかなる基準フィルター・キューブ、カス
タマイズされたいかなるフィルター・キューブあるいは
フィルター・キューブの組合せで行ってもよい。
ヒューマン・ゲノム・プロジェクト（Human Genome P
roject:HGP）の主要な利益の一つは、病んだ遺伝子や他
の染色体領域及び構造に対する多数の核酸プローブの分
離がある。このことは、DNA診断に対する興味を刺激し
た。これは、開発される試験の数及び種類がこれらのプ
ローブに依存しているためである。近年は、蛍光DNAハ
イブリダイゼーション（FISH）に対する興味が盛んであ
る。この蛍光ハイブリダイゼーションは、調べられる染
色体領域を補足する特定の核酸分子に共役反応された蛍
光部分（本文中プローブと呼ぶ）でマークし、続いて蛍
光顕微鏡検査法によって蛍光部分を視覚化する処理であ
る。
基礎化学研究所での従来の用途と共に、医療現場でFI
SH技術を用いる明らかな傾向がある。FISHは細胞遺伝学
への高度なアプローチであると見られる。FISHから得ら
れる染色体についての情報量は、現在使用されるDNAバ
ンディング法（例えば、Ｇ及びＲバンディング）による
基準核型から得られる情報量を遥かに上回ることは明ら
かである。さらに、典型的な（分裂中期）細胞遺伝学と
比較すると、細胞培養や同期化が省略できるため、細胞
分裂間期細胞遺伝学等の技術を用いることで診断情報が
より速やかに得られる。
本発明によれば、蛍光顕微鏡の視野内のすべてのピク
セルから同時に蛍光スペクトルを獲得可能な、また、一
回の測定で多数のプローブの位置を同時に検出可能なFI
SH結像方法が提供される。染色体特定プローブ（すなわ
ち、染色体ペイント）、染色体分裂片特定プローブ（例
えば、YACコンティグ（contigs）、BACコンティグ及び
放射線ハイブリッド細胞ライン）、そして奇抜なラベル
付け戦略を用いることによって、この方法は、各染色体
が異なる色（すなわち、ヒトの男性の核型のために異な
る24色、女性のために23色）で彩色された状態でのFISH
核型、そして／あるいは、発蛍光団あるいは発蛍光団の
組合せでラベル付けされた染色体分裂片を用いて確立さ
れる多色特定バンディング・パターンを各染色体が得る
染色体多色バンディング核型を生成することが可能であ
る。この方法は、非常に高い試料処理能力をもたらし、
異なるラベルが付けられたかなり多数のプローブの分析
を可能にする。
したがって、完全な多色核型を得るために、種々の発
蛍光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされた多
数の染色体ペイント、遺伝子座特定プローブ及び染色体
分裂片プローブを用いて、蛍光DNAハイブリダイゼーシ
ョンを検出し分析するスペクトル結像方法に対する広い
必要性が認められるため、この方法を獲得することは非
常に有利である。この場合、各染色体は、特定色、すな
わち完全な染色体多色バンディングパターンによって識
別される。また、各染色体は、特定多色バンディング・
パターンそして／あるいは多数の遺伝子座の同時マッピ
ングによって識別される。
本発明の要約 本発明によれば、各々が異なる発蛍光団あるいは発蛍
光団の組合せでラベル付けされた多数の染色体ペイント
及び／あるいは遺伝子座特定プローブ、そして、発蛍光
団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされた染色体
分裂片のグループを用いて確立される特定バンディング
・パターンを各染色体が得る染色体多色バンディング
（すなわち、バー・コード化）を用いる、蛍光DNAハイ
ブリダイゼーションを検出し分析することを目的とする
スペクトル結像方法が提供される。
さらに、下記に説明される本発明の実施例における特
徴によれば、この方法は、次のステップからなる。
（ａ）染色体多色彩色のために、染色体を持つ細胞核を
準備するステップ。このとき、染色体は、少なくとも一
つの発蛍光団でラベル付けされた少なくとも一つの核酸
プローブで交雑される。あるいは、（a'）染色体多色バ
ンディングのために、ゲノム及び染色体を持つ第一の核
種の細胞核を準備するステップ。このとき、染色体は、
少なくとも第一の核種のゲノムの一部を被覆する染色体
分裂片の少なくとも一つのグループで交雑され、分裂片
のグループの各々は、少なくとも一つの発蛍光団でラベ
ル付けされる。（ｂ）結像分光計に光学的に繋がれた蛍
光顕微鏡を介して細胞核を視検するステップ。そして、
（ｃ）記録された第一のスペクトル・キューブのデータ
を数学的アルゴリズムを用いて解釈するステップ。な
お、蛍光顕微鏡及び結像分光計は、細胞の各ピクセルの
スペクトルを得るためのものであって、（ｉ）コリメー
ター光学系を用いて細胞核のすべてのピクセルから同時
に入射光を集め、（ii）この平行入射光を複数の要素を
持つ干渉計システムを介して通過させることで、まず光
を二つのコヒーレント光線へ分割させ、干渉計内の各々
異なる方向へ導き、その後にこれら二つのコヒーレント
光線を再び結合させて互いに干渉させ射出光線を形成
し、（iii）検出器要素の二次元アレイを持つ検出器上
にこの射出光線を集束させる焦点調節光学系を介して射
出光線を通過させることで、測定の全持続時間に渡る各
瞬間において、検出器要素の各々が細胞核の一つの常に
同じピクセルの画像をもたらすため、細胞核の実像は検
出アレイの平面上に動かず、測定中のいかなる時におい
ても、画像は明確に認識可能であり、検出器要素の各々
は、異なる波長でピクセルによって発光された光輝度の
特定の一次結合である信号を生成し、なお、この一次結
合は瞬間的な光路差の関数であり、（iv）干渉計システ
ムの要素の一つあるいはいくつかを回転させる、あるい
は移動させる（すなわち、走査）ことで、干渉計システ
ムによって生成された二つのコヒーレント光線間の光路
差が細胞核のピクセルのすべてに対して同時に走査さ
れ、（ｖ）第一のスペクトル・キューブのデータを形成
するために、記録装置を用いて検出器要素の各々の信号
を時間の関数として記録することによって、細胞核の各
ピクセルのスペクトルを得る。
さらに、好適実施例における特徴によれば、蛍光顕微
鏡は、二重の二色性帯域フィルター及び三重の二色性帯
域フィルターからなるグループから選択される一つのフ
ィルターで補完される。
さらに、好適実施例における特徴によれば、少なくと
も一つの核酸プローブは、少なくとも一つの遺伝子座、
少なくとも一つの分裂染色体、インサートを含む少なく
とも一つの酵母人工染色体、インサートを含む少なくと
も一つのプラスミド、インサートを含む少なくとも一つ
のコスミド、インサートを含む少なくとも一つのファゲ
ミド、インサートを含む少なくとも一つのウイルス・ベ
クター、一つの核種の完全なゲノム、癌組織の完全なゲ
ノム及びそれらの組合せからなるグループから選択され
る。
さらに、好適実施例における特徴によれば、核酸プロ
ーブ及び染色体分裂片の標識化は、組合せによるラベル
付け、すなわちハイブリダイゼーション戦略による。
さらに、好適実施例における特徴によれば、この方法
は、比較ゲノム交雑に用いられる。
さらに、下記の好適実施例によれば、細胞核は、分裂
間期の細胞核、有糸分裂中の細胞核及び減数分裂中の細
胞核からなるグループから選択される。
さらに、下記の好適実施例によれば、核酸プローブの
数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24
あるいは24より大きな数からなるグループから選択さ
れ、プローブの各々は、異なる発蛍光団あるいは発蛍光
団の異なる組合せを含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、染色体は、細胞
分裂間期の染色体、有糸分裂中の染色体及び減数分裂中
の染色体からなるグループから選択される。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、細胞核におけるピクセルの各々のスペクトルの
ポイント演算分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、ポイント演算分
析は、変換関数に従って、細胞核におけるピクセルの各
々のスペクトルをスカラーへマップすることを含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、ポイント演算分
析は、変換関数に従って、細胞核におけるピクセルの各
々のスペクトルをもう一つのスペクトルへマップするこ
とを含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは形態学的分析であり、形態学的分析は細胞核内の
染色体の相対的な大きさを測定する。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、ピクセルの各々のスペクトルについて少なくと
も一つの基準スペクトルからのスペクトル差を計算する
分類マッピング分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、分類マッピング
分析は、複数の基準スペクトルの一つからの所定最大ス
ペクトル差を持つピクセルのグループが所定人工色で彩
色される多色画像を生成する。
さらに、下記の好適実施例によれば、スペクトル差
は、ピクセルの各々のスペクトルと複数の基準スペクト
ルの一つとの間の差の絶対値の予め定められた波長範囲
に対する不定積分として定義されるスカラーである。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、主要構成要素分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、主要構成要素分
析は、（ａ）多数の波長が用いられるときは励起源の波
長をも含めて、全てのピクセル及び測定の波長に対する
共変マトリクスを形成すること、（ｂ）共変マトリクス
を対角化し、独立直交スペクトル基底要素のすべてを見
いだすこと、（ｃ）基底要素あるいはそれらの組合せの
いずれが、細胞核における特定の特徴を標識するかを見
いだすことを含む。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは一次結合分析である。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析は
スペクトルの正規化のためにある。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析
は、算術関数によって、ピクセルの各々のスペクトルの
すべての波長に任意のスカラーを適用することを含み、
関数は、加法、減法、乗法、除法及びそれらの組合せで
ある。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析
は、細胞核の背景領域に位置するピクセルのスペクトル
が、細胞核のピクセルのスペクトルから引き算される背
景除去のためにある。
さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析
は、細胞核を視検する前に測定されたスペクトルが、細
胞核のピクセルのスペクトルを割るためにある較正方法
のためのものである。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、予め定められた波長範囲を用いて、赤、緑、青
のカラー画像を計算する。
さらに、下記の好適実施例によれば、赤、緑、青のカ
ラー画像は、コントラスト延伸アルゴリズムによって修
正される。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、ピクセルのスペクトルの各々について、異なる
二つの波長における輝度の間の比を計算する。
さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリ
ズムは、ピクセルのスペクトルの各々について、異なる
二つの波長における輝度の間の比を計算し、この計算さ
れた比に従って、ピクセルの各々をより明るいあるいは
より暗い人工色で彩色する。
さらに、下記の好適実施例によれば、この方法は、胎
児の細胞のカラー核型を提供すること、白血球のカラー
核型を提供すること、悪性細胞のカラー核型を提供する
こと及び悪性腫瘍の検査が行われる細胞のカラー核型を
提供することからなるグループから選択される用途のた
めにある。
さらに、下記の好適実施例によれば、悪性腫瘍の検査
が行われた細胞のカラー核型を提供することは、カラー
の転座マップを得るためである。
さらに、下記の好適実施例によれば、悪性細胞のカラ
ー核型を提供することは、カラーの転座マップを得るた
めである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、染色体は
従来の染色体バンディング染料で染色され、この方法
は、さらに、染色体のグレースケールのバンディング画
像を得ることを含む。
さらに、好適実施例における特徴によれば、従来の染
色体バンディング染料はDAPIである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、染色体分
裂片は、放射線ハイブリッド細胞ライン、YACクロー
ン、BACクローン、核種のゲノムのサイズ分離型エンド
ヌクレアーゼ消化生成物及び顕微解剖する染色体分裂片
からなるグループから選択される。
さらに、好適実施例における特徴によれば、分裂片の
標識化は、分散型反復シーケンスPCRによる。
さらに、好適実施例における特徴によれば、分散型反
復シーケンスはAluである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、発蛍光団
は、ヌクレオチドあるいはヌクレオチド類似体に抱合さ
れる。
さらに、好適実施例における特徴によれば、割合は、
10−20％、21−30％、31−40％、41−50％、51−60％、
61−70％、71−80％、81−90％及び91−100％からなる
グループから選択される。
さらに、好適実施例における特徴によれば、第一の核
種は、ヒト及びマウスからなるグループから選択され
る。
さらに、好適実施例における特徴によれば、染色体分
裂片は第二の核種からなる。
さらに、好適実施例における特徴によれば、染色体分
裂片はグループに分類され、各グループは、異なる発蛍
光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされる。
さらに、好適実施例における特徴によれば、この方法
は、胎性細胞のカラー・バンディング核型を提供するこ
と、白血球のカラー・バンディング核型を提供するこ
と、悪性細胞のカラー・バンディング核型を提供するこ
と、そして悪性腫瘍の検査が行われた細胞のカラー・バ
ンディング核型を提供することからなるグループから選
択される用途のためのものである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、胎性細胞
は、妊娠女性の末梢血液から単離した絨毛膜絨毛細胞及
び胎性細胞からなるグループから選択される。
さらに、好適実施例における特徴によれば、この方法
は、ヒト染色体21、ヒト染色体バンド21q22、ヒト染色
体バンド21q22の分裂片、ヒト染色体18、ヒト染色体18
の分裂片、ヒト染色体13及びヒト染色体13の分裂片から
なるグループから選択される遺伝物質の三染色体性を検
出するためのものである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、悪性腫瘍
の検査が行われた細胞のカラー・バンディング核型を提
供することは、カラー転座マップを得るためである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、悪性細胞
のカラー・バンディング核型を提供することは、カラー
転座マップを得るためである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、この方法
は染色体異常を検出するためのものである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、この染色
体異常は、欠失、逆位、転座及び増幅からなるグループ
から選択されるものである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、この方法
は、再発性染色体異常及び続発性染色体異常からなるグ
ループから選択される染色体異常を検出するためのもの
である。
さらに、好適実施例における特徴によれば、この方法
は悪性腫瘍の病期を検出するためのものである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、悪性腫瘍
の病期の検出は、悪性腫瘍の治療を選択するためのもの
である。
さらに、好適実施例における特徴によれば、この方法
は抗癌性治療の効率をフォローするためのものである。
さらに、好適実施例における特徴によれば、この方法
は、分裂促進的な薬剤へさらされた後の染色体異常を検
出するためのものである。
本発明は、スペクトル的に類似した、しかし幾分異な
る蛍光プローブの多数を同時に検出するのに十分な感度
を持つDNAハイブリダイゼーションのための方法を提供
することによって現時点で既知の構成の欠点を指摘す
る。ゆえに、本発明の方法は、各染色体対が、異なるRG
Bあるいは人工色に現われるカラー核型、そして、多数
の遺伝子座を同時にマップする遺伝子座マッピングを提
供することができ、さらに、カラー核型作成と多数遺伝
子座マッピングと染色体多色バンディングとの組合せを
も提供することが可能である。
図面の簡単な説明 本発明が、一例として、添付図面を参照してここに説
明される。
図１は従来のスリット・タイプ結像分光計（従来の技
術）を示す。
図２は、米国特許出願第08/392,019号（従来の技術）
に従って構成された結像分光計の主な構成要素のブロッ
ク図である。
図３は、静止型の干渉計、すなわち、米国特許出願第
08/392,019号（従来の技術）による結像分光計に用いら
れたサニャック干渉計を示す。
図４は、選択されたスペクトル範囲を強調するための
疑似RGB（赤、緑及び青）色の鮮明度を示す。各疑似色
の輝度は、一つの曲線に掛け合わせた後に曲線下の面積
を積分することによって計算される。
図5a、5b及び5cは、テキサス・レッド及びローダミン
に付けた二つの異なるプローブで行われた細胞分裂間期
のFISHを示し、（ａ）は顕微鏡から見えるオリジナル画
像である。（ｂ）は、本発明の方法によって測定され処
理された後の同じ試料である。（ｃ）は、テキサス・レ
ッド及びローダミン発蛍光団の蛍光スペクトルである。
図6a、6b及び6cは、異なる発蛍光団で各々がラベル付
けされた六つの異なるプローブを用いて行われた細胞分
裂間期のFISHを示す。（ａ）は顕微鏡から見えるオリジ
ナル画像である。細胞はDAPIで対比染色された。（ｂ）
は、本発明の方法によって測定され処理された後の同じ
試料である。（ｃ）は、六つの発蛍光団の蛍光スペクト
ルである。
図7a、7b、7c、7d及び7eは、まとめて、図8a及び9aの
画像の24ピクセルについて24の正規化されたスペクトル
を示す。24の各々は、ヒトの異なる染色体から得たもの
である（１−22、Ｘ及びＹ）。染色体の各々は、下記表
３及び４に詳述される異なる染色体ペイントを用いて塗
られた。
図8a及び8bは、本発明の方法によって、ヒトの男性の
24の染色体（１−22、Ｘ及びＹ）から得た（白黒の）RG
B画像及びカラー核型である。染色体の各々は、下記表
３及び４に詳述される異なる染色体ペイントを用いて塗
られた。
図9a及び9bは、各々、図8a及び8bのカラー版である。
図10a、10b、10c及び10dは、各々、本発明の方法を用
いて得た、ヒトの男性の24の染色体（１−22、Ｘ及び
Ｙ）の、（ａ）RGB画像、（ｂ）それから得たカラー核
型、（ｃ）ａにおける画像の分類マッピング、そして
（ｄ）ｃから得たカラー核型であり、染色体の各々は、
下記の表３及び４に詳しく述べるように、異なる染色体
ペイントを用いて染色された。すべての画像は白黒で示
されている。
図11a、11b、11c及び11dは、各々、図10aから10dをカ
ラーで提示したものである。
図12a、12b、12c、12d及び12eは、（ａ）従来の蛍光
顕微鏡で得た、乳癌細胞ラインSKBR3の第一の染色体ス
プレッドのDAPI Rバンディング写真、（ｂ）図9a及び9b
における染色体ペイント及び本発明の方法を用いて得た
第一のスプレッドのRGBカラー核型（白黒で示す）、
（ｃ）スペクトラキューブ・システムで得た、第二の染
色体スプレッドのDAPI Rバンディング写真、（ｄ）図9a
及び9bにおける染色体ペイント及び本発明の方法を用い
て得た第一のスプレッドのRGBカラー核型（白黒で示
す）、そして（ｅ）図12c及び12dに矢印で示すSKBR3細
胞ラインの二つのマーカー染色体のRGBカラー比較ゲノ
ム交雑（CGH）である。細胞ライン（ｅの上部）から抽
出されたDNAと、染色体８（青）に対する染色体彩色プ
ローブ及びｃ−myc発癌遺伝子（赤）（ｅの下部）に対
するコスミド・プローブによる二色FISH分析とを用い
た。
図13aから13eは、図12aから12eに対するオリジナル
の、より明確なカラーのプレゼンテーションである。
図14は、各々、図13a（左）及び13b（右）に示したＲ
バンドにおけるDAPIと、彩色された転座染色体の、解釈
に基づく輪郭との比較プレゼンテーションである。図13
bから測定し、図9bに示すカラー核型を用いて解釈し
た。
図15は、図14の、カラーによるプレゼンテーションで
ある。
図16aは、（ａ）転座ｔ（1;11）（q44;p15.3）を持つ
染色体スプレッドのRGB画像であり、インサートは、転
座の染色体に関するスペクトルに基づく分類である。こ
こで、染色体１の物質は黄色に、そして染色体11の物質
は青色に人工的に着色されている。図16bは、（ｂ）本
発明の方法によるスペクトル核型分析後の、分裂中期ス
プレッドからの転座染色体（染色体４のセグメントが染
色体12へ転座）のRGB画像（右上の行）、分類マッピン
グ・アルゴリズムを適用した後の人工色画像（左上の
行）、そして（ｂ）Ｇバンディング分析（インサート）
と、染色体４（緑）及び12（赤）に対する彩色プローブ
による従来の二色FISHとを示す。
図17a及び17bは、各々、図16a及び16bの、カラーによ
るプレゼンテーションである。
図18は、ヒト染色体彩色プローブによる交雑後の、テ
ナガザル核種（Hylobates concolor）の多色スペクトル
核型である。
図19は、図18の、カラーによるプレゼンテーションで
ある。
図20は、長手方向の軸に沿って配列されたカラー・バ
ーコードを持ついくつかの染色体のRGB画像を示す。本
発明の方法である染色体多色バンディングを用いて得た
ものである。
図21は、図20の、カラーによるプレゼンテーションで
ある。
図22a、22b及び22cは、（ａ）染色体の染色のためにD
APIを用いたＲバンディング画像、（ｂ）図22aのネガ画
像を示すことによって得たＧバンディング画像、そして
（ｃ）単一のネズミ染色体スプレッドからのヒト染色体
ペイントを用いたカラー核型RGB画像である。すべてス
ペクトラキューブ・システムを用いて得た。
図23a、23b及び23cは、各々、図22a、22b及び22cの、
オリジナルの、カラーによるプレゼンテーションであ
る。
実施例の説明 本発明は、異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せ
でラベル付けされた多数の染色体ペイント、染色体分裂
片及び遺伝子座特定プローブを用いて、蛍光DNAハイブ
リダイゼーションを検出し分析するためのスペクトル結
像方法に関する。この方法は、立体解像度及びスペクト
ル解像度が高感度であり、多数の発蛍光団及び発蛍光団
の組合せを同時に検出することが可能である。このた
め、本発明の方法は、ヒト等の核種から、蛍光彩色され
た染色体、多数の遺伝子座及び／あるいは染色体特定多
色バンディング・パターン（すなわち、バー・コード
化）の全セットを検出するために用いることが可能であ
り、完全な多色核型を提供することができる。この場
合、各染色体は、特定色と完全な染色体多色バンディン
グ・パターンとによって識別される。また、各染色体は
特定多色バンディング・パターンによっても識別され
る。
図４から図23に示された本発明をより良く理解するた
めに、まず、図１に示される、検出器の二次元アレイを
利用する従来のスリット・タイプ結像分光計の構造及び
作動（すなわち、従来の技術）が参照される。
したがって、図１に示された従来の技術のスリット・
タイプ結像分光計は、４に概略的に示された情景から入
射光を集め、視野を定めるためにスリット６によって占
められた第一の焦点面に情景４からのかなり平行な光を
集束するための、２に示される採光光学系を含む。スリ
ット６から出る光は、コリメータ・レンズ８で一直線に
され、種々の波長を分離するためにスペクトル分散要素
10（例えば、回折格子）を介して通される。スペクトル
分散要素10からの出力は、第二の焦点面にある二次元検
出アレイ14上に集束レンズ12によって集束される。検出
アレイ14の出力はシグナル・プロセッサ16に送られる。
図１の従来の技術の結像分光計に示された検出器14の
二次元アレイにおいては、システム（例えば、矢13によ
って示されたライン走査のラスタ移動）の移動が一次元
に沿った走査をもたらす。第二の次元に沿った走査は、
システムの動きの方向に直角に向けられたスリット６に
よってもたらされる。したがって、スリット６は、アレ
イ14内の各検出器が単一波長で１ピクセルからの入力の
みを受けることを保証する。これは、各ピクセルのスペ
クトルを分離するために必要である。
発明の背景のところで、また上記にも述べたように、
図１に示された従来の技術の方法の欠点は、一つのフレ
ームのピクセル全てからのエネルギーが実際に光学系に
よって同時に集められるけれども、どの時点において
も、それらピクセルの大部分は測定されていないという
ことにある。その結果、このようなスリットを必要とし
ないシステムに比べて、必要とされるフレーム時間がか
なり増し、SN比（感度）はかなり減少する。しかしなが
ら、同業者には明らかであるが、例えば、図１に示すよ
うな従来のスリット・タイプの結像分光計や従来のフィ
ルターに基づく結像分光計（図示せず）も、下記に述べ
るように、本発明の方法のいくつかの用途に対しては有
用である。
図２は、参照として含まれる1995年２月21日に出願さ
れたカビブ（Cabib）氏他の米国特許出願第08/392,019
号に開示された、改善された従来の結像分光計の主な構
成要素を表すブロック図である。この結像分光計は、本
発明の方法を実行するために最適に構成されている。
したがって、図２の従来の結像分光計は、20と符号が
付いた採光光学系、ブロック22で示された１次元スキャ
ナー、ブロック24で示された光路差（OPD）発生器ある
いは干渉計、ブロック26で示された一次元あるいは二次
元検出アレイ及びブロック28で示されたシグナル・プロ
セッサ及びディスプレイを含む。
システム20における重要な要素は、OPD発生器あるい
は干渉計24であり、それは、分析される情景の各ピクセ
ルから放射された光のスペクトル輝度の一次結合の所定
セットに対応する被変調光を出力するものである。干渉
計からの出力は検出アレイに集束される。したがって、
すべての必要な光学的位相差は、スペクトルの再構築に
必要なすべての情報を得るために、視野のすべてのピク
セルに対して同時に走査される。情景内のすべてのピク
セルのスペクトルは、結像情報と共に同時に集められる
ため、リアルタイムでの画像分析を可能にする。
米国特許出願第08/392,019号による装置は多種多様の
構成が可能である。特に、用いられる干渉計は、米国特
許出願第08/392,019号の関連する図面に示されるよう
に、他の鏡と組み合わせてもよい。
したがって、米国特許出願第08/392,019号によれば、
別タイプの干渉計を用いることも可能である。これらに
は、次のものが含まれる。（１）光を変調するためにOP
Dが変えられる可動タイプ干渉計、すなわち、スキャン
厚があるファブリ−ペロ干渉計、（２）採光光学系及び
スキャナーから光線を受け二つの光路に光線を分けるビ
ーム・スプリッタを含むマイケルソン型干渉計、（３）
オプションとして、上記に引用した米国特許出願（同出
願の図14を参照）に述べられた、四つの鏡とビーム・ス
プリッタとを持つ干渉計等の、他の光学的手段と結合さ
れるサグナック干渉計（この干渉計内では、OPDは、入
ってくる光の入射角に応じて変化する）。
図３は、OPDが入射光の入射角に応じて変化する干渉
計を利用して米国特許出願第08/392,019号に従って構成
された結像分光計を示す。光軸に対して小さな角度で干
渉計に入る光線は、この角度に対し直線的にかなり変化
するOPDを生じる。
図３の干渉計においては、すべてのピクセルの源30か
らのすべての光は、採光光学系31によって一直線にされ
た後、メカニカルスキャナー32によって走査される。光
は、ビーム・スプリッタ33を介して第一の反射鏡34へ、
そして第二の反射鏡35へ通される。この第二の反射鏡35
への光は、反射してビーム・スプリッタ33そして集束レ
ンズ36を介して検出器37（例えば、CCD）のアレイへ送
られる。この光線は、ビーム・スプリッタ33によって反
射された光線に、次に第二の反射鏡35によって反射され
た光線に、最後に第一の反射鏡34によって反射された光
線に干渉する。
一回の走査の最後には、すべてのピクセルがすべての
OPDを介して測定されてしまうため、情景の各ピクセル
のスペクトルはフーリエ変換によって再構築されること
が可能である。光軸に平行な光線は補正され、光軸に対
して角度（θ）にある光線は、ビーム・スプリッタ33の
厚さ、屈折率及び角度の関数であるOPDを生じる。小さ
な角度においてOPDはθに比例する。適切な逆変換を適
用することによって、また、注意深いブックキーピング
を行うことによって、すべてのピクセルのスペクトルが
計算される。
図３の構成においては、角度β（図３ではβ＝45度）
にあるビーム・スプリッタ上に入射する光線は、干渉計
をOPD＝０で通り抜けるが、一般の角度β−θで入射す
る光線は、次の式で与えられるOPDを生じる。
OPD（β，θ,t,n）＝ｔ［（n2−sin2（β＋θ）0.5 −（n2−sin2（β−θ））0.5＋2sinβsinθ］ （１） この式において、βはビーム・スプリッタ上への光線の
入射角であり、θは、光軸からの光線の角距あるいは中
央位置に対する干渉計の回転角度であり、ｔはビーム・
スプリッタの厚みであり、ｎはビーム・スプリッタの屈
折率である。
方程式１から、中央位置に対する正及び負の両角度を
走査することによって、すべてのピクセルに対する両面
の干渉写真が得られることが明らかであり、このこと
は、位相誤差を消去するに助けとなり、フーリエ変換の
計算により正確な結果が得られることになる。走査振幅
は、達成可能な最大OPDを決めるため、測定されたスペ
クトル解像度に影響を与える。角度ステップの大きさが
OPDステップを決定するが、OPDステップは、逆に、シス
テム感度の良い最も短い波長によって規定される。事
実、試料採取の定理（「干渉分光分析法の原理」［Cham
berlain（1979）The principles of interferometric s
pectroscopy,John Wiley and Sond,pp.53−55］を参
照）によれば、このOPDステップは、システム感度の良
い最も短い波長の半分よりも小さくなければならない。
考慮すべきもう一つのパラメータは、マトリクスにお
ける検出器要素の限られた大きさである。集束光学素子
を介して、この要素は、干渉計内に有限のOPDを生じ、
干渉写真に直角関数を巻き込む効果がある。このこと
は、結果として、短い波長におけるシステム感度の減少
を引き起こし、要素によって生じるOPD以下の波長に対
してはゼロに落ちてしまう。この理由のため、変調伝達
関数（MTF）の条件が満足していることを保証しなくて
はならない。すなわち、干渉計内に検出器要素によって
生じるOPDは、この計測器の感度を満たす最短波長より
も小さくなくてはならない。
したがって、米国特許出願第08/392,019号に開示され
た発明に従って構成された結像分光計は、ただ単に、視
野内のすべてのピクセルから来る光の輝度のみを測るも
のではなく、予め定められた波長範囲内の各ピクセルの
スペクトルをも測るものである。また、どの時点におい
ても、視野内の各ピクセルによって発せられた光が全て
より良く利用されるため、先に説明したように、フレー
ム時間をかなり減少し分光計の感度をかなり増加するも
のである。このような結像分光計は、種々のタイプの干
渉計、採光光学系及び集束システムを含んでもよく、そ
のため、医学的診断及び治療や生物学の研究における用
途、また、地質学や農業における調査等のための遠隔測
定を含む多種多様な用途に用いられ得るものである。
米国特許出願第08/392,019号に開示された発明による
結像分光計は、イスラエル共和国にあるスペクトル診断
社（Spectral Diagnostics Ltd.;Industrial Park,Migd
al Haemek,Israel）によって開発されたもので、下記に
スペクトラキューブ（spectraCubeTM）として参照され
る。種々の光学的装置に光学的に接続されたスペクトラ
キューブ・システムが本発明の方法を実行するために用
いられた。スペクトラキューブ・システムには、下記の
表１にリストアップされた特徴がある。
スペクトル画像の表示及び分析 a. 概要 上記の説明の通り、スペクトル画像は、スペクトル情
報を画像の立体的構成に結びつける、データの三次元ア
レイ（ｘ、ｙ、λ）である。ゆえに、スペクトル画像
は、その次元数の理由でスペクトル・キューブと呼ばれ
る、データのセットであり、得るに難しい、場合によっ
ては、得ることが不可能な特徴の抽出及び量の評価を可
能にするものである。分光分析法及びデジタル画像分析
は、巨大な量の文献によって著されている、共によく知
られている分野である（例えば、「デジタル画像処理の
基本」［Jain（1989）Fundamentals of Digital Image
Processing,Prentice−Hall international］を参
照）。次の論議は、主に、スペクトル情報と結像情報と
を単一のデータ・セット、すなわち、スペクトル・キュ
ーブに結合することの利点に焦点を合わせる。
スペクトル・キューブの一つの可能な分析方法として
は、スペクトル・データと立体データとを個別に用いる
やり方がある。すなわち、スペクトル・アルゴリズムを
スペクトル・データに、また、二次元画像処理アルゴリ
ズムを立体データに適用することである。
スペクトル・アルゴリズムの例としては、アルゴリズ
ムが基準スペクトルとすべてのピクセルのスペクトルと
の間の類似性を計算し（すなわち、相似性マッピン
グ）、各ピクセルにおける輝度が「相似性」の程度に比
例するグレースケール（あるいは他のカラー）画像（す
なわち、相似性マップ）とすることを考える。このグレ
ースケール画像は、所望の特徴及びパラメータを引き出
すために、画像処理及びコンピュータビジョン技術（例
えば、画像の向上、パターン認識等）を用いることによ
ってさらに分析可能である。換言すれば、相似性マッピ
ングは、（予めライブラリに記憶された、またはその同
じスペクトル画像あるいは他のスペクトル画像のピクセ
ルに属する）基準スペクトルに対するスペクトル画像の
各ピクセルのスペクトル差の絶対値の不定積分を計算
し、グレースケールあるいは疑似色（白黒あるいはカラ
ー）画像を表示することを伴う。この画像においては、
明るいピクセルは小さなスペクトル差に対応し、黒いピ
クセルは大きなスペクトル差に対応する、あるいはその
逆である。
同様に、分類マッピングにおいても、基準スペクトル
としていくつかのスペクトルが採用されるが、相似性マ
ッピングで述べられたと同じ計算が行われ、そのいくつ
かの基準スペクトルの一つに最も類似しているという分
類に応じて、表示画像の各ピクセルは異なる所定の擬似
色で彩色される。
分離不可能な演算、すなわち、局所的なスペクトル情
報と隣接するピクセル間の立体的相関関係とを共に含む
アルゴリズムに基づくスペクトル画像アルゴリズムを適
用することも可能である（これらのアルゴリズムの一つ
は、下記に述べられるように、分析の主要な要素であ
る）。
スペクトル・キューブ（すなわち、Ｉ（ｘ、ｙ、
λ））等のすべての三次元（3D）データ構造を扱う場合
に当然生ずる根本的なことの一つとして、有意義な方法
でそのデータ構造を視覚化することが必要である。例え
ば共焦点顕微鏡によって得た断層データ、Ｄ（ｘ、ｙ、
ｚ）等の他のタイプの3Dデータは、一般に、三次元空間
における異なる位置（ｘ、ｙ、ｚ）の輝度を各ポイント
が表すが、それとは異なり、スペクトル画像は、同一二
次元平面（すなわち、試料）の輝度を複数の異なる波長
で表す画像シーケンスである。このため、データのスペ
クトル・キューブを捉える二つの直観的な方法として
は、画像平面（立体データ）を観察するか、あるいは１
ピクセルあるいはピクセルのセットの輝度を波長の関数
として三次元の凹凸表示で観察するかのいずれかであ
る。一般に、画像平面は、どの単一波長で測定された輝
度をも表示するために、あるいは、すべての画像ピクセ
ルにおける所望のスペクトル領域にスペクトル分析アル
ゴリズムを適用した後に結果として生じるグレースケー
ル画像を表示するために用いられることが可能である。
スペクトル軸は、一般に、どの所望のピクセルの近傍で
も行える（例えば、スペクトルを平均する）若干の立体
的な演算から結果として生じるスペクトルを示すために
用いられる。
例えば、スペクトル画像を、単純な単色カメラから得
られるような画像に類似したグレースケール画像とし
て、あるいは、重要な特徴を写像し強調表示するために
一つあるいはいくつかの人工色を利用する多色画像とし
て表示することが可能である。このようなカメラは、単
に、CCDアレイのスペクトル範囲（例えば、400ナノメー
トルから760ナノメートルに）上の光学的信号を統合す
るため、スペクトル軸に沿って次のように積分すること
によって、3Dスペクトル画像データベースから「同等」
の単色CCDカメラ画像を計算することが可能である。
方程式２において、ｗ（λ）は、あるスペクトル範囲
に適切に数学的重みがかけられたスペクトル画像の統合
にすべてが基づいている種々のグレースケール画像を計
算する場合に最大の柔軟性を提供する一般的な加重応答
関数である。例えば、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）及び青（Ｂ）
に対する三刺激値関数に各々対応する三つの異なる加重
関数｛wr（λ）、wg（λ）、wb（λ）｝で方程式（２）
を評価することによって、従来のRGBカラー画像を表示
することが可能である。また、有意義な従来にない（疑
似）カラー画像を表示することも可能である。図４はこ
の単純なアルゴリズムの能力を示す例である。｛wr、
wg、wb｝が、目的の１スペクトル「内に」分配されたガ
ウス関数となるように選べば、この場合に表示される擬
似色画像は、単に、加重関数に対応するスペクトル領域
内のデータだけを強調することになり、これら３領域に
おけるスペクトル差がより明確に検出されることを可能
にする。
b. ポイント演算 ポイント演算は、単一ピクセル（すなわち、一度に１
ピクセルのみ）に実行されるものと定義される。例え
ば、グレースケール画像においては、ポイント演算は、
所定の変換関数に従い各ピクセルの輝度をもう一つの異
なる輝度へマップするもの（輝度関数）である。このタ
イプの変換の特別な場合としては、各ピクセルの輝度を
定数で掛け算することである。
ポイント演算の概念は、スペクトル画像にも拡張され
得るものである。ここでは、各ピクセルはそれ自身の輝
度関数（スペクトル）、すなわち、ｎ次元ベクトルV
i（λ）、λ∈［λ１、λｎ］を有する。スペクトル画
像に適用されるポイント演算は、変換関数に従い各ピク
セルのスペクトルをスカラー（すなわち、輝度値）へマ
ップするものと定義されることも可能である。
ν２＝ｇ（V1（λ））；λ∈［λ1,λｎ］ （３） 方程式３によってグレースケール画像を作ることは、
このタイプのポイント演算の例である。より一般的な場
合には、ポイント演算は、変換関数によって各ピクセル
のスペクトル（ベクトル）をもう一つの異なるベクトル
へマップするものである。
V2（ｌ）＝ｇ（V1（λ））;l∈［1,N］，λ∈［λ1,λｎ］ （４）， ここで、Ｎn. この場合、スペクトル画像はもう一つのスペクトル画
像に変換される。
さて、異なるスペクトル画像の対応するピクセル間で
の演算を含むようにポイント演算の定義を拡張する。こ
のタイプのアルゴリズムの重要な例としては光学密度の
分析がある。光学密度は、透過スペクトルよりも高いダ
イナミックレンジで分光分析されるオブジェクトの領域
を強調表示しグラフで表すために用いられる。光学密度
は、対数演算によって透過に関連づけられるため、常に
正の関数である。光学密度と測定されたスペクトルとの
間の関係は、ランベルト・ベールの法則によって与えら
れる。
ここで、OD（λ）は、波長の関数としての光学密度であ
り、Ｉ（λ）は測定されたスペクトルであり、I0（λ）
は測定された基準スペクトルであり、τ（λ）は試料の
スペクトル透過率である。方程式５は、すべての波長に
対し、すべてのピクセルについて計算される。I0（λ）
は（１）ODが計算されるスペクトル・キューブ内のピク
セル、（２）第二のキューブ内の対応するピクセル及び
（３）ライブラリからのスペクトルから選択される。
光学密度は、測定システムのスペクトル感度あるいは
CCD検出器の不均一性に依存しないことに注意すべきで
ある。このアルゴリズムは、試料内の吸収体の吸収係数
及び試料厚が既知であるなら、その吸収体の相対濃度
を、ある場合には絶対濃度をマップするのに有用であ
る。ここで用いられる用語「レベル」は、用語「量」、
「相対量」、「相対濃度」及び「絶対濃度」としても用
いられることに注意すべきである。
他の例としては、種々の一次結合分析が含まれ、例え
ば、次のようなものがある。（１）新しいスペクトル・
キューブをもたらすために、加法、減法、乗法、除法、
それらの組合せ等の算術関数によって、任意のスペクト
ルをスペクトル画像内の各ピクセルのスペクトルに適用
する。この場合、各ピクセルについて結果として生じる
スペクトルは、第一のキューブの各スペクトルと選択さ
れたスペクトルとの間の和、差、積、比あるいはこれら
の組合せである。（２）上記に説明されたように、算術
関数によって任意のスカラーをスペクトル画像の各ピク
セルのスペクトルに適用する。
このような一次結合は、例えば、背景削除のために用
いられてもよく、この場合、背景領域に位置するピクセ
ルのスペクトルが各ピクセルのスペクトルから引かれ
る。また、較正方法にも用いられもよく、この場合、試
料分析以前に測定されたスペクトルがスペクトル画像内
の各ピクセルのスペクトルを割るために用いられる。
もう一つの例としては、グレースケール画像として表
示する比画像計算がある。このアルゴリズムは、スペク
トル画像のすべてのピクセルに対して、二つの異なる波
長における輝度の比を計算し、それに応じて、より明る
い、あるいは暗い人工色で各ピクセルを彩色する。例え
ば、スペクトル的に敏感な物質の分配を示すために、高
い比に対してはピクセルを明るく、低い比に対しては暗
く（あるいはその正反対に）彩色する。
c. 空間とスペクトル結合演算 上記に述べられたスペクトル画像分析方法において
は、アルゴリズムはスペクトル・データに適用される。
分光的に処理されたデータを画像として表示することの
重要性は、有用な画像をユーザーに提供することにあ
り、質的なものである。しかし、用途に応じて、スペク
トル画像に特有な、空間とスペクトルとの相関関係を利
用するアルゴリズムを適用することによって、利用可能
な結像データを更にいっそう有意義な方法で用いること
も可能である。空間及びスペクトルの演算は、スペクト
ル画像分析アルゴリズムの最も有効なものである。例と
して、次の状況を考察する。
試料は、ｋの異なる発蛍光団で染色されたｋのセル・
タイプを含んでいる（ここでの用語「セル」は、生物学
の細胞に対しても、また、「計測器の視野内の領域」に
対しても用いられる）。各発蛍光団は、別個の蛍光発光
スペクトルを有し、ｋセル・タイプの一つにのみ結び付
く。ｋセル・タイプの各々に対して、セル毎に平均蛍光
輝度を測ることは重要である。この目的を達成するため
に次の手法を用いることができる。
（１）画像内の各ピクセルを、そのスペクトルに応じ
て、（ｋセル・タイプに背景を加え）ｋ＋１のクラスの
一つに属するものとして分類する。（２）画像を種々の
セル・タイプへセグメント化し、各タイプの細胞数を数
える。（３）各クラスによって寄与された蛍光エネルギ
ーを加算し、対応するクラスのセル合計数によってそれ
を割る。
この手法は、スペクトル・データと立体データと両方
を用いる。立体データは種々のタイプのセル（すなわ
ち、セルの小塊）についてのデータからなり、その多く
は目には同じように見えるのだが、関連のあるスペクト
ル・データは、特徴のあるセル・スペクトルの形（すな
わち、スペクトルの「特徴」）を示す。この種の状況に
対する理想的なタイプの測定がスペクトル画像処理であ
る。上記の状況において、セルは、それらの特有なスペ
クトルの特徴によって区別されることができる。それ
故、各ピクセルにｋ＋１の値の一つを割り当てる適当な
ポイント演算が合成画像を生成するために実行される。
異なるセル・タイプの蛍光発光スペクトルがsi（λ）、
ｉ＝１、２、・・・、ｋ、λ∈［λ１、λｎ］であるこ
とが既知であり、各ピクセル（ｘ、ｙ）における測定ス
ペクトルがｓx.v（λ）、λ∈［λ１、λｎ］であると
仮定すると、次のアルゴリズムが、可能な分類方法であ
る（上記のステップ１）。
e2 iを、セル・タイプｉに付けられた発蛍光団の既知
のスペクトルからの測定スペクトルの偏差であるとす
る。このとき、最小二乗「距離」定義を採用して、次の
ように書くことができる。
ここで、Ｒλは、目的とするスペクトルの領域である。
画像における各ポイント［ピクセル（ｘ、ｙ）］は、次
の基準を用いることによって、ｋ＋１クラスの一つに分
類できる。
もし、e2 i＞全てのｉ∈［１、ｋ］に対する閾値なら、
ポイント（ｘ、ｙ）∈ｋ＋１クラス （７） もし、e2 i＜閾値なら、ポイント（ｘ、ｙ）∈ρクラス
であり、ρは、min［e2 i］＝e2ρである。
上記のステップ２及び３（画像分割及び平均蛍光輝度
の計算）は、方程式６及び７に表されたアルゴリズムに
よって生成された合成画像に、標準コンピュータビジョ
ン演算を用いることによって簡単に行える。
もう一つのアプローチは、各ピクセルにおける測定ス
ペクトルｓx.v（λ）をｋの既知の蛍光スペクトルs
i（λ）、ｉ＝１、２、・・・、ｋの一次結合として表
すことである。この場合、 を解く係数ベクトルＣ＝［c1、c2、・・・ck］がある。
ここで、 であり、 ｉ＝１、２、・・・、ｋに対する を求めて解くと、（すなわち、Ｆを最小にするciの値を
見いだす）マトリクス方程式Ｃ＝A-1B（９）を得る。こ
こで、Ａは、要素 を含むｋ次元の矩形マトリクスであり、Ｂは、 と定義されるベクトルである。
算術演算が同様に二つ以上のスペクトル・キューブ
に、あるいは任意のピクセルのスペクトルあるいはライ
ブラリからのスペクトルに適用されされてもよい。例え
ば、二つのスペクトル・キューブのデータを平均する、
時間変化のフォローアップあるいはスペクトルの正規化
を行う等の目的で、第一のスペクトル・キューブのデー
タと第二のスペクトル・キューブのデータとに属する、
対応する対のピクセルの対応する波長の間に算術演算を
適用し、結果として第三のスペクトル・キューブのデー
タを得ることを考察する。
多くの場合、スペクトル画像内に存在するオブジェク
ト（例えば、セル）は、化学物質構成要素においても、
また、構造においても各々異なるため、分散マトリクス
あるいは相関マトリクスを生成することによって主要な
構成要素の分析を行うことは、これらの小さな差異を高
めることになる。次に、分散マトリクスを用いることに
よる主要な構成要素の分析について簡単に説明する。主
要な構成要素の分析に関する詳細については、「多変量
較正」「実践多変量解析」及び「コンピューターエイデ
ッド・モデリングCAMO及び整理好きユーザーのガイド」
［Martens and Naes（1989）Multivariate Calibratio
n,John Wiley ＆ Sons,Great Britain;and to Esbensen
et al.,Eds.（1994）Multi variance analysis−in pr
actice;Computer−aided modeling as CAMO,and the Un
scrambler's User's guide,Trondheim,Norway］を参照
すべきである。
したがって、波長λｉ（ｉ＝１、・・・Ｎ）における
画像のピクセルの輝度は、長さがピクセル数ｑに等しい
ベクトルであると見なされる。測定の各波長に対して一
つずつ、全部でこれらのベクトルがＮあるので、これら
のベクトルは、ｑ行及びＮ行を含むマトリクスB'に整理
できる。
マトリクスＢの列の各々に対して定義される平均は、 であり、また、第二の正規化されたマトリクスＢは、次
に定義される。
分散マトリクスＣがマトリクスＢに対して定義され
る。次元NxNのＣ＝BT・Ｂ。Ｃは対角化され、固有ベク
トルと固有値とがＣ・Vi＝μｉ・Viによって関連づけら
れる。ここで、ViはＮ直交ユニットベクトルであり、μ
ｉはｉ番目のユニットベクトルViの方向に分散を表す固
有値である。一般に、最も低い構成要素が、ピクセルに
ついての一つの関数として最も高い変動を表わす。
積BVi（ｉ＝１、・・・Ｎ）は、直交基底の要素への
スペクトル画像の投影である。それらは、ｑ要素（ｑ＝
ピクセル数）からなるベクトルであり、白黒画像として
個別に表示される。これらの画像は、ある波長あるいは
波長範囲でフィルターされた通常の白黒画像からは明白
でない特徴を明らかにすることが可能である。
蛍光顕微鏡検査法 a. 概要 多数の染料（すなわち、発蛍光団）を用いること
（「デジタル画像処理の基本」［Jain（1989）Fundamen
tals of Digital Image Processing,Prentice−Hall In
ternational］を参照）は、組織及び及び細胞を分析す
るための最も強力な、そして一般的な道具の一つであ
る。したがって、蛍光顕微鏡検査法は、光学顕微鏡検査
法に用いられる最も重要な実験方法の一つである（「蛍
光分光分析法の原理」［Lakowicz（1983）Principles o
f fluorescence spectroscopy,Plenum Press,New York,
London］を参照）。蛍光プローブの能力は、主に、特性
染料が結び付くことが可能な生物学的構造の素晴らしい
多種多様性によるものである（「生体医学における蛍光
の応用」［Waggoner（1986）Applications of fluoresc
ence in the biomedical sciences,Eds.Taylor et al.,
New York:Alan R.Liss,Inc.pp.3−28］を参照）。蛍光
プローブの詳細な論評については、「生物学の技術シリ
ーズ、生物学的活動に対する蛍光及び発光性プローブ」
［Mason（editor）（1993）Fluorescent and Luminesce
nt Probes for Biological Activity,Biological Techn
iques Series,edited by Sattelle,Academic Press Lim
ited,London］及び「蛍光顕微鏡検査法入門」［Ploem a
nd Tanke（1987）Introduction to Fluorescence Micro
scopy,Oxford University press,Royal Microscopical
Society］）を参照すべきである。
新しく、より洗練された多色の蛍光染料分子の急速な
開発は、これら染料の可能性をフルに利用可能な、より
進んだ蛍光結像技術を絶えず必要としている。蛍光染料
が今日の研究のやり方に革命的な衝撃をもたらしたこと
への議論については、「光学顕微鏡検査法の新しいビジ
ョン」［Taylor et al.（1992）The New Vision of Lig
ht Microscopy,American Scientist,Vol.80,pp.322−33
5］を参照すべきである。
多色蛍光染料における注意すべき改善は、基本的な蛍
光染料（すなわち、発蛍光団）の種々の組合せを用いる
組合せ蛍光計画（例えば、組合せによるラベル付けや組
合せによる交雑）の導入にある。組合せによるラベル付
けについては、「組合せ蛍光及びデジタル結像顕微鏡検
査法を用いるDNAハイブリダイゼーションによる七つの
異なるDNAプローブの同時の視覚化」［Ried et al.,（1
992）Simultaneous visualization of seven different
DNA probes by in situ Hybridization using combina
torial fluorescence and digital imaging microscop
y.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,1388−1392］及び「遺伝
子診断における蛍光DNAハイブリダイゼーション」［Rie
d（Jan.1994）Fluoreszenz in situ hybridizierung in
der genetischen Diagnostik,Faculty of theoretical
medicine,Ruprecht−Karls University Heidelberg］
を参照。組合せによる交雑については、「比較ゲノムDN
Aハイブリダイゼーションによる染色体の完全な、そし
て部分的な増加及び減少の検出」［du−Manoir et al.
（1993）Detection of complete and partial chromoso
me gains and losses by comparative genomic in situ
hybridization.Hum.Genet.90,590−610］を参照。
本発明の方法を用いるスペクトル生体結像は、蛍光結
像の用途において、単純なフィルターや格子に基づくア
プローチに勝るいくつかの重要な利点を提供する。これ
らの利点には次のことが含まれる。（１）目的の試料に
おける染料分子の実際の反応へのよりいっそう量的な洞
察を提供する完全なスペクトル測定。（２）望ましくな
い背景冷光から生じる従来の問題の多くを克服する能
力。（３）蛍光プローブの発光スペクトルにその微細な
環境（例えば、温度）のゆえに起こる望ましくなく予想
できないスペクトルのシフト。これは、プローブ濃度を
測るときに考慮に入れることが可能である。しかし、蛍
光輝度が単に、例えば、帯域フィルターのみで測定され
るときには、このようなスペクトルのシフトは、単に検
出されないだけではなく、プローブ濃度の分析にかなり
のエラーを生じる可能性がある。（４）下記に詳細に述
べられるが、適切なスペクトル分析アルゴリズムと共に
用いるとき、スペクトル的に重なった多くの蛍光染料を
一回の測定で分離しマップすることが可能な、蛍光画像
データ収集の簡略化。事実、多変量分析、主要構成要素
の回帰及び分類等の精巧なデータ分析アルゴリズムを適
用することによって（「多変量較正」［Martens and Na
es（1989）Multivariate Calibration,John Wiely ＆ S
ons,Great Britain］を参照）、スペクトル的関連のあ
る多くのパラメータを同時に分析することが可能であ
る。
本発明によるスペクトル生体結像は、次のような望ま
しくない背景冷光に関する問題を解決する手段を提供す
る。蛍光結像顕微鏡検査法は、通常、試料が所望の短い
波長によって励起されることとプローブの蛍光放射に対
応する限られたスペクトルバンドの波長のみが検出器
（例えば、目、カメラ等）に到達することとを保証する
蛍光フィルター・キューブを用いることによって行われ
る（「生物学の技術シリーズ、生物学的活動に対する蛍
光及び発光性プローブ」［Mason（editor）（1993）Flu
orescent and Luminescent Probes for Biological Act
ivity,Biological Techniques Series,edited by Satte
lle,Academic Press Limited,London］を参照）。蛍光
輝度は、通常、励起源の輝度よりも数桁ほど少ないた
め、このような背景冷光を完全に消去することは不可能
である（「細胞生物学」［Benson et al.（1985）Cell
Biol.100,pp.1309−1323］を参照）。望ましくない背景
冷光が発生する三つの主要な原因としては、（１）二色
性ミラー・コーティング及び／あるいはフィルターによ
って完全に塞がれない励起源からの光、（２）試料の、
または、ある場合には光学素子の自己蛍光、そして、
（３）励起フィルター、二色性ミラー及び障壁フィルタ
ーの不適当な（あるいは最適以下の）組合せの選択があ
る。これらの原因は、背景冷光にかなり貢献する可能性
がある。試料自己蛍光効果は、通常、蛍光プローブの吸
収及び発光帯域が、測定される試料のそれと重ならない
ように、蛍光プローブを選択することによって減らすこ
とが可能である。同様に、自己蛍光を減らすために適切
に覆われた光学素子を選ぶことによって、このタイプの
自己蛍光効果も最小にすることが可能である。
最善のフィルター方法が利用可能であるにも関わら
ず、望ましくない背景冷光は、背景（ノイズ）から関連
のある蛍光信号を分離し取り出すことを、しばしば難し
く、あるいは不可能にしてしまう。他方、本発明のスペ
クトル生体結像方法は、望ましくない背景冷光効果を消
去するために、（ｉ）蛍光染料のスペクトル形状及びス
ペクトル範囲と、（ii）（自己蛍光を含む）背景冷光の
スペクトル形状及びスペクトル範囲との間のスペクトル
差を用いることが可能である。
したがって、蛍光プローブの発光スペクトルに適切な
スペクトル画像分析方法を適用することによって、SN比
を改善し、蛍光結像測定の精度を改善することが可能で
ある。測定結果の量子化を望む場合、このスペクトル生
体結像アプローチの利点は、比率結像を行うために特別
に重要である。さらに、本発明のスペクトル生体結像シ
ステムはフィルターに基づく測定の場合に必要な、最適
なフィルターの選択に費やされる時間及び労力を省くこ
とができる。
本発明の方法によるスペクトル生体結像の能力が適切
な蛍光マーカーと共に用いられるとき、多色蛍光画像を
得ることは大いに単純化される。スペクトル生体結像に
よってもたらされる利益を十分に実感するために、多数
のプローブを含む試料からの蛍光を測定するためのフィ
ルターに基づく結像方法を用いるのに必要な通常のステ
ップを考察すべきである。第一に、十分に異なる吸収及
び発光スペクトルをもつプローブが選択されなくてはな
らない。今日の方法において、この必要条件は、試料内
の蛍光マーカー数を、三つから五つのプローブに制限す
るものである。それから、蛍光画像は、励起波長を選択
するための一つのフィルター・ホイールと発光スペクト
ルを取り込むためのもう一つのフィルター・ホイールの
二つのホイールを適切に回転させることによって、各染
料に対して一つの画像が得られる。あるいは代替的に、
３枚重ね二色フィルターによって発光スペクトルを取り
込みながら、励起波長を選択することを目的とした一つ
のフィルター・ホイールを回転させる。励起及び／ある
いは発光波長を制御するために（可動部品のない）チュ
ーナブル・フィルターを用いるアプローチも提案されて
いる。近年は、多数の発蛍光団の結像を可能にするため
に多スペクトル干渉フィルターも用いられている（「人
類分子遺伝学２」［Lengauer et al.（1993）Human Mol
ecular Genetics 2,pp.505−512］を参照）。また、
（例えば、フィルター・キューブを変えることによっ
て）二色性ミラーを変える手段が必要とされる。また、
各波長における画像の焦点を合わせる再調整もしばしば
必要である。しかも、CCDカメラの露出時間をさえ、時
々、より高いSN比を達成するために変えなければならな
い。全体として、これらの条件が完全に行われることの
限界がすなわち位置決め問題の原因である。異なる蛍光
染料の発光に対応して生成された単色画像の各々は、
（容易に利用可能な既製のソフトウェアがあるデジタル
コンピュータを用いることにより）疑似色が付けられ重
ねられる。結果として生じた画像は、各々が異なる擬似
色が付いたいくつかの蛍光マーカーの位置を示すもので
ある。二色性ミラーの位置の僅かな変化が、デジタル化
された画像に並進シフトを起こしてしまうので、多波長
二色性ミラーを用いる（４波長帯域通過特性をもつ二色
効果の使用については、［Hiraoka et al.（1992）Semi
nars in Cell Biology,Vol.2,pp.153−164］を参照）あ
るいはそれらを重ね合わせる前に画像の位置を合わせる
必要がある。画像位置決めは、時間がかかること、ま
た、満足な結果が得られないということがしばしば起こ
る難しい問題である事実にもかかわらず、このアプロー
チは、より一般的である。また、これらは、多色蛍光画
像を得るために取り組まなくてはならない専門的な挑戦
である（「細胞生物学における方法、第Ｂ部」［Waggon
er et al.（1989）Par B of Methods in Cell Biology,
Vol.30,Ch.17,pp.449−478,edited by Taylor and Wan
g,Academic Press Inc］を参照）。
したがって、本発明のスペクトル生体結像方法は、蛍
光結像へのフィルターに基づくアプローチに課された重
要な制限の一つを克服することになる。（テキサス・レ
ッド及びローダミン発蛍光団についての例の部分で下記
に実証されるように、発光スペクトルが広範囲に重なる
染料を含み）無限数の蛍光染料の発光スペクトルの同時
測定を可能にすることによって、スペクトル生体結像
は、多数の蛍光プローブの発光画像を連続的に得る必要
をなくす。スペクトル生体結像システムを用いる利点
は、用いられる蛍光プローブが一般的な励起源によって
励起され得るときに最も大きい。この場合、単一のスペ
クトル画像を得ることで、ほぼ無制限の数の染料の蛍光
発光を捕らえることができる。（１）重なり合わない染
料を選択する、（２）フィルター・キューブを変える、
（３）励起あるいは発光フィルターを変える、（４）焦
点を合わせ及び／あるいは露出時間を最適にする、ある
いは（５）画像を位置合わせする必要性はなくなる。課
題は、もちろん、一般的な励起源で励起される適当な染
料を選択することである。したがって、次から次へと移
る蛍光エネルギーによって励起される染料が、スペクト
ル生体結像システムを用いる多色蛍光結像には理想的で
ある。類似する発光特性を持つ染料を用いることは、
（例えば、顕微鏡下での）視覚による検出をより難しく
することは明らかであるが、この制限は、本発明のスペ
クトル生体結像方法を用いれば解決可能である。
特に、スペクトラキューブ・システムでスペクトルを
測定すれば、多くの異なるスペクトル間のスペクトル差
が僅かなものであっても、それらを識別することは可能
である。
原理的には、可能な限り広いスペクトル範囲を用いる
方が良く、その理由は、スペクトル変化が観察される範
囲がより大きくなり、その結果がより正確になるためで
ある。他方、各々が異なるカラー発光を持つ発蛍光団を
いくつか同時に用いることを望むならば、発蛍光団の各
々を適切なスペクトル範囲で励起し、適正なスペクトル
範囲においてその発光を検出する必要がある。三重の帯
域フィルターを用いることで、三つの異なる励起帯で同
時に励起することが可能になり、そして同様に三つの異
なる周波数帯において発光を検出することが可能にな
る。しかしながら、スペクトル範囲を六つの帯域に分割
することは、非常に狭い周波数帯をもたらすことにな
る。狭帯域は、極めて少数の測定ポイントだけが、シス
テムに測定される周波数帯に入ることを意味する。他
方、二重の帯域フィルターを用いれば、スペクトルは、
単に四つに分割されるだけなので、各周波数帯の幅はよ
り大きい。このことは、各測定発蛍光団に対してより多
くの測定ポイントを見いだせるため、類似する発蛍光団
を区別する能力が向上することを意味する。したがっ
て、現時点において、スペクトラキューブ・システムを
用いる本発明の方法を行うには、蛍光顕微鏡に取り付け
られた二重の帯域フィルターを用いることが好ましい。
b. 多数の発蛍光団のスペクトル確認 本発明によるスペクトル生体結像方法を用いることに
より、一回の測定で多くの染料（すなわち、発蛍光団）
の同時測定が可能になる。染料のタイプに制限なく、下
記に実証されるように（例２及び３参照）、適当なアル
ゴリズム（例えば、背景減法等のための一次結合）を適
用することによって、スペクトル的に重なり合う染料
（例えば、ローダミン及びテキサス・レッド）さえも識
別し、それらの存在を画像にマップ可能である。しか
し、もし多くの染料が同時に用いられるのなら、それら
の励起波長、蛍光輝度及び発光スペクトルに関して、注
意深く考慮すべきである。これを正しく行なうなら、結
果は量的にも分析可能である。例えば、いくつかのタン
パク質の相対濃度は、これらタンパク質に特に結び付く
適当な蛍光標識が施された免疫抗体を用いて、一回の測
定でマップ可能である。また、標準較正された染料を用
いることによって、絶対濃度でも測定可能である。
多数の蛍光プローブの検出がかなりの利点となること
の一つの例は、染色体レベルで遺伝子を分析し、遺伝子
及び染色体の増幅、欠失、転座、配置替え、その他の起
こり得る遺伝子欠陥を見つけるために用いられるFISH
（fluorescent in situ hybridization:蛍光DNAハイブ
リダイゼーション）である（「成長遺伝学とホルモン
９」［Emanuel（1993）Growth Genetics and Hormones
,pp.6−12］を参照）。
多くの癌及び先天性異常を含む特定の病気及び疾患
は、いくつかの遺伝子の不良によって起こされる遺伝子
障害である。多くの他の病気も、遺伝子の要素、すなわ
ち、遺伝子欠陥が存在するためであると知られている、
あるいは信じられている。遺伝子欠陥は、単独では病気
を引き起こさないが、病気を起こすのに寄与する、ある
いは、後に病気になる可能性を増すものである。この現
象は、本技術において多因子の病気及び遺伝子的疾病素
質として知られている。明らかな遺伝子欠陥と既知の病
気との相関関係は、医者が決定的な診断を行い、多くの
病気を早期に発見し処置することを可能とする。遺伝カ
ウンセリングは、その可能性がある親や、その危険性が
ある人々が、将来における潜在的に重大な医学的問題の
可能性を示し、それを阻止する注意を喚起することがで
きる。
5,000以上もの遺伝子障害が確認されたが、その多く
は同義遺伝子障害に関連している。染色体が遺伝情報の
キャリアであることが発見された後、科学者は、特定の
疾患に責任がある染色体にある目に見える欠陥を記録す
ることが可能であると理論的に考えた。1960年代に、ガ
ラスのスライドに広げられた分裂中期染色体の顕微鏡検
査法に基づく分類のために着色技術が開発された。過去
数十年間、染色体のバンディング・パターンの視覚的分
析は、人間の遺伝子障害を、分裂中期染色体の観察され
た構造的な異常へ関連づけるために用いられている。染
色体は、それらの長さに沿った特有の明暗のバンドを明
らかにするために、通常、ギームザ染色（Ｇ−バンディ
ング）を施した後に明視野顕微鏡検査法によって、ある
いは、蛍光染色（Ｒ−バンディング）の後に蛍光顕微鏡
検査法によって調べられる。患者のバンディング・パタ
ーンを正常染色体のパターンに注意深く比較することに
よって、奇形及び遺伝病を起こす転座（染色体間あるい
は染色体内における遺伝物質の交換）、欠失（染色体あ
るいは染色体の断片が欠けている）、付加、逆位等の異
常が明らかになる。
しかしながら、例えば胞性線維症（CF）等の多くの重
大な遺伝病及び他の多くのものは、僅かに一つあるいは
いくつかのヌクレオチドの付加、欠失あるいは置換を伴
う突然変異によって起こる。このような小さな欠陥は、
上記で述べられた染色体バンディング技術によって探知
可能なものではなく、何年もの間、細胞遺伝学者は、僅
かな欠陥の位置を検出すると共に数量化する技術を開発
するために努力している。
蛍光DNAハイブリダイゼーション（FISH）は、複数の
補足的な技術の改良を受けて、過去25年間に渡って発展
したものである。この技術は、細胞遺伝学者の、染色体
上に遺伝子の正確な位置をマップし、染色体の肉眼的染
色によっては目に見えない非常に小さな遺伝子欠陥をも
検出する良い道具を開発したいという願望によって生ま
れたものである。ゲノム・プロジェクト（HGP）、人間
のすべての遺伝子を識別しマップする大胆なイニシアテ
ィブは、FISHに興味を示し、必要なDNAプローブの開発
を早めた。現行のFISH技術は、強力な免疫プローブの同
時の開発、顕微鏡検査法及び分光分析法のための優秀な
蛍光染料の多種多様な増加、そして蛍光顕微鏡検査法に
用いられる対物レンズ、照明装置及びフィルターの劇的
な改良によって可能になった。
FISHの性能及び実用性は、多くの要因による。（１）
FISHは、単に、単離した染色体及び核に用いられるばか
りでなく、固定パラフィンに埋め込まれた組織内におけ
る細胞全体にも用いられる。（２）比較的小さな欠陥を
検出できる（より小さな欠陥を検出するようと、性能は
常に改善されている）。（３）比較的速く結果を提供で
きる。（４）適度なコストは、大部分の臨床検査室や研
究所でそれが用いられることを可能にする。（５）種々
のプローブ及び試料タイプに使用できるように改良が可
能である。（６）高い特異性及び感度が達成可能であ
る。（７）短時間の処理、通常２時間で可能。
多くのFISHの用途において必要となることは、単に、
細胞遺伝学者が、顕微鏡のアイピースを介して、あるい
はモニタ上の画像において、蛍光ラベルが存在するか否
かを測定するだけである。幾分複雑な試料については、
１あるいは２色のラベルを単純にカウントするだけでよ
い。しかしながら、デジタル画像を処理し、それらから
数値データを抽出する能力は、FISH技術に新しい巨大な
機能のセットを加えるものである。本発明の方法等の、
適切な結像方法によって、非常に不明瞭なFISH画像の明
瞭度が向上するため、ラベルが付いた染色体及び遺伝子
座が明確に確認可能となる。容易に達成可能な実験条件
下で、ラベルが貼られたサイト数は自動的に計測可能で
ある。また、ラベルが貼られた各サイトの輝度が測定さ
れ、例えば、特定の遺伝子の存在数を明らかにするDNA
の量が計算される。多色FISH等の新しい技術は、（３、
４、５及びそれ以上の）多数の蛍光プローブを検出し数
量化するためのカラー画像分析を用いる。
上記で論じたように、FISHは、ラベル付けされたプロ
ーブの位置、各染色体上のラベルが貼られたサイト数及
び各サイトにおけるラベルの輝度（遺伝物質の量）につ
いての情報を提供する。動原体（反復DNA）プローブ及
び染色体ペイントは、目標に定められた各染色体にラベ
ル付けを行いコピー数を数えるために用いられる。遺伝
子座特定プローブは、遺伝物質の小さな領域の位置をマ
ップするために用いられる。これらのタイプのプローブ
は、そのままの細胞分裂間期核及び分裂中期の染色体ス
プレッドに用いることが可能で、視覚的にあるいは適当
なアルゴリズムによって自動的に計数可能であり、特定
の染色体、染色体分裂片、あるいは遺伝子があまりに多
いあるいは余りにも少ないために起こる遺伝病を識別す
るために決まって用いられる。
いくつかの癌の非常に早期の段階においては、細胞が
明らかに異常であると確認されるかなり以前に、特定の
遺伝子の数が増加することがある。この現象は、遺伝子
増幅としてこの技術分野で知られているが、遺伝子座特
定プローブを用いることによって、均一に染色された領
域（HSR）そして／あるいは二重の微細な染色体として
探知可能である。癌細胞における染色体異常を検出する
ためにFISHを用い、その病気の発達段階を指摘すること
によって、病期に応じて有効度が異なる多くの治療方法
から、最も適当な治療を選択できる可能性もある。最も
効率的な段階特性治療を選択することによって、貴重な
時間が節約されると共に、患者の苦痛も最小になる。
染色体を（例えば、音波破砕によって）物理的に、あ
るいは（例えば、エンドヌクレアーゼによって）酵素的
に切り刻み、（例えば、流動細胞計算法を用いて）単離
し、分裂片全てに対してプローブのセットを生成するこ
とによって、一つの特定な染色体の全面に一様にラベル
付けすることが可能である。染色体ペイントとしても知
られている染色体プローブの全体は、ターゲット染色体
のすべてのコピーに蛍光ラベルを付ける。染色体彩色の
一つの重要な用途は、特徴的に特定の癌の早期に起こ
る、二つの染色体間における遺伝物質の転座を検出する
ことにある。しかしながら、他の染色体異常も検出可能
である。
例えば、もし染色体Ａが緑のペイントでラベル付けさ
れ、染色体Ｂが赤のペイントでラベル付けされたなら、
ＡからＢへの遺伝物質のいかなる転座も赤色染色体上に
緑の領域として現われる（また、逆も同様である）。通
常、正常な染色体から生成された染色体ペイントが、異
常な（患者の）染色体上の欠失あるいは転座を検出する
ために用いられる。逆方向の染色体彩色は、異常な染色
体から生成されたプローブを、その異常な染色体に物質
を寄与した種々の正常な染色体からDNAを識別するため
に用いる。本発明の方法は、下記の例に実証されるよう
に、一回の交雑そして一回の測定によって、ヒト核型
（すなわち、ゲノム）を構成する24の異なる染色体を各
々が異なる色に彩色し、同時に検出して識別し有意義に
カラーのヒト核型を示すことを可能とする。
比較ゲノム・ハイブリダイゼーション（CGH）は、DNA
プローブの二つのカクテルが染色体の全セットから生成
される逆方向の染色体彩色の変型である。一つのカクテ
ルが正常な染色体のセットから、また、もう一つが異常
な染色体（例えば、腫瘍）のセットから生成される。プ
ローブの二つのセットは、例えば、正常なDNAが赤色の
蛍光を示し、異常なDNAが緑色の蛍光を示すように、異
なるリポーター分子を用いて生成される。正常な分裂中
期の広がりは、両方のカクテルで同時に交雑され、その
場でカラー画像分析を用いて評価される。赤よりも強烈
に緑の蛍光を発する正常な染色体の領域は、DNA増幅
（多数の遺伝子コピー）が患者の異常な細胞におけるそ
の遺伝子で起こったことを示すものである。緑の蛍光よ
りも赤が多い（緑／赤の比が少ない）領域は、患者の染
色体内の遺伝子欠失のサイトを示すものであり、緑と赤
の蛍光が平等な領域は、そのサイトにおいてDNAが変化
していないことを示すものである。CGHの詳細について
は、「比較ゲノムDNAハイブリダイゼーションによる染
色体の完全な、そして部分的な増加及び減少の検出」
［du−Manoir et al.（1993）Detection of complete a
nd partial chromosome gains and losses by comparat
ive genomic in situ hybridization.Hum.Genet.90,590
−610］を参照。CGH及び関連する技術は、先のラベル付
け技術よりも複雑であるが、以前に可能であったものに
比べ、より微妙で広範囲の遺伝子の変化を検出し数量化
する能力を提供する。本発明の方法は、これらのタイプ
の分析に非常に適している。
上記に述べられたことから、単純なカラー蛍光画像に
代わり、比較的に高いスペクトル解像度でスペクトル画
像全体を作る本発明の感度の良い、量的なスペクトル結
像方法を用いることは、核型の作成、転座あるいは転位
あるいは染色体欠失あるいは増幅の検出及び遺伝子マッ
ピングに、大いなる利益をもたらすものである。その理
由は、このような方法は、試料準備時間を減少させ、交
雑された蛍光プローブを、（小さなスペクトルのシフト
によって）背景に残留するものから区別し、多数のプロ
ーブを同時に測定することを可能にするからである。な
お、一回の測定でこのように多くのプローブの測定が達
成できたことは初めてのことである。
したがって、本発明の目的の一つは、プローブ技術に
おける進歩をうまく利用するように設計されたFISH結像
方法を提供することである。本発明によれば、いかなる
任意の染色体分析においても分析可能なプローブ数を大
いに増し、また、従来の技術の方法と比較し、この情報
が得られるスピード及び自動化の割合を劇的に増すこと
が可能である。
本発明のFISH結像方法は、顕微鏡視野のすべてのピク
セルから蛍光スペクトルを同時に得ることが可能で、一
回の実験で多くの蛍光プローブの位置を検出可能なスペ
クトラキューブ・システムの利点を採用する。染色体特
性プローブ及び奇抜なラベル付け戦略を用いることによ
って、下記の例に示されるように、この方法は、各染色
体が異なる色（すなわち、ヒト核型に対して24の異なる
色）で彩色された状態でのFISH核型を生成することが可
能である。この方法は、非常に高い試料処理能力をもた
らし、本質的に無制限のプローブ数の分析を可能にす
る。
上記に説明されたように、本発明の鍵となる概念は、
FISH分析への多くの蛍光プローブの利用にある。ビオチ
ンあるいはジゴキシゲニン等のハプテンが酵素反応を用
いてDNAに取り入れられる間接的な方法を含めて、FISH
に用いるためにDNAプローブにラベル付けを行う多数の
方法が利用可能である。分裂中期の染色体スプレッド
へ、あるいは細胞分裂間期の格への交雑後、免疫学的方
法を用いることによってハイブリッドに蛍光ラベルが付
けられる。最近では、蛍光染料は、直接的にプローブに
取り入れられ、中間ステップを用いることなく検出され
る。標準的なFISHの染料には、フルオレセイン、ローダ
ミン、テキサス・レッド及びカスケード・ブルーが含ま
れ、マルチプローブFISH分析は、異なるプローブを、異
なるハプテンあるいは蛍光染料あるいはそれらの組合せ
でラベル付けすることによって達成される。これは、こ
の技術において組合せプローブとして知られる（「組合
せ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いるDNA
ハイブリダイゼーションによって七つの異なるDNAプロ
ーブの同時の視覚化」［Ried et al.,（1992）Simultan
eous visualization of seven different DNA probes b
y in situ hybridization using combinatorial fluore
scence and digital imaging microscopy.Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 89,1388−1392;and,Ried（Jan.1994）Fluor
eszenz in situ hybridizierung in der genetischen D
iagnostik,Faculty of theoretical medicine,Ruprecht
−Karls University Heidelberg］を参照）。択一的
に、任意のプローブのプールを、各々が異なる発蛍光団
でラベル付けされたサブ・プールに分け、これらサブ・
プールを、同様の交雑結果が得られるように再編成す
る。この方法は、本技術において組合せ交雑として知ら
れている（「比較ゲノムDNAハイブリダイゼーションに
よる染色体の完全な、そして部分的な増加及び減少の検
出」［du−Manoir et al.（1993）Detection of comple
teand partial chromosome gains and losses by compa
rative genomic in situ hybridization.Hum.Genet.90,
590−610］を参照）。これら両分類戦略によれば、組合
せプローブが得られる。したがって、この明細書、特に
請求項において、用語「発蛍光団の組合せ」が用いられ
た場合、上記に説明したように、組合せラベル付け及び
組合せ交雑の両方が言及される。
蛍光は、接地電位において発蛍光団として知られる分
子に光の光子が吸収された後に起こる冷光の一つの形で
ある。この分子は、より高いエネルギー軌道へ電子が移
行するために、励起状態に上げられる。この超過エネル
ギーは、電子が元の接地状態に戻るとき、光量を発散し
て失われる。蛍光光は、吸収された光よりも長い波長に
ある。この移行には制限があるため、発光は励起波長に
近くなる。これため、ある一つのスペクトル範囲で励起
される発蛍光団は、類似のスペクトル範囲で発光する。
例えば、もし励起が青色の範囲にあるなら、発光は緑色
と期待される。したがって、もし異なるスペクトルを放
つ多くの異なるプローブを用いることを望むなら、波長
が近くなり、しばしば重なり合うということは明白であ
るため、異なるプローブ間を区別することが可能なスペ
クトル解像度が非常に重要になる。
本発明の方法によれば、個々のプローブ（この書類の
ここで言及されたプローブは、組合せプローブをも示
す）は、（RGBアルゴリズムによって）擬似色（すなわ
ち、上記に説明された分類マッピングあるいは主成分分
析等の分類アルゴリズムによる所定の色）が割り当てら
れ、その情報はコンピュータ・スクリーン上に表示され
る。多色蛍光を用いることで、多数のプローブからの恩
恵を享受可能な重要な臨床医学の用途にFISHを拡張でき
る可能性が開かれる。例としては、異数体及び染色体の
構造の研究、マーカー染色体及び完全なFISH核型の検出
及び染色体多色バンディングが含まれる。多数の情報が
一回の交雑から得られるかもしれないので、スループッ
トが増し、遺伝子投与量効果を算定する、あるいは欠失
の程度を測定するために内標準が用いられてもよい。
本発明の方法は、いくつかの狭いスペクトル・バンド
に白色あるいはコヒーレント単色光源によって励起され
た蛍光の検出を、冷却CCDをもつセンサを利用して行
う。したがって、異なるプローブを表す各々からなる多
数のスペクトルが同時に測定される。このことは、染色
体の多数のスナップ写真を撮り、次に画像を再構築する
という従来のアプローチだが、すべて上記に説明された
ように、このプロセスには時間がかかり、アーティファ
クトという結果が生じる。本発明の方法は、これと比較
して、画像を得るスピード及び精度を増すことになる。
それゆえ、本発明は、多数のプローブの、より感度が良
く、より速く、より正確な検出を可能にするため、最新
技術の細胞遺伝学の結像方法に勝る非常に意義深い進歩
を示すものである。
本発明の方法のもう一つの目的は、FISH及びスペクト
ル結像に基づく染色体の多色バンディング・パターンの
生成（すなわち、バー・コード化、多色バンディング核
型の作成）である。染色体のバー・コード化に関する詳
細については、Ｃ・ランゴア氏らの文献（C.Lengauer e
t al.（1993）Hum.Molec.Genet.5,505−512）を参照の
こと。
ヒューマン・ゲノム・プロジェクト（HGP）の最初の
目標がもうすぐ達成されようとしている。この目標は、
ヒトのゲノムの物理的なマップを作成することである。
この用語、物理的なマップは、YACクローンあるいはBAC
クローン等の大きなインサートを媒介としてゲノム全体
をクローン化すること、そして遺伝学的な、細胞遺伝学
的な、そして物理的なマッピングによって、これらクロ
ーンのマッピングを行うことに言及する。この目的のた
めに、ヒトのDNAの二つの主要源として、ヒト染色体の
すべてに対して重複するクローンを含む放射線ハイブリ
ッド細胞ライン及びYACコンティグズが用いられた。こ
のマップの完成によって、腫瘍を含む遺伝性あるいは後
天性遺伝病に関する遺伝子を識別するのに必要な、ゲノ
ム特定クローンにおけるほとんど全ての領域が検索可能
になる。多数のYACあるいはBACクローンあるいは放射線
ハイブリッドとスペクトル結像とをFISHに組み合わせる
ことによって、全ヒト染色体に対する多色バンディング
・パターンを生成することができ、究極的に遺伝学的な
マップと細胞遺伝学的なマップとをつなぐことが可能で
ある。
例として、放射線ハイブリッド・パネル（スタンフォ
ード・パネル）を用いることを考察する（「放射線ハイ
ブリッドに基づく遺伝学的なマッピング」［Barret J.
H.（1992）Genetic mapping based on radiation hybri
ds.Genomics 13,95−103］を参照）。スタンフォード・
パネルの個々のパネルは、約5,000Kbpの平均分裂片サイ
ズでDNA分裂片のセットを含んでおり、各パネルはヒト
のゲノムの約20％をカバーする。このような五つのパネ
ルから得られる蛍光プローブのコハイブリダイゼーショ
ン（cohybridization）によって、ゲノムの大部分をカ
バーし、ヒト染色体の全ての標識化を行うことができ
る。しかしながら、分裂片は個々のパネルにランダムに
分布しているため、ヒトのゲノムを完全にカバーするた
めには、もっと多くのパネルが必要である（例えば、６
から10個のパネル）。
次の説明では、五個のパネルが用いられることを想定
している。ヒトのシーケンスだけを排他的に増幅し標識
化することを保証する、本技術においてAlu−PCR等のIR
S−PCRアプローチとして知られる方法で、分散型反復シ
ーケンス（IRS、例えばAluシーケンス）から得られたプ
ライマーを用いて、例えば、dUTPによって共役された発
蛍光団を直接的に含ませることによって、各パネルの染
色体分裂片に、異なる発蛍光団（あるいは発蛍光団の異
なる組合せ、例えば、組合せラベル付けあるいはハイブ
リダイゼーション戦略）のラベル付けを行う。したがっ
て、ヒト以外の核種からのDNAが増幅された、そして／
あるいはラベル付けされた場合は、その核種のゲノムを
特徴づける核種特定分散型反復シーケンス（IRS）を、
適当なPCRプライマーを得るために用いる。個々のパネ
ルの一つを個別に交雑することによって、ゲノムのおよ
そ20％の範囲及び5,000Kbpの平均帯域サイズで、染色体
スプレッドのバンディング・パターンが単一色で得られ
る。五つのハイブリッド・パネルにおける個々の染色体
分裂片のランダムな重複があるため、分裂片の五つの異
なるラベルが付けられたグループ（各グループが単一の
パネルによって代表される）のコハイブリダイゼーショ
ンは、単純色を持つ周波数帯、各々が二つ、三つ、四
つ、そして五つの色の組合せを含む周波数帯を含むバン
ディング・パターンを生じる。全体として、31通りの色
の組合せが可能であり、これらの組合せは、スペクトル
結像を用いて識別可能である。
染色体の多色高解像度バンディング・パターンの生成
には、染色体彩色プローブ（すなわち、染色体ペイン
ト）の使用に比べ、次の二つの明確な利点がある。
染色体彩色は、転座等の染色体間の異常、あるいは均
一染色領域、そしてマーカー染色体等の追加染色体物質
あるいは二重の微細な染色体を検出するのに適したツー
ルである。重度の異常が染色体の全長に影響を及ぼす場
合は、欠失と重複等の染色体内の異常は検出可能である
が、この方法では、染色体の転位（逆位）については全
く検出が不可能である。しかし、多色バンディング・パ
ターンを用いれば、染色体間の、そして染色体内の異常
が診断可能である。その理由は、それらの異常の影響が
染色体バンドのシーケンスに現れるためである。
予めマッピングされたDNA分裂片（例えば、YACクロー
ンや放射線ハイブリッド細胞ライン）を用いる多色高解
像度バンディング・パターンの一つの大きな利点は、遺
伝学的なマップと細胞遺伝学的なマップとを統合できる
可能性があるということである。各多色バンドの特徴
は、標識されたシーケンスの部位の特定のセットにあ
る。それらの部位は、ゲノムにただ一度生じるCPR生成
物からなる。
統合された細胞遺伝学的な、そして遺伝学的なマップ
の有用性を次に説明する。例えば、腫瘍細胞から得た染
色体における特定色バンドの欠如は、癌抑制遺伝子の損
失を表す微小欠失を示す。このバンドに特定されるシー
ケンス目標部位（STS）の知識があれば、どんな大きな
インサート・クローン・コレクションをもスクリーニン
グが可能になり、この例において削除された遺伝子を含
む可能性がかなり高い複数の特定クローンを検索するこ
とができる。
さて、進行中の大規模なシーケンス付けの努力と、発
現標識部位（遺伝子を含むと知られている座位）の統合
とによって、交雑に基づく多色バンディング・パターン
の価値は、さらに増加することが明らかである。
このような多色バンディング・パターンは、容易に自
動化が可能である。相当な努力にも関わらず、従来の染
色体バンドに基づく細胞遺伝学的な診断の自動化は、こ
れまでのところ成功していない。上記のアプローチは、
ヒト染色体の交雑に基づくバンディング・パターンの生
成のためだけではなく、他の哺乳類（例えば、ネズミ）
及び非哺乳類の核種に対しても適用可能である。このこ
とは、腫瘍を含む人間の病気の、動物モデルでの分析に
特に有用である。
放射線ハイブリッド・パネルの説明に類似するが、YA
Cクローン、P1クローン、BACクローン等の個々の大きな
インサート・クローンのセットのコハイブリダイゼーシ
ョンによって、あるいは、所望の解像度に応じて、これ
らの源からのコンティグ（重複クローン）を用いること
によって、ヒト染色体の全てに対して多色バンディング
・パターンを得ることができる。さらに、放射線ハイブ
リッド・パネルの使用に類似するが、異なる発蛍光団で
故意に重複クローンすなわちコンティグにラベル付けを
行うことによって、多色バンディング・パターンを導入
することができる。交雑に基づく染色体バンディングに
よる利点のすべては、染色体ペイントの使用、あるいは
上記に説明した従来の染色体バンディングに比べ、大き
なインサート・クローンを用いることができる点にあ
る。同業者には明らかであるが、染色体ブレークポイン
トあるいは染色体遺伝子欠失に関与するクローンの検索
は、放射線ハイブリッド・パネルを用いるものよりも簡
単で単純である。
染色体多色バンディングの用途に適当な染色体分裂片
のもう一つの源は、染色体の顕微解剖によって得られる
分裂片である。顕微解剖染色体の分裂片は、本技術分野
でよく知られる染色体スプレッドのマニュアルあるいは
レーザ顕微操作によって生成される。このように生成さ
れた分裂片は、通常、本技術でDOP−PCRとして知られる
方法で、例えば、変性オリゴヌクレオチド・プライマー
（DOP）を用いる、あるいは本技術でIRS−PCRとして知
られる方法で、分散型反復シーケンス（IRS、例えば、A
luシーケンス）から得たプライマーを用いる重合酵素連
鎖反応によって増殖される。
さらに、染色体多色バンディングに用いる適当な染色
体分裂片のもう一つの源は、大きなDNA分裂片を生成す
るDNA制限法、そして大きなDNA分裂片を分離可能な電気
泳動法によって生成された分裂片である。DNA制限によ
って大きなDNA分裂片を生成することに関しては、二つ
のアプローチが考えられる。第一のアプローチによれ
ば、エンドヌクレアーゼ（例えば、よく用いられるある
いは稀なカッター）による部分消化が用いられるが、第
二のアプローチによれば、稀なカッターであるエンドヌ
クレアーゼ（例えば、Not I）による完全消化が用いら
れる。完全消化は、独立した試験で全く同一の結果を得
るために繰り返すことができるが、部分消化は性質的に
ランダムであるため、現在は後者が好まれる。大きなDN
A分裂片を分離可能な電気泳動法は、本技術でよく知ら
れており、これにはパルス・フィールド・ゲル電気泳動
（PFGE）が含まれる。したがって、例えば、PFGE航路に
沿った連続した領域からDNAを抽出し、各領域から抽出
されたDNAに、異なる発蛍光団を用いてラベル付けを行
い、このように形成したプローブを染色体にコハイブリ
ダイゼーション化することで、上記に説明したような染
色体の多色バンディング・パターンが得られる。本技術
分野でよく知られるショ糖あるいはセシウム塩化物グラ
ジエント等のグラジエント遠心分離によって、さらに、
大きなDNA分裂片が得られる。しかし、これらのアプロ
ーチを用いることが、上記に説明したように遺伝学的な
マップと細胞遺伝学的なマップとを統合する可能性を提
供するものではないため、現在、これらのアプローチは
あまり好まれない。
蛍光DNAハイブリダイゼーションとスペクトル結像と
に基づく染色体の多色バンディング・パターンの生成
（すなわち、多色バンディング核型）は、種々の実用的
な用途に用いられる。これらの用途には、例えば、
（ｉ）例えば、特注のクローンセットを用いる染色体異
常をスクリーニングすること、（ii）さもなければ検出
が難しい末端小粒欠失をスクリーニングすること、（ii
i）出生前診断における染色体異数体をスクリーニング
すること、（iv）再発性染色体ブレークポイントをスク
リーニングすること、（ｖ）多色比較ゲノム交雑を行う
こと、（vii）腫瘍細胞の多パラメター分析のために多
色FISHを、細胞学的な、そして免疫組織化学的な染色の
他の測定と組み合わせること、（viii）多色バンディン
グ・パターンを従来のＲあるいはＧバンドと組み合わせ
ること、（ix）細胞分裂間期細胞における遺伝学的な異
常を直接的に分析すること、そして（ｘ）放射線あるい
は変異誘発物質にさらされた住民の染色体異常をスクリ
ーニングすることが含まれる。
分子細胞遺伝学の分野におけるスペクトル生体結像の
用途を次に簡単に要約する。スペクトル生体結像が特に
診断の用途において重要な影響を与える細胞遺伝学の二
つの主要な分野は、（ｉ）臨床細胞遺伝学及び（ii）腫
瘍細胞遺伝学。
臨床臨床細胞遺伝学及び腫瘍細胞遺伝学においては、
アメリカ合衆国だけでも、染色体バンディング分析を用
いておよそ400,000ケースの分析が毎年行われている。
従来のバンディング分析に加えて、染色体彩色を行うこ
ともできる。これは、バンディングを用いるだけでは特
徴づけることができないマーカー染色体を識別する手助
けとなるものである。
従来の染色体バンディング分析（従来の核型分析）
は、未だ、出生前及び出生後の診断において染色体異常
を検出するのに最もよく用いられる診断手法である。こ
れは、染色体21（そして、稀に染色体13、18、Ｘ及び
Ｙ）の三染色体性のような数の異常の診断を含むもので
あり、染色体異常を検出するために利用可能な唯一のス
クリーニング試験（あるいはゲノムを走査する方法）で
あったため、用いられている。これは、全染色体組、す
なわちゲノムが単一の実験で査定可能であることを意味
する。また、これは、例えば、染色体21に特定なプロー
ブを用いる実験であるターゲットFISH処理が、単に補助
的な方法として用いられる理由でもある。ターゲットFI
SH処理においては、プローブが向けられた以外の染色体
の染色体異常は検出から漏れることになる。他方、本発
明の方法によれば、すべての染色体を同時彩色し、異な
るスペクトルによってすべての染色体を識別すること
で、FISH分析におけるこれらの限界を回避することがで
きる。出生前診断において、ゲノム彩色は、必須ではな
いしても、一つの重要な診断方法になるであろう。なぜ
なら、本発明のスペクトル生体結像方法は、適切なフィ
ルターを用いた場合、一回の測定でFISH発蛍光団とDAPI
対比染色との両方を検出することができるため、一回の
測定で同じ染色体スプレッドの多色FISH画像とDAPIバン
ディング画像とを提供できるからである。したがって、
確立された細胞遺伝学的情報の中枢を維持しながら、彩
色パターンを表示することができる。この点に関して、
染色体識別の自動化が可能になることは注記すべきこと
である。この目標は、従来のバンディング方法単独では
達成され得なかったことである。
出生後の細胞遺伝学的な診断の分野においては、スペ
クトル生体結像に基づく染色体彩色は、マーカー染色体
を識別するのに非常に役立つであろう。ここで、診断の
障害となるものは、転座し異常染色体になる分離した小
さな染色体の分裂片が、バランスがとれている（すなわ
ち、コピー数に全く変化がない）かあるいはアンバラン
スであるか、原因が解明されていない人間の形成異常及
び精神遅滞徴候の主要因である部分的な三染色体性ある
いは一染色体性に導くかどうかを確認することである。
前述のすべてのアプローチは染色体彩色プローブを用
いる。スペクトル生体結像と特定プローブ・セットとを
組み合わせることによって、交雑に基づく染色体バンデ
ィングが可能である。それらのプローブは、先例がない
ような解像度に選択されるか、あるいは遺伝病の原因と
して過小評価されている末端小粒シーケンスの微小欠失
のような特定の診断の問題を扱うのに適応する。
全染色体組（すなわち、ゲノム）の多色バンディング
・パターンを生成する試みに有用なプローブは、染色体
バンド特定シーケンス、YAC（あるいは他の）コンティ
グ、そしてヒト・シーケンスの特定な既知の表現を持つ
放射線誘発ハイブリッド細胞ラインを含む顕微解剖ライ
ブラリか、あるいはすべての染色体に沿って固定多色バ
ンディング・パターンを生成するエンドヌクレアーゼで
消化されPFGEサイズ分離されて生成された大きな染色体
分裂片かのいずれかである。カラー・パターンにおける
変化が、高解像度で、染色体異常の存在を示す。このよ
うなアプローチは、デザインが高度に柔軟であって容易
に自動化され得ることが明白である。
後天性染色体異常は、主に悪性変質に関係する。およ
そ、（ｉ）血液性腫瘍と（ii）固形腫瘍との二つの悪性
腫瘍が識別可能である。血液性悪性腫瘍からの細胞は人
工的に容易に培養が可能であるため、それら腫瘍の染色
体バンディング分析は、細胞遺伝学的な、そして遺伝学
的な腫瘍研究における成功例の一つである。二つのよく
知られた例として、慢性リンパ性白血病（CLL）におけ
るフィラデルフィア染色体及びバーキット・リンパ腫に
おける特定染色体異常の識別がある。過去10年間で、血
液性悪性腫瘍に関するこの他多くの腫瘍に特定な染色体
異常が識別され、診断及び研究のツールとして用いられ
ている。多くの場合、再発性染色体異常の記述から、分
子レベルで悪性変質のメカニズムを識別することが可能
である。残念なことに、固形腫瘍（乳房、結腸、脳、肺
及びその他の腫瘍）の分野は、分かっていないことが多
い。固形腫瘍の方が血液性悪性腫瘍よりもかなり罹患率
が高いため、この矛盾は憂慮すべきことである。この矛
盾は、主に、固形腫瘍細胞遺伝学に共通する技術的な困
難が原因となっている。固形腫瘍細胞は、培養が難し
く、染色体試料が低品質になり、高解像度の細胞遺伝学
的な分析を妨げるため、腫瘍の発現及び発育に必ずしも
関係がないこれら腫瘍の一般的な二次的な染色体異常の
特徴が現れるためである。交雑に基づく染色体スクリー
ニング試験（すなわち、染色体彩色）は、測定方法にお
けるギャップを埋めることができるため、上記に説明し
たように必要性が高い。この点に関して、比較ゲノム交
雑が部分的に助けとなるが、常に細胞混合物内の染色体
異常の平均が表示されるため、構造的な染色体異常を検
出することはできない。おそらく、交雑に基づく核型分
析は、基本研究においても、また診断試験においても、
固形腫瘍における再発性染色体異常を描写するための方
法として広範囲に用いられるようになるであろう。この
場合も、領域あるいはバンドを特定するプローブを用い
る技術を改善することで、劇的に解像度を増すことがで
きる。
染色体多色バンディング・パターン（すなわち、多色
バンディング核型）の生成、そしてFISH及びスペクトル
結像に基づく染色体彩色は、さらに、種々の用途に用い
ることができる。例えば、（ｉ）生物学的線量測定。放
射線に、あるいは染色体異常を促すことが知られる化学
物質にさらされた人から得た分裂中期のプレートのスク
リーニングを行い損傷の度合いを測定する。（ii）染色
体の進化。進化中に起こった染色体の転位を再構築する
ためにFISHを用いる。（iii）人間の病気、特に腫瘍の
動物モデルにおける染色体異常の分析。これは、交雑に
基づく核型分析を用いることによって大いに促進される
であろう。（iv）細胞分裂間期の細胞遺伝学。無傷の細
胞分裂間期の細胞における染色体コピー数の同時列挙
は、共焦点レーザ走査顕微鏡検査法との組合せで、出生
前診断及び腫瘍研究における異数体の検出、そして微細
な残留病の診断に用いることができる。これは、細胞分
裂間期染色質の構造分析のための素晴らしい研究ツール
になるであろう。（ｖ）細胞学的な診断。共焦点レーザ
走査顕微鏡検査法あるいは逆重畳積分アルゴリズムとの
組合せにおいて、組織片及び細胞核に直接的にマルチプ
ローブFISHを用いて組織化学的な診断を補完する。
したがって、本発明によれば、蛍光DNAハイブリダイ
ゼーションのための方法が提供される。この方法は、次
のステップを含む。（ａ）染色体を持つ細胞核を準備す
るステップ。染色体は、少なくとも一つの発蛍光団でラ
ベル付けされた少なくとも一つの核酸プローブで交雑さ
れる。（ｂ）蛍光顕微鏡を介して細胞核を視検するステ
ップ。蛍光顕微鏡と結像分光計とは光学的に連結されて
おり、蛍光顕微鏡と結像分光計とによって細胞核の各ピ
クセルのスペクトルを得る。
さらに、本発明によれば、交雑に基づく染色体多色バ
ンディングのための方法が提供される。この方法は、次
のステップを含む。（ａ）ゲノム及び染色体を持つ第一
の核種の細胞核を準備するステップ。これらの染色体
は、第一の核種のゲノムの少なくとも一部分をカバーす
る染色体分裂片の少なくとも一つのグループで交雑され
る。この場合、分裂片は少なくとも一つの発蛍光団でラ
ベル付けされている。（ｂ）蛍光顕微鏡を介して細胞核
を視検するステップ。蛍光顕微鏡と結像分光計とは光学
的に連結されており、蛍光顕微鏡と結像分光計とによっ
て細胞核の各ピクセルのスペクトルを得る。
同業者には明らかであるが、本発明の方法は、どのよ
うな結像分光計を用いても実行可能である。これらに
は、先に発明の背景のセクションにおいて説明したよう
に、格子及びフィルターに基づく結像分光計が含まれる
が、上記の理由により、現在は、干渉計に基づく結像分
光計を用いることが好ましい。
したがって、細胞核の各ピクセルのスペクトルを次の
ようにして得ることが好ましい。（ｉ）コリメーター光
学系を用いて細胞核のすべてのピクセルから同時に入射
光を集め、（ii）複数の要素を持つ干渉計システムを介
して平行入射光を通すことにより、光がまず二つのコヒ
ーレント光線に分けられ、干渉計内の各々異なる方向に
移動し、それから二つのコヒーレント光線は、再び結合
し各々他と干渉して射出光線を形成し、（iii）検出器
要素の二次元アレイを持つ検出器に、射出光線を集束さ
せる焦点調節光学系を介して射出光線を通過させること
により、測定の全持続時間に渡る各瞬間において、検出
器要素の各々は、細胞核の常に同一ピクセルの画像とな
るため、細胞核の実像は検出アレイの平面上にあって動
かず、測定中のどの時間においても画像は明らかで識別
可能であり、また、検出器要素の各々は、異なる波長で
ピクセルによって発光される光輝度の特定の一次結合で
ある信号を生成するが、この一次結合は瞬間的な光路差
の関数であり、（iv）干渉計システムの要素の一つ以上
を回転あるいは移動する（すなわち、走査する）ことに
より、細胞核のすべてのピクセルに対する、干渉計シス
テムによって生成された二つのコヒーレント光線の間の
光路差が同時に走査され、（ｖ）第一のスペクトル・キ
ューブのデータを形成するために、記録装置を用いて検
出器要素の各々の信号を時間の関数として記録する。そ
して、（ｃ）数学的アルゴリズムを用いて第一のスペク
トル・キューブのデータを解釈する。
核酸プローブは、各々がインサート、プラスミド、コ
スミド、ファゲミドを含む遺伝子座、分裂片の染色体、
酵母人工染色体を、あるいは、各々がインサート、ある
いはある種の癌組織の完全な（すなわち、全）ゲノム及
びその組合せを含むウィルス・ベクターを含んでもよ
い。発蛍光団は、単一の蛍光染料、あるいは複数の単一
の蛍光染料の種々の組合せである組合せ蛍光染料であっ
てもよい。細胞核は、細胞分裂間期中の核、有糸分裂中
の核あるいは減数分裂中の核であってもよい。したがっ
て、染色体も、細胞分裂間期染色体、有糸分裂中の染色
体あるいは減数分裂中の染色体であってもよい。核酸プ
ローブの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、2
2、23、24、あるいは24より多くてもよく、プローブの
各々は、異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の異なる組合
せ（すなわち、上記に説明したように、組合せラベル付
けあるいは交雑戦略によって得た組合せプローブ）を含
む。好適実施例によれば、発蛍光団は、ヌクレオチドあ
るいはヌクレオチド類似体に共役される。
数学的アルゴリズムは、（ａ）予め定められた波長範
囲を用いる赤緑青色画像計算、（ｂ）ピクセルの各々の
スペクトルに対して少なくとも一つの基準スペクトルか
らのスペクトル差を計算する分類マッピング分析、
（ｃ）一次結合分析、この分析は、分類マッピング分析
と組み合わされた背景減法のためのもの、（ｄ）主要な
構成要素の分析及び（ｅ）ピクセルに関するスペクトル
に応じたピクセル分類に適するいかなる他のアルゴリズ
ムであってもよい。
本発明の方法は、種々の研究及び医学的な用途に用い
ることができる。したがって、この方法は、例えば、次
のことに用いることができる。
（ｉ）これまで検出不可能な末端小粒欠失を高解像度で
検出する。（ii）再発性染色体異常等の染色体異常そし
て／あるいは種々の悪性腫瘍を特徴づける続発性染色体
異常を検出する。（iii）、再発性染色体異常そして／
あるいは続発性染色体異常の存在に従って悪性腫瘍の段
階を検出する。（iv）悪性腫瘍の段階を検出し、その結
果、悪性腫瘍に対する適切な治療を選択する。（ｖ）放
射線等の抗癌性治療や化学療法による治療の効率を確認
する。そして（vi）限定せずに、放射線等の分裂促進的
な作用因子や、仕事で、例えば石油化学製品や石綿等の
分裂促進的な化学物質へさらされた後の染色体異常を検
出する。
交雑に基づく染色体多色バンディングのための方法に
よれば、染色体分裂片は、どのような適当な源からのも
のであってもよいが、ハト・ハムスター放射線ハイブリ
ッド細胞ライン等の放射線ハイブリッド細胞ライン、YA
Cクローン（例えば、コンティグ）、BACクローン、選択
核種の完全なゲノムのサイズ分離型エンドヌクレアーゼ
消化生成物あるいは／及びその核種から顕微解剖した染
色体分裂片から得るのが好ましい。しかし、グラジエン
ト遠心分離によって得た染色体分裂片の他の源も本発明
の方法を実行するために用いることが可能である。これ
ら分裂片は、全体的に、ゲノムのいかなる割合をもカバ
ーすることができる。例えば、10−20％、21−30％、31
−40％、41−50％、51−60％、61−70％、71−80％、81
−90％及び91−100％の範囲であってもよい。この方法
はヒトの核種に行われることが好ましいが、いかなる核
種（例えば、ネズミ）をも、この方法による分析対象物
とすることが可能である。さらに、この方法を、染色体
が第一の核種（例えばネズミ、サルなど）からのもので
染色体分裂片が第二の核種（例えば、ヒト）からのもの
である異なる核種間の分析に用いることもできる。好適
実施例においては、染色体分裂片はグループに分類さ
れ、各グループは、異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の
組合せでラベル付けされる。分裂片がヒトからのもので
ある場合は、染色体分裂片の標識化を、例えばAlu−PCR
等のIRS−PCRによって達成することができる。
本発明は、限られた数の実施例に関して説明された
が、本発明について多くの変形、改良及び他の適用が行
なわれ得ることは明らかである。
さて、上記の説明と共に本発明を説明する次の例を参
照する。
例１ 実験手順の簡単な説明 YACクローン及びハイブリッド細胞ラインのAlu−PCR 分散型反復要素（IRS）−PCR（例えば、Alu−PCR）
は、YACクローンあるいはハイブリッド細胞ライン等か
らFISHのためのプローブ・シーケンスを生成する、信頼
性が高く速い方法である。このアプローチを用いると、
蛍光背景染色は、例えば、ニック・トランスレーション
あるいはランダム・プライミング等によってラベル付け
されたYACあるいはハイブリッド細胞ラインDNAのすべて
を用いる場合に比べて低くなる。
さらに、アガロース・プラグに埋め込まれたYAC−DN
A、寒天板上のイースト菌コロニー及び浄化YAC−DNA
は、増幅可能である。下記に示すプロトコルは、本質的
にアンゴア氏らによって表わされたものに従っている
（Lengauer et al.Cancer Res.52:2590−2596（1992）
を参照）。
溶液:10xPCRバッファ（パーキン・エルマーII）、各2
5mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP（全体としてdNTP）、50
μＭのAluプライマーCL1（5'TCC CAA AGT GCT GGG ATT
ACA G 3',SEQ ID NO:1）、50μＭのAluプライマーCL2
（5'CTG CAC TCC AGC CTG GG3',SEQ ID NO:2）。
手順:100ngのDNA（またはアガロース・プラグあるい
はイースト菌コロニー内における同量のDNA）、10μｌ
の10xPCRバッファ（パーキン・エルマーII）、10μｌの
15mM MgCl2、１μｌの25mM dNTP、0.5μｌの50μＭプラ
イマーCL1、0.5μｌの50μＭプライマーCL2、0.5μｌの
Taq DNA重合酵素（パーキン・エルマー、2.5U）、そし
て反応量を100μｌに仕上げるためにddH2Oを混合させ
て、96℃において１分間、37℃において0.5分間、そし
て72℃において６分間の30PCRサイクルにさらした。PCR
結果を、エチジウム臭化物で染色した1.2％のアガロー
ス・ゲルによってUV照射の下で視検した。PCR生成物を
エタノールで沈殿させ、50μl ddH20で再溶解して、使
用時まで40℃において保存した。
微量のDNAを増幅するためのDOP−PCR シーケンスに依存しないDNAの増幅、すなわち変性オ
リゴヌクレオチド・プライマー（DOP）−PCRは、テレニ
ウス氏らによって最初に説明された（「遺伝子、染色
体、癌」Telenius et al.Genes Chromosomes Cancer 4:
257−263（1992）を参照）。一方、いくつかの改良も発
表された（Bohlander et al.,Genomics 13:1322−1324,
1992;Milan et al.,cytogenet.Cell Genet.62:139−14
1,1993;Guan et al.,Genomics 22:101−107,1994を参
照）。
少ない腫瘍細胞からの微量なDNAの増幅のために用い
るプロトコルは、基本的に、テレニウス氏らによって著
されたプロトコルに沿っている。スピーチャー氏らによ
って、僅かな改良が施された（Speicher et al.,Hum.Mo
l.Genet.2:1907−1914（1993）を参照）。このプロトコ
ルを用いることによって、わずか30pgのテンプレートDN
Aの増幅が達成された。
溶液:10xPCRバッファ（パーキン・エルマーII）、25m
MのMgCl2、各5mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP（全体とし
てdNTP）、17μＭの６−MWプライマー（5'CCG ACT CGA
GNN NNN NAT GTG G 3',SEQ ID NO:3）。
手順:100ngのDNA（あるいはそれ以下）、５μｌの10x
PCRバッファ、４μｌの25mM MgCl2、２μｌの5mM dNT
P、５μｌの６−MWプライマー17μｍ（最終濃度1.7μ
Ｍ）、0.5μｌのTaq重合酵素（2.5ユニット）、そして
反応量を50μｌを仕上げるためにddH2Oを混合し、次の
ようにPCRサイクルにさらした。93℃において10分、そ
の後、94℃において１分、30℃において1.5分、30℃か
ら72℃へ３分間で変化させ、そして72℃において３分間
延長させる工程を５サイクル、その後、94℃において１
分、62℃において１分、そして72℃において３分、延長
ステップに１秒／サイクル加え、そして最終的に延長が
10分になる工程を35サイクル。PCR結果を、エチジウム
臭化物で染色した1.2％のアガロース・ゲルによってUV
照射の下で視検した。PCR生成物をエタノールで沈殿さ
せ、50μｌのddH2Oで再溶解し、使用時まで４℃におい
て保存した。
DOP−PCRあるいはIRS−PCRを用いるプローブの標識化 溶液:10xPCRバッファ（パーキン・エルマーII）、25m
MのMgCl2、各2mMのdATP、dCTP、dGTP及び1.5mMのdTTP
（全体としてdNTP）、適当な量の該当プライマー、例え
ば、DOP−PCRのための100μＭの６−MWプライマー、そ
して1mMのラベル付けされたdUTP。
手順:400から600ngのDNA、10μｌの10xPCRバッファ、
８μｌの25mM MgCl2、２μｌのdNTP、用いるプライマー
に応じて２から４μｌのプライマー、２μｌのTaq重合
酵素（10ユニット）、５μｌの1mMのラベル付けされたd
UTP、そして反応量を100μｌに仕上げるためにddH2Oを
混合し、94℃において１分、56℃において１分、72℃に
おいて４分、そして20分間の最終的な延長を持つ25PCR
サイクルにさらした。ラベル付けされたPCR生成物は、
エタノール沈殿物であった。これを50μｌのddH2Oに溶
解し、使用時まで−20℃で保存した。
プローブと試料の変性 プローブの変性：プローブのタイプに応じて種々の量
のプローブDNAを用いた。下記の量は、18x18mm2の交雑
領域に対して用いたものである。変性の前に、次の濃度
でプローブを10μｌの交雑溶液に再懸濁した（下記を参
照）。
動原体特定DNAプローブ:1から2ng/μｌ 染色体彩色プローブ:20から40ng/μｌ 遺伝子座特定プローブ：−プラスミド10ng/μｌ −ファージ20ng/μｌ −コスミド５から8ng/μｌ −YAGあるいは細胞ハイブリ
ッド（Alu−PCR生成物）10ng/μｌ −単一コピーcDNAプローブ10
ng/μｌ −ゲノム（CGH）20から50ng/
μｌ。
プローブDNAを、キャリアーDNAの存在下で、また、染
色体ペイント等の複雑なプローブを用いる場合は、競争
的DNA（例えば、ヒト・ゲノムDNA）の存在下でエタノー
ル沈殿した。キャリアーDNAとしては、（交雑溶液にお
ける）最終濃度が100ng/μｌのサケ精子DNAが好ましか
った。プローブDNAを、スピード・バック（speed−va
c）で乾燥し、チューブ・キャリアーを備えたボーテク
ス（vortex）上で室温において５μｌのホルムアミドで
再懸濁した。ボーテクスによっておよそ30分間処理した
後に、2xSSCの20％デキストラン硫酸塩を５μｌ添加し
た。プローブDNAを76℃において５分間変性させ、氷で
冷却した。複雑なプローブ（例えば、染色体彩色プロー
ブ）を交雑する場合は、37℃において30分間予め自己ア
ニーリング（なまし）の工程を行った。CGHの実験にお
いては、DNAプローブを２時間自己アニーリングさせ
た。
試料の変性：たいていの用途においては、前処理を行
うことなく分裂中期の染色体を交雑のために用いること
ができるが、ある用途において、もし蛍光背景が高いよ
うならば、前処理工程が助けとなることもある。蛍光背
景が特に高いような場合によく用いられる前処理手順を
下記に示す。
溶液:ddH2Oにおける20mg/mlのDNA分解酵素を含まない
RNA分解酵素−Ａ、ddH2Oにおける10％ペプシン、そして
50mlの1M MgCl2＋950mlの1xPBS（1xPBS/MgCl2）。
手順：スライドを室温において2xSSC内で平衡にし、
下記のように、RNA分解酵素処理を行い、その後、ペプ
シン処理を行った。RNA分解酵素を1:200に希釈し、その
200μｌをスライドに適用し、その後、それらのスライ
ドを24x60mm2のカバー・ガラスで覆った。45分から60分
間37℃に保温した後、カバー・ガラスを取り除き、室温
において3x5分間スライドを2xSSC内で洗浄した。50μｌ
のペプシンを（コプリン・ジャー（coplin jar）内の）
37℃に予め暖めておいた100mlの0.01M HClに加えた。RN
A分解酵素で処理したスライドを、37℃で５から10分
間、コプリン・ジャー内の上記ペプシン−HCI溶液内で
保温した。その後、スライドを室温において2x5分間、
撹拌下にある1xPBSで、そして一度1xPBS/MgCl2で５分間
洗浄した。ペプシン処理の後、次のように、スライドを
ホルムアルデヒトの存在下で定着させた。100mlの1xPBS
/MgCl2へ2.7mlの37％ホルムアルデヒトを添加して、1xP
BS/MgCl2における１％のホルムアルデヒトの新鮮な溶液
を準備した。スライドを室温において10分間このホルム
アルデヒト溶液内で保温し、その後、室温において1x5
分間、撹拌下にある1xPBSでスライドを洗浄した。スラ
イドを70、90、100％のエタノールで各々３分間脱水
し、空気乾燥した。
試料の変性はプローブDNAの変性よりも重要である。
二つの目標を達成する必要がある。（ｉ）試料形態にお
ける損失が最小であり、プローブ浸透が最適であるこ
と、そして（ii）目標シーケンス損失が最小であるこ
と。異なる試料、例えば、分裂中期の染色体と組織切片
との間における最適な変性時間は異なるし、また、プレ
パラート毎にも変化する。したがって、最適な性能を確
保するために、試料の各バッチ毎に適切な条件を見定め
るべきである。次の手順においては、分裂中期の染色体
に対する平均時間が与えられている。
溶液：変性溶液:70％ホルムアミド、2xSSC（−20℃に
保存）、ddH2Oにおけるエタノール・シリーズ（70％、9
0％及び100％）。
手順:120μｌの変性溶液をスライドに適用し、24x60m
m2のカバー・ガラスで覆った。その後、オーブンで80℃
に予熱されたガラス・プレートの上に、スライドを２分
間（あるいは試料に応じてもっと長時間）置いた。カバ
ー・ガラスを取り除き、スライドをエタノール・シリー
ズ（70％、90％、100％）で脱水し、空気乾燥した。
DNAハイブリダイゼーション 37℃で交雑が起きる。しかし、ある特定なプローブ
は、より高い交雑温度を必要とする。このことは、染色
体の特異性を保証するために、特に反復DNAプローブに
該当する。（択一的に、この厳密性は、交雑溶液中の塩
分濃度を、例えば0.2xSSC最終へ、減少させることによ
って増すことができる）。交雑中には、カバー・ガラス
をゴム・セメントで密閉するため、湿り室は必要ではな
い。すべての遺伝子座特定プローブ、すなわち、コスミ
ド・プローブあるいはファージ・クローンに対する交雑
時間は、12時間から16時間で十分である。染色体彩色も
一晩で行うことができるが、遠く離れた核種の染色体を
ヒト・プローブで彩色する場合は、より長い交雑時間
（そしてより高いプローブ濃度）を確保することが好ま
しい。ゲノム全体を交雑する場合は（例えば、CGH）、
交雑時間は２日から４日間へと延びる。
蛍光プローブ検出 蛍光プローブ検出は、直接的な、あるいは間接的なも
のである。直接的なフォーマットにおいては、プローブ
は、蛍光色素（すなわち、発蛍光団）に繋がったdUTPで
ラベル付けされた。これらのプローブは免疫学的な増幅
ステップを必要としないが、信号を、dUTPに繋がった蛍
光色素に向けられた蛍光色素共役抗体、例えば、FITC共
役ウサギ抗FITCで増幅することができる。一般に、直接
的にラベル付けされたプローブは、信号の輝度が僅かに
減少するが、背景蛍光も同様に低い。直接的なフォーマ
ットに対しては、多くの彩色プローブが利用可能であ
り、大変良く機能する。直接的なアプローチの詳細につ
いては、文献（Wiegant et al.,Nucl.Acids Res.19:323
7−3241,I 1991 and Wiegant et al.,Cytogenet.Cell G
enet.63:73−76,1993）を参照のこと。
間接的なフォーマットは、ビオチン、ジゴキシゲニ
ン、ジニトロフェノール等のハプテンに繋がれたdUTPを
用いる。プローブ・シーケンスの視覚化は、蛍光色素の
アビジン共役体を介して、あるいはジゴキシゲニン及び
ジニトロフェノールに対して向けられた抗体を介して行
われる。ビオチン及びジゴキシゲニンのシステムは、感
度及び柔軟性において優れた能力を発揮するため、この
方法は多くの用途に対して選択可能である。通常の二重
ラベル検出を下記に示す。ビオチン及びジゴキシゲニン
でラベル付けされたプローブを視覚化するための多種多
様な蛍光検出フォーマットが利用可能である。ビオチン
及びジゴキシゲニンでラベル付けされたプローブには、
信号増幅ステップを容易に行うことができるという明白
な利点がある。ビオチンでラベル付けされたプローブ
を、ピンケル氏らが説明したサンドイッチ技術を用いて
増幅することができる（Pinkel et al.Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 83:2934−2938（1986）を参照）。ジゴキシゲ
ニンでラベル付けされたプローブを、蛍光色素に結合さ
れたジゴキシゲニンに対する抗体を用いて、あるいはネ
ズミに対する抗体を用いて後に、視覚化可能なジゴキシ
ゲニンに対するネズミ抗体を介して検出することができ
る。アビジン（あるいはストレプトアビジン）共役体
は、次の蛍光色素と共に市販されている。AMCA、カスケ
ード・ブルー、FITC、テキサス・レッド、ローダミン、
TRITC、Cy3、Cy5。ジゴキシゲニンに対する抗体は、次
の蛍光色素と共に市販されている。抗ディグ（anti di
g）TITC（Fab−分裂片）、抗ディグ・ローダミン（Fab
−分裂片）、ネズミ抗ディグIgG、ヤギ（ヒツジ）抗ネ
ズミFITC、ヤギ（ヒツジ）抗ネズミTRITC、ヤギ（ヒツ
ジ）抗ネズミCy3、ヤギ（ヒツジ）抗ネズミCy5。
プローブ検出及び信号増幅：次に、ビオチン及びジゴ
キシゲニンでラベル付けされた二つのプローブに対する
典型的な検出及び増幅手順を示す。
溶液：ウオッシュI:50％ホルムアミド、2xSSC、pH7.
0、45℃に予め暖められている。ウオッシュII:0.1xSS
C、60℃に予め暖められている。ウオッシュIII:4×SS
C、0.05％ツイーン、37℃に予め暖められている。ウオ
ッシュIV:2xSSC、0.025％ツイーン、37℃に予め暖めら
れている。バッファI:4xSSC、３％ BSA、37℃に予め暖
められている。バッファII:4xSSC、１％ BSA、37℃に予
め暖められている。DAPI−染色液:2xSSCにおける50ng/m
l（最高３週間まで４℃で保存）、使用前に室温へ暖め
る。抗フェード溶液:9:1のグリセリン及び0.2M Tris−C
lからなる溶液に溶けた2.3％ DABCO（w/v）（シグマD25
22）、70℃に暖めことによってpH8.0。
手順：交雑後、下記のようにスライドを処理した。検
出及び洗浄ステップ中のどの時点においてもスライドが
乾かないことが最も重要であるため、有蓋ウォーター・
バスの中に湿ったペーパー・タオルの層を含む浮き箱内
にスライドを保持した。ゴム・セメントを慎重に取り除
いた。ウオッシュＩ内でスライドを撹拌することによっ
て、カバー・ガラスを取り除いた。スライドをウオッシ
ュＩで3x5分間洗浄し、緩やかな撹拌の下でウオッシュI
Iで3x5分間洗浄した。その後、スライドを１分間ウオッ
シュIIIの中で保温し、次に、37℃において20分間バッ
ファＩの中で保温した。その後、スライドをウオッシュ
III内で簡単に洗浄した。
（比較的に）暗い所で37℃においてすべての検出ステ
ップを行った。バッファIIでアビジン−FITCの希釈液
（1:400）を調製し、120μｌをスライドに適用し、その
後24x60mm2のカバー・ガラスで覆った。湿室内の暗い環
境で30分間37℃においてスライドを保温した。カバー・
ガラスを除去するために、スライドをバッファIIの入っ
たジャーに入れた後、バッファIIIの中で37℃において3
x5分間洗浄した。その間に、バッファIIにおけるビオチ
ン標識された抗アビジン抗体（1:200）とネズミ抗ディ
ズ（1:500）との希釈液を調製し、各々120μｌを、上記
に説明したカバー・ガラスで覆われたスライドに適用し
た。スライドを暗所で37℃において30分間保温してか
ら、37℃においてウオッシュIIIで3x5分間洗浄した。そ
の間に、アビジン−FITC（1:400）とヤギ抗ネズミ−Cy3
（1:400）の希釈液を調製し、各々120μｌをスライドに
適用し、その後、上記に説明したようにスライドを処理
した。もし必要なら、Cy3に共役した抗ヤギ抗体でスラ
イドを保温することによって、Cy3信号をも増幅するこ
とが可能である。
DAPIでの対比染色を2xSSC内で５分間行った。FITC及
びローダミンに対して不特定なFITCフィルターあるいは
二重帯域通過フィルターを用いて、染色体及び信号を同
時に視覚化するために信号をFITCでのみ検出する場合
は、プロピジウム・ヨウ化物を代替的な、あるいは追加
的なDNA対比染色液として用いることができる。しか
し、ローダミン、TRITCあるいはCy3を用いるどの二重ラ
ベル実験においても、プロピジウム・ヨウ化物で対比染
色することは、スペクトルが重なり合うため、信号検出
の障害となる。
DAPI対比染色の後に、スライドを、2xSSC（室温で２
分間）で一度洗浄し、35μｌの抗フェード溶液を適用
し、きれいな24x60mm2のカバー・ガラスで覆い、気泡が
生じるのを避けた。スペクトル結像を行うまで、スライ
ドを４℃の暗所に保存した。
例２ スペクトラキューブ、一次結合アルゴリズム及び分類マ
ッピング・アルゴリズムを用いる改善された蛍光DNAハ
イブリダイゼーション（FISH） 本発明の方法をスペクトラキューブ・システムに用い
るスペクトル生体結像は、一回の測定で多数のプローブ
の同時検出を高い精度で可能にすることによって、FISH
有用性を向上させる。その結果、FISHによる遺伝子異常
の検出の効率及び信頼性は、大いに向上する。
上記に詳しく述べたように、蛍光DNAハイブリダイゼ
ーション（FISH）は、多くの研究及び診断分野におい
て、ますます重要な役割を担っている。1970年代に最初
に導入されて以来、FISH技術はかなり進歩し、単一の遺
伝子配列、部分的な染色体配列、さらに染色体全体（す
なわち、染色体彩色）の検出及び識別を可能にしてい
る。FISHの用途の多くは、遺伝病及び遺伝子異常を発見
し治療を行うためであり、また胎児期の診断、アニュー
ソミ（aneusomy）、その他の病気の早期発見にある。
相同核酸連鎖の交雑に基づくFISHの高感度及び選択性
のため、１キロベース（kb）ほどの小さな短い配列さえ
も観察可能である。（もうすぐ、15−30ベース程度の短
い配列をも検出可能なまでに改良されるであろう。その
結果、ポイント突然変異の検出も可能になるだろう。）
FISHは、分裂間期及び分裂中期の細胞に、さらには組織
全体に適用できるため、細胞遺伝学及び病理学の分野で
広範囲の用途に用いられることが可能である。FISHは、
DNAプローブ、蛍光染料（特に、組合せプローブの導
入）、蛍光顕微鏡検査法、高性能CCDカメラ及び結像技
術の改良に伴い能力が向上する。
同時に多くのプローブを検出する能力については、FI
SHを効率的な診断の道具にするために、すでに文献に示
されている（Rudkin and Stollar（1977）Nature 55,17
2−173を参照）。しかし、既存の方法は取り扱いが難し
い。下記に実証されるように、多数のプローブの検出
は、適切なアルゴリズムに組み合わされたスペクトラキ
ューブ・システムによって、スペクトル解像度及び感度
が良いため、大いに改善される。この機能を説明するた
めに、染色体１及び染色体17に特定されたDNAプローブ
を用いて行われた細胞分裂間期のFISH測定の例を含む図
5aから5cを参照する。この測定において、これらDNAプ
ローブは、蛍光スペクトルが非常に類似した発蛍光団テ
キサス・レッド及びローダミンで各々タグ付けされた。
染色体１のプローブは、染色体のサブテロマー（subtel
omeric）領域に対するミッドサテライト・プローブであ
り、交雑後ビオチンによってDNAプローブにリンクされ
たテキサス・レッドでタグを付けられた。染色体17のプ
ローブは、染色体の動原体領域に対するαサテライト・
プローブであり、ローダミンでタグを付けられて、交雑
後ジゴキシゲニンによって第二のDNAプローブにリンク
された。図5aは、顕微鏡を通して肉眼で見えるようなオ
リジナル画像を示す。図5bは、測定後スペクトラキュー
ブ・システムによって処理された同じ試料を示す。図5c
は、（Ｔと記された）テキサス・レッド及び（Ｒと記さ
れた）ローダミン発蛍光団の蛍光スペクトルを示す。
図5cに明らかなようにテキサス・レッド及びローダミ
ンのスペクトルのピークは、僅かに15ナノメートル異な
るだけであるため、フィルターに基づくシステムを用い
たとしたら、それらを区別することは非常に難しいであ
ろう。
図5aに示されるように、顕微鏡を通してカラーFISH画
像を見ると、画像に現れた（１−４と記された）点及び
プローブ・タイプの正しい数を認識する信頼性は、特に
高くないということが分かる。他方、図5bに示されるよ
うに、各ピクセルに対する測定スペクトルを利用するス
ペクトラキューブ・システムは、点の存在を確かめ正確
にそれらを数えると共に、それらの間の小さなスペクト
ル差から高い信頼性で異なる対を区別することが可能で
ある。図5cに示されるように、テキサス・レッド及びロ
ーダミン蛍光の人工彩色によって、プローブ特性蛍光の
位置は高い精度で測定される。点１及び２がテキサス・
レッドであり、点３及び４がローダミンである。
図6a及び6bは、六つの異なるプローブを用いる、細胞
分裂間期における核DNAの交雑後のFISH測定の例であ
る。図6aはオリジナル画像を示し、図6bは、スペクトラ
キューブ測定におけるすべての検出された対のペクトル
処理及び人工色表示を示す。図6cは、スペクトラキュー
ブ・システムを用いて３枚重ね二色フィルターを通して
検出され（染色体に応じて各々に次のラベルがある:1、
８、10、11、17及びＸ）交雑後の六つの発色団のスペク
トルを示す。（発蛍光団、プローブ及び染色体に関する
詳細については、次の説明、表２及びカタログ［Chroma
Corp.Cat.No.61502］を参照。
肉眼によって、あるいは単純なRGBカラー測定を用い
ても、色を一色毎に区別することは難しいということ
が、細胞分裂間期の細胞核のオリジナルRGB画像を示す
図6aから明らかである。経験豊かな観察者は、最も条件
が良い場合に、６色の内、異なる３色を検出できるかも
しれない。しかし、図6bは、背景減法及び分類のために
有標分類アルゴリズムでスペクトル・データを処理した
後（上記詳細を参照）の、図6aに示されたものと同じ試
料を示す。結果として生じた点は次のように人工色で強
調表示された。茶色−B1、青緑色−Ｃ、青色−B2、黄色
−Ｙ、緑色−Ｇ、及び赤色−Ｒ。なお、背景は黒色−B3
の人工色が与えられた。観察されるように、すべての六
つの発蛍光団の対を見つけること、そして容易にそれら
の対を区別することが可能である。
青色（B2）で強調表示された一つの対は、肉眼によっ
て、あるいはカラー・カメラを用いてもほとんど気付く
ことが不可能であるが、スペクトル・キューブに背景減
法アルゴリズムを適用した後では検出可能である（図6a
を図6bに比較）。
プローブは、染色体８、10、11、17及びＸの動原体領
域に対して五つのαサテライト・プローブが、染色体１
のサブテロマー領域に対してミッドサテライト・プロー
ブが用いられた。上記の染色体及びDAPI対比染色（背
景）の各々にラベルをはるために用いられた発蛍光団、
それらの発光ピーク及び人工表示色の分類は、表２に要
約される。
図6cに示される六つの発蛍光団の各々の正規化された
スペクトルの特徴から、いくつかの比較的に広いスペク
トル範囲で測定するフィルターに基づいたシステムは、
スペクトル間の大きさ重なり合いのため、異なるプロー
ブ核種を確実に区別することが不可能であることが明ら
かである。このようなシステムは、各プローブの輝度の
絶対測定により依存しているため、背景信号及びノイズ
によってさらに影響を受ける。スペクトルの重なり合い
は、セル自体から発生する自己蛍光という状態でも時々
起こるもので、この場合も、各ピクセルに対するスペク
トル情報の有用性が、自己蛍光の寄与の除去を可能に
し、より正確な結果をもたらす。
画像上の各点の全スペクトルの測定は、プローブの特
異性の問題をも解決するかもしれない。事実、ある場合
には、ある染色体DNA連鎖に合致するプローブは、異な
る（たいてい類似の）連鎖への低い特異性を持ち、第二
の連鎖へも交雑する可能性がより低い。このことは、あ
るタイプのプローブがあまりにも多く出現するかのよう
な見せかけを生じるが、第二のケースにおける蛍光スペ
クトルは、プローブの化学物質環境に小さな変化がある
ため、第一のものに対して非常に僅かにシフトする。ス
ペクトラキューブ・システムは、スペクトル解像度及び
感度によって、このアーチファクトを排除可能である。
試料準備中に洗浄されてないプローブに対して同様のア
ーチファクトは、虚偽の陽性の診断をもたらす。したが
って、本発明の方法によるスペクトラキューブ・システ
ムは、間違った診断の危険性を減少させる助けとなる。
多数の類似の染料へ一般化すると、図5a及びｂ及び6a
から6cの例は、多数のプローブを検出し区別することが
可能であることを示す。それらの間に小さなスペクトル
差が存在するという条件下で、スペクトラキューブは一
回の測定でそれらを検出し識別する。
他の既知の、また、将来に発見される、あるいは開発
される発蛍光団及び発蛍光団の組合せも、上記に詳しく
述べたように、多数の遺伝子座を同時に検出して核型の
各染色体を識別可能な色等で彩色するために、種々のFI
SHの用途に用いられてもよいことは同業者に明らかであ
る。最先端の細胞分子生物学に用いられる発蛍光団のリ
ストは、「蛍光プローブへの入門、生物学の研究のため
の蛍光及び発光性プローブの特性、歴史及び用途」［Ka
sten（1993）Introduction to fluorescent probes:Pro
perties history and applications,in Fluorescent an
d luminescent probes for biological research,Mason
Ed.Academic Press Limited,London,pp.24−31］に述
べられている。例えば、生体発光、化学発光及び非蛍光
分類法等の他のラベル付け技術も同様に適用されてもよ
いことは同業者には同じく明らかである。
したがって、FISH分析のためのスペクトラキューブ・
システムを用いることで、次のような重要な利点が得ら
れる。（例えば、蛍光顕微鏡を用いて）FISHを行うため
に従来の手段を用いると、一回の交雑で用いられるプロ
ーブ数は、二つから四つに制限されるが、スペクトラキ
ューブ・システムは、その高スペクトル解像度のため
に、多数のプローブの同時検出を可能にする。したがっ
て、FISH分析のためにスペクトラキューブ・システムを
用いることは労力及び時間を省くことになる。さらに、
FISHの分析のためにスペクトラキューブ・システムを用
いることで、完全な分析に必要とされるセル数を減少で
きる。これは、分析すべきセルの数が限られている場合
に重要な特徴である。
例３ 蛍光DNAハイブリダイゼーション及びスペクトル生体結
像を用いる、ヒトのすべての染色体の異なる色による同
時の視覚化 多色FISHの出現は、基本研究及び遺伝子の診断におけ
る分子細胞遺伝学の応用を広げた。すべての既存の多色
FISH技術は、発光スペクトルが光学フィルターで分離さ
れ得る蛍光プローブを用いることを必要とする（「組合
せ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いるDNA
ハイブリダイゼーションによる七つの異なるDNAプロー
ブの同時の視覚化」［Ried et al.,（1992）Simultaneo
us visualization of seven different DNA probes by
in situ hybridization using combinatorial fluoresc
ence and digital imaging microscopy.Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 89,1388−1392;and,Ried（Jan.1994）Fluore
szenz in situ Hybridizierung in der genetischen Di
agnostik,Faculty of theoretical medicine,Ruprecht
−Karls University Heidelberg］を参照）。この必要
条件は任意の試料内に識別可能な染料数を制限する。本
発明によれば、スペクトラキューブ・システムを用い
る、FISHに対する奇抜なアプローチと、スペクトル的に
重なり合うラベル付けされた多数のプローブ（単独及び
組合せ）を測定し分析する本発明の方法とが提供され
る。この例においては、上記に説明されたように、生物
学的試料のすべてのポイントにおいて決定的なスペクト
ル・データを同時に測定可能なフーリエ分光分析法、CC
D結像及び光学顕微鏡検査法の組合せであるスペクトル
生体結像検査法が、ヒト染色体のすべてのタイプ（すな
わち、24種）に沿って、交雑に基づく多色帯域を視覚化
し、ヒト核型のカラー・マップを生成するために用いら
れた。
この目的のために、各々が５以下の異なる発蛍光団
（ａからｅ、表３）の異なる組合せでラベル付けされた
24の染色体ペイント（１から22、Ｘ及びＹ、表４）（異
なる発蛍光団及びそれらのスペクトルの特徴については
表３を、24の染色体ペイントを得るために、表３にリス
トアップされた発蛍光団を割当てることについては表４
を参照）は、リエド（Ried）氏他の著書（「組合せ蛍光
発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いるDNAハイブ
リダイゼーションによる七つの異なるDNAプローブの同
時の視覚化」［Ried et al.,（1992）Simultaneous vis
ualization of seven different DNA probes by in sit
u hybridization using combinatorial fluorescence a
nd digital imaging microscopy.Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 89,1388−1392］を参照）に述べられているように本
質的に交雑のために準備された男性の白血球の有糸分裂
染色体スプレッドに、同時に交雑された。交雑された染
色体は、スペクトラキューブ・システムに接続された逆
蛍光顕微鏡を通して視検され、分析された。
さて、図7aから7e、8a及びｂ及び図9a及びｂを参照す
る。図7aから7eは、24の個々のピクセルについて正規化
されたスペクトル、すなわち、ヒトの異なるタイプの染
色体の各々（１−22、Ｘ及びＹ）を示す。番号１−22、
文字Ｘ及びＹは、スペクトルの各々が引き出された染色
体のタイプを示す。図7aから7eに示されるように、ヒト
の24の染色体の各々から得たスペクトルは、他のすべて
のスペクトルとは異なる。この差異は、大きい（例え
ば、図7cの染色体11と15とのCa.530ナノメートル発光ピ
ークを比較）かもしれないし、あるいは小さい（例え
ば、図7eの染色体22とＹとのCa.530ナノメートル発光ピ
ークを比較）かもしれないし、あるいはいくつかのスペ
クトル範囲では、（例えば、図7eの染色体22とＹとのC
a.680ナノメートル発光ピークを比較）無くなってしま
うかもしれない。しかし、さらに、図7aから7eに示され
るように、スペクトラキューブ・システム及び本発明の
方法を用いることで、非常に類似したスペクトル間の僅
かな相違さえも検出が可能となる。しかし、本発明の方
法における、スペクトル間の差異を検出する能力は、か
なりの部分において、適切な発蛍光団及び発蛍光団の組
合せの選択に依存するが、この技術における同業者ある
いは熟練した者には、ここに示された性能が、いかなる
従来の細胞遺伝学の技術をも超越することが理解される
であろうことは、この説明から明らかである。
図8aは、上記に述べられたヒトの彩色された染色体の
RGB画像を示し、図8bは、図8aの彩色された染色体から
得たヒトのカラー核型を示す。文字で24の異なる色を表
すことは不可能であるため、白黒の図8a及び8bと、色が
付いていなければまったく同じ図であるところの、色の
付いた図9a及び9bも含まれている。染色体対の各々は、
異なる色で彩色されること、また、カラー核型（図9b）
は、カラー画像（図9a）から容易に得られることに注意
すべきである。
図8a及び9aの画像を生成し表示するアルゴリズムは、
上記に説明され、図４に例証されたように、RGBアルゴ
リズムである。Ｒ＝640−740ナノメートル、ｇ＝550−6
40及びＢ＝530−550ナノメートル。しかしながら、輝度
に関してより統一された画像を得るために、得たRGB値
に特別な修正が行われた。この修正は、カラー結像技術
において「コントラスト・ストレッチ」として知られて
おり（例えば、「ENVITMユーザーズ・ガイド、画像化の
ための環境」［ENVITM User's guide,The environment
for visualizing images Version 1.1 July 1994 Editi
on,BSC limited Liability Company］を参照）、次のこ
とを含む。（ａ）RGB値の各々の分布を測定する。
（ｂ）測定された分布内における輝度間の差異を最大に
するためにルックアップ表を定義する。（ｃ）修正され
たRGB画像を表示する。この画像が、オリジナルの各々
のスペクトルの最大の色変化を表す。このオリジナルの
RGB画像の単純な修正は、上記に説明されたように、実
際は、分類アルゴリズムの一つの限定版である。
さて、図10aから10d及び11aから11dを参照する。図10
aは、もう一人の彩色ヒト染色体のRGB画像を示し、図10
bは、図10aの彩色染色体から得たカラー・ヒト核型を示
す。図10c及び10dは、各々、図10a及び10bの彩色ヒト染
色体及び核型の分類マップを示す。48の異なる色及び暗
度を表すことは非常に難しいため、各々が、白黒の図10
aから10dとまったく同一な有色の図11aから11dをも共に
示している。染色体の対の各々が、異なる色で彩色され
ており、RGB画像及び分類マッピング・アルゴリズムの
ために、カラー画像からカラー核型を容易に得ることが
できる。
この例では、組合せ交雑アプローチに従って準備した
五つの異なる基本的な発蛍光団（表３のａからｅ）か
ら、組み合わせて24の異なる単一及び組合せプローブを
用いることを、ヒト染色体のカラー核型を作成すること
に対して説明した。しかし、いくつかの他の核種は、よ
り多くの数の染色体を持っているため、多分、より多く
の基本的な発蛍光団から組み合わされたより複雑な組合
せプローブを用いる必要がある。しかし、ヒト染色体も
含み、染色体は、大きさのグループにも分類が可能であ
る。このため、いくつかの用途に対しては、異なる大き
さのグループに属している染色体が同じに彩色されて
も、それらの相対的な大きさによって識別が容易である
ため、色数の必要が最小に抑えられることに注意を払う
べきである。これは、人手による点検によって、あるい
は代替的に、どの形態学的アルゴリズムを用いても達成
可能である。同業者には明らかであるが、同様の画像を
表示するのに他のアルゴリズムも等しく用いることがで
きる、あるいはより適当である場合もある。
上記に詳細に説明したように、有意義な成分の各々、
あるいはそれらの組合せに異なる所定の人工色を与える
主成分分析も適当である。さらに、同様なスペクトルを
区別し、異なるスペクトルを持つピクセルに異なる所定
の人工色（すなわち擬似色）を与えることが可能なアル
ゴリズムも、本発明の方法によるカラー核型分析に適し
ている。
例４ 乳癌細胞における多数の染色体転座の検出 説明されたように、本発明の方法は、正常な血液細胞
の完全なカラー核型を提供することができる。多く場
合、従来の核型作成技術（例えば、Ｇバンディングある
いはＲバンディングを用いる技術）は、遺伝子障害に関
する転座等の染色体異常（例えば、ダウン症候群の21q2
2三染色体、染色体18（あるいはその分裂片）の三染色
体及び染色体13（あるいはその分裂片）の三染色体）あ
るいは悪性腫瘍（例えば、慢性の骨髄性白血病の患者か
らの白血球内における染色体９及び22の遠心端間での転
座、そしてバーキットリンパ腫の患者のリンパ球内にお
ける染色体８及び14の転座）を検出するために用いられ
る。この例においては、乳癌細胞における多数の染色体
転座を検出する本発明の方法に組み合わされたスペクト
ラキューブ・システムの機能が説明される。
さて、図12aから12e、13aから13e、14及び15を参照す
る。乳癌細胞ラインSKBR3の染色体スプレッドは、上記
表３及び４に詳述されたように、24の染色体ペイント
（１から22、Ｘ及びＹ）で交雑され、上記例２のところ
で詳述されるように、スペクトル的に画像化された。図
12a及び13a、そして図12c及び12dは、二つの染色体スプ
レッドのDAPI Rバンディングを示す。一つ（12a及び13
a）は、従来の蛍光顕微鏡を用いて撮ったもので、もう
一つ（12c及び13c）は、DAPIフィルター（すなわち、DA
PIの帯域通過フィルター・キューブ）を持つスペクトラ
キューブ・システムを用いて結像したものである。これ
らの図によって表された核型はかなり異常であるけれど
も、染色体の特定な転座を識別することは不可能である
ことが分かる。図12b及び13b及び図12d及び13d（各々、
白黒及びカラー）は、スペクトラキューブ・システム及
び本発明の方法を用いて得た、同じスプレッドのRGB画
像である。他の同一実験条件下で得たヒトの正常な核型
を提示する図9a及びｂと比較すると、図12b及び13bに示
された染色体を含む異常の多くは、ヒトの種々の正常な
染色体の一部をも含むことが明らかである。図12b及び1
3bの転座した染色体（右）は、Ｒバンドの染色体（左）
と共に図14及び15に示されている。図14及び15に示され
た転座染色体のいくつかは、二つ、三つ、さらには四つ
の異なる染色体から発生した分裂片を含むことが分か
る。さらに、染色体物質の大きな広がりが染色体８ペイ
ントで彩色されており、この染色体に対するコピー数が
増加したことを示唆する。
さて、図12e及び13eを参照する。染色体8qに対する増
加コピー数をこの細胞ラインから抽出したDNA（図の上
部）で比較ゲノム交雑（CGH）を用いて確認した（「比
較ゲノムDNAハイブリダイゼーションによる染色体の完
全な、そして部分的な増加及び減少の検出」［A.Kallio
niemi et al.,Science 258,818（1992）;and du−Manoi
r et al.（1993）Detection of complete and partial
chromosome gains and losses by comparative genomic
in situ hybridization.Hum.Genet.90,590−610］を参
照）。染色体８に対する彩色プローブ（青）及びｃ−my
c発癌遺伝子に対するコスミド・プローブ（赤）による
二色FISHによっても、マーカー染色体の構造を確認した
（図の下部）。染色体バンド8q24、すなわちｃ−myc発
癌遺伝子のマップ位置の形状が離散しているのが分か
る。
特定の染色体の転座及び他の染色体の異常（例えば、
遺伝子増幅）は、以前から、悪性腫瘍の早期あるいは段
階特性に結びつけられており、また、このような転座及
び他の異常を検出し描写する能力は、本発明の方法によ
ってかなり増進されるため、本発明の方法を用いる悪性
腫瘍の早期発見及び分類の能力には大きな恩恵がある。
さらに、本発明の方法を用いることで、特定の悪性腫瘍
と繰り返して関連づけられるさらに新しい染色体特性の
異常（例えば、転座）に関する知識の確立が可能であ
り、その結果、このような転座に対する包括的なガイド
の提供が可能となる。さらに、このような再発性的な異
常に関する知識は、遺伝子を活性化される、あるいは非
活性化されることによって悪性の過程に関連がある遺伝
子の分離につながるかもしれない。
このようなことを考慮すると、この例と前記例２とに
用いられた発蛍光団は、（表３にリストアップされ図7a
から7cに示されたように）全体として、480から730nmの
範囲で発光することに気付くことは重要である。なぜな
ら、DAPIは、このスペクトル範囲のかなり下にある青色
で発光するため、対比染色にDAPIを同時に用いることが
可能であるからである。したがって、図12a及び12b、13
a及び13b、14及び15に示されるように、同一の染色体ス
プレッドを、従来の単色Ｒバンディング・アプローチ
と、本発明の多色アプローチによって同時に観察可能で
ある。測定スペクトル範囲を青色に制限することによっ
て、スペクトラキューブ・システムにより、従来のDAPI
Rバンディング画像が提供可能であることは明らかであ
る。したがって、比較の目的で、単一染色体スプレッド
は、DAPI Rバンドの核型あるいはカラー核型として、ス
ペクトラキューブ・システム及び本発明の方法を用いて
視検されてもよい。このため、染色体の転座による事象
が本発明の方法によって研究されるとき、DAPI Rバンド
の核型は、さらなる情報を提供し、正確にどの特定の染
色体のどの領域（すなわち、バンド）が特定の転座事象
に関連しているかを指摘することが可能である。
例５ 染色体異常のスクリーニング方法としてのスペクトル核
型分析の可能性 異なる試験所から提供された五つの臨床試料を分析す
ることによって、染色体異常のスクリーニング方法とし
てのスペクトル核型分析の可能性を探った。すべてのサ
ンプルを、従来のバンディング方法、そして／あるいは
一つ、またはいくつかの個別な染色体彩色プローブを用
いる従来のFSIHによって予め調べた。染色体異常の事前
の知識がない状態でスペクトル核型分析を行った。例外
なく、Ｇバンディングとスペクトル核型分析とは、一貫
した結果をもたらした。例を図16a及び16b（白黒）と図
17a及び17b（カラー）に示す。いくつかのケースでは、
染色体異常を完全に解明するのに、ギームザ・バンディ
ングだけでは十分ではなかったため、スペクトル核型分
析による染色体異常の診断を従来の二色FISH分析を用い
て確認した。
さて、図16a及び17aを参照する。分析した最も小さな
異常は、転座ｔ（1;11）（q44;p15.3）であった。精神
遅滞がある子供の父親の末梢血液リンパ球から染色体を
準備した。染色体１に転座した分裂片は、（矢印によっ
て示す）染色体11物質であると確認できた。染色体１に
対応する小さな分裂片が染色体11の短い腕の上に検出さ
れたため、この転座は相互関係にあった。インサート
は、転座染色体のスペクトルに基づく分類結果を表すも
ので、染色体１物質が人工的に黄色に、そして染色体11
物質が青色に彩色されている。染色体１及び11上の転座
セグメントを、染色体1q及び11p（図示せず）に対する
副末端小粒特定コスミド・プローブを用いて確認した。
さて、図16b及び17bを参照する。もう一つのケースで
は、Ｇバンディング分析は、染色体４のセグメントが染
色体12に転座していることを示唆した。スペクトル核型
分析は、染色体物質の出所を染色体４からのものである
と明確に識別した。図16b及び17bの上側には、本発明の
方法によるスペクトル核型分析後の、分裂中期のスプレ
ッドから得た転座染色体のRGB画像（右）と、分類マッ
ピング・アルゴリズムを適用した後の人工色画像（左）
とを示す。また、図16b及び17bの下側には、Ｇバンディ
ング分析（インサート）、そして本発明の方法によって
アンバランスな転座を確認した染色体４（緑）及び12
（赤）に対する彩色プローブを用いる従来の二色FISHを
示す。
図によって示さない他のケースとしては、（ｉ）転座
ｔ（8;13）（q24.1;q34）の診断、（ii）クラインフェ
ルター症候群（核型47、XXY）の診断、そして（iii）こ
れまで未確認であったマーカー染色体Xp＋上に存在する
余分な物質は、スペクトル核型分析後に、Ｘ染色体から
得られるものであると確認された。
例６ 比較細胞遺伝学における本発明の方法の用途 上記例３及び４に説明した臨床的な腫瘍細胞遺伝学に
おける診断の用途に加え、本発明の方法によるスペクト
ル核型分析は、比較細胞遺伝学のための多様な研究ツー
ルである（「遺伝学における現在の意見と発達」J.Wein
berg and R.Stanyon（1995）Current opinion in genet
ics and development 5,792−797を参照）。進化中に染
色体形態を変えた転位を容易に視覚化できる。さて、図
18及び19を参照する。例えば、例２のヒト染色体彩色プ
ローブを用いて、テナガザル核種の高度に転移した核型
を単一交雑で再構築することが可能であった。したがっ
て、図18及び19は、ヒト彩色プローブによる交雑後のテ
ナガザル核種（Hylobates concolor）のスペクトル核型
を示す。テナガザルＸ染色体は、ヒトＸ染色体で完全に
彩色されている。常染色体の大部分、例えば染色体19
は、多数の進化的な染色体の転位を表すバンディング・
パターンを明らかにする。
進化的に転移した染色体のスペクトル核型分析の結果
は、以前に行った従来のFISHによる実験及びバンディン
グ分析のものと一貫していた（U.Koehler,F.Bigoni,J.W
ienberg and R.Stanyon.Genomics 30,287（1995）;and
P.van Tuinen and D.H.Ledbetter.Am.J.Phys.Anthropo
l.61,453（1983）を参照）。
例７ さらなるFISHの応用 上記の説明から、次のことが明らかである。（１）数
種類のプローブがFISHに使用可能である。これらには、
遺伝子座特定プローブ、染色体分裂片のグループ、染色
体ペイント、そして（例えば、CGH分析のための）ゲノ
ム全体が含まれる。（２）分析される染色体は、細胞分
裂、有糸分裂あるいは減数分裂中であってもよい。
（３）すべてのタイプのプローブが、多数、染色体に同
時に交雑されてもよい。また、プローブの各々が幾分異
なるスペクトルを持つという条件で、本発明の方法に従
って用いられるスペクトラキューブ・システムは、スペ
クトル的にプローブの各々を検出し、適当な分類アルゴ
リズム（例えば、分類マッピングあるいは主成分分析）
を用いて、スペクトルの各々を表すピクセルにRGB色
（すなわち、擬似色）あるいは所定の人工色を当てるこ
とによってその立体的な構成を明らかにすることが可能
である。
したがって、例えば、もし本発明の方法が、新たに単
離された遺伝子（あるいは他のDNA連鎖）をマップする
ために用いられるのなら、染色体バンドへ遺伝子をマッ
プするのに単一の手法が用いられ得る。この目的に対し
て、二つの新たな遺伝子に対して例示する。まず、26の
異なるプローブ、24の染色体ペイント及び二つの遺伝子
座特定プローブ（すなわち、蛍光的にラベル付けされた
新たに単離された遺伝子）が準備される。次に、プロー
ブは、混ぜられ、好ましくは、DAPI対比染色された有糸
分裂の染色体に同時に交雑される。その結果は、24（男
性の場合、あるいは女性の場合23）色の核型であり、図
9bで示すものに類似している。さらに異なる二つの色が
着いた二つの遺伝子座特性信号（遺伝子座特定プローブ
に分類された点）は、新たに単離された遺伝子の染色体
の位置を示す。これらは、次に、上記に説明されたよう
に、Ｒバンド画像を生成することによって、特定の染色
体バンドと関連づけられる。
多くの場合、遺伝子座特定プローブが、一つの染色体
バンドにマップされることはほとんどなく、どれが近位
あるいは遠位であるのかは未だに確立されていない。各
々が異なるRGBあるいは人工色として現われるように、
少数のプローブの各々を同時に検出するために本発明の
方法を用いることは、多く場合、密接にマップされた連
鎖の相対的な構成を決定することを可能にする。
スペクトラキューブ・システム及び本発明の方法は、
細胞分裂間期染色体の三次元配置を検出するために用い
られてもよい。図8a及び9aを再び参照する。右上角に示
された（NIと記された）ものは、上記表４にリストアッ
プされた染色体ペイントで交雑された細胞分裂間期中の
核である。この核のカラー・パターンの観察から、独特
な特徴が明らかになる。例えば、（赤色の）染色体２の
対の両方が核の低い部分に位置しており、（紫色の）染
色体６の対は共にその反対側の極に位置していることが
分かる。細胞分裂間期中にある染色体組織については、
未だに分からないことが多いが、悪性細胞においては、
細胞分裂間期中に染色体組織に変化が起こるのではない
かと推測できる。したがって、本発明の方法は、種々の
悪性腫瘍の早期発見を行う、悪性の病気の段階を定義す
る、また、それゆえに、診察患者等への治療をより適切
に行えるという点で、大変価値が高いものである。本発
明の方法に組み合わされたスペクトラキューブ・システ
ム及び三次元再構築手段（例えば、共焦点顕微鏡）は、
細胞分裂間期中の染色体組織の三次元情報を引き出すた
めに用いられることが分かる。
多くの癌及び遺伝子障害は、染色体欠失、点座、他の
転位及び大きな異常（例えば、遺伝子増幅）から起こ
る。上記例３に説明されたように、本発明の方法を用い
ることによって、このような異常を検出する能力が向上
される。さらに、上記に説明されたように、本発明の方
法は、比較ゲノム・ハイブリダイゼーション（CGH）及
び逆染色体彩色に非常に適していることが明らかであ
る。
一般的な染色体異常の一つが、ダウン症候群と結び付
けられる。ダウン症が染色体21の三染色体性が原因で生
じることはかなり以前に確立されている。より注意深く
観察することによって、染色体21（21q22）の特定の領
域が、この一般的な徴候に常に関連づけられる（すなわ
ち、三染色体として現われる）。しかし、従来のＧある
いはＲバンディングによる核型作成技術によって測定さ
れたダウン症の人の核型が見かけ上正常である場合があ
る。この現象への説明として、これらの場合の三染色体
性は、2q22染色体領域からの分裂片に見られるが、この
分裂片は、従来のバンディング技術の解像度以下に小さ
なものであるためとするものが広く受け入れられてい
る。しかし、本発明の方法と組み合わされたスペクトラ
キューブ・システムを用いることによって、これまで検
出不可能であった（例えば、絨毛膜絨毛を介しての試料
採取で得た）胚芽細胞内の染色体21の三染色体が検出可
能であり、この危険性が高い女性たちへの、知識に基づ
いた遺伝子カウンセリングが可能になる。染色体13及び
染色体18あるいはその分裂片が、極めて異常な子供の出
生を引き起こす三染色体を生じるという報告もあるが、
本発明の方法は、これらの破壊的な染色体13あるいは18
の三染色体性の胎児期の診断のために同様に適用され得
るということにも注意すべきである。
急速に発展している、妊娠女性の血液から胚芽細胞を
分離する技術と組み合わされた本発明の方法は、染色体
21の三染色体性及び他の頻度の少ない染色体異常を検出
するのに危険性が少ない、胎児期の核型作成に対して非
常に価値が高いものである。
染色体末端小粒特定プローブと組み合わせてスペクト
ラキューブ・システム及び本発明の方法を用いることに
よって、末端小粒（ヒトの男性に48、女性に46）の各々
は、異なる色に現われるため、調べられる種におけるす
べての末端小粒の比較研究を可能にする。
進化論的に関連のある種の研究及びモデル・システム
（例えば、ヒトに対するモデル・システムとしてのネズ
ミ）の研究においては、多く場合、二つ以上の種の染色
体が連鎖相似性に従って整列されて染色体を媒介とする
遺伝子情報が見い出される比較ゲノム・マップを得るこ
とが要求される。本発明の方法を用いることは、このよ
うな比較マップを得ることを容易にする。例えば、ヒト
とネズミとの染色体比較マップを構築することを考察す
る。この目的のために、一つの種の染色体ペイントの完
全なセット（例えば、ヒトのもの）が他の種の（この例
ではネズミの）染色体スプレッドに同時に交雑され、上
記に説明されたように分析される。結果は、ヒト染色体
ペイントで彩色された、ネズミの核型の画像が得られ
る。したがって、この二つの種の核型間での位置合わせ
が可能である。
FISHに対する多くの他の用途がこの技術の文献に述べ
られている。一つの例は、遺伝子表現の研究である。同
期細胞培養から周期的に得られる細胞分裂間期の核で交
雑された遺伝子座特定プローブを用いることによって、
再現の度合いを測定することができ（すなわち、複製さ
れない遺伝子は二つの点として現れるが、複製された遺
伝子は四つの点として現れる）、決まって、早い時期に
複製する遺伝子が、遅く複製する遺伝子よりも測定細胞
内に表現される。本発明の方法は、各々が僅かに異なる
スペクトルを持つ多数のプローブが、一回の交雑で同時
に分析された後に一回の結像ステップによってすべて測
定される、このタイプの分析に非常に適している。事
実、本発明の方法は、これまでに述べられた、あるいは
これから現れるいかなるFISHの用途に対しても使用可能
である。
例８ 染色体多色バンディング−染色体バー・コード化 さて、図20及び21を参照する。スペクトラキューブ・
システムと本発明の染色体多色バンディング法とを用い
て得た、カラーのバー・コードを持ついくつかの染色体
を、長手方向の軸に沿って配列したRGB画像である。
ヒト染色体５、２、10、13、16及び７に示されたバー
コードは、多色染色体分裂片の源として、（５、２、1
0、13及び16については）蛍光的にラベル付けされた放
射ハイブリッド染色体分裂片を、（７については）YAC
クローンを用いて生成した。
すべてのケースで、明瞭な異なる色を持つ二つの発蛍
光団、（緑色蛍光を持つ）FITC及びTRITC（赤色蛍光を
持つテトラメチル・ローダミン−５−イソチオシアネー
ト）を、組合せ交雑アプローチに従って染色体分裂片に
ラベル付けを行うのに用いた。
染色体５、２、10、13及び16に対しては、放射線ハイ
ブリッド染色体分裂片のフル・セットから分けた二つの
ランダムな分裂片グループにラベル付けを行うために、
FITC及びTRITC発蛍光団を用いた（すなわち、全体的に
ヒト・ゲノムのすべてをカバーする）。しかしながら、
交雑に用いる染色体分裂片源が存在し、測定されたな
ら、同じ源の分裂片で交雑した他のいかなる正常な染色
体も同じ色のバー・コード（すなわち、バンディング）
パターンを生じ、同様に測定される。
表示色は、色の違いを際立たせるRGB検索表を用いて
選択されるため、異なる色を持つバーが強調される。
染色体７の短い腕に沿ったカラー・バー・コードは、
ヒト染色体７の短い腕の既知の位置において予め互いの
近傍でマッピングした６つの異なるYACクローンを用い
て生成された。これらの６つのYACクローンは、既知の
染色体位置に応じて交替する様式で、前述の緑及び赤の
発蛍光団でラベル付けした。得たRGB画像の表示色は、
結果を強調するために、適当なRGB検索表を用いて同様
に選択した。各々が異なるクローンの交雑を表す、染色
体に沿った６つの異なるバーが現れている。染色体５、
２、10、13及び16に関する上記の説明に反して、この場
合（すなわち、染色体７）は、既知の染色体源の交雑プ
ローブを選択することで、任意の染色体に関連するバン
ディング・パターンは予測可能である。
すべての染色体をカバーする多くのYACクローンを用
いることによって、また、各々が異なる蛍光特性を持つ
より多くのタイプの発蛍光団を用いることによって、こ
の例を拡張し、ヒトあるいは他の核種の完全な多色バン
ディング核型をもたらすことが可能である。
上記に説明したスペクトラキューブ・システムに連結
した、クロマ・テクノロジー（Chroma Technology）か
らの注文設計に基づく三重帯域フィルターで補った蛍光
顕微鏡を用いて測定を行った（励起:455−485、555−57
5、630−650nm、発光:500−550、580−620、660−740n
m）。発蛍光団の励起のためにキセノン光源を用いた。
例９ 染色体彩色そして／あるいは染色体多色バンディング及
び従来の染色体バンディング 前述のように、従来の染色体バンディング（Ｇバンデ
ィングあるいはＲバンディング）は、例えば、染色体異
常の検出等、種々の目的で細胞遺伝学において今日用い
られる主な方法である。
従来の染色体バンディングは、実際、「細胞遺伝学者
の言語」であり、細胞遺伝学の社会ではよく知られてい
る。
本発明の方法の最も重要な利点の一つは、同一染色体
スプレッドについて、従来の染色体バンディング（例え
ば、DAPI染色を用いるＲバンディング）及びスペクトル
核型分析（すなわち、染色体彩色あるいは多色染色体バ
ンディング）の両方を測定できる能力にある。
得られた二つの画像の相互分析によって、構造的な異
常及び数量的な異常の両方の識別と共に、すべての染色
体の分類を行うことができ、染色体彩色及び多色染色体
バンディングに関する新しい細胞遺伝学的な言語を得る
上で細胞遺伝学者を支援することができる。
さて、図22aから22c及び23aから23cを参照する。染色
体の染色にDAPIを用いたＲバンディング画像（図22a及
び23a）、図22a及び23aのネガ画像を提示して得たＧバ
ンディング画像（図22b及び23b）、そして単一染色体ス
プレッドのカラー核型RGB画像（図22c及び23c）であ
る。すべてスペクトラキューブ・システムを用いて得た
ものである。
ＧあるいはＲバンディングのために、ネズミ染色体を
DAPIで染色した。カラー核型分析のために、上記の表２
及び３で詳しく説明したように、DAPI染色された染色体
をヒト染色体ペイントの完全なセットで交雑した。最適
な立体的解像度を得るために、DAPI画像を得るために用
いた対物レンズはx100であった。また、カラー核型分析
に通常用いる三重フィルター・キューブを特別なDAPI帯
域通過フィルター・キューブに取り換えた（励起350−4
00nm、発光400−450nm）。このようなフィルター・キュ
ーブは、非常に一般的なもので、各メーカーの核タイプ
の顕微鏡に対して存在する。その後、絶えず前後に急速
にスキャナーを移動させることによって、およそ５から
15秒の露光時間で画像を測定した。そのようにスキャナ
ーを移動する理由は、干渉縞を排除し、より明瞭な画像
を得ることにある。一般的に、DAPI染料の輝度は他の蛍
光染料の輝度よりもかなり小さいため、比較的に長い露
光時間が必要である。他方、DAPIは安定性がある発蛍光
団で、カラー核型分析に用いられる他の発蛍光団ほど、
測定時間中に白くなることはない。DAPI Rバンディング
（図22a及び23a）のグレー・スケール画像が得られる。
DAPI Rバンディング画像から可能な限りの情報を抽出す
るために、ネガ画像を計算し、細胞遺伝学者が見慣れた
Ｇ−バンディング・パターンを生成した（図22b及び2
3）。一般的な形の逆転関数を用いることによって、こ
れを行った。v'x,y＝Ｎ−Ｉx,y。この式において、Ｎは
カメラの最大ダイナミック・レンジであり（このケース
では、Ｎ＝4,095）、Ｉは各x,y位置における正の輝度で
あり、そしてI'は各x,y位置における計算された負の輝
度である。グレー・レベル検索表を強めることによっ
て、その結果を改善することができる。
同じ染色体スプレッドのカラー核型画像をも測定し
て、図22c及び23cに示している。これらの画像の相関関
係によって、染色体の識別精度が向上することが明白で
ある。大きさがより均一で、従来の染色体バンディング
技術によるバンディングの特定性が低いため、ヒト染色
体に比べて、ネズミ染色体を識別することはかなり難し
いことが明らかである。その結果、ほとんどの科学者に
は、ネズミ染色体の識別は不可能である。しかし、カラ
ー核型分析そして／あるいは本発明の多色バンディング
方法を用いることによって、染色体の識別は単純にな
る。
DAPIの励起及び発光が青の範囲の波長になるとき、他
の発蛍光団がより長い励起及び発光波長となる特徴があ
るため、上記の表２でリストされた発蛍光団と共にDAPI
を用いることは、たいへん便利である。したがって、上
記に説明したように、染色体のＧあるいはＲバンディン
グを得るために、同様な特質を持つ他の染色液（すなわ
ち、従来の染色体バンディング染料）を用いてもよい。
例10 染色体彩色そして／あるいは多色染色体バンディング及
び自動染色体測定 上記に説明したように、繰り返して全く同一の条件下
で、染色体バンディングあるいは染色体彩色に多色プロ
ーブの任意のセットを用いるなら、自動核型分析のため
に、所定のスペクトル特性を持つピクセルを染色体に結
びつける単純な染色体分類アルゴリズムを用いることが
可能である。また、この染色体分類アルゴリズムを、自
動核型分析の技術分野でよく知られる形態学的アルゴリ
ズムをも含むように拡張することによって、さらに良い
結果が達成できる可能性がある。
したがって、正常な染色体スプレッドの参照交雑結果
を保存し、同一の状態下で交雑し分析した染色体スプレ
ッドとのスペクトル的な（そして形態学的な）比較に用
いる。
シーケンス・リスト （１）シーケンスID番号１の情報 （ｉ）シーケンス特性 （ａ）長さ:22 （ｂ）タイプ：核酸 （ｃ）撚り：単一 （ｄ）位相幾何：線形 （xi）シーケンス解説：シーケンスID番号1: （２）シーケンスID番号２の情報 （ｉ）シーケンス特性 （ａ）長さ:17 （ｂ）タイプ：核酸 （ｃ）撚り：単一 （ｄ）位相幾何：線形 （xi）シーケンス解説：シーケンスID番号2: （３）シーケンスID番号３の情報 （ｉ）シーケンス特性 （ａ）長さ:22 （ｂ）タイプ：核酸 （ｃ）撚り：単一 （ｄ）位相幾何：線形 （xi）シーケンス解説：シーケンスID番号3:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート エー バックワルド イスラエル国、ラマト イシャイ30095、 ハダガンストリート（番地なし) (72)発明者 ダーク ジー ソエンクセン アメリカ合衆国、カリフォルニア92008、 カースルバッド、チェシャー3639 (72)発明者 トーマス ライド アメリカ合衆国、メリーランド20814、 ベゼスダ、パークウッド ドライブ9819 (56)参考文献 特開 平６−38798（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ ｅ Ｓｐｉｅ，Ｖｏｌ．2678，ｐｐ. 303−309（Ｍａｙ 1996) Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖ ｏｌ．12，ｐｐ．368−375（1996年４月 15日ＪＩＣＳＴ受入) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (26)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）染色体を持つ細胞核を準備するステ
    ップ、これら染色体は、少なくとも一つの発蛍光団でラ
    ベル付けされた少なくとも一つの核酸プローブで交雑さ
    れる、 （ｂ）前記細胞核を蛍光顕微鏡を介して視検するステッ
    プ、この蛍光顕微鏡は結像分光計に光学的に結合されて
    おり、前記蛍光顕微鏡及び前記結像分光計は、前記細胞
    核の各ピクセルのスペクトルを得るためのものであり、
    前記細胞核の各ピクセルの前記スペクトルを次のように
    して得る、 （ｉ）コリメーター光学系を用いて前記細胞核のすべて
    のピクセルから同時に入射光を集め、 （ii）この平行入射光を複数の要素を持つ干渉計システ
    ムを介して通過させることで、まず前記光が二つのコヒ
    ーレント光線へ分割され前記干渉計内の各々異なる方向
    へ移動してから、前記二つのコヒーレント光線が再び結
    合し互いに干渉し射出光線を形成し、 （iii）検出器要素の二次元アレイを持つ検出器上に前
    記射出光線を集束させる焦点調節光学系を介して前記射
    出光線を通過させることで、測定の全持続時間に渡る各
    瞬間において、前記検出器要素の各々が前記細胞核の一
    つの常に同じピクセルの画像をもたらし、前記細胞核の
    実像は検出アレイの平面上に動かず、測定中のいかなる
    時においても前記画像は明確に認識可能であり、前記検
    出器要素の各々は、異なる波長で前記ピクセルによって
    発光される光輝度の特定の一次結合である信号を生成す
    るが、この一次結合は瞬間的な光路差の関数であり、 （iv）前記干渉計システムの前記要素の一つあるいはい
    くつかを回転させるあるいは移動させることで、前記干
    渉計システムによって生成された前記二つのコヒーレン
    ト光線間の前記光路差が前記細胞核の前記ピクセルのす
    べてに対して同時に走査され、 （ｖ）第一のスペクトル・キューブのデータを形成する
    ために、記録装置を用いて前記検出器要素の各々の信号
    を時間の関数として記録する、 （ｃ）数学的アルゴリズムを用いて前記第一のスペクト
    ル・キューブのデータを解釈するステップからなる蛍光
    DNAハイブリダイゼーションのための方法。
  2. 【請求項２】前記核酸プローブの前記ラベル付けが、組
    合せラベル付け及び組合せ交雑からなるグループから選
    択される戦略である請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記細胞核が、細胞分裂間期中の細胞核、
    有糸分裂中の細胞核及び減数分裂中の細胞核からなるグ
    ループから選択される請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記数学的アルゴリズムが、前記細胞核に
    おける前記ピクセルの各々の前記スペクトルのポイント
    演算分析である請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記数学的アルゴリズムが、前記ピクセル
    の各々の前記スペクトルに対して、少なくとも一つの基
    準スペクトルからのスペクトル差を計算する分類マッピ
    ング分析である請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記分類マッピング分析は、結果として、
    前記いくつかの基準スペクトルの一つからの所定最大ス
    ペクトル差を持つピクセルのグループから所定人工色で
    彩色される多色画像を生成する請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記数学的アルゴリズムが主成分分析であ
    る請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記数学的アルゴリズムが一次結合分析で
    ある請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記数学的アルゴリズムが、予め定められ
    た波長範囲を用いて赤、緑、青のカラー画像を計算する
    請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記数学的アルゴリズムが、前記ピクセ
    ルの前記スペクトルの各々に対して、二つの異なる波長
    における輝度間の比を計算する請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記方法が、胎性細胞のカラー核型を提
    供すること、白血球のカラー核型を提供すること、悪性
    細胞のカラー核型を提供すること、そして悪性かどうか
    を調べる細胞のカラー核型を提供することからなるグル
    ープから選択される用途のためにある請求項１に記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】前記方法が染色体異常を検出するための
    ものである請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記方法が悪性腫瘍の段階を検出するた
    めのものである請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記方法が抗癌性治療の効率を観察する
    ためのものである請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記染色体が従来の染色体バンディング
    染料で染色され、前記方法が前記染色体のグレー・スケ
    ールのバンディング画像を得ることからなる請求項１に
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記方法が比較ゲノム交雑のためのもの
    である請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】（ａ）ゲノム及び染色体を持つ第一の核
    種の細胞核を準備するステップ、前記染色体は、前記第
    一の核種の前記ゲノムの少なくとも一部分をカバーする
    染色体分裂片の少なくとも一つのグループで交雑され、
    染色体分裂片の前記少なくとも一つのグループの各々
    は、少なくとも一つの発蛍光団でラベル付けされてい
    る、 （ｂ）前記細胞核を蛍光顕微鏡を介して視検するステッ
    プ、この蛍光顕微鏡は結像分光計に光学的に結合されて
    おり、前記蛍光顕微鏡及び前記結像分光計は、前記細胞
    核の各ピクセルのスペクトルを得るためのものであり、
    前記細胞核の各ピクセルの前記スペクトルを次のように
    して得る、 （ｉ）コリメーター光学系を用いて前記細胞核のすべて
    のピクセルから同時に入射光を集め、 （ii）この平行入射光を複数の要素を持つ干渉計システ
    ムを介して通過させることで、まず前記光が二つのコヒ
    ーレント光線へ分割され前記干渉計内の各々異なる方向
    へ移動してから、前記二つのコヒーレント光線が再び結
    合し互いに干渉し射出光線を形成し、 （iii）検出器要素の二次元アレイを持つ検出器上に前
    記射出光線を集束させる焦点調節光学系を介して前記射
    出光線を通過させることで、測定の全持続時間に渡る各
    瞬間において、前記検出器要素の各々が前記細胞核の一
    つの常に同じピクセルの画像をもたらし、前記細胞核の
    実像は検出アレイの平面上に動かず、測定中のいかなる
    時においても前記画像は明確に認識可能であり、前記検
    出器要素の各々は、異なる波長で前記ピクセルによって
    発光される光輝度の特定の一次結合である信号を生成す
    るが、この一次結合は瞬間的な光路差の関数であり、 （iv）前記干渉計システムの前記要素の一つあるいはい
    くつかを回転させるあるいは移動させることで、前記干
    渉計システムによって生成された前記二つのコヒーレン
    ト光線間の前記光路差が前記細胞核の前記ピクセルのす
    べてに対して同時に走査され、 （ｖ）第一のスペクトル・キューブのデータを形成する
    ために、記録装置を用いて前記検出器要素の各々の信号
    を時間の関数として記録する、 （ｃ）数学的アルゴリズムを用いて前記第一のスペクト
    ル・キューブのデータを解釈するステップからなる交雑
    に基づく染色体多色バンディングのための方法。
  18. 【請求項１８】（ａ）第一の核種の分裂中期の染色体ス
    プレッドと第二の核種の染色体ペイントとを準備するス
    テップ、前記染色体ペイントの少なくともいくつかは、
    異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付け
    される、 （ｂ）前記染色体ペイントを前記分裂中期の染色体スプ
    レッドで交雑するステップ、 （ｃ）前記染色体スプレッドからのスペクトル・データ
    を収集するために、多バンドの収集装置に光学的に結合
    された蛍光顕微鏡を用いるステップ、そして （ｄ）前記収集データに基づき、前記異なる発蛍光団あ
    るいは発蛍光団の組合せの各々に関連するピクセルが特
    有な色で分類されることによって、前記分裂中期の染色
    体スプレッドのバンディングされたカラー画像が得られ
    るカラー画像を計算するステップからなる交雑に音づく
    染色体多色バンディングのための方法。
  19. 【請求項１９】前記染色体ペイントが、組合せラベル付
    け及び組合せ交雑からなるグループから選択される戦略
    を用いてラベル付けされる請求項18に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記第一及び第二の核種が、各々、独立
    して、ヒト、ネズミ及びサルからなるグループから選択
    される請求項18に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記方法が、胎性細胞のカラー・バンデ
    ィング核型を提供すること、白血球のカラー・バンディ
    ング核型を提供すること、悪性細胞のカラー・バンディ
    ング核型を提供すること、そして悪性かどうかを調べる
    細胞のカラー・バンディング核型を提供することからな
    るグループから選択される用途のためにある請求項18に
    記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記方法が染色体異常を検出するための
    ものである請求項18に記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記方法が悪性腫瘍の段階を検出するた
    めのものである請求項18に記載の方法。
  24. 【請求項２４】前記方法が抗癌性治療の効率を観察する
    ためのものである請求項18に記載の方法。
  25. 【請求項２５】前記分裂中期の染色体スプレッドが従来
    の染色体バンディング染料で染色され、前記方法が前記
    染色体のグレースケールのバンディング画像を得るステ
    ップからなる請求項18に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記多バンドの収集装置が結像分光計で
    ある請求項18に記載の方法。
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