JPH11503239A

JPH11503239A - スペクトル生体結像方法および蛍光ｄｎａハイブリダイゼーション方法

Info

Publication number: JPH11503239A
Application number: JP9522950A
Authority: JP
Inventors: ガリニユバル; カビブダリオ; エーバックワルドロバート; ジーソエンクセンダーク; カチールニル; ワインデービッド; ラビモーシェ
Original assignee: アプライドスペクトラルイメージングリミテッド
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-12-10
Publication date: 1999-03-23
Anticipated expiration: 2016-12-10
Also published as: DE69629374T2; DE69629374D1; IL121425A; IL121425A0; EP0832417A4; EP0832417B1; US5936731A; WO1997022848A1; US6055325A; EP1367384A1; EP0832417A1; JP3474579B2

Abstract

(57)【要約】各々が異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされた多数の染色体ペイント（図９）及び／あるいは遺伝子座特定プローブを用いた蛍光 DNAハイブリダイゼーションを検出し分析するスペクトル結像方法（図５）。この方法は、立体解像度及びスペクトル解像度（図６）が共に高感度であり、発蛍光団あるいは発蛍光団（図７）の組合せを多数同時に検出可能である。本発明の方法は、人間等の核種（図１０）からの蛍光彩色された完全なセットの染色体及び／あるいは多数の遺伝子座を検出するために用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】スペクトル生体結像方法および蛍光ＤＮＡハイブリダイゼーション方法発明の分野及び背景本発明は、一般に、多数の発蛍光団を同時に検出するための方法に関する。本発明は、特に、各々が異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされた多数の染色体ペイント及び／あるいは遺伝子座特定プローブを用いて、蛍光 DNA ハイブリダイゼーションを検出し分析することを目的とするスペクトル結像方法に関する。この方法は、立体解像度及びスペクトル解像度が高感度であり、多数の発蛍光団及び／あるいは発蛍光団の組合せを同時に検出することが可能である。このため、本発明の方法は、人間等の生物学的種から、蛍光彩色された染色体の全セット及び／あるいは多数の遺伝子座を検出するために用いられ、完全なカラー核型を提供することができる。分光計は、光を受け入れ、構成波長に分離（分散）し、波長の関数としての光の輝度であるところの光のスペクトルを測定するようにデザインされた装置である。結像分光計は、情景からの入射光を集め、各ピクセル（すなわち、画素）のスペクトルを測定するものの一つである。分光分析法は、化学物質構成要素のスペクトルの特徴に基づいて、材料や処理を特徴づけるために科学及び産業において何十年間もに渡って用いられている既知の分析用の手法である。分光分析法の物理的基礎は光と物質との相互作用にある。もともと、分光分析法は、波長の関数として、試料から発せられ、送られ、散乱せられ、あるいは反射される光の輝度を高スペクトル解像度で測定するものであり、立体的な情報は全く得られない。一方、高解像度分光分析法及び高解像度結像の組合せであるスペクトル結像（すなわち、立体的な情報）は、生物学の試料分析には未だ用いられていない。これまでのところ最も近いものとしては、生物学的試料から高解像度の立体的な情報を得ることに関するものがあるが、例えば、高解像度立体結像が一つあるいはいくつかの異なる帯域フィルターで行われるとき、これは、僅かに限られたスペクトル情報を提供するものであり（「SPIE 会報−生体結像及び二次元的分光分析法」[Andersson-Engels et al．（1990）Proceedings of SPIE - Bioimaging and Two-Dimensional Spectroscopy, 1205, pp．179-189]を参照）、また、高スペクトル解像度（例えば、全スペクトル）を得ることに関するものもあるが、立体解像において試料の小数の箇所に限定される、あるいは試料全体について平均化されるものである（例えば、アルファノ（Alfano）氏他の米国特許第 4,930,5 16 号を参照）。下記に詳しく述べられるが、分光分析法と結像とを結びつけることは、種々の生物学研究及び医学的応用に役立つものであり、スペクトル生体結像として下記に言及される。スペクトル生体結像の有用性の一つの例としては、蛍光プローブによって判別した（すなわち、タグを付けた）後に特定の細胞構成要素（例えば、タンパク質、核酸連鎖等）を検出するものがある。この用途においては、一回の測定でいくつかの発蛍光団を同時に識別して図に表わすためにスペクトル結像が用いられる。事実、本発明のスペクトル結像特有の高いスペクトル解像度は、スペクトルが重なる蛍光プローブ（あるいは他の化学物質構成要素）の分類に理想的である。概念的に、スペクトル生体結像システムは、（１）測定システム及び（２）分析ソフトウェアから成る。この測定システムには、全ての光学機器、エレクトロニクス、また、その測定から所望の結果を抽出するに最適な試料照射（例えば、光源選択）、測定モード（例えば、蛍光）及び較正の方法が含まれる。分析ソフトウェアには、有意義な方法で重要な結果を分析し表示するために必要な全てのソフトウェア及び数学的アルゴリズムが含まれる。スペクトル結像は、地球及び他の惑星についての研究において、スペクトル吸収特質を識別することによって重要な洞察を得るために遠隔測定の分野で何十年間も用いられている。しかし、遠隔測定スペクトル結像システム（例えば、ランドサット、AVIRIS）は、高いコスト、大きさ及び構成のため、大気中での使用及び人工衛星による使用に限定されている。（「SPIE 会報−遠隔測定のためのセンサ、放射測定及びデータ処理における最近の進歩」[Maymon and Neeck（1988 ）Recent Advances in Sensors，Radiometry and Data Processing for Remote Sensing，924，pp．10-22; Dozier（1988）Proceedings of SPIE - Recent Adva nces in Sensors，Radiometry and Data Processing for Remote Sensing，924 ，pp．23-30]を参照）スペクトル生体結像システムに関して考慮すべき基本的な３種類のスペクトル分散方法がある。（ｉ）スペクトル格子、（ｉｉ）スペクトル・フィルター及び（iii）干渉分光分析法。下記に説明されるが、干渉分光分析法が本発明の方法を実行するに最適である。スリット・タイプ結像分光計としても知られる、回折格子（すなわち、モノクロメータ）に基礎を置くシステム、例えば DILOR システム等（「ヨーロッパ医学的光学週報、SPIE 会議での発表」［Valisa et al．（Sep．1995）presentati on at the SPIE Conference European Medical Optics Week，BiOS Europe’95 ，Barcelona，Spain］を参照）においては、CCD（電荷結合素子）配列検出器の僅かに一つの軸（空間軸）が実像データを提供し、第二の（スペクトル）軸が、波長の関数として、格子によって分散される光の輝度を測るために用いられる。このシステムは、また、第一の焦点面にスリットを有し、一時点での視野を１ラインのピクセルに制限している。したがって、文献でライン走査として知られる方法で CCD のスペクトル軸に平行な方向に格子あるいは入射光線を走査した後にのみ全画像が得られる。測定全体が完了するまで二次元画像を視覚化できないことは、測定を行う前に、視野内における所望の領域を選択すること及び／あるいはシステムの焦点及び露出時間等を最適化することを不可能にする。地面上を航行する飛行機（あるいは人工衛星）は、システムに自然発生的なライン走査メカニズムを提供するため、格子に基づくスペクトル映像装置が遠隔測定の用途に用いられている。さらに、一つのフレームのピクセルの大部分は、計測器の前段光学素子によって実際に入射光が同時に集められるけれども、いかなる時点においても測定されていないため、スリット・タイプ結像分光計には大きな欠点があることに注意すべきである。その結果は、ある一定のＳＮ比で必要な情報を得るためには比較的大きな測定時間が要求されるか、あるいはある測定時間に対してＳＮ比（感度）はかなり減らされるかのどちらかである。さらに、スリット・タイプのスペクトル映像装置は、情景全体に対する必要な情報を集めるのにライン走査を必要とするため、得られた結果には誤差が含まれる。フィルターに基づくスペクトル分散方法は、さらに、分離フィルター及びチューナブルフィルターに分類される。これらのタイプの結像分光計では、スペクトル画像は、光路に連続的に狭帯域フィルターを差し込むことによって、あるいは超音波光学チューナブルフィルター（AOTF）あるいは液晶チューナブルフィルター（LCTF）を用いて電子的に周波数帯を走査することによって、情景のすべてのピクセルに対する光を同時に異なる波長で一度にろ過することによって構築される。下記を参照。上記に説明された格子が備えられたスリット・タイプ結像分光計と同様に、フィルターに基づくスペクトル分散方法が用いられる場合は、光の大部分は、いつも拒絶されている。事実、特定波長での画像全体の測定は、測定される瞬間波長外のすべての光子は阻まれ CCD に到達しないゆえに可能である。干渉分光分析法がフィルター及び格子による方法に勝る感度をもつことの利点は、この技術において、マルチプレックスあるいはフェルゲット（Fe11gett）利点として知られている。 AOTFs 及び LCTFs 等のチューナブルフィルターは、可動部品がなく、用いられる装置のスペクトル範囲における特定の波長に調整可能である。チューナブルフィルターをスペクトル結像のための分散方法として用いる一つの利点は、任意の波長アクセス、すなわち、いかなる所望の順序においても、フィルター・ホイールを用いることなく複数の波長において画像の輝度が測れる能力にある。しかし、AOTFs 及び LCTFs には次の不利な点がある。（ｉ）制限されたスペクトル範囲（通常、λmax ＝２λmin）、このスペクトル範囲外の他の光全てが遮られなければならない、（ｉｉ）感温性、（iii）低い透過度、（ｉｖ）感偏光性及び（ｖ）AOTFs の場合、波長走査中に画像がずれる影響。すべてのタイプのフィルター及びチューナブルフィルターに基づくシステムは、スペクトル解像度の制限、低い感度、そしてデータを解釈し表示するための使用が容易で精巧なソフトウェア・アルゴリズムがないという理由で、何年もの間いかなる用途に対してもスペクトル結像に、うまく広範囲に利用されてはいない。上記の点で有利な、画像のスペクトル分析のための方法及び装置は、1995 年２月２１日に出願されたカビブ（Cabib）氏他の米国特許出願第 08/392,019 号、現在の 1996 年７月２３日に発行された米国特許第 5,539,5 17 号に開示されている。その内容は、従来のスリットあるいはフィルター・タイプの結像分光計と比較し、必要フレーム時間をかなり減少させＳＮ比をかなり増し、ライン走査を必要とせずに、画像の、集められた入射光から利用可能なすべての情報を利用する画像スペクトル分析の方法及び装置を提供するという目的において、参照として、ここに完全に明らかにされたものとして含まれる。本発明によれば、情景からの入射光を集めることによって情景の各ピクセルのスペクトル輝度を測る、情景の光学的イメージを分析する方法が提供される。これは、各ピクセルから発散される光のスペクトル輝度の一次結合の所定セットに対応する被変調光を出力する干渉計を介して光を通過させ、検出アレイ上に干渉計から出力された光を集束させ、全てのピクセルに対して独立且つ同時に干渉計内に生成される光路差（OPD）を走査し、その各ピクセルのスペクトル輝度を測るために検出アレイの出力を処理する（個別にすべてのピクセルの干渉写真を作る）ものである。この方法は、全干渉計、干渉計内の要素、あるいは入ってくる光の入射角を移動することによって干渉写真を作るためにOPD が変えられる種々のタイプの干渉計を利用することによって実践される。これら全てのケースにおいては、スキャナーが干渉計の一走査を完了すると、情景すべてのピクセルに対する干渉写真が完成する。上記の特徴をもつ装置は、上記に説明されたように干渉計を利用する点で、従来のスリット及びフィルター・タイプの結像分光計とは異なるため、集められるエネルギーがアパーチャあるいはスリットで制限されることはなく、また、入ってくる波長が狭帯域の干渉あるいはチューナブルフィルターで制限されることもなく、システムの処理能力はかなり増す。したがって、干渉計に基づく装置は、分析されるべき情景の入射光から利用可能なすべての情報を利用するものであり、これによって、測定時間をかなり減少させＳＮ比（すなわち、感度）をかなり増やす。例えば、「地球及び惑星の遠隔測定のための結像分光計」［John B．Wellman（1987）Imaging Spectrometers for Terrestrial and Planetary R emote Sensing, SPIE Proceedings，Vol．750，p．140］に説明された「ほうき」デザインを考察してみる。ｎを直線アレー内における検出器の数、ｍｘｍをフレーム内におけるピクセル数及びＴをフレーム時間とする。アレーのすべての検出器について合計される、一つのフレーム内の各ピクセルに使われる合計時間は、ｎＴ／ｍ²である。米国特許出願第 08/392,019 号に説明された発明の方法において同じサイズのアレー及び同じフレーム・レートを用いると、ある特定のピクセル上のすべての検出器について合計された合計時間は同じｎＴ／ｍ²である。しかし、従来の格子による方法においては、波長解像度がその範囲の１／ｎであるため、いつも各検出器に検出されるエネルギーは合計の１／ｎ程度であるのに対して、米国特許出願第 08/392,019 号に説明された発明の方法においては、変調関数は、大きな OPD 範囲の平均が５０％の（例えば、ファブリ -ペロがある低フィネス・エアリー関数等のシヌソイド（マイケルソン）あるいは類似の周期関数）振動関数であるため、エネルギーは単一性のあるものである。干渉法のテキスト（例えば、「干渉分光分析法の原理」［Chamberlain（1979）The princ iples of interferometric spectroscopy, John Wiley and Sons，pp．16-18 an d p．263］を参照）に述べられているフェルゲット利点（あるいはマルチプレックス利点）の基準処置に基づけば、本発明による装置の測定ＳＮ比が、ノイズ制限の場合には、ノイズ・レベルが信号から独立した状態で（システムあるいは背景のノイズが制限された状況）ｎ０．５の因子によって、また、その制限が信号光子ノイズによる場合には、狭いピークの波長の、スペクトル範囲内の、ある特定の波長にある信号の平均信号への比の平方根によって改善されることを示すことが可能である。したがって、米国特許出願第 08/392,019 号に説明された発明によれば、すべての必要な OPDs は、スペクトルを再構築するのに必要なすべての情報を得るために、情景のすべてのピクセルに対して同時に走査される。このため、スペクトル情報は結像情報と同時に集められる。本発明は、遠隔測定のための望遠鏡、実験室での分析のための顕微鏡、工場監視及び医学用画像診断や治療、その他のファイバー・オプティックス等、多くの異なる光学的構成に用いられ得る。継続出願（参照として含まれる、カビブ（Cabib）氏他の 1995 年１２月１２日に出願された米国特許出願第 08/571,047 号）においては、その目的は、生物学的研究、医学的診断及び治療のためのスペクトル結像方法を提供することであった。この方法は、高い立体的なスペクトル解像度で、立体的組織（すなわち、分布）を検出するために、また、細胞及び組織の元来の構成要素、構造、小器官、そしてタグを付けるプローブ（例えば、蛍光プローブ）や光の伝達、反射、散乱及び蛍光放射を行うのに用いる薬等の投与された構成要素を数量化するために用いられる。米国特許出願第 08/571,047 号には、DNA ハイブリダイゼーションにおける六つの遺伝子座特定プローブ（各遺伝子座は異なる染色体上に位置する）による細胞分裂間期の蛍光において、米国特許出願第 08/392,019 号に述べられたスペクトル結像装置を使用することが、他の生物学的及び医学的用途と共に述べられている。スペクトル生体結像システムは、潜在的に、画像内の立体的分布及び構成を調べようとする化学物質構成要素間に微妙なスペクトル差が存在するすべての用途に有用である。測定は、全く、米国特許出願第 08/392,019 号に説明されたシステムに付けられたいかなる光学系を用いても実行可能である。例えば、投与された蛍光発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せと併せて蛍光顕微鏡を用いてもよい。蛍光測定は、発光スペクトルがシステム感度のスペクトル範囲内にあるという条件の下で、特殊な用途に対して、（障壁フィルター、励起フィルター及び二色性ミラーからなる）いかなる基準フィルター・キューブ、カスタマイズされたいかなるフィルター・キューブあるいはフィルター・キューブの組合せで行ってもよい。ヒューマン・ゲノム・プロジェクト（Human Genome Project: HGP）の主要な利益の一つは、病んだ遺伝子や他の染色体領域及び構造に対する多数の核酸プローブの分離がある。このことは、ＤＮＡ診断に対する興味を刺激した。これは、開発される試験の数及び種類がこれらのプローブに依存しているためである。近年は、蛍光 DNA ハイブリダイゼーション（FISH）に対する興味が盛んである。この蛍光ハイブリダイゼーションは、調べられる染色体領域を補足する特定の核酸分子に共役反応された蛍光部分（本文中プローブと呼ぶ）でマークし、続いて蛍光顕微鏡検査法によって蛍光部分を視覚化する処理である。基礎科学研究所での従来の用途と共に、医療現場で FISH 技術を用いる明らかな傾向がある。FISH は細胞遺伝学への高度なアプローチであると見られる。FIS H から得られる染色体についての情報量は、ＤＮＡバンディング法による基準核型から得られる情報量を遥かに上回ることは明らかである。さらに、典型的な（分裂中期）細胞遺伝学と比較すると、細胞分裂間期細胞遺伝学等の技術を用いることによって診断情報がより速やかに得られる。本発明によれば、蛍光顕微鏡の視野内のすべてのピクセルから同時に蛍光スペクトルを獲得可能な、また、一回の測定で多数のプローブの位置を同時に検出可能な FISH 結像方法が提供される。染色体特性プローブ（すなわち、染色体ペイント）及び奇抜なラベル付け戦略を用いることによって、この方法は、各染色体が異なる色（すなわち、人間の男性の核型のために異なる２４色、女性のために２３色）で彩色された状態での FISH 核型を生成することが可能である。この方法は、非常に高い試料処理能力をもたらし、本質的に無制限のプローブ数の分析を可能にする。したがって、人間等の種からの、蛍光彩色された染色体の完全なセット及び／あるいは多数の遺伝子座を検出するために、多数の染色体ペイント及び／あるいは各々が異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされた遺伝子座特定プローブを用いて、蛍光 DNA ハイブリダイゼーションを検出し分析するスペクトル結像方法に対する広い必要性が認められるため、この方法を獲得することは非常に有利である。本発明の概要本発明によれば、各々が異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされた多数の染色体ペイント及び／あるいは遺伝子座特定プローブを用いる蛍光 DNA ハイブリダイゼーションを検出し分析することを目的とするスペクトル結像方法が提供される。この方法は、立体解像度及びスペクトル解像度が高感度であり、多数の発蛍光団及び／あるいは発蛍光団の組合せを同時検出可能であるため、人間等の核種からの染色体が蛍光彩色された完全なセット及び／あるいは多数の遺伝子座の検出及びカラー核型の提供のために用いられる。さらに、下記に説明される本発明の実施例における特徴によれば、この方法は、（ａ）スペクトル的に映像化される試料を準備するステップ、（ｂ）結像分光計に光学的に繋がれた光学装置を通して試料を視検するステップ及び（ｃ）記録された第一のスペクトル・キューブのデータを数学的アルゴリズムを用いて解釈するステップからなる。なお、光学装置及び結像分光計は、次のプロセスによって、試料の各ピクセルのスペクトルを測定するためのものである。（ｉ）コリメーター光学系を用いて試料のすべてのピクセルから同時に入射光を集め、（ｉｉ）この平行入射光を複数の要素を持つ干渉計システムを介して通過させることで、まず光を二つのコヒーレント光線へ分割させ、干渉計内の各々異なる方向へ導き、その後にこれら二つのコヒーレント光線を再び結合させて互いに干渉させ射出光線を形成し、（iii）検出器要素の二次元アレイを持つ検出器上にこの射出光線を集束させる焦点調節光学系を介して射出光線を通過させることで、測定の全持続時間に渡る各瞬間において、検出器要素の各々が試料の一つの常に同じピクセルの画像をもたらすため、試料の実像は検出アレイの平面上に動かず、測定中のいかなる時においても、画像は明確に認識可能であり、検出器要素の各々は、異なる波長でピクセルによって発光された光輝度の特定の一次結合である信号を生成し、なお、この一次結合は瞬間的な光路差の関数であり、（ｉｖ）干渉計システムの要素の一つあるいはいくつかを回転させる、あるいは移動させる（すなわち、走査）ことで、干渉計システムによって生成された二つのコヒーレント光線間の光路差が試料のピクセルのすべてに対して同時に走査され、（ｖ）第一のスペクトル・キューブのデータを形成するために、記録装置を用いて検出器要素の各々の信号を時間の関数として記録する。さらに、下記の好適実施例によれば、この方法は、（ｄ）解釈されたスペクトル・キューブのデータをマップし表示するステップからなる。さらに、下記の好適実施例によれば、光学装置は蛍光顕微鏡である。さらに、下記の好適実施例によれば、平行光は、試料から発光される蛍光である。さらに、下記の好適実施例によれば、試料から発光された平行光は、投与されたプローブ蛍光である。さらに、下記の好適実施例によれば、光は、レーザー、白色光、フィルターを介した光、紫外光及び小さな波長範囲を持つ光等の光源から生じる。さらに、下記の好適実施例によれば、光は多数の光源から生じ、これら光源は同時にあるいは連続的に作動する。さらに、下記の好適実施例によれば、二次元アレイは、ビデオ・レート CCD、冷却高ダイナミック・レンジ CCD、増感 CCD 及び時間ゲート増感 CCD からなるグループから選択される。さらに、下記の好適実施例によれば、試料は、分裂間期の細胞、有糸分裂中の細胞及び減数分裂中の細胞である。さらに、下記の好適実施例によれば、細胞は人間からのものである。さらに、下記の好適実施例によれば、細胞は、がん細胞、血液細胞、胎児の細胞あるいは悪性腫瘍の細胞である。さらに、下記の好適実施例によれば、試料は細胞であり、光はプローブによって誘発され、このプローブは特定の細胞構成要素に結びつき、この方法は、細胞構成要素の存在あるいはレベルを検出するためにある。さらに、下記の好適実施例によれば、プローブは共役蛍光部分を含み、誘発はこの蛍光部分の蛍光発光である。さらに、下記の好適実施例によれば、プローブがさらに核酸分子を含み、方法は、細胞における、この核酸分子と交雑する核酸の存在あるいはレベルを検出するためにある。さらに、下記の好適実施例によれば、細胞の核酸は、デオキシリボ核酸及びリボ核酸である。さらに、下記の好適実施例によれば、蛍光部分は、スペクトラム・オレンジ、スペクトラム・グリーン、アクア、テキサス・レッド、FITC、ローダミン、フルオレセイン、カスケード・ブルー及びそれらの組合せである。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは、試料におけるピクセルの各々のスペクトルのポイント演算分析である。さらに、下記の好適実施例によれば、ポイント演算分析は、試料におけるピクセルの各々のスペクトルを、変換関数に従ってスカラーへマップすることを含む。さらに、下記の好適実施例によれば、ポイント演算分析は、試料におけるピクセルの各々のスペクトルを、変換関数に従ってもう一つのスペクトルヘマップすることを含む。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムが形態学的分析である。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは、試料におけるピクセルの各々に対して、基準スペクトルからのスペクトル差を計算する相似性マッピング分析である。さらに、下記の好適実施例によれば、相似性マッピング分析は、明るいピクセルが小さなスペクトル差に対応し暗いピクセルが大きなスペクトル差に対応するグレースケール画像あるいは擬似色画像を生成する。さらに、下記の好適実施例によれば、相似性マッピング分析は、明るいピクセルが大きなスペクトル差に対応し暗いピクセルが小さなスペクトル差に対応するグレースケールの画像あるいは擬似色画像を生成する。さらに、下記の好適実施例によれば、スペクトル差は、ピクセルの各々のスペクトルと基準スペクトルとの間の差の絶対値の、予め定められた波長範囲に対する不定積分として定義されたスカラーである。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは、ピクセルの各々のスペクトルに対して、複数の基準スペクトルからのスペクトル差を計算する分類マッピング分析である。さらに、下記の好適実施例によれば、分類マッピング分析は、複数の基準スペクトルの一つに対して所定最大スペクトル差を持つピクセルのグループが、所定の人工色で着色された多色画像を生成する。さらに、下記の好適実施例によれば、スペクトル差は、ピクセルの各々のスペクトルと複数の基準スペクトルの一つとの間の差の絶対値の、予め定められた波長範囲に対する不定積分として定義されるスカラーである。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムが主要構成要素を分析する。さらに、下記の好適実施例によれば、主要構成要素分析は、（ａ）多数の波長が用いられたときには励起源の波長を含めて、全てのピクセル及び測定の波長に対する共変マトリクスを構築すること、（ｂ）共変マトリクスを対角化し、独立直交スペクトル基底要素のすべてを見いだすこと、（ｃ）基底要素のいずれが試料の特定の特徴にタグをつけるかを見いだすことを含む。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムが一次結合分析である。さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析は、第一のスペクトル・キューブのデータ及び第二のスペクトル・キューブのデータに属する対応する対のピクセルの対応する波長の間に算術関数を適用し、その結果として第三のスペクトル・キューブのデータを得ることを含む。さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析は、二つのスペクトル・キューブのデータの平均化、時間変化のフォローアップ及びスペクトルの正規化等の目的を満たす。さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析は、算術関数によって、ピクセルの各々のスペクトルの各波長に任意のスカラーを適用することを含み、この関数は、加法、減法、乗法、除法及びそれらの組合せである。さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析は、試料の背景領域に位置するピクセルのスペクトルが、試料のピクセルのスペクトルから引き算される背景除去を行うものである。さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析は較正方法のためにあり、この較正方法においては、試料を視検する以前に測定されたスペクトルが、試料のピクセルのスペクトルを割るために用いられる。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムが光学密度分析である。さらに、下記の好適実施例によれば、光学密度分析は、解釈された光学密度マップの画像を得るためにある。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは、予め定められた波長範囲を用いて、赤、緑、青のカラー画像を計算する。さらに、下記の好適実施例によれば、赤、緑、青のカラー画像がコントラスト延伸アルゴリズムによって修正される。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは、ピクセルのスペクトルの各々について二つの異なる波長における輝度間の比を計算する。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは、ビクセルのスペクトルの各々について二つの異なる波長における輝度間の比を計算し、この計算された比に従ってピクセルの各々を、より明るいあるいはより暗い人工色で彩色する。さらに、下記の好適実施例によれば、方法は、試料へ投与された多数の発蛍光団のスペクトルを識別するためにある。さらに、下記に説明される好適実施例によれば、この方法は、蛍光 DNA ハイブリダイゼーションであって、次のステップからなる。（ａ）少なくとも一つの核酸プローブで交雑された染色体を持つ細胞核を提供するステップ、なお、この少なくとも一つの核酸プローブの各々は、少なくとも一つの核酸分子を含み、この少なくとも一つの核酸分子の各々は、少なくとも一つの発蛍光団でラベル付けされるものであり、（ｂ）蛍光顕微鏡を介して細胞核を視検するステップ、なお、この蛍光顕微鏡は、結像分光計に光学的に繋がれており、これら蛍光顕微鏡及び結像分光計は、細胞核の各ピクセルのスペクトルを得るためのものであり、（ｉ）コリメーター光学系を用いて細胞核のすべてのピクセルから同時に入射光を集め、（ｉｉ）複数の要素を持つ干渉計システムを介して平行入射光を通すことによって、光をまず二つのコヒーレント光線に分け、干渉計内の各々異なる方向へ導いた後に二つのコヒーレント光線を再び結合させて各々を他と干渉させ射出光線を形成し、（iii）検出器要素の二次元アレイを持つ検出器にこの射出光線を集束させる焦点調節光学系を介して射出光線を通過させることによって、測定の全持続時間に渡る各瞬間において、検出器要素の各々が細胞核の常に同一ピクセルの画像をもたらすため、細胞核の実像は検出アレイの平面上にあって動かず、測定中のどの時間においても画像は明確に識別可能であり、また、検出器要素の各々は、異なる波長でピクセルによって発光される光輝度の特定の一次結合である信号を生成するが、この一次結合は瞬間的な光路差の関数であり、（ｉｖ）干渉計システムの要素の一つあるいはいくつかを回転あるいは移動する（すなわち、走査する）ことによって、細胞核のすべてのピクセルに対して干渉計システムによって生成された二つのコヒーレント光線の間の光路差が同時に走査され、（ｖ）第一のスペクトル・キューブのデータを形成するために記録装置を用いて、検出器要素の各々の信号を時間の関数として記録することによって、細胞核の各ピクセルのスペクトルを得るためのものであり、（ｃ）記録された第一のスペクトル・キューブのデータを数学的アルゴリズムを用いて解釈するステップからなる。さらに、下記の好適実施例によれば、少なくとも一つの核酸分子は、少なくとも一つの遺伝子座、少なくとも染色体の一つの分裂片、インサートを含む少なくとも一つの酵母人工染色体、インサートを含む少なくとも一つのプラスミド、インサートを含む少なくとも一つのコスミド、インサートを含む少なくとも一つのファゲミド、インサートを含む少なくとも一つのウイルス・ベクター、一つの核種の完全なゲノム、がん組織の完全なゲノム及びそれらの組合せである。さらに、下記の好適実施例によれば、少なくとも一つの発蛍光団は、少なくとも一つの蛍光性組み合わせ染料である。さらに、下記の好適実施例によれば、細胞核は、分裂間期中の細胞核、有糸分裂中の細胞核及び減数分裂中の細胞核である。さらに、下記の好適実施例によれば、核酸プローブの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４あるいは２４より大きな数であり、プローブの各々は、異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の異なる組合せを含む。さらに、下記の好適実施例によれば、染色体が、細胞分裂間期の染色体、有糸分裂中の染色体及び減数分裂中の染色体である。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムが、細胞核におけるピクセルの各々のスペクトルのポイント演算分析である。さらに、下記の好適実施例によれば、ポイント演算分析は、変換関数に従って、細胞核におけるピクセルの各々のスペクトルをスカラーへマップすることを含む。さらに、下記の好適実施例によれば、ポイント演算分析は、変換関数に従って、細胞核におけるピクセルの各々のスペクトルをもう一つのスペクトルへマップすることを含む。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは形態学的分析であり、形態学的分析は細胞核内の染色体の相対的な大きさを測定する。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは、ピクセルの各々のスペクトルについて少なくとも一つの基準スペクトルからのスペクトル差を計算する分類マッピング分析である。さらに、下記の好適実施例によれば、分類マッピング分析は、複数の基準スペクトルの一つからの所定最大スペクトル差を持つピクセルのグループが所定人工色で彩色される多色画像を生成する。さらに、下記の好適実施例によれば、スペクトル差は、ピクセルの各々のスペクトルと複数の基準スペクトルの一つとの間の差の絶対値の予め定められた波長範囲に対する不定積分として定義されるスカラーである。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムが主要構成要素分析である。さらに、下記の好適実施例によれば、主要構成要素分析は、（ａ）多数の波長が用いられるときは励起源の波長をも含めて、全てのピクセル及び測定の波長に対する共変マトリクスを形成すること、（ｂ）共変マトリクスを対角化し、独立直交スペクトル基底要素のすべてを見いだすこと、（ｃ）基底要素あるいはそれらの組合せのいずれが、細胞核における特定の特徴をタグするかを見いだすことを含む。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムが一次結合分析である。さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析がスペクトルの正規化のためにある。さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析は、算術関数によって、ピクセルの各々のスペクトルのすべての波長に任意のスカラーを適用することを含み、関数は、加法、減法、乗法、除法及びそれらの組合せである。さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析は、細胞核の背景領域に位置するピクセルのスペクトルが、細胞核のピクセルのスペクトルから引き算される背景除去のためにある。さらに、下記の好適実施例によれば、一次結合分析は、細胞核を視検する前に測定されたスペクトルが、細胞核のピクセルのスペクトルを割るためにある較正方法のためのものである。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは、予め定められた波長範囲を用いて、赤、緑、青のカラー画像を計算する。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは、ピクセルのスペクトルの各々について、異なる二つの波長における輝度の間の比を計算する。さらに、下記の好適実施例によれば、数学的アルゴリズムは、ピクセルのスペクトルの各々について、異なる二つの波長における輝度の間の比を計算し、この計算された比に従って、ピクセルの各々をより明るいあるいはより暗い人工色で彩色する。さらに、下記の好適実施例によれば、方法は、胎児の細胞のカラー核型、白血球のカラー核型、悪性細胞のカラー核型及び悪性腫瘍の検査が行われる細胞のカラー核型を提供すること等の用途のためにある。さらに、下記の好適実施例によれば、胎児の細胞は、妊娠女性の末梢血液から単離された絨毛膜絨毛細胞及び／あるいは胎児細胞である。さらに、下記の好適実施例によれば、方法は、人間の染色体２１、人間の染色体バンド２１ｑ２２、人間の染色体バンド２１ｑ２２の分裂片、人間の染色体１８、人間の染色体１８の分裂片、人間の染色体１３及び人間の染色体１３の分裂片の三染色体を検出するためにある。さらに、下記の好適実施例によれば、悪性腫瘍の検査が行われた細胞のカラー核型を提供することは、カラーの転座マップを得るためである。さらに、下記の好適実施例によれば、悪性細胞のカラー核型を提供することは、カラーの転座マップを得るためである。本発明は、スペクトル的に類似したしかし幾分異なる蛍光プローブの多数を同時に検出するのに十分な感度を持つ DNA ハイブリダイゼーションのための方法を提供することによって現時点で既知の構成の欠点を指摘する。ゆえに、本発明の方法は、各染色体対が、異なる RGB あるいは人工色に現われるカラー核型、多数の遺伝子座を同時にマップする遺伝子座マッピング、カラー核型作成と多数遺伝子座マッピングとの組合せ及び染色体異常に対する容易に利用可能な遺伝子検査を提供することが可能である。図面の簡単な説明本発明が、一例として、添付図面を参照してここに説明される。図１は従来のスリット・タイプ結像分光計（従来の技術）を示す。図２は、米国特許出願第 08/392,019 号（従来の技術）に従って構成された結像分光計の主な構成要素のブロック図である。図３は、静止型の干渉計、すなわち、米国特許出願第 08/392,019 号（従来の技術）による結像分光計に用いられたサニャック干渉計を示す。図４は、選択されたスペクトル範囲を強調するための疑似 RGB（赤、緑及び青）色の鮮明度を示す。各疑似色の輝度は、一つの曲線に掛け合わせた後に曲線下の面積を積分することによって計算される。図５ａ、５ｂ及び５ｃは、テキサス・レッド及びローダミンに付けた二つの異なるプローブで行われた細胞分裂間期の FISH を示し、（ａ）は顕微鏡から見えるオリジナル画像である。（ｂ）は、本発明の方法によって測定され処理された後の同じ試料である。（ｃ）は、テキサス・レッド及びローダミン発蛍光団の蛍光スペクトルである。図６ａ、６ｂ及び６ｃは、異なる発蛍光団で各々がラベル付けされた六つの異なるプローブを用いて行われた細胞分裂間期の FISH を示す。（ａ）は顕微鏡から見えるオリジナル画像である。細胞は DAPI で対比染色された。（ｂ）は、本発明の方法によって測定され処理された後の同じ試料である。（ｃ）は、六つの発蛍光団の蛍光スペクトルである。図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ及び７ｅは、まとめて、図８ａ及び９ａの画像の２４ピクセルについて２４の正規化されたスペクトルを示す。２４の各々は、人間の異なる染色体から得られたものである（１−２２、Ｘ及びＹ）。染色体の各々は、下記表３及び４に詳述される異なる染色体ペイントを用いて塗られた。図８ａ及び８ｂは、本発明の方法によって、人間の男性の２４の染色体（１− ２２、Ｘ及びＹ）から得られた（白黒の）RGB 画像及びカラー核型である。染色体の各々は、下記表３及び４に詳述される異なる染色体ペイントを用いて塗られた。図９ａ及び９ｂは、各々、図８ａ及び８ｂのカラー版である。図１０ａ及び１０ｂは、各々、女性の乳がん細胞染色体スプレッドについての、（白黒の）従来の蛍光顕微鏡で得られる DAPI Ｒバンディング写真と、図９ａ及び９ｂに示された染色体ペイント及び本発明の方法を用いて得られる RGB カラー核型である。図１１ａ及び１１ｂは、各々、図１０ａ及び１０ｂに対するオリジナルのさらにはっきりしたプレゼンテーション及びカラーのプレゼンテーションである。図１２は、各々、図１１ａ及び１１ｂに示された DAPI Ｒ−バンドと、図１１ｂから決定され図９ｂに示されたカラー核型を用いて解釈された転座した染色体の、解釈が施された輪郭とを比較するプレゼンテーションである。図１３は図１２のカラーのプレゼンテーションである。実施例の説明本発明は、各々が異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の組合せでラベル付けされた多数の染色体ペイント及び／あるいは遺伝子座特定プローブを用いて、蛍光 D NA ハイブリダイゼーションを検出し分析するためのスペクトル結像方法に関する。この方法は、立体解像度及びスペクトル解像度が高感度であり、多数の発蛍光団及び発蛍光団の組合せを同時に検出することが可能である。このため、本発明の方法は、人間等の種から、光彩色された染色体の全セット及び／あるいは多数の遺伝子座を検出するために用いられるため、カラー核型を提供することができる。図４から９に示された本発明をより良く理解するために、まず、図１に示される、検出器の二次元アレイを利用する従来のスリット・タイプ結像分光計の構造及び作動（すなわち、従来の技術）が参照される。したがって、図１に示された従来の技術のスリット・タイプ結像分光計は、４に概略的に示された情景から入射光を集め、視野を定めるためにスリット６によって占められた第一の焦点面に情景４からのかなり平行な光を集束するための、２に示される採光光学系を含む。スリット６から出る光は、コリメータ・レンズ８で一直線にされ、種々の波長を分離するためにスペクトル分散要素１０（例えば、回折格子）を介して通される。スペクトル分散要素１０からの出力は、第二の焦点面にある二次元検出アレイ１４上に集束レンズ１２によって集束される。検出アレイ１４の出力はシグナル・プロセッサ１６に送られる。図１の従来の技術の結像分光計に示された検出器１４の二次元アレイにおいては、システム（例えば、矢１３によって示されたライン走査のラスタ移動）の移動が一次元に沿った走査をもたらす。第二の次元に沿った走査は、システムの動きの方向に直角に向けられたスリット６によってもたらされる。したがって、スリット６は、アレイ１４内の各検出器が単一波長で１ピクセルからの入力のみを受けることを保証する。これは、各ピクセルのスペクトルを分離するために必要である。発明の背景のところで、また上記にも述べたように、図１に示された従来の技術の方法の欠点は、一つのフレームのピクセル全てからのエネルギーが実際に光学系によって同時に集められるけれども、どの時点においても、それらピクセルの大部分は測定されていないということにある。その結果、このようなスリットを必要としないシステムに比べて、必要とされるフレーム時間がかなり増し、ＳＮ比（感度）はかなり減少する。図２は、参照として含まれる 1995年２月２１日に出願されたカビブ（Cabib）氏他の米国特許出願第 08/392,019 号に開示された、改善された従来の結像分光計の主な構成要素を表すブロック図である。この結像分光計は、本発明の方法を実行するために最適に構成されている。したがって、図２の従来の結像分光計は、２０と符号が付いた採光光学系、ブロック２２で示された１次元スキャナー、ブロック２４で示された光路差（OPD）発生器あるいは干渉計、ブロック２６で示された一次元あるいは二次元検出アレイ及びブロック２８で示されたシグナル・プロセッサ及びディスプレイを含む。システム２０における重要な要素は、OPD 発生器あるいは干渉計２４であり、それは、分析される情景の各ピクセルから放射された光のスペクトル輝度の一次結合の所定セットに対応する被変調光を出力するものである。干渉計からの出力は検出アレイに集束される。したがって、すべての必要な光学的位相差は、スペクトルの再構築に必要なすべての情報を得るために、視野のすべてのピクセルに対して同時に走査される。情景内のすべてのピクセルのスペクトルは、結像情報と共に同時に集められるため、リアルタイムでの画像分析を可能にする。米国特許出願第 08/392,019 号による装置は多種多様の構成が可能である。特に、用いられる干渉計は、米国特許出願第 08/392,019 号の関連する図面に示されるように、他の鏡と組み合わせてもよい。したがって、米国特許出願第 08/392,019 号によれば、別タイプの干渉計を用いることも可能である。これらには、次のものが含まれる。（１）光を変調するために OPD が変えられる可動タイプ干渉計、すなわち、スキャン厚があるファブリーペロ干渉計、（２）採光光学系及びスキャナーから光線を受け二つの光路に光線を分けるビーム・スプリッタを含むマイケルソン型干渉計、（３）オプションとして他の光学的手段と結合されるサグナック干渉計（この干渉計内では、 OPD が、入ってくる光の入射角に応じて変化する）及び（４）米国特許出願に述べられた、四つの鏡とビーム・スプリッタがある干渉計。図３は、OPD が入射光の入射角に応じて変化する干渉計を利用して米国特許出願第 08/392,019 号に従って構成された結像分光計を示す。光軸に対して小さな角度で干渉計に入る光線は、この角度に対し直線的にかなり変化する OPD を生じる。図３の干渉計においては、すべてのピクセルの源３０からのすべての光は、採光光学系３１によって一直線にされた後、メカニカルスキャナー３２によって走査される。光は、ビーム・スプリッタ３３を介して第一の反射鏡３４へ、そして第二の反射鏡３５へ通される。この第二の反射鏡３５への光は、反射してビーム・スプリッタ３３そして集束レンズ３６を介して検出器３７（例えば、CCD）のアレイへ送られる。この光線は、ビーム・スプリッタ３３によって反射された光線に、次に第二の反射鏡３５によって反射された光線に、最後に第一の反射鏡３４によって反射された光線に干渉する。一回の走査の最後には、すべてのピクセルがすべての OPD を介して測定されてしまうため、情景の各ピクセルのスペクトルはフーリエ変換によって再構築されることが可能である。光軸に平行な光線は補正され、光軸に対して角度（θ）にある光線は、ビーム・スプリッタ３３の厚さ、屈折率及び角度の関数である O PD を生じる。小さな角度において OPD はθに比例する。適切な逆変換を適用することによって、また、注意深いブックキーピングを行うことによって、すべてのピクセルのスペクトルが計算される。図３の構成においては、角度β（図３ではβ ＝４５度）にあるビーム・スプリッタ上に入射する光線は、干渉計を OPD ＝０で通り抜けるが、一般の角度β −θで入射する光線は、次の式で与えられる OPD を生じる。 OPD(β,θ,t,n)＝t[(n²-sin²(β+θ))^0.5-(n²-sin²(β-θ))^0.5 +2sinβsinθ] （１）この式において、βはビーム・スプリッタ上への光線の入射角であり、θは、光軸からの光線の角距あるいは中央位置に対する干渉計の回転角度であり、ｔはビーム・スプリッタの厚みであり、ｎはビーム・スプリッタの屈折率である。方程式１から、中央位置に対する正及び負の両角度を走査することによって、すべてのピクセルに対する両面の干渉写真が得られることが明らかであり、このことは、位相誤差を消去するに助けとなり、フーリエ変換の計算により正確な結果が得られることになる。走査振幅は、達成可能な最大 OPD を決めるため、測定されたスペクトル解像度に影響を与える。角度ステップの大きさが OPD ステップを決定するが、OPD ステップは、逆に、システム感度の良い最も短い波長によって規定される。事実、試料採取の定理（「干渉分光分析法の原理」［Chambe rlain（1979）The principles of interferometric spectroscopy，John Wiley and Sons，pp．53-55］を参照）によれば、この OPD ステップは、システム感度の良い最も短い波長の半分よりも小さくなければならない。考慮すべきもう一つのパラメータは、マトリクスにおける検出器要素の限られた大きさである。集束光学素子を介して、この要素は、干渉計内に有限の OPD を生じ、干渉写真に直角関数を巻き込む効果がある。このことは、結果として、短い波長におけるシステム感度の減少を引き起こし、要素によって生じる OPD 以下の波長に対してはゼロに落ちてしまう。この理由のため、変調伝達関数（MT F）の条件が満足していることを保証しなくてはならない。すなわち、干渉計内に検出器要素によって生じる OPD は、この計測器の感度を満たす最短波長よりも小さくなくてはならない。したがって、米国特許出願第 08/392,019 号に開示された発明に従って構成された結像分光計は、ただ単に、視野内のすべてのピクセルから来る光の輝度のみを測るものではなく、予め定められた波長範囲内の各ピクセルのスペクトルをも測るものである。また、どの時点においても、視野内の各ピクセルによって発せられた光が全てより良く利用されるため、先に説明したように、フレーム時間をかなり減少し分光計の感度をかなり増加するものである。このような結像分光計は、種々のタイプの干渉計、採光光学系及び集束システムを含んでもよく、そのため、医学的診断及び治療や生物学の研究における用途、また、地質学や農業における調査等のための遠隔測定を含む多種多様な用途に用いられ得るものである。米国特許出願第 08/392,019 号に開示された発明による結像分光計は、イスラエル共和国にあるスペクトル診断社（Spectral Diagnostics Ltd.；Industrial Park，Migdal Haemek，Israel）によって開発されたもので、下記にスペクトラキューブ（SpectraCubeTM）として参照される。種々の光学的装置に光学的に接続されたスペクトラキューブ・システムが本発明の方法を実行するために用いられた。スペクトラキューブ・システムには、下記の表１にリストアップされた特徴がある。スペクトル画像の表示及び分析ａ．概要上記の説明の通り、スペクトル画像は、スペクトル情報を画像の立体的構成に結びつける、データの三次元アレイ（ｘ、ｙ、λ）である。ゆえに、スペクトル画像は、その次元数の理由でスペクトル・キューブと呼ばれる、データのセットであり、得るに難しい、場合によっては、得ることが不可能な特徴の抽出及び量の評価を可能にするものである。分光分析法及びデジタル画像分析は、巨大な量の文献によって著されている、共によく知られている分野である（例えば、「デジタル画像処理の基本」［ Jain（1989）Fundamentals of Digital Image Processing，Prentice-Hall Inte rnational］を参照）。次の論議は、主に、スペクトル情報と結像情報とを単一のデータ・セット、すなわち、スペクトル・キューブに結合することの利点に焦点を合わせる。スペクトル・キューブの一つの可能な分析方法としては、スペクトル・データと立体データとを個別に用いるやり方がある。すなわち、スペクトル・アルゴリズムをスペクトル・データに、また、二次元画像処理アルゴリズムを立体データに適用することである。スペクトル・アルゴリズムの例としては、アルゴリズムが基準スペクトルとすべてのピクセルのスペクトルとの間の類似性を計算し（すなわち、相似性マッピング）、各ピクセルにおける輝度が「相似性」の程度に比例するグレースケール（あるいは他のカラー）画像（すなわち、相似性マップ）とすることを考える。このグレースケール画像は、所望の特徴及びパラメータを引き出すために、画像処理及びコンピュータビジョン技術（例えば、画像の向上、パターン認識等）を用いることによってさらに分析可能である。換言すれば、相似性マッピングは、（予めライブラリに記憶された、またはその同じスペクトル画像あるいは他のスペクトル画像のピクセルに属する）基準スペクトルに対するスペクトル画像の各ピクセルのスペクトル差の絶対値の不定積分を計算し、グレースケールあるいは擬似色（白黒あるいはカラー）画像を表示することを伴う。この画像においては、明るいピクセルは小さなスペクトル差に対応し、黒いピクセルは大きなスペクトル差に対応する、あるいはその逆である。同様に、分類マッピングにおいても、基準スペクトルとしていくつかのスペクトルが採用されるが、相似性マッピングで述べられたと同じ計算が行われ、そのいくつかの基準スペクトルの一つに最も類似しているという分類に応じて、表示画像の各ピクセルは異なる所定の擬似色で彩色される。分離不可能な演算、すなわち、局所的なスペクトル情報と隣接するピクセル間の立体的相関関係とを共に含むアルゴリズムに基づくスペクトル画像アルゴリズムを適用することも可能である（これらのアルゴリズムの一つは、下記に述べられるように、分析の主要な要素である）。スペクトル・キューブ（すなわち、Ｉ（ｘ、ｙ、λ））等のすべての三次元（３Ｄ）データ構造を扱う場合に当然生ずる根本的なことの一つとして、有意義な方法でそのデータ構造を視覚化することが必要である。例えば共焦点顕微鏡によって得られた断層データ、Ｄ（ｘ、ｙ、ｚ）等の他のタイプの３Ｄデータは、一般に、三次元空間における異なる位置（ｘ、ｙ、ｚ）の輝度を各ポイントが表すが、それとは異なり、スペクトル画像は、同一二次元平面（すなわち、試料）の輝度を複数の異なる波長で表す画像シーケンスである。このため、データのスペクトル・キューブを捉える二つの直観的な方法としては、画像平面（立体データ）を観察するか、あるいは１ピクセルあるいはピクセルのセットの輝度を波長の関数として三次元の凹凸表示で観察するかのいずれかである。一般に、画像平面は、どの単一波長で測定された輝度をも表示するために、あるいは、すべての画像ピクセルにおける所望のスペクトル領域にスペクトル分析アルゴリズムを適用した後に結果として生じるグレースケール画像を表示するために用いられることが可能である。スペクトル軸は、一般に、どの所望のピクセルの近傍でも行える（例えば、スペクトルを平均する）若干の立体的な演算から結果として生じるスペクトルを示すために用いられる。例えば、スペクトル画像を、単純な単色カメラから得られるような画像に類似したグレースケール画像として、あるいは、重要な特徴を写像し強調表示するために一つあるいはいくつかの人工色を利用する多色画像として表示することが可能である。このようなカメラは、単に、CCD アレイのスペクトル範囲（例えば、４００ナノメートルから７６０ナノメートルに）上の光学的信号を統合するため、スペクトル軸に沿って次のように積分することによって、３Ｄスペクトル画像データベースから「同等」の単色 CCD カメラ画像を計算することが可能である。方程式２において、ｗ（λ）は、あるスペクトル範囲に適切に数学的重みがかけられたスペクトル画像の統合にすべてが基づいている種々のグレースケール画像を計算する場合に最大の柔軟性を提供する一般的な加重応答関数である。例えば、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）及び青（Ｂ）に対する三刺激値関数に各々対応する三つの異なる加重関数｛ｗｒ（λ）、ｗｇ（λ）、ｗｂ（λ）｝で方程式（２）を評価することによって、従来の RGB カラー画像を表示することが可能である。また、有意義な従来にない（疑似）カラー画像を表示することも可能である。図４はこの単純なアルゴリズムの能力を示す例である。｛ｗｒ、ｗｇ、ｗｂ｝が、目的の１スペクトル「内に」分配されたガウス関数となるように選べば、この場合に表示される擬似色画像は、単に、加重関数に対応するスペクトル領域内のデータだけを強調することになり、これら３領域におけるスペクトル差がより明確に検出されることを可能にする。ｂ．ポイント演算ポイント演算は、単一ピクセル（すなわち、一度に１ピクセルのみ）に実行されるものと定義される。例えば、グレースケール画像においては、ポイント演算は、所定の変換関数に従い各ピクセルの輝度をもう一つの異なる輝度へマップするもの（輝度関数）である。このタイプの変換の特別な場合としては、各ピクセルの輝度を定数で掛け算することである。ポイント演算の概念は、スペクトル画像にも拡張され得るものである。ここでは、各ピクセルはそれ自身の輝度関数（スペクトル）、すなわち、ｎ次元ベクトルＶ1（λ）、λ∈［λ１、λｎ］を有する。スペクトル画像に適用されるポイント演算は、変換関数に従い各ピクセルのスペクトルをスカラー（すなわち、輝度値）へマップするものと定義されることも可能である。ｖ₂＝g(Ｖ₁(λ))；λ∈［λ₁,λ_n］（３）方程式３によってグレースケール画像を作ることは、このタイプのポイント演算の例である。より一般的な場合には、ポイント演算は、変換関数によって各ピクセルのスペクトル（ベクトル）をもう一つの異なるベクトルへマップするものである。Ｖ₂(l)＝g(Ｖ₁(λ))；ｌ∈[1,N],λ∈[λ₁,λ_n] （４）ただし、Ｎ≧ｎこの場合、スペクトル画像はもう一つのスペクトル画像に変換される。さて、異なるスペクトル画像の対応するピクセル間での演算を含むようにポイント演算の定義を拡張する。このタイプのアルゴリズムの重要な例としては光学密度の分析がある。光学密度は、透過スペクトルよりも高いダイナミックレンジで分光分析されるオブジェクトの領域を強調表示しグラフで表すために用いられる。光学密度は、対数演算によって透過に関連づけられるため、常に正の関数である。光学密度と測定されたスペクトルとの間の関係は、ランベルト・ベールの法則によって与えられる。ここで、OD（λ）は、波長の関数としての光学密度であり、Ｉ（λ）は測定されたスペクトルであり、ＩＯ（λ）は測定された基準スペクトルであり、τ（λ）は試料のスペクトル透過率である。方程式５は、すべての波長に対し、すべてのピクセルについて計算される。ＩＯ（λ）は（１）ODが計算されるスペクトル・キューブ内のピクセル、（２）第二のキューブ内の対応するピクセル及び（３）ライブラリからのスペクトルから選択される。光学密度は、測定システムのスペクトル感度あるいは CCD 検出器の不均一性に依存しないことに注意すべきである。このアルゴリズムは、試料内の吸収体の吸収係数及び試料厚が既知であるなら、その吸収体の相対濃度を、ある場合には絶対濃度をマップするのに有用である。ここで用いられる用語「レベル」は、用語「量」、「相対量」、「相対濃度」及び「絶対濃度」としても用いられることに注意すべきである。他の例としては、種々の一次結合分析が含まれ、例えば、次のようなものがある。（１）新しいスペクトル・キューブをもたらすために、加法、減法、乗法、除法、それらの組合せ等の算術関数によって、任意のスペクトルをスペクトル画像内の各ピクセルのスペクトルに適用する。この場合、各ピクセルについて結果として生じるスペクトルは、第一のキューブの各スペクトルと選択されたスペクトルとの間の和、差、積、比あるいはこれらの組合せである。（２）上記に説明されたように、算術関数によって任意のスカラーをスペクトル画像の各ピクセルのスペクトルに適用する。このような一次結合は、例えば、背景削除のために用いられてもよく、この場合、背景領域に位置するピクセルのスペクトルが各ピクセルのスペクトルから引かれる。また、較正方法にも用いられてもよく、この場合、試料分析以前に測定されたスペクトルがスペクトル画像内の各ピクセルのスペクトルを割るために用いられる。もう一つの例としては、グレースケール画像として表示する比画像計算がある。このアルゴリズムは、スペクトル画像のすべてのピクセルに対して、二つの異なる波長における輝度の比を計算し、それに応じて、より明るい、あるいは暗い人工色で各ピクセルを彩色する。例えば、スペクトル的に敏感な物質の分配を示すために、高い比に対してはピクセルを明るく、低い比に対しては暗く（あるいはその正反対に）彩色する。ｃ．空間とスペクトル結合演算上記に述べられたスペクトル画像分析方法においては、アルゴリズムはスペクトル・データに適用される。分光的に処理されたデータを画像として表示することの重要性は、有用な画像をユーザーに提供することにあり、質的なものである。しかし、用途に応じて、スペクトル画像に特有な、空間とスペクトルとの相関関係を利用するアルゴリズムを適用することによって、利用可能な結像データを更にいっそう有意義な方法で用いることも可能である。空間及びスペクトルの演算は、スペクトル画像分析アルゴリズムの最も有効なものである。例として、次の状況を考察する。試料は、ｋの異なる発蛍光団で染色されたｋのセル・タイプを含んでいる（ここでの用語「セル」は、生物学の細胞に対しても、また、「計測器の視野内の領域」に対しても用いられる）。各発蛍光団は、別個の蛍光発光スペクトルを有し、ｋセル・タイプの一つにのみ結び付く。ｋセル・タイプの各々に対して、セル毎に平均蛍光輝度を測ることは重要である。この目的を達成するために次の手法を用いることができる。（１）画像内の各ピクセルを、そのスペクトルに応じて、（ｋセル・タイプに背景を加え）ｋ＋１のクラスの一つに属するものとして分類する。（２）画像を種々のセル・タイプへセグメント化し、各タイプの細胞数を数える。（３）各クラスによって寄与された蛍光エネルギーを加算し、対応するクラスのセル合計数によってそれを割る。この手法は、スペクトル・データと立体データと両方を用いる。立体データは種々のタイプのセル（すなわち、セルの小塊）についてのデータからなり、その多くは目には同じように見えるのだが、関連のあるスペクトル・データは、特徴のあるセル・スペクトルの形（すなわち、スペクトルの「特徴」）を示す。この種の状況に対する理想的なタイプの測定がスペクトル画像処理である。上記の状況において、セルは、それらの特有なスペクトルの特徴によって区別されることができる。それ故、各ピクセルにｋ＋１の値の一つを割り当てる適当なポイント演算が合成画像を生成するために実行される。異なるセル・タイプの蛍光発光スペクトルがｓ_i（λ）、ｉ＝１、２、・・・、ｋ、λ∈［λ₁、λ_n］であることが既知であり、各ピクセル（ｘ、ｙ）における測定スペクトルがｓ_x.y（λ）、 λ∈［λ₁、λ_n］であると仮定すると、次のアルゴリズムが、可能な分類方法である（上記のステップ１）。ｅ² _iを、セル・タイプｉに付けられた発蛍光団の既知のスペクトルからの測定スペクトルの偏差であるとする。このとき、最小二乗「距離」定義を採用して、次のように書くことができる。ここで、Ｒλは、目的とするスペクトルの領域である。画像における各ポイント［ピクセル（ｘ、ｙ）］は、次の基準を用いることによって、ｋ＋１クラスの一つに分類できる。もし、ｅ² _i＞全てのｉ∈［１、ｋ］に対する閾値なら、ポイント（ｘ、ｙ）∈ｋ＋１クラス（７）もし、ｅ² _i＜閾値なら、ポイント（ｘ、ｙ）∈ρクラスであり、 ρは、ｍｉｎ［ｅ² _i］＝ｅ² _ρである。上記のステップ２及び３（画像分割及び平均蛍光輝度の計算）は、方程式６及び７に表されたアルゴリズムによって生成された合成画像に、標準コンピュータビジョン演算を用いることによって簡単に行える。もう一つのアプローチは、各ピクセルにおける測定スペクトルｓ_x.y（λ）をｋの既知の蛍光スペクトルｓ_i（λ）、ｉ＝１、２、・・・、ｋの一次結合として表すことである。この場合、を解く係数ベクトルＣ＝［ｃ１、ｃ２、・・・ｃｋ］がある。ｉ＝１、２、・・・、ｋに対するｄＦ／ｄｃ_i＝０を求めて解くと、（すなわち、Ｆを最小にするｃ_iの値を見いだす）マトリクス方程式Ｃ＝Ａ^-1Ｂ（９）を得る。の次元ｋの正方行列、として定義されるベクトルである。算術演算が同様に二つ以上のスペクトル・キューブに、あるいは任意のピクセルのスペクトルあるいはライブラリからのスペクトルに適用されされてもよい。例えば、二つのスペクトル・キューブのデータを平均する、時間変化のフォローアップあるいはスペクトルの正規化を行う等の目的で、第一のスペクトル・キューブのデータと第二のスペクトル・キューブのデータとに属する、対応する対のピクセルの対応する波長の間に算術演算を適用し、結果として第三のスペクトル・キューブのデータを得ることを考察する。多くの場合、スペクトル画像内に存在するオブジェクト（例えば、セル）は、化学物質構成要素においても、また、構造においても各々異なるため、分散マトリクスあるいは相関マトリクスを生成することによって主要な構成要素の分析を行うことは、これらの小さな差異を高めることになる。次に、分散マトリクスを用いることによる主要な構成要素の分析について簡単に説明する。主要な構成要素の分析に関する詳細については、「多変量較正」「実践多変量解析」及び「コンピューターエイデッド・モデリング CAMO 及び整理好きユーザーのガイド」［Martens and Naes（1989）Multivariate Calibration , John Wiley & Sons, Great Britain; and to Esbensen et al., Eds．（1994 ）Multi variance analysis - in practice; Computer-aided modeling as CAMO , and the Unscrambler's User's guide，Trondheim，Norway］を参照すべきである。したがって、波長λｉ（ｉ=１、・・・Ｎ）における画像のピクセルの輝度は、長さがピクセル数ｑに等しいベクトルであると見なされる。測定の各波長に対して一つずつ、全部でこれらのベクトルがＮあるので、これらのベクトルは、ｑ行及びＮ列を含むマトリクスＢ’に整理できる。行列Ｂ’の列各々について平均を定義し、第２の標準化行列Ｂをとして定義する。分散マトリクスＣがマトリクスＢに対して定義される。次元ＮｘＮのＣ＝Ｂ^T ・Ｂ。Ｃは対角化され、固有ベクトルと固有値とがＣ・Ｖｉ＝μｉ・Ｖｉによって関連づけられる。ここで、ＶｉはＮ直交ユニットベクトルであり、μｉはｉ番目のユニットベクトルＶｉの方向に分散を表す固有値である。一般に、最も低い構成要素が、ピクセルについての一つの関数として最も高い変動を表わす。積ＢＶｉ（ｉ＝１、・・・Ｎ）は、直交基底の要素へのスペクトル画像の投影である。それらは、ｑ要素（ｑ＝ピクセル数）からなるベクトルであり、白黒画像として個別に表示される。これらの画像は、ある波長あるいは波長範囲でフィルターされた通常の白黒画像からは明白でない特徴を明らかにすることが可能である。蛍光顕微鏡検査法ａ．概要多数の染料（すなわち、発蛍光団）を用いること（「デジタル画像処理の基本」［Jain（1989）Fundamentals of Digital Image Processing, Prentice-Hall International］を参照）は、組織及び及び細胞を分析するための最も強力な、そして一般的な道具の一つである。したがって、蛍光顕微鏡検査法は、光学顕微鏡検査法に用いられる最も重要な実験方法の一つである（「蛍光分光分析法の原理」［Lakowicz（1983）Principles of fluorescence spectroscopy, Plenum Pr ess，New York，London］を参照）。蛍光プローブの能力は、主に、特性染料が結び付くことが可能な生物学的構造の素晴らしい多種多様性によるものである（「生体医学における蛍光の応用」［Waggoner（1986）Applications of fluoresc ence in the biomedical sciences, Eds．Taylor et al., New York: Alan R．L iss，Inc．pp．3-28］を参照）。蛍光プローブの詳細な論評については、「生物学の技術シリーズ、生物学的活動に対する蛍光及び発光性プローブ」［Mason（e ditor）（1993）Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activit y, Biological Techniques Series, edited by Sattelle, Academic Press Limi ted, London］及び「蛍光顕微鏡検査法入門」［Ploem and Tanke（1987）Introd uction to Fluorescence Microscopy, Oxford University Press，Royal Micros copical Society］）を参照すべきである。新しく、より洗練された多色の蛍光染料分子の急速な開発は、これら染料の可能性をフルに利用可能な、より進んだ蛍光結像技術を絶えず必要としている。蛍光染料が今日の研究のやり方に革命的な衝撃をもたらしたことへの論議については、「光学顕微鏡検査法の新しいビジョン」［Taylor et al．(1992)The New Vi sion of Light Microscopy,American Scientist，Vol．80，pp．322-335］を参照すべきである。多色蛍光染料における注意すべき改善は、いくつかの根本的な蛍光染料を種々に組合せる組み合わせ蛍光染料の導入にある（「組み合わせ蛍光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いる DNA ハイブリダイゼーションによる七つの異なるＤＮＡプローブの同時の視覚化」［Ried et al.,(1992)Simultaneous visua lization of seven different DNA probesby in situ hybridization using com binatorial fluorescence and digital imaging microscopy．Proc．Natl．Acad . Sci．USA 89，1388-1392; and，Ried（Jan．1994）Fluoreszenz in situ Hybr idizierung in der genetischen Diagnostik，Faculty of theoretical medicin e, Ruprecht-Karls University Heidelberg］を参照）。本発明の方法を用いるスペクトル生体結像は、蛍光結像の用途において、フィルターに基づく単純なアプローチに勝るいくつかの重要な利点を提供する。これらの利点には次のことが含まれる。（１）目的の試料における染料分子の実際の反応へのよりいっそう量的な洞察を提供する完全なスペクトル測定。（２）望ましくない背景冷光から生じる従来の問題の多くを克服する能力。（３）蛍光プローブの発光スペクトルにその微細な環境（例えば、温度）のゆえに起こる望ましくなく予想できないスペクトルのシフト。これは、プローブ濃度を測るときに考慮に入れることが可能である。しかし、蛍光輝度が単に帯域フィルターのみで測定されるときには、このようなスペクトルのシフトは、単に検出されないだけではなく、プローブ濃度の分析にかなりのエラーを生じる可能性がある。（４）下記に詳細に述べられるが、適切なスペクトル分析アルゴリズムと共に用いるとき、スペクトル的に重なった多くの蛍光染料を一回の測定で分離しマップすることが可能な、蛍光画像データ収集の簡略化。事実、多変量分析、主要構成要素の回帰及び分類等の精巧なデータ分析アルゴリズムを適用することによって（「多変量較正」［Martens and Naes（1989）Multivariate Calibration，John Wiley & Sons，G reat Britain］を参照）、スペクトル的関連のある多くのパラメータを同時に分析することが可能である。本発明によるスペクトル生体結像は、次のような望ましくない背景冷光に関する問題を解決する手段を提供する。蛍光結像顕微鏡検査法は、通常、試料が所望の短い波長によって励起されることとプローブの蛍光放射に対応する限られたスペクトルバンドの波長のみが検出器（例えば、目、カメラ等）に到達することとを保証する蛍光フィルター・キューブを用いることによって行われる（「生物学の技術シリーズ、生物学的活動に対する蛍光及び発光性プローブ」［Mason（edi tor）（1993）Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity ，Biological Techniques Series, edited by Sattelle, Academic Press Limit ed，London］を参照）。蛍光輝度は、通常、励起源の輝度よりも数桁ほど少ないため、このような背景冷光を完全に消去することは不可能である（「細胞生物学」［Benson et al．（1985）Cell Biol．100，pp．1309-1323］を参照）。望ましくない背景冷光が発生する三つの主要な原因としては、（１）二色性ミラー・コーティング及び／あるいはフィルターによって完全に塞がれない励起源からの光、（２）試料の、または、ある場合には光学素子の自己蛍光、そして、（３）励起フィルター、二色性ミラー及び障壁フィルターの不適当な（あるいは最適以下の）組合せの選択がある。これらの原因は、背景冷光にかなり貢献する可能性がある。試料自己蛍光効果は、通常、蛍光プローブの吸収及び発光帯域が、測定される試料のそれと重ならないように、蛍光プローブを選択することによって減らすことが可能である。同様に、自己蛍光を減らすために適切に覆われた光学素子を選ぶことによって、このタイプの自己蛍光効果も最小にすることが可能である。最善のフィルター方法が利用可能であるにも関わらず、望ましくない背景冷光は、背景（ノイズ）から関連のある蛍光信号を分離し取り出すことを、しばしば難しく、あるいは不可能にしてしまう。他方、本発明のスペクトル生体結像方法は、望ましくない背景冷光効果を消去するために、（ｉ）蛍光染料のスペクトル形状及びスペクトル範囲と、（ｉｉ）（自己蛍光を含む）背景冷光のスペクトル形状及びスペクトル範囲との間のスペクトル差を用いることが可能である。したがって、蛍光プローブの発光スペクトルに適切なスペクトル画像分析方法を適用することによって、ＳＮ比を改善し、蛍光結像測定の精度を改善することが可能である。測定結果の量子化を望む場合、このスペクトル生体結像アプローチの利点は、比率結像を行うために特別に重要である。さらに、本発明のスペクトル生体結像システムは、フィルターに基づく測定の場合に必要な、最適なフィルターの選択に費やされる時間及び労力を省くことができる。本発明の方法によるスペクトル生体結像の能力が適切な蛍光マーカーと共に用いられるとき、多色蛍光画像を得ることは大いに単純化される。スペクトル生体結像によってもたらされる利益を十分に実感するために、多数のプローブを含む試料からの蛍光を測定するためのフィルターに基づく結像方法を用いるのに必要な通常のステップを考察すべきである。第一に、十分に異なる吸収及び発光スペクトルをもつプローブが選択されなくてはならない。今日の方法において、この必要条件は、試料内の蛍光マーカー数を、三つから五つのプローブに制限するものである。それから、蛍光画像は、励起波長を選択するための一つのフィルター・ホイールと発光スペクトルを取り込むためのもう一つのフィルター・ホイールの二つのホイールを適切に回転させることによって、各染料に対して一つの画像が得られる。あるいは代替的に、３枚重ね二色フィルターによって発光スペクトルを取り込みながら、励起波長を選択することを目的とした一つのフィルター・ホイールを回転させる。励起及び／あるいは発光波長を制御するために（可動部品のない）チューナブルフィルターを用いるアプローチも提案されている。近年は、多数の発蛍光団の結像を可能にするために多スペクトル干渉フィルターも用いられている（「人間の分子遺伝学２」［Lengau er et al.（1993）Human Molecular Genetics 2，pp．505-512］を参照）。また、（例えば、フィルター・キューブを変えることによって）二色性ミラーを変える手段が必要とされる。また、各波長における画像の焦点を合わせる再調整もしばしば必要である。しかも、CCD カメラの露出時間をさえ、時々、より高いＳＮ比を達成するために変えなければならない。全体として、これらの条件が完全に行われることの限界がすなわち位置決め問題の原因である。異なる蛍光染料の発光に対応して生成された単色画像の各々は、（容易に利用可能な既製のソフトウェアがあるデジタルコンピュータを用いることにより）疑似色が付けられ重ねられる。結果として生じた画像は、各々が異なる擬似色が付いたいくつかの蛍光マーカーの位置を示すものである。二色性ミラーの位置の僅かな変化が、デジタル化された画像に並進シフトを起こしてしまうので、多波長二色性ミラーを用いる（４波長帯域通過特性をもつ二色効果の使用については、［Hiraoka et al．（1 992）Seminars in Cell Biology，Vol．2，pp．153-164］を参照）あるいはそれらを重ね合わせる前に画像の位置を合わせる必要がある。画像位置決めは、時間がかかること、また、満足な結果が得られないということがしばしば起こる難しい問題である事実にもかかわらず、このアプローチは、より一般的である。また、これらは、多色蛍光画像を得るために取り組まなくてはならない専門的な挑戦である（「細胞生物学における方法、第Ｂ部」［Waggoner et al．（1989）Par B of Methods in Cell Biology，Vol．30，Ch．17，pp．449-478，edited by Ta ylor and Wa ng，Academic Press Inc］を参照）。したがって、本発明のスペクトル生体結像方法は、蛍光結像へのフィルターに基づくアプローチに課された重要な制限の一つを克服することになる。（テキサス・レッド及びローダミン発蛍光団についての例の部分で下記に実証されるように、発光スペクトルが広範囲に重なる染料を含み）無限数の蛍光染料の発光スペクトルの同時測定を可能にすることによって、スペクトル生体結像は、多数の蛍光プローブの発光画像を連続的に得る必要をなくす。スペクトル生体結像システムを用いる利点は、用いられる蛍光プローブが一般的な励起源によって励起され得るときに最も大きい。この場合、単一のスペクトル画像を得ることで、ほぼ無制限の数の染料の蛍光発光を捕らえることができる。（１）重なり合わない染料を選択する、（２）フィルター・キューブを変える、（３）励起あるいは発光フィルターを変える、（４）焦点を合わせ及び／あるいは露出時間を最適にする、あるいは（５）画像を位置合わせする必要性はなくなる。課題は、もちろん、一般的な励起源で励起される適当な染料を選択することである。次から次へと移る蛍光エネルギーによって励起される染料は、したがって、スペクトル生体結像システムを用いる多色の蛍光結像に理想的である。明らかに、類似の発光特性がある染料を用いることは、（例えば、顕微鏡下での）視覚による検出をより難しくする。しかし、この制限は、本発明のスペクトル生体結像方法を用いれば解決可能である。ｂ．多数の発蛍光団のスペクトル確認本発明によるスペクトル生体結像方法を用いることにより、一回の測定で多くの染料（すなわち、発蛍光団あるいは蛍光部分）の同時測定が可能になる。染料のタイプに制限なく、下記に実証されるように(例１及び２参照)、適当なアルゴリズム（例えば、背景減法等のための一次結合）を適用することによって、スペクトル的に重なり合う染料（例えば、ローダミン及びテキサス・レッド）さえも識別し、それらの存在を画像にマップ可能である。しかし、もし多くの染料が同時に用いられるのなら、それらの励起波長、蛍光輝度及び発光スペクトルに関して、注意深く考慮すべきである。これを正しく行なうなら、結果は量的にも分析可能である。例えば、いくつかのタンパク質の相対濃度は、これらタンパク質に特に結び付く適当な蛍光標識が施された免疫抗体を用いて、一回の測定でマップ可能である。また、標準較正された染料を用いることによって、絶対濃度でも測定可能である。多数の蛍光プローブの検出がかなりの利点となることの一つの例は、染色体レベルで遺伝子を分析し、遺伝子及び染色体の増幅、欠失、転座、配置替え、その他の起こり得る遺伝子欠陥を見つけるために用いられる FISH（fluorescent in situ hybridization：蛍光 DNA ハイブリダイゼーション）である（「成長遺伝学とホルモン９」［Emanuel（1993）Growth Genetics and Hormones 9, pp．6-1 2］を参照）。多くのがん及び先天性異常を含む特定の病気及び疾患は、いくつかの遺伝子の不良によって起こされる遺伝子障害である。多くの他の病気も、遺伝子の要素、すなわち、遺伝子欠陥が存在するためであると知られている、あるいは信じられている。遺伝子欠陥は、単独では病気を引き起こさないが、病気を起こすのに寄与する、あるいは、後に病気になる可能性を増すものである。この現象は、本技術において多因子の病気及び遺伝子的疾病素質として知られている。明らかな遺伝子欠陥と既知の病気との相関関係は、医者が決定的な診断を行い、多くの病気を早期に発見し処置することを可能とする。遺伝カウンセリングは、その可能性がある親や、その危険性がある人々が、将来における潜在的に重大な医学的問題の可能性を示し、それを阻止する注意を喚起することができる。 5,000以上もの遺伝子障害が確認されたが、その多くのは同義遺伝子障害に関連している。染色体が遺伝情報のキャリアであることが発見された後、科学者は、特定の疾患に責任がある染色体にある目に見える欠陥を記録することが可能であると理論的に考えた。1960年代に、ガラスのスライドに広げられた分裂中期染色体の顕微鏡検査法に基づく分類のために着色技術が開発された。過去数十年間、染色体のバンディング・パターンの視覚的分析は、人間の遺伝子障害を、分裂中期染色体の観察された構造的な異常へ関連づけるために用いられている。染色体は、それらの長さに沿った特有の明暗のバンドを明らかにするために、通常、ギームザ染色（Ｇ - バンディング）を施した後に明視野顕微鏡検査法によって、あるいは、蛍光染色（Ｒ - バンディング）の後に蛍光顕微鏡検査法によって調べられる。患者のバンディング・パターンを正常染色体のパターンに注意深く比較することによって、奇形及び遺伝病を起こす転座（染色体間あるいは染色体内における遺伝物質の交換）、欠失（染色体あるいは染色体の断片が欠けている）、付加、逆位等の異常が明らかになる。しかしながら、例えば胞性線維症（CF）等の多くの重大な遺伝病及び他の多くのものは、僅かに一つあるいはいくつかのヌクレオチドの付加、欠失あるいは置換を伴う突然変異によって起こる。このような小さな欠陥は、上記で述べられた染色体バンディング技術によって探知可能なものではなく、何年もの間、細胞遺伝学者は、僅かな欠陥の位置を検出すると共に数量化する技術を開発するために努力している。蛍光 DNA ハイブリダイゼーション（FISH）は、複数の補足的な技術の改良を受けて、過去２５年間に渡って発展したものである。この技術は、細胞遺伝学者の、染色体上に遺伝子の正確な位置をマップし、染色体の肉眼的染色によっては目に見えない非常に小さな遺伝子欠陥をも検出する良い道具を開発したいという願望によって生まれたものである。ゲノム・プロジェクト（HG P）、人間のすべての遺伝子を識別しマップする大胆なイニシアティブは、FISH に興味を示し、必要なＤＮＡプローブの開発を早めた。現行の FISH技術は、強力な免疫プローブの同時の開発、顕微鏡検査法及び分光分析法のための優秀な蛍光染料の多種多様な増加、そして蛍光顕微鏡検査法に用いられる対物レンズ、照明装置及びフィルターの劇的な改良によって可能になった。 FISH の性能及び実用性は、多くの要因による。（１）FISHは、単に、単離した染色体及び核に用いられるばかりでなく、固定パラフィンに埋め込まれた組織内における細胞全体にも用いられる。（２）比較的小さな欠陥を検出できる（より小さな欠陥を検出するようと、性能は常に改善されている）。（３）比較的速く結果を提供できる。（４）適度なコストは、大部分の臨床検査室や研究所でそれが用いられることを可能にする。（５）種々のプローブ及び試料タイプに使用できるように改良が可能である。（６）高い特異性及び感度が達成可能である。（７）短時間の処理、通常２時間で可能。多くの FISH の用途において必要となることは、単に、細胞遺伝学者が、顕微鏡のアイピースを介して、あるいはモニタ上の画像において、蛍光ラベルが存在するか否かを測定するだけである。幾分複雑な試料については、１あるいは２色のラベルを単純にカウントするだけでよい。しかしながら、デジタル画像を処理し、それらから数値データを抽出する能力は、FISH 技術に新しい巨大な機能のセットを加えるものである。本発明の方法等の、適切な結像方法によって、非常に不明瞭な FISH 画像の明瞭度が向上するため、ラベルが付いた染色体及び遺伝子座が明確に確認可能となる。容易に達成可能な実験条件下で、ラベルが貼られたサイト数は自動的に計測可能である。また、ラベルが貼られた各サイトの輝度が測定され、例えば、特定の遺伝子の存在数を明らかにするＤＮＡの量が計算される。多色 FISH 等の新しい技術は、（３、４、５及びそれ以上の）多数の蛍光プローブを検出し数量化するためのカラー画像分析を用いる。上記で論じたように、FISH は、ラベル付けされたプローブの位置、各染色体上のラベルが貼られたサイト数及び各サイトにおけるラベルの輝度（遺伝物質の量）についての情報を提供する。動原体（反復 DNA）プローブ及び染色体ペイントは、目標に定められた各染色体にラベル付けを行いコピー数を数えるために用いられる。遺伝子座特定プローブは、遺伝物質の小さな領域の位置をマップするために用いられる。これらのタイプのプローブは、そのままの細胞分裂間期核及び分裂中期の染色体スプレッドに用いることが可能で、視覚的にあるいは適当なアルゴリズムによって自動的に計数可能であり、特定の染色体、染色体分裂片、あるいは遺伝子があまりに多いあるいは余りにも少ないために起こる遺伝病を識別するために決まって用いられる。いくつかのがんの非常に早期の段階においては、細胞が明らかに異常であると確認されるかなり以前に、特定の遺伝子の数が増加することがある。この現象は、遺伝子増幅として、この技術分野で知られているが、遺伝子座特定プローブを用いて探知可能である。がん細胞における染色体異常を検出するために FISH を用い、その病気の発達段階を指摘することによって、段階に応じて有効度が異なる多くの治療方法から、最も適当な治療を選択できる可能性もある。最も効率的な段階特性治療を選択することによって、貴重な時間が節約されると共に、患者の苦痛も最小になる。染色体を（例えば、音波破砕によって）物理的に、あるいは（例えば、エンドヌクレアーゼによって）酵素的に切り刻み、（例えば、流動細胞計算法を用いて）単離し、分裂片全てに対してプローブのセットを生成することによって、一つの特定な染色体の全面に一様にラベル付けすることが可能である。染色体ペイントとしても知られている染色体プローブの全体は、ターゲット染色体のすべてのコピーに蛍光ラベルを付ける。染色体彩色の一つの重要な用途は、特徴的に特定のがんの早期に起こる欠失及び二つの染色体間の転座の検出にある。例えば、もし染色体Ａが緑のペイントでラベル付けされ、染色体Ｂが赤のペイントでラベル付けされたなら、ＡからＢへの物質のいかなる転座も赤色染色体上に緑の領域として現われる（また、逆も同様である）。通常、正常な染色体から生成された染色体ペイントが、異常な（患者の）染色体上の欠失あるいは転座を検出するために用いられる。逆方向の染色体彩色は、異常な染色体から生成されたプローブを、その異常な染色体に物質を寄付した種々の正常な染色体からＤＮＡを識別するために用いる。本発明の方法は、下記の例に実証されるように、一回の交雑そして一回の測定によって、人間の核型（すなわち、ゲノム）を構成する２４の異なる染色体を各々が異なる色に彩色し、同時に検出して識別し有意義にカラーの人間核型を示すことを可能とする。比較ゲノム・ハイブリダイゼーション（CGH）は、ＤＮＡプローブの二つのカクテルが染色体の全セットから生成される逆方向の染色体彩色の変型である。一つのカクテルが正常な染色体のセットから、また、もう一つが異常な染色体（例えば、腫瘍）のセットから生成される。プローブの二つのセットは、例えば、正常なＤＮＡが赤色の蛍光を示し、異常なＤＮＡが緑色の蛍光を示すように、異なるリポーター分子を用いて生成される。正常な分裂中期の広がりは、両方のカクテルで同時に交雑され、その場でカラー画像分析を用いて評価される。赤よりも強烈に緑の蛍光を発する正常な染色体の領域は、ＤＮＡ増幅（多数の遺伝子コピー）が患者の異常な細胞におけるその遺伝子で起こったことを示すものである。緑の蛍光よりも赤が多い（緑／赤の比が少ない）領域は、患者の染色体内の遺伝子欠失のサイトを示すものであり、緑と赤の蛍光が平等な領域は、そのサイトにおいてＤＮＡが変化していないことを示すものである。CGH 及び関連する技術は、先のラベル付け技術よりも複雑であるが、以前に可能であったものに比べ、より微妙で広範囲の遺伝子の変化を検出し数量化する能力を提供する。本発明の方法は、これらのタイプの分析に非常に適している。上記に述べられたことから、単純なカラー蛍光画像に代わり、比較的に高いスペクトル解像度でスペクトル画像全体を作る本発明の感度の良い、量的なスペクトル結像方法を用いることは、核型の作成、転座あるいは転位あるいは染色体欠失あるいは増幅の検出及び遺伝子マッピングに、大いなる利益をもたらすものである。その理由は、このような方法は、試料準備時間を減少させ、交雑された蛍光プローブを、（小さなスペクトルのシフトによって）背景に残留するものから区別し、未だに達成されていない大きな数のプローブを同時に測定することを可能にするからである。したがって、本発明の目的の一つは、プローブ技術における進歩をうまく利用するように設計された FISH 結像方法を提供することである。本発明によれば、いかなる任意の染色体分析においても分析可能なプローブ数を大いに増し、また、従来の技術の方法と比較し、この情報が得られるスピード及び自動化の割合を劇的に増すことが可能である。本発明の FISH 結像方法は、顕微鏡視野のすべてのピクセルから蛍光スペクトルを同時に得ることが可能で、一回の実験で多くの蛍光プローブの位置を検出可能なスペクトラキューブ・システムの利点を採用する。染色体特性プローブ及び奇抜なラベル付け戦略を用いることによって、下記の例に示されるように、この方法は、各染色体が異なる色（すなわち、人間の核型に対して２４の異なる色）で彩色された状態での FISH 核型を生成することが可能である。この方法は、非常に高い試料処理能力をもたらし、本質的に無制限のプローブ数の分析を可能にする。上記に説明されたように、本発明の鍵となる概念は、FISH 分析への多くの蛍光プローブの利用にある。ビオチンあるいはジゴキシゲニン等のハプテンが酵素反応を用いてＤＮＡに取り入れられる間接的な方法を含めて、FISH に用いるためにＤＮＡプローブにラベル付けを行う多数の方法が利用可能である。分裂中期の染色体スプレッドへ、あるいは細胞分裂間期の核への交雑後、免疫学的方法を用いることによってハイブリッドに蛍光ラベルが付けられる。最近では、蛍光染料は、直接的にプローブに取り入れられ、中間ステップを用いることなく検出される。標準的な FISH の染料には、フルオレセイン、ローダミン、テキサス・レッド及びカスケード・ブルーが含まれ、マルチプローブ FISH 分析は、異なるプローブを、異なるハプテンあるいは蛍光染料あるいはそれらの組合せでラベル付けすることによって達成される。これは、この技術において組み合わせプローブとして知られる（「組み合わせ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いる DNA ハイブリダイゼーションによって七つの異なるＤＮＡプローブの同時の視覚化」［Ried et al.，（1992）Simultaneous visualization of seven differe nt DNA probes by insitu hybridization using combinatorial fluorescence a nd digitalimaging microscopy．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89，1388-1392; and，Ried（Jan．1994）Fluoreszenz in situ Hybridizierung in der genetisc hen Diagnostik，Faculty of theoretical medicine，Ruprecht -Karls University Heidelberg］を参照）。蛍光は、接地電位において発蛍光団として知られる分子に光の光子が吸収された後に起こる冷光の一つの形である。この分子は、より高いエネルギー軌道へ電子が移行するために、励起状態に上げられる。この超過エネルギーは、電子が元の接地状態に戻るとき、光量を解放して発散される。蛍光光は、吸収された光よりも長い波長にある。この移行には制限があるため、発光は励起波長に近くなる。これため、ある一つのスペクトル範囲で励起される発蛍光団は、類似のスペクトル範囲で発光する。例えば、もし励起が青色の範囲にあるなら、発光は緑色と期待される。したがって、もし異なるスペクトルを放つ多くの異なるプローブを用いることを望むなら、波長が近くなり、しばしば重なり合うということは明白であるため、異なるプローブ間を区別することが可能なスペクトル解像度が非常に重要になる。本発明の方法によれば、個々のプローブ（この書類のここで言及されたプローブは、組み合わせプローブをも示す）は、（RGB アルゴリズムによって）擬似色（すなわち、分類アルゴリズムによる所定の色）が割り当てられ、その情報はコンピュータ・スクリーン上に表示される。多色蛍光を用いることで、多数のプローブからの恩恵を享受可能な重要な臨床医学の用途に FISH を拡張できる可能性が開かれる。例としては、異数体及び染色体の構造の研究、マーカー染色体及び完全な FISH 核型の検出が含まれる。多数の情報が一回の交雑から得られるかもしれないので、スループットが増し、遺伝子投与量効果を算定する、あるいは欠失の程度を測定するために内標準が用いられてもよい。本発明の方法は、いくつかの狭いスペクトル・バンドに白色あるいはコヒーレント単色光源によって励起された蛍光の検出を、冷却 CCD をもつセンサを利用して行う。したがって、異なるプローブを表す各々からなる多数のスペクトルが同時に測定される。このことは、染色体の多数のスナップ写真を撮り、次に画像を再構築するという従来のアプローチだが、すべて上記に説明されたように、このプロセスには時間がかかり、アーティファクトという結果が生じる。本発明の方法は、これと比較して、画像を得るスピード及び精度を増すことになる。それ故、本発明は、多数のプローブの、より感度が良く、より速く、より正確な検出を可能にするため、最新技術の細胞遺伝学の結像方法に勝る非常に意義深い進歩を示すものである。したがって、本発明は、蛍光 DNA ハイブリダイゼーション方法を提供するものであり、この方法は、次のステップを含む。（ａ）染色体を持つ細胞核を提供する。この染色体は、少なくとも一つの核酸プローブで交雑される。この少なくとも一つの核酸プローブの各々は、少なくとも一つの核酸分子を含み、この少なくとも一つの核酸分子の各々は、少なくとも一つの発蛍光団でラベル付けされる。（ｂ）蛍光顕微鏡を介して細胞核を視検する。この蛍光顕微鏡は、結像分光計に光学的に繋がれており、これら蛍光顕微鏡及び結像分光計は、細胞核の各ピクセルのスペクトルを得るためのものであり、（ｉ）コリメーター光学系を用いて細胞核のすべてのピクセルから同時に入射光を集め、（ｉｉ）複数の要素を持つ干渉計システムを介して平行入射光を通すことにより、光がまず二つのコヒーレント光線に分けられ、干渉計内の各々異なる方向に移動し、それから二つのコヒーレント光線は、再び結合し各々他と干渉して射出光線を形成し、（iii）検出器要素の二次元アレイを持つ検出器に、射出光線を集束させる焦点調節光学系を介して射出光線を通過させることにより、測定の全持続時間に渡る各瞬間において、検出器要素の各々は、細胞核の常に同一ピクセルの画像となるため、細胞核の実像は検出アレイの平面上にあって動かず、測定中のどの時間においても画像は明らかで識別可能であり、また、検出器要素の各々は、異なる波長でピクセルによって発光される光輝度の特定の一次結合である信号を生成するが、この一次結合は瞬間的な光路差の関数であり、（ｉｖ）干渉計システムの要素の一つ以上を回転あるいは移動する（すなわち、走査する）ことにより、細胞核のすべてのピクセルに対する、干渉計システムによって生成された二つのコヒーレント光線の間の光路差が同時に走査され、（ｖ）第一のスペクトル・キューブのデータを形成するために、記録装置を用いて検出器要素の各々の信号を時間の関数として記録する。そして、（ｃ）数学的アルゴリズムを用いて第一のスペクトル・キューブのデータを解釈する。核酸プローブは、各々がインサート、プラスミド、コスミド、ファゲミドを含む遺伝子座、分裂片の染色体、酵母人工染色体を、あるいは、各々がインサート、あるいはある種のがん組織の完全な（すなわち、全）ゲノム及びその組合せを含むウィルス・ベクターを含んでもよい。発蛍光団は、単一の蛍光染料、あるいは複数の単一の蛍光染料の種々の組合せである組み合わせ蛍光染料であってもよい。細胞核は、細胞分裂間期中の核、有糸分裂中の核あるいは減数分裂中の核であってもよい。したがって、染色体も、細胞分裂間期染色体、有糸分裂中の染色体あるいは減数分裂中の染色体であってもよい。核酸プローブの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、あるいは２４より多くてもよく、プローブの各々は、異なる発蛍光団あるいは発蛍光団の異なる組合せを含む（すなわち、組み合わせプローブ）。数学的アルゴリズムは、（ａ）予め定められた波長範囲を用いる赤緑青色画像計算、（ｂ）ピクセルの各々のスペクトルに対して少なくとも一つの基準スペクトルからのスペクトル差を計算する分類マッピング分析、（ｃ）一次結合分析、この分析は、分類マッピング分析と組み合わされた背景減法のためのもの、（ｄ）主要な構成要素の分析及び（ｅ）ピクセルに関するスペクトルに応じたピクセル分類に適するいかなる他のアルゴリズムであってもよい。さて、上記の説明と共に本発明を説明する次の例を参照する。例１：スペクトラキューブ、一次結合アルゴリズム及び分類マッピング・アルゴリズムを用いる改善された蛍光 DNA ハイブリダイゼーション（FISH）本発明の方法をスペクトラキューブ・システムに用いるスペクトル生体結像は、一回の測定で多数のプローブの同時検出を高い精度で可能にすることによって、FISH 有用性を向上させる。その結果、FISH による遺伝子異常の検出の効率及び信頼性は、大いに向上する。上記に詳しく述べたように、蛍光 DNA ハイブリダイゼーション（FISH）は、多くの研究及び診断分野において、ますます重要な役割を担っている。1970 年代に最初に導入されて以来、FISH 技術はかなり進歩し、単一の遺伝子配列、部分的な染色体配列、さらに染色体全体（すなわち、染色体彩色）の検出及び識別を可能にしている。FISH の用途の多くは、遺伝病及び遺伝子異常を発見し治療を行うためであり、また胎児期の診断、アニューソミ（aneusomy）、その他の病気の早期発見にある。相同核酸連鎖の交雑に基づく FISH の高感度及び選択性のため、１キロベース（kb）ほどの小さな短い配列さえも観察可能である。（もうすぐ、１５−３０ベース程度の短い配列をも検出可能なまでに改良されるであろう。その結果、ポイント突然変異の検出も可能になるだろう。）FISH は、分裂間期及び分裂中期の細胞に、さらには組織全体に適用できるため、細胞遺伝学及び病理学の分野で広範囲の用途に用いられることが可能である。FISH は、ＤＮＡプローブ、蛍光染料（特に、組み合わせプローブの導入）、蛍光顕微鏡検査法、高性能 CCD カメラ及び結像技術の改良に伴い能力が向上する。同時に多くのプローブを検出する能力については、FISH を効率的な診断の道具にするために、すでに文献に示されている（Rudkin and Stollar（1977）Natu re 55，172-173 を参照）。しかし、既存の方法は取り扱いが難しい。下記に実証されるように、多数のプローブの検出は、適切なアルゴリズムに組み合わされたスペクトラキューブ・システムによって、スペクトル解像度及び感度が良いため、大いに改善される。この機能を説明するために、染色体１及び染色体１７に特定されたＤＮＡプローブを用いて行われた細胞分裂間期の FISH 測定の例を含む図５a−ｃを参照する。この測定において、これらＤＮＡプローブは、蛍光スペクトルが非常に類似した発蛍光団テキサス・レッド及びローダミンで各々タグ付けされた。染色体１のプローブは、染色体のサブテロマー（subtelomeric）領域に対するミッドサテライト・プローブであり、交雑後ビオチンによってＤＮＡプローブにリンクされたテキサス・レッドでタグを付けられた。染色体１７のプローブは、染色体の動原体領域に対するαサテライト・プローブであり、ローダミンでタグを付けられて、交雑後ジゴキシゲニンによって第二のＤＮＡプローブにリンクされた。図５a は、顕微鏡を通して肉眼で見えるようなオリジナル画像を示す。図５b は、測定後スペクトラキューブ・システムによって処理された同じ試料を示す。図５c は、（Ｔと記された）テキサス・レッド及び（Ｒと記された）ローダミン発蛍光団の蛍光スペクトルを示す。図５c に明らかなようにテキサス・レッド及びローダミンのスペクトルのピークは、僅かに１５ナノメートル異なるだけであるため、フィルターに基づくシステムを用いたとしたら、それらを区別することは非常に難しいであろう。図５a に示されるように、顕微鏡を通してカラー FISH 画像を見ると、画像に現われた（１−４と記された）点及びプローブ・タイプの正しい数を認識する信頼性は、特に高くないということが分かる。他方、図５b に示されるように、各ピクセルに対する測定スペクトルを利用するスペクトラキューブ・システムは、点の存在を確かめ正確にそれらを数えると共に、それらの間の小さなスペクトル差から高い信頼性で異なる対を区別することが可能である。図５c に示されるように、テキサス・レッド及びローダミン蛍光の人工彩色によって、プローブ特性蛍光の位置は高い精度で測定される。点１及び２がテキサス・レッドであり、点３及び４がローダミンである。図６a-b は、六つの異なるプローブを用いる、細胞分裂間期における核 DNA の交雑後の FISH 測定の例である。図６a はオリジナル画像を示し、図６b は、スペクトラキューブ測定におけるすべての検出された対のペクトル処理及び人工色表示を示す。図６c は、スペクトラキューブ・システムを用いて３枚重ね二色フィルターを通して検出され（染色体に応じて各々に次のラベルがある：１、８、１０、１１、１７及びＸ）交雑後の六つの発色団のスペクトルを示す。（発蛍光団、プローブ及び染色体に関する詳細については、次の説明、表２及びカタログ［Chroma Corp．Cat．No．61502］を参照。肉眼によって、あるいは単純な RGB カラー測定を用いても、色を一色毎に区別することは難しいということが、細胞分裂間期の細胞核のオリジナル RGB 画像を示す図６a から明らかである。経験豊かな観察者は、最も条件が良い場合に、６色の内、異なる３色を検出できるかもしれない。しかし、図６b は、背景減法及び分類のために有標分類アルゴリズムでスペクトル・データを処理した後（上記詳細を参照）の、図６a に示されたものと同じ試料を示す。結果として生じた点は次のように人工色で強調表示された。茶色−Ｂ１、青緑色 −Ｃ、青色−Ｂ２、黄色−Ｙ、緑色−Ｇ、及び赤色−Ｒ。なお、背景は黒色−Ｂ３の人工色が与えられた。観察されるように、すべての六つの発蛍光団の対を見つけること、そして容易にそれらの対を区別することが可能である。青色（Ｂ２）で強調表示された一つの対は、肉眼によって、あるいはカラー・カメラを用いてもほとんど気付くことが不可能であるが、スペクトル・キューブに背景減法アルゴリズムを適用した後では検出可能である（図６a を図６b に比較）。プローブは、染色体８、１０、１１、１７及びＸの動原体領域に対して五つの αサテライト・プローブが、染色体１のサブテロマー領域に対してミッドサテライト・プローブが用いられた。上記の染色体及び DAPI 対比染色（背景）の各々にラベルをはるために用いられた発蛍光団、それらの発光ピーク及び人工表示色の分類は、表２に要約される。図６c に示される六つの発蛍光団の各々の正規化されたスペクトルの特徴から、いくつかの比較的に広いスペクトル範囲で測定するフィルターに基づいたシステムは、スペクトル間の大きな重なり合いのため、異なるプローブ核種を確実に区別することが不可能であることが明らかである。このようなシステムは、各プローブの輝度の絶対測定により依存しているため、背景信号及びノイズによってさらに影響を受ける。スペクトルの重なり合いは、セル自体から発生する自己蛍光という状態でも時々起こるもので、この場合も、各ピクセルに対するスペクトル情報の有用性が、自己蛍光の寄与の除去を可能にし、より正確な結果をもたらす。画像上の各点の全スペクトルの測定は、プローブの特異性の問題をも解決するかもしれない。事実、ある場合には、ある染色体ＤＮＡ連鎖に合致するプローブは、異なる（たいてい類似の）連鎖への低い特異性を持ち、第二の連鎖へも交雑する可能性がより低い。このことは、あるタイプのプローブがあまりにも多く出現するかのような見せかけを生じるが、第二のケースにおける蛍光スペクトルは、プローブの化学物質環境に小さな変化があるため、第一のものに対して非常に僅かにシフトする。スペクトラキューブ・システムは、スペクトル解像度及び感度によって、このアーチファクトを排除可能である。試料準備中に洗浄されてないプローブに対して同様のアーチファクトは、虚偽の陽性の診断をもたらす。したがって、本発明の方法によるスペクトラキューブ・システムは、間違った診断の危険性を減少させる助けとなる。多数の類似の染料へ一般化すると、図５a-b 及び６a-c の例は、多数のプローブを検出し区別することが可能であることを示す。それらの間に小さなスペクトル差が存在するという条件下で、スペクトラキューブは一回の測定でそれらを検出し識別する。他の既知の、また、将来に発見される、あるいは開発される発蛍光団及び発蛍光団の組合せも、上記に詳しく述べたように、多数の遺伝子座を同時に検出して核型の各染色体を識別可能な色等で彩色するために、種々の FISH の用途に用いられてもよいことは同業者に明らかである。最先端の細胞分子生物学に用いられる発蛍光団のリストは、「蛍光プローブへの入門、生物学の研究のための蛍光及び発光性プローブの特性、歴史及び用途」［Kasten（1993）Introduction to fl uorescent probes: Properties history and applications，in Fluorescent an d luminescent probes for biological research, Mason Ed. Academic Press L imited, London, pp. 24-31］に述べられている。例えば、生体発光、化学発光及び非蛍光分類法等の他のラベル付け技術も同様に適用されてもよいことは同業者には同じく明らかである。したがって、FISH 分析のためのスペクトラキューブ・システムを用いることで、次のような重要な利点が得られる。（例えば、蛍光顕微鏡を用いて）FISH を行うために従来の手段を用いると、一回の交雑で用いられるプローブ数は、二つから四つに制限されるが、スペクトラキューブ・システムは、その高スペクトル解像度のために、多数のプローブの同時検出を可能にする。したがって、FISH 分析のためにスペクトラキューブ・システムを用いることは労力及び時間を省くことになる。さらに、FISH の分析のためにスペクトラキューブ・システムを用いることで、完全な分析に必要とされるセル数を減少できる。これは、分析すべきセルの数が限られている場合に重要な特徴である。例２：蛍光 DNA ハイブリダイゼーション及びスペクトル生体結像を用いる、人間のすべての染色体の異なる色による同時の視覚化多色 FISH の出現は、基本研究及び遺伝子の診断における分子細胞遺伝学の応用を広げた。すべての既存の多色 FISH 技術は、発光スペクトルが光学フィルターで分離され得る蛍光プローブを用いることを必要とする（「組み合わせ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いる DNA ハイブリダイゼーションによる七つの異なるＤＮＡプローブの同時の視覚化」［Ried et al.,（1992）Simultan eous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridizatio n using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy．Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 89，1388-1392; and，Ried（Jan．1994）Fluoreszenz in situ Hybridizierung in der genetischen Diagnostik，Faculty of theoret ical medicine，Ruprecht-Karls University Heidelberg］を参照）。この必要条件は任意の試料内に識別可能な染料数を制限する。本発明によれば、スペクトラキューブ・システムを用いる、FISH に対する奇抜なアプローチと、スペクトル的に重なり合うラベル付けされた多数のプローブ（単独及び組み合わせ）を測定し分析する本発明の方法とが提供される。この例においては、上記に説明されたように、生物学的試料のすべてのポイントにおいて決定的なスペクトル・データを同時に測定可能なフーリエ分光分析法、CCD 結像及び光学顕微鏡検査法の組合せであるスペクトル生体結像検査法が、人間の染色体のすべてのタイプ（すなわち、２４種）に沿って、交雑に基づく多色帯域を視覚化し、人間の核型のカラー・マップを生成するために用いられた。この目的のために、各々が５以下の異なる発蛍光団（ａからｅ、表３）の異なる組合せでラベル付けされた２４の染色体ペイント（１から２２、Ｘ及びＹ、表４）（異なる発蛍光団及びそれらのスペクトルの特徴については表３を、２４の染色体ペイントを得るために、表３にリストアップされた発蛍光団を割当てることについては表４を参照）は、リエド（Ried）氏他の著書（「組み合わせ蛍光発光及びデジタル結像顕微鏡検査法を用いる DNA ハイブリダイゼーションによる七つの異なるＤＮＡプローブの同時の視覚化」［Ried et al.,（1992）Simultan eous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridizatio nusing combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy．Proc． Natl．Acad．Sci．USA 89，1388-1392］を参照）に述べられているように本質的に交雑のために準備された男性の白血球の有糸分裂染色体スプレッドに、同時に交雑された。交雑された染色体は、スペクトラキューブ・システムに接続された逆蛍光顕微鏡を通して視検され、分析された。さて、図７a-e、８a-b 及び９a-b を参照する。図７a-e は、２４の個々のピクセルについて正規化されたスペクトル、すなわち、人間の異なるタイプの染色体の各々（１−２２、Ｘ及びＹ）を示す。番号１−２２、文字Ｘ及びＹは、スペクトルの各々が引き出された染色体のタイプを示す。図７a-e に示されるように、人間の２４の染色体の各々から得られたスペクトルは、他のすべてのスペクトルとは異なる。この差異は、大きい（例えば、図７c の染色体１１と１５との C a．530 ナノメートル発光ピークを比較）かもしれないし、あるいは小さい（例えば、図７e の染色体２２とＹとの Ca．530 ナノメートル発光ピークを比較）かもしれないし、あるいはいくつかのスペクトル範囲では、（例えば、図７e の染色体２２とＹとの C a．680 ナノメートル発光ピークを比較）無くなってしまうかもしれない。しかし、さらに、図７a-e に示されるように、スペクトラキューブ・システム及び本発明の方法を用いることで、非常に類似したスペクトル間の僅かな相違さえも検出が可能となる。しかし、本発明の方法における、スペクトル間の差異を検出する能力は、かなりの部分において、適切な発蛍光団及び発蛍光団の組合せの選択に依存するが、この技術における同業者あるいは熟練した者には、ここに示された性能が、いかなる従来の細胞遺伝学の技術をも超越することが理解されるであろうことは、この説明から明らかである。図８a は、上記に述べられた人間の彩色された染色体のRGB 画像を示し、図８b は、図８a の彩色された染色体から得られた人間のカラー核型を示す。文字で２４の異なる色を表すことは不可能であるため、白黒の図８a 及び８b と、色が付いていなければまったく同じ図であるところの、色の付いた図９a 及び９b も含まれている。染色体対の各々は、異なる色で彩色されること、また、カラー核型（図９b）は、カラー画像（図９a）から容易に得られることに注意すべきである。図８a 及び９a の画像を生成し表示するアルゴリズムは、上記に説明され、図４に例証されたように、RGB アルゴリズムである。Ｒ＝640−740ナノメートル、Ｇ＝550−640 及びＢ＝530−550ナノメートル。しかしながら、輝度に関してより統一された画像を得るために、得られた RGB 値に特別な修正が行われた。この修正は、カラー結像技術において「コントラスト・ストレッチ」として知られており（例えば、「ENVITM ユーザーズ・ガイド、画像化のための環境」［ENVIT M User (IUs guide, The environment for visualizing images Version 1.1 July 1994 Edition，BSC limited Liability Company］を参照）、次のことを含む。（ａ）RGB 値の各々の分布を測定する。（ｂ）測定された分布内における輝度間の差異を最大にするためにルックアップ表を定義する。（ｃ）修正された RGB 画像を表示する。この画像が、オリジナルの各々のスペクトルの最大の色変化を表す。このオリジナルの RGB 画像の単純な修正は、上記に説明されたように、実際は、分類アルゴリズムの一つの限定版である。しかし、類似の画像を表示するのに、他のアルゴリズムも、同等にあるいはより適当に用いられ得ることは、同業者には明らかである。上記に詳細に例証されたように（例えば、例１）、分類マッピングは、染色体の特有なカラー・パターンをさらに得るために、いかなる人間の染色体をも所定の人工色で表すことが可能である。さらに、上記に詳述されたように、主要な構成要素分析においても、有意義な構成要素の各々あるいはそれらの組合せに、一つの所定の人工色が当てられることも適当である。それでも、類似のスペクトルを区別すること、また、異なるスペクトルを持つピクセルへ異なる所定の人工色（あるいは疑似色）を当てることが可能な追加のアルゴリズムも、本発明の方法によれば、核型を作成するのに適当である。この例では、五つの異なる基本的な発蛍光団（表３のａからｅ）から合わされた２４の異なる単一及び組み合わせプローブは、人間の染色体のカラー核型を作成するために説明された。しかし、いくつかの他の核種は、より多くの数の染色体を持っているため、多分、より多くの基本的な発蛍光団から組み合わされたより複雑な組み合わせプローブを用いる必要がある。しかし、人間の染色体も含み、染色体は、大きさのグループにも分類が可能である。このため、いくつかの用途に対しては、異なる大きさのグループに属している染色体が同じに彩色されても、それらの相対的な大きさによって識別が容易であるため、色数の必要が最小に抑えられることに注意を払うべきである。これは、人手による点検によって、あるいは代替的に、どの形態学的アルゴリズムを用いても達成可能である。例３：乳がん細胞における多数の染色体転座の検出説明されたように、本発明の方法は、正常な血液細胞の完全なカラー核型を提供することができる。多く場合、従来の核型作成技術（例えば、ＧバンディングあるいはＲバンディングを用いる技術）は、遺伝子障害に関する転座等の染色体異常（例えば、ダウン症候群の２１ｑ２２三染色体、染色体１８（あるいはその分裂片）の三染色体及び染色体１３（あるいはその分裂片）の三染色体）あるいは悪性腫瘍（例えば、慢性の骨髄性白血病の患者からの白血球内における染色体９及び２２の遠心端間での転座、そしてバーキットリンパ腫の患者のリンパ球内における染色体８及び１４の転座）を検出するために用いられる。この例においては、乳がん細胞における多数の染色体転座を検出する本発明の方法に組み合わされたスペクトラキューブ・システムの機能が説明される。さて、図１０a-b、１１a-b、１２及び１３を参照する。乳がん細胞の染色体スプレッドは、上記表３及び４に詳述されたように、２４の染色体ペイント（１から２２、Ｘ及びＹ）で交雑され、上記例２のところで詳述されるように、スペクトル的に画像化された。図１０a 及び１１a は、従来の蛍光顕微鏡を用いて撮られた、染色体スプレッドの DAPIＲバンディングを示す。この核型はかなり異常であるけれども、図１０ a 及び１１a で染色体の特定な転座を識別することは不可能であることが分かる。図１０b 及び１１b（各々、白黒及びカラー）は、スペクトラキューブ・システム及び本発明の方法を用いて得られた、同じスプレッドの RGB 画像である。他の同一実験条件下で得られた人間の正常な核型を提示する図９a-b と比較すると、図１０b 及び１１b に示された染色体を含む異常の多くは、人間の種々の正常な染色体の一部をも含むことが明らかである。図１０b 及び１１b の転座した染色体（右）は、Ｒバンドの染色体（左）と共に図１２及び１３に示されている。図１２及び１３に示された転座染色体のいくつかは、二つ、三つ、さらには四つの異なる染色体から発生した分裂片を含むことが分かる。特定の染色体の転座及び他の染色体の異常（例えば、遺伝子増幅）は、以前から、悪性腫瘍の早期あるいは段階特性に結びつけられており、また、このような転座及び他の異常を検出し描写する能力は、本発明の方法によってかなり増進されるため、本発明の方法を用いる悪性腫瘍の早期発見及び分類の能力には大きな恩恵がある。さらに、本発明の方法を用いることで、特定の悪性腫瘍と繰り返して関連づけられるさらに新しい染色体特性の異常（例えば、転座）に関する知識の確立が可能であり、その結果、このような転座に対する包括的なガイドの提供が可能となる。さらに、このような再発性的な異常に関する知識は、遺伝子を活性化される、あるいは非活性化されることによって悪性の過程に関連がある遺伝子の分離につながるかもしれない。このようなことを考慮すると、この例と前記例２とに用いられた発蛍光団は、（表３にリストアップされ図７a-c に示されたように）全体として、480−730 ナノメートルの範囲で発光することに気付くことは重要である。なぜなら、DAPI は、このスペクトル範囲のかなり下にある青色で発光するため、対比染色に DA PI を同時に用いることが可能であるからである。したがって、図１０a-b、１１a-b、１２及び１３に示されるように、同一の染色体スプレッドを、従来の単色Ｒバンディング・アプローチと、本発明の多色アプローチによって同時に観察可能である。測定スペクトル範囲を青色に制限することによって、スペクトラキューブ・システムにより、従来の D API Ｒバンディング画像が提供可能であることは明らかである。したがって、比較の目的で、単一染色体スプレッドは、DAPI Ｒバンドの核型あるいはカラー核型として、スペクトラキューブ・システム及び本発明の方法を用いて視検されてもよい。このため、染色体の転座による事象が本発明の方法によって研究されるとき、DAPI Ｒバンドの核型は、さらなる情報を提供し、正確にどの特定の染色体のどの領域（すなわち、バンド）が特定の転座事象に関連しているかを指摘することが可能である。例４：さらなる FISH の応用上記の説明から、次のことが明らかである。（１）数種類のプローブが FISH に使用可能である。これらには、遺伝子座特定プローブ、染色体ペイント及びゲノム全体が含まれる。（２）分析される染色体は、細胞分裂、有糸分裂あるいは減数分裂中であってもよい。（３）すべてのタイプのプローブが、多数、染色体に同時に交雑されてもよい。また、プローブの各々が幾分異なるスペクトルを持つという条件で、本発明の方法に従って用いられるスペクトラキューブ・システムは、スペクトル的にプローブの各々を検出し、スペクトルの各々を表すピクセルに RGB 色（すなわち、擬似色）あるいは所定の人工色を当てることによってその立体的な構成を明らかにすることが可能である。したがって、例えば、もし本発明の方法が、新たに単離された遺伝子（あるいは他のＤＮＡ連鎖）をマップするために用いられるのなら、染色体バンドへ遺伝子をマップするのに単一の手法が用いられ得る。この目的に対して、二つの新たな遺伝子に対して例示する。まず、２６の異なるプローブ、２４の染色体ペイント及び二つの遺伝子座特定プローブ（すなわち、蛍光的にラベル付けされた新たに単離された遺伝子）が準備される。次に、プローブは、混ぜられ、好ましくは、DAPI 対比染色された有糸分裂の染色体に同時に交雑される。その結果は、２４（男性の場合、あるいは女性の場合２３）色の核型であり、図９b で示すものに類似している。さらに異なる二つの色が着いた二つの遺伝子座特性信号（遺伝子座特定プローブに分類された点）は、新たに単離された遺伝子の染色体の位置を示す。これらは、次に、上記に説明されたように、Ｒバンド画像を生成することによって、特定の染色体バンドと関連づけられる。多くの場合、遺伝子座特定プローブが、一つの染色体バンドにマップされることはほとんどなく、どれが近位あるいは遠位であるのかは未だに確立されていない。各々が異なる RGB あるいは人工色として現われるように、少数のプローブの各々を同時に検出するために本発明の方法を用いることは、多く場合、密接にマップされた連鎖の相対的な構成を決定することを可能にする。スペクトラキューブ・システム及び本発明の方法は、細胞分裂間期染色体の三次元配置を検出するために用いられてもよい。図８a 及び９a を再び参照する。右上角に示された（NI と記された）ものは、上記表４にリストアップされた染色体ペイントで交雑された細胞分裂間期中の核である。この核のカラー・パターンの観察から、独特な特徴が明らかになる。例えば、（赤色の）染色体２の対の両方が核の低い部分に位置しており、（紫色の）染色体６の対は共にその反対側の極に位置していることが分かる。細胞分裂間期中にある染色体組織については、未だに分からないことが多いが、悪性細胞においては、細胞分裂間期中に染色体組織に変化が起こるのではないかと推測できる。したがって、本発明の方法は、種々の悪性腫瘍の早期発見を行う、悪性の病気の段階を定義する、また、それゆえに、診察患者等への治療をより適切に行えるという点で、大変価値が高いものである。本発明の方法に組み合わされたスペクトラキューブ・システム及び三次元再構築手段（例えば、共焦点顕微鏡）は、細胞分裂間期中の染色体組織の三次元情報を引き出すために用いられることが分かる。多くのがん及び遺伝子障害は、染色体欠失、転座、他の転位及び大きな異常（例えば、遺伝子増幅）から起こる。上記例３に説明されたように、本発明の方法を用いることによって、このような異常を検出する能力が向上される。さらに、上記に説明されたように、本発明の方法は、比較ゲノム・ハイブリダイゼーション（CGH）及び逆染色体彩色に非常に適していることが明らかである。一般的な染色体異常の一つが、ダウン症候群と結び付けられる。ダウン症が染色体２１の三染色体性が原因で生じることはかなり以前に確立されている。より注意深く観察することによって、染色体２１（２１ｑ２２）の特定の領域が、この一般的な徴候に常に関連づけられる（すなわち、三染色体として現われる）。しかし、従来のＧあるいはＲバンディングによる核型作成技術によって測定されたダウン症の人の核型が見かけ上正常である場合がある。この現象への説明として、これらの場合の三染色体性は、２ｑ２２染色体領域からの分裂片に見られるが、この分裂片は、従来のバンディング技術の解像度以下に小さなものであるためとするものが広く受け入れられている。しかし、本発明の方法と組み合わされたスペクトラキューブ・システムを用いることによって、これまで検出不可能であった（例えば、絨毛膜絨毛を介しての試料採取で得られた）胚芽細胞内の染色体２１の三染色体が検出可能であり、この危険性が高い女性たちへの、知識に基づいた遺伝子カウンセリングが可能になる。染色体１３及び染色体１８あるいはその分裂片が、極めて異常な子供の出生を引き起こす三染色体を生じるという報告もあるが、本発明の方法は、これらの破壊的な染色体１３あるいは１８の三染色体性の胎児期の診断のために同様に適用され得るということにも注意すべきである。急速に発展している、妊娠女性の血液から胚芽細胞を分離する技術と組み合わされた本発明の方法は、染色体２１の三染色体性及び他の頻度の少ない染色体異常を検出するのに危険性が少ない、胎児期の核型作成に対して非常に価値が高いものである。染色体末端小粒特定プローブと組み合わせてスペクトラキューブ・システム及び本発明の方法を用いることによって、末端小粒（人間の男性に４８、女性に４６）の各々は、異なる色に現われるため、調べられる種におけるすべての末端小粒の比較研究を可能にする。進化論的に関連のある種の研究及びモデル・システム（例えば、人間に対するモデル・システムとしてのねずみ）の研究においては、多く場合、二つ以上の種の染色体が連鎖相似性に従って整列されて染色体を媒介とする遺伝子情報が見い出される比較ゲノム・マップを得ることが要求される。本発明の方法を用いることは、このような比較マップを得ることを容易にする。例えば、人間とねずみとの染色体比較マップを構築することを考察する。この目的のために、一つの種の染色体ペイントの完全なセット（例えば、人間のもの）が他の種の（この例ではねずみの）染色体スプレッドに同時に交雑され、上記に説明されたように分析される。結果は、人間の染色体ペイントで彩色された、ねずみの核型の画像が得られる。したがって、この二つの種の核型間での位置合わせが可能である。 FISH に対する多くの他の用途がこの技術の文献に述べられている。一つの例は、遺伝子表現の研究である。同期細胞培養から周期的に得られる細胞分裂間期の核で交雑された遺伝子座特定プローブを用いることによって、再現の度合いを測定することができ（すなわち、複製されない遺伝子は二つの点として現れるが、複製された遺伝子は四つの点として現れる）、決まって、早い時期に複製する遺伝子が、遅く複製する遺伝子よりも測定細胞内に表現される。本発明の方法は、各々が僅かに異なるスペクトルを持つ多数のプローブが、一回の交雑で同時に分析された後に一回の結像ステップによってすべて測定される、このタイプの分析に非常に適している。事実、本発明の方法は、これまでに述べられた、あるいはこれから現れるいかなる FISH の用途に対しても使用可能である。本発明は、限られた数の実施例に関して説明されたが、本発明について多くの変形、改良及び他の適用が行なわれ得ることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダークジーソエンクセンアメリカ合衆国、カリフォルニア 92008、カールスバッド、チェシャイア 3638 (72)発明者ニルカチールイスラエル国、ギバトエラー 23800、ハガリル３ (72)発明者デービッドワインイスラエル国、ティムラート23840、ハーロン15 (72)発明者モーシェラビイスラエル国、キルヤートチャイム 26254、ハキブチム２

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）スペクトル的に映像化される試料を準備するステップ、（ｂ）結像分光計に光学的に繋がれた光学装置を通して前記試料を視検するステップ、なお、前記光学装置及び前記結像分光計は、（ｉ）コリメーター光学系を用いて前記試料のすべてのピクセルから同時に入射光を集め、（ｉｉ）この平行入射光を複数の要素を持つ干渉計システムを介して通過させることで、まず前記光が二つのコヒーレント光線へ分割され前記干渉計内の各々異なる方向へ移動してから、前記二つのコヒーレント光線が再び結合し互いに干渉し射出光線を形成し、（iii）検出器要素の二次元アレイを持つ検出器上に前記射出光線を集束させる焦点調節光学系を介して前記射出光線を通過させることで、測定の全持続時間に渡る各瞬間において、前記検出器要素の各々が前記試料の一つの常に同じピクセルの画像をもたらし、前記試料の実像は検出アレイの平面上に動かず、測定中のいかなる時においても前記画像は明確に認識可能であり、前記検出器要素の各々は、異なる波長で前記ピクセルによって発光される光輝度の特定の一次結合である信号を生成するが、この一次結合は瞬間的な光路差の関数であり、（ｉｖ）前記干渉計システムの前記要素の一つあるいはいくつかを回転させるあるいは移動させることで、前記干渉計システムによって生成された前記二つのコヒーレント光線間の前記光路差が前記試料の前記ピクセルのすべてに対して同時に走査され、（ｖ）第一のスペクトル・キューブのデータを形成するために、記録装置を用いて前記検出器要素の各々の信号を時間の関数として記録することによって、前記試料の各ピクセルのスペクトルを得るためのもので、（ｃ）数学的アルゴリズムを用いて前記第一のスペクトル・キューブのデータを解釈するステップからなる高立体解像度及び高スペクトル解像度を特徴とするスペクトル生体結像方法。２．（ｄ）前記解釈されたスペクトル・キューブのデータをマップし表示するステップからなる請求項１に記載の方法。３．前記光学装置が蛍光顕微鏡である請求項１に記載の方法。４．前記平行光は、前記試料から発光される蛍光である請求項１に記載の方法。５．前記試料から発光された前記平行光は、投与されたプローブ蛍光である請求項４に記載の方法。６．前記光は、レーザー、白色光、フィルターを介した光、紫外光及び小さな波長範囲を持つ光からなるグループから選択された光源から生じる請求項１に記載の方法。７．前記光は多数の光源から生じ、これら光源は同時に作動する請求項１に記載の方法。８．前記光は多数の光源から生じ、これら光源は連続的に作動する請求項１に記載の方法。９．前記二次元アレイは、ビデオ・レート CCD 、冷却高ダイナミック・レンジ CCD、増感 CCD 及び時間ゲート増感 CCD からなるグループから選択される請求項１に記載の方法。１０．前記試料は、分裂間期の細胞、有糸分裂中の細胞及び減数分裂中の細胞からなるグループから選択される請求項１に記載の方法。１１．前記細胞は人間からのものである請求項１０に記載の方法。１２．前記細胞は、がん細胞、血液細胞、胎児の細胞及び悪性腫瘍の細胞からなるグループから選択される請求項１０に記載の方法。１３．前記試料が細胞であり、前記光はプローブによって誘発され、このプローブは特定の細胞構成要素に結びつき、前記方法は、前記細胞構成要素の存在あるいはレベルを検出するためにある請求項１に記載の方法。１４．前記プローブは共役蛍光部分を含み、前記誘発はこの蛍光部分の蛍光発光である請求項１３に記載の方法。１５．前記プローブがさらに核酸分子を含み、前記方法は、細胞における、この核酸分子と交雑する核酸の存在あるいはレベルを検出するためにある請求項１４に記載の方法。１６．前記細胞の核酸は、デオキシリボ核酸及びリボ核酸からなるグループから選択される請求項１５に記載の方法。１７．前記蛍光部分は、スペクトラム・オレンジ、スペクトラム・グリーン、アクア、テキサス・レッド、 FITC 、ローダミン、フルオレセイン、カスケード・ブルー及びそれらの組合せからなるグループから選択される請求項１４に記載の方法。１８．前記数学的アルゴリズムは、前記試料における前記ピクセルの各々の前記スペクトルのポイント演算分析である請求項１に記載の方法。１９．前記ポイント演算分析は、前記試料における前記ピクセルの各々の前記スペクトルを、変換関数に従ってスカラーへマップすることを含む請求項１８に記載の方法。２０．前記ポイント演算分析は、前記試料における前記ピクセルの各々の前記スペクトルを、変換関数に従ってもう一つのスペクトルへマップすることを含む請求項１８に記載の方法。２１．前記数学的アルゴリズムが形態学的分析である請求項１に記載の方法。２２．前記数学的アルゴリズムは、前記試料における前記ピクセルの各々に対して、基準スペクトルからのスペクトル差を計算する相似性マッピング分析である請求項１に記載の方法。２３．前記相似性マッピング分析は、明るいピクセルが小さなスペクトル差に対応し暗いピクセルが大きなスペクトル差に対応するグレースケール画像あるいは擬似色画像を生成する請求項２２に記載の方法。２４．前記相似性マッピング分析は、明るいピクセルが大きなスペクトル差に対応し暗いピクセルが小さなスペクトル差に対応するグレースケールの画像あるいは擬似色画像を生成する請求項２２に記載の方法。２５．前記スペクトル差は、前記ピクセルの各々の前記スペクトルと前記基準スペクトルとの間の差の絶対値の、予め定められた波長範囲に対する不定積分として定義されたスカラーである請求項２２に記載の方法。２６．前記数学的アルゴリズムは、前記ピクセルの各々の前記スペクトルに対して、複数の基準スペクトルからのスペクトル差を計算する分類マッピング分析である請求項１に記載の方法。２７．前記分類マッピング分析は、前記複数の基準スペクトルの一つに対して所定最大スペクトル差を持つピクセルのグループが、所定の人工色で着色された多色画像を生成する請求項２６に記載の方法。２８．前記スペクトル差は、前記ピクセルの各々の前記スペクトルと前記複数の基準スペクトルの一つとの間の差の絶対値の、予め定められた波長範囲に対する不定積分として定義されるスカラーである請求項２６に記載の方法。２９．前記数学的アルゴリズムが主要構成要素を分析する請求項１に記載の方法。３０．前記主要構成要素分析は、（ａ）多数の波長が用いられたときには励起源の波長を含めて、全ての前記ピクセル及び前記測定の前記波長に対する共変マトリクスを構築すること、（ｂ）前記共変マトリクスを対角化し、独立直交スペクトル基底要素のすべてを見いだすこと、（ｃ）前記基底要素あるいはそれらの組合せのいずれが前記試料の特定の特徴にタグをつけるかを見いだすことを含む請求項２９に記載の方法。３１．前記数学的アルゴリズムが一次結合分析である請求項１に記載の方法。３２．前記一次結合分析は、前記第一のスペクトル・キューブのデータ及び第二のスペクトル・キューブのデータに属する対応する対のピクセルの対応する波長の間に算術関数を適用し、その結果として第三のスペクトル・キューブのデータを得ることを含む請求項３１に記載の方法。３３．前記一次結合分析は、二つのスペクトル・キューブのデータの平均化、時間変化のフォローアップ及びスペクトルの正規化からなるグループから選択される目的を満たす請求項３１に記載の方法。３４．前記一次結合分析は、算術関数によって、前記ピクセルの各々の前記スペクトルの各波長に任意のスカラーを適用することを含み、この関数は、加法、減法、乗法、除法及びそれらの組合せからなるグループから選択される請求項３１に記載の方法。３５．前記一次結合分析は、前記試料の背景領域に位置するピクセルのスペクトルが、前記試料の前記ピクセルの前記スペクトルから引き算される背景除去を行うものである請求項３１に記載の方法。３６．前記一次結合分析は較正方法のためにあり、この較正方法においては、前記試料を視検する以前に測定されたスペクトルが、前記試料の前記ピクセルの前記スペクトルを割るために用いられる請求項３１に記載の方法。３７．前記数学的アルゴリズムが光学密度分析である請求項１に記載の方法。３８．前記光学密度分析は、解釈された光学密度マップの画像を得るためにある請求項３７に記載の方法。３９．前記数学的アルゴリズムは、予め定められた波長範囲を用いて、赤、緑、青のカラー画像を計算する請求項１に記載の方法。４０．前記赤、緑、青のカラー画像がコントラスト延伸アルゴリズムによって修正される請求項３９に記載の方法。４１．前記数学的アルゴリズムは、前記ピクセルの前記スペクトルの各々について二つの異なる波長における輝度間の比を計算する請求項１に記載の方法。４２．前記数学的アルゴリズムは、前記ピクセルの前記スペクトルの各々について二つの異なる波長における輝度間の比を計算し、この計算された比に従って前記ピクセルの各々を、より明るいあるいはより暗い人工色で彩色する請求項１に記載の方法。４３．前記方法は、前記試料へ投与された多数の発蛍光団のスペクトルを識別するためにある請求項１に記載の方法。４４．（ａ）少なくとも一つの核酸プローブで交雑される染色体を持つ細胞核を提供するステップ、なお、これら少なくとも一つの核酸プローブは、各々、少なくとも一つの発蛍光団でラベル付けされる少なくとも一つの核酸分子を含み、（ｂ）結像分光計に光学的に繋がれた蛍光顕微鏡を介して前記細胞核を視検するステップ、なお、これら蛍光顕微鏡及び結像分光計は、（ｉ）コリメーター光学系を用いて前記細胞核のすべてのピクセルから同時に入射光を集め、（ｉｉ）複数の要素を持つ干渉計システムを介して前記平行入射光を通すことによって、前記光がまず二つのコヒーレント光線に分けられ、前記干渉計内の各々異なる方向に移動し、それからこれら二つのコヒーレント光線は、再び結合し各々他と干渉して射出光線を形成し、（iii）検出器要素の二次元アレイを持つ検出器に前記射出光線を集束させる焦点調節光学系を介して前記射出光線を通過させることによって、測定の全持続時間に渡る各瞬間において、前記検出器要素の各々が、前記細胞核の一つの常に同じピクセルの画像をもたらすため、前記細胞核の実像は検出アレイの平面上にあって動かず、測定中のどの時間においても画像は明確に識別可能であり、また、前記検出器要素の各々は、異なる波長で前記ピクセルによって発光される光輝度の特定の一次結合である信号を生成するが、この一次結合は瞬間的な光路差の関数であり、（ｉｖ）前記干渉計システムの前記要素の一つあるいはいくつかを回転あるいは移動することによって、前記細胞核のすべての前記ピクセルに対する、前記干渉計システムによって生成された前記二つのコヒーレント光線間の前記光路差が同時に走査され、（ｖ）第一のスペクトル・キューブのデータを形成するために記録装置を用いて、前記検出器要素の各々の信号を時間の関数として記録することによって、前記細胞核の各ピクセルのスペクトルを得るためのものであって、さらに、（ｃ）数学的アルゴリズムを用いて前記第一のスペクトル・キューブのデータを解釈するステップからなる蛍光 DNA ハイブリダイゼーション方法。４５．前記少なくとも一つの核酸分子は、少なくとも一つの遺伝子座、少なくとも染色体の一つの分裂片、インサートを含む少なくとも一つの酵母人工染色体、インサートを含む少なくとも一つのプラスミド、インサートを含む少なくとも一つのコスミド、インサートを含む少なくとも一つのファゲミド、インサートを含む少なくとも一つのウイルス・ベクター、一つの核種の完全なゲノム、がん組織の完全なゲノム及びそれらの組合せからなるグループから選択される請求項４４に記載の方法。４６．前記少なくとも一つの発蛍光団は、少なくとも一つの蛍光性組み合わせ染料である請求項４４に記載の方法。４７．前記細胞核は、分裂間期中の細胞核、有糸分裂中の細胞核及び減数分裂中の細胞核からなるグループから選択される請求項４４に記載の方法。４８．核酸プローブの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２４より大きい数からなる数のグループから選択され、前記プローブの各々は、異なる発蛍光団あるいは前記発蛍光団の異なる組合せを含む請求項４４に記載の方法。４９．前記染色体が、細胞分裂間期の染色体、有糸分裂中の染色体及び減数分裂中の染色体からなるグループから選択される請求項４４に記載の方法。５０．前記数学的アルゴリズムが、前記細胞核における前記ピクセルの各々の前記スペクトルのポイント演算分析である請求項４４に記載の方法。５１．前記ポイント演算分析は、変換関数に従って、前記細胞核における前記ピクセルの各々の前記スペクトルをスカラーへマップすることを含む請求項５０に記載の方法。５２．前記ポイント演算分析は、変換関数に従って、前記細胞核における前記ピクセルの各々の前記スペクトルをもう一つのスペクトルへマップすることを含む請求項５０に記載の方法。５３．前記数学的アルゴリズムは形態学的分析であり、前記形態学的分析は前記細胞核内の前記染色体の相対的な大きさを測定する請求項４４に記載の方法。５４．前記数学的アルゴリズムは、前記ピクセルの各々の前記スペクトルについて少なくとも一つの基準スペクトルからのスペクトル差を計算する分類マッピング分析である請求項４４に記載の方法。５５．前記分類マッピング分析は、前記複数の基準スペクトルの一つからの所定最大スペクトル差を持つピクセルのグループが所定人工色で彩色される多色画像を生成する請求項５４に記載の方法。５６．前記スペクトル差は、前記ピクセルの各々の前記スペクトルと前記複数の基準スペクトルの一つとの間の差の絶対値の予め定められた波長範囲に対する不定積分として定義されるスカラーである請求項５５に記載の方法。５７．前記数学的アルゴリズムが主要構成要素分析である請求項４４に記載の方法。５８．前記主要構成要素分析は、（ａ）多数の波長が用いられるときは励起源の波長をも含めて、全ての前記ピクセル及び前記測定の前記波長に対する共変マトリクスを形成すること、（ｂ）前記共変マトリクスを対角化し、独立直交スペクトル基底要素のすべてを見いだすこと、（ｃ）前記基底要素あるいはそれらの組合せのいずれが、前記細胞核における特定の特徴をタグするかを見いだすことを含む請求項５７に記載の方法。５９．前記数学的アルゴリズムが一次結合分析である請求項４４に記載の方法。６０．前記一次結合分析がスペクトルの正規化のためにある請求項５９に記載の方法。６１．前記一次結合分析は、算術関数によって、前記ピクセルの各々の前記スペクトルのすべての波長に任意のスカラーを適用することを含み、前記関数は、加法、減法、乗法、除法及びそれらの組合せからなるグループから選択される請求項５９に記載の方法。６２．前記一次結合分析は、前記細胞核の背景領域に位置するピクセルのスペクトルが、前記細胞核の前記ピクセルの前記スペクトルから引き算される背景除去のためにある請求項５９に記載の方法。６３．前記一次結合分析は、前記細胞核を視検する前に測定されたスペクトルが、前記細胞核の前記ピクセルの前記スペクトルを割るためにある較正方法のためのものである請求項５９に記載の方法。６４．前記数学的アルゴリズムは、予め定められた波長範囲を用いて、赤、緑、青のカラー画像を計算する請求項４４に記載の方法。６５．前記赤、緑、青のカラー画像がコントラスト延伸アルゴリズムによって修正される請求項６４に記載の方法。６６．前記数学的アルゴリズムは、前記ピクセルの前記スペクトルの各々について、異なる二つの波長における輝度の間の比を計算する請求項４４に記載の方法。６７．前記数学的アルゴリズムは、前記ピクセルの前記スペクトルの各々について、異なる二つの波長における輝度の間の比を計算し、この計算された比に従って、前記ピクセルの各々をより明るいあるいはより暗い人工色で彩色する請求項４４に記載の方法。６８．前記方法は、胎児の細胞のカラー核型、白血球のカラー核型、悪性細胞のカラー核型及び悪性腫瘍の検査が行われる細胞のカラー核型を提供することからなるグループから選択される用途のためにある請求項４４に記載の方法。６９．前記胎児の細胞は、妊娠女性の末梢血液から単離された絨毛膜絨毛細胞及び胎児細胞からなるグループから選択される請求項６８に記載の方法。７０．前記方法は、人間の染色体２１、人間の染色体バンド２１ｑ２２、人間の染色体バンド２１ｑ２２の分裂片、人間の染色体１８、人間の染色体１８の分裂片、人間の染色体１３及び人間の染色体１３の分裂片からなるグループから選択された遺伝物質の三染色体を検出するためにある請求項６９に記載の方法。７１．悪性腫瘍の検査が行われた前記細胞の前記カラー核型を提供することは、カラーの転座マップを得るためである請求項６８に記載の方法。７２．前記悪性細胞の前記カラー核型を提供することは、カラーの転座マップを得るためである請求項６８に記載の方法。