JP2002521066A

JP2002521066A - 蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを行うための方法および組成物

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Publication number: JP2002521066A
Application number: JP2000562555A
Authority: JP
Inventors: イリットバー−アム，; キャシージャニッシュ，; ユバルガリニ，; ダリオカビブ，; ロバート，エー．バックワルド，
Original assignee: アプライドスペクトラルイメイジングリミテッド
Priority date: 1998-07-27
Filing date: 1999-07-23
Publication date: 2002-07-16
Also published as: EP1100965A4; EP1100965A1; WO2000006773A1; IL140973A0; US6043039A; AU5123599A

Abstract

(57)【要約】（ａ）１つの種の染色体展開物を得る工程；（ｂ）多数の染色体ペイントを含有するハイブリダイゼーション組成物を調製する工程であって、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の平均比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントはそれぞれが異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識される工程；（ｃ）前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前記ハイブリダイゼーション組成物における前記高頻度反復配列の少なくとも一部を再アニーリングさせるが、前記ハイブリダイゼーション組成物における前記ユニーク配列の少なくとも一部が一本鎖のままである条件に前記ハイブリダイゼーション組成物を供する工程；（ｄ）前記ハイブリダイゼーション組成物をハイブリダイゼーション条件のもとで前記染色体展開物と接触させる工程；（ｅ）過剰な前記ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工程；および（ｆ）前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開物を分析して、その像を示す工程を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野および背景）本発明は、一般には、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションによる核型
決定に関する。より詳しくは、本発明は、加えられた未標識の高頻度反復ＤＮＡ
（Ｃｏｔ−Ｉ画分など）を含まず、そして必要に応じて、変性、および細胞サン
プルにおけるＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを最大に
し、それによって、用いられるプローブの濃度を少なくとも約１０分の１〜２０
０分の１に低下させることができるように設計されている染色体ペイントのハイ
ブリダイゼーション組成物を使用する蛍光インサイチューハイブリダイゼーショ
ンを行うための方法および組成物に関する。

【０００２】ヒトなどの高等生物のゲノムには、すべての染色体にわたって分布する反復配
列が大きな割合で含まれている。Ｃｏｔ曲線によって示されるように、ヒトのゲ
ノムは、大まかには下記の配列に分類することができる：（ｉ）高頻度反復配列
（これはまた、再会合に対する高速成分または第１部分として知られている）、
すなわち、Ｃｏｔ−Ｉ部分（Ｃｏｔ＝約１０^−４Ｍ・ｓｅｃ〜約２・１０^−２Ｍ
・ｓｅｃ、Ｃｏｔ_１／２＝約１．３・１０^−３Ｍ・ｓｅｃ）、例えば、Ａｌｕ配
列およびＡｌｕ様配列、ＬＩＮＥ１配列およびＬＩＮＥ２配列、αサテライト配
列、βサテライト配列、古典的なサテライト配列などであるが、これらに限定さ
れない；（ｉｉ）中頻度反復配列（これはまた、中間成分として知られている）
（Ｃｏｔ＝約２・１０^−１Ｍ・ｓｅｃ〜約１０^２Ｍ・ｓｅｃ、Ｃｏｔ_１／２＝約
１．９Ｍ・ｓｅｃ）、例えば、リボソームＤＮＡなどであるが、これに限定され
ない；および（ｉｉｉ）低頻度反復のユニーク配列（これはまた、再生に対する
遅速度成分または最終画分として知られている）（Ｃｏｔ＝約１０^２Ｍ・ｓｅｃ
〜約１０^４Ｍ・ｓｅｃ、Ｃｏｔ_１／２＝約６．３・１０^２Ｍ・ｓｅｃ）、例えば
、遺伝子コード配列などであるが、これに限定されない。ヒトゲノムのこれらの
部分に関してさらに詳しいことは、例えば、遺伝子Ｖ（ＢｅｎｊａｍｉｎＬｅ
ｗｉｎ、Ｏｘｆｏｒｄ大学出版（１９９４）、６６０頁〜６７５頁）に記載され
ている（これは、本明細書中に十分に示されるかのように参考として援用される
）。

【０００３】従って、染色体ペイントなどの反復配列を含むプローブを、染色体展開物など
の反復配列を同様に含む標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせる場合には、
プローブに由来する標識された反復配列と標的ＤＮＡにおける反復配列とのハイ
ブリダイゼーションを制限するか、またはそのようなハイブリダイゼーションを
低下させるための方策を取らなければならない。

【０００４】このような方策には、下記の１つまたは複数が含まれ得る：（ｉ）反復配列の
プローブからの除去；（ｉｉ）未標識の反復配列を過剰にプローブ組成物に加え
ることによってプローブの反復配列をブロッキングして、実質的に反復配列のみ
を、典型的にはハイブリダイゼーション時間の制限によってハイブリダイゼーシ
ョンさせるアニーリング条件を提供すること；および／または（ｉｉｉ）ハイブ
リダイゼーション操作中に未標識の反復配列を過剰に標的ＤＮＡに加えることに
よって標的ＤＮＡの反復配列をブロッキングすること。蛍光インサイチューハイ
ブリダイゼーションを考えた場合、プローブの反復配列をブロッキングすること
が、現在、最も良好な結果をもたらす最善の方法として受け入れられている。

【０００５】しかし、このような方法はすべて、多くの時間を要するさらなる工程を必要と
し、良好な結果を得るためには非常に正確に行わなければならない。

【０００６】蛍光性色素（すなわち、蛍光プローブ、蛍光基、蛍光色素）は、組織および細
胞を分析するための最も強力で汎用的なツールの１つである。従って、蛍光顕微
鏡検査は、光学顕微鏡検査において使用される最も重要な実験法の１つである［
Ｌａｋｏｗｉｃｚ（１９８３）、蛍光顕微鏡検査の原理、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅ
ｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｌｏｎｄｏｎ］。

【０００７】蛍光プローブの能力は、主に、特定の色素を結合させることができる非常に多
様な生物学的構造による［Ｗａｇｇｏｎｅｒ（１９８６）、生物医科学における
蛍光の応用、Ｔａｙｌｏｒ他編、ＮｅｗＹｏｒｋ；ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，
Ｉｎｃ．、３頁〜２８頁］。蛍光プローブの詳細な総説については、Ｍａｓｏｎ
編（１９９３）、生物学的活性に対する蛍光プローブおよび発光プローブ（生物
学技術シリーズ、Ｓａｔｔｅｌｌｅ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍ
ｉｔｅｄ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ＰｌｏｅｍおよびＴａｎｋｅ（１９８７）、蛍光顕
微鏡検査入門（Ｏｘｆｏｒｄ大学出版、王立顕微鏡検査学会）を参照のこと。

【０００８】より洗練された新しい蛍光性色素分子の迅速な開発により、これらの色素の潜
在的能力を十分に利用し得るより進んだ蛍光画像化技術が必要とされ続けている
。蛍光性色素が有し、そして研究が現在行われているように、蛍光性色素が有し
続けている画期的な影響の議論については、Ｔａｙｌｏｒ他（１９９２）、光学
顕微鏡検査の新展開（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｃｉｅｎｔｉｓｔ、第８０巻、３２
２頁〜３３５頁）を参照のこと。

【０００９】多数の蛍光プローブを検出することが特に好都合であり得る重要な例は、遺伝
子を染色体レベルで分析して、遺伝子／染色体の増幅、欠失、転座、再編成、な
らびに遺伝子および／または染色体に関連する他の異常などの起こり得る遺伝子
的欠陥を見出すＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）［Ｅｍ
ａｎｕｅｌ（１９９３）、ＧｒｏｗｔｈＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＨｏｒｍ
ｏｎｅｓ、９、６頁〜１２頁］である。

【００１０】多くのガンおよび先天的欠損症を含むいくつかの疾患および異常は、１つまた
は複数の遺伝子における欠陥（すなわち、変異）によって引き起こされる遺伝子
的異常である。多くの他の疾患が、遺伝子成分（１つまたは複数）を有すること
が知られ、あるいは遺伝子成分（１つまたは複数）を有すると考えられている。
すなわち、疾患を単独では引き起こさず、疾患に寄与するか、あるいは生涯の後
期に発病させる可能性、多因性疾患および遺伝子的素因としてこの分野で知られ
ている現象を増大させる遺伝子的欠陥（１つまたは複数）が存在する。

【００１１】認識可能な遺伝子的欠陥を知られている疾患と相関させることにより、医師は
、最終的な診断を下すことができ、多くの疾患を初期に検出して処置することが
できる。遺伝子カウンセリングは、潜在的に重大な医学的問題が将来生じる可能
性が予想される親およびその危険性を有する個体に警告し、適切な介入を可能に
する。

【００１２】８，０００を超える遺伝子的異常が現在同定されており、その多くは多数の遺
伝子的欠陥を伴っている。染色体が遺伝情報のキャリアであるということが発見
された後、科学者は、特定の異常に関わる染色体における認識可能な欠陥を明ら
かにできると推論した。

【００１３】１９６０年代に、染色技術が、中期染色体展開物を顕微鏡検査に基づいて分類
するために開発された。数十年間にわたって、染色体のバンド形成パターンの肉
眼による分析が、ヒトの遺伝子的異常を、中期染色体において認められる構造的
異常と相関させるために使用されている。染色体は、典型的には、ギームザ染色
（Ｇバンド形成）後の明視野の顕微鏡検査によって、あるいは蛍光染色（Ｒバン
ド形成）後の蛍光顕微鏡検査によって調べられ、特徴的な明バンドおよび暗バン
ドがその長さに沿って明らかにされる。患者のバンド形成パターンを正常な染色
体のバンド形成パターンと注意深く比較することによって、転座（染色体間また
は染色体内における遺伝物質の交換）、欠失（染色体（１つまたは複数）または
そのフラグメント（１つまたは複数）の喪失）、付加、逆位、ならびに奇形およ
び遺伝子疾患をもたらす他の欠陥などの異常を明らかにすることができる。しか
し、従来の染色体バンド形成技術では分解に限界がある。

【００１４】蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は数多くの相補的技
術の改善により過去２５年間にわたって進化している。その進歩は、遺伝子の正
確な位置を染色体上にマッピングするためのより良好な道具を開発するために、
そして染色体の全体的な染色によって認識できない非常に小さい遺伝子的欠陥を
検出するために細胞遺伝学者の要望によって進められている。

【００１５】すべてのヒト遺伝子を同定してマッピングする果敢な第一歩であるヒトゲノム
プロジェクト（ＨＧＰ）により、ＦＩＳＨが注目され、多く必要とされるＤＮＡ
プローブの開発が急務となっている。現在のＦＩＳＨ技術もまた、強力な免疫学
的プローブ、顕微鏡検査および分光法に必要な増大しつつある様々な優れた蛍光
性色素の同時に行われる開発、ならびに蛍光顕微鏡検査のために使用される対物
レンズ、イルミネーターおよびフィルターにおける劇的な改善によって可能にな
っている。

【００１６】ＦＩＳＨの能力および有用性は多くの要因による：（ｉ）ＦＩＳＨは、単離さ
れた染色体および核に対してだけでなく、固定されたパラフィン包埋組織切片内
の細胞全体に対しても使用できること；（ｉｉ）ＦＩＳＨにより、比較的小さい
欠陥が検出できること（より小さい欠陥を検出する能力は絶えず増大している）
；（ｉｉｉ）ＦＩＳＨにより、結果が比較的迅速に得られうること；（ｉｖ）そ
の手頃な費用により、ＦＩＳＨは大部分の診断室および研究室で使用できること
；（ｖ）様々なプローブおよび標本タイプに対する適合化が開発できること；お
よび（ｖｉ）大きな特異性および感度が得られうること；（ｖｉｉ）短時間であ
ること、場合により、２時間の範囲であること。

【００１７】多くのＦＩＳＨ適用により細胞遺伝学者に求められていることは、単に、顕微
鏡の接眼レンズを通して見て、あるいはモニター上の画像を見て、蛍光標識が存
在するか、または存在しないかどうかを明らかにすることだけである。少しより
複雑な標本の場合には、１つまたは２つの発色標識を単純に計測することが行わ
れることがある。しかし、デジタル画像を処理して、その画像から数値データを
抽出することができることは、非常に広い新しい可能性をＦＩＳＨ技術にもたら
す。

【００１８】適切な画像化方法は、非常にかすかなＦＩＳＨ像を増強することができ、その
結果、標識された染色体および遺伝子座を明確に同定することができる。容易に
達成される実験条件のもとでは、標識部位の数を自動的に計測することができる
。さらに、それぞれの標識部位における強度を測定することができ、ＤＮＡの量
を、例えば特定の遺伝子が存在するコピー数を明らかにするために計算すること
ができる。

【００１９】上記に論じられているように、ＦＩＳＨにより、標識されたプローブの位置、
各染色体における標識部位の数、および各部位における標識化強度（遺伝物質の
量）に関する情報を得ることができる。動原体（反復ＤＮＡ）プローブおよび染
色体ペイントが、標識のために、それぞれが標的化された染色体が存在するコピ
ー数を計測するために、そして構造的変化を検出するために使用される。遺伝子
座に特異的なプローブが、遺伝物質の小さな領域の位置をマッピングするために
使用される。このようなタイプのプローブは、中期染色体展開物と同様に、無傷
の間期核について使用することができ、そして肉眼的に、あるいは好適なアルゴ
リズムによって自動的に計測することができる。そのようなプローブは、染色体
および／または遺伝子における数的変化および／または構造的変化を特徴とする
遺伝子疾患を同定するために日常的に使用される。

【００２０】ＦＩＳＨを使用した場合、（例えば、フローサイトメトリーを使用して）染色
体を単離して、（例えば、超音波処理によって）物理的に、あるいは（例えば、
エンドヌクレアーゼによって）酵素的に切断し、そしてそのフラグメントのすべ
てに対する一組のプローブを作製することによって１つの特定の染色体の表面全
体を均一に標識することができる。染色体全域プローブ（これはまた、染色体ペ
イントとして知られている）により、その標的染色体の全コピーが蛍光的に標識
される。染色体をペイント化する１つの重要な適用は、いくつかのガンの初期段
階において特徴的に生じている２つの染色体間における遺伝物質の転座を検出す
ることである。しかし、他の染色体異常もまた検出可能である。

【００２１】例えば、染色体Ａが緑色ペイントで特異的に標識され、かつ染色体Ｂが赤色ペ
イントで標識された場合、ＡからＢへの遺伝物質の転座は、赤色領域に並置する
緑色領域として現れる（逆に、ＢからＡへの遺伝物質の転座は、緑色領域に並置
する赤色領域として現れる）。

【００２２】典型的には、正常な染色体から得られる染色体ペイントが、異常な（患者）染
色体に伴う構造的異常を検出するために使用される。逆の染色体ペイント化には
、異常な染色体に物質をもたらした様々な正常な染色体に由来するＤＮＡを同定
するために、異常な染色体から作製されたプローブが使用される。

【００２３】下記の実施例の節に例示されている本発明の方法により、それぞれが異なる色
で、ヒトの核型を含む２４個の異なる染色体（すなわち、ゲノム）をペイント化
することができ、そして１回のハイブリダイゼーション操作、その後の１回の短
い測定を使用して、着色されたヒト核型を同時に検出し、同定して、意味のある
ように表示することができる。

【００２４】染色体ペイントを標識するために使用される多色の蛍光性色素における著しい
改善は、少数の塩基性蛍光性色素の様々な組み合わせが用いられるコンビナトリ
アル蛍光法（例えば、コンビナトリアル標識化およびコンビナトリアルハイブリ
ダイゼーション）の導入である。コンビナトリアルハイブリダイゼーションに関
してさらに詳しいことについては、Ｒｉｅｄ他（１９９２）、コンビナトリアル
蛍光およびデジタル画像化顕微鏡検査を使用するインサイチューハイブリダイゼ
ーションによる７種の異なるＤＮＡプローブの同時可視化、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、１３８８〜１３９２；およびＲｉｅｄ（１
９９４年１月）、遺伝子診断における蛍光インサイチューハイブリダイゼーショ
ン、Ｒｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ大学理論医学部（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を
参照のこと（これらはともに、本明細書中に十分に示されているかのように参考
として援用される）。コンビナトリアル標識化に関してさらに詳しいことについ
ては、ｄｕ−Ｍａｎｏｉｒ他（１９９３）、比較ゲノムインサイチューハイブリ
ダイゼーションによる完全または部分的な染色体の獲得および喪失の検出、Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎｅｔ．、９０、５９０〜６１０；および米国特許第５，７５９，７８
１号（Ｗａｒｄ他）を参照のこと（これらはともに、本明細書中に十分に示され
ているかのように参考として援用される）。

【００２５】数多くの方法を、（染色体ペイント化を含む）ＦＩＳＨアッセイにおいて使用
されるＤＮＡプローブを標識するために利用することができる。これには、ビオ
チンまたはジゴキシゲニンなどのハプテンが、酵素的反応を使用してＤＮＡに取
り込まれる間接的な方法が含まれる。中期染色体展開物または間期核に対するハ
イブリダイゼーションの後、蛍光標識が、免疫学方法を使用することによってハ
イブリッドに結合させられる。より最近では、蛍光性色素が、中間工程を使用す
ることなく、プローブに直接取り込まれて検出される。標準的なＦＩＳＨ色素に
は、フルオレセイン、ローダミン、テキサス−レッドおよびカスケードブルーが
含まれ、多プローブＦＩＳＨ分析を、コンビナトリアル標識化としてこの分野で
知られているように種々のハプテンまたは蛍光性色素およびその組み合わせで種
々のプローブを標識することによって行うことができる。あるいは、所定のプロ
ーブ集団を、それぞれが異なる蛍光基で標識されるサブ集団に分割し、その後、
それ以外では類似するハイブリダイゼーション結果が得られるようにサブ集団を
再度分けることができる（コンビナトリアルハイブリダイゼーションとしてこの
分野で知られている方法）。両方の標識化法に従って、コンビナトリアルプロー
ブが得られる。従って、「蛍光基の組み合わせ」という用語が、本明細書中にお
いて、特に添付された請求項において使用されている場合、それは、上記に記載
されているコンビナトリアル標識化およびコンビナトリアルハイブリダイゼーシ
ョンの両方を示す。

【００２６】染色体ペイント化および核型決定、多色の染色体バンド形成および比較ゲノム
ハイブリダイゼーションのためにコンビナトリアル蛍光基を使用することが、米
国特許出願第０８／６３５，８２０号（１９９６年４月２２日出願）、米国特許
第５，７５９，７８１号（Ｗａｒｄ他）、およびＳｃｉｅｎｃｅ誌［Ｅ．Ｓｃｈ
ｒｏｅｃｋ他（１９９６）、ヒト染色体の多色分光的核型決定、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２７３、４９４〜４９７］に詳しく記載されている（これらはすべて、本明細
書中に十分に示されているかのように参考として援用される）。

【００２７】Ｓｃｉｅｎｃｅに記載されている大きな進歩は、分光的画像化によってゲノム
全体を走査することにより、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩ
ＳＨ）後のそれぞれのヒト染色体に関して規定された発光スペクトルを即座に可
視化できることである。スペクトルのコンピューター分離（分類）によって、分
光的に重なっている染色体に特異的なＤＮＡプローブが分離され、従って、すべ
てのヒト染色体が同時に同定される。

【００２８】それに記載されているこの分光的画像化法は、可視および近赤外の分光範囲に
おいてサンプルの発光スペクトルにおけるすべての点を同時に測定するために、
フーリエ分光法、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）による画像化、および光学顕微鏡
検査が一緒になっている。これにより、多数の分光的に重なるプローブの使用が
可能になる。この方法は、（多くの異なる波長で測定された画素毎における一連
の強度から同定される）異なるスペクトルの測定に基づいている。これにより、
多数の蛍光基の識別が容易になる。蛍光発色基の識別が、蛍光発色基に特異的な
少数の狭域光学フィルターを介した蛍光強度の測定に基づいている従来の表面蛍
光による顕微鏡検査［Ｓｐｅｉｃｈｅｒ他（１９９６）、ＮａｔｕｒｅＧｅｎ
ｅｔｉｃｓ、１２：３６８〜３７５を参照のこと］とは劇的に異なり、それに記
載されているように、分光的核型決定を使用することにより、発散される光のス
ペクトルに含まれる発散された光子に存在する利用可能な情報のすべてを分析に
使用することができる。

【００２９】分光的に重なっている蛍光基を識別するための分光的方法（分類）は、各蛍光
発色基の発光スペクトルの違いが測定可能で、安定している場合には非常に多く
の蛍光発色基に容易に拡大される。

【００３０】中期調製物におけるそれぞれのヒト染色体の同時同定（分光的核型決定として
示される方法）もまた報告されている。この目的に対して、流動分類されたヒト
染色体に由来するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製された染色体に
特異的な組成物ライブラリーが、５種の異なる蛍光基に結合したヌクレオチドま
たはその組み合わせで直接標識される。その後、２４個のすべての染色体を含有
する組成物プローブ集団が中期染色体に対してハイブリダイゼーションさせられ
る。染色体に特異的な標識化が抑圧的ハイブリダイゼーションによって達成され
る。詳しく記載すると、ハイブリダイゼーション組成物における反復配列は、未
標識のヒトＣｏｔ−ＩＤＮＡを過剰に加えることによってブロッキングされる。

【００３１】ハイブリダイゼーションは、ＲＧＢ表示および分類色の両方で示される。表示
色により、すべてのヒト染色体を分光的画像化の後で容易に可視化することがで
き、そして各画素における分光的測定に基づいて、染色体の分類アルゴリズムが
、すべてのヒト染色体を分光的に核型決定するために適用される。最も重要な分
析アルゴリズムの１つは、画像における多数の異なるスペクトルを分類色で同定
および強調することができる分光型分類アルゴリズムである。これにより、その
スペクトルに基づいて、特定の分類色をすべてのヒト染色体に割り当てることが
できる。このアルゴリズムは、各染色体の（参照）スペクトルが測定されて、コ
ンピューター内の参照ライブラリーに保存されていることを仮定する。区別する
ための分類色が、その与えられた画素におけるスペクトルに最も類似している参
照スペクトルに割り当てられている分類色に従って画像内の画素のそれぞれに割
り当てられる。下記の数式１で示される最小二乗誤差アルゴリズムが画素毎に計
算される：

【数１】式中、Ｉ_ｘ，ｙ（λ）は画素座標（ｘ、ｙ）における正規化スペクトルであり
、Ｉ_ｎ（λ）はそれぞれの染色体（ｎ＝１、２、・・・、２３、２４）に対する
正規化参照スペクトルを示す。すべての参照スペクトルについてＳ_{ｘ，ｙ，ｎ}の
値を計算した後、最小値が選ばれ、人為的な分類色が、最も類似する参照スペク
トルに割り当てられた分類色に従ってその画素に割り当てられる。

【００３２】染色体異常に関するスクリーニング法としての分光的核型決定の可能性を、従
来のバンド形成法または染色体ペイント化プローブによるＦＩＳＨが前もって行
われた多数の実験室から得られた臨床的サンプルを分析することによってさらに
調べた。すべての場合において、Ｇバンド形成および分光的核型決定は、結果が
一致していることが明らかにされた。いくつかの場合には、ギームザバンド形成
は、染色体異常を完全に解釈するには十分ではなかった。この場合、分光的核型
決定による染色体異常の診断を従来の二色ＦＩＳＨ分析により確認した。この報
告のために分析された最小の識別可能な異常は、相互転座が従来のバンド形成分
析では認識されなかったｔ（１；１１）（ｑ４４；ｐ１５．３）の転座であった
。この相互転座に寄与する染色体物質の起源は正しく分類された。第１染色体お
よび第１１染色体における転座セグメントは、染色体１ｑおよび染色体１１ｐに
対するサブテロメアに特異的なコスミドプローブによって確認されていた。用い
たプローブの位置に基づいて、変化の大きさは、＞１，５００ｋｂｐであると見
積もられた。別の場合には、バンド形成分析によって、第４染色体から第１２染
色体へのセグメントの転座が示唆された。分光的核型決定により、第４染色体に
由来するさらなる染色体物質の起源が明確に同定および分類された。分光的核型
決定の感度限界を測定するために、（中期染色体および前中期染色体の両方にお
いて認識できない）第１６染色体および第１７染色体が関与する極微小の転座の
場合を調べた。このｔ（１６；１７）は、コスミドプローブを用いたＦＩＳＨに
よって以前に明らかにされており、クロマチンの相互交換が約５００ｋｂｐで見
積もられた。この患者から得られた中期染色体を用いた分光的核型決定は、この
知られているｔ（１６；１７）を同定することができなかった。このことは、現
在得られるペイント化プローブを用いた中期染色体分析の感度限界は５００ｋｐ
ｂ〜１，５００ｋｂｐの間であることを示唆している。

【００３３】分光的核型決定は、従来のバンド形成分析を補完するために使用できる方法で
あることを明らかにするために、前もってＧバンド形成させた染色体に対するハ
イブリダイゼーションを行った。おそらくはＧバンド形成のために必要とされる
トリプシン消化のために、シグナル強度は、前もってＧバンド形成させなかった
中期物と比較してわずかに低下していた。シグナル強度の減少は約１０％であり
、従って、曝露時間を長くすることによって容易に補償することができる。Ｇバ
ンド形成させていない染色体と比較して、前もってＧバンド形成させた染色体の
端においてわずかに増大したノイズもまた認められた。しかし、中期物の分類は
容易に行うことができる。

【００３４】従って、上記に記載された方法により、最初に、１つの正常な核型の染色体が
、従来の染色体バンド形成技術（例えば、Ｇバンド形成またはＲバンド形成）に
よって同定される。次に、その同じ染色体は、上記に記載されているように染色
体ペイントとハイブリダイゼーションさせられる。その次に、染色体バンド形成
によって以前に決定されたように任意の染色体型（例えば、１〜２２、Ｘ、およ
びヒト男性におけるＹ）に割り当てられた画素を特徴とする平均スペクトルが計
算され、得られたスペクトル（例えば、ヒトの場合には２４個）により、参照ス
ペクトルのライブラリーが形成される。次に、参照スペクトルが、その後、新し
い核型の画素をその染色体に分類するために使用される。

【００３５】上記に記載された結果、および他による結果（例えば、Ｓｐｅｉｃｈｅｒ他（
１９９６）、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ、１２：３６８〜３７５を参照の
こと）が、染色体ペイントにおける高頻度反復配列を過剰の未標識のＣｏｔ−Ｉ
部分（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬＬｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｃｏｔｌ
ａｎｄ）でブロッキングすることによって得られた。

【００３６】ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ（ＤＥＮＨＹＢはＩｎｇｅｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ．の商標である）溶液は、試験者が開発したＤＮＡプローブまたは市販の
ＤＮＡプローブを懸濁または溶解するために使用されるように設計されている。
ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ溶液は、変性、および細胞サンプルにおけるＤＮＡプローブと
標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを最大にするように開発されている。Ｄ
ＥＮＨＹＢ^ＴＭ溶液は、直接的および間接的に標識されたＤＮＡプローブと適合
し得る。２種類のＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ溶液を、標的またはプローブの性質に依存し
てシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から入手することができる。

【００３７】ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ（カタログ番号Ｄ００１）：反復配列（サテライト）を用い
たＦＩＳＨ、ペイント化、および同様にユニーク配列プローブに対して。

【００３８】ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ（カタログ番号Ｄ００３）：ユニーク配列プローブとのＦＩ
ＳＨに推奨される。

【００３９】ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ溶液は、プローブおよび標的がともに反復配列を含むときに
ＤＮＡのブロッキングを伴う使用に推奨される。

【００４０】ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ溶液を使用することにより、特定の適用および用いられるプ
ローブに依存して、最大の検出感度を維持しながら、プローブを１０倍〜２００
倍希釈することができる。ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ溶液はまた、ハイブリダイゼーショ
ン時間を、サテライトプローブを用いた間期核および中期細胞に対するＦＩＳＨ
が達成されるように１５分までの間に短縮する。ペイントまたはユニーク配列プ
ローブを用いたＦＩＳＨの場合、約３時間〜１５時間のハイブリダイゼーション
で十分である。従って、ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ溶液の使用は費用を大きく削減する。

【００４１】従って、加えられた未標識の高頻度反復ＤＮＡ配列を有していない染色体ペイ
ントのハイブリダイゼーション組成物を使用する蛍光インサイチューハイブリダ
イゼーションに関する方法および組成物が必要なことが広く認識されており、そ
してそのような方法および組成物を得ることは非常に都合がよい。

【００４２】（発明の要旨）本発明により、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションに関する方法およ
び組成物が提供される。

【００４３】下記に記載されている本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により
、下記の工程を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法が提供される
：（ａ）１つの種の染色体展開物を得る工程；（ｂ）多数の染色体ペイントを含
有するハイブリダイゼーション組成物を調製する工程であって、前記ハイブリダ
イゼーション組成物における高頻度反復配列の平均比活性が前記ハイブリダイゼ
ーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくなるように
、前記多数の染色体ペイントはそれぞれが異なる蛍光基または蛍光基の組み合わ
せで標識される工程；（ｃ）前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前
記ハイブリダイゼーション組成物における前記高頻度反復配列の少なくとも一部
を再アニーリングさせるが、前記ハイブリダイゼーション組成物における前記ユ
ニーク配列の少なくとも一部が一本鎖のままである条件に前記ハイブリダイゼー
ション組成物を供する工程；（ｄ）前記ハイブリダイゼーション組成物をハイブ
リダイゼーション条件のもとで前記展開物と接触させる工程；（ｅ）過剰な前記
ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工程；および（ｆ）前記のそのときに
ハイブリダイゼーションした染色体展開物を分析して、その像を示す工程。

【００４４】下記に記載されている本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により
、下記の工程を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法が提供される
：（ａ）１つの種の染色体展開物を得る工程；（ｂ）未標識のＣｏｔ−Ｉを含ま
ず、かつ異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせでそれぞれが標識されている多
数の染色体ペイントを含有するハイブリダイゼーション組成物を調製する工程；
（ｃ）前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前記ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列は大部分が再アニーリングさせられるが、前
記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は大部分が一本鎖に維持
される条件に前記ハイブリダイゼーション組成物を供する工程；（ｄ）前記ハイ
ブリダイゼーション組成物をハイブリダイゼーション条件のもとで前記展開物と
接触させる工程；（ｅ）過剰な前記ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工
程；および（ｆ）前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開物を
分析して、その像を示す工程。

【００４５】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記種は
哺乳動物である。

【００４６】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記哺乳
動物はヒトである。

【００４７】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は、１個から、前記種に関して得られるすべてまでの
間の任意の数の染色体ペイントを含有する。

【００４８】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体ペイントの少なくとも１つは、染色体の特定セグメントをペイント化するため
の部分的な染色体ペイントである。

【００４９】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は過剰の未標識の中頻度反復配列をさらに含む。

【００５０】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記未標
識の中頻度反復配列はリボソームＤＮＡ配列である。

【００５１】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体展開物は任意の種のものであり、かつ前記染色体ペイントはそれとは別の種の
ものである。

【００５２】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は変性剤をさらに含む。

【００５３】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記変性
剤はホルムアミドである。

【００５４】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物はポリマーをさらに含む。記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ポリ
マーはデキストラン硫酸である。

【００５５】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は塩類をさらに含む。

【００５６】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記塩類
はＳＳＣである。

【００５７】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記平均
比活性は１００ヌクレオチドあたり１個〜２５個の蛍光基の範囲にある。

【００５８】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物における前記高頻度反復配列の少なくとも一部を再ア
ニーリングさせる前記条件は、約３２℃〜３６℃で約２時間〜４時間の範囲であ
る。

【００５９】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション条件には、前記染色体ペイントの前記ユニーク配列が前記染
色体展開物におけるその対応配列とハイブリダイゼーションするために十分な時
間にわたる約３７℃の温度が含まれる。

【００６０】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記洗浄
工程は希釈されたＳＳＣ溶液によって部分的に行われる。

【００６１】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記のそ
のときにハイブリダイゼーションした染色体展開物の分析およびその像の提示は
多バンド集光デバイスまたは分光的画像化装置によって行われる。

【００６２】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記分光
的画像化装置は干渉計を含む。

【００６３】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から得られるＰＣＲ産物を前記蛍光
基で標識することによって調製される。

【００６４】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前記蛍光基で標識することによっ
て調製される。

【００６５】下記に記載されている本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により
、多数の染色体ペイントを含むハイブリダイゼーション組成物であって、前記ハ
イブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の平均比活性が前記ハイブ
リダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくな
るように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異なる蛍光基または蛍光基の
組み合わせで標識されているハイブリダイゼーション組成物が提供される。

【００６６】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物における高頻度反復反列は大部分がアニーリングさせ
られるが、前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は大部分が
一本鎖にされる。

【００６７】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物が染色体展開物とハイブリダイゼーションさせられた
ときに、一致している染色体ペイントを有する染色体またはその一部分が標識さ
れ、そして分光的画像化装置または多バンド集光デバイスを介して分析可能であ
る。

【００６８】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は変性剤をさらに含む。

【００６９】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記変性
剤はホルムアミドである。

【００７０】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物はポリマーをさらに含む。

【００７１】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ポリ
マーデキストラン硫酸である。

【００７２】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は塩類をさらに含む。

【００７３】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記塩類
はＳＳＣである。

【００７４】下記に記載されている本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により
、多数の染色体ペイントから本質的になるハイブリダイゼーション組成物が提供
される。この場合、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列
の平均比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均
比活性と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異
なる蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識され、かつ前記ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列は大部分がアニーリングさせられるが、前記
ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は、前記ハイブリダイゼー
ション組成物が染色体展開物とハイブリダイゼーションさせられたときに、一致
している染色体ペイントを有する染色体またはその一部分が標識され、そして分
光的画像化装置または多バンド集光デバイスを介して分析可能であるようにその
大部分が一本鎖であり、かつ前記ハイブリダイゼーション組成物はさらに、変性
剤、ポリマーおよび塩類からなる。

【００７５】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から得られるＰＣＲ産物を前記蛍光
基で標識することによって調製される。

【００７６】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前記蛍光基で標識することによっ
て調製される。

【００７７】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞サンプルにおけるＤＮＡプロー
ブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを最大にし、それによって、前記多
数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約１０分の１〜２００分の１に低下させ
ることができるように設計または改変される。

【００７８】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物はＤＥＮＨＹＢ^ＴＭの名称でシグマ（Ｓｉｇｍａ）社
によって販売されている製造物を含む。

【００７９】記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記多数
の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲノムＤＮＡと比較したときに少
なく示されるように、前記組成物から少なくとも部分的に除かれる。

【００８０】本発明は、染色体ペイントを用いた未標識のＣｏｔ−Ｉを含まないインサイチ
ューハイブリダイゼーションに関する方法および組成物を提供することによって
、現在知られている形態の欠点を十分に解決する。

【００８１】本発明は、添付された図面を参照して、例としてのみ、本明細書中において記
載される。図１は、米国特許出願第０８／３９２，０１９号（先行技術）に従って組み立
てられた画像化分光装置の主要部を例示するブロック図である。図２は、米国特許出願第０８／３９２，０１９号（先行技術）による画像化分
光装置において使用されている非可動型干渉計（すなわち、Ｓａｇｎａｃ干渉計
）を例示する。図３〜図５は、本発明による方法および組成物を使用した、正常な男性の染色
体展開物との２４個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。図
３は、ＲＧＢアルゴリズムを使用して得られたＲＧＢ画像である。図４および図
５は、分類アルゴリズムを使用して得られた分類画像である。図３および図４は
元の展開物を示し、図５は核型として配置された染色体展開物を示す。図６は、選択された分光範囲を強調するための擬似ＲＧＢ（赤、緑および青）
色の定義を示す。それぞれの擬似色の強度が、曲線の１つを乗じた後、曲線の面
積を積分することによって計算される。図７ａ〜７ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像および分
類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼーショ
ン組成物にはＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡが含まれた。従って、この結果はコ
ントロールとして役立つ。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイゼー
ション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃で１時間再アニーリング
させた。ハイブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホ
ルムアミド／１ｘＳＳＣを用いた。図８ａ〜８ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像および分
類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼーショ
ン組成物にはＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡが含まれた。従って、この結果はコ
ントロールとして役立つ。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１５に希釈
した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃
で１時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は３６時間であっ
た。後洗浄には５５％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いた。図９ａ〜９ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像および分
類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼーショ
ン組成物にはＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡが含まれた。従って、この結果はコ
ントロールとして役立つ。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に希釈
した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃
で１時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は３６時間であっ
た。後洗浄には５５％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いた。図１０ａ〜１０ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイント
をＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７
５℃で７分間変性し、その後、３７℃で４時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は１４時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘ
ＳＳＣを用いた。図１１ａ〜１１ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイント
をＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７
５℃で７分間変性し、その後、３７℃で２時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は１４時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘ
ＳＳＣを用いた。図１２ａ〜１２ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイント
は希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、そ
の後、３７℃で２時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は３
６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘＳＳＣを用いた。図１３ａ〜１３ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物は、Ｃｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含み、従って、コントロール
として役立つ。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１５に希釈した。ハイ
ブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃で１時間再
アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄
には５５％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いた。図１４ａ〜１４ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物は、Ｃｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含み、従って、コントロール
として役立つ。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成
物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃で１時間再アニーリングさせた。ハ
イブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド
／１ｘＳＳＣを用いた。図１５ａ〜１５ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物は、Ｃｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含み、従って、コントロール
として役立つ。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に希釈した。ハイ
ブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃で１時間再
アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄
には５５％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いた。図１６ａ〜１６ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイント
をＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７
５℃で７分間変性し、その後、３７℃で２時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５０％ホルムアミド／２ｘ
ＳＳＣを用いた。図１７ａ〜１７ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイント
をＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７
５℃で７分間変性し、その後、３７℃で６時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘ
ＳＳＣを用いた。図１８ａ〜１８ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイント
をＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１５に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７
５℃で７分間変性し、その後、３７℃で２時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘ
ＳＳＣを用いた。図１９ａ〜１９ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物にはＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡが含まれた。従って、この結果
はコントロールとして役立つ。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１５に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３
７℃で１時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は３６時間で
あった。後洗浄には５５％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いた。図２０ａ〜２０ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイント
をＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７
５℃で７分間変性し、その後、３７℃で２時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘ
ＳＳＣを用いた。図２１ａ〜２１ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイント
は希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、そ
の後、３７℃で２時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は３
６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘＳＳＣを用いた。図２２ａ〜２２ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイント
をＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７
５℃で７分間変性し、その後、３７℃で６時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘ
ＳＳＣを用いた。図２３ａ〜２３ｄは、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のＲＧＢ、分類、ＤＡＰＩ、ならびにＲＧＢ画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はＣｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイント
をＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１５に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７
５℃で７分間変性し、その後、３７℃で２時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘ
ＳＳＣを用いた。図２４ａ〜２４ｂは、第１染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト
染色体の像を示す。図２４ｂの染色体ペイントは、Ｃｏｔ−Ｉ配列を除くために
磁気ビーズで処理されたが、図２４ａの染色体ペイントは処理しなかった。両方
の場合、長時間の再アニーリング（４時間）は、依然として利用可能な標識され
たＣｏｔ−Ｉ配列をさらに再アニーリングさせるのに役立った。図２５ａ〜２５ｂは、第５染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト
染色体の像を示す。図２５ｂの染色体ペイントは、Ｃｏｔ−Ｉ配列を除くために
磁気ビーズで処理されたが、図２５ａの染色体ペイントは処理しなかった。両方
の場合、長時間の再アニーリング（４時間）は、依然として利用可能な標識され
たＣｏｔ−Ｉ配列をさらに再アニーリングさせるのに役立った。

【００８２】（好適な実施形態の説明）本発明は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション手法において使用され
得る方法および組成物である。詳細には、本発明は、染色体異常の検出のために
使用され得る着色された（分光的）核型を得るために使用することができる。

【００８３】本発明による方法および組成物の原理および操作は、図面および記載された説
明を参照することによってより十分に理解され得る。

【００８４】本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適
用において、下記の説明で示されているか、または図面に例示されている要素の
構成および配置の細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は
、他の実施形態が可能であり、あるいは様々な方法で実行または実施され得る。
また、本明細書中において用いられている表現および用語は説明目的のためであ
って、限定として見なされるものではない。

【００８５】本発明の好ましい実施形態により、下記の工程を含む蛍光インサイチューハイ
ブリダイゼーション法が提供される。

【００８６】最初に、１つの種の染色体展開物が得られる。染色体展開物を得ることは、好
ましくは、下記の実施例１に記載されているように行われる。種は、典型的には
、ヒト（これに限定されない）などの哺乳動物である。

【００８７】次に、ハイブリダイゼーション組成物が調製される。ハイブリダイゼーション
組成物は多数の染色体ペイントを含有し、そのそれぞれは、ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列の平均比活性がハイブリダイゼーション組成
物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、異なる蛍光
基または蛍光基の組み合わせで標識される（例えば、下記の実施例１の表２を参
照のこと）。

【００８８】本発明の好ましい実施形態により、異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせに
よる標識の前あるいはその後のいずれかにおいて、多数の染色体ペイントに存在
する反復配列は、ゲノムＤＮＡと比較したときに少なく示されるように組成物か
ら少なくとも部分的に除かれる。これは、例えば、これらの配列を磁気ビーズ（
これに限定されない）などの小粒子に直接的または間接的に結合することによっ
て行うことができる。そのような小粒子は、その後で、例えば、磁気分離器で除
くことができる。この分野でよく知られているように、例えば、カラム内に配置
されているか、または遠心分離で除去可能な他の粒状物もまた考えられる。

【００８９】比活性により、標識された物質の量単位（例えば、１００ヌクレオチドのＤＮ
Ａ）あたりの標識量（例えば、蛍光基分子の数）が決定される。本発明の場合、
用いられる各染色体ペイントは、高頻度反復配列、中頻度反復配列、およびユニ
ーク配列を含む。そのそれぞれが、異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせによ
って標識される。従って、例えば、あるペイントにおける特定の蛍光基の比活性
は、１００ヌクレオチドあたりのそのような蛍光基の平均分子数として定義され
る。同様に、ハイブリダイゼーション組成物における様々なタイプ（例えば、反
復型、ユニーク型、など）のＤＮＡ（その染色体起源に関わらず）の１００ヌク
レオチドあたりのすべての蛍光基タイプの平均分子数により、ハイブリダイゼー
ション組成物における様々なタイプのＤＮＡの平均比活性が定義される。本明細
書中および請求項において使用されている表現「平均比活性」は後者の場合を示
す。高頻度反復比活性およびユニーク配列の比活性は、例えば、１００ヌクレオ
チドあたり１個〜２５個の蛍光基の範囲に含まれ得る。

【００９０】「実質的に」という用語は、例えば、高頻度反復配列が、その平均Ｇ＋Ｃヌク
レオチド含有量において、調べているゲノムにおけるユニーク配列と異なる特定
のタイプ（１つまたは複数）のヌクレオチドを標識のために使用することによる
平均比活性の可能な変動を示すために本明細書中で使用されている。

【００９１】従って、上記に既に述べられているように、本発明により、ハイブリダイゼー
ション組成物における高頻度反復配列およびユニーク配列の比活性は実質的に等
しい。

【００９２】高頻度反復配列は、Ｃｏｔ値が約１０^−４Ｍ・ｓｅｃ〜約２・１０^−２Ｍ・ｓ
ｅｃの範囲にある配列として本明細書中では定義される。ユニーク配列は、半数
体ゲノムにおいて一度現れる配列として本明細書中では定義される。高頻度反復
配列は、時間を制限した再アニーリング手法によってゲノムＤＮＡから単離する
ことができ、Ｃｏｔ−Ｉ部分として知られているＣｏｔ曲線の最初の肩に含まれ
る配列を反映している。Ｃｏｔ−Ｉ部分の市販調製物は、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｃｏｔｌａｎｄ）から入手することが
できる。典型的には、Ｃｏｔ−Ｉ部分は、上記の「背景」の節で記載されている
ように、ハイブリダイゼーション組成物に過剰に加えられ、標識された高頻度反
復配列をハイブリダイゼーション組成物中でブロッキングするために役立つ。そ
の一方で、そうすることによって、高頻度反復配列の平均比活性は実質的に０に
低下する。

【００９３】すなわち、本発明によるハイブリダイゼーション組成物は、それぞれが異なる
蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識されている多数の染色体ペイントを含有
し、かつ未標識のＣｏｔ−Ｉを含まないハイブリダイゼーション組成物と見なす
ことができる。

【００９４】好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物は、１個から、その
種に関して得られるすべての数（例えば、ヒト男性の場合には２４、ヒト女性の
場合には２３）までの任意の数の染色体ペイントを含有する。しかし、本発明の
別の好ましい実施形態により、少なくとも１つの染色体ペイントは、染色体の特
定セグメント（例えば、第１染色体の長腕）をペイント化するための部分的な染
色体ペイントである。染色体のセグメントは、高頻度反復配列を含むその一部分
として本明細書中では定義される。従って、染色体ペイントの数は染色体の数よ
りも多くてもよく、本明細書および請求項に記載されている方法は分光的（着色
された）染色体バンド形成のために使用することができる。さらに、反復したブ
ロッキング配列を含まない種間ハイブリダイゼーションもまた考えられ、これに
より、例えば、米国特許出願第０８／５３５，０４７号（１９９７年４月１８日
出願；これは、本明細書中に十分に示されているかのように参考として援用され
る）に示されているように、バンド形成させたペイント化パターンが得られる。

【００９５】好ましい実施形態により、染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体か
ら得られるＰＣＲ（例えば、ＤＯＰＰＣＲ）産物を蛍光基で標識することによ
って調製される。あるいは、染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を
蛍光基で直接標識することによって調製される。

【００９６】本発明の別の好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物はさら
に、未標識の中頻度反復配列（リボソームＤＮＡ配列など、これに限定されない
）を過剰に含む。結果として、ハイブリダイゼーション組成物におけるこれらの
配列の平均比活性は実質的に０に低下する。例えば、過剰の未標識のリボソーム
ＤＮＡ配列を加えることによって、変性および時間限定再アニーリングの後にお
いて、組成物における標識リボソームＤＮＡ配列がブロックキング（すなわち、
二本鎖化）され、従って、例えば、ヒトの第１３染色体、第１４染色体、第１５
染色体、第２１染色体および第２２染色体のテロメアとの染色体間ハイブリダイ
ゼーションが生じないことが保証される。

【００９７】別の好ましい実施形態により、染色体展開物は任意の種（例えば、ヒト）のも
のであり、染色体ペイントはそれとは別の種（例えば、ヒト以外の霊長類）のも
のである。

【００９８】ハイブリダイゼーションの分野ではよく認められているように、ハイブリダイ
ゼーション組成物は、ホルムアミド（これに限定されない）などの変性剤、デキ
ストラン硫酸（これに限定されない）などのポリマー、およびＳＳＣ（これに限
定されない）などの塩類をさらに含む。

【００９９】第３の工程として、ハイブリダイゼーション組成物は変性され、その後、ハイ
ブリダイゼーション組成物における（蛍光基で標識された）高頻度反復配列の少
なくとも一部（好ましくは大部分、例えば、少なくとも約７０％〜８０％、好ま
しくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましく
は少なくとも約９５％以上、理想的には約１００％）が再アニーリングさせられ
るが、ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の少なくとも一部（
好ましくは大部分、例えば、少なくとも約７０％〜８０％、好ましくは少なくと
も約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約
９５％以上、理想的には約１００％）が一本鎖のままである条件に供される。本
発明の好ましい実施形態により、このような条件には、約２０℃〜６５℃（好ま
しくは約３０℃〜５０℃、より好ましくは約３５℃〜４５℃）の範囲の温度で約
２時間〜４時間（好ましくは約３時間）再アニーリングすることが含まれる。

【０１００】その後、ハイブリダイゼーション組成物はハイブリダイゼーション条件のもと
で染色体展開物と接触させられる。本発明の好ましい実施形態により、このハイ
ブリダイゼーション条件には、染色体ペイントのユニーク配列が染色体展開物に
おけるその対応配列とハイブリダイゼーションするために十分な時間（例えば、
１４時間〜４８時間）にわたる約３７℃の温度が含まれる。このような条件に関
してさらに詳しいことは下記の実施例１において記載されている。

【０１０１】その後、過剰のハイブリダイゼーション組成物が洗い流される。本発明の好ま
しい実施形態により、洗浄は、部分的には、希釈されたＳＳＣ溶液（例えば、０
．１ｘＳＳＣ）によって行われる。

【０１０２】最後に、ハイブリダイゼーションした染色体展開物が分光的に分析され、そし
て分光的な（着色）像として示される。ハイブリダイゼーションした染色体展開
物の分析およびその像の提示は多バンド集光デバイスまたは分光的画像化装置に
よって行われる。好ましくは、分光的画像化装置は干渉計を含む。

【０１０３】蛍光インサイチューハイブリダイゼーション結果の種々の分光的分析方法が、
例えば、米国特許出願第０８／５７５，１９１号；同第０８／６３５，８２０号
；同第０８／７１８，８３１号；同第０８／８３１，３８０号；同第０８／７５
９，３４２号；および同第０８／８４４，５１６号；ならびにＥ．Ｓｃｈｒｏｅ
ｃｋ他（１９９６）、ヒト染色体の多色分光的核型決定、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７
３、４９４〜４９７；ＳｐｅｉｃｈｅｒＲ．Ｍ．、ＢａｌｌａｒｄＳ．Ｇ．
およびＷａｒｄＣ．Ｄ．（１９９６）、コンビナトリアル多色ＦＩＳＨによる
ヒト染色体の核型決定、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ、１２：３６８〜３７
５に記載されている（これらはすべて、本明細書中で十分に示されているかのよ
うに参考として援用される）。

【０１０４】本発明の方法の好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物は、
変性、および細胞サンプルにおけるＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダ
イゼーションを最大にし、それによって前記多数の染色体ペイントの濃度を少な
くとも約１０分の１〜２００分の１に低下させることができるように設計（すな
わち、事前、再アニーリングの前）あるいは改変（記載されているように再アニ
ーリングの後）される。この目的のために、ハイブリダイゼーション溶液は、シ
グマ社によって販売されているＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ溶液であり、あるいはＤＥＮＨ
ＹＢ^ＴＭ溶液を含む。ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ溶液は、ペイントを溶解して、再アニー
リングを維持するために使用することができる。あるいは、再アニーリングは上
記のように行うことができ、そして再アニーリングしたペイントは所望する濃度
にＤＥＮＨＹＢ^ＴＭ溶液で希釈することができる。

【０１０５】さらに、本発明により、それぞれが、ハイブリダイゼーション組成物における
高頻度反復配列の平均比活性がハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク
配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、異なる蛍光基または蛍光基の組
み合わせで標識されている多数の染色体ペイントを含むハイブリダイゼーション
組成物が提供される。

【０１０６】ハイブリダイゼーション組成物は、好ましくは、変性、および細胞サンプルに
おけるＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを最大にし、そ
れによって前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約１０分の１〜２００
分の１に低下させることができるように設計または改変される。ハイブリダイゼ
ーション組成物は、好ましくは、ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭの名称でシグマ社によって販
売されている製造物であり、あるいはそのような製造物を含む。

【０１０７】本発明の好ましい実施形態により、多数の染色体ペイントに存在する反復配列
は、ゲノムＤＮＡと比較したときに少なく示されるように組成物から少なくとも
部分的に除かれる。

【０１０８】本発明の好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物における高
頻度反復配列は大部分が再アニーリングさせられるが、ハイブリダイゼーション
組成物におけるユニーク配列は大部分が一本鎖にされる。

【０１０９】別の好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物が染色体展開物
とハイブリダイゼーションさせられたときに、一致している染色体ペイントを有
する染色体またはその一部分が標識され、そして分光的画像化装置または多バン
ド集光デバイスによって分析可能になる。

【０１１０】ハイブリダイゼーションの分野でよく認められているように、ハイブリダイゼ
ーション組成物はさらに、ホルムアミド（これに限定されない）などの変性剤、
デキストラン硫酸（これに限定されない）などのポリマー、およびＳＳＣ（これ
に限定されない）などの塩類を含む。

【０１１１】好ましい実施形態により、染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体か
ら得られるＰＣＲ（例えば、ＤＯＰＰＣＲ）産物を蛍光基で標識することによ
って調製される。あるいは、染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を
蛍光基で直接標識することによって調製される。

【０１１２】本発明の別の好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物はさら
に、未標識の中頻度反復配列（リボソームＤＮＡ配列など、これに限定されない
）を過剰に含む。

【０１１３】さらに、本発明により、それぞれが、ハイブリダイゼーション組成物における
高頻度反復配列の平均比活性がハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク
配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、異なる蛍光基または蛍光基の組
み合わせで標識されている多数の染色体ペイントから実質的になるハイブリダイ
ゼーション組成物が提供される。ハイブリダイゼーション組成物における高頻度
反復配列は大部分がアニーリングさせられるが、ハイブリダイゼーション組成物
におけるユニーク配列は、ハイブリダイゼーション組成物が染色体展開物とハイ
ブリダイゼーションさせられたときに、一致している染色体ペイントを有する染
色体またはその一部分が標識され、そして分光的画像化装置または多バンド集光
デバイスによって分析可能になるようにその大部分が一本鎖にされる。ハイブリ
ダイゼーション組成物はさらに、変性剤、ポリマーおよび塩類からなる。

【０１１４】上記の方法および組成物のいずれかの好ましい実施形態により、ハイブリダイ
ゼーション組成物は、特定の適用に依存して、変性、および細胞サンプルにおけ
るＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを最大にし、それに
よって、用いられる前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約１０分の１
〜２００分の１に低下させることができるように設計される。従って、好ましく
は、ハイブリダイゼーション組成物は、ＤＥＮＨＹＢ^ＴＭの名称でシグマ社によ
って販売されている製造物を含む。

【０１１５】本発明による方法および組成物は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーショ
ンのためだけではなく、プローブＤＮＡおよび標的ＤＮＡがともに、結果を妨げ
ることがある高頻度反復配列を含む他の表面（例えば、フィルター）ハイブリダ
イゼーションのためにも有用であることが当業者によって理解される。

【０１１６】本発明をその具体的な実施形態とともに記載してきたが、多くの代替、改変お
よび変化が当業者には明らかであることは明白である。従って、添付された請求
項の精神およびその明白な範囲に含まれるそのような代替、改変および変化はす
べて包含されるものとする。

【０１１７】次に、上記の説明とともに、本発明を非限定的な様式で例示する下記の実施例
が参照される。

【０１１８】（実施例１）標識およびハイブリダイゼーション材料：ＰＣＲ用材料：プライマー：Ｔｅｌｅｎｉｕｓ６ＭＷ（５'−ＣＣＧＡＣ
ＴＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮＡＴＧＴＧＧ−３'、配列番号１）；ポリメラーゼ：Ｔ
ａｑ（５Ｕ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ１８６１）；緩衝液：１０ｘＰＣＲ緩衝
液（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ヌクレオチド：１００ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ、１２７７０４９）；色素：スペクトラムグリーンｄＵＴＰ（１ｍＭ；
Ｖｙｓｉｓ、３０−８０３２００）、スペクトラムオレンジｄＵＴＰ（１ｍＭ；
Ｖｙｓｉｓ、３０−８０３０００）、テキサスレッドｄＵＴＰ（１ｍＭ；Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、７６３１）、ビオチン１６−ｄＵＴＰ（１ｍＭ；
ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、１０９３０７０）、ジゴキシゲニン
１１−ｄＵＴＰ（１ｍＭ；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、１０９３
０８８）；ヌクレオチドストック溶液（表１）：

【表１】

【０１１９】沈澱用材料：２０ｘＳＳＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ４２６１）；デキストラン
硫酸（Ｏｎｃｏｒ、Ｓ４０１０）；ホルムアミド（Ｏｎｃｏｒ、Ｓ４１１７）；
酢酸ナトリウム（Ｐｅｉｒｃｅ）；無水エタノール（Ｍｅｒｃｋ、１００９８３
）；ハイブリダイゼーションミックス（２ｘＳＳＣ／２０％デキストラン硫酸）
；ＤＥＮＨＹＢ溶液（Ｓｉｇｍａ、７５２２）。

【０１２０】反復配列の除去用材料：Ｃｏｔ−ＩＤＮＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、１５２７
９−０１１）；ＢｉｏｔｉｎＣｈｅｍＬｉｎｋキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒＭａｎｎｈｅｉｍ、１８１２１４９）；アビジン磁石粒子（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、１６４１７８９）。

【０１２１】染色体切片の前処理用材料：ＭｇＣｌ_２、１Ｍ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ−１０２８
）；ホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ、４００３）；ペプシンストック溶液：１０
％＝１００ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ／ＭｇＣｌ_２：５０ｍｌの１ＭＭｇＣｌ_２を含
む９５０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）。

【０１２２】変性および検出に必要な材料：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｖ画分（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、７３５０７８）；ツィーン２０（Ｍｅｒｃｋ、１０９２８
０）；抗ジゴキシン（Ｓｉｇｍａ、Ｄ８１５６）；６０％ホルムアルデヒド／２
ｘＳＳＣ；０．１ｘＳＳＣ；４ｘＳＳＣ／０．１％ツィーン２０；ブロッキング
溶液：３％ＢＳＡを含む４ｘＳＳＣ／０．１％ツィーン２０；抗体希釈溶液：１
％ＢＳＡを含む４ｘＳＳＣ／０．１％ツィーン２０；Ｃｙ５アビジン（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ、ＰＡ４５０００）２ｍｇ、ストック溶液：１ｍｇ／ｍｌ；Ｃｙ５．５
ヒツジ抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＲＰＱ０１１５）１ｍｇ、ストック溶液：
１ｍｇ／ｍｌ；ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ−９５４２）１ｍｇ、ストック溶液１
０ｍｇ／ｍｌ；退色防止溶液：Ｖｅｃｔｒａｓｈｉｅｌｄ（ＶｅｃｔｏｒＨ−
１０００）。

【０１２３】方法：反復配列の除去：Ｃｏｔ−ＩＤＮＡを、ＢｉｏｔｉｎＣｈｅｍ−Ｌｉｎ
ｋキットを使用してビオチンで標識した。（８５℃で３０分）標識した後、生成
物を、標準的なＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０を使用して精製した。各染色体から流
動分類されたＤＮＡ（３００ｎｇ）を１５μｌのビオチン化Ｃｏｔ−ＩＤＮＡ
に加え、それとともに沈澱させた。乾燥したペレットを１００μｌの６ｘＳＳＣ
、０．１％ＳＤＳに溶解し、１０分間煮沸することによって変性し、その後、６
５℃で一晩再アニーリングさせた。この２つのＤＮＡをストレプトアビジン磁石
粒子と３０分間一緒にし、その後、磁石粒子分離器に加えた。Ｃｏｔ−Ｉを少な
く提示するＤＮＡを含有する上清を除き、精製して、２５μｌのＴＥに再懸濁し
た。

【０１２４】プローブの標識：流動分類されたヒト染色体またはＣｏｔ−Ｉを少なく提示
するヒト染色体を標識し、その後、ＤＯＰ−ＰＣＲ（Ｔｅｌｅｎｉｏｕｓ、１９
９２）を使用して増幅した。各染色体を、ヌクレオチドに結合させた１種〜４種
の異なる蛍光発色基で標識した（表２参照）。合計で５種の異なる蛍光発色基を
使用した：スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、テキサスレッド、Ｃ
ｙ５およびＣｙ５．５。Ｃｙ５およびＣｙ５．５は、ビオチンおよびジゴキシゲ
ニンを用いて間接的に標識した。各ＰＣＲチューブについて、４００ｎｇを、標
識スキーム（表２参照）に従って２．５μｌの適切な色素と一緒にした。

【表２】略号：Ａ−スペクトラムオレンジ；Ｂ−テキサスレッド；Ｃ−Ｃｙ５；Ｄ−ス
ペクトラムグリーン；およびＥ−Ｄｉｇ−Ｃｙ５．５。

【０１２５】ＰＣＲ混合物（１ｘＰＣＲ緩衝液；２ｍＭのＭｇＣｌ_２；１０μｌのｄＮＴＰ
；２μＭプライマーおよび１０ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有す
る）を加えた。ＰＣＲ条件は、９５℃で２分；９５℃で１分、５６℃で１分およ
び７２℃で４分の２５サイクルであり、最後の伸長を７２℃で１０分間行った。

【０１２６】それぞれのハイブリダイゼーションのために、各染色体から得られた０．２６
μｌ（１５倍希釈）から４μｌ（無希釈）までのＰＣＲ産物をエッペンドルフチ
ューブで一緒にして、酢酸ナトリウムおよび１００％エタノールの存在下におい
て、抑制またはキャリアＤＮＡを加えることなく沈澱させた（すなわち、Ｃｏｔ
Ｉを含まない）。

【０１２７】「無希釈」手順に従い、乾燥ペレットを５μｌのホルムアミドおよび５μｌの
ハイブリダイゼーションストック溶液に溶解した。ハイブリダイゼーション溶液
の最終濃度は、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸および２ｘＳＳＣ
であった。

【０１２８】第１の「プローブ希釈」手順に従い、この組成物をＤＥＮＨＹＢ溶液で１０倍
〜１５倍希釈した（再アニーリング後、下記参照）。

【０１２９】第２の「プローブ希釈」手順に従い、乾燥ペレットを１０μｌのＤＥＮＨＹＢ
溶液に溶解した。

【０１３０】変性およびハイブリダイゼーション：切片の前処理を標準的な技術に従って
行った。簡単に記載すると、切片を１０％ペプシン溶液中で３７℃で５分間イン
キュベーションし、ＰＢＳで洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ／Ｍｇ
Ｃｌ_２緩衝液で固定し、その後、一連のエタノールによって脱水した。

【０１３１】染色体を７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣにおいて７０℃で２分間変性し、そ
の後、一連のエタノールに通して風乾した。

【０１３２】「無希釈」手順に従い、染色体ペイントカクテルを９４℃で５分間変性し、そ
の後、室温〜４５℃（典型的には、３４℃）で３時間インキュベーションして、
反復配列を自己アニーリングさせた。

【０１３３】第１の「希釈」手順に従い、染色体ペイントのカクテルを９４℃で５分間変性
し、その後、室温〜４５℃（典型的には、３４℃）で３時間インキュベーション
して、反復配列を自己アニーリングさせ、その後、ＤＥＮＨＹＢ溶液で１０倍〜
１５倍希釈した。

【０１３４】一方、第２の「希釈」手順に従い、染色体ペイントのカクテルを９４℃で５分
間変性し、その後、４０℃〜６５℃で３時間インキュベーションして、反復配列
を自己アニーリングさせた。

【０１３５】それぞれの場合、その後、１０μｌの染色体ペイント混合物を、変性した染色
体調製物に加え、１８ｘ１８ｍｍのカバーガラスで覆い、３７℃で１４時間〜４
８時間ハイブリダイゼーションした。

【０１３６】検出：切片を６０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣにおいて４５℃で１５分間洗
浄し、次いで０．１ｘＳＳＣにおいて４５℃で１０分間洗浄し、最後に４ｘＳＳ
Ｃ／０．１％ツィーン２０において４分間洗浄した。その後、切片をブロッキン
グ試薬で３０分間ブロッキングし、その後、Ｃｙ５アビジンおよび抗ジゴキシゲ
ニン（１：２００）で４５分間インキュベーションした。４ｘＳＳＣ／１％ツィ
ーン２０において４５℃で洗浄した後、Ｃｙ５．５抗マウス（１：２００）のさ
らなる層をさらに４５分間加えた。その後、切片を上記のように洗浄して、ＤＡ
ＰＩ／退色防止溶液において固定した。

【０１３７】（実施例２）測定装置図１は、米国特許出願第０８／３９２，０１９号（Ｃａｂｉｂ他、１９９５年
２月２１日出願：現在、米国特許第５，５３９，５１７号、１９９６年７月２３
日発行）（これは、本明細書中に十分に示されているかのように参考として援用
される）に開示されている先行技術による画像化分光装置の主要部を例示するブ
ロック図である。

【０１３８】この画像化分光装置は、分光的分解能（波長に依存して約４ｎｍ〜１４ｎｍ）
および空間的分解能（約３０／Ｍμｍ；Ｍは顕微鏡または対物光学系の有効倍率
である）が大きいために、本発明の方法を実施するのに非常に適するように組み
立てられる。

【０１３９】従って、図１の先行技術による画像化分光装置は、集光光学系（２０と一般に
は示される）；１次元スキャナー（ブロック２２により示される）；光学的経路
差（ＯＰＤ）生成装置または干渉計（ブロック２４により示される）；１次元検
出器列または２次元検出器列（ブロック２６により示される）；およびシグナル
処理装置および表示装置（ブロック２８により示される）を含む。

【０１４０】システム２０の非常に重要な要素は、分析される画面の各画素から発する光の
分光的強度の予め決められた一連の一次結合形に対応する変調光を出力するＯＰ
Ｄ生成装置または干渉計２４である。干渉計の出力は検出器列２６に集められる
。従って、必要とされる光学的位相差のすべてが、スペクトルを再構築するため
に必要とされるすべての情報を得るために、視野の画素のすべてについて同時に
走査される。従って、画面におけるすべての画素のスペクトルが画像化情報とと
もに同時に集められ、それにより、画像の瞬時的な分析が可能になる。

【０１４１】米国特許第５，５３９，５１７号による装置は非常に様々な形態で実施するこ
とができる。具体的には、使用される干渉計は、米国特許第５，５３９，５１７
号の関連図に記載されているような他の鏡と組み合わせることができる。

【０１４２】従って、米国特許第５，５３９，５１７号により、代わりのタイプの干渉計を
用いることができる。これには、下記の干渉計が含まれる：（ｉ）ＯＰＤが光を
変調させるために変化する可動型干渉計、すなわち、走査厚を伴うファブリ−ペ
ロ干渉計；（ｉｉ）光学的集光系およびスキャナーからのビームを受けて、ビー
ムを２つの経路に分割するビームスプリッターを含むマイケルソン型干渉計；（
ｉｉｉ）干渉計においてＯＰＤが入射光の入射角によって変化する他の光学的手
段を必要に応じて併せ持つＳａｇｎａｃ干渉計、例えば、引用された米国特許（
添付の図１４を参照のこと）においてさらに記載されている４鏡＋ビームスプリ
ッターの干渉計。

【０１４３】図２は、米国特許第５，５３９，５１７号に従って組み立てられ、ＯＰＤが入
射光の入射角によって変化する干渉計が用いられる画像化分光装置を例示する。
光軸に対して小さな角度で干渉計に入るビームは、その角度によって実質的に一
次的に変化するＯＰＤを経る。

【０１４４】図２の干渉計において、すべての画素内の源３０からのすべての放射光は、光
学的集光系３１によって平行化された後、機械的なスキャナー３２によって走査
される。その後、光はビームスプリッター３３を通って第１の反射鏡３４に至り
、その後、第２の反射鏡３５に至る。これにより、光は反射して戻り、ビームス
プリッター３３を通り、その後、焦点レンズ３６を通って検出器列３７（例えば
、ＣＣＤ）に至る。このビームは、３３によって、続いて第２の反射鏡３５によ
って、最後に第１の反射鏡３４によって反射されたビームと干渉する。

【０１４５】１つの走査の最後において、すべての画素がすべてのＯＰＤを通して測定され
、従って、その画面の各画素のスペクトルをフーリエ変換によって再構築するこ
とができる。光軸に平行なビームは補償され、光軸に対してある角度（θ）のビ
ームは、ビームスプリッター３３の厚さ、その屈折率、および角度θを関数とす
るＯＰＤを経る。ＯＰＤは、角度が小さい場合にはθに比例する。適切な反転を
加えることによって、そして注意深い記録により、画素毎のスペクトルが計算さ
れる。

【０１４６】図２の形態において、角度β（図２の場合、β＝４５°）でビームスプリッタ
ーに入射する光線は、ＯＰＤ＝０で干渉計を通過するが、β−θの一般的な角度
で入射する光線は、下記の数式２によって与えられるＯＰＤを経る：

【数２】式中、θは、中心位置に関する光軸または干渉計の回転角からの光線の角距離
であり；ｔはビームスプリッターの厚さであり；ｎはビームスプリッターの屈折
率である。

【０１４７】数式２から、中心位置に関して正および負の両方の角度を走査することによっ
て、位相誤差を除いて、より正確な結果をフーリエ変換計算においてもたらすこ
とを助ける両側の干渉波形がすべての画素について得られることが理解される。
走査振幅により、測定の分光的分解能に関連するＯＰＤの到達最大値が決定され
る。角度幅の大きさにより、ＯＰＤの幅が決定され、これはまた、システムが感
度を有する最短波長によって決定される。実際には、サンプリング理論［Ｃｈａ
ｍｂｅｒｌａｉｎ（１９７９）、干渉分光法の原理（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａ
ｎｄＳｏｎｓ、５３頁〜５５頁）を参照のこと］に従い、このＯＰＤ幅は、シ
ステムが感度を有する最短波長の１／２よりも小さくなければならない。

【０１４８】考慮しなければならないもう１つのパラメーターは、マトリックスにおける検
出器エレメントの有限の大きさである。焦点光学系を通して、エレメントによっ
て、直交的な関数による干渉波形の巻き込み作用を有する干渉計における有限の
ＯＰＤが定められる。これにより、エレメントによって定められるＯＰＤ以下の
波長に関して０に低下する短波長側でのシステム感度の低下が結果としてもたら
される。この理由により、変調伝達関数（ＭＴＦ）を確実に満足しなければなら
ない。すなわち、干渉計における検出器エレメントによって定められるＯＰＤを
、装置が感度を有する最短波長よりも確実に小さくしなければならない。

【０１４９】従って、米国特許第５，５３９，５１７号において開示され、本発明に従って
組み立てられる画像化分光装置は、視野内のすべての画素から来る光の強度を単
に測定するだけでなく、所定の波長範囲における各画素のスペクトルもまた測定
する。そのような分光装置はまた、任意の特定時間における視野内の各画素によ
って発せられる放射光のすべてをより十分に利用し、従って、上記に説明されて
いるように、フレーム時間の著しい低下および／または分光装置の感度の著しい
増大を可能にする。そのような画像化分光装置は、様々なタイプの干渉計ならび
に集光および焦点形成の光学システムを含むことができ、従って、医学的診断適
用および治療適用および生物学的研究適用、ならびに地質学的調査および農業的
調査などに関する遠隔探査を含む広範囲の適用において使用することができる。

【０１５０】上記に述べられているように、米国特許第５，５３９，５１７号において開示
され、本発明による画像化分光装置が、ＡｐｐｌｉｅｄＳｐｅｃｔｒａｌＩ
ｍａｇｉｎｇＬｔｄ．（ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＰａｒｋ、ＭｉｇｄａｌＨ
ａｅｍｅｋ、イスラエル）によって開発され、本明細書中においてはＳＰＥＣＴ
ＲＡＣＵＢＥ^ＴＭとして示されている。

【０１５１】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥ^ＴＭシステムは、下記の表３に列記される下記のより
優れた特性を有する。表３パラメーター性能空間分解能：３０／Ｍμｍ（Ｍ＝顕微鏡または対物光学系の有効倍率）視野：１５／Ｍミリメートル感度：２０ミリルクス（１００ｍｓｅｃの積分時間の場合、積分時間が長くなると、Ｔの平方根に比例して増大する）分光範囲：４００〜１０００ｎｍ分光分解能：４００ｎｍにおいて４ｎｍ（８００ｎｍにおいて１６ｎｍ）積算時間：５〜５０秒（典型的には、２５秒）ＦＦＴ処理時間：２０〜１８０秒、典型的には６０秒

【０１５２】顕微鏡に必要に応じて接続されたＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥ^ＴＭシステムは、本
発明によるインサイチューハイブリダイゼーション物を分析するために好ましく
使用される。しかし、フィルター（例えば、音響光学同調フィルター（ＡＯＴＦ
）または液晶同調フィルター（ＬＣＴＦ））および分散素子（例えば、格子また
はプリズム）に基づく分光的画像化装置を含む任意の分光的画像化装置（すなわ
ち、その後の復元および分析のために、その視野内に位置する対象物のすべての
点による発光スペクトルを測定してメモリーに保存する装置）、あるいは他の分
光的データまたは多バンド集光デバイス（例えば、ＳｐｅｉｃｈｅｒＲ．Ｍ．
、ＢａｌｌａｒｄＳ．Ｇ．およびＷａｒｄＣ．Ｄ．（１９９６）、コンビナ
トリアル多色ＦＩＳＨによるヒト染色体の核型決定、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ
ｉｃｓ、１２：３６８〜３７５における開示によるデバイス）を、必要とされる
分光的データを得るために使用することができる。従って、このことは、本発明
の範囲を、任意の特定タイプの分光的データ収集デバイスあるいは任意の特定タ
イプの分光的画像化装置を使用するために制限するものではない。

【０１５３】（実施例３）核型決定の結果図３〜図５は、上記の「非希釈」プロトコル（実施例１）および測定（実施例
２）を使用した正常な男性の染色体のハイブリダイゼーション結果を示す。

【０１５４】図５は、ＲＧＢアルゴリズムを使用して得られた染色体展開物のＲＧＢ像であ
る。このＲＧＢアルゴリズムにより、光学的シグナルがＣＣＤ列の分光範囲（例
えば、４００ｎｍ〜７６０ｎｍ）にわたって積分されて、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）お
よび青（Ｂ）の三刺激応答関数に対応する３つの加重関数｛ｗ_ｒ（λ）、ｗ_ｇ（
λ）、ｗ_ｂ（λ）｝に従って、赤、緑および青の強度の組み合わせが各画素に割
り当てられた染色体のＲＧＢ像が得られる。

【０１５５】図６は、この単純なアルゴリズムの出力例を示す。選択｛ｗ_ｒ、ｗ_ｇ、ｗ_ｂ｝
を、目的とするスペクトルの「内側」に分布するガウス関数または他の（例えば
、矩形的な）関数とみなした場合、この場合に表示される得られた擬似色画像に
より、加重関数に対応する分光的領域のデータのみが強調され、これにより、こ
れらの３領域における分光的な差がより明瞭に検出され得る。

【０１５６】図３において、用いられている加重関数ｗ_ｒ、ｗ_ｇ、ｗ_ｂは、ｗ_ｒ（赤）の場
合、λ_１＝６４０ｎｍおよびλ_２＝７５０ｎｍであり；ｗ_ｇ（緑）の場合、λ_１
＝５５５ｎｍおよびλ_２＝６４０ｎｍであり；ｗ_ｂ（青）の場合、λ_１＝４５０
ｎｍおよびλ_２＝５５５ｎｍである単純な矩形の加重関数であった。これらの単
純な加重関数ｗ_ｒ、ｗ_ｇ、ｗ_ｂを組み合わせて、染色体のＲＧＢ像が作製される
。

【０１５７】図４は、図３の染色体展開物の分類画像である。図５は、図４の染色体展開物
から得られる核型である。分類画像は、各画素がそのスペクトルに従って分類さ
れる分類アルゴリズムによって計算される。最も重要な分析アルゴリズムの１つ
は、画像内の多数の異なるスペクトルを分類色で同定して強調することを可能に
する分光型分類アルゴリズムである。これにより、そのスペクトルに基づいて、
特定の分類色をすべてのヒト染色体に割り当てることが可能になる。このアルゴ
リズムは、各染色体の参照スペクトルが測定されて、コンピューター内の参照ラ
イブラリーに保存されていることを仮定する。区別するための分類色が、例えば
、下記の数式３で示される最小二乗誤差アルゴリズムによって規定されているよ
うに、その特定の画素におけるスペクトルに最も類似する参照スペクトルに割り
当てられた分類色に従って画像内の画素のそれぞれに割り当てられる。

【数３】式中、Ｉ_ｘ，ｙ（λ）は画素座標（ｘ、ｙ）における正規化スペクトルであり
、Ｉ_ｎ（λ）はそれぞれの染色体（ｎ＝１、２、・・・、２３、２４）に対する
正規化参照スペクトルを示す。すべての参照スペクトルについてＳ_{ｘ，ｙ，ｎ}の
値を計算した後、最小値が選ばれ、人為的な分類色が、最も類似する参照スペク
トルに割り当てられた分類色に従ってその画素に割り当てられる。

【０１５８】示される結果は、未標識のＣｏｔ−Ｉを含まないハイブリダイゼーションプロ
トコルの結果であることに注意されたい。実際、このような画像は、Ｃｏｔ−Ｉ
の存在下で得られる類似した画像とは少し異なる。例えば、ＲＧＢ画像において
、そしてより少ない程度ではあるが、分類画像においては、高頻度反復配列を大
きな含有量で含むことが知られている動原体の少数がより明るくなるだけである
。このことは、これらの動原体が、多数の染色体に起源を有する反復配列にハイ
ブリダイゼーションしたことを示している。第１３染色体、第１４染色体、第１
５染色体および第２１染色体のテロメアと反復的に会合した着色パターンは、こ
れらのテロメアに位置する中頻度反復リボソームＤＮＡ配列のためである。これ
らの着色パターンは、リボソームＤＮＡを同様に含有する第２２染色体において
も時々見られるが、Ｃｏｔ−Ｉを含むハイブリダイゼーション混合物においても
認められている。なぜなら、Ｃｏｔ−Ｉは、中頻度反復配列とは異なり、主とし
て高頻度反復配列を含む部分であるからである。これらの着色パターンは、部分
的な再アニーリング手順の前に、未標識のリボソームＤＮＡを過剰にハイブリダ
イゼーション混合物に加えることによってなくすことができる。

【０１５９】従って、本発明によるインサイチューハイブリダイゼーションは、未標識のＣ
ｏｔ−Ｉを含まないが、高品質の核型画像をもたらす。染色体ペイントを用いた
、未標識のＣｏｔ−Ｉを含まないインサイチューハイブリダイゼーションは、こ
れまで一度も試みられていなかったことに留意されたい。

【０１６０】図７〜図２３は、ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のＲＧＢ（ａ）、分類（ｂ）、ＤＡＰＩ（ｃ）、ならびに
ＲＧＢ画像および分類画像（ｄ）から導かれる合成核型をそれぞれ示す。

【０１６１】図７ａ〜７ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物にはＣｏｔ−Ｉブロッキ
ングＤＮＡが含まれた。従って、この結果はコントロールとして役立つ。染色体
ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変
性し、その後、３７℃で１時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５
％ホルムアミド／１ｘＳＳＣを用いた。

【０１６２】図８ａ〜８ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物にはＣｏｔ−Ｉブロッキ
ングＤＮＡが含まれた。従って、この結果もまたコントロールとして役立つ。染
色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１５に希釈した。ハイブリダイゼーショ
ン組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃で１時間再アニーリングさせ
た後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は３６時
間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いた。

【０１６３】図９ａ〜９ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物にはＣｏｔ−Ｉブロッキ
ングＤＮＡが含まれた。従って、この結果もまたコントロールとして役立つ。染
色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に希釈した。ハイブリダイゼーショ
ン組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃で１時間再アニーリングさせ
た後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は３６時
間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いた。

【０１６４】図１０ａ〜１０ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物はＣｏｔ−Ｉブロッ
キングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３
７℃で４時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は１４時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／
１ｘＳＳＣを用いた。

【０１６５】図１１ａ〜１１ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物はＣｏｔ−Ｉブロッ
キングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３
７℃で２時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は１４時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／
１ｘＳＳＣを用いた。

【０１６６】図１２ａ〜１２ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物はＣｏｔ−Ｉブロッ
キングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイ
ゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃で２時間再アニーリ
ングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間
は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘＳＳＣを用いた。

【０１６７】図１３ａ〜１３ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物は、Ｃｏｔ−Ｉブロ
ッキングＤＮＡを含み、従って、コントロールとして役立つ。染色体ペイントを
ＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１５に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５
℃で７分間変性し、その後、３７℃で１時間再アニーリングさせた後にハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は３６時間であった。後
洗浄には５５％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いた。

【０１６８】図１４ａ〜１４ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物は、Ｃｏｔ−Ｉブロ
ッキングＤＮＡを含み、従って、コントロールとして役立つ。染色体ペイントは
希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その
後、３７℃で１時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った
。ハイブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムア
ミド／１ｘＳＳＣを用いた。

【０１６９】図１５ａ〜１５ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物は、Ｃｏｔ−Ｉブロ
ッキングＤＮＡを含み、従って、コントロールとして役立つ。染色体ペイントを
ＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５
℃で７分間変性し、その後、３７℃で１時間再アニーリングさせた後にハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は３６時間であった。後
洗浄には５５％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いた。

【０１７０】図１６ａ〜１６ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物はＣｏｔ−Ｉブロッ
キングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３
７℃で２時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５０％ホルムアミド／
２ｘＳＳＣを用いた。

【０１７１】図１７ａ〜１７ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物はＣｏｔ−Ｉブロッ
キングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３
７℃で６時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／
１ｘＳＳＣを用いた。

【０１７２】図１８ａ〜１８ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物はＣｏｔ−Ｉブロッ
キングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１５に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３
７℃で２時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／
１ｘＳＳＣを用いた。

【０１７３】図１９ａ〜１９ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物にはＣｏｔ−Ｉブロ
ッキングＤＮＡが含まれた。従って、この結果はコントロールとして役立つ。染
色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１５に希釈した。ハイブリダイゼーショ
ン組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃で１時間再アニーリングさせ
た後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は３６時
間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／２ｘＳＳＣを用いた。

【０１７４】図２０ａ〜２０ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物はＣｏｔ−Ｉブロッ
キングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３
７℃で２時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／
１ｘＳＳＣを用いた。

【０１７５】図２１ａ〜２１ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物はＣｏｔ−Ｉブロッ
キングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイ
ゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３７℃で２時間再アニーリ
ングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間
は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／１ｘＳＳＣを用いた。

【０１７６】図２２ａ〜２２ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物はＣｏｔ−Ｉブロッ
キングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１０に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３
７℃で６時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／
１ｘＳＳＣを用いた。

【０１７７】図２３ａ〜２３ｄの場合、ハイブリダイゼーション組成物はＣｏｔ−Ｉブロッ
キングＤＮＡを含まなかった。染色体ペイントをＤＥＮＨＹＢ溶液で１：１５に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を７５℃で７分間変性し、その後、３
７℃で２時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は３６時間であった。後洗浄には５５％ホルムアミド／
１ｘＳＳＣを用いた。

【０１７８】図７〜図２３に示される結果から導かれる主要な結論は、染色体ペイントの濃
度が、先行技術の（Ｃｏｔ−ＩブロッキングＤＮＡを含む）方法または本発明の
（Ｃｏｔ−Ｉを含まない）方法に従って多数倍に希釈することができ、それによ
って方法を費用効果的にすることである。しかし、Ｃｏｔ−Ｉを含まない方法と
組み合わせたＤＥＮＨＹＢ^ＴＭの使用により、全体的なペイント濃度が低下して
いるため、その結果が明らかに改善されていることは予想外のことである。

【０１７９】図２４ａ〜２４ｂおよび図２５ａ〜２５ｂは、第１染色体ペイントまたは第５
染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト染色体の像をそれぞれ示す。
図２４ｂおよび図２５ｂの染色体ペイントは、本明細書中上記の実施例１に記載
されているように、磁石ビーズによってＣｏｔ−Ｉ配列を少なくとも部分的に除
くために処理されたが、図２４ａおよび図２５ａの染色体ペイントは処理しなか
った。すべての場合において、長時間の再アニーリング（４時間）は、依然とし
て利用可能な標識されたＣｏｔ−Ｉ配列をさらに再アニーリングさせるのに役立
った。

【０１８０】これらの結果は、ペイント特異性の顕著な改善を示している。Ｃｏｔ−Ｉ配列
が除かれなかった場合、ペイントにより、実質的にすべてのそれ以外の染色体に
おける反復配列が強調されたが、Ｃｏｔ−Ｉ配列の部分的な除去により、染色体
特異的なハイブリダイゼーションが得られた。図２４ａ〜２４ｂにおいて、全く
同じ結果が、間期染色体についても同様に認められる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】米国特許出願第０８／３９２，０１９号（先行技術）に従って組み立てられた
画像化分光装置の主要部を例示するブロック図である。

【図２】米国特許出願第０８／３９２，０１９号（先行技術）による画像化分光装置に
おいて使用されている非可動型干渉計（すなわち、Ｓａｇｎａｃ干渉計）を例示
する。

【図３】本発明による方法および組成物を使用した、正常な男性の染色体展開物との２
４個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。

【図４】本発明による方法および組成物を使用した、正常な男性の染色体展開物との２
４個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。

【図５】本発明による方法および組成物を使用した、正常な男性の染色体展開物との２
４個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。

【図６】選択された分光範囲を強調するための擬似ＲＧＢ（赤、緑および青）色の定義
を示す。

【図７ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図７ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図７ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図７ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図８ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図８ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図８ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図８ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図９ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図９ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図９ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図９ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図１０ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図１０ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図１０ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図１０ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図１１ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図１１ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図１１ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図１１ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図１２ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図１２ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図１２ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図１２ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図１３ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図１３ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図１３ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図１３ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図１４ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図１４ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図１４ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図１４ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図１５ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図１５ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図１５ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図１５ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図１６ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図１６ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図１６ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図１６ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図１７ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図１７ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図１７ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図１７ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図１８ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図１８ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図１８ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図１８ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図１９ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図１９ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図１９ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図１９ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図２０ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図２０ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図２０ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図２０ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図２１ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図２１ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図２１ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図２１ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図２２ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図２２ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図２２ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図２２ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図２３ａ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢを示す。

【図２３ｂ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。

【図２３ｃ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＤＡＰＩを示す。

【図２３ｄ】ＳＰＥＣＴＲＡＣＵＢＥシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のＲＧＢ画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。

【図２４】図２４ａ〜２４ｂは、第１染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト
染色体の像を示す。

【図２５】図２５ａ〜２５ｂは、第５染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト
染色体の像を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年８月１５日（２０００．８．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ガリニ，ユバルイスラエル， 20126 ミズペコラニト（番地なし) (72)発明者カビブ，ダリオイスラエル， 23840 ティムラト，ハブロシュ７ (72)発明者バックワルド，ロバート，エー．イスラエル， 30095 ラマットイシェイ，ハダガンストリート（番地なし) Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA09 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR56 QS34 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）１つの種の染色体展開物を得る工程；（ｂ）多数の染色体ペイントを含有するハイブリダイゼーション組成物を調製す
る工程であって、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の
平均比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比
活性と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異な
る蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識される工程；（ｃ）前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前記ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における前記高頻度反復配列の少なくとも一部を再アニーリングさせ
るが、前記ハイブリダイゼーション組成物における前記ユニーク配列の少なくと
も一部が一本鎖のままである条件に前記ハイブリダイゼーション組成物を供する
工程；（ｄ）前記ハイブリダイゼーション組成物をハイブリダイゼーション条件のもと
で前記展開物と接触させる工程；（ｅ）過剰な前記ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工程；および（ｆ）前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開物を分析して、
その像を示す工程を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項２】前記ハイブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞サ
ンプルにおけるＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを最大
にし、それによって、前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約１０分の
１〜２００分の１に低下させることができるように設計または改変される、請求
項１に記載の方法。
【請求項３】前記ハイブリダイゼーション組成物はＤＥＮＨＹＢ^ＴＭの名
称でシグマ（Ｓｉｇｍａ）社によって販売されている製造物を含む、請求項２に
記載の方法。
【請求項４】前記多数の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲノ
ムＤＮＡと比較したときに少なく示されるように前記組成物から少なくとも部分
的に除かれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記種は哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記哺乳動物はヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記ハイブリダイゼーション組成物は、１個から、前記種に
関して得られるすべてまでの間の任意の数の染色体ペイントを含有する、請求項
１に記載の方法。
【請求項８】前記染色体ペイントの少なくとも１つは、染色体の特定セグ
メントをペイント化するための部分的な染色体ペイントである、請求項１に記載
の方法。
【請求項９】前記ハイブリダイゼーション組成物は過剰の未標識の中頻度
反復配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記未標識の中頻度反復配列はリボソームＤＮＡ配列であ
る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記染色体展開物は任意の種のものであり、かつ前記染色
体ペイントはそれとは別の種のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記ハイブリダイゼーション組成物は変性剤をさらに含む
、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記変性剤はホルムアミドである、請求項１２に記載の方
法。
【請求項１４】前記ハイブリダイゼーション組成物はポリマーをさらに含
む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】前記ポリマーはデキストラン硫酸である、請求項１４に記
載の方法。
【請求項１６】前記ハイブリダイゼーション組成物は塩類をさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１７】前記塩類はＳＳＣである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】前記平均比活性は１００ヌクレオチドあたり１個〜２５個
の蛍光基の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】前記ハイブリダイゼーション組成物における前記高頻度反
復配列の少なくとも一部を再アニーリングさせる前記条件は、約３２℃〜３６℃
で約２時間〜４時間の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】前記ハイブリダイゼーション条件は、前記染色体ペイント
の前記ユニーク配列が前記染色体展開物におけるその対応配列とハイブリダイゼ
ーションするために十分な時間にわたる約３７℃の温度を含む、請求項１に記載
の方法。
【請求項２１】前記洗浄工程は希釈されたＳＳＣ溶液によって部分的に行
われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開
物の分析およびその像の提示は多バンド集光デバイスまたは分光的画像化装置に
よって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】前記分光的画像化装置は干渉計を含む、請求項２２に記載
の方法。
【請求項２４】前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から
得られるＰＣＲ産物を前記蛍光基で標識することによって調製される、請求項１
に記載の方法。
【請求項２５】前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前
記蛍光基で標識することによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】（ａ）１つの種の染色体展開物を得る工程；（ｂ）未標識のＣｏｔ−Ｉを含まず、かつ異なる蛍光基または蛍光基の組み合わ
せでそれぞれが標識されている多数の染色体ペイントを含有するハイブリダイゼ
ーション組成物を調製する工程；（ｃ）前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前記ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列は大部分が再アニーリングされるが、前記ハ
イブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は大部分が一本鎖に維持され
る条件に前記ハイブリダイゼーション組成物を供する工程；（ｄ）前記ハイブリダイゼーション組成物をハイブリダイゼーション条件のもと
で前記染色体展開物と接触させる工程；（ｅ）過剰な前記ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工程；および（ｆ）前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開物を分析して、
その像を示す工程を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項２７】前記ハイブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞
サンプルにおけるＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを最
大にし、それによって、前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約１０分
の１〜２００分の１に低下させることができるように設計または改変される、請
求項２６に記載の方法。
【請求項２８】前記ハイブリダイゼーション組成物はＤＥＮＨＹＢ^ＴＭの
名称でシグマ（Ｓｉｇｍａ）社によって販売されている製造物を含む、請求項２
７に記載の方法。
【請求項２９】前記多数の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲ
ノムＤＮＡと比較したときに少なく示されるように前記組成物から少なくとも部
分的に除かれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】前記種は哺乳動物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】前記哺乳動物はヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】前記ハイブリダイゼーション組成物は、１個から、前記種
に関して得られるすべてまでの間の任意の数の染色体ペイントを含有する、請求
項２６に記載の方法。
【請求項３３】前記染色体ペイントの少なくとも１つは、染色体の特定セ
グメントをペイント化するための部分的な染色体ペイントである、請求項２６に
記載の方法。
【請求項３４】前記ハイブリダイゼーション組成物は過剰の未標識の中頻
度反復配列をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】前記未標識の中頻度反復配列はリボソームＤＮＡ配列であ
る、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】前記染色体展開物は任意の種のものであり、かつ前記染色
体ペイントはそれとは別の種のものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】前記ハイブリダイゼーション組成物は変性剤をさらに含む
、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】前記変性剤はホルムアミドである、請求項３７に記載の方
法。
【請求項３９】前記ハイブリダイゼーション組成物はポリマーをさらに含
む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】前記ポリマーはデキストラン硫酸である、請求項３９に記
載の方法。
【請求項４１】前記ハイブリダイゼーション組成物は塩類をさらに含む、
請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】前記塩類はＳＳＣである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】前記ハイブリダイゼーション組成物における前記高頻度反
復配列の少なくとも一部を再アニーリングさせる前記条件は、約３２℃〜３６℃
で約２時間〜４時間の範囲である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】前記ハイブリダイゼーション条件は、前記染色体ペイント
の前記ユニーク配列が前記染色体展開物におけるその対応配列とハイブリダイゼ
ーションするために十分な時間にわたる約３７℃の温度を含む、請求項２６に記
載の方法。
【請求項４５】前記洗浄工程は希釈されたＳＳＣ溶液によって部分的に行
われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開
物の分析およびその像の提示は多バンド集光デバイスまたは分光的画像化装置に
よって行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４７】前記分光的画像化装置は干渉計を含む、請求項４６に記載
の方法。
【請求項４８】前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から
得られるＰＣＲ産物を前記蛍光基で標識することによって調製される、請求項２
６に記載の方法。
【請求項４９】前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前
記蛍光基で標識することによって調製される、請求項２６に記載の方法。
【請求項５０】多数の染色体ペイントを含むハイブリダイゼーション組成
物であって、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の平均
比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性
と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異なる蛍
光基または蛍光基の組み合わせで標識されているハイブリダイゼーション組成物
。
【請求項５１】前記ハイブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞
サンプルにおけるＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを最
大にし、それによって、前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約１０分
の１〜２００分の１に低下させることができるように設計または改変される、請
求項５０に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項５２】前記ハイブリダイゼーション組成物はＤＥＮＨＹＢ^ＴＭの
名称でシグマ（Ｓｉｇｍａ）社によって販売されている製造物を含む、請求項５
１に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項５３】前記多数の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲ
ノムＤＮＡと比較したときに少なく示されるように前記組成物から少なくとも部
分的に除かれる、請求項５０に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項５４】前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復反
列は大部分がアニーリングされるが、前記ハイブリダイゼーション組成物におけ
るユニーク配列は大部分が一本鎖にされる、請求項５０に記載のハイブリダイゼ
ーション組成物。
【請求項５５】前記ハイブリダイゼーション組成物が染色体展開物とハイ
ブリダイゼーションされたときに、一致している染色体ペイントを有する染色体
またはその一部分が標識され、そして分光的画像化装置または多バンド集光デバ
イスを介して分析可能である、請求項５４に記載のハイブリダイゼーション組成
物。
【請求項５６】変性剤をさらに含む、請求項５０に記載のハイブリダイゼ
ーション組成物。
【請求項５７】前記変性剤はホルムアミドである、請求項５６に記載のハ
イブリダイゼーション組成物。
【請求項５８】ポリマーをさらに含む、請求項５０に記載のハイブリダイ
ゼーション組成物。
【請求項５９】前記ポリマーはデキストラン硫酸である、請求項５８に記
載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項６０】塩類をさらに含む、請求項５０に記載のハイブリダイゼー
ション組成物。
【請求項６１】前記塩類はＳＳＣである、請求項６０に記載のハイブリダ
イゼーション組成物。
【請求項６２】前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から
得られるＰＣＲ産物を前記蛍光基で標識することによって調製される、請求項５
０に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項６３】前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前
記蛍光基で標識することによって調製される、請求項５０に記載のハイブリダイ
ゼーション組成物。
【請求項６４】多数の染色体ペイントを含むハイブリダイゼーション組成
物であって、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の平均
比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性
と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異なる蛍
光基または蛍光基の組み合わせで標識され、かつ前記ハイブリダイゼーション組
成物における高頻度反復配列は大部分がアニーリングされるが、前記ハイブリダ
イゼーション組成物におけるユニーク配列は、前記ハイブリダイゼーション組成
物が染色体展開物とハイブリダイゼーションされたときに、一致している染色体
ペイントを有する染色体またはその一部分が標識され、そして分光的画像化装置
または多バンド集光デバイスを介して分析可能であるようにその大部分が一本鎖
であるハイブリダイゼーション組成物。
【請求項６５】前記ハイブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞
サンプルにおけるＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを最
大にし、それによって、前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約１０分
の１〜２００分の１に低下させることができるように設計または改変される、請
求項６４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項６６】前記ハイブリダイゼーション組成物はＤＥＮＨＹＢ^ＴＭの
名称でシグマ（Ｓｉｇｍａ）社によって販売されている製造物を含む、請求項６
５に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項６７】前記多数の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲ
ノムＤＮＡと比較したときに少なく示されるように前記組成物から少なくとも部
分的に除かれる、請求項６４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項６８】変性剤をさらに含む、請求項６４に記載のハイブリダイゼ
ーション組成物。
【請求項６９】前記変性剤はホルムアミドである、請求項６８に記載のハ
イブリダイゼーション組成物。
【請求項７０】ポリマーをさらに含む、請求項６４に記載のハイブリダイ
ゼーション組成物。
【請求項７１】前記ポリマーはデキストラン硫酸である、請求項７０に記
載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項７２】塩類をさらに含む、請求項６４に記載のハイブリダイゼー
ション組成物。
【請求項７３】前記塩類はＳＳＣである、請求項７２に記載のハイブリダ
イゼーション組成物。
【請求項７４】前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から
得られるＰＣＲ産物を前記蛍光基で標識することによって調製される、請求項６
４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項７５】前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前
記蛍光基で標識することによって調製される、請求項６４に記載のハイブリダイ
ゼーション組成物。
【請求項７６】多数の染色体ペイントから本質的になるハイブリダイゼー
ション組成物であって、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復
配列の平均比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の
平均比活性と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれ
が異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識され、かつ前記ハイブリダイゼ
ーション組成物における高頻度反復配列は大部分がアニーリングされるが、前記
ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は、前記ハイブリダイゼー
ション組成物が染色体展開物とハイブリダイゼーションされたときに、一致して
いる染色体ペイントを有する染色体またはその一部分が標識され、そして分光的
画像化装置または多バンド集光デバイスを介して分析可能であるようにその大部
分が一本鎖であり、かつ前記ハイブリダイゼーション組成物はさらに、変性剤、
ポリマーおよび塩類からなる、ハイブリダイゼーション組成物。
【請求項７７】前記ハイブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞
サンプルにおけるＤＮＡプローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを最
大にし、それによって、前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約１０分
の１〜２００分の１に低下させることができるように設計または改変される、請
求項７６に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項７８】前記ハイブリダイゼーション組成物はＤＥＮＨＹＢ^ＴＭの
名称でシグマ（Ｓｉｇｍａ）社によって販売されている製造物を含む、請求項７
７に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項７９】前記多数の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲ
ノムＤＮＡと比較したときに少なく示されるように前記組成物から少なくとも部
分的に除かれる、請求項７６に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項８０】前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から
得られるＰＣＲ産物を前記蛍光基で標識することによって調製される、請求項７
６に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項８１】前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前
記蛍光基で標識することによって調製される、請求項７６に記載のハイブリダイ
ゼーション組成物。