JP2002521066A - 蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを行うための方法および組成物 - Google Patents
蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを行うための方法および組成物Info
- Publication number
- JP2002521066A JP2002521066A JP2000562555A JP2000562555A JP2002521066A JP 2002521066 A JP2002521066 A JP 2002521066A JP 2000562555 A JP2000562555 A JP 2000562555A JP 2000562555 A JP2000562555 A JP 2000562555A JP 2002521066 A JP2002521066 A JP 2002521066A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hybridization
- hybridization composition
- chromosome
- composition
- paints
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
(a)1つの種の染色体展開物を得る工程;(b)多数の染色体ペイントを含有するハイブリダイゼーション組成物を調製する工程であって、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の平均比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントはそれぞれが異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識される工程;(c)前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前記ハイブリダイゼーション組成物における前記高頻度反復配列の少なくとも一部を再アニーリングさせるが、前記ハイブリダイゼーション組成物における前記ユニーク配列の少なくとも一部が一本鎖のままである条件に前記ハイブリダイゼーション組成物を供する工程;(d)前記ハイブリダイゼーション組成物をハイブリダイゼーション条件のもとで前記染色体展開物と接触させる工程;(e)過剰な前記ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工程;および(f)前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開物を分析して、その像を示す工程を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
Description
【0001】 (発明の分野および背景) 本発明は、一般には、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションによる核型
決定に関する。より詳しくは、本発明は、加えられた未標識の高頻度反復DNA
(Cot−I画分など)を含まず、そして必要に応じて、変性、および細胞サン
プルにおけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大に
し、それによって、用いられるプローブの濃度を少なくとも約10分の1〜20
0分の1に低下させることができるように設計されている染色体ペイントのハイ
ブリダイゼーション組成物を使用する蛍光インサイチューハイブリダイゼーショ
ンを行うための方法および組成物に関する。
決定に関する。より詳しくは、本発明は、加えられた未標識の高頻度反復DNA
(Cot−I画分など)を含まず、そして必要に応じて、変性、および細胞サン
プルにおけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大に
し、それによって、用いられるプローブの濃度を少なくとも約10分の1〜20
0分の1に低下させることができるように設計されている染色体ペイントのハイ
ブリダイゼーション組成物を使用する蛍光インサイチューハイブリダイゼーショ
ンを行うための方法および組成物に関する。
【0002】 ヒトなどの高等生物のゲノムには、すべての染色体にわたって分布する反復配
列が大きな割合で含まれている。Cot曲線によって示されるように、ヒトのゲ
ノムは、大まかには下記の配列に分類することができる:(i)高頻度反復配列
(これはまた、再会合に対する高速成分または第1部分として知られている)、
すなわち、Cot−I部分(Cot=約10−4M・sec〜約2・10−2M
・sec、Cot1/2=約1.3・10−3M・sec)、例えば、Alu配
列およびAlu様配列、LINE1配列およびLINE2配列、αサテライト配
列、βサテライト配列、古典的なサテライト配列などであるが、これらに限定さ
れない;(ii)中頻度反復配列(これはまた、中間成分として知られている)
(Cot=約2・10−1M・sec〜約102M・sec、Cot1/2=約
1.9M・sec)、例えば、リボソームDNAなどであるが、これに限定され
ない;および(iii)低頻度反復のユニーク配列(これはまた、再生に対する
遅速度成分または最終画分として知られている)(Cot=約102M・sec
〜約104M・sec、Cot1/2=約6.3・102M・sec)、例えば
、遺伝子コード配列などであるが、これに限定されない。ヒトゲノムのこれらの
部分に関してさらに詳しいことは、例えば、遺伝子V(Benjamin Le
win、Oxford大学出版(1994)、660頁〜675頁)に記載され
ている(これは、本明細書中に十分に示されるかのように参考として援用される
)。
列が大きな割合で含まれている。Cot曲線によって示されるように、ヒトのゲ
ノムは、大まかには下記の配列に分類することができる:(i)高頻度反復配列
(これはまた、再会合に対する高速成分または第1部分として知られている)、
すなわち、Cot−I部分(Cot=約10−4M・sec〜約2・10−2M
・sec、Cot1/2=約1.3・10−3M・sec)、例えば、Alu配
列およびAlu様配列、LINE1配列およびLINE2配列、αサテライト配
列、βサテライト配列、古典的なサテライト配列などであるが、これらに限定さ
れない;(ii)中頻度反復配列(これはまた、中間成分として知られている)
(Cot=約2・10−1M・sec〜約102M・sec、Cot1/2=約
1.9M・sec)、例えば、リボソームDNAなどであるが、これに限定され
ない;および(iii)低頻度反復のユニーク配列(これはまた、再生に対する
遅速度成分または最終画分として知られている)(Cot=約102M・sec
〜約104M・sec、Cot1/2=約6.3・102M・sec)、例えば
、遺伝子コード配列などであるが、これに限定されない。ヒトゲノムのこれらの
部分に関してさらに詳しいことは、例えば、遺伝子V(Benjamin Le
win、Oxford大学出版(1994)、660頁〜675頁)に記載され
ている(これは、本明細書中に十分に示されるかのように参考として援用される
)。
【0003】 従って、染色体ペイントなどの反復配列を含むプローブを、染色体展開物など
の反復配列を同様に含む標的DNAとハイブリダイゼーションさせる場合には、
プローブに由来する標識された反復配列と標的DNAにおける反復配列とのハイ
ブリダイゼーションを制限するか、またはそのようなハイブリダイゼーションを
低下させるための方策を取らなければならない。
の反復配列を同様に含む標的DNAとハイブリダイゼーションさせる場合には、
プローブに由来する標識された反復配列と標的DNAにおける反復配列とのハイ
ブリダイゼーションを制限するか、またはそのようなハイブリダイゼーションを
低下させるための方策を取らなければならない。
【0004】 このような方策には、下記の1つまたは複数が含まれ得る:(i)反復配列の
プローブからの除去;(ii)未標識の反復配列を過剰にプローブ組成物に加え
ることによってプローブの反復配列をブロッキングして、実質的に反復配列のみ
を、典型的にはハイブリダイゼーション時間の制限によってハイブリダイゼーシ
ョンさせるアニーリング条件を提供すること;および/または(iii)ハイブ
リダイゼーション操作中に未標識の反復配列を過剰に標的DNAに加えることに
よって標的DNAの反復配列をブロッキングすること。蛍光インサイチューハイ
ブリダイゼーションを考えた場合、プローブの反復配列をブロッキングすること
が、現在、最も良好な結果をもたらす最善の方法として受け入れられている。
プローブからの除去;(ii)未標識の反復配列を過剰にプローブ組成物に加え
ることによってプローブの反復配列をブロッキングして、実質的に反復配列のみ
を、典型的にはハイブリダイゼーション時間の制限によってハイブリダイゼーシ
ョンさせるアニーリング条件を提供すること;および/または(iii)ハイブ
リダイゼーション操作中に未標識の反復配列を過剰に標的DNAに加えることに
よって標的DNAの反復配列をブロッキングすること。蛍光インサイチューハイ
ブリダイゼーションを考えた場合、プローブの反復配列をブロッキングすること
が、現在、最も良好な結果をもたらす最善の方法として受け入れられている。
【0005】 しかし、このような方法はすべて、多くの時間を要するさらなる工程を必要と
し、良好な結果を得るためには非常に正確に行わなければならない。
し、良好な結果を得るためには非常に正確に行わなければならない。
【0006】 蛍光性色素(すなわち、蛍光プローブ、蛍光基、蛍光色素)は、組織および細
胞を分析するための最も強力で汎用的なツールの1つである。従って、蛍光顕微
鏡検査は、光学顕微鏡検査において使用される最も重要な実験法の1つである[
Lakowicz(1983)、蛍光顕微鏡検査の原理、Plenum Pre
ss、New York、London]。
胞を分析するための最も強力で汎用的なツールの1つである。従って、蛍光顕微
鏡検査は、光学顕微鏡検査において使用される最も重要な実験法の1つである[
Lakowicz(1983)、蛍光顕微鏡検査の原理、Plenum Pre
ss、New York、London]。
【0007】 蛍光プローブの能力は、主に、特定の色素を結合させることができる非常に多
様な生物学的構造による[Waggoner(1986)、生物医科学における
蛍光の応用、Taylor他編、New York;Alan R.Liss,
Inc.、3頁〜28頁]。蛍光プローブの詳細な総説については、Mason
編(1993)、生物学的活性に対する蛍光プローブおよび発光プローブ(生物
学技術シリーズ、Sattelle編、Academic Press Lim
ited、London);PloemおよびTanke(1987)、蛍光顕
微鏡検査入門(Oxford大学出版、王立顕微鏡検査学会)を参照のこと。
様な生物学的構造による[Waggoner(1986)、生物医科学における
蛍光の応用、Taylor他編、New York;Alan R.Liss,
Inc.、3頁〜28頁]。蛍光プローブの詳細な総説については、Mason
編(1993)、生物学的活性に対する蛍光プローブおよび発光プローブ(生物
学技術シリーズ、Sattelle編、Academic Press Lim
ited、London);PloemおよびTanke(1987)、蛍光顕
微鏡検査入門(Oxford大学出版、王立顕微鏡検査学会)を参照のこと。
【0008】 より洗練された新しい蛍光性色素分子の迅速な開発により、これらの色素の潜
在的能力を十分に利用し得るより進んだ蛍光画像化技術が必要とされ続けている
。蛍光性色素が有し、そして研究が現在行われているように、蛍光性色素が有し
続けている画期的な影響の議論については、Taylor他(1992)、光学
顕微鏡検査の新展開(American Scientist、第80巻、32
2頁〜335頁)を参照のこと。
在的能力を十分に利用し得るより進んだ蛍光画像化技術が必要とされ続けている
。蛍光性色素が有し、そして研究が現在行われているように、蛍光性色素が有し
続けている画期的な影響の議論については、Taylor他(1992)、光学
顕微鏡検査の新展開(American Scientist、第80巻、32
2頁〜335頁)を参照のこと。
【0009】 多数の蛍光プローブを検出することが特に好都合であり得る重要な例は、遺伝
子を染色体レベルで分析して、遺伝子/染色体の増幅、欠失、転座、再編成、な
らびに遺伝子および/または染色体に関連する他の異常などの起こり得る遺伝子
的欠陥を見出すFISH(蛍光インサイチューハイブリダイゼーション)[Em
anuel(1993)、Growth Genetics and Horm
ones、9、6頁〜12頁]である。
子を染色体レベルで分析して、遺伝子/染色体の増幅、欠失、転座、再編成、な
らびに遺伝子および/または染色体に関連する他の異常などの起こり得る遺伝子
的欠陥を見出すFISH(蛍光インサイチューハイブリダイゼーション)[Em
anuel(1993)、Growth Genetics and Horm
ones、9、6頁〜12頁]である。
【0010】 多くのガンおよび先天的欠損症を含むいくつかの疾患および異常は、1つまた
は複数の遺伝子における欠陥(すなわち、変異)によって引き起こされる遺伝子
的異常である。多くの他の疾患が、遺伝子成分(1つまたは複数)を有すること
が知られ、あるいは遺伝子成分(1つまたは複数)を有すると考えられている。
すなわち、疾患を単独では引き起こさず、疾患に寄与するか、あるいは生涯の後
期に発病させる可能性、多因性疾患および遺伝子的素因としてこの分野で知られ
ている現象を増大させる遺伝子的欠陥(1つまたは複数)が存在する。
は複数の遺伝子における欠陥(すなわち、変異)によって引き起こされる遺伝子
的異常である。多くの他の疾患が、遺伝子成分(1つまたは複数)を有すること
が知られ、あるいは遺伝子成分(1つまたは複数)を有すると考えられている。
すなわち、疾患を単独では引き起こさず、疾患に寄与するか、あるいは生涯の後
期に発病させる可能性、多因性疾患および遺伝子的素因としてこの分野で知られ
ている現象を増大させる遺伝子的欠陥(1つまたは複数)が存在する。
【0011】 認識可能な遺伝子的欠陥を知られている疾患と相関させることにより、医師は
、最終的な診断を下すことができ、多くの疾患を初期に検出して処置することが
できる。遺伝子カウンセリングは、潜在的に重大な医学的問題が将来生じる可能
性が予想される親およびその危険性を有する個体に警告し、適切な介入を可能に
する。
、最終的な診断を下すことができ、多くの疾患を初期に検出して処置することが
できる。遺伝子カウンセリングは、潜在的に重大な医学的問題が将来生じる可能
性が予想される親およびその危険性を有する個体に警告し、適切な介入を可能に
する。
【0012】 8,000を超える遺伝子的異常が現在同定されており、その多くは多数の遺
伝子的欠陥を伴っている。染色体が遺伝情報のキャリアであるということが発見
された後、科学者は、特定の異常に関わる染色体における認識可能な欠陥を明ら
かにできると推論した。
伝子的欠陥を伴っている。染色体が遺伝情報のキャリアであるということが発見
された後、科学者は、特定の異常に関わる染色体における認識可能な欠陥を明ら
かにできると推論した。
【0013】 1960年代に、染色技術が、中期染色体展開物を顕微鏡検査に基づいて分類
するために開発された。数十年間にわたって、染色体のバンド形成パターンの肉
眼による分析が、ヒトの遺伝子的異常を、中期染色体において認められる構造的
異常と相関させるために使用されている。染色体は、典型的には、ギームザ染色
(Gバンド形成)後の明視野の顕微鏡検査によって、あるいは蛍光染色(Rバン
ド形成)後の蛍光顕微鏡検査によって調べられ、特徴的な明バンドおよび暗バン
ドがその長さに沿って明らかにされる。患者のバンド形成パターンを正常な染色
体のバンド形成パターンと注意深く比較することによって、転座(染色体間また
は染色体内における遺伝物質の交換)、欠失(染色体(1つまたは複数)または
そのフラグメント(1つまたは複数)の喪失)、付加、逆位、ならびに奇形およ
び遺伝子疾患をもたらす他の欠陥などの異常を明らかにすることができる。しか
し、従来の染色体バンド形成技術では分解に限界がある。
するために開発された。数十年間にわたって、染色体のバンド形成パターンの肉
眼による分析が、ヒトの遺伝子的異常を、中期染色体において認められる構造的
異常と相関させるために使用されている。染色体は、典型的には、ギームザ染色
(Gバンド形成)後の明視野の顕微鏡検査によって、あるいは蛍光染色(Rバン
ド形成)後の蛍光顕微鏡検査によって調べられ、特徴的な明バンドおよび暗バン
ドがその長さに沿って明らかにされる。患者のバンド形成パターンを正常な染色
体のバンド形成パターンと注意深く比較することによって、転座(染色体間また
は染色体内における遺伝物質の交換)、欠失(染色体(1つまたは複数)または
そのフラグメント(1つまたは複数)の喪失)、付加、逆位、ならびに奇形およ
び遺伝子疾患をもたらす他の欠陥などの異常を明らかにすることができる。しか
し、従来の染色体バンド形成技術では分解に限界がある。
【0014】 蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)は数多くの相補的技
術の改善により過去25年間にわたって進化している。その進歩は、遺伝子の正
確な位置を染色体上にマッピングするためのより良好な道具を開発するために、
そして染色体の全体的な染色によって認識できない非常に小さい遺伝子的欠陥を
検出するために細胞遺伝学者の要望によって進められている。
術の改善により過去25年間にわたって進化している。その進歩は、遺伝子の正
確な位置を染色体上にマッピングするためのより良好な道具を開発するために、
そして染色体の全体的な染色によって認識できない非常に小さい遺伝子的欠陥を
検出するために細胞遺伝学者の要望によって進められている。
【0015】 すべてのヒト遺伝子を同定してマッピングする果敢な第一歩であるヒトゲノム
プロジェクト(HGP)により、FISHが注目され、多く必要とされるDNA
プローブの開発が急務となっている。現在のFISH技術もまた、強力な免疫学
的プローブ、顕微鏡検査および分光法に必要な増大しつつある様々な優れた蛍光
性色素の同時に行われる開発、ならびに蛍光顕微鏡検査のために使用される対物
レンズ、イルミネーターおよびフィルターにおける劇的な改善によって可能にな
っている。
プロジェクト(HGP)により、FISHが注目され、多く必要とされるDNA
プローブの開発が急務となっている。現在のFISH技術もまた、強力な免疫学
的プローブ、顕微鏡検査および分光法に必要な増大しつつある様々な優れた蛍光
性色素の同時に行われる開発、ならびに蛍光顕微鏡検査のために使用される対物
レンズ、イルミネーターおよびフィルターにおける劇的な改善によって可能にな
っている。
【0016】 FISHの能力および有用性は多くの要因による:(i)FISHは、単離さ
れた染色体および核に対してだけでなく、固定されたパラフィン包埋組織切片内
の細胞全体に対しても使用できること;(ii)FISHにより、比較的小さい
欠陥が検出できること(より小さい欠陥を検出する能力は絶えず増大している)
;(iii)FISHにより、結果が比較的迅速に得られうること;(iv)そ
の手頃な費用により、FISHは大部分の診断室および研究室で使用できること
;(v)様々なプローブおよび標本タイプに対する適合化が開発できること;お
よび(vi)大きな特異性および感度が得られうること;(vii)短時間であ
ること、場合により、2時間の範囲であること。
れた染色体および核に対してだけでなく、固定されたパラフィン包埋組織切片内
の細胞全体に対しても使用できること;(ii)FISHにより、比較的小さい
欠陥が検出できること(より小さい欠陥を検出する能力は絶えず増大している)
;(iii)FISHにより、結果が比較的迅速に得られうること;(iv)そ
の手頃な費用により、FISHは大部分の診断室および研究室で使用できること
;(v)様々なプローブおよび標本タイプに対する適合化が開発できること;お
よび(vi)大きな特異性および感度が得られうること;(vii)短時間であ
ること、場合により、2時間の範囲であること。
【0017】 多くのFISH適用により細胞遺伝学者に求められていることは、単に、顕微
鏡の接眼レンズを通して見て、あるいはモニター上の画像を見て、蛍光標識が存
在するか、または存在しないかどうかを明らかにすることだけである。少しより
複雑な標本の場合には、1つまたは2つの発色標識を単純に計測することが行わ
れることがある。しかし、デジタル画像を処理して、その画像から数値データを
抽出することができることは、非常に広い新しい可能性をFISH技術にもたら
す。
鏡の接眼レンズを通して見て、あるいはモニター上の画像を見て、蛍光標識が存
在するか、または存在しないかどうかを明らかにすることだけである。少しより
複雑な標本の場合には、1つまたは2つの発色標識を単純に計測することが行わ
れることがある。しかし、デジタル画像を処理して、その画像から数値データを
抽出することができることは、非常に広い新しい可能性をFISH技術にもたら
す。
【0018】 適切な画像化方法は、非常にかすかなFISH像を増強することができ、その
結果、標識された染色体および遺伝子座を明確に同定することができる。容易に
達成される実験条件のもとでは、標識部位の数を自動的に計測することができる
。さらに、それぞれの標識部位における強度を測定することができ、DNAの量
を、例えば特定の遺伝子が存在するコピー数を明らかにするために計算すること
ができる。
結果、標識された染色体および遺伝子座を明確に同定することができる。容易に
達成される実験条件のもとでは、標識部位の数を自動的に計測することができる
。さらに、それぞれの標識部位における強度を測定することができ、DNAの量
を、例えば特定の遺伝子が存在するコピー数を明らかにするために計算すること
ができる。
【0019】 上記に論じられているように、FISHにより、標識されたプローブの位置、
各染色体における標識部位の数、および各部位における標識化強度(遺伝物質の
量)に関する情報を得ることができる。動原体(反復DNA)プローブおよび染
色体ペイントが、標識のために、それぞれが標的化された染色体が存在するコピ
ー数を計測するために、そして構造的変化を検出するために使用される。遺伝子
座に特異的なプローブが、遺伝物質の小さな領域の位置をマッピングするために
使用される。このようなタイプのプローブは、中期染色体展開物と同様に、無傷
の間期核について使用することができ、そして肉眼的に、あるいは好適なアルゴ
リズムによって自動的に計測することができる。そのようなプローブは、染色体
および/または遺伝子における数的変化および/または構造的変化を特徴とする
遺伝子疾患を同定するために日常的に使用される。
各染色体における標識部位の数、および各部位における標識化強度(遺伝物質の
量)に関する情報を得ることができる。動原体(反復DNA)プローブおよび染
色体ペイントが、標識のために、それぞれが標的化された染色体が存在するコピ
ー数を計測するために、そして構造的変化を検出するために使用される。遺伝子
座に特異的なプローブが、遺伝物質の小さな領域の位置をマッピングするために
使用される。このようなタイプのプローブは、中期染色体展開物と同様に、無傷
の間期核について使用することができ、そして肉眼的に、あるいは好適なアルゴ
リズムによって自動的に計測することができる。そのようなプローブは、染色体
および/または遺伝子における数的変化および/または構造的変化を特徴とする
遺伝子疾患を同定するために日常的に使用される。
【0020】 FISHを使用した場合、(例えば、フローサイトメトリーを使用して)染色
体を単離して、(例えば、超音波処理によって)物理的に、あるいは(例えば、
エンドヌクレアーゼによって)酵素的に切断し、そしてそのフラグメントのすべ
てに対する一組のプローブを作製することによって1つの特定の染色体の表面全
体を均一に標識することができる。染色体全域プローブ(これはまた、染色体ペ
イントとして知られている)により、その標的染色体の全コピーが蛍光的に標識
される。染色体をペイント化する1つの重要な適用は、いくつかのガンの初期段
階において特徴的に生じている2つの染色体間における遺伝物質の転座を検出す
ることである。しかし、他の染色体異常もまた検出可能である。
体を単離して、(例えば、超音波処理によって)物理的に、あるいは(例えば、
エンドヌクレアーゼによって)酵素的に切断し、そしてそのフラグメントのすべ
てに対する一組のプローブを作製することによって1つの特定の染色体の表面全
体を均一に標識することができる。染色体全域プローブ(これはまた、染色体ペ
イントとして知られている)により、その標的染色体の全コピーが蛍光的に標識
される。染色体をペイント化する1つの重要な適用は、いくつかのガンの初期段
階において特徴的に生じている2つの染色体間における遺伝物質の転座を検出す
ることである。しかし、他の染色体異常もまた検出可能である。
【0021】 例えば、染色体Aが緑色ペイントで特異的に標識され、かつ染色体Bが赤色ペ
イントで標識された場合、AからBへの遺伝物質の転座は、赤色領域に並置する
緑色領域として現れる(逆に、BからAへの遺伝物質の転座は、緑色領域に並置
する赤色領域として現れる)。
イントで標識された場合、AからBへの遺伝物質の転座は、赤色領域に並置する
緑色領域として現れる(逆に、BからAへの遺伝物質の転座は、緑色領域に並置
する赤色領域として現れる)。
【0022】 典型的には、正常な染色体から得られる染色体ペイントが、異常な(患者)染
色体に伴う構造的異常を検出するために使用される。逆の染色体ペイント化には
、異常な染色体に物質をもたらした様々な正常な染色体に由来するDNAを同定
するために、異常な染色体から作製されたプローブが使用される。
色体に伴う構造的異常を検出するために使用される。逆の染色体ペイント化には
、異常な染色体に物質をもたらした様々な正常な染色体に由来するDNAを同定
するために、異常な染色体から作製されたプローブが使用される。
【0023】 下記の実施例の節に例示されている本発明の方法により、それぞれが異なる色
で、ヒトの核型を含む24個の異なる染色体(すなわち、ゲノム)をペイント化
することができ、そして1回のハイブリダイゼーション操作、その後の1回の短
い測定を使用して、着色されたヒト核型を同時に検出し、同定して、意味のある
ように表示することができる。
で、ヒトの核型を含む24個の異なる染色体(すなわち、ゲノム)をペイント化
することができ、そして1回のハイブリダイゼーション操作、その後の1回の短
い測定を使用して、着色されたヒト核型を同時に検出し、同定して、意味のある
ように表示することができる。
【0024】 染色体ペイントを標識するために使用される多色の蛍光性色素における著しい
改善は、少数の塩基性蛍光性色素の様々な組み合わせが用いられるコンビナトリ
アル蛍光法(例えば、コンビナトリアル標識化およびコンビナトリアルハイブリ
ダイゼーション)の導入である。コンビナトリアルハイブリダイゼーションに関
してさらに詳しいことについては、Ried他(1992)、コンビナトリアル
蛍光およびデジタル画像化顕微鏡検査を使用するインサイチューハイブリダイゼ
ーションによる7種の異なるDNAプローブの同時可視化、Proc.Natl
.Acad.Sci.USA、89、1388〜1392;およびRied(1
994年1月)、遺伝子診断における蛍光インサイチューハイブリダイゼーショ
ン、Ruprecht−Karls大学理論医学部(Heidelberg)を
参照のこと(これらはともに、本明細書中に十分に示されているかのように参考
として援用される)。コンビナトリアル標識化に関してさらに詳しいことについ
ては、du−Manoir他(1993)、比較ゲノムインサイチューハイブリ
ダイゼーションによる完全または部分的な染色体の獲得および喪失の検出、Hu
m.Genet.、90、590〜610;および米国特許第5,759,78
1号(Ward他)を参照のこと(これらはともに、本明細書中に十分に示され
ているかのように参考として援用される)。
改善は、少数の塩基性蛍光性色素の様々な組み合わせが用いられるコンビナトリ
アル蛍光法(例えば、コンビナトリアル標識化およびコンビナトリアルハイブリ
ダイゼーション)の導入である。コンビナトリアルハイブリダイゼーションに関
してさらに詳しいことについては、Ried他(1992)、コンビナトリアル
蛍光およびデジタル画像化顕微鏡検査を使用するインサイチューハイブリダイゼ
ーションによる7種の異なるDNAプローブの同時可視化、Proc.Natl
.Acad.Sci.USA、89、1388〜1392;およびRied(1
994年1月)、遺伝子診断における蛍光インサイチューハイブリダイゼーショ
ン、Ruprecht−Karls大学理論医学部(Heidelberg)を
参照のこと(これらはともに、本明細書中に十分に示されているかのように参考
として援用される)。コンビナトリアル標識化に関してさらに詳しいことについ
ては、du−Manoir他(1993)、比較ゲノムインサイチューハイブリ
ダイゼーションによる完全または部分的な染色体の獲得および喪失の検出、Hu
m.Genet.、90、590〜610;および米国特許第5,759,78
1号(Ward他)を参照のこと(これらはともに、本明細書中に十分に示され
ているかのように参考として援用される)。
【0025】 数多くの方法を、(染色体ペイント化を含む)FISHアッセイにおいて使用
されるDNAプローブを標識するために利用することができる。これには、ビオ
チンまたはジゴキシゲニンなどのハプテンが、酵素的反応を使用してDNAに取
り込まれる間接的な方法が含まれる。中期染色体展開物または間期核に対するハ
イブリダイゼーションの後、蛍光標識が、免疫学方法を使用することによってハ
イブリッドに結合させられる。より最近では、蛍光性色素が、中間工程を使用す
ることなく、プローブに直接取り込まれて検出される。標準的なFISH色素に
は、フルオレセイン、ローダミン、テキサス−レッドおよびカスケードブルーが
含まれ、多プローブFISH分析を、コンビナトリアル標識化としてこの分野で
知られているように種々のハプテンまたは蛍光性色素およびその組み合わせで種
々のプローブを標識することによって行うことができる。あるいは、所定のプロ
ーブ集団を、それぞれが異なる蛍光基で標識されるサブ集団に分割し、その後、
それ以外では類似するハイブリダイゼーション結果が得られるようにサブ集団を
再度分けることができる(コンビナトリアルハイブリダイゼーションとしてこの
分野で知られている方法)。両方の標識化法に従って、コンビナトリアルプロー
ブが得られる。従って、「蛍光基の組み合わせ」という用語が、本明細書中にお
いて、特に添付された請求項において使用されている場合、それは、上記に記載
されているコンビナトリアル標識化およびコンビナトリアルハイブリダイゼーシ
ョンの両方を示す。
されるDNAプローブを標識するために利用することができる。これには、ビオ
チンまたはジゴキシゲニンなどのハプテンが、酵素的反応を使用してDNAに取
り込まれる間接的な方法が含まれる。中期染色体展開物または間期核に対するハ
イブリダイゼーションの後、蛍光標識が、免疫学方法を使用することによってハ
イブリッドに結合させられる。より最近では、蛍光性色素が、中間工程を使用す
ることなく、プローブに直接取り込まれて検出される。標準的なFISH色素に
は、フルオレセイン、ローダミン、テキサス−レッドおよびカスケードブルーが
含まれ、多プローブFISH分析を、コンビナトリアル標識化としてこの分野で
知られているように種々のハプテンまたは蛍光性色素およびその組み合わせで種
々のプローブを標識することによって行うことができる。あるいは、所定のプロ
ーブ集団を、それぞれが異なる蛍光基で標識されるサブ集団に分割し、その後、
それ以外では類似するハイブリダイゼーション結果が得られるようにサブ集団を
再度分けることができる(コンビナトリアルハイブリダイゼーションとしてこの
分野で知られている方法)。両方の標識化法に従って、コンビナトリアルプロー
ブが得られる。従って、「蛍光基の組み合わせ」という用語が、本明細書中にお
いて、特に添付された請求項において使用されている場合、それは、上記に記載
されているコンビナトリアル標識化およびコンビナトリアルハイブリダイゼーシ
ョンの両方を示す。
【0026】 染色体ペイント化および核型決定、多色の染色体バンド形成および比較ゲノム
ハイブリダイゼーションのためにコンビナトリアル蛍光基を使用することが、米
国特許出願第08/635,820号(1996年4月22日出願)、米国特許
第5,759,781号(Ward他)、およびScience誌[E.Sch
roeck他(1996)、ヒト染色体の多色分光的核型決定、Science
、273、494〜497]に詳しく記載されている(これらはすべて、本明細
書中に十分に示されているかのように参考として援用される)。
ハイブリダイゼーションのためにコンビナトリアル蛍光基を使用することが、米
国特許出願第08/635,820号(1996年4月22日出願)、米国特許
第5,759,781号(Ward他)、およびScience誌[E.Sch
roeck他(1996)、ヒト染色体の多色分光的核型決定、Science
、273、494〜497]に詳しく記載されている(これらはすべて、本明細
書中に十分に示されているかのように参考として援用される)。
【0027】 Scienceに記載されている大きな進歩は、分光的画像化によってゲノム
全体を走査することにより、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FI
SH)後のそれぞれのヒト染色体に関して規定された発光スペクトルを即座に可
視化できることである。スペクトルのコンピューター分離(分類)によって、分
光的に重なっている染色体に特異的なDNAプローブが分離され、従って、すべ
てのヒト染色体が同時に同定される。
全体を走査することにより、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FI
SH)後のそれぞれのヒト染色体に関して規定された発光スペクトルを即座に可
視化できることである。スペクトルのコンピューター分離(分類)によって、分
光的に重なっている染色体に特異的なDNAプローブが分離され、従って、すべ
てのヒト染色体が同時に同定される。
【0028】 それに記載されているこの分光的画像化法は、可視および近赤外の分光範囲に
おいてサンプルの発光スペクトルにおけるすべての点を同時に測定するために、
フーリエ分光法、電荷結合デバイス(CCD)による画像化、および光学顕微鏡
検査が一緒になっている。これにより、多数の分光的に重なるプローブの使用が
可能になる。この方法は、(多くの異なる波長で測定された画素毎における一連
の強度から同定される)異なるスペクトルの測定に基づいている。これにより、
多数の蛍光基の識別が容易になる。蛍光発色基の識別が、蛍光発色基に特異的な
少数の狭域光学フィルターを介した蛍光強度の測定に基づいている従来の表面蛍
光による顕微鏡検査[Speicher他(1996)、Nature Gen
etics、12:368〜375を参照のこと]とは劇的に異なり、それに記
載されているように、分光的核型決定を使用することにより、発散される光のス
ペクトルに含まれる発散された光子に存在する利用可能な情報のすべてを分析に
使用することができる。
おいてサンプルの発光スペクトルにおけるすべての点を同時に測定するために、
フーリエ分光法、電荷結合デバイス(CCD)による画像化、および光学顕微鏡
検査が一緒になっている。これにより、多数の分光的に重なるプローブの使用が
可能になる。この方法は、(多くの異なる波長で測定された画素毎における一連
の強度から同定される)異なるスペクトルの測定に基づいている。これにより、
多数の蛍光基の識別が容易になる。蛍光発色基の識別が、蛍光発色基に特異的な
少数の狭域光学フィルターを介した蛍光強度の測定に基づいている従来の表面蛍
光による顕微鏡検査[Speicher他(1996)、Nature Gen
etics、12:368〜375を参照のこと]とは劇的に異なり、それに記
載されているように、分光的核型決定を使用することにより、発散される光のス
ペクトルに含まれる発散された光子に存在する利用可能な情報のすべてを分析に
使用することができる。
【0029】 分光的に重なっている蛍光基を識別するための分光的方法(分類)は、各蛍光
発色基の発光スペクトルの違いが測定可能で、安定している場合には非常に多く
の蛍光発色基に容易に拡大される。
発色基の発光スペクトルの違いが測定可能で、安定している場合には非常に多く
の蛍光発色基に容易に拡大される。
【0030】 中期調製物におけるそれぞれのヒト染色体の同時同定(分光的核型決定として
示される方法)もまた報告されている。この目的に対して、流動分類されたヒト
染色体に由来するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作製された染色体に
特異的な組成物ライブラリーが、5種の異なる蛍光基に結合したヌクレオチドま
たはその組み合わせで直接標識される。その後、24個のすべての染色体を含有
する組成物プローブ集団が中期染色体に対してハイブリダイゼーションさせられ
る。染色体に特異的な標識化が抑圧的ハイブリダイゼーションによって達成され
る。詳しく記載すると、ハイブリダイゼーション組成物における反復配列は、未
標識のヒトCot−IDNAを過剰に加えることによってブロッキングされる。
示される方法)もまた報告されている。この目的に対して、流動分類されたヒト
染色体に由来するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作製された染色体に
特異的な組成物ライブラリーが、5種の異なる蛍光基に結合したヌクレオチドま
たはその組み合わせで直接標識される。その後、24個のすべての染色体を含有
する組成物プローブ集団が中期染色体に対してハイブリダイゼーションさせられ
る。染色体に特異的な標識化が抑圧的ハイブリダイゼーションによって達成され
る。詳しく記載すると、ハイブリダイゼーション組成物における反復配列は、未
標識のヒトCot−IDNAを過剰に加えることによってブロッキングされる。
【0031】 ハイブリダイゼーションは、RGB表示および分類色の両方で示される。表示
色により、すべてのヒト染色体を分光的画像化の後で容易に可視化することがで
き、そして各画素における分光的測定に基づいて、染色体の分類アルゴリズムが
、すべてのヒト染色体を分光的に核型決定するために適用される。最も重要な分
析アルゴリズムの1つは、画像における多数の異なるスペクトルを分類色で同定
および強調することができる分光型分類アルゴリズムである。これにより、その
スペクトルに基づいて、特定の分類色をすべてのヒト染色体に割り当てることが
できる。このアルゴリズムは、各染色体の(参照)スペクトルが測定されて、コ
ンピューター内の参照ライブラリーに保存されていることを仮定する。区別する
ための分類色が、その与えられた画素におけるスペクトルに最も類似している参
照スペクトルに割り当てられている分類色に従って画像内の画素のそれぞれに割
り当てられる。下記の数式1で示される最小二乗誤差アルゴリズムが画素毎に計
算される:
色により、すべてのヒト染色体を分光的画像化の後で容易に可視化することがで
き、そして各画素における分光的測定に基づいて、染色体の分類アルゴリズムが
、すべてのヒト染色体を分光的に核型決定するために適用される。最も重要な分
析アルゴリズムの1つは、画像における多数の異なるスペクトルを分類色で同定
および強調することができる分光型分類アルゴリズムである。これにより、その
スペクトルに基づいて、特定の分類色をすべてのヒト染色体に割り当てることが
できる。このアルゴリズムは、各染色体の(参照)スペクトルが測定されて、コ
ンピューター内の参照ライブラリーに保存されていることを仮定する。区別する
ための分類色が、その与えられた画素におけるスペクトルに最も類似している参
照スペクトルに割り当てられている分類色に従って画像内の画素のそれぞれに割
り当てられる。下記の数式1で示される最小二乗誤差アルゴリズムが画素毎に計
算される:
【数1】 式中、Ix,y(λ)は画素座標(x、y)における正規化スペクトルであり
、In(λ)はそれぞれの染色体(n=1、2、・・・、23、24)に対する
正規化参照スペクトルを示す。すべての参照スペクトルについてSx,y,nの
値を計算した後、最小値が選ばれ、人為的な分類色が、最も類似する参照スペク
トルに割り当てられた分類色に従ってその画素に割り当てられる。
、In(λ)はそれぞれの染色体(n=1、2、・・・、23、24)に対する
正規化参照スペクトルを示す。すべての参照スペクトルについてSx,y,nの
値を計算した後、最小値が選ばれ、人為的な分類色が、最も類似する参照スペク
トルに割り当てられた分類色に従ってその画素に割り当てられる。
【0032】 染色体異常に関するスクリーニング法としての分光的核型決定の可能性を、従
来のバンド形成法または染色体ペイント化プローブによるFISHが前もって行
われた多数の実験室から得られた臨床的サンプルを分析することによってさらに
調べた。すべての場合において、Gバンド形成および分光的核型決定は、結果が
一致していることが明らかにされた。いくつかの場合には、ギームザバンド形成
は、染色体異常を完全に解釈するには十分ではなかった。この場合、分光的核型
決定による染色体異常の診断を従来の二色FISH分析により確認した。この報
告のために分析された最小の識別可能な異常は、相互転座が従来のバンド形成分
析では認識されなかったt(1;11)(q44;p15.3)の転座であった
。この相互転座に寄与する染色体物質の起源は正しく分類された。第1染色体お
よび第11染色体における転座セグメントは、染色体1qおよび染色体11pに
対するサブテロメアに特異的なコスミドプローブによって確認されていた。用い
たプローブの位置に基づいて、変化の大きさは、>1,500kbpであると見
積もられた。別の場合には、バンド形成分析によって、第4染色体から第12染
色体へのセグメントの転座が示唆された。分光的核型決定により、第4染色体に
由来するさらなる染色体物質の起源が明確に同定および分類された。分光的核型
決定の感度限界を測定するために、(中期染色体および前中期染色体の両方にお
いて認識できない)第16染色体および第17染色体が関与する極微小の転座の
場合を調べた。このt(16;17)は、コスミドプローブを用いたFISHに
よって以前に明らかにされており、クロマチンの相互交換が約500kbpで見
積もられた。この患者から得られた中期染色体を用いた分光的核型決定は、この
知られているt(16;17)を同定することができなかった。このことは、現
在得られるペイント化プローブを用いた中期染色体分析の感度限界は500kp
b〜1,500kbpの間であることを示唆している。
来のバンド形成法または染色体ペイント化プローブによるFISHが前もって行
われた多数の実験室から得られた臨床的サンプルを分析することによってさらに
調べた。すべての場合において、Gバンド形成および分光的核型決定は、結果が
一致していることが明らかにされた。いくつかの場合には、ギームザバンド形成
は、染色体異常を完全に解釈するには十分ではなかった。この場合、分光的核型
決定による染色体異常の診断を従来の二色FISH分析により確認した。この報
告のために分析された最小の識別可能な異常は、相互転座が従来のバンド形成分
析では認識されなかったt(1;11)(q44;p15.3)の転座であった
。この相互転座に寄与する染色体物質の起源は正しく分類された。第1染色体お
よび第11染色体における転座セグメントは、染色体1qおよび染色体11pに
対するサブテロメアに特異的なコスミドプローブによって確認されていた。用い
たプローブの位置に基づいて、変化の大きさは、>1,500kbpであると見
積もられた。別の場合には、バンド形成分析によって、第4染色体から第12染
色体へのセグメントの転座が示唆された。分光的核型決定により、第4染色体に
由来するさらなる染色体物質の起源が明確に同定および分類された。分光的核型
決定の感度限界を測定するために、(中期染色体および前中期染色体の両方にお
いて認識できない)第16染色体および第17染色体が関与する極微小の転座の
場合を調べた。このt(16;17)は、コスミドプローブを用いたFISHに
よって以前に明らかにされており、クロマチンの相互交換が約500kbpで見
積もられた。この患者から得られた中期染色体を用いた分光的核型決定は、この
知られているt(16;17)を同定することができなかった。このことは、現
在得られるペイント化プローブを用いた中期染色体分析の感度限界は500kp
b〜1,500kbpの間であることを示唆している。
【0033】 分光的核型決定は、従来のバンド形成分析を補完するために使用できる方法で
あることを明らかにするために、前もってGバンド形成させた染色体に対するハ
イブリダイゼーションを行った。おそらくはGバンド形成のために必要とされる
トリプシン消化のために、シグナル強度は、前もってGバンド形成させなかった
中期物と比較してわずかに低下していた。シグナル強度の減少は約10%であり
、従って、曝露時間を長くすることによって容易に補償することができる。Gバ
ンド形成させていない染色体と比較して、前もってGバンド形成させた染色体の
端においてわずかに増大したノイズもまた認められた。しかし、中期物の分類は
容易に行うことができる。
あることを明らかにするために、前もってGバンド形成させた染色体に対するハ
イブリダイゼーションを行った。おそらくはGバンド形成のために必要とされる
トリプシン消化のために、シグナル強度は、前もってGバンド形成させなかった
中期物と比較してわずかに低下していた。シグナル強度の減少は約10%であり
、従って、曝露時間を長くすることによって容易に補償することができる。Gバ
ンド形成させていない染色体と比較して、前もってGバンド形成させた染色体の
端においてわずかに増大したノイズもまた認められた。しかし、中期物の分類は
容易に行うことができる。
【0034】 従って、上記に記載された方法により、最初に、1つの正常な核型の染色体が
、従来の染色体バンド形成技術(例えば、Gバンド形成またはRバンド形成)に
よって同定される。次に、その同じ染色体は、上記に記載されているように染色
体ペイントとハイブリダイゼーションさせられる。その次に、染色体バンド形成
によって以前に決定されたように任意の染色体型(例えば、1〜22、X、およ
びヒト男性におけるY)に割り当てられた画素を特徴とする平均スペクトルが計
算され、得られたスペクトル(例えば、ヒトの場合には24個)により、参照ス
ペクトルのライブラリーが形成される。次に、参照スペクトルが、その後、新し
い核型の画素をその染色体に分類するために使用される。
、従来の染色体バンド形成技術(例えば、Gバンド形成またはRバンド形成)に
よって同定される。次に、その同じ染色体は、上記に記載されているように染色
体ペイントとハイブリダイゼーションさせられる。その次に、染色体バンド形成
によって以前に決定されたように任意の染色体型(例えば、1〜22、X、およ
びヒト男性におけるY)に割り当てられた画素を特徴とする平均スペクトルが計
算され、得られたスペクトル(例えば、ヒトの場合には24個)により、参照ス
ペクトルのライブラリーが形成される。次に、参照スペクトルが、その後、新し
い核型の画素をその染色体に分類するために使用される。
【0035】 上記に記載された結果、および他による結果(例えば、Speicher他(
1996)、Nature Genetics、12:368〜375を参照の
こと)が、染色体ペイントにおける高頻度反復配列を過剰の未標識のCot−I
部分(GIBCO−BRL Life−Technologies、Scotl
and)でブロッキングすることによって得られた。
1996)、Nature Genetics、12:368〜375を参照の
こと)が、染色体ペイントにおける高頻度反復配列を過剰の未標識のCot−I
部分(GIBCO−BRL Life−Technologies、Scotl
and)でブロッキングすることによって得られた。
【0036】 DENHYBTM(DENHYBはIngen Laboratories
Inc.の商標である)溶液は、試験者が開発したDNAプローブまたは市販の
DNAプローブを懸濁または溶解するために使用されるように設計されている。
DENHYBTM溶液は、変性、および細胞サンプルにおけるDNAプローブと
標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大にするように開発されている。D
ENHYBTM溶液は、直接的および間接的に標識されたDNAプローブと適合
し得る。2種類のDENHYBTM溶液を、標的またはプローブの性質に依存し
てシグマ(Sigma)社から入手することができる。
Inc.の商標である)溶液は、試験者が開発したDNAプローブまたは市販の
DNAプローブを懸濁または溶解するために使用されるように設計されている。
DENHYBTM溶液は、変性、および細胞サンプルにおけるDNAプローブと
標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大にするように開発されている。D
ENHYBTM溶液は、直接的および間接的に標識されたDNAプローブと適合
し得る。2種類のDENHYBTM溶液を、標的またはプローブの性質に依存し
てシグマ(Sigma)社から入手することができる。
【0037】 DENHYBTM(カタログ番号D001):反復配列(サテライト)を用い
たFISH、ペイント化、および同様にユニーク配列プローブに対して。
たFISH、ペイント化、および同様にユニーク配列プローブに対して。
【0038】 DENHYBTM(カタログ番号D003):ユニーク配列プローブとのFI
SHに推奨される。
SHに推奨される。
【0039】 DENHYBTM溶液は、プローブおよび標的がともに反復配列を含むときに
DNAのブロッキングを伴う使用に推奨される。
DNAのブロッキングを伴う使用に推奨される。
【0040】 DENHYBTM溶液を使用することにより、特定の適用および用いられるプ
ローブに依存して、最大の検出感度を維持しながら、プローブを10倍〜200
倍希釈することができる。DENHYBTM溶液はまた、ハイブリダイゼーショ
ン時間を、サテライトプローブを用いた間期核および中期細胞に対するFISH
が達成されるように15分までの間に短縮する。ペイントまたはユニーク配列プ
ローブを用いたFISHの場合、約3時間〜15時間のハイブリダイゼーション
で十分である。従って、DENHYBTM溶液の使用は費用を大きく削減する。
ローブに依存して、最大の検出感度を維持しながら、プローブを10倍〜200
倍希釈することができる。DENHYBTM溶液はまた、ハイブリダイゼーショ
ン時間を、サテライトプローブを用いた間期核および中期細胞に対するFISH
が達成されるように15分までの間に短縮する。ペイントまたはユニーク配列プ
ローブを用いたFISHの場合、約3時間〜15時間のハイブリダイゼーション
で十分である。従って、DENHYBTM溶液の使用は費用を大きく削減する。
【0041】 従って、加えられた未標識の高頻度反復DNA配列を有していない染色体ペイ
ントのハイブリダイゼーション組成物を使用する蛍光インサイチューハイブリダ
イゼーションに関する方法および組成物が必要なことが広く認識されており、そ
してそのような方法および組成物を得ることは非常に都合がよい。
ントのハイブリダイゼーション組成物を使用する蛍光インサイチューハイブリダ
イゼーションに関する方法および組成物が必要なことが広く認識されており、そ
してそのような方法および組成物を得ることは非常に都合がよい。
【0042】 (発明の要旨) 本発明により、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションに関する方法およ
び組成物が提供される。
び組成物が提供される。
【0043】 下記に記載されている本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により
、下記の工程を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法が提供される
:(a)1つの種の染色体展開物を得る工程;(b)多数の染色体ペイントを含
有するハイブリダイゼーション組成物を調製する工程であって、前記ハイブリダ
イゼーション組成物における高頻度反復配列の平均比活性が前記ハイブリダイゼ
ーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくなるように
、前記多数の染色体ペイントはそれぞれが異なる蛍光基または蛍光基の組み合わ
せで標識される工程;(c)前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前
記ハイブリダイゼーション組成物における前記高頻度反復配列の少なくとも一部
を再アニーリングさせるが、前記ハイブリダイゼーション組成物における前記ユ
ニーク配列の少なくとも一部が一本鎖のままである条件に前記ハイブリダイゼー
ション組成物を供する工程;(d)前記ハイブリダイゼーション組成物をハイブ
リダイゼーション条件のもとで前記展開物と接触させる工程;(e)過剰な前記
ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工程;および(f)前記のそのときに
ハイブリダイゼーションした染色体展開物を分析して、その像を示す工程。
、下記の工程を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法が提供される
:(a)1つの種の染色体展開物を得る工程;(b)多数の染色体ペイントを含
有するハイブリダイゼーション組成物を調製する工程であって、前記ハイブリダ
イゼーション組成物における高頻度反復配列の平均比活性が前記ハイブリダイゼ
ーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくなるように
、前記多数の染色体ペイントはそれぞれが異なる蛍光基または蛍光基の組み合わ
せで標識される工程;(c)前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前
記ハイブリダイゼーション組成物における前記高頻度反復配列の少なくとも一部
を再アニーリングさせるが、前記ハイブリダイゼーション組成物における前記ユ
ニーク配列の少なくとも一部が一本鎖のままである条件に前記ハイブリダイゼー
ション組成物を供する工程;(d)前記ハイブリダイゼーション組成物をハイブ
リダイゼーション条件のもとで前記展開物と接触させる工程;(e)過剰な前記
ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工程;および(f)前記のそのときに
ハイブリダイゼーションした染色体展開物を分析して、その像を示す工程。
【0044】 下記に記載されている本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により
、下記の工程を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法が提供される
:(a)1つの種の染色体展開物を得る工程;(b)未標識のCot−Iを含ま
ず、かつ異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせでそれぞれが標識されている多
数の染色体ペイントを含有するハイブリダイゼーション組成物を調製する工程;
(c)前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前記ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列は大部分が再アニーリングさせられるが、前
記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は大部分が一本鎖に維持
される条件に前記ハイブリダイゼーション組成物を供する工程;(d)前記ハイ
ブリダイゼーション組成物をハイブリダイゼーション条件のもとで前記展開物と
接触させる工程;(e)過剰な前記ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工
程;および(f)前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開物を
分析して、その像を示す工程。
、下記の工程を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法が提供される
:(a)1つの種の染色体展開物を得る工程;(b)未標識のCot−Iを含ま
ず、かつ異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせでそれぞれが標識されている多
数の染色体ペイントを含有するハイブリダイゼーション組成物を調製する工程;
(c)前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前記ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列は大部分が再アニーリングさせられるが、前
記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は大部分が一本鎖に維持
される条件に前記ハイブリダイゼーション組成物を供する工程;(d)前記ハイ
ブリダイゼーション組成物をハイブリダイゼーション条件のもとで前記展開物と
接触させる工程;(e)過剰な前記ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工
程;および(f)前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開物を
分析して、その像を示す工程。
【0045】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記種は
哺乳動物である。
哺乳動物である。
【0046】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記哺乳
動物はヒトである。
動物はヒトである。
【0047】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は、1個から、前記種に関して得られるすべてまでの
間の任意の数の染色体ペイントを含有する。
ブリダイゼーション組成物は、1個から、前記種に関して得られるすべてまでの
間の任意の数の染色体ペイントを含有する。
【0048】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体ペイントの少なくとも1つは、染色体の特定セグメントをペイント化するため
の部分的な染色体ペイントである。
体ペイントの少なくとも1つは、染色体の特定セグメントをペイント化するため
の部分的な染色体ペイントである。
【0049】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は過剰の未標識の中頻度反復配列をさらに含む。
ブリダイゼーション組成物は過剰の未標識の中頻度反復配列をさらに含む。
【0050】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記未標
識の中頻度反復配列はリボソームDNA配列である。
識の中頻度反復配列はリボソームDNA配列である。
【0051】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体展開物は任意の種のものであり、かつ前記染色体ペイントはそれとは別の種の
ものである。
体展開物は任意の種のものであり、かつ前記染色体ペイントはそれとは別の種の
ものである。
【0052】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は変性剤をさらに含む。
ブリダイゼーション組成物は変性剤をさらに含む。
【0053】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記変性
剤はホルムアミドである。
剤はホルムアミドである。
【0054】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物はポリマーをさらに含む。 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ポリ
マーはデキストラン硫酸である。
ブリダイゼーション組成物はポリマーをさらに含む。 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ポリ
マーはデキストラン硫酸である。
【0055】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は塩類をさらに含む。
ブリダイゼーション組成物は塩類をさらに含む。
【0056】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記塩類
はSSCである。
はSSCである。
【0057】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記平均
比活性は100ヌクレオチドあたり1個〜25個の蛍光基の範囲にある。
比活性は100ヌクレオチドあたり1個〜25個の蛍光基の範囲にある。
【0058】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物における前記高頻度反復配列の少なくとも一部を再ア
ニーリングさせる前記条件は、約32℃〜36℃で約2時間〜4時間の範囲であ
る。
ブリダイゼーション組成物における前記高頻度反復配列の少なくとも一部を再ア
ニーリングさせる前記条件は、約32℃〜36℃で約2時間〜4時間の範囲であ
る。
【0059】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション条件には、前記染色体ペイントの前記ユニーク配列が前記染
色体展開物におけるその対応配列とハイブリダイゼーションするために十分な時
間にわたる約37℃の温度が含まれる。
ブリダイゼーション条件には、前記染色体ペイントの前記ユニーク配列が前記染
色体展開物におけるその対応配列とハイブリダイゼーションするために十分な時
間にわたる約37℃の温度が含まれる。
【0060】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記洗浄
工程は希釈されたSSC溶液によって部分的に行われる。
工程は希釈されたSSC溶液によって部分的に行われる。
【0061】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記のそ
のときにハイブリダイゼーションした染色体展開物の分析およびその像の提示は
多バンド集光デバイスまたは分光的画像化装置によって行われる。
のときにハイブリダイゼーションした染色体展開物の分析およびその像の提示は
多バンド集光デバイスまたは分光的画像化装置によって行われる。
【0062】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記分光
的画像化装置は干渉計を含む。
的画像化装置は干渉計を含む。
【0063】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から得られるPCR産物を前記蛍光
基で標識することによって調製される。
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から得られるPCR産物を前記蛍光
基で標識することによって調製される。
【0064】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前記蛍光基で標識することによっ
て調製される。
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前記蛍光基で標識することによっ
て調製される。
【0065】 下記に記載されている本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により
、多数の染色体ペイントを含むハイブリダイゼーション組成物であって、前記ハ
イブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の平均比活性が前記ハイブ
リダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくな
るように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異なる蛍光基または蛍光基の
組み合わせで標識されているハイブリダイゼーション組成物が提供される。
、多数の染色体ペイントを含むハイブリダイゼーション組成物であって、前記ハ
イブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の平均比活性が前記ハイブ
リダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくな
るように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異なる蛍光基または蛍光基の
組み合わせで標識されているハイブリダイゼーション組成物が提供される。
【0066】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物における高頻度反復反列は大部分がアニーリングさせ
られるが、前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は大部分が
一本鎖にされる。
ブリダイゼーション組成物における高頻度反復反列は大部分がアニーリングさせ
られるが、前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は大部分が
一本鎖にされる。
【0067】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物が染色体展開物とハイブリダイゼーションさせられた
ときに、一致している染色体ペイントを有する染色体またはその一部分が標識さ
れ、そして分光的画像化装置または多バンド集光デバイスを介して分析可能であ
る。
ブリダイゼーション組成物が染色体展開物とハイブリダイゼーションさせられた
ときに、一致している染色体ペイントを有する染色体またはその一部分が標識さ
れ、そして分光的画像化装置または多バンド集光デバイスを介して分析可能であ
る。
【0068】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は変性剤をさらに含む。
ブリダイゼーション組成物は変性剤をさらに含む。
【0069】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記変性
剤はホルムアミドである。
剤はホルムアミドである。
【0070】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物はポリマーをさらに含む。
ブリダイゼーション組成物はポリマーをさらに含む。
【0071】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ポリ
マーデキストラン硫酸である。
マーデキストラン硫酸である。
【0072】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は塩類をさらに含む。
ブリダイゼーション組成物は塩類をさらに含む。
【0073】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記塩類
はSSCである。
はSSCである。
【0074】 下記に記載されている本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により
、多数の染色体ペイントから本質的になるハイブリダイゼーション組成物が提供
される。この場合、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列
の平均比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均
比活性と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異
なる蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識され、かつ前記ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列は大部分がアニーリングさせられるが、前記
ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は、前記ハイブリダイゼー
ション組成物が染色体展開物とハイブリダイゼーションさせられたときに、一致
している染色体ペイントを有する染色体またはその一部分が標識され、そして分
光的画像化装置または多バンド集光デバイスを介して分析可能であるようにその
大部分が一本鎖であり、かつ前記ハイブリダイゼーション組成物はさらに、変性
剤、ポリマーおよび塩類からなる。
、多数の染色体ペイントから本質的になるハイブリダイゼーション組成物が提供
される。この場合、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列
の平均比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均
比活性と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異
なる蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識され、かつ前記ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列は大部分がアニーリングさせられるが、前記
ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は、前記ハイブリダイゼー
ション組成物が染色体展開物とハイブリダイゼーションさせられたときに、一致
している染色体ペイントを有する染色体またはその一部分が標識され、そして分
光的画像化装置または多バンド集光デバイスを介して分析可能であるようにその
大部分が一本鎖であり、かつ前記ハイブリダイゼーション組成物はさらに、変性
剤、ポリマーおよび塩類からなる。
【0075】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から得られるPCR産物を前記蛍光
基で標識することによって調製される。
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から得られるPCR産物を前記蛍光
基で標識することによって調製される。
【0076】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記染色
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前記蛍光基で標識することによっ
て調製される。
体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前記蛍光基で標識することによっ
て調製される。
【0077】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞サンプルにおけるDNAプロー
ブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大にし、それによって、前記多
数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分の1〜200分の1に低下させ
ることができるように設計または改変される。
ブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞サンプルにおけるDNAプロー
ブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大にし、それによって、前記多
数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分の1〜200分の1に低下させ
ることができるように設計または改変される。
【0078】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記ハイ
ブリダイゼーション組成物はDENHYBTMの名称でシグマ(Sigma)社
によって販売されている製造物を含む。
ブリダイゼーション組成物はDENHYBTMの名称でシグマ(Sigma)社
によって販売されている製造物を含む。
【0079】 記載されている好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、前記多数
の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲノムDNAと比較したときに少
なく示されるように、前記組成物から少なくとも部分的に除かれる。
の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲノムDNAと比較したときに少
なく示されるように、前記組成物から少なくとも部分的に除かれる。
【0080】 本発明は、染色体ペイントを用いた未標識のCot−Iを含まないインサイチ
ューハイブリダイゼーションに関する方法および組成物を提供することによって
、現在知られている形態の欠点を十分に解決する。
ューハイブリダイゼーションに関する方法および組成物を提供することによって
、現在知られている形態の欠点を十分に解決する。
【0081】 本発明は、添付された図面を参照して、例としてのみ、本明細書中において記
載される。 図1は、米国特許出願第08/392,019号(先行技術)に従って組み立
てられた画像化分光装置の主要部を例示するブロック図である。 図2は、米国特許出願第08/392,019号(先行技術)による画像化分
光装置において使用されている非可動型干渉計(すなわち、Sagnac干渉計
)を例示する。 図3〜図5は、本発明による方法および組成物を使用した、正常な男性の染色
体展開物との24個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。図
3は、RGBアルゴリズムを使用して得られたRGB画像である。図4および図
5は、分類アルゴリズムを使用して得られた分類画像である。図3および図4は
元の展開物を示し、図5は核型として配置された染色体展開物を示す。 図6は、選択された分光範囲を強調するための擬似RGB(赤、緑および青)
色の定義を示す。それぞれの擬似色の強度が、曲線の1つを乗じた後、曲線の面
積を積分することによって計算される。 図7a〜7dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像および分
類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼーショ
ン組成物にはCot−IブロッキングDNAが含まれた。従って、この結果はコ
ントロールとして役立つ。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイゼー
ション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリング
させた。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホ
ルムアミド/1xSSCを用いた。 図8a〜8dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像および分
類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼーショ
ン組成物にはCot−IブロッキングDNAが含まれた。従って、この結果はコ
ントロールとして役立つ。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に希釈
した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃
で1時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は36時間であっ
た。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。 図9a〜9dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像および分
類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼーショ
ン組成物にはCot−IブロッキングDNAが含まれた。従って、この結果はコ
ントロールとして役立つ。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に希釈
した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃
で1時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は36時間であっ
た。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。 図10a〜10dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で4時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は14時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図11a〜11dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は14時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図12a〜12dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
は希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、そ
の後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は3
6時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1xSSCを用いた。 図13a〜13dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物は、Cot−IブロッキングDNAを含み、従って、コントロール
として役立つ。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイ
ブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再
アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄
には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。 図14a〜14dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物は、Cot−IブロッキングDNAを含み、従って、コントロール
として役立つ。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成
物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせた。ハ
イブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド
/1xSSCを用いた。 図15a〜15dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物は、Cot−IブロッキングDNAを含み、従って、コントロール
として役立つ。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイ
ブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再
アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄
には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。 図16a〜16dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には50%ホルムアミド/2x
SSCを用いた。 図17a〜17dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で6時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図18a〜18dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図19a〜19dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物にはCot−IブロッキングDNAが含まれた。従って、この結果
はコントロールとして役立つ。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で1時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は36時間で
あった。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。 図20a〜20dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図21a〜21dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
は希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、そ
の後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は3
6時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1xSSCを用いた。 図22a〜22dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で6時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図23a〜23dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図24a〜24bは、第1染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト
染色体の像を示す。図24bの染色体ペイントは、Cot−I配列を除くために
磁気ビーズで処理されたが、図24aの染色体ペイントは処理しなかった。両方
の場合、長時間の再アニーリング(4時間)は、依然として利用可能な標識され
たCot−I配列をさらに再アニーリングさせるのに役立った。 図25a〜25bは、第5染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト
染色体の像を示す。図25bの染色体ペイントは、Cot−I配列を除くために
磁気ビーズで処理されたが、図25aの染色体ペイントは処理しなかった。両方
の場合、長時間の再アニーリング(4時間)は、依然として利用可能な標識され
たCot−I配列をさらに再アニーリングさせるのに役立った。
載される。 図1は、米国特許出願第08/392,019号(先行技術)に従って組み立
てられた画像化分光装置の主要部を例示するブロック図である。 図2は、米国特許出願第08/392,019号(先行技術)による画像化分
光装置において使用されている非可動型干渉計(すなわち、Sagnac干渉計
)を例示する。 図3〜図5は、本発明による方法および組成物を使用した、正常な男性の染色
体展開物との24個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。図
3は、RGBアルゴリズムを使用して得られたRGB画像である。図4および図
5は、分類アルゴリズムを使用して得られた分類画像である。図3および図4は
元の展開物を示し、図5は核型として配置された染色体展開物を示す。 図6は、選択された分光範囲を強調するための擬似RGB(赤、緑および青)
色の定義を示す。それぞれの擬似色の強度が、曲線の1つを乗じた後、曲線の面
積を積分することによって計算される。 図7a〜7dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像および分
類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼーショ
ン組成物にはCot−IブロッキングDNAが含まれた。従って、この結果はコ
ントロールとして役立つ。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイゼー
ション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリング
させた。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホ
ルムアミド/1xSSCを用いた。 図8a〜8dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像および分
類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼーショ
ン組成物にはCot−IブロッキングDNAが含まれた。従って、この結果はコ
ントロールとして役立つ。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に希釈
した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃
で1時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は36時間であっ
た。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。 図9a〜9dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像および分
類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼーショ
ン組成物にはCot−IブロッキングDNAが含まれた。従って、この結果はコ
ントロールとして役立つ。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に希釈
した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃
で1時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は36時間であっ
た。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。 図10a〜10dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で4時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は14時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図11a〜11dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は14時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図12a〜12dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
は希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、そ
の後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は3
6時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1xSSCを用いた。 図13a〜13dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物は、Cot−IブロッキングDNAを含み、従って、コントロール
として役立つ。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイ
ブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再
アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄
には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。 図14a〜14dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物は、Cot−IブロッキングDNAを含み、従って、コントロール
として役立つ。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成
物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせた。ハ
イブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド
/1xSSCを用いた。 図15a〜15dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物は、Cot−IブロッキングDNAを含み、従って、コントロール
として役立つ。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイ
ブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再
アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄
には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。 図16a〜16dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には50%ホルムアミド/2x
SSCを用いた。 図17a〜17dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で6時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図18a〜18dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図19a〜19dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物にはCot−IブロッキングDNAが含まれた。従って、この結果
はコントロールとして役立つ。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で1時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は36時間で
あった。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。 図20a〜20dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図21a〜21dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
は希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、そ
の後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリダイゼーション時間は3
6時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1xSSCを用いた。 図22a〜22dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で6時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図23a〜23dは、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、
ヒト男性のリンパ球染色体のRGB、分類、DAPI、ならびにRGB画像およ
び分類画像から導かれる合成核型をそれぞれ示す。この場合のハイブリダイゼー
ション組成物はCot−IブロッキングDNAを含まなかった。染色体ペイント
をDENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を7
5℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリングさせた。ハイブリ
ダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1x
SSCを用いた。 図24a〜24bは、第1染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト
染色体の像を示す。図24bの染色体ペイントは、Cot−I配列を除くために
磁気ビーズで処理されたが、図24aの染色体ペイントは処理しなかった。両方
の場合、長時間の再アニーリング(4時間)は、依然として利用可能な標識され
たCot−I配列をさらに再アニーリングさせるのに役立った。 図25a〜25bは、第5染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト
染色体の像を示す。図25bの染色体ペイントは、Cot−I配列を除くために
磁気ビーズで処理されたが、図25aの染色体ペイントは処理しなかった。両方
の場合、長時間の再アニーリング(4時間)は、依然として利用可能な標識され
たCot−I配列をさらに再アニーリングさせるのに役立った。
【0082】 (好適な実施形態の説明) 本発明は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション手法において使用され
得る方法および組成物である。詳細には、本発明は、染色体異常の検出のために
使用され得る着色された(分光的)核型を得るために使用することができる。
得る方法および組成物である。詳細には、本発明は、染色体異常の検出のために
使用され得る着色された(分光的)核型を得るために使用することができる。
【0083】 本発明による方法および組成物の原理および操作は、図面および記載された説
明を参照することによってより十分に理解され得る。
明を参照することによってより十分に理解され得る。
【0084】 本発明の少なくとも1つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適
用において、下記の説明で示されているか、または図面に例示されている要素の
構成および配置の細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は
、他の実施形態が可能であり、あるいは様々な方法で実行または実施され得る。
また、本明細書中において用いられている表現および用語は説明目的のためであ
って、限定として見なされるものではない。
用において、下記の説明で示されているか、または図面に例示されている要素の
構成および配置の細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は
、他の実施形態が可能であり、あるいは様々な方法で実行または実施され得る。
また、本明細書中において用いられている表現および用語は説明目的のためであ
って、限定として見なされるものではない。
【0085】 本発明の好ましい実施形態により、下記の工程を含む蛍光インサイチューハイ
ブリダイゼーション法が提供される。
ブリダイゼーション法が提供される。
【0086】 最初に、1つの種の染色体展開物が得られる。染色体展開物を得ることは、好
ましくは、下記の実施例1に記載されているように行われる。種は、典型的には
、ヒト(これに限定されない)などの哺乳動物である。
ましくは、下記の実施例1に記載されているように行われる。種は、典型的には
、ヒト(これに限定されない)などの哺乳動物である。
【0087】 次に、ハイブリダイゼーション組成物が調製される。ハイブリダイゼーション
組成物は多数の染色体ペイントを含有し、そのそれぞれは、ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列の平均比活性がハイブリダイゼーション組成
物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、異なる蛍光
基または蛍光基の組み合わせで標識される(例えば、下記の実施例1の表2を参
照のこと)。
組成物は多数の染色体ペイントを含有し、そのそれぞれは、ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列の平均比活性がハイブリダイゼーション組成
物におけるユニーク配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、異なる蛍光
基または蛍光基の組み合わせで標識される(例えば、下記の実施例1の表2を参
照のこと)。
【0088】 本発明の好ましい実施形態により、異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせに
よる標識の前あるいはその後のいずれかにおいて、多数の染色体ペイントに存在
する反復配列は、ゲノムDNAと比較したときに少なく示されるように組成物か
ら少なくとも部分的に除かれる。これは、例えば、これらの配列を磁気ビーズ(
これに限定されない)などの小粒子に直接的または間接的に結合することによっ
て行うことができる。そのような小粒子は、その後で、例えば、磁気分離器で除
くことができる。この分野でよく知られているように、例えば、カラム内に配置
されているか、または遠心分離で除去可能な他の粒状物もまた考えられる。
よる標識の前あるいはその後のいずれかにおいて、多数の染色体ペイントに存在
する反復配列は、ゲノムDNAと比較したときに少なく示されるように組成物か
ら少なくとも部分的に除かれる。これは、例えば、これらの配列を磁気ビーズ(
これに限定されない)などの小粒子に直接的または間接的に結合することによっ
て行うことができる。そのような小粒子は、その後で、例えば、磁気分離器で除
くことができる。この分野でよく知られているように、例えば、カラム内に配置
されているか、または遠心分離で除去可能な他の粒状物もまた考えられる。
【0089】 比活性により、標識された物質の量単位(例えば、100ヌクレオチドのDN
A)あたりの標識量(例えば、蛍光基分子の数)が決定される。本発明の場合、
用いられる各染色体ペイントは、高頻度反復配列、中頻度反復配列、およびユニ
ーク配列を含む。そのそれぞれが、異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせによ
って標識される。従って、例えば、あるペイントにおける特定の蛍光基の比活性
は、100ヌクレオチドあたりのそのような蛍光基の平均分子数として定義され
る。同様に、ハイブリダイゼーション組成物における様々なタイプ(例えば、反
復型、ユニーク型、など)のDNA(その染色体起源に関わらず)の100ヌク
レオチドあたりのすべての蛍光基タイプの平均分子数により、ハイブリダイゼー
ション組成物における様々なタイプのDNAの平均比活性が定義される。本明細
書中および請求項において使用されている表現「平均比活性」は後者の場合を示
す。高頻度反復比活性およびユニーク配列の比活性は、例えば、100ヌクレオ
チドあたり1個〜25個の蛍光基の範囲に含まれ得る。
A)あたりの標識量(例えば、蛍光基分子の数)が決定される。本発明の場合、
用いられる各染色体ペイントは、高頻度反復配列、中頻度反復配列、およびユニ
ーク配列を含む。そのそれぞれが、異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせによ
って標識される。従って、例えば、あるペイントにおける特定の蛍光基の比活性
は、100ヌクレオチドあたりのそのような蛍光基の平均分子数として定義され
る。同様に、ハイブリダイゼーション組成物における様々なタイプ(例えば、反
復型、ユニーク型、など)のDNA(その染色体起源に関わらず)の100ヌク
レオチドあたりのすべての蛍光基タイプの平均分子数により、ハイブリダイゼー
ション組成物における様々なタイプのDNAの平均比活性が定義される。本明細
書中および請求項において使用されている表現「平均比活性」は後者の場合を示
す。高頻度反復比活性およびユニーク配列の比活性は、例えば、100ヌクレオ
チドあたり1個〜25個の蛍光基の範囲に含まれ得る。
【0090】 「実質的に」という用語は、例えば、高頻度反復配列が、その平均G+Cヌク
レオチド含有量において、調べているゲノムにおけるユニーク配列と異なる特定
のタイプ(1つまたは複数)のヌクレオチドを標識のために使用することによる
平均比活性の可能な変動を示すために本明細書中で使用されている。
レオチド含有量において、調べているゲノムにおけるユニーク配列と異なる特定
のタイプ(1つまたは複数)のヌクレオチドを標識のために使用することによる
平均比活性の可能な変動を示すために本明細書中で使用されている。
【0091】 従って、上記に既に述べられているように、本発明により、ハイブリダイゼー
ション組成物における高頻度反復配列およびユニーク配列の比活性は実質的に等
しい。
ション組成物における高頻度反復配列およびユニーク配列の比活性は実質的に等
しい。
【0092】 高頻度反復配列は、Cot値が約10−4M・sec〜約2・10−2M・s
ecの範囲にある配列として本明細書中では定義される。ユニーク配列は、半数
体ゲノムにおいて一度現れる配列として本明細書中では定義される。高頻度反復
配列は、時間を制限した再アニーリング手法によってゲノムDNAから単離する
ことができ、Cot−I部分として知られているCot曲線の最初の肩に含まれ
る配列を反映している。Cot−I部分の市販調製物は、GIBCO−BRL
Life−Technologies(Scotland)から入手することが
できる。典型的には、Cot−I部分は、上記の「背景」の節で記載されている
ように、ハイブリダイゼーション組成物に過剰に加えられ、標識された高頻度反
復配列をハイブリダイゼーション組成物中でブロッキングするために役立つ。そ
の一方で、そうすることによって、高頻度反復配列の平均比活性は実質的に0に
低下する。
ecの範囲にある配列として本明細書中では定義される。ユニーク配列は、半数
体ゲノムにおいて一度現れる配列として本明細書中では定義される。高頻度反復
配列は、時間を制限した再アニーリング手法によってゲノムDNAから単離する
ことができ、Cot−I部分として知られているCot曲線の最初の肩に含まれ
る配列を反映している。Cot−I部分の市販調製物は、GIBCO−BRL
Life−Technologies(Scotland)から入手することが
できる。典型的には、Cot−I部分は、上記の「背景」の節で記載されている
ように、ハイブリダイゼーション組成物に過剰に加えられ、標識された高頻度反
復配列をハイブリダイゼーション組成物中でブロッキングするために役立つ。そ
の一方で、そうすることによって、高頻度反復配列の平均比活性は実質的に0に
低下する。
【0093】 すなわち、本発明によるハイブリダイゼーション組成物は、それぞれが異なる
蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識されている多数の染色体ペイントを含有
し、かつ未標識のCot−Iを含まないハイブリダイゼーション組成物と見なす
ことができる。
蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識されている多数の染色体ペイントを含有
し、かつ未標識のCot−Iを含まないハイブリダイゼーション組成物と見なす
ことができる。
【0094】 好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物は、1個から、その
種に関して得られるすべての数(例えば、ヒト男性の場合には24、ヒト女性の
場合には23)までの任意の数の染色体ペイントを含有する。しかし、本発明の
別の好ましい実施形態により、少なくとも1つの染色体ペイントは、染色体の特
定セグメント(例えば、第1染色体の長腕)をペイント化するための部分的な染
色体ペイントである。染色体のセグメントは、高頻度反復配列を含むその一部分
として本明細書中では定義される。従って、染色体ペイントの数は染色体の数よ
りも多くてもよく、本明細書および請求項に記載されている方法は分光的(着色
された)染色体バンド形成のために使用することができる。さらに、反復したブ
ロッキング配列を含まない種間ハイブリダイゼーションもまた考えられ、これに
より、例えば、米国特許出願第08/535,047号(1997年4月18日
出願;これは、本明細書中に十分に示されているかのように参考として援用され
る)に示されているように、バンド形成させたペイント化パターンが得られる。
種に関して得られるすべての数(例えば、ヒト男性の場合には24、ヒト女性の
場合には23)までの任意の数の染色体ペイントを含有する。しかし、本発明の
別の好ましい実施形態により、少なくとも1つの染色体ペイントは、染色体の特
定セグメント(例えば、第1染色体の長腕)をペイント化するための部分的な染
色体ペイントである。染色体のセグメントは、高頻度反復配列を含むその一部分
として本明細書中では定義される。従って、染色体ペイントの数は染色体の数よ
りも多くてもよく、本明細書および請求項に記載されている方法は分光的(着色
された)染色体バンド形成のために使用することができる。さらに、反復したブ
ロッキング配列を含まない種間ハイブリダイゼーションもまた考えられ、これに
より、例えば、米国特許出願第08/535,047号(1997年4月18日
出願;これは、本明細書中に十分に示されているかのように参考として援用され
る)に示されているように、バンド形成させたペイント化パターンが得られる。
【0095】 好ましい実施形態により、染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体か
ら得られるPCR(例えば、DOP PCR)産物を蛍光基で標識することによ
って調製される。あるいは、染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を
蛍光基で直接標識することによって調製される。
ら得られるPCR(例えば、DOP PCR)産物を蛍光基で標識することによ
って調製される。あるいは、染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を
蛍光基で直接標識することによって調製される。
【0096】 本発明の別の好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物はさら
に、未標識の中頻度反復配列(リボソームDNA配列など、これに限定されない
)を過剰に含む。結果として、ハイブリダイゼーション組成物におけるこれらの
配列の平均比活性は実質的に0に低下する。例えば、過剰の未標識のリボソーム
DNA配列を加えることによって、変性および時間限定再アニーリングの後にお
いて、組成物における標識リボソームDNA配列がブロックキング(すなわち、
二本鎖化)され、従って、例えば、ヒトの第13染色体、第14染色体、第15
染色体、第21染色体および第22染色体のテロメアとの染色体間ハイブリダイ
ゼーションが生じないことが保証される。
に、未標識の中頻度反復配列(リボソームDNA配列など、これに限定されない
)を過剰に含む。結果として、ハイブリダイゼーション組成物におけるこれらの
配列の平均比活性は実質的に0に低下する。例えば、過剰の未標識のリボソーム
DNA配列を加えることによって、変性および時間限定再アニーリングの後にお
いて、組成物における標識リボソームDNA配列がブロックキング(すなわち、
二本鎖化)され、従って、例えば、ヒトの第13染色体、第14染色体、第15
染色体、第21染色体および第22染色体のテロメアとの染色体間ハイブリダイ
ゼーションが生じないことが保証される。
【0097】 別の好ましい実施形態により、染色体展開物は任意の種(例えば、ヒト)のも
のであり、染色体ペイントはそれとは別の種(例えば、ヒト以外の霊長類)のも
のである。
のであり、染色体ペイントはそれとは別の種(例えば、ヒト以外の霊長類)のも
のである。
【0098】 ハイブリダイゼーションの分野ではよく認められているように、ハイブリダイ
ゼーション組成物は、ホルムアミド(これに限定されない)などの変性剤、デキ
ストラン硫酸(これに限定されない)などのポリマー、およびSSC(これに限
定されない)などの塩類をさらに含む。
ゼーション組成物は、ホルムアミド(これに限定されない)などの変性剤、デキ
ストラン硫酸(これに限定されない)などのポリマー、およびSSC(これに限
定されない)などの塩類をさらに含む。
【0099】 第3の工程として、ハイブリダイゼーション組成物は変性され、その後、ハイ
ブリダイゼーション組成物における(蛍光基で標識された)高頻度反復配列の少
なくとも一部(好ましくは大部分、例えば、少なくとも約70%〜80%、好ま
しくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましく
は少なくとも約95%以上、理想的には約100%)が再アニーリングさせられ
るが、ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の少なくとも一部(
好ましくは大部分、例えば、少なくとも約70%〜80%、好ましくは少なくと
も約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約
95%以上、理想的には約100%)が一本鎖のままである条件に供される。本
発明の好ましい実施形態により、このような条件には、約20℃〜65℃(好ま
しくは約30℃〜50℃、より好ましくは約35℃〜45℃)の範囲の温度で約
2時間〜4時間(好ましくは約3時間)再アニーリングすることが含まれる。
ブリダイゼーション組成物における(蛍光基で標識された)高頻度反復配列の少
なくとも一部(好ましくは大部分、例えば、少なくとも約70%〜80%、好ま
しくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましく
は少なくとも約95%以上、理想的には約100%)が再アニーリングさせられ
るが、ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の少なくとも一部(
好ましくは大部分、例えば、少なくとも約70%〜80%、好ましくは少なくと
も約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約
95%以上、理想的には約100%)が一本鎖のままである条件に供される。本
発明の好ましい実施形態により、このような条件には、約20℃〜65℃(好ま
しくは約30℃〜50℃、より好ましくは約35℃〜45℃)の範囲の温度で約
2時間〜4時間(好ましくは約3時間)再アニーリングすることが含まれる。
【0100】 その後、ハイブリダイゼーション組成物はハイブリダイゼーション条件のもと
で染色体展開物と接触させられる。本発明の好ましい実施形態により、このハイ
ブリダイゼーション条件には、染色体ペイントのユニーク配列が染色体展開物に
おけるその対応配列とハイブリダイゼーションするために十分な時間(例えば、
14時間〜48時間)にわたる約37℃の温度が含まれる。このような条件に関
してさらに詳しいことは下記の実施例1において記載されている。
で染色体展開物と接触させられる。本発明の好ましい実施形態により、このハイ
ブリダイゼーション条件には、染色体ペイントのユニーク配列が染色体展開物に
おけるその対応配列とハイブリダイゼーションするために十分な時間(例えば、
14時間〜48時間)にわたる約37℃の温度が含まれる。このような条件に関
してさらに詳しいことは下記の実施例1において記載されている。
【0101】 その後、過剰のハイブリダイゼーション組成物が洗い流される。本発明の好ま
しい実施形態により、洗浄は、部分的には、希釈されたSSC溶液(例えば、0
.1xSSC)によって行われる。
しい実施形態により、洗浄は、部分的には、希釈されたSSC溶液(例えば、0
.1xSSC)によって行われる。
【0102】 最後に、ハイブリダイゼーションした染色体展開物が分光的に分析され、そし
て分光的な(着色)像として示される。ハイブリダイゼーションした染色体展開
物の分析およびその像の提示は多バンド集光デバイスまたは分光的画像化装置に
よって行われる。好ましくは、分光的画像化装置は干渉計を含む。
て分光的な(着色)像として示される。ハイブリダイゼーションした染色体展開
物の分析およびその像の提示は多バンド集光デバイスまたは分光的画像化装置に
よって行われる。好ましくは、分光的画像化装置は干渉計を含む。
【0103】 蛍光インサイチューハイブリダイゼーション結果の種々の分光的分析方法が、
例えば、米国特許出願第08/575,191号;同第08/635,820号
;同第08/718,831号;同第08/831,380号;同第08/75
9,342号;および同第08/844,516号;ならびにE.Schroe
ck他(1996)、ヒト染色体の多色分光的核型決定、Science、27
3、494〜497;Speicher R.M.、Ballard S.G.
およびWard C.D.(1996)、コンビナトリアル多色FISHによる
ヒト染色体の核型決定、Nature Genetics、12:368〜37
5に記載されている(これらはすべて、本明細書中で十分に示されているかのよ
うに参考として援用される)。
例えば、米国特許出願第08/575,191号;同第08/635,820号
;同第08/718,831号;同第08/831,380号;同第08/75
9,342号;および同第08/844,516号;ならびにE.Schroe
ck他(1996)、ヒト染色体の多色分光的核型決定、Science、27
3、494〜497;Speicher R.M.、Ballard S.G.
およびWard C.D.(1996)、コンビナトリアル多色FISHによる
ヒト染色体の核型決定、Nature Genetics、12:368〜37
5に記載されている(これらはすべて、本明細書中で十分に示されているかのよ
うに参考として援用される)。
【0104】 本発明の方法の好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物は、
変性、および細胞サンプルにおけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダ
イゼーションを最大にし、それによって前記多数の染色体ペイントの濃度を少な
くとも約10分の1〜200分の1に低下させることができるように設計(すな
わち、事前、再アニーリングの前)あるいは改変(記載されているように再アニ
ーリングの後)される。この目的のために、ハイブリダイゼーション溶液は、シ
グマ社によって販売されているDENHYBTM溶液であり、あるいはDENH
YBTM溶液を含む。DENHYBTM溶液は、ペイントを溶解して、再アニー
リングを維持するために使用することができる。あるいは、再アニーリングは上
記のように行うことができ、そして再アニーリングしたペイントは所望する濃度
にDENHYBTM溶液で希釈することができる。
変性、および細胞サンプルにおけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダ
イゼーションを最大にし、それによって前記多数の染色体ペイントの濃度を少な
くとも約10分の1〜200分の1に低下させることができるように設計(すな
わち、事前、再アニーリングの前)あるいは改変(記載されているように再アニ
ーリングの後)される。この目的のために、ハイブリダイゼーション溶液は、シ
グマ社によって販売されているDENHYBTM溶液であり、あるいはDENH
YBTM溶液を含む。DENHYBTM溶液は、ペイントを溶解して、再アニー
リングを維持するために使用することができる。あるいは、再アニーリングは上
記のように行うことができ、そして再アニーリングしたペイントは所望する濃度
にDENHYBTM溶液で希釈することができる。
【0105】 さらに、本発明により、それぞれが、ハイブリダイゼーション組成物における
高頻度反復配列の平均比活性がハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク
配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、異なる蛍光基または蛍光基の組
み合わせで標識されている多数の染色体ペイントを含むハイブリダイゼーション
組成物が提供される。
高頻度反復配列の平均比活性がハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク
配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、異なる蛍光基または蛍光基の組
み合わせで標識されている多数の染色体ペイントを含むハイブリダイゼーション
組成物が提供される。
【0106】 ハイブリダイゼーション組成物は、好ましくは、変性、および細胞サンプルに
おけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大にし、そ
れによって前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分の1〜200
分の1に低下させることができるように設計または改変される。ハイブリダイゼ
ーション組成物は、好ましくは、DENHYBTMの名称でシグマ社によって販
売されている製造物であり、あるいはそのような製造物を含む。
おけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大にし、そ
れによって前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分の1〜200
分の1に低下させることができるように設計または改変される。ハイブリダイゼ
ーション組成物は、好ましくは、DENHYBTMの名称でシグマ社によって販
売されている製造物であり、あるいはそのような製造物を含む。
【0107】 本発明の好ましい実施形態により、多数の染色体ペイントに存在する反復配列
は、ゲノムDNAと比較したときに少なく示されるように組成物から少なくとも
部分的に除かれる。
は、ゲノムDNAと比較したときに少なく示されるように組成物から少なくとも
部分的に除かれる。
【0108】 本発明の好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物における高
頻度反復配列は大部分が再アニーリングさせられるが、ハイブリダイゼーション
組成物におけるユニーク配列は大部分が一本鎖にされる。
頻度反復配列は大部分が再アニーリングさせられるが、ハイブリダイゼーション
組成物におけるユニーク配列は大部分が一本鎖にされる。
【0109】 別の好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物が染色体展開物
とハイブリダイゼーションさせられたときに、一致している染色体ペイントを有
する染色体またはその一部分が標識され、そして分光的画像化装置または多バン
ド集光デバイスによって分析可能になる。
とハイブリダイゼーションさせられたときに、一致している染色体ペイントを有
する染色体またはその一部分が標識され、そして分光的画像化装置または多バン
ド集光デバイスによって分析可能になる。
【0110】 ハイブリダイゼーションの分野でよく認められているように、ハイブリダイゼ
ーション組成物はさらに、ホルムアミド(これに限定されない)などの変性剤、
デキストラン硫酸(これに限定されない)などのポリマー、およびSSC(これ
に限定されない)などの塩類を含む。
ーション組成物はさらに、ホルムアミド(これに限定されない)などの変性剤、
デキストラン硫酸(これに限定されない)などのポリマー、およびSSC(これ
に限定されない)などの塩類を含む。
【0111】 好ましい実施形態により、染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体か
ら得られるPCR(例えば、DOP PCR)産物を蛍光基で標識することによ
って調製される。あるいは、染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を
蛍光基で直接標識することによって調製される。
ら得られるPCR(例えば、DOP PCR)産物を蛍光基で標識することによ
って調製される。あるいは、染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を
蛍光基で直接標識することによって調製される。
【0112】 本発明の別の好ましい実施形態により、ハイブリダイゼーション組成物はさら
に、未標識の中頻度反復配列(リボソームDNA配列など、これに限定されない
)を過剰に含む。
に、未標識の中頻度反復配列(リボソームDNA配列など、これに限定されない
)を過剰に含む。
【0113】 さらに、本発明により、それぞれが、ハイブリダイゼーション組成物における
高頻度反復配列の平均比活性がハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク
配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、異なる蛍光基または蛍光基の組
み合わせで標識されている多数の染色体ペイントから実質的になるハイブリダイ
ゼーション組成物が提供される。ハイブリダイゼーション組成物における高頻度
反復配列は大部分がアニーリングさせられるが、ハイブリダイゼーション組成物
におけるユニーク配列は、ハイブリダイゼーション組成物が染色体展開物とハイ
ブリダイゼーションさせられたときに、一致している染色体ペイントを有する染
色体またはその一部分が標識され、そして分光的画像化装置または多バンド集光
デバイスによって分析可能になるようにその大部分が一本鎖にされる。ハイブリ
ダイゼーション組成物はさらに、変性剤、ポリマーおよび塩類からなる。
高頻度反復配列の平均比活性がハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク
配列の平均比活性と実質的に等しくなるように、異なる蛍光基または蛍光基の組
み合わせで標識されている多数の染色体ペイントから実質的になるハイブリダイ
ゼーション組成物が提供される。ハイブリダイゼーション組成物における高頻度
反復配列は大部分がアニーリングさせられるが、ハイブリダイゼーション組成物
におけるユニーク配列は、ハイブリダイゼーション組成物が染色体展開物とハイ
ブリダイゼーションさせられたときに、一致している染色体ペイントを有する染
色体またはその一部分が標識され、そして分光的画像化装置または多バンド集光
デバイスによって分析可能になるようにその大部分が一本鎖にされる。ハイブリ
ダイゼーション組成物はさらに、変性剤、ポリマーおよび塩類からなる。
【0114】 上記の方法および組成物のいずれかの好ましい実施形態により、ハイブリダイ
ゼーション組成物は、特定の適用に依存して、変性、および細胞サンプルにおけ
るDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大にし、それに
よって、用いられる前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分の1
〜200分の1に低下させることができるように設計される。従って、好ましく
は、ハイブリダイゼーション組成物は、DENHYBTMの名称でシグマ社によ
って販売されている製造物を含む。
ゼーション組成物は、特定の適用に依存して、変性、および細胞サンプルにおけ
るDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大にし、それに
よって、用いられる前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分の1
〜200分の1に低下させることができるように設計される。従って、好ましく
は、ハイブリダイゼーション組成物は、DENHYBTMの名称でシグマ社によ
って販売されている製造物を含む。
【0115】 本発明による方法および組成物は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーショ
ンのためだけではなく、プローブDNAおよび標的DNAがともに、結果を妨げ
ることがある高頻度反復配列を含む他の表面(例えば、フィルター)ハイブリダ
イゼーションのためにも有用であることが当業者によって理解される。
ンのためだけではなく、プローブDNAおよび標的DNAがともに、結果を妨げ
ることがある高頻度反復配列を含む他の表面(例えば、フィルター)ハイブリダ
イゼーションのためにも有用であることが当業者によって理解される。
【0116】 本発明をその具体的な実施形態とともに記載してきたが、多くの代替、改変お
よび変化が当業者には明らかであることは明白である。従って、添付された請求
項の精神およびその明白な範囲に含まれるそのような代替、改変および変化はす
べて包含されるものとする。
よび変化が当業者には明らかであることは明白である。従って、添付された請求
項の精神およびその明白な範囲に含まれるそのような代替、改変および変化はす
べて包含されるものとする。
【0117】 次に、上記の説明とともに、本発明を非限定的な様式で例示する下記の実施例
が参照される。
が参照される。
【0118】 (実施例1) 標識およびハイブリダイゼーション 材料: PCR用材料: プライマー:Telenius 6MW(5'−CCGAC
TCGAGNNNNNNATGTGG−3'、配列番号1);ポリメラーゼ:T
aq(5U/μl;Promega、M1861);緩衝液:10xPCR緩衝
液(Promega);ヌクレオチド:100mMの各dNTP(Boehri
nger、1277049);色素:スペクトラムグリーンdUTP(1mM;
Vysis、30−803200)、スペクトラムオレンジdUTP(1mM;
Vysis、30−803000)、テキサスレッドdUTP(1mM;Mol
ecular Probes、7631)、ビオチン16−dUTP(1mM;
Boehringer Mannheim、1093070)、ジゴキシゲニン
11−dUTP(1mM;Boehringer Mannheim、1093
088);ヌクレオチドストック溶液(表1):
TCGAGNNNNNNATGTGG−3'、配列番号1);ポリメラーゼ:T
aq(5U/μl;Promega、M1861);緩衝液:10xPCR緩衝
液(Promega);ヌクレオチド:100mMの各dNTP(Boehri
nger、1277049);色素:スペクトラムグリーンdUTP(1mM;
Vysis、30−803200)、スペクトラムオレンジdUTP(1mM;
Vysis、30−803000)、テキサスレッドdUTP(1mM;Mol
ecular Probes、7631)、ビオチン16−dUTP(1mM;
Boehringer Mannheim、1093070)、ジゴキシゲニン
11−dUTP(1mM;Boehringer Mannheim、1093
088);ヌクレオチドストック溶液(表1):
【表1】
【0119】 沈澱用材料: 20xSSC(Promega、V4261);デキストラン
硫酸(Oncor、S4010);ホルムアミド(Oncor、S4117);
酢酸ナトリウム(Peirce);無水エタノール(Merck、100983
);ハイブリダイゼーションミックス(2xSSC/20%デキストラン硫酸)
;DENHYB溶液(Sigma、7522)。
硫酸(Oncor、S4010);ホルムアミド(Oncor、S4117);
酢酸ナトリウム(Peirce);無水エタノール(Merck、100983
);ハイブリダイゼーションミックス(2xSSC/20%デキストラン硫酸)
;DENHYB溶液(Sigma、7522)。
【0120】 反復配列の除去用材料: Cot−I DNA(GibcoBRL、1527
9−011);Biotin Chem Linkキット(Boehringe
r Mannheim、1812149);アビジン磁石粒子(Boehrin
ger Mannheim、1641789)。
9−011);Biotin Chem Linkキット(Boehringe
r Mannheim、1812149);アビジン磁石粒子(Boehrin
ger Mannheim、1641789)。
【0121】 染色体切片の前処理用材料: MgCl2、1M(Sigma、M−1028
);ホルムアルデヒド(Merck、4003);ペプシンストック溶液:10
%=100mg/ml、PBS/MgCl2:50mlの1M MgCl2を含
む950mlのPBS(リン酸緩衝化生理食塩水)。
);ホルムアルデヒド(Merck、4003);ペプシンストック溶液:10
%=100mg/ml、PBS/MgCl2:50mlの1M MgCl2を含
む950mlのPBS(リン酸緩衝化生理食塩水)。
【0122】 変性および検出に必要な材料: ウシ血清アルブミン(BSA)、V画分(B
oehringer、735078);ツィーン20(Merck、10928
0);抗ジゴキシン(Sigma、D8156);60%ホルムアルデヒド/2
xSSC;0.1xSSC;4xSSC/0.1%ツィーン20;ブロッキング
溶液:3%BSAを含む4xSSC/0.1%ツィーン20;抗体希釈溶液:1
%BSAを含む4xSSC/0.1%ツィーン20;Cy5アビジン(Amer
sham、PA45000)2mg、ストック溶液:1mg/ml;Cy5.5
ヒツジ抗マウス(Amersham、RPQ0115)1mg、ストック溶液:
1mg/ml;DAPI(Sigma、D−9542)1mg、ストック溶液1
0mg/ml;退色防止溶液:Vectrashield(Vector H−
1000)。
oehringer、735078);ツィーン20(Merck、10928
0);抗ジゴキシン(Sigma、D8156);60%ホルムアルデヒド/2
xSSC;0.1xSSC;4xSSC/0.1%ツィーン20;ブロッキング
溶液:3%BSAを含む4xSSC/0.1%ツィーン20;抗体希釈溶液:1
%BSAを含む4xSSC/0.1%ツィーン20;Cy5アビジン(Amer
sham、PA45000)2mg、ストック溶液:1mg/ml;Cy5.5
ヒツジ抗マウス(Amersham、RPQ0115)1mg、ストック溶液:
1mg/ml;DAPI(Sigma、D−9542)1mg、ストック溶液1
0mg/ml;退色防止溶液:Vectrashield(Vector H−
1000)。
【0123】 方法: 反復配列の除去: Cot−I DNAを、Biotin Chem−Lin
kキットを使用してビオチンで標識した。(85℃で30分)標識した後、生成
物を、標準的なSephadex G50を使用して精製した。各染色体から流
動分類されたDNA(300ng)を15μlのビオチン化Cot−I DNA
に加え、それとともに沈澱させた。乾燥したペレットを100μlの6xSSC
、0.1%SDSに溶解し、10分間煮沸することによって変性し、その後、6
5℃で一晩再アニーリングさせた。この2つのDNAをストレプトアビジン磁石
粒子と30分間一緒にし、その後、磁石粒子分離器に加えた。Cot−Iを少な
く提示するDNAを含有する上清を除き、精製して、25μlのTEに再懸濁し
た。
kキットを使用してビオチンで標識した。(85℃で30分)標識した後、生成
物を、標準的なSephadex G50を使用して精製した。各染色体から流
動分類されたDNA(300ng)を15μlのビオチン化Cot−I DNA
に加え、それとともに沈澱させた。乾燥したペレットを100μlの6xSSC
、0.1%SDSに溶解し、10分間煮沸することによって変性し、その後、6
5℃で一晩再アニーリングさせた。この2つのDNAをストレプトアビジン磁石
粒子と30分間一緒にし、その後、磁石粒子分離器に加えた。Cot−Iを少な
く提示するDNAを含有する上清を除き、精製して、25μlのTEに再懸濁し
た。
【0124】 プローブの標識: 流動分類されたヒト染色体またはCot−Iを少なく提示
するヒト染色体を標識し、その後、DOP−PCR(Telenious、19
92)を使用して増幅した。各染色体を、ヌクレオチドに結合させた1種〜4種
の異なる蛍光発色基で標識した(表2参照)。合計で5種の異なる蛍光発色基を
使用した:スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、テキサスレッド、C
y5およびCy5.5。Cy5およびCy5.5は、ビオチンおよびジゴキシゲ
ニンを用いて間接的に標識した。各PCRチューブについて、400ngを、標
識スキーム(表2参照)に従って2.5μlの適切な色素と一緒にした。
するヒト染色体を標識し、その後、DOP−PCR(Telenious、19
92)を使用して増幅した。各染色体を、ヌクレオチドに結合させた1種〜4種
の異なる蛍光発色基で標識した(表2参照)。合計で5種の異なる蛍光発色基を
使用した:スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、テキサスレッド、C
y5およびCy5.5。Cy5およびCy5.5は、ビオチンおよびジゴキシゲ
ニンを用いて間接的に標識した。各PCRチューブについて、400ngを、標
識スキーム(表2参照)に従って2.5μlの適切な色素と一緒にした。
【表2】 略号:A−スペクトラムオレンジ;B−テキサスレッド;C−Cy5;D−ス
ペクトラムグリーン;およびE−Dig−Cy5.5。
ペクトラムグリーン;およびE−Dig−Cy5.5。
【0125】 PCR混合物(1xPCR緩衝液;2mMのMgCl2;10μlのdNTP
;2μMプライマーおよび10ユニットのTaq DNAポリメラーゼを含有す
る)を加えた。PCR条件は、95℃で2分;95℃で1分、56℃で1分およ
び72℃で4分の25サイクルであり、最後の伸長を72℃で10分間行った。
;2μMプライマーおよび10ユニットのTaq DNAポリメラーゼを含有す
る)を加えた。PCR条件は、95℃で2分;95℃で1分、56℃で1分およ
び72℃で4分の25サイクルであり、最後の伸長を72℃で10分間行った。
【0126】 それぞれのハイブリダイゼーションのために、各染色体から得られた0.26
μl(15倍希釈)から4μl(無希釈)までのPCR産物をエッペンドルフチ
ューブで一緒にして、酢酸ナトリウムおよび100%エタノールの存在下におい
て、抑制またはキャリアDNAを加えることなく沈澱させた(すなわち、Cot
Iを含まない)。
μl(15倍希釈)から4μl(無希釈)までのPCR産物をエッペンドルフチ
ューブで一緒にして、酢酸ナトリウムおよび100%エタノールの存在下におい
て、抑制またはキャリアDNAを加えることなく沈澱させた(すなわち、Cot
Iを含まない)。
【0127】 「無希釈」手順に従い、乾燥ペレットを5μlのホルムアミドおよび5μlの
ハイブリダイゼーションストック溶液に溶解した。ハイブリダイゼーション溶液
の最終濃度は、50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸および2xSSC
であった。
ハイブリダイゼーションストック溶液に溶解した。ハイブリダイゼーション溶液
の最終濃度は、50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸および2xSSC
であった。
【0128】 第1の「プローブ希釈」手順に従い、この組成物をDENHYB溶液で10倍
〜15倍希釈した(再アニーリング後、下記参照)。
〜15倍希釈した(再アニーリング後、下記参照)。
【0129】 第2の「プローブ希釈」手順に従い、乾燥ペレットを10μlのDENHYB
溶液に溶解した。
溶液に溶解した。
【0130】 変性およびハイブリダイゼーション: 切片の前処理を標準的な技術に従って
行った。簡単に記載すると、切片を10%ペプシン溶液中で37℃で5分間イン
キュベーションし、PBSで洗浄し、1%ホルムアルデヒドを含むPBS/Mg
Cl2緩衝液で固定し、その後、一連のエタノールによって脱水した。
行った。簡単に記載すると、切片を10%ペプシン溶液中で37℃で5分間イン
キュベーションし、PBSで洗浄し、1%ホルムアルデヒドを含むPBS/Mg
Cl2緩衝液で固定し、その後、一連のエタノールによって脱水した。
【0131】 染色体を70%ホルムアミド/2xSSCにおいて70℃で2分間変性し、そ
の後、一連のエタノールに通して風乾した。
の後、一連のエタノールに通して風乾した。
【0132】 「無希釈」手順に従い、染色体ペイントカクテルを94℃で5分間変性し、そ
の後、室温〜45℃(典型的には、34℃)で3時間インキュベーションして、
反復配列を自己アニーリングさせた。
の後、室温〜45℃(典型的には、34℃)で3時間インキュベーションして、
反復配列を自己アニーリングさせた。
【0133】 第1の「希釈」手順に従い、染色体ペイントのカクテルを94℃で5分間変性
し、その後、室温〜45℃(典型的には、34℃)で3時間インキュベーション
して、反復配列を自己アニーリングさせ、その後、DENHYB溶液で10倍〜
15倍希釈した。
し、その後、室温〜45℃(典型的には、34℃)で3時間インキュベーション
して、反復配列を自己アニーリングさせ、その後、DENHYB溶液で10倍〜
15倍希釈した。
【0134】 一方、第2の「希釈」手順に従い、染色体ペイントのカクテルを94℃で5分
間変性し、その後、40℃〜65℃で3時間インキュベーションして、反復配列
を自己アニーリングさせた。
間変性し、その後、40℃〜65℃で3時間インキュベーションして、反復配列
を自己アニーリングさせた。
【0135】 それぞれの場合、その後、10μlの染色体ペイント混合物を、変性した染色
体調製物に加え、18x18mmのカバーガラスで覆い、37℃で14時間〜4
8時間ハイブリダイゼーションした。
体調製物に加え、18x18mmのカバーガラスで覆い、37℃で14時間〜4
8時間ハイブリダイゼーションした。
【0136】 検出: 切片を60%ホルムアミド/2xSSCにおいて45℃で15分間洗
浄し、次いで0.1xSSCにおいて45℃で10分間洗浄し、最後に4xSS
C/0.1%ツィーン20において4分間洗浄した。その後、切片をブロッキン
グ試薬で30分間ブロッキングし、その後、Cy5アビジンおよび抗ジゴキシゲ
ニン(1:200)で45分間インキュベーションした。4xSSC/1%ツィ
ーン20において45℃で洗浄した後、Cy5.5抗マウス(1:200)のさ
らなる層をさらに45分間加えた。その後、切片を上記のように洗浄して、DA
PI/退色防止溶液において固定した。
浄し、次いで0.1xSSCにおいて45℃で10分間洗浄し、最後に4xSS
C/0.1%ツィーン20において4分間洗浄した。その後、切片をブロッキン
グ試薬で30分間ブロッキングし、その後、Cy5アビジンおよび抗ジゴキシゲ
ニン(1:200)で45分間インキュベーションした。4xSSC/1%ツィ
ーン20において45℃で洗浄した後、Cy5.5抗マウス(1:200)のさ
らなる層をさらに45分間加えた。その後、切片を上記のように洗浄して、DA
PI/退色防止溶液において固定した。
【0137】 (実施例2) 測定装置 図1は、米国特許出願第08/392,019号(Cabib他、1995年
2月21日出願:現在、米国特許第5,539,517号、1996年7月23
日発行)(これは、本明細書中に十分に示されているかのように参考として援用
される)に開示されている先行技術による画像化分光装置の主要部を例示するブ
ロック図である。
2月21日出願:現在、米国特許第5,539,517号、1996年7月23
日発行)(これは、本明細書中に十分に示されているかのように参考として援用
される)に開示されている先行技術による画像化分光装置の主要部を例示するブ
ロック図である。
【0138】 この画像化分光装置は、分光的分解能(波長に依存して約4nm〜14nm)
および空間的分解能(約30/Mμm;Mは顕微鏡または対物光学系の有効倍率
である)が大きいために、本発明の方法を実施するのに非常に適するように組み
立てられる。
および空間的分解能(約30/Mμm;Mは顕微鏡または対物光学系の有効倍率
である)が大きいために、本発明の方法を実施するのに非常に適するように組み
立てられる。
【0139】 従って、図1の先行技術による画像化分光装置は、集光光学系(20と一般に
は示される);1次元スキャナー(ブロック22により示される);光学的経路
差(OPD)生成装置または干渉計(ブロック24により示される);1次元検
出器列または2次元検出器列(ブロック26により示される);およびシグナル
処理装置および表示装置(ブロック28により示される)を含む。
は示される);1次元スキャナー(ブロック22により示される);光学的経路
差(OPD)生成装置または干渉計(ブロック24により示される);1次元検
出器列または2次元検出器列(ブロック26により示される);およびシグナル
処理装置および表示装置(ブロック28により示される)を含む。
【0140】 システム20の非常に重要な要素は、分析される画面の各画素から発する光の
分光的強度の予め決められた一連の一次結合形に対応する変調光を出力するOP
D生成装置または干渉計24である。干渉計の出力は検出器列26に集められる
。従って、必要とされる光学的位相差のすべてが、スペクトルを再構築するため
に必要とされるすべての情報を得るために、視野の画素のすべてについて同時に
走査される。従って、画面におけるすべての画素のスペクトルが画像化情報とと
もに同時に集められ、それにより、画像の瞬時的な分析が可能になる。
分光的強度の予め決められた一連の一次結合形に対応する変調光を出力するOP
D生成装置または干渉計24である。干渉計の出力は検出器列26に集められる
。従って、必要とされる光学的位相差のすべてが、スペクトルを再構築するため
に必要とされるすべての情報を得るために、視野の画素のすべてについて同時に
走査される。従って、画面におけるすべての画素のスペクトルが画像化情報とと
もに同時に集められ、それにより、画像の瞬時的な分析が可能になる。
【0141】 米国特許第5,539,517号による装置は非常に様々な形態で実施するこ
とができる。具体的には、使用される干渉計は、米国特許第5,539,517
号の関連図に記載されているような他の鏡と組み合わせることができる。
とができる。具体的には、使用される干渉計は、米国特許第5,539,517
号の関連図に記載されているような他の鏡と組み合わせることができる。
【0142】 従って、米国特許第5,539,517号により、代わりのタイプの干渉計を
用いることができる。これには、下記の干渉計が含まれる:(i)OPDが光を
変調させるために変化する可動型干渉計、すなわち、走査厚を伴うファブリ−ペ
ロ干渉計;(ii)光学的集光系およびスキャナーからのビームを受けて、ビー
ムを2つの経路に分割するビームスプリッターを含むマイケルソン型干渉計;(
iii)干渉計においてOPDが入射光の入射角によって変化する他の光学的手
段を必要に応じて併せ持つSagnac干渉計、例えば、引用された米国特許(
添付の図14を参照のこと)においてさらに記載されている4鏡+ビームスプリ
ッターの干渉計。
用いることができる。これには、下記の干渉計が含まれる:(i)OPDが光を
変調させるために変化する可動型干渉計、すなわち、走査厚を伴うファブリ−ペ
ロ干渉計;(ii)光学的集光系およびスキャナーからのビームを受けて、ビー
ムを2つの経路に分割するビームスプリッターを含むマイケルソン型干渉計;(
iii)干渉計においてOPDが入射光の入射角によって変化する他の光学的手
段を必要に応じて併せ持つSagnac干渉計、例えば、引用された米国特許(
添付の図14を参照のこと)においてさらに記載されている4鏡+ビームスプリ
ッターの干渉計。
【0143】 図2は、米国特許第5,539,517号に従って組み立てられ、OPDが入
射光の入射角によって変化する干渉計が用いられる画像化分光装置を例示する。
光軸に対して小さな角度で干渉計に入るビームは、その角度によって実質的に一
次的に変化するOPDを経る。
射光の入射角によって変化する干渉計が用いられる画像化分光装置を例示する。
光軸に対して小さな角度で干渉計に入るビームは、その角度によって実質的に一
次的に変化するOPDを経る。
【0144】 図2の干渉計において、すべての画素内の源30からのすべての放射光は、光
学的集光系31によって平行化された後、機械的なスキャナー32によって走査
される。その後、光はビームスプリッター33を通って第1の反射鏡34に至り
、その後、第2の反射鏡35に至る。これにより、光は反射して戻り、ビームス
プリッター33を通り、その後、焦点レンズ36を通って検出器列37(例えば
、CCD)に至る。このビームは、33によって、続いて第2の反射鏡35によ
って、最後に第1の反射鏡34によって反射されたビームと干渉する。
学的集光系31によって平行化された後、機械的なスキャナー32によって走査
される。その後、光はビームスプリッター33を通って第1の反射鏡34に至り
、その後、第2の反射鏡35に至る。これにより、光は反射して戻り、ビームス
プリッター33を通り、その後、焦点レンズ36を通って検出器列37(例えば
、CCD)に至る。このビームは、33によって、続いて第2の反射鏡35によ
って、最後に第1の反射鏡34によって反射されたビームと干渉する。
【0145】 1つの走査の最後において、すべての画素がすべてのOPDを通して測定され
、従って、その画面の各画素のスペクトルをフーリエ変換によって再構築するこ
とができる。光軸に平行なビームは補償され、光軸に対してある角度(θ)のビ
ームは、ビームスプリッター33の厚さ、その屈折率、および角度θを関数とす
るOPDを経る。OPDは、角度が小さい場合にはθに比例する。適切な反転を
加えることによって、そして注意深い記録により、画素毎のスペクトルが計算さ
れる。
、従って、その画面の各画素のスペクトルをフーリエ変換によって再構築するこ
とができる。光軸に平行なビームは補償され、光軸に対してある角度(θ)のビ
ームは、ビームスプリッター33の厚さ、その屈折率、および角度θを関数とす
るOPDを経る。OPDは、角度が小さい場合にはθに比例する。適切な反転を
加えることによって、そして注意深い記録により、画素毎のスペクトルが計算さ
れる。
【0146】 図2の形態において、角度β(図2の場合、β=45°)でビームスプリッタ
ーに入射する光線は、OPD=0で干渉計を通過するが、β−θの一般的な角度
で入射する光線は、下記の数式2によって与えられるOPDを経る:
ーに入射する光線は、OPD=0で干渉計を通過するが、β−θの一般的な角度
で入射する光線は、下記の数式2によって与えられるOPDを経る:
【数2】 式中、θは、中心位置に関する光軸または干渉計の回転角からの光線の角距離
であり;tはビームスプリッターの厚さであり;nはビームスプリッターの屈折
率である。
であり;tはビームスプリッターの厚さであり;nはビームスプリッターの屈折
率である。
【0147】 数式2から、中心位置に関して正および負の両方の角度を走査することによっ
て、位相誤差を除いて、より正確な結果をフーリエ変換計算においてもたらすこ
とを助ける両側の干渉波形がすべての画素について得られることが理解される。
走査振幅により、測定の分光的分解能に関連するOPDの到達最大値が決定され
る。角度幅の大きさにより、OPDの幅が決定され、これはまた、システムが感
度を有する最短波長によって決定される。実際には、サンプリング理論[Cha
mberlain(1979)、干渉分光法の原理(John Wiley a
nd Sons、53頁〜55頁)を参照のこと]に従い、このOPD幅は、シ
ステムが感度を有する最短波長の1/2よりも小さくなければならない。
て、位相誤差を除いて、より正確な結果をフーリエ変換計算においてもたらすこ
とを助ける両側の干渉波形がすべての画素について得られることが理解される。
走査振幅により、測定の分光的分解能に関連するOPDの到達最大値が決定され
る。角度幅の大きさにより、OPDの幅が決定され、これはまた、システムが感
度を有する最短波長によって決定される。実際には、サンプリング理論[Cha
mberlain(1979)、干渉分光法の原理(John Wiley a
nd Sons、53頁〜55頁)を参照のこと]に従い、このOPD幅は、シ
ステムが感度を有する最短波長の1/2よりも小さくなければならない。
【0148】 考慮しなければならないもう1つのパラメーターは、マトリックスにおける検
出器エレメントの有限の大きさである。焦点光学系を通して、エレメントによっ
て、直交的な関数による干渉波形の巻き込み作用を有する干渉計における有限の
OPDが定められる。これにより、エレメントによって定められるOPD以下の
波長に関して0に低下する短波長側でのシステム感度の低下が結果としてもたら
される。この理由により、変調伝達関数(MTF)を確実に満足しなければなら
ない。すなわち、干渉計における検出器エレメントによって定められるOPDを
、装置が感度を有する最短波長よりも確実に小さくしなければならない。
出器エレメントの有限の大きさである。焦点光学系を通して、エレメントによっ
て、直交的な関数による干渉波形の巻き込み作用を有する干渉計における有限の
OPDが定められる。これにより、エレメントによって定められるOPD以下の
波長に関して0に低下する短波長側でのシステム感度の低下が結果としてもたら
される。この理由により、変調伝達関数(MTF)を確実に満足しなければなら
ない。すなわち、干渉計における検出器エレメントによって定められるOPDを
、装置が感度を有する最短波長よりも確実に小さくしなければならない。
【0149】 従って、米国特許第5,539,517号において開示され、本発明に従って
組み立てられる画像化分光装置は、視野内のすべての画素から来る光の強度を単
に測定するだけでなく、所定の波長範囲における各画素のスペクトルもまた測定
する。そのような分光装置はまた、任意の特定時間における視野内の各画素によ
って発せられる放射光のすべてをより十分に利用し、従って、上記に説明されて
いるように、フレーム時間の著しい低下および/または分光装置の感度の著しい
増大を可能にする。そのような画像化分光装置は、様々なタイプの干渉計ならび
に集光および焦点形成の光学システムを含むことができ、従って、医学的診断適
用および治療適用および生物学的研究適用、ならびに地質学的調査および農業的
調査などに関する遠隔探査を含む広範囲の適用において使用することができる。
組み立てられる画像化分光装置は、視野内のすべての画素から来る光の強度を単
に測定するだけでなく、所定の波長範囲における各画素のスペクトルもまた測定
する。そのような分光装置はまた、任意の特定時間における視野内の各画素によ
って発せられる放射光のすべてをより十分に利用し、従って、上記に説明されて
いるように、フレーム時間の著しい低下および/または分光装置の感度の著しい
増大を可能にする。そのような画像化分光装置は、様々なタイプの干渉計ならび
に集光および焦点形成の光学システムを含むことができ、従って、医学的診断適
用および治療適用および生物学的研究適用、ならびに地質学的調査および農業的
調査などに関する遠隔探査を含む広範囲の適用において使用することができる。
【0150】 上記に述べられているように、米国特許第5,539,517号において開示
され、本発明による画像化分光装置が、Applied Spectral I
maging Ltd.(Industrial Park、Migdal H
aemek、イスラエル)によって開発され、本明細書中においてはSPECT
RACUBETMとして示されている。
され、本発明による画像化分光装置が、Applied Spectral I
maging Ltd.(Industrial Park、Migdal H
aemek、イスラエル)によって開発され、本明細書中においてはSPECT
RACUBETMとして示されている。
【0151】 SPECTRACUBETMシステムは、下記の表3に列記される下記のより
優れた特性を有する。 表 3 パラメーター 性能 空間分解能: 30/Mμm(M=顕微鏡または対物光学系の有効倍率) 視野: 15/Mミリメートル 感度: 20ミリルクス(100msecの積分時間の場合、 積分時間が長くなると、Tの平方根に比例して増大する) 分光範囲: 400〜1000nm 分光分解能: 400nmにおいて4nm(800nmにおいて16nm) 積算時間: 5〜50秒(典型的には、25秒) FFT処理時間:20〜180秒、典型的には60秒
優れた特性を有する。 表 3 パラメーター 性能 空間分解能: 30/Mμm(M=顕微鏡または対物光学系の有効倍率) 視野: 15/Mミリメートル 感度: 20ミリルクス(100msecの積分時間の場合、 積分時間が長くなると、Tの平方根に比例して増大する) 分光範囲: 400〜1000nm 分光分解能: 400nmにおいて4nm(800nmにおいて16nm) 積算時間: 5〜50秒(典型的には、25秒) FFT処理時間:20〜180秒、典型的には60秒
【0152】 顕微鏡に必要に応じて接続されたSPECTRACUBETMシステムは、本
発明によるインサイチューハイブリダイゼーション物を分析するために好ましく
使用される。しかし、フィルター(例えば、音響光学同調フィルター(AOTF
)または液晶同調フィルター(LCTF))および分散素子(例えば、格子また
はプリズム)に基づく分光的画像化装置を含む任意の分光的画像化装置(すなわ
ち、その後の復元および分析のために、その視野内に位置する対象物のすべての
点による発光スペクトルを測定してメモリーに保存する装置)、あるいは他の分
光的データまたは多バンド集光デバイス(例えば、Speicher R.M.
、Ballard S.G.およびWard C.D.(1996)、コンビナ
トリアル多色FISHによるヒト染色体の核型決定、Nature Genet
ics、12:368〜375における開示によるデバイス)を、必要とされる
分光的データを得るために使用することができる。従って、このことは、本発明
の範囲を、任意の特定タイプの分光的データ収集デバイスあるいは任意の特定タ
イプの分光的画像化装置を使用するために制限するものではない。
発明によるインサイチューハイブリダイゼーション物を分析するために好ましく
使用される。しかし、フィルター(例えば、音響光学同調フィルター(AOTF
)または液晶同調フィルター(LCTF))および分散素子(例えば、格子また
はプリズム)に基づく分光的画像化装置を含む任意の分光的画像化装置(すなわ
ち、その後の復元および分析のために、その視野内に位置する対象物のすべての
点による発光スペクトルを測定してメモリーに保存する装置)、あるいは他の分
光的データまたは多バンド集光デバイス(例えば、Speicher R.M.
、Ballard S.G.およびWard C.D.(1996)、コンビナ
トリアル多色FISHによるヒト染色体の核型決定、Nature Genet
ics、12:368〜375における開示によるデバイス)を、必要とされる
分光的データを得るために使用することができる。従って、このことは、本発明
の範囲を、任意の特定タイプの分光的データ収集デバイスあるいは任意の特定タ
イプの分光的画像化装置を使用するために制限するものではない。
【0153】 (実施例3) 核型決定の結果 図3〜図5は、上記の「非希釈」プロトコル(実施例1)および測定(実施例
2)を使用した正常な男性の染色体のハイブリダイゼーション結果を示す。
2)を使用した正常な男性の染色体のハイブリダイゼーション結果を示す。
【0154】 図5は、RGBアルゴリズムを使用して得られた染色体展開物のRGB像であ
る。このRGBアルゴリズムにより、光学的シグナルがCCD列の分光範囲(例
えば、400nm〜760nm)にわたって積分されて、赤(R)、緑(G)お
よび青(B)の三刺激応答関数に対応する3つの加重関数{wr(λ)、wg(
λ)、wb(λ)}に従って、赤、緑および青の強度の組み合わせが各画素に割
り当てられた染色体のRGB像が得られる。
る。このRGBアルゴリズムにより、光学的シグナルがCCD列の分光範囲(例
えば、400nm〜760nm)にわたって積分されて、赤(R)、緑(G)お
よび青(B)の三刺激応答関数に対応する3つの加重関数{wr(λ)、wg(
λ)、wb(λ)}に従って、赤、緑および青の強度の組み合わせが各画素に割
り当てられた染色体のRGB像が得られる。
【0155】 図6は、この単純なアルゴリズムの出力例を示す。選択{wr、wg、wb}
を、目的とするスペクトルの「内側」に分布するガウス関数または他の(例えば
、矩形的な)関数とみなした場合、この場合に表示される得られた擬似色画像に
より、加重関数に対応する分光的領域のデータのみが強調され、これにより、こ
れらの3領域における分光的な差がより明瞭に検出され得る。
を、目的とするスペクトルの「内側」に分布するガウス関数または他の(例えば
、矩形的な)関数とみなした場合、この場合に表示される得られた擬似色画像に
より、加重関数に対応する分光的領域のデータのみが強調され、これにより、こ
れらの3領域における分光的な差がより明瞭に検出され得る。
【0156】 図3において、用いられている加重関数wr、wg、wbは、wr(赤)の場
合、λ1=640nmおよびλ2=750nmであり;wg(緑)の場合、λ1
=555nmおよびλ2=640nmであり;wb(青)の場合、λ1=450
nmおよびλ2=555nmである単純な矩形の加重関数であった。これらの単
純な加重関数wr、wg、wbを組み合わせて、染色体のRGB像が作製される
。
合、λ1=640nmおよびλ2=750nmであり;wg(緑)の場合、λ1
=555nmおよびλ2=640nmであり;wb(青)の場合、λ1=450
nmおよびλ2=555nmである単純な矩形の加重関数であった。これらの単
純な加重関数wr、wg、wbを組み合わせて、染色体のRGB像が作製される
。
【0157】 図4は、図3の染色体展開物の分類画像である。図5は、図4の染色体展開物
から得られる核型である。分類画像は、各画素がそのスペクトルに従って分類さ
れる分類アルゴリズムによって計算される。最も重要な分析アルゴリズムの1つ
は、画像内の多数の異なるスペクトルを分類色で同定して強調することを可能に
する分光型分類アルゴリズムである。これにより、そのスペクトルに基づいて、
特定の分類色をすべてのヒト染色体に割り当てることが可能になる。このアルゴ
リズムは、各染色体の参照スペクトルが測定されて、コンピューター内の参照ラ
イブラリーに保存されていることを仮定する。区別するための分類色が、例えば
、下記の数式3で示される最小二乗誤差アルゴリズムによって規定されているよ
うに、その特定の画素におけるスペクトルに最も類似する参照スペクトルに割り
当てられた分類色に従って画像内の画素のそれぞれに割り当てられる。
から得られる核型である。分類画像は、各画素がそのスペクトルに従って分類さ
れる分類アルゴリズムによって計算される。最も重要な分析アルゴリズムの1つ
は、画像内の多数の異なるスペクトルを分類色で同定して強調することを可能に
する分光型分類アルゴリズムである。これにより、そのスペクトルに基づいて、
特定の分類色をすべてのヒト染色体に割り当てることが可能になる。このアルゴ
リズムは、各染色体の参照スペクトルが測定されて、コンピューター内の参照ラ
イブラリーに保存されていることを仮定する。区別するための分類色が、例えば
、下記の数式3で示される最小二乗誤差アルゴリズムによって規定されているよ
うに、その特定の画素におけるスペクトルに最も類似する参照スペクトルに割り
当てられた分類色に従って画像内の画素のそれぞれに割り当てられる。
【数3】 式中、Ix,y(λ)は画素座標(x、y)における正規化スペクトルであり
、In(λ)はそれぞれの染色体(n=1、2、・・・、23、24)に対する
正規化参照スペクトルを示す。すべての参照スペクトルについてSx,y,nの
値を計算した後、最小値が選ばれ、人為的な分類色が、最も類似する参照スペク
トルに割り当てられた分類色に従ってその画素に割り当てられる。
、In(λ)はそれぞれの染色体(n=1、2、・・・、23、24)に対する
正規化参照スペクトルを示す。すべての参照スペクトルについてSx,y,nの
値を計算した後、最小値が選ばれ、人為的な分類色が、最も類似する参照スペク
トルに割り当てられた分類色に従ってその画素に割り当てられる。
【0158】 示される結果は、未標識のCot−Iを含まないハイブリダイゼーションプロ
トコルの結果であることに注意されたい。実際、このような画像は、Cot−I
の存在下で得られる類似した画像とは少し異なる。例えば、RGB画像において
、そしてより少ない程度ではあるが、分類画像においては、高頻度反復配列を大
きな含有量で含むことが知られている動原体の少数がより明るくなるだけである
。このことは、これらの動原体が、多数の染色体に起源を有する反復配列にハイ
ブリダイゼーションしたことを示している。第13染色体、第14染色体、第1
5染色体および第21染色体のテロメアと反復的に会合した着色パターンは、こ
れらのテロメアに位置する中頻度反復リボソームDNA配列のためである。これ
らの着色パターンは、リボソームDNAを同様に含有する第22染色体において
も時々見られるが、Cot−Iを含むハイブリダイゼーション混合物においても
認められている。なぜなら、Cot−Iは、中頻度反復配列とは異なり、主とし
て高頻度反復配列を含む部分であるからである。これらの着色パターンは、部分
的な再アニーリング手順の前に、未標識のリボソームDNAを過剰にハイブリダ
イゼーション混合物に加えることによってなくすことができる。
トコルの結果であることに注意されたい。実際、このような画像は、Cot−I
の存在下で得られる類似した画像とは少し異なる。例えば、RGB画像において
、そしてより少ない程度ではあるが、分類画像においては、高頻度反復配列を大
きな含有量で含むことが知られている動原体の少数がより明るくなるだけである
。このことは、これらの動原体が、多数の染色体に起源を有する反復配列にハイ
ブリダイゼーションしたことを示している。第13染色体、第14染色体、第1
5染色体および第21染色体のテロメアと反復的に会合した着色パターンは、こ
れらのテロメアに位置する中頻度反復リボソームDNA配列のためである。これ
らの着色パターンは、リボソームDNAを同様に含有する第22染色体において
も時々見られるが、Cot−Iを含むハイブリダイゼーション混合物においても
認められている。なぜなら、Cot−Iは、中頻度反復配列とは異なり、主とし
て高頻度反復配列を含む部分であるからである。これらの着色パターンは、部分
的な再アニーリング手順の前に、未標識のリボソームDNAを過剰にハイブリダ
イゼーション混合物に加えることによってなくすことができる。
【0159】 従って、本発明によるインサイチューハイブリダイゼーションは、未標識のC
ot−Iを含まないが、高品質の核型画像をもたらす。染色体ペイントを用いた
、未標識のCot−Iを含まないインサイチューハイブリダイゼーションは、こ
れまで一度も試みられていなかったことに留意されたい。
ot−Iを含まないが、高品質の核型画像をもたらす。染色体ペイントを用いた
、未標識のCot−Iを含まないインサイチューハイブリダイゼーションは、こ
れまで一度も試みられていなかったことに留意されたい。
【0160】 図7〜図23は、SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト
男性のリンパ球染色体のRGB(a)、分類(b)、DAPI(c)、ならびに
RGB画像および分類画像(d)から導かれる合成核型をそれぞれ示す。
男性のリンパ球染色体のRGB(a)、分類(b)、DAPI(c)、ならびに
RGB画像および分類画像(d)から導かれる合成核型をそれぞれ示す。
【0161】 図7a〜7dの場合、ハイブリダイゼーション組成物にはCot−Iブロッキ
ングDNAが含まれた。従って、この結果はコントロールとして役立つ。染色体
ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変
性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55
%ホルムアミド/1xSSCを用いた。
ングDNAが含まれた。従って、この結果はコントロールとして役立つ。染色体
ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変
性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55
%ホルムアミド/1xSSCを用いた。
【0162】 図8a〜8dの場合、ハイブリダイゼーション組成物にはCot−Iブロッキ
ングDNAが含まれた。従って、この結果もまたコントロールとして役立つ。染
色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイブリダイゼーショ
ン組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせ
た後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時
間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。
ングDNAが含まれた。従って、この結果もまたコントロールとして役立つ。染
色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイブリダイゼーショ
ン組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせ
た後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時
間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。
【0163】 図9a〜9dの場合、ハイブリダイゼーション組成物にはCot−Iブロッキ
ングDNAが含まれた。従って、この結果もまたコントロールとして役立つ。染
色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーショ
ン組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせ
た後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時
間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。
ングDNAが含まれた。従って、この結果もまたコントロールとして役立つ。染
色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーショ
ン組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせ
た後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時
間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。
【0164】 図10a〜10dの場合、ハイブリダイゼーション組成物はCot−Iブロッ
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で4時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は14時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で4時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は14時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
【0165】 図11a〜11dの場合、ハイブリダイゼーション組成物はCot−Iブロッ
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で2時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は14時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で2時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は14時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
【0166】 図12a〜12dの場合、ハイブリダイゼーション組成物はCot−Iブロッ
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイ
ゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリ
ングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間
は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1xSSCを用いた。
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイ
ゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリ
ングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間
は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1xSSCを用いた。
【0167】 図13a〜13dの場合、ハイブリダイゼーション組成物は、Cot−Iブロ
ッキングDNAを含み、従って、コントロールとして役立つ。染色体ペイントを
DENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75
℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせた後にハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後
洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。
ッキングDNAを含み、従って、コントロールとして役立つ。染色体ペイントを
DENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75
℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせた後にハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後
洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。
【0168】 図14a〜14dの場合、ハイブリダイゼーション組成物は、Cot−Iブロ
ッキングDNAを含み、従って、コントロールとして役立つ。染色体ペイントは
希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その
後、37℃で1時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った
。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムア
ミド/1xSSCを用いた。
ッキングDNAを含み、従って、コントロールとして役立つ。染色体ペイントは
希釈しなかった。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その
後、37℃で1時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った
。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムア
ミド/1xSSCを用いた。
【0169】 図15a〜15dの場合、ハイブリダイゼーション組成物は、Cot−Iブロ
ッキングDNAを含み、従って、コントロールとして役立つ。染色体ペイントを
DENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75
℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせた後にハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後
洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。
ッキングDNAを含み、従って、コントロールとして役立つ。染色体ペイントを
DENHYB溶液で1:10に希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75
℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせた後にハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時間であった。後
洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。
【0170】 図16a〜16dの場合、ハイブリダイゼーション組成物はCot−Iブロッ
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で2時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には50%ホルムアミド/
2xSSCを用いた。
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で2時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には50%ホルムアミド/
2xSSCを用いた。
【0171】 図17a〜17dの場合、ハイブリダイゼーション組成物はCot−Iブロッ
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で6時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で6時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
【0172】 図18a〜18dの場合、ハイブリダイゼーション組成物はCot−Iブロッ
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で2時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で2時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
【0173】 図19a〜19dの場合、ハイブリダイゼーション組成物にはCot−Iブロ
ッキングDNAが含まれた。従って、この結果はコントロールとして役立つ。染
色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイブリダイゼーショ
ン組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせ
た後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時
間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。
ッキングDNAが含まれた。従って、この結果はコントロールとして役立つ。染
色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に希釈した。ハイブリダイゼーショ
ン組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で1時間再アニーリングさせ
た後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間は36時
間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/2xSSCを用いた。
【0174】 図20a〜20dの場合、ハイブリダイゼーション組成物はCot−Iブロッ
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で2時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で2時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
【0175】 図21a〜21dの場合、ハイブリダイゼーション組成物はCot−Iブロッ
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイ
ゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリ
ングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間
は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1xSSCを用いた。
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントは希釈しなかった。ハイブリダイ
ゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、37℃で2時間再アニーリ
ングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション時間
は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/1xSSCを用いた。
【0176】 図22a〜22dの場合、ハイブリダイゼーション組成物はCot−Iブロッ
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で6時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:10に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で6時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
【0177】 図23a〜23dの場合、ハイブリダイゼーション組成物はCot−Iブロッ
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で2時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
キングDNAを含まなかった。染色体ペイントをDENHYB溶液で1:15に
希釈した。ハイブリダイゼーション組成物を75℃で7分間変性し、その後、3
7℃で2時間再アニーリングさせた後にハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション時間は36時間であった。後洗浄には55%ホルムアミド/
1xSSCを用いた。
【0178】 図7〜図23に示される結果から導かれる主要な結論は、染色体ペイントの濃
度が、先行技術の(Cot−IブロッキングDNAを含む)方法または本発明の
(Cot−Iを含まない)方法に従って多数倍に希釈することができ、それによ
って方法を費用効果的にすることである。しかし、Cot−Iを含まない方法と
組み合わせたDENHYBTMの使用により、全体的なペイント濃度が低下して
いるため、その結果が明らかに改善されていることは予想外のことである。
度が、先行技術の(Cot−IブロッキングDNAを含む)方法または本発明の
(Cot−Iを含まない)方法に従って多数倍に希釈することができ、それによ
って方法を費用効果的にすることである。しかし、Cot−Iを含まない方法と
組み合わせたDENHYBTMの使用により、全体的なペイント濃度が低下して
いるため、その結果が明らかに改善されていることは予想外のことである。
【0179】 図24a〜24bおよび図25a〜25bは、第1染色体ペイントまたは第5
染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト染色体の像をそれぞれ示す。
図24bおよび図25bの染色体ペイントは、本明細書中上記の実施例1に記載
されているように、磁石ビーズによってCot−I配列を少なくとも部分的に除
くために処理されたが、図24aおよび図25aの染色体ペイントは処理しなか
った。すべての場合において、長時間の再アニーリング(4時間)は、依然とし
て利用可能な標識されたCot−I配列をさらに再アニーリングさせるのに役立
った。
染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト染色体の像をそれぞれ示す。
図24bおよび図25bの染色体ペイントは、本明細書中上記の実施例1に記載
されているように、磁石ビーズによってCot−I配列を少なくとも部分的に除
くために処理されたが、図24aおよび図25aの染色体ペイントは処理しなか
った。すべての場合において、長時間の再アニーリング(4時間)は、依然とし
て利用可能な標識されたCot−I配列をさらに再アニーリングさせるのに役立
った。
【0180】 これらの結果は、ペイント特異性の顕著な改善を示している。Cot−I配列
が除かれなかった場合、ペイントにより、実質的にすべてのそれ以外の染色体に
おける反復配列が強調されたが、Cot−I配列の部分的な除去により、染色体
特異的なハイブリダイゼーションが得られた。図24a〜24bにおいて、全く
同じ結果が、間期染色体についても同様に認められる。
が除かれなかった場合、ペイントにより、実質的にすべてのそれ以外の染色体に
おける反復配列が強調されたが、Cot−I配列の部分的な除去により、染色体
特異的なハイブリダイゼーションが得られた。図24a〜24bにおいて、全く
同じ結果が、間期染色体についても同様に認められる。
【配列表】
【図1】 米国特許出願第08/392,019号(先行技術)に従って組み立てられた
画像化分光装置の主要部を例示するブロック図である。
画像化分光装置の主要部を例示するブロック図である。
【図2】 米国特許出願第08/392,019号(先行技術)による画像化分光装置に
おいて使用されている非可動型干渉計(すなわち、Sagnac干渉計)を例示
する。
おいて使用されている非可動型干渉計(すなわち、Sagnac干渉計)を例示
する。
【図3】 本発明による方法および組成物を使用した、正常な男性の染色体展開物との2
4個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。
4個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。
【図4】 本発明による方法および組成物を使用した、正常な男性の染色体展開物との2
4個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。
4個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。
【図5】 本発明による方法および組成物を使用した、正常な男性の染色体展開物との2
4個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。
4個の染色体ペイントのハイブリダイゼーション結果を示す。
【図6】 選択された分光範囲を強調するための擬似RGB(赤、緑および青)色の定義
を示す。
を示す。
【図7a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図7b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図7c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図7d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図8a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図8b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図8c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図8d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図9a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図9b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図9c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図9d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図10a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図10b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図10c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図10d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図11a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図11b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図11c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図11d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図12a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図12b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図12c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図12d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図13a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図13b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図13c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図13d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図14a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図14b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図14c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図14d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図15a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図15b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図15c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図15d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図16a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図16b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図16c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図16d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図17a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図17b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図17c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図17d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図18a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図18b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図18c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図18d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図19a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図19b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図19c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図19d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図20a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図20b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図20c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図20d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図21a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図21b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図21c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図21d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図22a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図22b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図22c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図22d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図23a】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGBを示す。
色体のRGBを示す。
【図23b】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体の分類を示す。
色体の分類を示す。
【図23c】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のDAPIを示す。
色体のDAPIを示す。
【図23d】 SPECTRACUBEシステムを使用して得られる、ヒト男性のリンパ球染
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
色体のRGB画像および分類画像から導かれる合成核型を示す。
【図24】 図24a〜24bは、第1染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト
染色体の像を示す。
染色体の像を示す。
【図25】 図25a〜25bは、第5染色体ペイントとハイブリダイゼーションしたヒト
染色体の像を示す。
染色体の像を示す。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成12年8月15日(2000.8.15)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU, CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z A,ZW (72)発明者 ガリニ, ユバル イスラエル, 20126 ミズペ コラニト (番地なし) (72)発明者 カビブ, ダリオ イスラエル, 23840 ティムラト, ハ ブロシュ 7 (72)発明者 バックワルド, ロバート, エー. イスラエル, 30095 ラマット イシェ イ, ハダガン ストリート (番地な し) Fターム(参考) 4B024 AA11 CA09 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR56 QS34 QX01
Claims (81)
- 【請求項1】 (a)1つの種の染色体展開物を得る工程; (b)多数の染色体ペイントを含有するハイブリダイゼーション組成物を調製す
る工程であって、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の
平均比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比
活性と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異な
る蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識される工程; (c)前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前記ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における前記高頻度反復配列の少なくとも一部を再アニーリングさせ
るが、前記ハイブリダイゼーション組成物における前記ユニーク配列の少なくと
も一部が一本鎖のままである条件に前記ハイブリダイゼーション組成物を供する
工程; (d)前記ハイブリダイゼーション組成物をハイブリダイゼーション条件のもと
で前記展開物と接触させる工程; (e)過剰な前記ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工程;および (f)前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開物を分析して、
その像を示す工程 を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。 - 【請求項2】 前記ハイブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞サ
ンプルにおけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最大
にし、それによって、前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分の
1〜200分の1に低下させることができるように設計または改変される、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記ハイブリダイゼーション組成物はDENHYBTMの名
称でシグマ(Sigma)社によって販売されている製造物を含む、請求項2に
記載の方法。 - 【請求項4】 前記多数の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲノ
ムDNAと比較したときに少なく示されるように前記組成物から少なくとも部分
的に除かれる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 前記種は哺乳動物である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項6】 前記哺乳動物はヒトである、請求項5に記載の方法。
- 【請求項7】 前記ハイブリダイゼーション組成物は、1個から、前記種に
関して得られるすべてまでの間の任意の数の染色体ペイントを含有する、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項8】 前記染色体ペイントの少なくとも1つは、染色体の特定セグ
メントをペイント化するための部分的な染色体ペイントである、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項9】 前記ハイブリダイゼーション組成物は過剰の未標識の中頻度
反復配列をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】 前記未標識の中頻度反復配列はリボソームDNA配列であ
る、請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 前記染色体展開物は任意の種のものであり、かつ前記染色
体ペイントはそれとは別の種のものである、請求項1に記載の方法。 - 【請求項12】 前記ハイブリダイゼーション組成物は変性剤をさらに含む
、請求項1に記載の方法。 - 【請求項13】 前記変性剤はホルムアミドである、請求項12に記載の方
法。 - 【請求項14】 前記ハイブリダイゼーション組成物はポリマーをさらに含
む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】 前記ポリマーはデキストラン硫酸である、請求項14に記
載の方法。 - 【請求項16】 前記ハイブリダイゼーション組成物は塩類をさらに含む、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項17】 前記塩類はSSCである、請求項16に記載の方法。
- 【請求項18】 前記平均比活性は100ヌクレオチドあたり1個〜25個
の蛍光基の範囲にある、請求項1に記載の方法。 - 【請求項19】 前記ハイブリダイゼーション組成物における前記高頻度反
復配列の少なくとも一部を再アニーリングさせる前記条件は、約32℃〜36℃
で約2時間〜4時間の範囲である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項20】 前記ハイブリダイゼーション条件は、前記染色体ペイント
の前記ユニーク配列が前記染色体展開物におけるその対応配列とハイブリダイゼ
ーションするために十分な時間にわたる約37℃の温度を含む、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項21】 前記洗浄工程は希釈されたSSC溶液によって部分的に行
われる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項22】 前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開
物の分析およびその像の提示は多バンド集光デバイスまたは分光的画像化装置に
よって行われる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項23】 前記分光的画像化装置は干渉計を含む、請求項22に記載
の方法。 - 【請求項24】 前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から
得られるPCR産物を前記蛍光基で標識することによって調製される、請求項1
に記載の方法。 - 【請求項25】 前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前
記蛍光基で標識することによって調製される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項26】 (a)1つの種の染色体展開物を得る工程; (b)未標識のCot−Iを含まず、かつ異なる蛍光基または蛍光基の組み合わ
せでそれぞれが標識されている多数の染色体ペイントを含有するハイブリダイゼ
ーション組成物を調製する工程; (c)前記ハイブリダイゼーション組成物を変性して、前記ハイブリダイゼーシ
ョン組成物における高頻度反復配列は大部分が再アニーリングされるが、前記ハ
イブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は大部分が一本鎖に維持され
る条件に前記ハイブリダイゼーション組成物を供する工程; (d)前記ハイブリダイゼーション組成物をハイブリダイゼーション条件のもと
で前記染色体展開物と接触させる工程; (e)過剰な前記ハイブリダイゼーション組成物を洗い流す工程;および (f)前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開物を分析して、
その像を示す工程 を含む蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。 - 【請求項27】 前記ハイブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞
サンプルにおけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最
大にし、それによって、前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分
の1〜200分の1に低下させることができるように設計または改変される、請
求項26に記載の方法。 - 【請求項28】 前記ハイブリダイゼーション組成物はDENHYBTMの
名称でシグマ(Sigma)社によって販売されている製造物を含む、請求項2
7に記載の方法。 - 【請求項29】 前記多数の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲ
ノムDNAと比較したときに少なく示されるように前記組成物から少なくとも部
分的に除かれる、請求項26に記載の方法。 - 【請求項30】 前記種は哺乳動物である、請求項26に記載の方法。
- 【請求項31】 前記哺乳動物はヒトである、請求項30に記載の方法。
- 【請求項32】 前記ハイブリダイゼーション組成物は、1個から、前記種
に関して得られるすべてまでの間の任意の数の染色体ペイントを含有する、請求
項26に記載の方法。 - 【請求項33】 前記染色体ペイントの少なくとも1つは、染色体の特定セ
グメントをペイント化するための部分的な染色体ペイントである、請求項26に
記載の方法。 - 【請求項34】 前記ハイブリダイゼーション組成物は過剰の未標識の中頻
度反復配列をさらに含む、請求項26に記載の方法。 - 【請求項35】 前記未標識の中頻度反復配列はリボソームDNA配列であ
る、請求項34に記載の方法。 - 【請求項36】 前記染色体展開物は任意の種のものであり、かつ前記染色
体ペイントはそれとは別の種のものである、請求項26に記載の方法。 - 【請求項37】 前記ハイブリダイゼーション組成物は変性剤をさらに含む
、請求項26に記載の方法。 - 【請求項38】 前記変性剤はホルムアミドである、請求項37に記載の方
法。 - 【請求項39】 前記ハイブリダイゼーション組成物はポリマーをさらに含
む、請求項26に記載の方法。 - 【請求項40】 前記ポリマーはデキストラン硫酸である、請求項39に記
載の方法。 - 【請求項41】 前記ハイブリダイゼーション組成物は塩類をさらに含む、
請求項26に記載の方法。 - 【請求項42】 前記塩類はSSCである、請求項41に記載の方法。
- 【請求項43】 前記ハイブリダイゼーション組成物における前記高頻度反
復配列の少なくとも一部を再アニーリングさせる前記条件は、約32℃〜36℃
で約2時間〜4時間の範囲である、請求項26に記載の方法。 - 【請求項44】 前記ハイブリダイゼーション条件は、前記染色体ペイント
の前記ユニーク配列が前記染色体展開物におけるその対応配列とハイブリダイゼ
ーションするために十分な時間にわたる約37℃の温度を含む、請求項26に記
載の方法。 - 【請求項45】 前記洗浄工程は希釈されたSSC溶液によって部分的に行
われる、請求項26に記載の方法。 - 【請求項46】 前記のそのときにハイブリダイゼーションした染色体展開
物の分析およびその像の提示は多バンド集光デバイスまたは分光的画像化装置に
よって行われる、請求項26に記載の方法。 - 【請求項47】 前記分光的画像化装置は干渉計を含む、請求項46に記載
の方法。 - 【請求項48】 前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から
得られるPCR産物を前記蛍光基で標識することによって調製される、請求項2
6に記載の方法。 - 【請求項49】 前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前
記蛍光基で標識することによって調製される、請求項26に記載の方法。 - 【請求項50】 多数の染色体ペイントを含むハイブリダイゼーション組成
物であって、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の平均
比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性
と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異なる蛍
光基または蛍光基の組み合わせで標識されているハイブリダイゼーション組成物
。 - 【請求項51】 前記ハイブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞
サンプルにおけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最
大にし、それによって、前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分
の1〜200分の1に低下させることができるように設計または改変される、請
求項50に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項52】 前記ハイブリダイゼーション組成物はDENHYBTMの
名称でシグマ(Sigma)社によって販売されている製造物を含む、請求項5
1に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項53】 前記多数の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲ
ノムDNAと比較したときに少なく示されるように前記組成物から少なくとも部
分的に除かれる、請求項50に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項54】 前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復反
列は大部分がアニーリングされるが、前記ハイブリダイゼーション組成物におけ
るユニーク配列は大部分が一本鎖にされる、請求項50に記載のハイブリダイゼ
ーション組成物。 - 【請求項55】 前記ハイブリダイゼーション組成物が染色体展開物とハイ
ブリダイゼーションされたときに、一致している染色体ペイントを有する染色体
またはその一部分が標識され、そして分光的画像化装置または多バンド集光デバ
イスを介して分析可能である、請求項54に記載のハイブリダイゼーション組成
物。 - 【請求項56】 変性剤をさらに含む、請求項50に記載のハイブリダイゼ
ーション組成物。 - 【請求項57】 前記変性剤はホルムアミドである、請求項56に記載のハ
イブリダイゼーション組成物。 - 【請求項58】 ポリマーをさらに含む、請求項50に記載のハイブリダイ
ゼーション組成物。 - 【請求項59】 前記ポリマーはデキストラン硫酸である、請求項58に記
載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項60】 塩類をさらに含む、請求項50に記載のハイブリダイゼー
ション組成物。 - 【請求項61】 前記塩類はSSCである、請求項60に記載のハイブリダ
イゼーション組成物。 - 【請求項62】 前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から
得られるPCR産物を前記蛍光基で標識することによって調製される、請求項5
0に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項63】 前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前
記蛍光基で標識することによって調製される、請求項50に記載のハイブリダイ
ゼーション組成物。 - 【請求項64】 多数の染色体ペイントを含むハイブリダイゼーション組成
物であって、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復配列の平均
比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の平均比活性
と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれが異なる蛍
光基または蛍光基の組み合わせで標識され、かつ前記ハイブリダイゼーション組
成物における高頻度反復配列は大部分がアニーリングされるが、前記ハイブリダ
イゼーション組成物におけるユニーク配列は、前記ハイブリダイゼーション組成
物が染色体展開物とハイブリダイゼーションされたときに、一致している染色体
ペイントを有する染色体またはその一部分が標識され、そして分光的画像化装置
または多バンド集光デバイスを介して分析可能であるようにその大部分が一本鎖
であるハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項65】 前記ハイブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞
サンプルにおけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最
大にし、それによって、前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分
の1〜200分の1に低下させることができるように設計または改変される、請
求項64に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項66】 前記ハイブリダイゼーション組成物はDENHYBTMの
名称でシグマ(Sigma)社によって販売されている製造物を含む、請求項6
5に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項67】 前記多数の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲ
ノムDNAと比較したときに少なく示されるように前記組成物から少なくとも部
分的に除かれる、請求項64に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項68】 変性剤をさらに含む、請求項64に記載のハイブリダイゼ
ーション組成物。 - 【請求項69】 前記変性剤はホルムアミドである、請求項68に記載のハ
イブリダイゼーション組成物。 - 【請求項70】 ポリマーをさらに含む、請求項64に記載のハイブリダイ
ゼーション組成物。 - 【請求項71】 前記ポリマーはデキストラン硫酸である、請求項70に記
載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項72】 塩類をさらに含む、請求項64に記載のハイブリダイゼー
ション組成物。 - 【請求項73】 前記塩類はSSCである、請求項72に記載のハイブリダ
イゼーション組成物。 - 【請求項74】 前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から
得られるPCR産物を前記蛍光基で標識することによって調製される、請求項6
4に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項75】 前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前
記蛍光基で標識することによって調製される、請求項64に記載のハイブリダイ
ゼーション組成物。 - 【請求項76】 多数の染色体ペイントから本質的になるハイブリダイゼー
ション組成物であって、前記ハイブリダイゼーション組成物における高頻度反復
配列の平均比活性が前記ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列の
平均比活性と実質的に等しくなるように、前記多数の染色体ペイントのそれぞれ
が異なる蛍光基または蛍光基の組み合わせで標識され、かつ前記ハイブリダイゼ
ーション組成物における高頻度反復配列は大部分がアニーリングされるが、前記
ハイブリダイゼーション組成物におけるユニーク配列は、前記ハイブリダイゼー
ション組成物が染色体展開物とハイブリダイゼーションされたときに、一致して
いる染色体ペイントを有する染色体またはその一部分が標識され、そして分光的
画像化装置または多バンド集光デバイスを介して分析可能であるようにその大部
分が一本鎖であり、かつ前記ハイブリダイゼーション組成物はさらに、変性剤、
ポリマーおよび塩類からなる、ハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項77】 前記ハイブリダイゼーション組成物は、変性、および細胞
サンプルにおけるDNAプローブと標的DNAとのハイブリダイゼーションを最
大にし、それによって、前記多数の染色体ペイントの濃度を少なくとも約10分
の1〜200分の1に低下させることができるように設計または改変される、請
求項76に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項78】 前記ハイブリダイゼーション組成物はDENHYBTMの
名称でシグマ(Sigma)社によって販売されている製造物を含む、請求項7
7に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項79】 前記多数の染色体ペイントに存在する前記反復配列は、ゲ
ノムDNAと比較したときに少なく示されるように前記組成物から少なくとも部
分的に除かれる、請求項76に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項80】 前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体から
得られるPCR産物を前記蛍光基で標識することによって調製される、請求項7
6に記載のハイブリダイゼーション組成物。 - 【請求項81】 前記染色体ペイントのそれぞれは、分類された染色体を前
記蛍光基で標識することによって調製される、請求項76に記載のハイブリダイ
ゼーション組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/122,661 US6043039A (en) | 1998-02-17 | 1998-07-27 | Method of and composite for in situ fluorescent hybridization |
US09/122,661 | 1998-07-27 | ||
PCT/US1999/016626 WO2000006773A1 (en) | 1998-07-27 | 1999-07-23 | Method of and composite for fluorescent in situ hybridization |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002521066A true JP2002521066A (ja) | 2002-07-16 |
Family
ID=22404018
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000562555A Pending JP2002521066A (ja) | 1998-07-27 | 1999-07-23 | 蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを行うための方法および組成物 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6043039A (ja) |
EP (1) | EP1100965A4 (ja) |
JP (1) | JP2002521066A (ja) |
AU (1) | AU5123599A (ja) |
IL (1) | IL140973A0 (ja) |
WO (1) | WO2000006773A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021083431A (ja) * | 2019-11-29 | 2021-06-03 | シスメックス株式会社 | 細胞解析方法、細胞解析装置、細胞解析システム、及び細胞解析プログラム |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050266494A1 (en) * | 2000-09-06 | 2005-12-01 | Hodge Timothy A | System and method for computer network ordering of biological testing |
US20030087286A1 (en) * | 2000-09-06 | 2003-05-08 | Hodge Timothy A. | Isolation of eukaryotic genomic DNA using magnetically responsive solid functionalized particles |
EP1978110B1 (en) * | 2000-09-06 | 2010-05-26 | Transnetyx, Inc. | Computer-based method and system for screening genomic DNA |
US20030082605A1 (en) * | 2000-09-06 | 2003-05-01 | Hodge Timothy A. | Genomic DNA detection method and system thereof |
US20050272085A1 (en) * | 2000-09-06 | 2005-12-08 | Hodge Timothy A | Methods for forensic and congenic screening |
US7494817B2 (en) * | 2000-09-06 | 2009-02-24 | Transnet Yx, Inc. | Methods for genotype screening using magnetic particles |
US20050239125A1 (en) * | 2000-09-06 | 2005-10-27 | Hodge Timothy A | Methods for genotype screening |
US20060014186A1 (en) * | 2001-09-04 | 2006-01-19 | Hodge Timothy A | Methods for genotype screening of a strain disposed on an adsorbent carrier |
US6946285B2 (en) * | 2002-04-29 | 2005-09-20 | Agilent Technologies, Inc. | Arrays with elongated features |
US7315371B2 (en) | 2004-01-23 | 2008-01-01 | P&P Optica Inc. | Multi-channel spectrum analyzer |
JP4476050B2 (ja) * | 2004-06-30 | 2010-06-09 | 株式会社ニデック | 視野計 |
JP5592357B2 (ja) | 2008-05-27 | 2014-09-17 | ダコ・デンマーク・エー/エス | 新規なハイブリダイゼーションバッファーを用いた染色体異常の検出のための組成物及び方法 |
CN104328109A (zh) * | 2008-09-22 | 2015-02-04 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 微阵列底物上的生物材料的选择性处理 |
WO2010097655A1 (en) | 2009-02-26 | 2010-09-02 | Dako Denmark A/S | Compositions and methods for rna hybridization applications |
JP5384453B2 (ja) | 2010-09-09 | 2014-01-08 | シャープ株式会社 | 測定装置、測定システム、測定方法、制御プログラム、および、記録媒体 |
EP2761028A1 (en) * | 2011-09-30 | 2014-08-06 | Dako Denmark A/S | Hybridization compositions and methods using formamide |
WO2013057310A2 (en) | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Dako Denmark A/S | Hybridization compositions and methods |
JP5576993B2 (ja) | 2012-05-30 | 2014-08-20 | パナソニック株式会社 | 画像計測装置、画像計測方法及び画像計測システム |
NL2020377B1 (en) * | 2018-02-05 | 2019-08-14 | Lumicks Tech B V | Methods and devices for determining a guest structure on a host structure |
CN109609601A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-04-12 | 广东和信健康科技有限公司 | 一种rna荧光原位杂交液及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5756696A (en) * | 1986-01-16 | 1998-05-26 | Regents Of The University Of California | Compositions for chromosome-specific staining |
CN1046392A (zh) * | 1988-11-15 | 1990-10-24 | 耶鲁大学 | 通过原位抑制杂交对人个体中期和间期细胞染色体定位 |
US5871932A (en) * | 1993-08-18 | 1999-02-16 | Applied Spectral Imaging Ltd. | Method of and composite for fluorescent in situ hybridization |
GB9704054D0 (en) * | 1997-02-27 | 1997-04-16 | Univ Cambridge Tech | Assay |
-
1998
- 1998-07-27 US US09/122,661 patent/US6043039A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-07-23 JP JP2000562555A patent/JP2002521066A/ja active Pending
- 1999-07-23 AU AU51235/99A patent/AU5123599A/en not_active Abandoned
- 1999-07-23 EP EP99935850A patent/EP1100965A4/en not_active Withdrawn
- 1999-07-23 IL IL14097399A patent/IL140973A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-07-23 WO PCT/US1999/016626 patent/WO2000006773A1/en not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021083431A (ja) * | 2019-11-29 | 2021-06-03 | シスメックス株式会社 | 細胞解析方法、細胞解析装置、細胞解析システム、及び細胞解析プログラム |
US12020492B2 (en) | 2019-11-29 | 2024-06-25 | Sysmex Corporation | Cell analysis method, cell analysis device, and cell analysis system |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1100965A4 (en) | 2004-11-03 |
EP1100965A1 (en) | 2001-05-23 |
WO2000006773A1 (en) | 2000-02-10 |
IL140973A0 (en) | 2002-02-10 |
US6043039A (en) | 2000-03-28 |
AU5123599A (en) | 2000-02-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2002521066A (ja) | 蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを行うための方法および組成物 | |
US6066459A (en) | Method for simultaneous detection of multiple fluorophores for in situ hybridization and multicolor chromosome painting and banding | |
US5798262A (en) | Method for chromosomes classification | |
EP0899558B1 (en) | Method for classification of pixels into groups according to their spectra using a plurality of wide band filters and hardware therefor | |
Tanke et al. | New strategy for multi-colour fluorescence in situ hybridisation: COBRA: COmbined Binary RAtio labelling | |
Imataka et al. | Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY) | |
Haddad et al. | Identification of de novo chromosomal markers and derivatives by spectral karyotyping | |
JPH11503239A (ja) | スペクトル生体結像方法および蛍光dnaハイブリダイゼーション方法 | |
Speicher et al. | Computer image analysis of combinatorial multi‐fluor FISH | |
US5871932A (en) | Method of and composite for fluorescent in situ hybridization | |
US6562959B1 (en) | Detection of altered expression of genes regulating cell proliferation | |
JP2002517183A (ja) | マルチパラメトリック蛍光in−situハイブリッド形成法 | |
Difilippantonio et al. | Technicolor genome analysis | |
Hilgenfeld et al. | Spectral karyotyping in cancer cytogenetics | |
Lee et al. | Multicolor fluorescence in situ hybridization (FISH) approaches for simultaneous analysis of the entire human genome | |
Kearns et al. | Fluorescent in situ hybridization using chromosome-specific DNA libraries | |
JP2000507809A (ja) | マルチパラメーター蛍光in situハイブリダイゼーション | |
DE29724412U1 (de) | Vorrichtung zum gleichzeitgen Nachweis mehrerer Fluorophore für die in situ Hybridisierung | |
Breneman et al. | Automated spectral imaging for clinical diagnostics | |
Weier et al. | Cytogenetic analysis of interphase cells using spectral imaging [SIm] technology | |
Hopwood et al. | Color Banding |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060612 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090515 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091016 |