JPH11106400A

JPH11106400A - 顆粒球コロニー刺激因子誘導活性を有する抗体及びその医薬

Info

Publication number: JPH11106400A
Application number: JP9266591A
Authority: JP
Inventors: Ryoko Aoki; 良子青木; Daisuke Hirano; 大祐平野; Motonao Nakamura; 元直中村; Yoshisuke Nishi; 義介西
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 1999-04-20
Anticipated expiration: 2017-09-30
Also published as: JP3908836B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【解決手段】顆粒球コロニー刺激因子の誘導活性を有
するモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドー
マ及び該モノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物。【効果】上記モノクローナル抗体は、濃度依存的に顆
粒球コロニー刺激因子の産生能を有し、抗ガン剤の副作
用としての好中球減少症や骨髄移植後の好中球減少症の
治療、再生不良性貧血の治療に効果を示す。また、顆粒
球コロニー刺激因子を産生させることにより日和見感染
症をはじめとする各種感染性疾患の予防又は治療に利用
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、顆粒球コロニー
刺激因子（G-CSF）の誘導活性を有するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ、G-CSFの誘導活性を有
する抗体及びその一部、該抗体または該抗体フラグメン
トを含んでなる医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は、
分子量は約18000から22000で、ヒトの場合１７４個（ま
れに１７８個）、マウスで１７８個のアミノ酸で構成さ
れている。血液成分の白血球の一種である好中球の分化
増殖を誘導する糖タンパクである。

【０００３】G-CSFは、成熟好中球の生存の延長や機能
の亢進作用を有するが、エリスロポエチンによる赤芽
球、インターロイキン３による芽球コロニーの形成も増
強する。このようなG-CSFを産生する細胞としては、マ
クロファージ、ストローマ細胞、単球、Tリンパ球、繊
維芽細胞、血管内皮細胞などが挙げられる。

【０００４】G-CSFを薬剤として投与することは、抗ガ
ン剤の副作用としての好中球減少症や骨髄移植後の好中
球減少症の治療及び再生不良性貧血の治療に効果を示
す。しかし、投与時においては、血中安定性が低いため
に頻回投与を必要とし、しかも投与は静脈投与に限られ
ているために患者、医師の双方に苦痛と負担を強いられ
てきた。さらに、G-CSFを薬剤として投与すると、副作
用として骨痛を起こすことが報告されている。また、G-
CSFを産生する細胞としてのマクロファージやストロー
マ細胞を直接投与することは、細胞であるために種々の
タンパクや様々な物質を含んでいるために思わぬ副作用
を起こす可能性があるため、そのような治療は行われて
いない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記の如く、G-CSF自
体を投与することによって好中球を分化増殖させる方法
では、副作用として骨痛を惹起することばかりでなく、
頻回投与が必要であり、患者及び医師にも苦痛と負担を
強いられてきたため、他の治療方法の開発が強く要望さ
れているが、未だ確立されていない。

【０００６】そこで、本発明者らは、G-CSF自体を投与
するのではなく、G-CSFを産生させ、好中球を分化増殖
させることを考えた。本発明は、G-CSFを産生させる抗
体を提供することを課題とする。本発明は、そのような
臨床上でG-CSFの誘導剤の誘導に関わる分子の分離及び
精製のための試薬として、また医薬品として極めて有用
なG-CSF誘導抗体を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、まず、マ
クロファージ自体を免疫して抗体を取得し、得られた抗
体の中からG-CSFを誘導する抗体の単離を行うこととし
た。以下、具体的に説明する。

【０００８】本発明者らは、まず、マウスマクロファー
ジ細胞株を免疫原としてMRL/lprマウス（自己免疫疾患
マウス）に投与し、モノクローナル抗体の単離を行っ
た。次いで、本発明者らは、得られたモノクローナル抗
体を、免疫原細胞であるマウスマクロファージ細胞株に
作用させ、該抗体の免疫原細胞に与える影響を検討し
た。この結果、本発明者らは、得られた抗体の一つが免
疫原細胞株であるマウスマクロファージ細胞株から濃度
依存的にG-CSFを産生させる特性を有することを見い出
した（以下、この抗体を「3-4H7抗体」と称する）。

【０００９】即ち、本発明は、マウスマクロファージ細
胞株から濃度依存的にG-CSFを産生させる特性を有する
抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を含ん
でなる医薬組成物に関する。より具体的には、本発明
は、（１） G-CSF誘導活性を有する抗体又はその一
部、例えば、（２）抗体がモノクローナル抗体である
（１）記載の抗体又はその一部、（３）モノクローナ
ル抗体が国際寄託番号FERM BP-6103であるハイブリドー
マが産生する抗体である、（２）記載の抗体もしくはそ
の一部。に関する。

【００１０】また、本発明は、（４）（２）又は
（３）に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ、例えば、（５）国際寄託番号FERM BP-6103で
あるハイブリドーマ、に関する。

【００１１】さらに本発明は、（６）（２）又は
（３）記載のモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成
物、例えば、（７）（２）又は（３）記載のモノクロ
ーナル抗体を含んでなる感染症の予防または治療のため
の医薬組成物、又は、（８）（２）又は（３）記載の
モノクローナル抗体を含んでなる好中球減少症の予防ま
たは治療のための医薬組成物、に関する。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明で用いる語句の意味
を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「モノクロ−ナル抗体」は、マクロファ
ージ細胞株に反応性を有するモノクローナル抗体であ
り、具体的には、G-CSFを産生させる作用を有するモノ
クローナル抗体である。本発明の抗体は、マクロファ
ージ細胞株に実質的に結合するという特性を有する。本
発明の抗体は、上記性質を有するポリクローナル抗体お
よびモノクローナル抗体を共に包含する。また、本発明
のモノクローナル抗体には、IgG、IgM、IgA、IgDおよび
IgEなるいずれのイムノグロブリンクラスに属するモノ
クローナル抗体をも包含し、好適には、IgGまたはIgMイ
ムノグロブリンクラスモノクローナル抗体である。

【００１３】なお、マクロファージ細胞株は、例えば、
自然発生の白血病細胞から調製したり、白血病ウイルス
による形質転換から調整することが可能である。本発明
の抗体は常法（例えば、文献「続生化学実験講座5、免
疫生化学研究法、日本生化学会編：東京化学同人発行、
等」に記載の方法）に従って取得することができる。例
えば、本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融
合によって製造されるハイブリドーマ（融合細胞）から
製造することができる。すなわち、抗体産生細胞と骨髄
腫系細胞から融合ハイブリドーマを形成し、当該ハイブ
リドーマをクローン化し、マクロファージ細胞株の全部
または一部を抗原として、それに対して特異的親和性を
示す抗体を生産するクローンを選択することによって製
造される。その操作は免疫抗原としてマクロファージ細
胞株の全部または一部を使用する以外は、従来既知の手
段を用いることができる。

【００１４】免疫抗原は、例えばマクロファージ細胞株
そのものを用いるか、マクロファージ細胞株の膜画分若
くは溶解抽出液の全部または一部を有する（ポリ）ペプ
チドの溶液又は例えば完全フロインドアジュバンドとを
混和して調製される。免疫の対象として用いられる動物
しては、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまた
はウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたはラッ
ト、より好ましくはマウスが例示される。免疫は、これ
らの哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フットパッド
内、または腹腔内に1乃至数回注射することにより行わ
れる。通常、初回免疫から約1〜2週間毎に1〜4度免疫を
行い、さらに約1〜4週間後に最終免疫を行って、最終免
疫より約3〜5日後に免疫感作された動物から抗体産生細
胞が採取される。本発明のモノクローナル抗体には、
「国際寄託番号 FERM BP-6103」のハイブリドーマが産
生するモノクローナル抗体（3-4H7抗体）もしくはその
一部または該抗体と実質的に同一の性状を有する抗体が
含まれる。「3-4H7抗体」は、細胞からのG-CSF産生誘導
能を有する。

【００１５】また、本発明は、「国際寄託番号 FERM
BP-6103」のハイブリドーマに関する。本発明のハイブ
リドーマは、公知の方法で調製することが可能である。
公知の方法としては、例えば、モノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマの調製には、ケーラー及びミルシ
ュタインらの方法（Nature，Vol．256，pp．495-497，1
975）及びそれに準じる修飾方法が挙げられる。すなわ
ち、本発明のモノクローナル抗体は、前述の如く免疫感
作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄ある
いは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞
と、好ましくは同種のマウス、ラット、モルモット、ハ
ムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好まし
くはマウス、ラットまたはヒトの骨髄腫系細胞（ミエロ
ーマ）との融合により得られる融合細胞（ハイブリドー
マ）を培養することにより調製される。培養は、インビ
トロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスター
もしくはウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたは
ラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボ
で行うことができ、抗体はそれぞれ該培養上清、または
哺乳動物の腹水から取得することができる。

【００１６】細胞融合に用いられる骨髄腫系細胞として
は、例えばマウス由来ミエローマ「P3/X63-AG8」、「P3
/NSI/1-Ag4-1」、「P3/X63-Ag8.U1」、「SP2/0-Ag1
4」、「PAI」、「FO」または「BW5147」、ラット由来ミ
エローマ「210RCY3-Ag1.2.3」、ヒト由来ミエローマ「U
-266AR1」、「GM1500-6TG-A1-2」、「UC729-6」、「CEM
-AGR」、「D1R11」又は「CEM-T15」などを挙げることが
できる。本発明のモノクローナル抗体を産生する融合細
胞クローンのスクリーニングは、融合細胞を、例えばマ
イクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウ
ェルの培養上清の抗原に対する反応性を、例えば、フロ
ーサイトメトリー、RIAやELISA等の酵素抗体法によって
測定することにより行うことができる。モノクローナル
抗体の精製、単離は、上述のような方法によって取得さ
れる本発明のモノクローナル抗体を含有する血清、腹水
あるいはハイブリドーマ培養上清をイオン交換クロマト
グラフィー（DEAEまたはDE52など）、抗イムノグロブリ
ンカラムあるいはプロテインA若くはプロテインGカラム
等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに付する
こと、または、カプロイン酸を添加することにより行う
ことができる。

【００１７】本発明の「モノクローナル抗体」は、上述
の製造方法に限定されることなく、いかなる方法で得ら
れたものであってもよい。また、通常「モノクローナル
抗体」は、免疫感作を施す哺乳動物の種類によりそれぞ
れ異なる構造の糖鎖を有するが、本発明における「モノ
クローナル抗体」は該糖鎖の構造差異により限定される
ものではなく、あらゆる哺乳動物由来のモノクローナル
抗体をも包含するものである。ファージディスプレイで
つくられるモノクローナル抗体、さらに、例えばヒトイ
ムノグロブリン遺伝子を組み込むことにより、ヒト型抗
体を産生するように遺伝子工学的に作出されたトランス
ジェニックマウスを用いて得られるヒト型モノクローナ
ル抗体、あるいは、遺伝子組換え技術により、ある哺乳
動物由来のモノクローナル抗体の定常領域（Fc領域）を
ヒトモノクローナル抗体のFc領域と組み換えたキメラモ
ノクローナル抗体、さらには抗原と相補的に直接結合し
得る相補性決定部位（CDR：complementarity-determini
ng residue）以外、全領域をヒトモノクローナル抗体の
対応領域と組換えたヒト化モノクローナル抗体も本発明
の「モノクローナル抗体」に包含される。

【００１８】本発明において「抗体の一部」とは、少な
くとも一つの可変領域を含有する抗体フラグメントの意
であり、前述の本発明における抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはFv、
F(ab')2、Fab'あるいはFabを指す。ここで、「F(ab')
2」及び「Fab'」とは、イムノグロブリン（モノクロー
ナル抗体）をタンパク質分解酵素であるペプシンあるい
はパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領
域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で
消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例
えば、IgGをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の2本
のH鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断され
てVL（L鎖可変領域）とCL（L鎖定常領域）からなるL
鎖、及びVH（H鎖可変領域）とCHγ1（H鎖定常領域中の
γ1領域）とからなるH鎖フラグメントがC末端領域でジ
スルフィド結合により結合した相同な2つの抗体フラグ
メントを製造することができる。これら2つの相同な抗
体フラグメントをそれぞれFab'という。また、IgGをペ
プシンで処理すると、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在
するジスルフィド結合の下流で切断されて前記2つのFa
b'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フ
ラグメントを製造することができる。この抗体フラグメ
ントをF(ab')2という。

【００１９】モノクローナル抗体の細胞への結合活性
は、例えば、抗体により染色したマクロファージ細胞株
をフローサイトメトリーやELISA法などを用いて解析す
るなどの方法により検出することができる。

【００２０】G-CSFの産生誘導活性を検出するためのマ
クロファージ細胞株は、レポーター遺伝子を導入したベ
クターを宿主細胞（マクロファージ細胞株）に導入する
ことにより達成される。レポーター遺伝子をプラスミド
ベクター、ファージベクター、レトロウイルスベクター
等のベクターに導入し、細胞を形質転換して、あるいは
インビトロパッケージング後、宿主細胞に形質移入（ト
ランスフェクト）することによりレポーター遺伝子を安
定に保持した形質転換細胞を作製する。

【００２１】ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主細胞内で複製保持されるものであれば特に制
限されず、また用いられるファージベクターとしても宿
主細胞内で増殖できるものであればよい。常法的に用い
られるベクターとしてpUC119、λgt10、λgt11、ピッカ
ジーンエンハンサーベクター２、pMC1 neo PolyA等
が例示される。

【００２２】プラスミドにG-CSF遺伝子の5'制御領域を
組み込む方法としては、例えば、「Maniatis,T.ら,モレ
キュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル
（Molecular Cloning,A Laboratory Manual, second ed
ition）、Cold Spring HarborLaboratory, 1.53(198
9)」に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベ
クターにG-CSF遺伝子の5'制御領域を組み込む方法とし
ては、Hyunh,T.V.らの方法（Hyunh,T.V.,DNA Cloning,a
practical approach,1,49(1985)）などが挙げられる。
簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒
造製等）を用いることもできる。このようにして得られ
る組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞
（例えば、E.coli HB101，DH5またはMC1061/P3等）及び
／または真核細胞（J774.1、PU5-1.8、RAW264.7、ST2）
真核細胞の各種の適当な宿主細胞に導入する。

【００２３】プラスミドを宿主細胞に導入する方法とし
ては、「Maniatis,T.ら,モレキュラークローニング，ア
・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A La
boratory Manual, second edition）,Cold Spring Harb
or Laboratory, 1.74(1989)」に記載の塩化カルシウム
法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクト
ロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PE
Gなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用い
る方法などが挙げられる。また、ファージベクターを宿
主細胞に導入する方法としてはファージDNAをインビト
ロパッケージングした後、増殖させた宿主細胞に導入す
る方法等が例示される。インビトロパッケージングは、
市販のインビトロパッケージングキット（例えば、スト
ラタジーン社製、アマシャム社製等）を用いることによ
って簡便に行うことができる。

【００２４】ベクターは、簡便には当業界において入手
可能な組換え用ベクター（プラスミドDNAおよびバクテ
リアファージDNA）に所望の遺伝子を常法により連結す
ることによって調製することができる。用いられるベク
ターとしては、具体的には、大腸菌由来のプラスミドと
して、例えば、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13などが、
酵母由来プラスミドとして、例えば、pSH19、pSH15など
が、枯草菌由来プラスミドとして、例えば、pUB110、pT
P5、pC194などが例示されるがこれらに制限されない。
また、ファージとしてはλファージなどのバクテリオフ
ァージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイル
ス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス[pVL
1393（インビトロゲン社製）]などが例示されるがこれ
らに制限されない。

【００２５】所望のタンパク質を生産する目的において
は、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターと
しては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主
細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生
産する機能を有するものであれば特に制限はないが、例
えば、大腸菌（pGEX-5X-1）、またはSV-40由来の発現ベ
クターなどが好ましい。

【００２６】形質転換体は、所望の発現ベクターを宿主
細胞に導入することにより調製することができる。用い
られる宿主細胞としては、本発明の発現ベクターに適合
し、形質転換されうるものであれば特に制限はなく、本
発明の技術分野において通常使用される天然細胞、また
は人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞を用いる
ことが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属
菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキ
ア属など）、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。

【００２７】特に、大腸菌または動物細胞が好ましく、
具体的には、大腸菌（DH5，HB101等）、マウス由来細胞
（COP、L、C127、Sp2／0、NS−1またはNIH3T3等）、ラ
ット由来細胞、ハムスター由来細胞（BHKおよびCHO
等）、サル由来細胞（COS1、COS3、COS7、CV1およびVel
o等）およびヒト由来細胞（Hela、2倍体線維芽細胞に由
来する細胞、ミエローマ細胞およびNamalwa等）などが
例示される。その他、動物細胞としてはマクロファー
ジ、ストローマ細胞、単球、Tリンパ球、繊維芽細胞、
血管内皮細胞、若くはそれらの動物細胞から樹立した培
養細胞株などが例示される。

【００２８】宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる
場合、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター
−オペレーター領域、開始コドン、所望の遺伝子、終止
コドンおよび複製可能単位から構成される。宿主細胞
として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合に
は、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター、
開始コドン、所望の遺伝子、終止コドンを含んでいるこ
とが好ましい。またシグナルペプチドをコードするDN
A、エンハンサー配列、所望遺伝子の5’側および3’側
の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレー
ション部位、選択マーカー領域または複製可能単位など
を適宜含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用い
られる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよ
い。

【００２９】本発明のベクターにおいて、好適な開始コ
ドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が例示され
る。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例
えば、TAG，TGAなど）が例示される。

【００３０】複製可能単位とは、宿主細胞中でその全DN
A配列を複製することができる能力をもつDNAをいい、天
然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然
のプラスミドから調製されたDNAフラグメント）および
合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとして
は、E．coliではプラスミドpBR322、もしくはその人工
的修飾物（pBR322を適当な制限酵素で処理して得られる
DNAフラグメント）が、酵母では酵母2μプラスミド、も
しくは酵母染色体DNAが、また哺乳動物細胞ではプラス
ミドpRSVneo ATCC 37198、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37
145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミド
pSV2neo ATCC 37149、プラスミドpME18S等があげられ
る。

【００３１】エンハンサー配列、ポリアデニレーション
部位およびスプライシング接合部位については、例え
ば、それぞれSV40に由来するもの等、当業者において通
常使用されるものを用いることができる。

【００３２】選択マーカーとしては、通常使用される
ものを常法により用いることができる。例えばテトラサ
イクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくは
ネオマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示され
る。

【００３３】遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ（DHFR）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝
子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺
伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカ
ルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−B−ホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカル
バミラーゼ遺伝子等を例示することができる。

【００３４】発現ベクターは、少なくとも、上述のプロ
モーター、開始コドン、所望の遺伝子、終止コドン、お
よびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製
可能単位に連結することによって調製することができ
る。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4DNA
リガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当な
DNAフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリク
ションサイトなど）を用いることができる。

【００３５】本発明に用いた発現ベクターの宿主細胞へ
の導入[形質転換（形質移入）]は従来公知の方法を用い
て行うことができる。例えば、細菌（E．coli，Bacillu
s subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法[Proc．
Natl．Acad．Sci．USA，69，2110（1972）]、プロトプ
ラスト法[Mol．Gen．Genet．，168，111（1979）]やコ
ンピテント法[J．Mol．Biol．，56，209（1971）]によ
って、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinn
enらの方法[Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75，1927（1
978）]やリチウム法[J．Bacteriol．，153，163（198
3）]によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法
[Virology，52，456（1973）]、昆虫細胞の場合は、例
えばSummersらの方法[Mol．Cell．Biol．，3，2156-216
5（1983）]によってそれぞれ形質転換することができ
る。

【００３６】上記のごとく調整した宿主細胞からの所望
タンパクの産生確認試験は、以下のように行えばよい。
つまり、上記のごとく調整した宿主細胞には、上記ベク
ターの所望遺伝子部位にマーカー遺伝子を導入し、宿主
細胞からマーカーとなるタンパクを産生させる。本発明
抗体が、宿主細胞と結合することにより、産生したタン
パクを検出すればよい。

【００３７】ここで、所望遺伝子部位に用いるレポータ
ー遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、β-ガラク
トシダーゼ、グリーンフルオレッセンスプロテイン（GF
P）、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（CAT）などが挙げられる。

【００３８】産生したタンパクを検出する方法として
は、タンパクがルシフェラーゼの場合は、ルシフェラー
ゼアッセイ法を、タンパクがクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（CAT）の場合はCATアッセイ法
を用いることができる。タンパクがグリーンフルオレッ
センスプロテイン（GFP）等の場合は蛍光測定法を用い
ることができる。

【００３９】調製された本発明のモノクローナル抗体
は、例えば、血液成分の白血球の一種である好中球が関
与する疾患の検出や治療などに利用することが可能であ
る。

【００４０】本発明の抗体は、抗ガン剤の副作用として
の好中球減少症や骨髄移植後の好中球減少症の治療及び
再生不良性貧血の診断、予防および治療などのために用
いることが可能である。本発明の抗体は通常、全身また
は局所的に、一般的には非経口の形で投与することがで
きる。非経口投与の内でも特に好ましくは静脈内投与で
ある。

【００４１】投与量は、年齢、性別、体重、症状、治療
効果、投与方法、処理時間、投与するもの（全長のタン
パク質、該タンパク質の一部を置換、欠失、挿入したタ
ンパク質、該タンパク質の抗体の種類）などにより異な
るが、成人一人当たり、一回につき10μgから100mgの範
囲で、一日一回から複数回非経口投与することができる
だろう。投与量は種々の条件により変動するため、上記
投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範
囲を越える投与量が必要な場合もある。本発明による非
経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非
水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤などを包含する。水性ま
たは非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ
以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と
して混合される。水性の希釈剤としては、例えば注射用
蒸留水および生理食塩水などが挙げられる。非水性の希
釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチ
レングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノー
ルのようなアルコール類などが挙げられる。このような
組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安
定化剤（例えばアルギニン、アスパラギン酸など）のよ
うな補助剤を含んでいてもよい。これらはバクテリア保
留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によ
って無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を例
えば凍結乾燥法などによって製造し、使用前に無菌の注
射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもで
きる。非経口投与のためのその他の組成物としては、一
つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方さ
れる外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリ
ーなどが含まれる。

【００４２】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるもので
はない。

【実施例】

[実施例1] モノクローナル抗体の調製以下に述べる抗体産生ハイブリドーマの調製は、ケーラ
ー（Kohler）らの方法（Blood、第81巻、101-111ペ−
ジ、1993年、大森ら）を参照しながら行い、また、モ
ノクロ−ナル抗体の調製は神奈木らの方法（Handbook o
f Experimental Immunology、第4巻、117.21-117.21ペ
−ジ、1986年）を参照しながら行った。まず、マウスマ
クロファージ細胞株RAW264.7を免疫感作抗原として、該
抗原をMRL/lprマウスに0日目、7日目、14日目および28
日目（それぞれ10⁷個/匹）という間隔及び量で腹腔内投
与した。最後の免疫感作から3日後に該マウスの脾臓を
採取し、常法によりマウスミエロ−マ細胞PAI（Stocke
r,J.W.et al. Res.Disclosure,217:155(1982)）と融合
させた。得られたハイブリドーマの各々の培養上清を、
免疫原であるマクロファージ細胞に添加し、ELISA法で
マクロファージ細胞に結合する抗体を産生するハイブリ
ドーマを選別した。

【００４３】[実施例2] マクロファージ細胞のG-CSF産
生確認試験に使用するベクターの調整実施例1で調製したモノクロ−ナル抗体のマクロファー
ジ細胞に及ぼす効果を以下の方法で解析した。レポータ
ー遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いたピッカジ
ーンシステム（Picagene System（和光純薬工業（株）
社製））を使用した。ピッカジーンエンハンサーベ
クター２（和光純薬工業（株）社製）を用いてXho Iサ
イトからNco Iサイトにかけて、G-CSFプロモーター遺伝
子を挿入し、その下流にG-CSF遺伝子の代りにルシフェ
ラーゼ遺伝子を結合させ、さらにＳＶ４０の下流のＳａ
ｌＩサイトにpMC1Neo Poly Aから切り出したネオマイ
シン抵抗性遺伝子を挿入したPicaGCSFneoベクターを構
築した。その結果を図１に示す。

【００４４】[実施例3] ベクターのマクロファージへ
の導入次に、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7に上記ベク
ターを以下の方法で導入した。対数増殖期のRAW264.7細
胞株を収穫し、10％ウシ胎児血清（FCS；Bio-Whittacke
r社製）及び非必須アミノ酸（NEAA）を含むイーグル培
地で一回洗浄し、同培地中に2×10⁷個／mlの濃度で再懸
濁した。上記細胞懸濁液250μl（5×10⁶個）にキャパ
シタンスエクステンダーを付けたバイオ−ラッドジ
ーンパルサーを用いて、300V、960μFで0.4cm エレク
トロポレーションキュベット（electroporation cuvett
e）中で塩化セシウムで精製したPicaGCSFneoプラスミド
DNA10μgを室温にてエレクトロポレーション法を用いて
導入した。

【００４５】[実施例4] クローンの選抜形質転換して48時間後、得られた細胞をジェネチシン
（ネオマイシンの一種）200μg/mlを含む培地でで処理
し、コロニーを形成した細胞群を10乃至15日後、選抜し
た。50個のジェネチシン抵抗性クローンの内43個のクロ
ーンがリポポリサッカライド（LPS）で処理し検出可能
なルシフェラーゼ活性を示した。そのなかでも、一つの
クローンが極めて高いルシフェラーゼ活性を示し、RAW2
64.7クローン27-3と命名した。

【００４６】なお、ルシフェラーゼ活性が実際のG-CSFm
RNAの発現を反映していることは以下の実験で確認し
た。18時間LPS10μg/mlで処理したRAW264.7クローン27-
3細胞（1.5×10⁷個）を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
で洗浄した。全RNAを1％ホルムアルデヒド・アガロース
・ゲル上で電気泳動させ、ナイロンフィルターに移し、
³²PラベルマウスG-CSFのcDNAをプローブとしてノーザン
ブロット解析を行った。コントロールとしてフィルター
を³²Pラベルβ-アクチンcDNAでハイブリダイゼーション
を行った。上記実験によって、ルシフェラーゼ活性が実
際のG-CSFmRNAの発現を反映していることが確認され
た。

【００４７】[実施例5] 抗体のマクロファージ細胞のG
-CSF産生作用 G-CSF産生能を有する抗体をルシフェラーゼを指標に選
別した。96ウェルマイクロプレートに、1ウェル当り5×
10⁴個のマクロファージ細胞株を播き、37℃で24時間培
養し、実施例1で選別したマクロファージ細胞に結合す
る抗体産生ハイブリドーマの培養上清液を添加し、さら
に、37℃で18時間培養した。ルシフェラーゼ測定は、Pi
cagene Luminescence Kit（和光純薬社製）を用いて手
引き書に従った。ルシフェラーゼ活性測定は、CT9000ル
ミノメーター（Dia-Iatron社製）で測定し、Bicinchoni
nic Acid（BCA）アッセイによりタンパク濃度を測定
し、タンパクのμg当たりの相対発光単位（Relative l
ight units(RLU)）で表示した。

【００４８】G-CSF産生能を有するハイブリドーマクロ
−ンを7クローン取得し、その中で最も活性の強いハイ
ブリドーマクロ−ンを「3-4H7」と命名した。なお、こ
のハイブリドーマは通産省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託した（寄託番号：FERM BP-6103）。また、
マウスモノクロ−ナル抗体アイソタイプ同定キット（Am
ersham社製）を用いてアイソタイプを同定したところ、
上記ハイブリドーマクローンからモノクローナル抗体
（寄託番号：FERM BP-6103から調製されるものを「3-4H
7抗体」と称する）のイムノグロブリンクラスはIgMであ
った。さらに、E-G-SEP IgM精製キット（ファルマシア
社製）を用いて「3-4H7抗体」を精製し、96ウェルマイ
クロプレートに1ウェル当り5×10⁴個のマクロファージ
細胞株を播き、37℃で24時間培養し、0, 3.75, 7.5, 1
5, 30, 60μg/mlの濃度で添加し、37℃で18時間培養し
た。その結果を図２に示す。

【００４９】図２から、本願発明抗体は、抗体濃度依存
的にマクロファージ細胞株RAW264.7クローン27-3からG-
CSFを産生する作用を有することが確認された。

【００５０】

【発明の効果】本発明の抗体は、G-CSFの産生能を有
し、抗ガン剤の副作用としての好中球減少症や骨髄移植
後の好中球減少症の治療及び再生不良性貧血の治療に効
果を示す。G-CSFの産生能を有することにより、日和見
感染症をはじめとする各種感染症性疾患の予防又は治療
に利用できる。また、該抗体を産生するハイブリドーマ
は、多大な有用性が期待される本発明の該抗体を生産す
る際の重要かつ必須の細胞である。

【００５１】

【図面の簡単な説明】

【図１】「3-4H7抗体」によるマクロファージ細胞のG-C
SF産生確認試験に使用するベクターの遺伝子地図であ
る。

【図２】「3-4H7抗体」のマクロファージ細胞株に及ぼ
す効果を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者西義介神奈川県横浜市青葉区梅が丘６−２経営企画部青葉台駐在内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】顆粒球コロニー刺激因子誘導活性を有す
る抗体又はその一部。
【請求項２】抗体がモノクローナル抗体である請求項
１記載の抗体又はその一部。
【請求項３】モノクローナル抗体が国際寄託番号FERM
BP-6103であるハイブリドーマが産生する抗体である、
請求項２記載の抗体もしくはその一部。
【請求項４】請求項２に記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ。
【請求項５】国際寄託番号FERM BP-6103であるハイブ
リドーマ。
【請求項６】請求項１乃至請求項３記載の抗体又はそ
の一部及び薬学的に許容されうる担体とを含んでなる医
薬組成物。
【請求項７】請求項１乃至請求項３記載の抗体又はそ
の一部及び薬学的に許容されうる担体を有効成分として
含んでなる感染症の予防または治療のための医薬組成
物。
【請求項８】請求項１乃至請求項３記載の抗体又はそ
の一部及び薬学的に許容されうる担体を有効成分として
含んでなる好中球減少症の予防または治療のための医薬
組成物。