JPH1099093A - 豚流行性下痢ウイルス（ｐｅｄｖ）の糖蛋白抗原の作製法 - Google Patents
豚流行性下痢ウイルス（ｐｅｄｖ）の糖蛋白抗原の作製法Info
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- JPH1099093A JPH1099093A JP25463796A JP25463796A JPH1099093A JP H1099093 A JPH1099093 A JP H1099093A JP 25463796 A JP25463796 A JP 25463796A JP 25463796 A JP25463796 A JP 25463796A JP H1099093 A JPH1099093 A JP H1099093A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対する
抗体を短期間に大量に得ることにより当該病気の診断を
容易に行うこと。 【解決手段】 ＰＥＤウイルスの糖蛋白を調製し、特異
性に優れた各種診断用抗原に利用できること。
抗体を短期間に大量に得ることにより当該病気の診断を
容易に行うこと。 【解決手段】 ＰＥＤウイルスの糖蛋白を調製し、特異
性に優れた各種診断用抗原に利用できること。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は豚伝染性下痢ウイル
ス（以下「ＰＥＤＶ」と略記する）の診断用抗原の作製
法とＰＥＤＶの診断法に関する。
ス（以下「ＰＥＤＶ」と略記する）の診断用抗原の作製
法とＰＥＤＶの診断法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】豚伝
染性下痢症（ＰＥＤ）は、１９７１年に英国で豚の急性
下痢症が発生し、その原因はそれまで知られていた下痢
の起因微生物ではなく、新しく発見されたコロナウイル
スによることが明らかにされ、ＰＥＤウイルスと名付け
られた。ＰＥＤは今や世界的に発生が見られ、わが国に
おいても１９８２年に初発生があり、１９９４年以後全
国的に発生を見ている。ＰＥＤＶは全ての年令の豚に感
染し、感染豚は嘔吐、発熱、水様性の下痢（または軟
便）、食欲不振等の症状を呈する。哺乳豚が感染すると
１０〜１００％の死亡率となり、母豚では泌乳の減少や
停止などを起こし、さらには死流産を起こすこともあ
る。本病による経済的損失は、流産や死産、哺乳豚の死
亡、下痢による発育低下、飼料効率の低下、薬剤費や労
賃の増加などにより甚大な金額となる。ＰＥＤウイルス
はコロナウイルス科に属するウイルスであり、粒子の表
面に多数の針状の構造物をもつことが特徴であり、この
構造物をスパイクと称している。このスパイクはウイル
スの糖蛋白から形成されている。コロナウイルス科で良
く研究されている豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）ウイルスで
はウイルスの感染を防御する中和抗体は、スパイクの糖
蛋白に対する抗体であることが明らかにされている。さ
らに、スパイク糖蛋白を抗原として使用した各種診断薬
は特異性に優れていることが報告されている（豚病学第
三版、２４０頁、近代出版）。しかし、ＰＥＤウイルス
の培養にはトリプシンを必要とするが、トリプシンは普
通の細胞に障害を起こすので、ＰＥＤウイルスを大量に
得ることは困難である。したがって、特異性に優れ、短
期間に大量の血清検査ができる方法は確立されていな
い。このように、従来技術においてはＰＥＤウイルスに
対する抗体を短期間に大量に検査することができないと
いう問題点があった。
染性下痢症（ＰＥＤ）は、１９７１年に英国で豚の急性
下痢症が発生し、その原因はそれまで知られていた下痢
の起因微生物ではなく、新しく発見されたコロナウイル
スによることが明らかにされ、ＰＥＤウイルスと名付け
られた。ＰＥＤは今や世界的に発生が見られ、わが国に
おいても１９８２年に初発生があり、１９９４年以後全
国的に発生を見ている。ＰＥＤＶは全ての年令の豚に感
染し、感染豚は嘔吐、発熱、水様性の下痢（または軟
便）、食欲不振等の症状を呈する。哺乳豚が感染すると
１０〜１００％の死亡率となり、母豚では泌乳の減少や
停止などを起こし、さらには死流産を起こすこともあ
る。本病による経済的損失は、流産や死産、哺乳豚の死
亡、下痢による発育低下、飼料効率の低下、薬剤費や労
賃の増加などにより甚大な金額となる。ＰＥＤウイルス
はコロナウイルス科に属するウイルスであり、粒子の表
面に多数の針状の構造物をもつことが特徴であり、この
構造物をスパイクと称している。このスパイクはウイル
スの糖蛋白から形成されている。コロナウイルス科で良
く研究されている豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）ウイルスで
はウイルスの感染を防御する中和抗体は、スパイクの糖
蛋白に対する抗体であることが明らかにされている。さ
らに、スパイク糖蛋白を抗原として使用した各種診断薬
は特異性に優れていることが報告されている（豚病学第
三版、２４０頁、近代出版）。しかし、ＰＥＤウイルス
の培養にはトリプシンを必要とするが、トリプシンは普
通の細胞に障害を起こすので、ＰＥＤウイルスを大量に
得ることは困難である。したがって、特異性に優れ、短
期間に大量の血清検査ができる方法は確立されていな
い。このように、従来技術においてはＰＥＤウイルスに
対する抗体を短期間に大量に検査することができないと
いう問題点があった。
【０００３】
【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するた
めに、本発明はＰＥＤウイルスを大量に得ることのでき
るウイルス培養法を見出した（特願平８−２４５８０７
号）ことに基づき、大量のウイルス糖蛋白を調製し、特
異性に優れた各種診断用抗原に利用できることを見出し
た。本発明のＰＥＤウイルス糖蛋白は下記の実施例に詳
述する方法により得ることができる。
めに、本発明はＰＥＤウイルスを大量に得ることのでき
るウイルス培養法を見出した（特願平８−２４５８０７
号）ことに基づき、大量のウイルス糖蛋白を調製し、特
異性に優れた各種診断用抗原に利用できることを見出し
た。本発明のＰＥＤウイルス糖蛋白は下記の実施例に詳
述する方法により得ることができる。
【０００４】実施例 １粗ＰＥＤウイルス糖蛋白の作製法 豚由来のＰＥＤウイルスに感受性のある培養細胞（ＴＲ
−ＳＫ細胞またはＴＲ−ＳＳＩ細胞等）（特願平８−２
４５８０７号参照）を、０．２５％トリプシン溶液と
０．２％ＥＤＴＡ溶液の等量混合物からなる細胞消化液
で細胞をばらばらにした。これを細胞培養液中に約１０
０万個／ｍｌになるように浮遊させ、ついで培養瓶に分
注し３７℃で１〜３日間培養した。前記細胞培養液はイ
ーグルＭＥＭ液に容量百分率で非働化牛血清１０％、ト
リプトースホスフェートブロス１０％、さらにカナマイ
シン１００μｇ／ｍｌ、ファンギゾン１μｇ／ｍｌを混
合したものである。単層を形成したところでＰＥＤウイ
ルスを接種し、３７℃で６０〜９０分感作し、ウイルス
を完全に細胞に吸着させる。ついでウイルス液を除去し
７５μｇ／ｍｌの割合にトリプシンを添加した培養液
（組成はイーグルＭＥＭ液に容量百分率でトリプトース
ホスフェートブロス１０％、カナマイシン１００μｇ／
ｍｌ、ファンギゾン１μｇ／ｍｌおよびトリプシンを７
５μｇ／ｍｌに混合したものである）で５〜７日間培養
した。かくして前記の各細胞はいずれもウイルス接種後
１〜５日で特有の細胞変性効果を示してくる。細胞変性
効果が完全に起こった時期に培養液を採取した。このよ
うに採取した培養液に含まれるウイルス量はいずれも１
０7.0 ＴＣＩＤ50／ｍｌ以上であった。採取したウイル
ス培養液から低速遠心（５，０００回転、３０分間）に
より細胞、細胞破片等を除去した。遠心上清液にポリエ
チレングリコール６，０００を１０％に、塩化ナトリウ
ムを０．５モルになるように添加し、完全に溶解するま
で４℃でマグネチックスターラーを用いて溶解させた。
ついで５，０００回転で３０分間遠心して沈澱物を得
た。沈澱物をウイルス培養液の約１／５０量のリン酸緩
衝生理食塩液（ＰＢＳ）で溶解することにより粗ＰＥＤ
ウイルス糖蛋白を得た。本製品にはウイルス粒子とウイ
ルス糖蛋白（ウイルスのスパイク）を含む。
−ＳＫ細胞またはＴＲ−ＳＳＩ細胞等）（特願平８−２
４５８０７号参照）を、０．２５％トリプシン溶液と
０．２％ＥＤＴＡ溶液の等量混合物からなる細胞消化液
で細胞をばらばらにした。これを細胞培養液中に約１０
０万個／ｍｌになるように浮遊させ、ついで培養瓶に分
注し３７℃で１〜３日間培養した。前記細胞培養液はイ
ーグルＭＥＭ液に容量百分率で非働化牛血清１０％、ト
リプトースホスフェートブロス１０％、さらにカナマイ
シン１００μｇ／ｍｌ、ファンギゾン１μｇ／ｍｌを混
合したものである。単層を形成したところでＰＥＤウイ
ルスを接種し、３７℃で６０〜９０分感作し、ウイルス
を完全に細胞に吸着させる。ついでウイルス液を除去し
７５μｇ／ｍｌの割合にトリプシンを添加した培養液
（組成はイーグルＭＥＭ液に容量百分率でトリプトース
ホスフェートブロス１０％、カナマイシン１００μｇ／
ｍｌ、ファンギゾン１μｇ／ｍｌおよびトリプシンを７
５μｇ／ｍｌに混合したものである）で５〜７日間培養
した。かくして前記の各細胞はいずれもウイルス接種後
１〜５日で特有の細胞変性効果を示してくる。細胞変性
効果が完全に起こった時期に培養液を採取した。このよ
うに採取した培養液に含まれるウイルス量はいずれも１
０7.0 ＴＣＩＤ50／ｍｌ以上であった。採取したウイル
ス培養液から低速遠心（５，０００回転、３０分間）に
より細胞、細胞破片等を除去した。遠心上清液にポリエ
チレングリコール６，０００を１０％に、塩化ナトリウ
ムを０．５モルになるように添加し、完全に溶解するま
で４℃でマグネチックスターラーを用いて溶解させた。
ついで５，０００回転で３０分間遠心して沈澱物を得
た。沈澱物をウイルス培養液の約１／５０量のリン酸緩
衝生理食塩液（ＰＢＳ）で溶解することにより粗ＰＥＤ
ウイルス糖蛋白を得た。本製品にはウイルス粒子とウイ
ルス糖蛋白（ウイルスのスパイク）を含む。
【０００５】実施例 ２蔗糖不連続密度勾配遠心による粗製ＰＥＤウイルス糖蛋
白の作製法 粗ＰＥＤウイルス糖蛋白を６０％蔗糖および２０％蔗糖
の２層の上層に重層し、４０，０００回転で２時間遠心
した。この結果、６０％蔗糖と２０％蔗糖の層間と２０
％蔗糖の上層に白色のバンドが形成された。２０％蔗糖
の上層白色バンドを採取した。このようにして粗製ＰＥ
Ｄウイルス糖蛋白を得た。また、６０％蔗糖の上層白色
バンドを採取し、これを部分精製ＰＥＤウイルス糖蛋白
とした。
白の作製法 粗ＰＥＤウイルス糖蛋白を６０％蔗糖および２０％蔗糖
の２層の上層に重層し、４０，０００回転で２時間遠心
した。この結果、６０％蔗糖と２０％蔗糖の層間と２０
％蔗糖の上層に白色のバンドが形成された。２０％蔗糖
の上層白色バンドを採取した。このようにして粗製ＰＥ
Ｄウイルス糖蛋白を得た。また、６０％蔗糖の上層白色
バンドを採取し、これを部分精製ＰＥＤウイルス糖蛋白
とした。
【０００６】実施例 ３ＰＥＤウイルス可溶化糖蛋白の作製法 実施例２で得た部分精製ＰＥＤウイルスを、最終濃度が
０．１〜２％のオクチル−１−フェノキシポリエトキシ
エタノール（ノニデットＰ−４０）またはポリオキシエ
チレン（１０）オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ
−１００）で３７℃で混合処理し、ウイルス糖蛋白をウ
イルス粒子から解離させた。このように調製したものを
ＰＥＤウイルス可溶化糖蛋白とした。
０．１〜２％のオクチル−１−フェノキシポリエトキシ
エタノール（ノニデットＰ−４０）またはポリオキシエ
チレン（１０）オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ
−１００）で３７℃で混合処理し、ウイルス糖蛋白をウ
イルス粒子から解離させた。このように調製したものを
ＰＥＤウイルス可溶化糖蛋白とした。
【０００７】実施例 ４ＰＥＤウイルス感染細胞可溶化糖蛋白の作製法 実施例１に記載した方法によりウイルスを培養し、培養
液を低速遠心により沈澱させた。沈澱に集まった感染細
胞を１〜２％のノニデットＰ−４０またはトリトンＸ−
１００溶液で浮遊させ、１０％浮遊液を作製した。１０
％感染細胞浮遊液をガラスホモゲナイザーで乳剤にし、
３７℃で３０分間作用させ、ウイルス糖蛋白をウイルス
感染細胞から解離させた後、７，０００回転３０分間遠
心して上澄を採取した。このように調製したものをＰＥ
Ｄウイルス感染細胞可溶化糖蛋白とした。
液を低速遠心により沈澱させた。沈澱に集まった感染細
胞を１〜２％のノニデットＰ−４０またはトリトンＸ−
１００溶液で浮遊させ、１０％浮遊液を作製した。１０
％感染細胞浮遊液をガラスホモゲナイザーで乳剤にし、
３７℃で３０分間作用させ、ウイルス糖蛋白をウイルス
感染細胞から解離させた後、７，０００回転３０分間遠
心して上澄を採取した。このように調製したものをＰＥ
Ｄウイルス感染細胞可溶化糖蛋白とした。
【０００８】実施例 ５ＰＥＤウイルス精製糖蛋白の作製法 実施例１〜４の方法により得た製品には、ウイルスに由
来する糖蛋白以外に蛋白を含有する。これらの製品か
ら、ウイルス糖蛋白を単離しＰＥＤウイルス精製糖蛋白
を作製した。すなわち、コンカナバリンＡセファデック
ス粒子に実施例１〜４で得た製品をそれぞれに混合し、
４℃で一夜振盪し粒子に糖蛋白を吸着させた。これを静
置するとコンカナバリンＡセファデックス粒子が沈澱
し、上澄を取り除き、ＰＢＳで５回以上洗浄した。洗浄
後、２モルのメチルマンノシド液にコンカナバリンＡセ
ファデックス粒子を浮遊させ、糖蛋白を粒子から解離さ
せた。糖蛋白はメチルマンノシド液に溶解されてくるの
で、静置または低速遠心によりコンカナバリンＡセファ
デックス粒子を沈め、上澄液を回収した。上澄液を透析
膜あるいはコロジオンパックを使いＰＢＳで透析と濃縮
を行った。このように調製したものをＰＥＤウイルス精
製糖蛋白とした。なお、ＰＥＤウイルス精製糖蛋白の作
製は実施例１〜４で得た製品をそれぞれ個別に行って
も、あるいは実施例１〜４の製品を混合した後に作製し
てもよい。
来する糖蛋白以外に蛋白を含有する。これらの製品か
ら、ウイルス糖蛋白を単離しＰＥＤウイルス精製糖蛋白
を作製した。すなわち、コンカナバリンＡセファデック
ス粒子に実施例１〜４で得た製品をそれぞれに混合し、
４℃で一夜振盪し粒子に糖蛋白を吸着させた。これを静
置するとコンカナバリンＡセファデックス粒子が沈澱
し、上澄を取り除き、ＰＢＳで５回以上洗浄した。洗浄
後、２モルのメチルマンノシド液にコンカナバリンＡセ
ファデックス粒子を浮遊させ、糖蛋白を粒子から解離さ
せた。糖蛋白はメチルマンノシド液に溶解されてくるの
で、静置または低速遠心によりコンカナバリンＡセファ
デックス粒子を沈め、上澄液を回収した。上澄液を透析
膜あるいはコロジオンパックを使いＰＢＳで透析と濃縮
を行った。このように調製したものをＰＥＤウイルス精
製糖蛋白とした。なお、ＰＥＤウイルス精製糖蛋白の作
製は実施例１〜４で得た製品をそれぞれ個別に行って
も、あるいは実施例１〜４の製品を混合した後に作製し
てもよい。
【０００９】実施例 ６赤血球凝集反応によるＰＥＤウイルス抗体の測定法 赤血球凝集抑制反応による赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体
の測定は、ウイルスに赤血球凝集性が認められているウ
イルスに利用することができる。ＰＥＤウイルスには赤
血球凝集性（ＨＡ）がない（豚病学第３版、２４９頁、
近代出版）とされているため、赤血球凝集抑制反応によ
るＰＥＤの血清学的診断は行わなかった。実施例１〜５
で作製した糖蛋白製品についてＨＡ性を調べたところ、
表１に示すようにすべての製品でＨＡ性が認められた。
具体的には、各製品の２５μｌの段階希釈列を９６穴Ｖ
型マイクロプレートに作り、これにリン酸緩衝食塩液に
各種動物の赤血球を０．４％に含有する浮遊液５０μｌ
を加え、良く混合した後、室温、３７℃および４℃に静
置し観察した。この結果、ウサギ、マウス、豚および鶏
の赤血球を使用した場合、室温および３７℃で１６〜１
２８倍希釈した製品で赤血球の凝集が認められた。 表１ 各種糖蛋白製品のＨＡ価 ──────────────────────────────────── 製品名 培養液100mlmから得た量 ＨＡ価 ──────────────────────────────────── 製品（１）、粗ＰＥＤウイルス糖蛋白 ２ ｍｌ ２０４８ 製品（２）、粗製ＰＥＤウイルス糖蛋白 ２ ｍｌ ２０４８ 部分精製ＰＥＤウイルス糖蛋白 ２ ｍｌ ５１２ 製品（３）、ＰＥＤウイルス可溶化糖蛋白 ２ ｍｌ ５１２ 製品（４）、ＰＥＤウイルス感染細胞可溶化糖蛋白 ２ ｍｌ ８１９２ 製品（５）、ＰＥＤウイルス精製糖蛋白 ２ ｍｌ ４０９６ ──────────────────────────────────── このようにＰＥＤウイルス糖蛋白に赤血球凝集性がある
ことを新たに見出したので、この性質を利用してＰＥＤ
ウイルス感染豚血清について赤血球凝集抑制反応を行っ
た。反応は検査血清を０．１ｍｌを取り、これにカオリ
ン５０％を含有するリン酸緩衝生理食塩液を０．４ｍｌ
加え、３７℃で３０分間混合し、２０００回転／１０分
間遠心し上清を得た。これに沈澱させたウサギ赤血球を
約０．１ｍｌ滴下し室温で３０分間混合し２０００回転
／１０分間の遠心により赤血球を沈澱させ上清を採取し
た（以下「処理血清」と呼ぶ）。この処理血清２５μｌ
と、８倍に希釈しても赤血球を凝集する実施例１〜５で
作製した糖蛋白製品（以下「赤血球凝集抑制反応用抗
原」と呼ぶ」２５μｌとを混合し、３７℃で６０分間作
用させた。ついで、０．４％に調整したウサギ赤血球を
５０μｌ加え、混合後室温で２時間静置し判定した。赤
血球の凝集を完全に抑制した場合を抗体陽性とし、その
希釈倍数の逆数をＨＩ抗体価とした。赤血球凝集抑制反
応の成績を表２に示した。 表２ ＰＥＤウイルスＨＩ抗体の測定 ─────────────────────────豚番号 感染の経過 ＨＩ抗体価 １ 発症中 ＜１０ ２ 発症中 ＜１０ ３ 発症中 ＜１０ ４ 発症中 ＜１０ ５ 発症中 ＜１０ １−後 発症後３週目 ４０ ２−後 発症後３週目 １６０ ３−後 発症後３週目 ３２０ ４−後 発症後３週目 ６４０５−後 発症後３週目 ３２０ 成績から明らかなように、本法による抗体測定法は高い
感度と特異性を示した。上記実施例では、ウサギ赤血球
を使用した成績であったが、凝集性のある各種動物の赤
血球を用いても同様の成績が得られた。なお、豚赤血球
を使用した場合、血清処理においてカオリン処理だけで
赤血球による吸収処理をしなくても成績に影響はなかっ
た。
の測定は、ウイルスに赤血球凝集性が認められているウ
イルスに利用することができる。ＰＥＤウイルスには赤
血球凝集性（ＨＡ）がない（豚病学第３版、２４９頁、
近代出版）とされているため、赤血球凝集抑制反応によ
るＰＥＤの血清学的診断は行わなかった。実施例１〜５
で作製した糖蛋白製品についてＨＡ性を調べたところ、
表１に示すようにすべての製品でＨＡ性が認められた。
具体的には、各製品の２５μｌの段階希釈列を９６穴Ｖ
型マイクロプレートに作り、これにリン酸緩衝食塩液に
各種動物の赤血球を０．４％に含有する浮遊液５０μｌ
を加え、良く混合した後、室温、３７℃および４℃に静
置し観察した。この結果、ウサギ、マウス、豚および鶏
の赤血球を使用した場合、室温および３７℃で１６〜１
２８倍希釈した製品で赤血球の凝集が認められた。 表１ 各種糖蛋白製品のＨＡ価 ──────────────────────────────────── 製品名 培養液100mlmから得た量 ＨＡ価 ──────────────────────────────────── 製品（１）、粗ＰＥＤウイルス糖蛋白 ２ ｍｌ ２０４８ 製品（２）、粗製ＰＥＤウイルス糖蛋白 ２ ｍｌ ２０４８ 部分精製ＰＥＤウイルス糖蛋白 ２ ｍｌ ５１２ 製品（３）、ＰＥＤウイルス可溶化糖蛋白 ２ ｍｌ ５１２ 製品（４）、ＰＥＤウイルス感染細胞可溶化糖蛋白 ２ ｍｌ ８１９２ 製品（５）、ＰＥＤウイルス精製糖蛋白 ２ ｍｌ ４０９６ ──────────────────────────────────── このようにＰＥＤウイルス糖蛋白に赤血球凝集性がある
ことを新たに見出したので、この性質を利用してＰＥＤ
ウイルス感染豚血清について赤血球凝集抑制反応を行っ
た。反応は検査血清を０．１ｍｌを取り、これにカオリ
ン５０％を含有するリン酸緩衝生理食塩液を０．４ｍｌ
加え、３７℃で３０分間混合し、２０００回転／１０分
間遠心し上清を得た。これに沈澱させたウサギ赤血球を
約０．１ｍｌ滴下し室温で３０分間混合し２０００回転
／１０分間の遠心により赤血球を沈澱させ上清を採取し
た（以下「処理血清」と呼ぶ）。この処理血清２５μｌ
と、８倍に希釈しても赤血球を凝集する実施例１〜５で
作製した糖蛋白製品（以下「赤血球凝集抑制反応用抗
原」と呼ぶ」２５μｌとを混合し、３７℃で６０分間作
用させた。ついで、０．４％に調整したウサギ赤血球を
５０μｌ加え、混合後室温で２時間静置し判定した。赤
血球の凝集を完全に抑制した場合を抗体陽性とし、その
希釈倍数の逆数をＨＩ抗体価とした。赤血球凝集抑制反
応の成績を表２に示した。 表２ ＰＥＤウイルスＨＩ抗体の測定 ─────────────────────────豚番号 感染の経過 ＨＩ抗体価 １ 発症中 ＜１０ ２ 発症中 ＜１０ ３ 発症中 ＜１０ ４ 発症中 ＜１０ ５ 発症中 ＜１０ １−後 発症後３週目 ４０ ２−後 発症後３週目 １６０ ３−後 発症後３週目 ３２０ ４−後 発症後３週目 ６４０５−後 発症後３週目 ３２０ 成績から明らかなように、本法による抗体測定法は高い
感度と特異性を示した。上記実施例では、ウサギ赤血球
を使用した成績であったが、凝集性のある各種動物の赤
血球を用いても同様の成績が得られた。なお、豚赤血球
を使用した場合、血清処理においてカオリン処理だけで
赤血球による吸収処理をしなくても成績に影響はなかっ
た。
【００１０】実施例 ７寒天ゲル内沈降反応によるＰＥＤウイルス抗体の測定 寒天ゲル内沈降反応は、寒天ゲル内で抗原と抗体を互い
に拡散させて沈降反応を起こさせる方法であり、両者の
間に白色の沈降線が生ずるか否かで判定する。１％の寒
天（栄研化学の電気泳動用寒天の他いずれの製品でもよ
い）を混合させたＰＢＳにアジ化ナトリウムを０．０１
％添加し、沸騰水中で融解させた。融解した寒天液５ｍ
ｌを、あらかじめ寒天液を塗布し乾燥させてある顕微鏡
用スライドグラス上に静かにのせ、固まるまで室温に放
置した。ついで直径５ｍｍの穴を中心に１個と、これか
ら３ｍｍの距離で６個の穴をあけた。中心の穴に実施例
１〜５の製品を入れ、周囲の穴に抗体の有無を検査しよ
うとする血清を入れ（１穴に１検体）、３７℃で１８時
間静置した。この結果、ＰＥＤＶ非感染の血清では沈降
線が認められなかったが、ＰＥＤＶ感染３週後の血清で
は白色の沈降線が中心の穴との間に形成された。このよ
うに沈降線が形成された場合は検査血清中にＰＥＤＶ抗
体が存在していることを示す。また、抗体の強さ（抗体
価）を知るためには、抗原力価を一定にして（４単位）
中心の穴に入れ、周囲の穴に検査血清を２倍段階希釈し
てそれぞれ１穴に入れ、３７℃で４８時間反応させた。
沈降線の形成された血清の最高希釈倍数の逆数を抗体価
として知ることができた。ＰＥＤＶ感染豚血清について
寒天ゲル内沈降反応により抗体価を測定した成績を表３
に示した。なお、実施例１〜５で作製したいずれの製品
を用いても同様の成績であった。 表３ ＰＥＤウイルス寒天ゲル内沈降抗体の測定 ─────────────────────────── 豚番号 感染の経過 ＨＩ抗体価 ─────────────────────────── １ 発症中 ＜１０ ２ 発症中 ＜１０ ３ 発症中 ＜１０ ４ 発症中 ＜１０ ５ 発症中 ＜１０ １−後 発症後３週目 ４０ ２−後 発症後３週目 １６０ ３−後 発症後３週目 ３２０ ４−後 発症後３週目 ６４０ ５−後 ３２０ ──────────────────────────
に拡散させて沈降反応を起こさせる方法であり、両者の
間に白色の沈降線が生ずるか否かで判定する。１％の寒
天（栄研化学の電気泳動用寒天の他いずれの製品でもよ
い）を混合させたＰＢＳにアジ化ナトリウムを０．０１
％添加し、沸騰水中で融解させた。融解した寒天液５ｍ
ｌを、あらかじめ寒天液を塗布し乾燥させてある顕微鏡
用スライドグラス上に静かにのせ、固まるまで室温に放
置した。ついで直径５ｍｍの穴を中心に１個と、これか
ら３ｍｍの距離で６個の穴をあけた。中心の穴に実施例
１〜５の製品を入れ、周囲の穴に抗体の有無を検査しよ
うとする血清を入れ（１穴に１検体）、３７℃で１８時
間静置した。この結果、ＰＥＤＶ非感染の血清では沈降
線が認められなかったが、ＰＥＤＶ感染３週後の血清で
は白色の沈降線が中心の穴との間に形成された。このよ
うに沈降線が形成された場合は検査血清中にＰＥＤＶ抗
体が存在していることを示す。また、抗体の強さ（抗体
価）を知るためには、抗原力価を一定にして（４単位）
中心の穴に入れ、周囲の穴に検査血清を２倍段階希釈し
てそれぞれ１穴に入れ、３７℃で４８時間反応させた。
沈降線の形成された血清の最高希釈倍数の逆数を抗体価
として知ることができた。ＰＥＤＶ感染豚血清について
寒天ゲル内沈降反応により抗体価を測定した成績を表３
に示した。なお、実施例１〜５で作製したいずれの製品
を用いても同様の成績であった。 表３ ＰＥＤウイルス寒天ゲル内沈降抗体の測定 ─────────────────────────── 豚番号 感染の経過 ＨＩ抗体価 ─────────────────────────── １ 発症中 ＜１０ ２ 発症中 ＜１０ ３ 発症中 ＜１０ ４ 発症中 ＜１０ ５ 発症中 ＜１０ １−後 発症後３週目 ４０ ２−後 発症後３週目 １６０ ３−後 発症後３週目 ３２０ ４−後 発症後３週目 ６４０ ５−後 ３２０ ──────────────────────────
【００１１】実施例 ８酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるＰＥＤウイルス抗
体の測定 実施例２〜５のそれぞれの製品について酵素免疫測定法
によりＰＥＤウイルス抗体測定を実施した。それぞれの
製品を５００〜２０００倍に炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）
で希釈しＥＬＩＳＡ用抗原とした。９６穴のマイクロプ
レートに０．１ｍｌあて加え、４℃で一晩置いた後、洗
浄液（０．０２％にツウィーン２０を加えた生理食塩
水）で５回洗浄した。１００倍に希釈した可検血清を１
穴に０．１ｍｌあて加え、３７℃で６０分間反応させ
た。洗浄液で５回洗浄した後、酵素標識抗体（豚１ｇＧ
で免疫したウサギ血清から１ｇＧを分画し、ペルオキシ
ダーゼで標識したもの、市販品を使用）を０．１ｍｌあ
て加え、２５℃で３０分間反応させた。洗浄後ｏ−フェ
ニレンジアミン（ＯＰＤ）液（０．２モルリン酸水素ナ
トリウム２５ｍｌと０．１モルクエン酸２５ｍｌにＯＰ
Ｄ２０ｍｇを溶解させ、過酸化水素０．０１ｍｌを加え
た液）を０．１ｍｌあて加え、２５℃で２０分間反応さ
せた。反応後直ちに反応停止液（３規定硫酸）を０．１
ｍｌあて加えた。これを４９２ｎｍで吸光度を測定し
た。この結果は表４に示す。 表４ ＰＥＤウイルスＥＬＩＳＡの測定 ───────────────────────────── 豚番号 感染の経過 ＯＤ値 ───────────────────────────── １ 発症中 ０．０８ ２ 発症中 ０．１１ ３ 発症中 ０．０５ ４ 発症中 ０．０８ ５ 発症中 ０．０７ １−後 発症後３週目 １．５３ ２−後 発症後３週目 １．７２ ３−後 発症後３週目 １．９５ ４−後 発症後３週目 １．５９ ５−後 発症後３週目 １．３８ ──────────────────────────── 上記の結果から、いずれの糖蛋白製品を用いても、ウイ
ルス感染前（発症初期）血清では、ＯＤ値が０．２以下
であったが、発症後２週目ではいずれの血清においても
ＯＤ値が０．２以上であった。すなわち、ＯＤ値が高い
ほどＰＥＤウイルス糖蛋白に対する抗体が多いことを示
す。このように、実施例１〜５の製品を使ったＥＬＩＳ
Ａ法によりＰＥＤウイルス糖蛋白に対する抗体を検出す
ることができた。また、この実施例ではＯＰＤ液を使用
したが、この代わりに２，２’−アジノ−ジ−〔３−エ
チルベンズチアゾリンスルホン酸（６）〕（ＡＢＴＳ）
を使用しても上記と同様に抗体を検出することができ
た。
体の測定 実施例２〜５のそれぞれの製品について酵素免疫測定法
によりＰＥＤウイルス抗体測定を実施した。それぞれの
製品を５００〜２０００倍に炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）
で希釈しＥＬＩＳＡ用抗原とした。９６穴のマイクロプ
レートに０．１ｍｌあて加え、４℃で一晩置いた後、洗
浄液（０．０２％にツウィーン２０を加えた生理食塩
水）で５回洗浄した。１００倍に希釈した可検血清を１
穴に０．１ｍｌあて加え、３７℃で６０分間反応させ
た。洗浄液で５回洗浄した後、酵素標識抗体（豚１ｇＧ
で免疫したウサギ血清から１ｇＧを分画し、ペルオキシ
ダーゼで標識したもの、市販品を使用）を０．１ｍｌあ
て加え、２５℃で３０分間反応させた。洗浄後ｏ−フェ
ニレンジアミン（ＯＰＤ）液（０．２モルリン酸水素ナ
トリウム２５ｍｌと０．１モルクエン酸２５ｍｌにＯＰ
Ｄ２０ｍｇを溶解させ、過酸化水素０．０１ｍｌを加え
た液）を０．１ｍｌあて加え、２５℃で２０分間反応さ
せた。反応後直ちに反応停止液（３規定硫酸）を０．１
ｍｌあて加えた。これを４９２ｎｍで吸光度を測定し
た。この結果は表４に示す。 表４ ＰＥＤウイルスＥＬＩＳＡの測定 ───────────────────────────── 豚番号 感染の経過 ＯＤ値 ───────────────────────────── １ 発症中 ０．０８ ２ 発症中 ０．１１ ３ 発症中 ０．０５ ４ 発症中 ０．０８ ５ 発症中 ０．０７ １−後 発症後３週目 １．５３ ２−後 発症後３週目 １．７２ ３−後 発症後３週目 １．９５ ４−後 発症後３週目 １．５９ ５−後 発症後３週目 １．３８ ──────────────────────────── 上記の結果から、いずれの糖蛋白製品を用いても、ウイ
ルス感染前（発症初期）血清では、ＯＤ値が０．２以下
であったが、発症後２週目ではいずれの血清においても
ＯＤ値が０．２以上であった。すなわち、ＯＤ値が高い
ほどＰＥＤウイルス糖蛋白に対する抗体が多いことを示
す。このように、実施例１〜５の製品を使ったＥＬＩＳ
Ａ法によりＰＥＤウイルス糖蛋白に対する抗体を検出す
ることができた。また、この実施例ではＯＰＤ液を使用
したが、この代わりに２，２’−アジノ−ジ−〔３−エ
チルベンズチアゾリンスルホン酸（６）〕（ＡＢＴＳ）
を使用しても上記と同様に抗体を検出することができ
た。
【００１２】実施例 ９ラテックス凝集反応用抗原を用いた抗体の測定 実施例５の方法で得た製品をグリシン緩衝液、ｐＨ８．
０で約１００倍に希釈し抗原液とした。０．９μｍのラ
テックス粒子をグリシン緩衝液で洗浄し、１％ラテック
ス粒子浮遊液を調製した。これに抗原液を等量に混合し
３７℃で２時間感作した。４０００回転／２０分間の遠
心でラテックスを沈澱に集めた。これを０．５％の豚胎
子血清を含有するグリシン緩衝液で浮遊させ、４℃で１
８時間放置した。０．１％豚胎子血清を含有するグリシ
ン緩衝液（以下「希釈液」と呼ぶ）で遠心操作により、
５回ラテックス粒子を洗浄し、同緩衝液で０．２％ラテ
ックス粒子懸濁液を調製し、これを抗原感作ラテックス
とした。ラテックス凝集反応は９６穴Ｕ型マイクロプレ
ートを使用した。可検血清の５０μｌ段階希釈列を作
り、これに５０μｌの抗原感作ラテックス粒子懸濁液を
加え良く混合した後、３７℃で１８時間静置し、判定し
た。凝集が認められた血清の最高希釈倍数を抗体価とし
た。この結果を表５に示す。 表５ ＰＥＤウイルス糖蛋白ラテックスの凝集測定 ───────────────────────────── 豚番号 感染の経過 ラテックス凝集価 ───────────────────────────── １ 発症中 ＜４ ２ 発症中 ＜４ ３ 発症中 ＜４ ４ 発症中 ＜４ ５ 発症中 ＜４ １−後 発症後３週目 ４０ ２−後 発症後３週目 １６０ ３−後 発症後３週目 ３２０ ４−後 発症後３週目 ６４０ ５−後 発症後３週目 ３２０ ──────────────────────────── 上記の結果から、本法によりＰＥＤウイルスの抗体が簡
単に測定できる。
０で約１００倍に希釈し抗原液とした。０．９μｍのラ
テックス粒子をグリシン緩衝液で洗浄し、１％ラテック
ス粒子浮遊液を調製した。これに抗原液を等量に混合し
３７℃で２時間感作した。４０００回転／２０分間の遠
心でラテックスを沈澱に集めた。これを０．５％の豚胎
子血清を含有するグリシン緩衝液で浮遊させ、４℃で１
８時間放置した。０．１％豚胎子血清を含有するグリシ
ン緩衝液（以下「希釈液」と呼ぶ）で遠心操作により、
５回ラテックス粒子を洗浄し、同緩衝液で０．２％ラテ
ックス粒子懸濁液を調製し、これを抗原感作ラテックス
とした。ラテックス凝集反応は９６穴Ｕ型マイクロプレ
ートを使用した。可検血清の５０μｌ段階希釈列を作
り、これに５０μｌの抗原感作ラテックス粒子懸濁液を
加え良く混合した後、３７℃で１８時間静置し、判定し
た。凝集が認められた血清の最高希釈倍数を抗体価とし
た。この結果を表５に示す。 表５ ＰＥＤウイルス糖蛋白ラテックスの凝集測定 ───────────────────────────── 豚番号 感染の経過 ラテックス凝集価 ───────────────────────────── １ 発症中 ＜４ ２ 発症中 ＜４ ３ 発症中 ＜４ ４ 発症中 ＜４ ５ 発症中 ＜４ １−後 発症後３週目 ４０ ２−後 発症後３週目 １６０ ３−後 発症後３週目 ３２０ ４−後 発症後３週目 ６４０ ５−後 発症後３週目 ３２０ ──────────────────────────── 上記の結果から、本法によりＰＥＤウイルスの抗体が簡
単に測定できる。
【効果】本発明による豚流行性下痢ウイルスの糖蛋白を
用いた各種抗体検査法により、豚流行性下痢の診断を下
すことができる。従って、従来の血清診断法に比べ、術
式や操作が容易であるばかりでなく、豚流行性下痢ウイ
ルスの伝染防止に即対応でき、その蔓延防止にも寄与す
ることができる。
用いた各種抗体検査法により、豚流行性下痢の診断を下
すことができる。従って、従来の血清診断法に比べ、術
式や操作が容易であるばかりでなく、豚流行性下痢ウイ
ルスの伝染防止に即対応でき、その蔓延防止にも寄与す
ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00
Claims (5)
- 【請求項１】 ＴＲ−ＳＫ細胞、ＴＲ−ＳＳＩ細胞など
の豚由来細胞を用いて、ＰＥＤウイルスをトリプシン添
加培養液で培養し、感染培養液を濃縮し、粗ＰＥＤウイ
ルス糖蛋白を採取し、必要に応じて精製することを特徴
とする、ＰＥＤＶ糖蛋白を大量に単離する方法。 - 【請求項２】 請求項１の方法により調製したウイルス
糖蛋白を使用して赤血球凝集抑制（ＨＩ）反応に供す
る、ＰＥＤウイルスＨＩ抗体の測定法。 - 【請求項３】 請求項１の方法により調製したウイルス
糖蛋白を使用して寒天ゲル内沈降（ＡＧＰ）反応に供す
る、ＰＥＤウイルスＡＧＰ抗体の測定法。 - 【請求項４】 請求項１の方法により調製したウイルス
糖蛋白を使用して酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に
供する、ＰＥＤウイルスＥＬＩＳＡ抗体の測定法。 - 【請求項５】 請求項１の方法により調製したウイルス
糖蛋白を付着させたラテックス粒子を用いてラテックス
凝集反応に供する、ＰＥＤウイルスのラテックス凝集抗
体の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25463796A JPH1099093A (ja) | 1996-09-26 | 1996-09-26 | 豚流行性下痢ウイルス（ｐｅｄｖ）の糖蛋白抗原の作製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25463796A JPH1099093A (ja) | 1996-09-26 | 1996-09-26 | 豚流行性下痢ウイルス（ｐｅｄｖ）の糖蛋白抗原の作製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1099093A true JPH1099093A (ja) | 1998-04-21 |
Family
ID=17267793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25463796A Pending JPH1099093A (ja) | 1996-09-26 | 1996-09-26 | 豚流行性下痢ウイルス（ｐｅｄｖ）の糖蛋白抗原の作製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1099093A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103675274A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-03-26 | 广西大学 | 检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接elisa试剂盒 |
-
1996
- 1996-09-26 JP JP25463796A patent/JPH1099093A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103675274A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-03-26 | 广西大学 | 检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接elisa试剂盒 |
| CN103675274B (zh) * | 2013-12-17 | 2016-03-30 | 广西大学 | 检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接elisa试剂盒 |
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